Определение эффекторных субпопуляций лимфоцитов

«Использование метода
внутриклеточного
окрашивания цитокинов для
определения содержания
эффекторных субпопуляций
Т-лимфоцитов »
МУ «Клинико-диагностический центр»
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН
г.Екатеринбург
Трансформации CD4+лимфоцитарных субпопуляций
Наивные Т-лимфоциты
Нестабильны
TGF
iTreg
Foxp3
IL-6
Th17
Th1
IL-4
RORt, AhR
IFN-,
IL-12
T-bet
IL-12R2+
Th1+2
IFN-,
IL-12
IFN I
GATA-3
IL-12R2-
Стабильны
Murphy KM et al. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances.
Nature Immunology, 2010,11(8): 674-679
Th2
Характеристика отдельных CD4
эффекторных Т-клеточных субпопуляций
Субпопуляции
CD4 Тэффекторов
Поляризационные
факторы
Транскрипционные
факторы
Маркерные
цитокины
Th1
IL-12, IFN-
T-bet
IFN-, TNF,
IL-2
Th2
IL-4
GATA-3
Th17
TGF, IL-6,
ROR- t
IL-4, IL-5,
IL-13
IL-17, IL21, IL-22
K.K.McKinstry et al. The potential of CD4 T-cell memory. Immunology, 2010, 130, 1-9
Tс1/Тс2-лимфоциты
Tс2
Tс1
Маркерные
молекулы
Цитокиныиндукторы
Участие в иммунном
ответе
Tc1
IL2, IFN
IFN, IL12
Вирусные инфекции,
противоопухолевый
иммунитет
Tc2
IL4, IL5, IL6,
IL10
IL4
Вирусные инфекции,
противоопухолевый
иммунитет
Участие в
иммунопатологичес
ких реакциях
Аутоиммунные
заболевания
Актуальность изучения возрастных особенностей
баланса Th1, Tc1 и Th2, Tc2, Th17 и Tnc17
лимфоцитов
Определение
содержания
различных
эффекторных T-лимфоцитарных субпопуляций,
начиная с периода новорожденности вплоть до
взрослого
возраста,
имеет
важнейшее
значение:
• для оценки колебания их уровня в ходе того
или иного патологического процесса
• для
представления
о
нормальных
иммунологических вариациях в различных
возрастных группах
• для
исследования
процессов
иммунологического созревания
Объект исследования
Образцы гепаринизированной венозной крови
150 здоровых детей и 45 взрослых:
7-12 месяцев – 30 детей
1-3 года-30 детей
4-7 лет – 30 детей
8-14 лет – 30 детей
15-18 лет – 30 подростков
25-45 лет – 45 взрослых
Метод внутриклеточного окрашивания цитокинов в
стимулированных лимфоцитах периферической
крови:
Активация PMA (50 нг/мл)с
иономицином (1 мкг/мл) в
присутствии Брефелдина А, 4
часа
Фиксация , 10 мин
Пермеабилизация сапонинсодержащим раствором , 10
мин
Одновременное
окрашивание
поверхностных рецепторов и
внутриклеточное
окрашивание
антицитокиновыми mAb, 30
мин
Анализ
Моноклональные антитела:
Для определения внутриклеточных цитокинов
использовались следующие моноклональные антитела:
Фикоэритрин (PE)-коньюгированные 45.15 для определения
IFN- (IO Test, Immunotech, France) - Th1, Tc1
PE-коньюгированные 4D9 для определения IL-4 (IO Test,
Immunotech, France) –Th2, Tc2
PE-коньюгированные SCPL1362 для определения IL-17А (BD
Pharmingen) –Th17, Tnc17
Для окрашивания поверхностных рецепторов:
Фикоэритринцианин 5.1 (PC-5)-коньюгированные UCHT1 CD3
(IO Test, Immunotech, France)
Флюоресцеин изотиоцианат (FITC)-коньюгированные 13В8.2
CD4 (IO Test, Immunotech, France)
FITC-коньюгированные В9.11 CD8 (IO Test, Immunotech,
France)
Для определения содержания Т-клеток-памяти:
CD45RA FITC/CD62L PE/CD3 PerCP/CD4 APC и CD45RA
FITC/CD62L PE/CD3 PerCP/CD8 APC MultiTest (BDIS).
