Инструкция (0.22Мб)

IntraPrep™
КАТАЛОЖНЫЙ НОМЕР A07803
150 тестов; 6 x 5 мл
2 x 0.1 мл / тест
Реагент для повышения
проницаемости мембран лейкоцитов
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
IN VITRO
Компонент 1
Компонент 2
Реагент для фиксации
Реагент для повышения проницаемости
цитоплазматической мембраны
Состояние
Жидкость
Жидкость
Активное вещество
Формальдегид
Сапонин
Объем
5 мл
5 мл
Количество
флаконов
3
3
Объем для одного
исследования
100 мкл
100 мкл
НАЗНАЧЕНИЕ
Реагент IntraPrep состоит из двух готовых к
использованию компонентов, действие которых
увеличивает проницаемость цитоплазматической
мембраны лейкоцитов и позволяет с помощью
флуоресцирующих
моноклональных
антител
выявить
внутриклеточные
антигенные
детерминанты.
IntraPrep
используется
при
подготовке биологических образцов для анализа
на
проточном
цитофлуориметре.
Реагент
оптимизирован
таким
образом,
что
при
исследовании данным методом неспецифическое
окрашивание минимально.
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
На первом этапе клетки фиксируются реагентом 1.
После отмывки под действием реагента 2
повышается проницаемость мембран лейкоцитов.
Затем выполняется лизис эритроцитов. Затем
клетки
обрабатываются
конъюгатами
моноклональных
антител,
специфичных
к
внутриклеточным антигенным детерминантам, после
чего выполняется анализ лейкоцитов на проточном
цитофлуориметре.
Данный
метод
также
позволяет
выявить
поверхностные антигенные детерминанты. Для
этого
следует
провести
инкубацию
со
специфическими моноклональными антителами до
фиксации.
Проточный цитометр измеряет светорассеяние и
флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить
интересующую
популяцию
на
диаграмме,
отображающей
светорассеяние
в
боковом
направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние в
прямом направлении под малыми углами (Forward
Scatter или FS). Для выбора анализируемых
популяций в различных приложениях можно
использовать другие двупараметровые диаграммы.
Прибор
выполняет
анализ
флуоресценции
выбранной популяции, распознавая окрашенные и
неокрашенные клетки. Результат представляется в
виде процентного содержания положительных
клеток от всех клеток выбранной популяции.
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Реагент IntraPrep хранится при температуре
18 - 25°C.
Стабильность
нераспечатанного
реагента
приводится на этикетке флакона.
Стабильность распечатанного реагента 90 дней.
ВНИМАНИЕ
1. Не используйте реагенты с истекшим сроком
годности.
2. Не замораживайте реагенты.
3. Воздействие света необходимо свести к
минимуму.
4. Избегайте контаминации микроорганизмами, в
противном
случае
возможно
получение
недостоверных результатов.
5. Реагент 1 содержит формальдегид - токсичное и
аллергенное
вещество,
потенциальный
канцероген. Никогда не отбирайте его через
пипетку ртом, не допускайте контакта с кожей,
слизистой оболочкой, глазами, избегайте
попадания на одежду.
6. Реагент 2 содержит азид натрия (NaN3) и требует
осторожного обращения. Не проглатывайте,
избегайте любого контакта с кожей, слизистой
оболочкой и глазами. В кислой среде азид натрия
способен образовывать взрывоопасную азотистоводородную кислоту. При утилизации перед сливом
в водопровод рекомендуется развести реагент
большим объемом воды. Это позволит избежать
накопления азида натрия в металлических трубах и
предотвратит образование взрывчатого вещества.
7. Все образцы крови следует рассматривать как
потенциально инфицированные. При работе с
ними
необходимо
соблюдать
все
меры
предосторожности (в частности, использовать
защитные перчатки, халат и очки).
8. После завершения работы пробирки с кровью и все
одноразовые материалы необходимо поместить в
специальные контейнеры для утилизации.
ОБРАЗЦЫ
Венозную кровь или образцы костного мозга
необходимо отобрать в стерильные пробирки с
солью EDTA, цитратом декстрозы (ACD) или
гепарином в качестве антикоагулянта.
Образцы должны храниться при комнатной
температуре (18 – 25°C). Встряхивание образцов не
допускается. Перед отбором аликвоты образец
следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.
Анализ образцов необходимо выполнить в течение
24 часов после отбора.
МЕТОДИКА
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
МАТЕРИАЛЫ
• Пробирки и материалы для отбора проб.
• Автоматические
пипетки
с
одноразовыми
наконечниками на 10, 20, 50, 100 и 500 мкл.
• Пластиковые пробирки для гемолиза.
• Калибровочные частицы: флуоросферы FlowSet™ (кат. № 6607007).
• Специфические моноклональные антитела.
• Изотипические контроли.
• Буфер (PBS: 0.01 M фосфат натрия; 0.145 M
хлорид натрия; pH 7.2).
• Центрифуга.
• Миксер (вортекс).
