На правах рукописи Л я п у н
реклама
На правах рукописи Ляпун Ирина Николаевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ИХ В З А И М О Д Е Й С Т В И И С Х А Н Т А В И Р У С О М 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1 9 ФЬВ 2015 005559133 Владивосток - 2014 Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии и гистопатологии ФГБУ «Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН. Научный руководитель: доктор биологических наук Плехова Наталья Геннадьевна Официальные оппоненты: Целуйко Сергей Семенович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Попов Александр Михайлович, доктор биологических наук, профессор, руководитель группы биологически активных добавок Федерального государственного бюджетного учреждения «Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова» Дальневосточного Отделения РАН. Ведущая организация-. Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) Защита диссертации состоится «12» марта 2015 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (690002, г. Владивосток, Острякова, 2). Тел.: (423) 242-97-78; Факс: (423) 245-17-19, электронный адрес: mail@vgmu.ш С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2. Автореферат разослан« (г » 2 0 1 ^ г о д а Л Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских паук, доцент //// V Н.Ю. Матвеева 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одной нз центральных задач вирусной цптонатологнп является изучение закономерностей патогенного и пролиферативного действия вирусов на клетки, что в последующем может оказывать влияние на развитие острой, хронической или латентной форм инфекции в организме. Использование современных методов микроскопии дает возможность анализа процесса развития специфических и неспецнфнческих защитных клеточных реакций в ответ на внедрение патогена. Выраженность морфологических изменений клеток тесно связана с их метаболизмом и, в таком случае, высокочувствительные методы определения ферментативной активности являются важным способом индикации репродукции и днфференцировки цитопатогенного действия вирусов, а также характера и формы протекающего в клетках инфекционного процесса. Основным компонентом первого барьера защиты организма при вирусных инфекциях являются клетки врожденного иммунитета — нейтрофнлы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и натуральные киллеры (ЛитвицкщТ П.Ф.. Синельникова Т.Г. 2009). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению состояния этих клеток, до сих пор остаются неясными точные механизмы, посредством которых нейтрофилы становятся посредниками защитных реакций при вирусных патологиях. В тоже время известно, что моноциты являются основными хозяевами для вируса геморрагической болезни кроликов (Ramiro-lbanez F. et al., 1999), а вирус Денге (сем. Флавивнрусы) способен заражать моноциты/макрофаги вне зависимости от стадии их дифференцировкн (Chen Y.C. et al., 2002). Тем не менее, необходимо отметить, что конкретные механизмы активации клеток мопоцитариого происхождения при различных вирусных инфекциях не идентичны и на да1И1ый момент находятся в стадии интенсивного изучения. Дендритные клетки в процессе миграции преобразуются в профессиональные антиге1трезентирующие клетки иммунной системы с характерным рецепторным фенотипом (Steinman R.M. et al., 2006; O'Brain М. et al., 2013). Показано, что при острых вирусных инфекциях эти клетки продуцируют цитокпиы, которые являются важнейшим компонентом, индуцирующим механизмы противовирусной защиты организма, приводящей к элиминации патогенов (Hubo М. et al., 2013; Макаренкова И.Д., 2013). При недостаточном количестве вирусспецифических лимфоцитов и антител в организме решающая роль в ограничении распространения вируса в начальЕ1ый период заболевания принадлежит NK-клеткам. Исследования уникальных свойств этих клеток на модели in vitro показали, что они способны предотвращать заражение флавивирусом Западного Нила клеток культуры Vero (Zhang М. et al., 2010), ограничивать инфекцию вызванную вирусом гепатита С в гепатоцитах (Yuan J.Р. et al., 2003), а также принимать опосредованное участие при заражении Т лимфоцитов вирусом герпеса и онковирусом альфа (Вагаг Ь. е1 а1., 1999). Несмотря на интенсивное изучение вопроса иммунопатогенеза при ГЛПС, в основном, эти работы посвящены оценке состояния системы защиты организма при Пуумала-инфекции (Мухетдинова Г.А. и др., 2012; 8е11ег§геп В., 2000; Яазтизоп 2010). Так, показано, что вирус Пуумала способствует активации КК-клеток и оказывает влияние на поляризацию их лпзирующих гранул в направлении клеток-мишеней (В]огк51гогп N.K. е1 а1., 2010). В отнощении хантавируса, показано, что он вызывает более высокую нммунореактивность у моноцитов, чем у резидентных макрофагов, и определено участие дендритных клеток в защите организма, но в результатах этих исследований не приведены морфологические или ферментативные изменения указанных клеток (8сЬбпг!с11 О., 2008). Наряду с этим, необходимо отметить, что комплексных исследований механизма развития клеточной реакции врожденной системы иммунитета при патогенезе ранних фаз Хантаан инфекций не проводилось. Таким образом, недостаточная изученность патогенеза геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), одним из возбудителей которой является вирус Хантаан, определяет необходимость исследования взаимодействия указанного вируса с клетками врожденного иммунитета, а именно, с нейтрофилами, моноцитами/макрофагами, дендритными и КК-клетками. Особенно, это касается оценки функциональных свойств и метаболизма этих клеток, зараженных вирусом, которое, как правило, сопровождается изменением их морфологического состояния. Цель работы: дать комплексную морфологическую и цитохимическую характеристику клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов, дендритных и КК-клеток) при их взаимодействии с хантавирусом. Задачи исследования: 1. Дать оценку морфофункционального состояния нейтрофилов, зараженных хантавирусом. 