Спонтанная экспрессия цитокинов лимфоцитами
периферической крови (4 часа в присутствии
брефелдина А)
Стимулированная экспрессия цитокинов
лимфоцитами периферической крови (ФМА и
иономицин, 4 часа в присутствии брефелдина А)
CD69s=96%
CD69cyt=98%
Содержание Th1-лимфоцитов в
разных возрастных группах
20
Тэффекторы
/клетки
памяти
18
16
CD3+CD4+IFN %
14
12
10
8
6
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
0,95
0,40
1,45
2,55
1,34
3,39
3,80
1,96
4,50
6,34
5,47
8,17
5,30
4,43
6,40
7,55
5,90
8,74
3,4,5,6
4,5,6
1,4,5,6
1,2,3
1,2,3
1,2,3
49,76
26,44
74,32
108,08
65,91
153,05
82,16
53,57
143,54
125,50
98,54
169,78
115,34
96,13
161,26
147,98
100,22
176,35
2,4,5,6
1
1
1
1
4
2
0
-2
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
0,45
0,40
Th1
%
0,35
CD3+CD4+IFN а
0,30
0,25
Th1
0,20
0,15
Абс./мк
л
0,10
0,05
0,00
-0,05
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
Содержание Th2-лимфоцитов в
разных возрастных группах
1,6
Тэффекторы
/клетки
памяти
1,4
1,2
CD3+CD4+IL4+, %
1,0
0,8
0,6
0,4
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
0,10
0,00
0,18
0,10
0,05
0,20
0,10
0,10
0,20
0,20
0,10
0,30
0,10
0,00
0,20
0,38
0,20
0,80
6
6
6
6
6
1,2,3,4,
5
4,98
0,00
10,16
5,24
1,40
8,50
3,24
1,82
5,41
3,74
1,15
5,56
2,88
0,00
4,60
7,80
3,38
13,96
1,6
5
0,2
0,0
-0,2
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
0,07
0,06
Th2
%
CD3+CD4+IL4+, 109/л
0,05
0,04
Th2
0,03
0,02
Абс./мк
л
0,01
0,00
-0,01
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
5
Содержание Th17-лимфоцитов в
разных возрастных группах
2,0
Тэффекторы
/клетки
памяти
1,8
1,6
CD3+CD4+IL17+, %
1,4
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
Th17
%
0,20
0,10
0,40
0,20
0,10
0,25
0,10
0,10
0,40
0,20
0,15
0,30
0,20
0,10
0,40
0,30
0,12
0,45
Th17
11,01
5,59
20,29
5,62
2,25
15,90
5,90
2,97
8,33
1
4,21
2,42
8,03
1
4,49
1,91
9,68
2,3,4,5,6
4,10
1,65
8,83
1
1
1
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
140
120
CD3+CD4+IL17+, 10 6/ л
100
80
60
40
Абс./мк
л
20
0
-20
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
Содержание Tс1-лимфоцитов в
разных возрастных группах
22
Тэффекторы
/клетки
памяти
20
18
16
CD3+CD8+IFN %
14
12
10
8
6
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
0,50
0,20
1,12
1,50
0,93
2,39
2,30
1,50
2,90
4,05
3,40
5,46
4,22
3,36
6,55
6,00
3,73
8,87
4,5,6
5,6
5,6
1
1,2,3
1,2,3
84,68
56,62
160,55
204,65
126,68
312,77
150,56
104,65
249,74
236,76
174,87
280,06
232,83
191,45
309,08
276,88
185,33
377,41
1
1
4
2
0
-2
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
0,8
0,7
Tс1
%
0,6
CD3+CD8+IFN а
0,5
0,4
Tс1
0,3
0,2
Абс./мк
л
0,1
0,0
-0,1
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
5,6
Содержание Tс2-лимфоцитов в
разных возрастных группах
Тэффекторы
/клетки
памяти
0,9
0,8
0,7
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
Tс2
%
0,10
0,07
0,18
0,10
0,00
0,13
0,05
0,00
0,10
0,10
0,08
0,10
0,10
0,00
0,20
0,10
0,10
0,20
Tс2
6,99
3,39
10,46
3,66
0,00
5,88
1,68
0,00
3,69
1,90
1,11
3,74
2,25
0,00
4,35
2,24
1,25
4,04
2,3,4,5,
6
1
1
1
1
1
CD3+CD8+IL4+, %
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
0,07
0,06
CD3+CD8+IL4+, 109/л
0,05
0,04
0,03
Абс./мк
л
0,02
0,01
0,00
-0,01
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
Содержание Tnс17-лимфоцитов в
разных возрастных группах
1,4
Тэффекторы
/клетки
памяти
1,2
CD3+CD8+IL17+, %
1,0
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
Tnс17
%
0,10
0,10
0,30
0,10
0,10
0,20
0,10
0,05
0,20
0,10
0,05
0,20
0,30
0,20
0,40
0,10
0,10
0,16
Tnc17
7,53
4,63
15,62
5,62
3,58
12,04
3,19
1,19
7,35
1
2,78
1,40
4,46
1
6,15
3,81
9,58
2,01
1,39
3,79
1
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
100
CD3+CD8+IL17+, 10 6/л
80
60
40
Абс./мк
л
20
0
3,4,5,6
-20
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
Соотношение Th1/Th2, Tc1/Tc2 лимфоцитов
в разных возрастных группах
200
Тэффекторы
/клетки
памяти