• Проточный цитофлуориметр.
ПОДГОТОВКА ПРОБ
А - Окрашивание внутриклеточных маркеров
Концентрация эритроцитов в образце должна быть
меньше 6 x 106/мкл (6 x 1012/л). В случае
необходимости следует развести PBS.
Концентрация лейкоцитов в образце должна быть
меньше 5 x 103 клеток/мкл (5 x 109/л). При
необходимости разведите образец PBS.
При исследовании любого образца необходимо
также проанализировать контрольный образец
(исследуемый образец плюс отрицательный
контроль,
соответствующий
специфическому
окрашиванию).
1. В пробирки для анализа клинических образцов и
изотипических контролей добавьте по 50 мкл
анализируемых образцов.
2. В пробирки для анализа образцов и изотипических
контролей добавьте по 100 мкл реагента 1.
Немедленно хорошо перемешайте на вортексе.
3. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной
температуре (18 – 25°C).
1/3
4. В каждую пробирку добавьте по 4 мл PBS.
5. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 x
g при комнатной температуре.
6. Удалите супернатант аспирацией.
7. Добавьте 100 мкл реагента 2 в каждую пробирку.
НЕ ПЕРЕМЕШИВАЙТЕ. Реагент 2 должен
диффундировать в осадок клеток.
8. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре
(18 – 25°C) БЕЗ ВСТРЯХИВАНИЯ.
9. Аккуратно встряхните пробы вручную в течение 2 3 секунд.
10. В пробирки для анализа образцов добавьте по 20
мкл мАт, специфичных к внутриклеточным
антигенным детерминантам.
11. В пробирки для анализа контролей добавьте по 20
мкл изотипического контроля.
12. Аккуратно перемешайте содержимое пробирок на
вортексе.
13. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре
(18 – 25°C) в защищенном от света месте.
14. Во все пробирки добавьте по 4 мл PBS.
15. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300
x g при комнатной температуре.
16. Удалите
супернатант
аспирацией.
Ресуспендируйте осадок клеток в 0.5 или 1 мл
раствора для фиксации IOTest 3 Fixative Solution
(кат. № A07800) в рабочей концентрации (1X).
Зафиксированные таким образом клетки могут
храниться при температуре 2 – 8°C в
защищенном от света месте в течение 24
часов.
В - Окрашивание внутриклеточных и
поверхностных маркеров
Концентрация эритроцитов в образце должна быть
меньше 6 x 106/мкл (6 x 1012/л). В случае
необходимости следует развести PBS.
Концентрация лейкоцитов в образце должна быть
меньше 5 x 103 клеток/мкл (5 x 109/л). При
необходимости разведите образец PBS.
При исследовании любого образца необходимо
также проанализировать контрольный образец
(исследуемый образец плюс отрицательный
контроль,
соответствующий
специфическому
окрашиванию).
1. В пробирки для анализа клинических образцов и
изотипических контролей добавьте по 50 мкл
анализируемых образцов.
2. В пробирки для анализа клинических образцов
добавьте по 20 мкл мАт, специфичных к
поверхностным антигенным детерминантам.
3. В пробирки для анализа контролей добавьте по 20
мкл изотипического контроля.
4. Аккуратно перемешайте содержимое пробирок на
вортексе.
5. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной
температуре (18 – 25°C) в защищенном от света
месте.
6. В пробирки для анализа образцов и изотипических
контролей добавьте по 100 мкл реагента 1.
Немедленно хорошо перемешайте на вортексе.
A07803EN_A 2003-12-03
AC-03-1143
7. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной
температуре (18 – 25°C).
8. В каждую пробирку добавьте по 4 мл PBS.
9. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 x
g при комнатной температуре.
10. Удалите супернатант аспирацией.
11. Добавьте 100 мкл реагента 2 в каждую пробирку.
НЕ ПЕРЕМЕШИВАЙТЕ. Реагент 2 должен
диффундировать в осадок клеток.
12. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре
(18 – 25°C) БЕЗ ВСТРЯХИВАНИЯ.
13. Аккуратно встряхните пробы вручную в течение 23 секунд.
14. В пробирки для анализа образцов добавьте по 20
мкл мАт, специфичных к внутриклеточным
антигенным детерминантам.
15. В пробирки для анализа контролей добавьте по 20
мкл изотипического контроля.
16. Аккуратно перемешайте содержимое пробирок на
вортексе.
17. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре
(18 – 25°C) в защищенном от света месте.
18. Во все пробирки добавьте по 4 мл PBS.
19. Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 x
g при комнатной температуре.
20. Удалите
супернатант
аспирацией.
Ресуспендируйте осадок клеток в 0.5 или 1 мл
раствора для фиксации IOTest 3 Fixative Solution
(кат. № A07800) в рабочей концентрации (1X).
Зафиксированные таким образом клетки могут
храниться при температуре 2 – 8°C в
защищенном от света месте в течение 24
часов.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ
ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ
В один день на одном цитометре определялось
процентное
содержание
гранулоцитов
по
отношению к популяции лейкоцитов в образце крови
донора.