2. При воздействии указанного вируса исследовать функциональную активность и морфологию клеток моноцитарного ряда различной степени днфференцировки. 3. Изучить характер влияния МК-клеток, преинкубированных с хантавирусом, на функциональную активность макрофагов. 4. Исследовать влияние хантавируса на морфофункциональное состояние дендритных клеток. 5. Определить морфологические и цитохимические маркеры вирусной инфекции в клетках врожденного иммунитета (нейтрофилах, моноцитах/макрофагах и дендритных клетках). Научная новизна: С помощью современных методов микроскопии (лазерная конфокальная и сканирующая электронная микроскопия) получены приоритетные данные об архитектонике поверхности пейтрофнлов, макрофагов и дендритных клеток в процессе их взапмоденствия с хантавирусом. Впервые установлено, что под воздействием хантавируса активируется кислороднезависимая бактерицидная система нейтрофилов с экскрецией биологического компонента во внеклеточное пространство, что свидетельствует об эффекторной функции этих клеток. Выявлено, что хантавирус не оказывает стимулирующего эффекта на моноциты периферической крови, тогда как в отношении резидентных макрофагов проявляется его выраженное действие. Так, в альвеолярных макрофагах под воздействием хантавируса на фоне выраженной активации компонентов нитроксидобразующей системы снижается активность ферментов кислородобразующей системы. Впервые показано, что КК-клетки, контактировавшие с хантавирусом, в отличие от клеток, которые не подвергались его воздействию, оказывали более выраженное цитотоксическое действие на макрофаги им инфицированные. Впервые установлено индуцирующее воздействие хантавируса на созревание дендритных клеток, полученных из костного мозга морских свинок. В зависимости от вида индуктора, под влиянием которого происходило созревание дендритных клеток, установлена их дифференцированная морфофункциональная реакция в ответ на заражение вирусом. Наиболее выраженное изменение морфологии и функциональных свойств наблюдалось в дендритных клетках, созревание которых происходило под влиянием хантавируса. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученное в результате исследования доказательство воздействия хантавируса на функциональную активность клеток врожденного иммунитета расширяет представление об эффекторной и модулирующей роли этих клеток в системе противовирусной защиты организма. С позиции решения общебиологической проблемы избирательности вирусов к различным типам клеток, поддерживающих их первичное размножение, новые данные о морфофункциональном состоянии дендритных клеток и мо1юцптов/макрофагов, 1шфицированных хантавирусом, вносят существенное дополнение в понимание молекулярно-клеточных механизмов развития патогенеза ГЛПС. Комплексная оценка ферментативной активности клеток врожденного иммунитета, зараженных хантавирусом, в совокупности с результатами вирусологических исследований, может являться одним из тестов определения репродуктивной активности вирусов в цитоплазме клетки с идентификацией их цитопатогепного действия. Разработанная модель взаимодействия вирусов с клетками врожденного иммунитета и способ оценки их морфофункционального состояния могут быть использованы в исследованиях вирулицидных свойств биологически активных соединений. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Клетки врожденного иммунитета (неитрофилы, моноциты/макрофаги, К К и дендритные клетки) подвергаются воздействию хантавируса. В ответ на внедрение вируса происходит выраженное изменение архитектоники поверхности клеток, активируются компоненты их бактерицидных систем и реализуются эффекторные свойства. 2. Хантавирус оказывает стимулирующий эффект на функциональную активность моноцитов/макрофагов в зависимости от степени их дифференцировки. Выраженное действие вируса обнаруживается в моноцитах, предварительно инкубированных в течение 18 ч, и макрофагах. В этих клетках определяется повышение активности сукцинатоксидазной кислородзависимой и нитроксидобразующей систем. В альвеолярных макрофагах, зараженных хантавирусом, на фоне выделения во внеклеточное пространство нитритов отмечается снижение активностп ферментов кислородобразующей системы, что указывает на проявление эффекторнои функции этих клеток. 3. NK-клeтки, контактировавшие с хантавирусом, оказывают цнтотоксическое действие на макрофаги, предварительно им инфицированные. 4. Хантавирус индуцирует созревание дендритных клеток, полученных из костного мозга морских свинок. В ответ на повторное заражение вирусом в данных клетках наблюдается выраженное изменение морфологии и функциональных свойств. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); X региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии студентов, аспирантов ВУЗов и научных организаций Дальнего Востока России (г. Владивосток, 2011); XIV Международной молодежной школеконференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС, ТИБОХ, 2012); XXIV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2012); XV Международном конгрессе по инфекционным болезням (Бангкок, Таиланд, 2012); Первых научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Г. П. Сомова «Будущее науки - за молодыми учеными» (Владивосток, 2012); IX международной конференции ГЛПС, ХЛС и Хантавирусы на базе Национального института контроля за вирусами и вакцин (Пекин, Китай, 2013); XXV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2014). Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, включая 8 статей в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук». Личный вклад соискателя заключается в планировании, подготовке и проведенпн экспериментов, статистической обработке и анализе полученных результатов. Автором в полном объеме выполнена экспериментальная часть исследования: получение первичных культур клеток, постановка и реализация цитологических, иммуногистохимических, электронномикроскоиических и спектрофотометрические методов исследования. Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 16.740.11.0182). Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописи, пллюстрирована 31 рисунками. Список литературы содержит 145 источников, из них 37 отечественных и 108 зарубежных авторов. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа была выполнена на 100 морских свинках массой 250-300 г. Содержа1П1е животных и протоколы моделированных патологических процессов соответствовали правилам и принципам международных рекомендаций Европейской конвенции но защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. В качестве инфекционного агента использовался штамм Аа 60343 (ПМ79-95) геноварианта Far East вируса Hantaan из Семейства Bunyaviridae род Hantavirus из рабочей коллекции лаборатории хаитавирусных инфекций ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН. В экспериментах использовали супернатантную впруссодержащую жидкость, включавшую не менее 5 инфекционных единиц на клетку, исходя из посадочной концентрации клеток и величины титра (2,5 lg фокус-формирующие единицы/мл) вируса, используемого для заражения (по методу Плеховой Н.Г., Сомова Л.М., 2010). Все работы с инфекционным вирусом проводились в условиях боксобиологпческой безопасности П-А, в лаборатории хаитавирусных инфекций ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН. Эксперименты ех vivo проводились на первичной культуре клеток: нейтрофилах воспалительного экссудата, моноцитах крови, перитонеальных и альвеолярных макрофагах, дендритных клетках из костномозговых предшественников (Lutz M.B. et al., 1999) и NK-клетках, полученных из селезенки морских сви1юк (Harris D.T., 1987). Условия эксперимента. Время контакта культуры клеток с вируссодержащей жидкостью составило от 5 до 60 мин. Для удаления внеклеточных вирусных частиц монослой клеток дважды промывали средой 199 (БиолоТ), содержащей 5 % эмбриональной телячьей сыворотки (БиолоТ), 0,004 % гентамицпна-К (KRKA). Затем продолжали инкубацию в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 18, 24,48, 72, 96, 120 ч. Эксперименты повторяли трижды. Оценку динамики накопления вирусного антигена в клетках проводили с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА). Для выявления специфических антигенов в клетках врожденного иммунитета применяли гомологичную иммуно-асцитическую жидкость к хантавирусу (ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН, г. Владивосток). Электронномикроскопические исследования Для изучения ультраструктуры клеток в процессе их взаимодействия хантавирусом использовали комплексный фиксатор, предложенный Ито с соавт. (1975). Для дофиксации использовали 1% раствор OSO4 (Serva), дегидратацию проводили в этаноле с возрастающей концентрацией, и образцы заключали в White Resin (Sigma) с использованием метода плоскопараллельной заливки. Образцы контрастировали цитратом свинца по стандартной методике (Уикли, 1975) и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOCS (JEOL, Япония). Обработку образцов для исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии проводили согласно методу Ю.А. Ровенского (1979). Монослой клеток фиксировали 2 % раствором глютаральдегида, приготовленном на 0,15 М натрий-какодилатном буфере с постфиксацией 1 % раствором 0 s 0 4 (Serva). Обезвоживание клеток проводили через ряд растворов ацетона восходящей концентрации (10-100 %). Поверхность образцов напыляли углеродом с использованием устройства для нанесения проводящих покрытий Jeol JEE-420D (Jeol, Япония) и исследовали в сканирующем электронном микроскопе Carl Zeiss Ultra 55 (Carl Zeiss, Германия). Оценка ферментативной активности макрофагов проводилась в динамике. Спектрофотометрические исследования • Содержание метаболитов NO - нитритов (NO'2) проводили с использованием Griess реактива (Schulz et al., 1999). В качестве контроля использовали образцы с добавлением ингибитора реакции - N a F (1CN, 1,5 мг/мл). • Активность аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) и 5'-нуклеотидазы определяли по методу Г.Б Кириличевой и соавт. (1988) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали adenosine-5'triphosphate и aclenosine-5'-mono phosphate (Sigma) соответственно. • Активность цитохромоксидазы (ЦХО) определяли по методу A.B. Novikoff и соавт. (1969) в собственной модификации, в качестве субстратов использовали 3,3 *- diaminobenzidine (Sigma). • Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли по методу 3. Лойда (1965) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide и iodonitrotetrazolium violet (Sigma) соответственно. • Активность мпелопероксидазы определяли по методу 3. Лопда (1965) в собствениоп модификации, используя в качестве субстрата оphenylenediamine (ICN). • Активность катиоииых белков определяли по методу A.A. Бутакова (1991), используя раствор прочного зеленого («Fast Green») fia основе метанолового трис-НС1-буфера. • Активность неспецифической эстеразы (НЭ) проводили по методу Хейхоу и Кваглиио (Хейхоу. 1983) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали нафтил AS ацетат и синий прочньиТ ВВ. Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No - N 0 / N^ х 100; где Nk средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных макрофагах; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных макрофагах. Результаты, полученные при проведении трех экспериментов но каждому изучаемому параметру, обрабатывали с применением факторного анализа, используя который определяли взаимосвязь между наблюдаемыми переменными. В результате анализа корреляционной матрицы получали факторы, которые отражали линейные комбинации соответствующих переменных. Для анализа связей данных использовали таблицы сопряженности признаков, критерий х-квадрат и логарифмический ранговый критерий для определения различий в группах. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика иейтрофилов, зараженных хаитавирусом Иммунная функция нейтрофилов при инфекционных заболеваниях, главным образом, ассоциируется с фагоцитозом и продукцией цитотоксических компонентов, в том числе нитроксидных и кислородных радикалов (Borregaard N., 2010). В настоящей работе проводились исследования по влиящио хантавируса на морфологическую и ферментативную активность нейтрофилов. Нами установлено, что вирусные частицы обнаруживались в фагосомах нейтрофилов через 15 мин, а через 2 ч после заражения происходила экскреция гранул нентрофила во внеклеточное пространство (рис. 1). В последующем, в цитоплазме нейтрофилов отмечалось повышение количества свободнолежащих рибосом, что, вероятно, было связано с активным синтезом белкового компонента. Через 24 ч после заражения фагосомы нейтрофилов, содержащие вирусные частицы, увеличивались в размерах и, в них наблюдалось формирование многослой[1ых мембран. Исследования архитектоники поверхности нейтрофилов показали, что при воздействии вируса в течение 15 мин обнаруживались признаки специфической стимуляции клеток, а уже через I ч выявлялись фагоциты с наличием на поверхности экзоцитированных компонентов (рис. 2). 10 #а I >' »'", ' ''íi Ом Рисунок 1 - У л ь т р а с т р у к т у р н ы е изменения з а р а ж е н н ы х хантавирусом н е й т р о ф и л о в : а) вирусные частицы в фагосомах (Ф) нентрофила - 15 м и н ; б) э к с к р е н и я гранул (Г) нейтрофила во внеклеточное пространство - 2 ч; в) образования из м н о г о с л о й н ы х 0слн10(1>илы1ых м е м б р а н (Ом), с ф о р м и р о в а н н ы е н е й т р о ф и л о м в ответ на заражение вирусами ~ 24 ч. Рисунок 2 - А р х и т е к т о н и к а поверхности нейтрофилов: а) интактная культура клеток; нейтрофилы после 15 (б), 45 мин (в), и 1 ч (г) после заражения хантавирусом. Длина отрезка соответствует; а) 2 ц т ; б, в) 1 ц т ; г) 2 ц т . 11 Таким образом, установлено, что хантавирус способен адгезировать к наружной мембране нейтрофилов и изменять архитектонику их поверхности. Поглощение вируса этими клетками, преимущественно, происходило с помощью фагоцитоза, после чего в фагосомах обнаруживался лизис его оболочек. В последующем морфология таких клеток изменялась, увеличивался их размер, в околоядерном пространстве отмечался активный синтез белкового компонента, а в периферической части цитоплазмы, напротив, снижалось количество гранул, и наблюдался ее отек, что указывало на цитолитическое действие хантавируса. Для комплексной оценки активности кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов нами были проведены цитохимические исследования активности ферментов миелопероксидазы, лактатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и внутриклеточного содержания катионных белков. Также исследовали активность нитроксидобразующей системы нейтрофилов, зараженных хантавирусом, путем определения уровня конечных продуктов оксида а з о т а нитритов. Известно, что 5'-нуклеатидаза катализирует гидролиз преимущественно аденозинмонофосфатов и инозинмонофосфатов и может также катализировать гидролиз дезоксирибонуклеозидмонофосфатов. Нами установлено, что на фоне увеличения числа антигенположительных клеток в нейтрофилах регистрировалось повышение активности этого фермента. Помимо этого, определено, что динамика активности 5'-нуклеатидазы совпадала с изменением активности АТФазы (рис. За). Наименьшая активность ферментов отмечалась через 15 мин после заражения. Это указывало на выраженную стимуляцию нейтрофилов, зараженных хантавирусом, что нашло отражение в изменении архитектоники их поверхности. На наш взгляд, обнаруженное нами в поздние сроки инкубации повышение внутриклеточного содержания 5'-нуклеатидазы в нейтрофилах, зараженных хантавирусом, можно связать с началом активации нуклеозид Ж время инкубации, ч I брсмл инкубации, ч Рисунок 3 — А к т и в н о с т ь ф е р м е н т о в в и н ф и ц и р о в а н н ы х хантавирусом нейтрофилах п е р в и ч н о й культуры: а) 5 ' - и у к л е о т и д а з ы (1) и А Т Ф а з ы (2): б) Л Д [ ' (3) и Ц Х О (4). 12 трнфосфатаз и нуклеотндаз, которые, в свою очередь, принимают участие в синтезе белкового компонента, выделяемого клетками во внеклеточное пространство. Для синтеза собственных нуклеиновых кислот и белковых компонентов вирусы могут использовать ферментные системы самой клетки без их модификации, либо индуцировать синтез новых, не свойственных ей ферментов. Одномоментно, активность собственных клеточных энзимов резко угнетается (Веугаи М. et al., 2012; Tecle Т. et al., 2007). Известно, что нарушение передачи электронов по электроннотранспортнои цепи митохондрий и клеточных мембран при стимуляции нейтрофнла приводит к появлению активных метаболитов кислорода, которые нестабильны и реактивны (Tecle Т. et al., 2007). Их действие улавливается теми мишенями, которые находятся в непосредственной близости. К таким мишеням относят различные соли тетразолия, используемые в качестве субстратов для определения активности ферментов. Установлено, что в нейтрофилах, зараженных хантавирусом, в образовании активных метаболитов кислорода была задействована ЛДГ, а также комплекс IV дыхательной цепи с участием ЦХО, активность которой отражает образование основного аниона кислорода, на это указывало повышение индекса стимуляции к 4 ч инкубации (рис. 36). Нейтрофилы относятся к клеткам с преимущественно аэробным типом обмена, а повышение в них активности ЛДГ связывают с изменениями интенсивности гликолиза. Образование богатых энергией фосфорных соединений путем анаэробного гликолиза свидетельствует об интенсификации энергообеспечения нейтрофилов. Этот путь окисления может быть расценен как компенсаторный механизм адаптивной реакции этих клеток на воздействие стимула. Обнаруженную в начальные сроки после заражения хантавирусом сниженную активность ЛДГ в нейтрофилах, на наш взгляд, следует расценивать как снижение энергетического потенциала клетки, связанного с ее адаптивной реакцией на внедрение возбудителя. Относительная стабильность в энергетическом гомеостазе нейтрофилов, зараженных хантавирусом, отмечалась только в поздние сроки наблюдения, когда индекс стимуляции повышался. Эти данные были подтверждены результатами исследования активности МПО. Известно, что до 90 % потребленного нейтрофилами кислорода идет на