180
160
140
7-12
мес
1-3
года
4-7
лет
8-14
лет
15-18
лет
25-45
лет
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
1
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
2
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
3
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
4
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
5
Медиана
Нижний и
верхний
квартили
6
Th1/
Th2
5,00
3,00
9,75
3,4,5,6
17,32
10,38
27,60
26,80
17,97
39,90
1
39,70
17,33
52,50
1
31,08
23,00
45,50
1
15,25
10,11
31,00
1
Tc1/
Tc2
3,00
1,75
6,30
18,20
7,10
22,03
22,55
12,57
34,88
34,00
19,75
58,35
23,85
16,58
43,55
46,00
29,00
58,00
1
1
1
Th1/Th2
120
100
80
60
40
20
0
-20
1
2
3
4
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
возрастные группы
220
200
180
160
140
Tc1/Tc2
120
100
80
60
40
20
0
-20
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
4,5,6
Т-лимфоциты памяти
Центральные
CD4+Т-клеткипамяти
Эффекторные
CD4+Т-клеткипамяти
Наивные Тхелперы
Относительное содержание центральных и
эффекторных CD4+и CD8+ Т-лимфоцитов
памяти
60
90
80
50
70
40
CD4+TEM, %
CD4+ TCM, %
60
30
20
50
40
30
10
20
0
-10
10
1
2
3
4
5
6
возрастные группы
Median
25%-75%
Min-Max
0
1
2
3
4
5
6
возрастные группы
35
Median
25%-75%
Min-Max
100
30
80
20
CD8+TEM, %
CD8+ TCM, %
25
15
60
40
10
5
20
0
-5
1
2
3
4
N
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
0
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
Содержание CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов памяти в
разных возрастных группах
100
120
90
100
70
CD8+ Т-клетки памяти, %
CD4 Т-клетки памяти, %
80
60
50
40
30
20
80
60
40
20
10
0
1
2
3
4
5
6
возрастные группы
Median
25%-75%
Min-Max
0
2
3
4
5
6
5
6
возрастные группы
1800
1000
1600
900
Median
25%-75%
Min-Max
800
CD8 + Т-клетки памяти, 10 6/л
1400
CD4+Т-клетки памяти. 10 6/л
1
1200
1000
800
600
700
600
500
400
300
200
400
100
200
0
1
2
3
4
возрастные группы
5
6
Median
25%-75%
Min-Max
0
1
2
3
4
возрастные группы
Median
25%-75%
Min-Max
Коррелятивные связи между содержанием
Th1, Th2, Th17-субпопуляций и CD4+Tлимфоцитами памяти
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции=.267
p=0,000258
CD4+TCM + CD4TEM
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции =.646
p<.000000
CD4+TCM + CD4TEM
Th2
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции=. 082
p=0,0269843
Th1
CD4+TCM + CD4TEM
Th17
Коррелятивные связи между содержанием
Tс1, Tс2, Tnc17-субпопуляций и CD8+Tлимфоцитами памяти
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции =.066
p=0,375756
CD8+TCM + CD8TEM
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции = .499
p=.000000
CD8+TCM + CD8TEM
Tc2
Ранговая корреляция по Спирмену,
коэффициент корреляции =-.029
р=0,688191
Tc1
CD8+TCM + CD8TEM
Tnc17
Заключение:
• На фоне редуцированного Th1 и Тс1иммунитета на 7-12 месяце жизни у
ребенка наблюдается преимущественная
поляризация
дифференцировки
Тлимфоцитов по пути Th2 (Tc2) и Th17
(Tnc17), что,
по
всей
видимости,
способствует
манифестации
Th2опосредованных
аллергических
заболеваний
у
детей
с
предрасположенностью к атопии.
Заключение:
• У детей старше одного года количество Th1
и Тс1, Th2 и Тс2 лимфоцитов значимо не
отличалось
от
содержания
этих
субпопуляций у взрослых.
Заключение:
• В подростковом возрасте увеличение
индекса Th1/Тh2 связано со снижением
содержания Th2-субпопуляции. В этой же
группе
наблюдалась
тенденция
к
нарастанию содержания IL17А-позитивных
лимфоцитов, что может способствовать
предрасположенности к индукции различных
аутоиммунных заболеваний в подростковом
возрасте.
Заключение:
• У взрослых людей 25-45 летнего
возраста содержание Th1-субпопуляции
преобладало над содержанием Th2 в 15
раз, Тс1 над Тс2 – в 46 раз. Увеличение
с
возрастом
относительного
содержания Th1 и Тс1-субпопуляций
лимфоцитов непосредственно связано
с формированием пула Т-лимфоцитов
памяти.
Спасибо за внимание