Геномное секвенирование региона CDR3 генов тяжелых цепей иммуноглобулинов из архивных препаратов (FFPE) от больных лимфогранулематозом Ю.В. Сидорова, Б.В.Бидерман, А.Б. Судариков ФГБУ “Гематологический Центр” Минздрава РФ Thomas Hodgkin (1798-1866) Hodgkin T. On some morbid appearances of the absorbent glands and spleen. Med Chir Trans 1832;17:69–97. Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина – Hodgkin disease Hodgkin’s disease watercolor drawing by Robert Carswell in 1828. This was case 7 in Hodgkin’s report. Abdominal lymph nodes (Hodgkin’s original case 2), Gordon Museum, GKT, King’s College London. Reed-Sternberg cells (клетки Березовского- Штернберга) Dorothy Mabel Reed(1874-1964) Березовский С.Я. К вопросу о строении и клиническом течении Lyphadenomae malignae. Русская медицина, 1890; 39: 611-613. ●Sternberg C. Uber eine eigenartige unter dem Bilde der Pseudoleukamie verlaufende Tuberculose des lymphatischen Apparates. Ztschr Heilk 1898;19:21–90. ●Reed DM. On the pathological changes in Hodgkin’s disease, with especial reference to its relation to tuberculosis. Johns Hopkins Hosp Rep 1902; 10: 133–396. ● 0-1 1-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+ incidence/100,000/annum Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина – Hodgkin disease 6 5 4 3 2 1 0 Age (years) Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина – Hodgkin disease Hodgkin and Reed-Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived from B cells at various stages of development. R Küppers, K Rajewsky, M Zhao, G Simons, R Laumann, R Fischer, and M L Hansmann. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(23): 10962– 10966. Ранние иммунофенотипические исследования клеток БерезовскогоШтернберга (Reed-Sternberg) предполагали их нелимфоидную природу (макрофагальную, гранулоцитарную и т.д.). Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина – Hodgkin disease ● ● ● Немногочисленные многоядерные опухолевые клетки Березовского-Штернберга (ReedSternberg cells) имеют В-клеточное происхождение и расположены среди преобладающего реактивного компонента. В большинстве случаев реарранжировки IgH носят продуктивный характер Наличие VH мутаций свидетельствует о герминальной или постгерминальной природе этих клеток Цели эксперимента: ● ● Исследовать возможности метода геномного секвенирования для анализа спектра перестроенных генов иммуноглобулинов на ДНК, выделенных из архивных образцов (FFPE) Сравнить профили клональности IgH при лимфогранулематозе и реактивной лимфоаденопатии (инфекционный мононуклеоз) В исследование включены: ● ● 5 проб от больных инфекционным мононуклеозом 7 проб от больных лимфогранулематозом; гистологический вариант вариант – нодулярный склероз, EBV-negative, возраст 20-40 лет (медиана -29) Перестройки генов тяжелой цепи иммуноглобулинов Параметры амплификации: 35 циклов VH-FR1 - JHcons 10 циклов VH-FR2 - JHcons Next generation sequencing Амплифицированные ДНКфрагменты секвенировали на платформе GS Junior (Roche). RL1: 7294 reads RL2: 17834 reads RL3: 6961 reads RL4: 15047 reads RL5: 7437 reads RL6: 6876 reads RL7: 48673 reads RL8: 13990 reads RL9: 11529 reads RL10: 14412 reads RL11: 17349 reads RL12: 11561 reads Анализ данных производили при помощи программного обеспечения GSMapper (Roche) и при помощи webресурса IMGT/V-QUEST http://www.imgt.org IgH clusters Обсчитывали последовательности начиная со 100-кратного перекрытия Профили клональных перестроек генов тяжелой цепи иммуноглобулинов инфекционный мононуклеоз лимфогранулематоз Предварительные выводы: ● ● ● ● Метод геномного секвенирования на платформе GS Junior (Roche) обладает достаточной чувствительностью для анализа спектра перестроенных генов иммуноглобулинов на ДНК, выделенных из архивных образцов (FFPE). В образцах от больных лимфогранулематозом определена Вклеточная клональность. В части образцов со значительным преобладанием одного клона. В образцах от больных с реактивной лимфоаденопатией мажорные клоны (почти всегда продуктивные) не выходят за пределы 1-2%. Наличие клонов с представительством более 30% (особенно непродуктивных) позволяет предположить, что тезис о том, что опухолевый субстрат при лимфогранулематозе представлен лишь немногочисленными клетками Березовского-ReedSteinberg'а нуждается в дополнительной проверке. Благодарности: ● ● Ворониной Ольге Львовне, к.б.н., доценту, с.н.с. отдела генетики и молекулярной биологии бактерий Института им. Гамалеи. Коробан Надежде, Roche Applied Science Application Specialist.