образование супероксидного радикала, а затем перекиси водорода (Witko-Sarsat V. et al., 2000). Для ликвидации превышающего количества вредных окислителей клеточных компонентов, к которым относят активные метаболиты кислорода, в фагоцитах существует ряд ферментных систем ант1юкислителей. К числу таковых принадлежит МПО, субстратом для которой является перекись водорода. Выявленная в поздние сроки контакта повышенная активность МПО в зараженных хантавирусом нейтрофилах отражала их защитную реакцию на внедрение данного инфекта. Нами показано, что в начальный период заражения хантавирусом в нейтрофилах активируются преимущественно компоненты кислород- 13 независимой системы, на это указывало повышение внутриклеточного содержания катионных белков. Эти данные указывают на первоначальную стимуляцию синтеза катионных белков нейтрофилами в ответ на внедрение хантавируса с последующим их расходованием. Экскреция этого биологического компонента была подтверждена с помощью сканирующей электронной микроскопии. Таким образом, установлено, что под влиянием хантавируса в нейтрофилах резко угнетается активность собственных клеточных энзимов, что снижает способность этих клеток к реализации защитных механизмов в ответ на внедрение инфекционного агента. Синтеза вирусных компонентов в этих фагоцитах нами не обнаружено, и, в этом случае, можно говорить только о цитотоксическом действии этого вируса на нейтрофилы. Взаимодействие субпопуляций клеток мопоцитарпого с хантавирусом ряда Известно, что клетки миелоидного происхождения моноциты/макрофаги действуют как стражи в периферических тканях. Присутствие в эпителии и интерстиции легких, являющихся местом проникновения хантавируса, обусловливает возможность воздействия на указанные клетки инфекционного агента (Lambrecht B.N. et al., 2001; Nicod L.P., Cochand L., 2001; Peebles R.S. et al., 2001). Следует отметить, что при размножении некоторых вирусов в макрофагах их цитопатическое воздействие морфологически не выражено (Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2008). В нашей работе с помощью сканирующей микроскопии (рис. 4) впервые показано, что архитектоника поверхности макрофагов уже через 5 минут после заражения хантавирусом изменяется. Так, наблюдаются многочисленные складки на поверхности клеток и увеличение их адгезивной активности. Через 2 ч обнаруживалась секреция макрофагов, что проявлялось появлением обильного межклеточного вещества на их поверхности. В это же время, наблюдалось уменьшение количества складок на поверхности клеток, увеличение выямок в плазмалемме и округление. Через 24 ч после заражения хантавирусом отмечалась выраженная вакуолизация клеток и признаки деградации. Указывается, что многие вирусы (Пуумала, Хунин, Хантавирус и вирус клещевого энцефалита) используют в качестве клеток-мишеней для размножения моноциты/макрофаги (Temonen М. et al., 1993, 1994; Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2008). При этом вирус Денге способен заражать популяции моноцитов/макрофагов вне зависимости от стадии их дифференцировки (Chen Y.C. et al., 2002), тогда как скорость размножения вируса иммунодефицита человека в клетках коррелирует со степенью зрелости фагоцитов (Le DouceV. et al., 2010). Причем, вирус Западного Нила и полиовирус способен к репродукции только в зрелых макрофагах (Rios М. et al., 2006). Т. Narasaraju с соавторами (2011) установили, что у модифированных мышей с выключенным геном дифференцировки клеток 14 шШ Рисунок 4 - А р х и т е к т о н и к а поверхности п е р и т о н е а л ь н ы х макрофагов: а) пнгактная к} льт\ ра клеток: м а к р о | | ) а т после 5 (б). 30 ммм (в. г). н 2 (д). 24 (е) м после заражеппя хаптавпрусом. Длина отрезка соответствует: а) 2 ц т ; б) 3 (пп: в. I ) 200 п т ; д) 1 (.пп: е) 2 ц т . С к а п п р ) ю н и я электроппая м и к р о с к о п и я . мпелоидного происхождения в макрофаги, после заражения хантавирусом, определялось затруднённое дыхание, потеря веса и увеличивался процент смертности (40 %). Тогда как. у интактных животных при этой инфекции респираторный дистресс и смертность не выявлялись. В наших исследованиях показано, что количество антигенсодержащих фагоцитов повышалось с увеличением степени дифференцировкн моноцитарных клеток. Максимальные значения наблюдались в популяции резидентных макрофагов - альвеолярных и перитонеальных. Подобные результаты были выявлены при исследовании активности 5'нуклеотидазы и АТФазы в клетках моноцитарного ряда, зараженных хантавирусом. При этом в моноцитах, без предварительной инкубации, активность данных ферментов не изменялась, оставаясь в пределах контрольных значений, тогда как в моноцитах. предварительно инкубированных в течение 18 ч, она обнаруживалась через 3 и 8 ч. а в макрофагах - через 5-6 ч после заражения. В тоже время в альвеолярных макрофагах, зараженных хантавирусом, активность ферментов выявлялась на протяжении всего срока наблюдения. 15 Клетки моиоцитарного ряда, подобно нептрофилам, способны под влиянием различных факторов мгновенно генерировать кислородные радикалы. В ответ на заражение хантавирусом в моноцитах/макрофагах определялось повышение активности кислородзависимых ферментных систем, к которым относятся митохондриальные ферменты третьего порядка - сукцинатдегидрогеназа (СДГ), ЛДГ и ЦХО. Наибольшая активность указанных ферментов отмечалась в моноцитах, предварительно инкубированных в течение 18 ч, что свидетельствует о стимулирующем действии хантавируса на моноциты/макрофаги. В то же время, в альвеолярных макрофагах наблюдалась несостоятельность кислородобразующей системы, которая, на наш взгляд, является последствием цитотоксического действия вируса. В последнее время клеткам моноцитарной линии при вирусном инфицировании придается важное значение, определяемое их способностью в активном состоянии продуцировать оксид азота, который оказывает влияние на синтез интерферона у н фактора некроза опухоли а. Нами была установлена несостоятельность нитроксидобразующей активности как в незрелых, так и в