Измерение
выполнялось
12
раз.
Гранулоциты
идентифицировались,
с
одной
стороны, по светорассеянию (FS - SS), с другой
стороны, по экспрессии миелопероксидазы (МП).
Полученные результаты суммированы в следующей
таблице:
2. Некоторые
Исследуемая
популяция
Количество Среднее
измерений
(%)
SD
CV
(%)
Гранулоциты
(FS - SS)
12
52.4
1.38
2.6
Гранулоциты
(МП)
12
55.6
1.6
2.9
МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
РЕЗУЛЬТАТОВ
В один день на двух цитометрах двумя
лаборантами
определялось
процентное
содержание гранулоцитов по отношению к
популяции лейкоцитов в образце крови донора.
Измерение выполнялось 12 раз. Гранулоциты
идентифицировались, с одной стороны, по
светорассеянию (FS - SS), с другой стороны, по
экспрессии миелопероксидазы (МП). Полученные
результаты суммированы в следующих таблицах:
Цитометр # 1
Исследуемая
популяция
Количество
измерений
Среднее
(%)
Гранулоциты
(FS - SS)
12
44.4
0.72 1.6
Гранулоциты
(МП)
12
47.2
0.62 1.3
SD
CV
(%)
Цитометр # 2
Исследуемая
популяция
Количество
измерений
Среднее
(%)
Гранулоциты
(FS - SS)
12
44.5
0.90 2.0
Гранулоциты
(МП)
12
46.2
0.76 1.7
SD
CV
(%)
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
неверной
компенсации
флуоресценции
и
неправильном расположении регионов могут
быть получены недостоверные результаты.
2/3
антигенные
детерминанты
чувствительны к формальдегиду или сапонину.
Каждая лаборатория должна самостоятельно
проверить условия использования реагентов
моноклональных антител.
3. Для получения точных и воспроизводимых
результатов
необходимо
соблюдать
все
приведенные инструкции и следовать нормам
лабораторной работы.
4. Данный реагент оптимизирован для получения
наилучшего соотношения специфического и
неспецифического сигнала. Поэтому в каждом
исследовании необходимо строго дозировать
указанный объем реагента с учетом количества
эритроцитов и лейкоцитов в образце.
5. При повышенном содержании клеток разведите
образец PBS так, чтобы получить концентрацию
лейкоцитов менее 5 x 109/л, а эритроцитов - 6 x
1012/л.
6. При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
почечная недостаточность или гемоглобинопатии,
лизис эритроцитов может происходить медленно,
не полностью или совсем не происходить. В этом
случае перед окрашиванием рекомендуется
выделить мононуклеарные клетки в градиенте
плотности (например, фикола).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
В приложении приводится список литературы и
примеры диаграмм.
ТОРГОВЫЕ ЗНАКИ
Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, FlowSet,
IOTest,
System
II,
XL
являются
зарегистрированными
торговыми
знаками
компании Beckman Coulter Inc.
ИЗГОТОВЛЕНО:
IMMUNOTECH S.A.
a Beckman Coulter Company
130 avenue de Lattre de Tassigny
B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9
France
Отдел по работе с клиентами: (33) 4 91 17 27 27
www.beckmancoulter.com
A07803EN_A 2003-12-03
AC-03-1143
ПРИЛОЖЕНИЕ К РУКОВОДСТВУ № A07803
ПРИМЕРЫ ДИАГРАММ
Список литературы
Ниже показаны двупараметровые диаграммы без использования
программного выделения клеток (светорассеяние в боковом направлении интенсивность флуоресценции), полученные при анализе образца
нормальной цельной крови. Окрашивание внутриклеточных маркеров
выполнено с помощью конъюгатов моноклональных антител с FITC,
направленных против МП, и с помощью конъюгатов моноклональных
антител с PE, направленных против CD79a.
1.
Campana, D., Thompson, J.S., Amlot, P., Brown, S., Janossy, G., "The cytoplasmic expression of CD3 antigens in normal and malignant cells of the T
lymphoid lineage", 1987, J. Immunol., 138, (2), 648-655.
2.
Koeffler, H.P., Ranyard, J., Pertcheck, M., "Myeloperoxidase: its structure and
expression during myeloid differentiation", 1985, Blood, 65, (2), 484-491.
3.
Picker, L.J., Singh, M.K., Zdraveski, Z., Treer, J.R., Waldrop, S.L., Bergstresser, P.R., Maino, V.C., "Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effector T cells by flow cytometry", 1995,
Blood, 86, (4), 1408-1419.
4.
Lees, O., "Immunophénotypage des cellules sanguines : du
prélèvement à la lecture au cytomètre : les différentes méthodes", 1996, Revue Française des Laboratoires, 287, 33-39.
Считывание и анализ данных выполнены с помощью проточного
цитофлуориметра COULTER® EPICS® XL™ в программном обеспечении
System II™.
3/3
A07803EN_A 2003-12-03
AC-03-1143