дифференцированных моноцитах, зараженных хантавирусом. Тогда как, в резидентных макрофагах было обнаружено образование нитритов при максимальных значениях через 48 ч после заражения, что можно расценивать как проявление этими клетками эффекторных функций. Функциональная активность макрофагов, заралсенных хантавирусом, нри воздействии на них NK-KJiemoK Известно, что при вирусных заболеваниях NK-клетки принимают участие в ранней фазе защиты организма с последующей индукцией каскада реакций адаптивного иммунитета (Lanier L.L., 2008). Они обладают широким набором рецепторов, позволяющих им распознавать клетки-мишени и отличать здоровые клетки от пораженных вирусами. Исследования уникальных свойств этих клеток начаты от1юсительно недавно и изучение их вирулицидности проводилось в основном на организменном уровне. На модели in vitro выявлено, что NK-клетки способны предотвращать заражение флавивирусом Западного Нила клеток культуры Vero (Ziiang М. et al., 2010), ограничивать инфекцию в гепатоцитах, вызванную вирусом гепатита С (Yuan J.Р. et al., 2003). В нашей работе мы использовали NK-клетки, полученные из селезенки морских свинок, и оценивали их влияние на функциональную активность макрофагов, зараженных хантавирусом. При сравнении активности зараженных и незараженных NK-клеток в отношении макрофагов установлено, что активность ферментов кислород- и нитроксидобразующей систем были выше в интактных клетках, чем в предварительно зараженной вирусами популяции макрофагов (рис. 5). Эти данные указывали на выраженную цитотоксическую активность NK-клеток в отношении популяции макрофагов, инфицированных вирусом. 16 Бремя HHKY^-utK ti . ч ¿fL Вречг инкуФац!" и, ч в) Рисунок 5 - А к т и в н о с т ь ферментов в и и ф и и и р о в а и и ы х хамтавир) сом ма1фО(|)г1гах. после воздействия иа них ЫК-клеток. через 2 ( I ) и 24 (2) ч инкубации: а) СД!"; б) Ц Х О : в) внеклеточное с о д е р ж а н и е метаболитов оксида азота. Л - пмтактпые м а к р о ф а г и , после воздействия нреактивированных хантавирусом ЫК-к.четок; В макрофаги, иредварительно з а р а ж е н н ы е х а н т а в и р у с о м . после воздействия па них нптактиых ЫКклеток: С - макро(|)аг11. предварительно з а р а ж е н н ы е х а н т а в и р у с о м . после воздействия на них н р е а к т и в и р о в а н н ы х хантавирусом ЫК-клеток. Характеристика дендритных iciemoK, заражени ых хантавирусом Для формирования полноценного иммунного ответа, в том числе и противоинфекцнонного. необходимо наличие антигенпредставляющих клеток, среди которых наиболее важными являются дендритные клетки (ДК). Их морфология, фенотип и функции претерпевают значительные изменения в процессе днфференцировки из гематопоэтических CD34' клеток, предшественников из костного мозга. На первом этапе незрелые ДК циркулируют в крови, где приобретают способность к захвату и процессингу антигенов. В дальнейшем ДК мигрируют в органы, где впоследствии индуцируется их антигенпредставляюшая функция, что определяет их ключевую роль в развитии иммунных реакций организма (Прокопович С.К., Винниции В.Б., 2001; Алексеенко О.И. и др., 2006). M.J. Raftery с соавторами (2002) обнаружили, что хантавирус способен проникать и размножаться в ДК, полученных из моноцитарных дериватов пуповинной и периферической крови человека. Причем эти ДК обладали способностью стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов в той же степени, что и ДК после TNF-a-опосредованного созревания (Lui G. et al., 2009). Сообщалось, что антиген хантавируса может локализоваться в фолликулярных ДК селезенки и лимфатических узлов (Zaki C.R. et al., 1995). В рамках настоящей работы установлены особенности влияния хантавируса на процесс дифференцировки ДК, полученных из костного 17 мозга морских свинок. С помощью сканирующей микроскопии выявлено, что размеры клеток на 9 сутки инкубации различались в зависимости от вносимого индуктора созревания (рис. 6). Так размеры ДК, индуцированных TNF-a, составили 8-10 нм, а клеток, индуцированных хантавирусом - 15-30 нм. Эти данные указывают на то, что под воздействием хантавируса ДК достигали максимальных размеров быстрее, чем ДК, индуцированные ТЫР-а. Также определено, что в незрелых и индуцированных TNF-a ДК активировалась преимущественно сукцинатоксидазная система. Тогда как в ДК, индуцированных хантавирусом, наблюдалась сниженная активность СДГ по сравнению с ЛДГ. При заражении хантавирусом незрелых ДК, количество антигенсодержащих клеток было небольшим, а в популяции клеток, где в качестве (шдуктора созревания использовался TNF-a, их количество составило около 25 %. Наибольший процент таких клеток наблюдался в популяции ДК, индуцированных хантавирусом. При этом в этих ДК через 3 суток после заражения вирусом, специфический антиген выявлялся как на поверхности, так и в дендритных отростках (рис. 7). При изучении ферментативной активности клеток, было установлено, что хантавнрус в большей степени стимулирует популящио ДК, дифференцированных под его влиянием, тогда как активация незрелых ДК не выявлена. В то же время, под влиянием хантавируса в ДК обнаруживается активация сукцинатдегидрогеназной кислородобразующей системы в незрелых и индуцированных ТМР-а, а в популяции клеток, индуцированной хантавирусом, выявляется активность лактатдегидрогеназы (рис. 8). Из литературы известно, что неспецифические эстеразы экспрессируются только в незрелых предшественниках ДК (Прокопович С.К., Винницкий В.Б., 2001). Тем не менее, нами определено повышение активности неспецифической эстеразы в ДК в ответ на внесение хантавируса. Так, в популяции клеток, индуцированной хантавирусом, активация данного фермента наблюдалась через 24 ч, тогда как в незрелых ДК — через 48 ч после заражения. В то же время в популяции, индуцированной ТТЧГ-а, активация фермента не выявлялась. Результатов исследований, связанных с нитроксидобразующей активностью ДК, 1Н1фицированных вирусом, в литературных источниках нами не обнаружено. В популяции недифференцированных и индуцированных вирусом ДК на начальных сроках после заражения хантавирусом установлена внутриклеточная продукция нитритов, с последующим выбросом во внеклеточное пространство. Тогда как в ДК, индуцированных ТЫР-а, внутриклеточная продукция 1И1трнтов не выявлялась, что объяснялось деградацией культуры вследствие цитотоксического действия хантавируса. Итак, успехи последних лет в изучении факторов врожденного иммунитета показали их существенную значимость в гомеостазе организма, при формировании его ответа на воздействие патогенов. Основой врожденного иммунитета являются процессы воспаления и фагоцитоза и его 18 Рисунок 6 - Д м ф ф е р е и ш ф о в г и т ы е д е н д р и т н ы е клетки на 9 сутки зшкубашн!: Л дендритная клетка, иидунированная ТЫР-а. рачмеры 8-10 им. X I |.нп; 15 - д е н д р и т н а я клетка, и н д у ц и р о в а н н а я х а н т а в и р у с о м . ра'5меры 15-30 им. X 10 ц т . Метод ска1Н1ру1ои1ей •\н1кроскоиин. Рисунок 7 - Скопление хаитавнрусиых частиц (Вч) на новсрхносги (а) н на отростках (б) дендритн1,1х клеток. нндуцнрованиь[х х а ш а в и р у с о м . через 4 сут. инкубации, X 1 (.ни. 19 3| -15 • 1 02 03 94 ОБ иб Я7 024 0.18 •щ Время инкубации, ч а) время инкубации, ч 6) Рисунок 8 - А к т и в н о с т ь ферментов к и с л о р о д з а в и с и м о г о метаболизма д е н д р и т н ы х клеток, и н ф и ц и р о в а н н ы х хантавирусом. а) Л Д Г ; б) С Д Г ; в) Ц Х О . А - незрелые д е н д р и т н ы е Ю1етки; Б — д е н д р и т н ы е клетки, и н д у ц и р о в а н н ы е ТЫР-а; В - д е н д р и т н ы е Ю1етки. и н д у ц и р о в а н н ы е хангавир)'сом. факторы обладают генетическими неклональными механизмами распознавания и элиминации патогенов. Эти свойства определяют важнейшую инициирующую и регулирующую роль клеточных факторов врожденной защиты организма в развитии специфических иммунных реакций при вирусных инфекциях. Наряду с вышеизложенным, необходимо отметить, что на настоящий момент неоправданно мало внимания уделяется исследователями проблеме изучения процессов, связанных с функциональными изменениями, происходящими в инфицированных вирусами клетках. Таким образом, в свете совокупности полученных в последние десятилетия данных необходимо расширить исследования, связанные с оценкой функционального состояния инфицированных вирусом клеток. ВЫВОДЫ 1. Обнаружено изменение архитектоники поверхности нейтрофилов в ответ на внедрение хантавируса. Поглощение вируса клетками преимущественно происходило путем фагоцитоза. В динамике инфекции в цитоплазме клеток отмечалось снижение количества гранул и 20 2. 3. 4. 5. 6. 7. обнаруживалось выделение белкового компонента во внеклеточное пространство. Установлено цптотоксическое действие хантавируса на нейтрофилы, которое проявлялось в снижении активности ферментов кислородзависимой системы лактатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и миелопероксидазы. Определено, что хантавирус не оказывает активирующего эффекта на моноциты периферической крови, тогда как в отношении моноцитов, предварительно, до заражения инкубированных в течение 18 ч, обнаруживалось его выраженное действие, которое проявлялось в повышении активности их сукцинатоксидазной кислородзависимои системы. Установлено, что при воздействии хантавируса реализуется защитная реакция перитонеальных макрофагов при активации компонентов кислородзависимой и нитроксидобразующей систем. В альвеолярных макрофагах, зараженных хантавирусом, на фоне повышения уровня нитритов и их выделения во внеклеточное пространство, отмечалось снижение активности ферментов кислородобразующей системы, что указывало на проявление эффекторной функции этих клеток. Определено, что NK-клeтки стимулируют активность макрофагов, инфицированных хантавирусом. При этом ЫК-клетки, контактировавшие с вирусом, по сравнению с интактными, оказывали более выраженное цптотоксическое действие на инфицированные им макрофаги. Установлено, что морфологические изменер1ия и выраженность функционального состояния дендритных клеток на 9-е сутки инкубирования зависят от вносимого индуктора созревания. Под влиянием хантавируса клетки увеличивались в размерах и находились в активированном состоянии, о чем свидетельствовали показатели активности АТФазы и ферментов кислородзависимой системы. Определено, что хантавирус не оказьшал активирующего эффекта на незрелые дендритные клетки, тогда как в отношении индуцированных проявлялось его выраженное действие. В зараженных хантавирусом дендритных клетках, предварительно им индуцированных, ироисходили выраженные морфологические изменения, которые сопровождались стимуляцией aктив^юcти их кислородзависимой и 1И1троксидобразуюшей систем. СПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК Мннобрнаукн РФ: 1. Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Ляпун И.Н., Смирнов И.С. Метаболическая активность макрофагов, зараженных энтеровирусами // Иммунол., аллергол., инфектол. 2011. № I. С. 71-77. 21 3. 4. 5. 6. 7. 8. Ляпун И.Н., Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Дробот Е.И., Крылова Н.В., Максема И.Г Функциональная активность нентрофилов, зараженных РНК-содержащимн вирусами // Тихоокеанский мед. жури. 2012. № 1. С. 93-96. Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Ляпун И.Н., Крылова Н.Э., Леонова Г.Н. Индукция апоптоза нейтрофилов вирусом клещевого энцефалита // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2012. Т. 153, № 1.С. 105-108. Plekhova N.G. Somova L.M., Lyapun I.N., Slonova R.A., Kompanets G.G. The cells of innate immunity in hemorrhagic fever with renal syndrome // International J. Infect. Dis. 2012. Vol. 16, Sup. 1. P. e91. Плехова Н.Г., Ляпун И.Н., Сомова Л.М., Компанец Г.Г., Смирнов И.Н. Реактивность клеток врожденного иммунитета в патогенезе хантавнрусной инфекции / Бюл. ВСИЦ СО РАМН. 2012. Т. 85, № 3. С. 296-300. Ляпун И.Н., Плехова Н.Г., Компанец Г.Г., Смирнов И.С., Сомова Л.М. Морфофункциональная характеристика нейтрофилов, зараженных хантавирусом // Бюллетень СО РАМН. 2013. Т. 33, № 2. С. 26-31. Патент: патент РФ «Способ определения степени цитопатогенности вирусов» (Пат. на изобр. № 2466190). Авторы: Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, И.Н. Ляпун. Заявитель и правообладатель: ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН. - 2011112215/10. Заявл. 30.03.2011. Опубл. 10.11.2012 Бюл. № 31. Базы данных: 9. 10. База данных РФ «База данных изменений морфологии биологических образцов при исследовании методом растровой электронной микроскопии (MBSEM)» (База данных № 2012620669). Авторы: И.С. Смирнов, Н.Г. Плехова, И.Н. Ляпун, Е.В. Пустовалов, B.C. Плотников, А.В. Колесников. Зарегистрирована 10.07.2012 г. База данных РФ «Результаты исследований морфофункциональной активности клеток врожденного иммунитета методами конфокальной микроскопии и спектрофотометрии (RICS)» (База данных № 2012620987). Авторы: И.С. Смирнов, Н.Г. Плехова, И.Н. Ляпун, Е.В. Пустовалов, B.C. Плотников. Зарегистрирована 12.09.2012 г. Работы, опубликованные в научных журналах, сборниках трудов н материалах конференций: 11. Plekhova N.G. The cells of innate systems in Tick-Borne Encephalitis / N.G. Plekhova, L.M. Somova, I.N. Lyapun, N.M. Kondrashova, N.V. Krylova, G.N. Leonova, E.V. Pustovalov // In: Filovirus Encephalitis (ed: Daniel Rui iz iek). Croatia. 1NTECH.2011. P. 167-194. 22 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Ляпун И.Н. Воздействие РНК-содержащих вирусов на функциональную активность нейтрофилов / Ляпун И.Н., Н.Г. Плехова, Н.В. Крылова, И.Г. Максёма, Л.М. Co^ювa // V Всероссийская научнопрактическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (12-14 апреля 2011). Россия, Новосибирск. 2011. С. 126127. Нлехова Н.Г. Биохимические маркеры энтеровирусной инфекции в макрофагах / Н.Г. Нлехова, И.Н. Ляпун, Е.И. Дробот, Л.М. Сомова // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов» (12-14 апреля 2011). Россия, Новосибирск. 201 I . e . 174-175. Ляпун И.Н. Способы проникновения РНК-содержащих вирусов в эукариотические клетки / И.Н. Ляпун, Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // X Региональная конференция студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (май 2011). Владивосток. 2011. Издательство Дальневосточ1юго Университета. С. 150-155. Плехова Н.Г. Ультраструктура клеток врожденного иммунитета, зараженных хантавирусом / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, В.В. Пустовалов, И.Н. Ляпун, Г.Г. Компанец // XXIV Российская конференция по электронной микроскопии (РКЭМ-2012) (с 29 мая по 1 июня 2012). Россия, Черноголовка. Ляпун И.Н. Архитектоника поверхности нейтрофилов под воздействием хантавируса / И.Н. Ляпун, Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, И.С. Смирнов, Г.Г. Компанец // XXIV Российская конферещщя по электронной микроскопии (РКЭМ-2012) (с 29 мая по 1 июня 2012). Россия, Чер1юголовка. Ляпуи И.Н. Изменение метаболизма нейтрофилов, зараженных хантавирусом / И.Н. Ляпун, Н.Г. Нлехова, Г.Г. Компанец, Л.М. Сомова // XIV Всероссийская молодежная щкола-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (17-21 сентября 2012). Россия, п. Рисовая падь. Морская экспериментальная станция. Ляпун И.Н. Морфофункциональная характеристика нейтрофилов, зараже1тых хантавирусом / И.Н. Ляпун // Первые научные чтения, посвященных памяти академика РАМН Г. П. Сомова «Будущее науки за молодыми учеными» (2 октября 2012). Владивосток. Плехова Н.Г. Нитроксидобразующая активность клеток врожденного иммунитета при вирусных инфекциях / Н.Г. Нлехова, Л.М. Сомова, И.Н. Ляпун. И.С. Смирнов, Г.Г. Компанец, Н.В. Крылова // XX международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, б1юлопш, фармакологии и экологии» (с 25 мая по 4 июня 2012). Россия. Гурзуф. Plekhova N.G. The cells of innate immunity in hemorrhagic fever with renal syndrome / N.G. Plekhova, L.M. Somova, G.G. Kompanets, I.N. Lyapun, 23 21. 22. 23. 24. 25. R.A. Slonova // 15th International Congress on Infectious Diseases (13-16 June 2012). Thailand, Bangkok / International Journal of Infectious Diseases. 2012. V. 16, Sup. 1. P. 91. Плехова Н.Г. Биохимические маркеры цитопатогенности вирусов в макрофагах / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, И.Н. Ляпун, И.С. Смирнов // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № I . e . 72. Lyapun I.N. The cells of monocytes system infected by Hantavirus / I.N. Lyapun, N.G. Plekhova, G.G. Kompanets, L.M. Somova // IX International Conference on HFRS HPS & Hantaviruses (June 2013). Chine, Beijing. 2013. P. 72-73. Plekhova N.G. The influence of Hantavirus on the cells of innate immunity / N.G. Plekhova, I.N. Lyapun, G.G. Kompanets, L.M. Somova // IX International Conference on HFRS HPS & Hantaviruses (June 2013). Chine, Beijing. 2013. P. 71-72. Ляпун И.Н. Разработка клеточных систем для моделирования вирусных инфекций / И.Н. Ляпун, Н.Г. Плехова, Е.И. Дробот, Л.М. Сомова // VI Всероссийский с международным участием Конгресс молодых ученыхбиологов «Симбиоз-Россия 2013» (19-23 августа 2013). Россия, Иркутск. 2013. С. 92-94. Ляпун И.Н. Ультраструктура нейтрофилов, зараженных вирулентным и авирулентным штаммами хантавируса / И.Н. Ляпун, Н.Г. Плехова, Е.В. Пустовалов, Е.И. Дробот, Л.М. Сомова, Г.Г. Компанец // XXV Российская конференция по электронной микроскопии (2-6 июня 2014). Россия, Черноголовка. 2014. Т. 2. С. 610-611. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФаза - аденозинтрифосфатаза СДГ - сукцинатдегидрогеназа ДК - дендритные клетки ЦХО - цитохромоксидаза ЛДГ - лактатдегидрогеназа NK-клетки МПО - миелопероксидаза киллерные клетки нМФА - непрямой флуоресцирующих антител метод - натуральные TNF-a - фактор некроза опухоли а ЛЯПУН Ирина Николаевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ХАНТАВИРУСОМ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уч. нзд. л. 1 , 0 Т и р а ж 100 экз. Формат 60x84/16 Заказ № 5 4 8 П о д п и с а н о в печать 10.12.2014 О т п е ч а т а н о в т и п о г р а ф и и ИП Ю р ч е н к о Лариса Викторовна 690078, г. Владивосток, ул. Комсомольская, д. 3, о ф и с 305 тел. 8 902 48 900 30
