предтрансплантационное введение донорских лимфоцитов

ПРЕДТРАНСПЛАНТАЦИОННОЕ ВВЕДЕНИЕ ДОНОРСКИХ
ЛИМФОЦИТОВ ПРОЛОНГИРУЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ АЛЛОГЕННОЙ
ТКАНИ ЯИЧНИКОВ У ОВАРИЭКТОМИРОВАННЫХ
ЖИВОТНЫХ-РЕЦИПИЕНТОВ
Божок Г. А., Кирошка В. В., Тищенко Ю. О.1 , Легач Е. И.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков;
1
Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина, г. Харьков
Заболевания репродуктивной системы
являются причиной бесплодия, ранней менопаузы и сопутствующих заболеваний
(остеопороз, нарушение сердечно-сосудистой системы и т. д.) у женщин. В связи
с этим в настоящее время активно применяются вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Трансплантацию овариальной ткани как один из методов ВРТ используют у женщин, подвергающихся радиохимиотерапии при онкологических заболеваниях [1, 2].
Выживаемость трансплантата напрямую зависит от активации иммунного ответа реципиента на чужеродную ткань и может быть улучшена путем применения
иммуносупрессивных препаратов [3]. Однако использование иммуносупрессии при
трансплантации эндокринных тканей является нежелательным, так как может
нарушить функцию пересаженной ткани [4]. Кроме того, пожизненный прием иммуносупрессантов приводит к тяжелым осложнениям и даже смерти реципиентов [3, 5]. В связи с этим актуальной
задачей является поиск способов продления функционирования трансплантата пу-
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
тем использования физиологических механизмов регуляции иммунного ответа, к которым относится индукция специфической
толерантности.
Привлекает внимание экспериментально установленный феномен так называемой «донор-специфической толерантности»
(ДСТ), которая может быть индуцирована путем претрансплантационного введения донорских лимфоцитов реципиенту [6].
Эффект ДСТ был установлен при аллотрансплантации органов у экспериментальных животных, когда им за несколько дней
до трансплантации в кровоток вводили лимфоциты, полученные из лимфоузлов или
селезенки [6, 7, 8]. Наступление состояния
толерантности к трансплантату зависело
от места введения (периферические сосуды
или портальная вена печени) [9], периода
времени от введения лимфоцитов до трансплантации [10], повторности претрансплантационных обработок [11].
Целью настоящей работы была оценка
влияния претрансплантационного введения
донорских лимфоцитов на выживаемость
аллогенной ткани яичников у овариэктомированных животных.
79
Експериментальнi дослiдження
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все манипуляции с животными проводились в соответствии с положениями «Европейской конвенции защиты позвоночных
животных, которые используются с экспериментальной и иной научной целью»
(Страсбург, 1985) и национальными нормами по биоэтике (I Национальный конгресс
по биоэтике, Киев, 2001).
Исследования проводили на 3–4-месячных крысах самках линий Вистар и Август.
Реципиентами были крысы линии Август.
В эксперименте использованы следующие группы животных: группа 1 — интактный контроль (n = 10), группа 2 — овариэктомированные крысы (n = 8), группа 3 — овариэктомированные крысы с изотрансплантацией (n = 6), группа 4 — овариэктомированные крысы с аллотрансплантацией (n = 8), группа 5 — овариэктомированные крысы с предтрансплантационным введением лимфоцитов и аллотрансплантацией
(n = 8).
Крысы линии Август были подвергнуты овариэктомии [12], непосредственно после которой осуществляли аллотрансплантацию яичников, полученных от неонатальных крысят линии Вистар. Неонатальные
яичники после экстирпации были отмыты 3–4 раза в физиологическом растворе
и трансплантированы под капсулу левой
почки в количестве двух штук на одного реципиента.
Для изотрансплантации брали неонатальные яичники от крыс линии Август, которые пересаживали половозрелым самкам
линии Август.
Из селезенки крыс линии Вистар получали лимфоциты [13]. От эритроцитов
избавлялись путем трехкратной обработки
клеточной суспензии раствором, содержащим 154 мМ хлорида аммония, 10 мМ би-
карбоната натрия, 0,082 мМ ЭДТА. Жизнеспособность полученных клеток, которую
проверяли методом суправитального окрашивания трипановым синим, составляла,
в среднем, 90 %.
Животным 5 группы за 7 дней до трансплантации в портальную вену печени вводили 1 мл физиологического раствора, содержащего лимфоциты селезенки в количестве
1 × 107 .
Все операции проводили под комбинированным наркозом (кетамин — 2,5 мг, ксилазин — 1 мг на 100 г массы тела).
На 30 сутки после трансплантации животных забивали. Выживаемость трансплантата оценивали по двум параметрам:
уровню половых гормонов сыворотки крови
и сохранности структуры ткани трансплантата на гистологических образцах.
Концентрации эстрадиола и прогестерона измеряли радиоиммунологическим методом с помощью тест-наборов РИА-Эстрадиол-СТ и РИА-Прогестерон-СТ (Беларусь).
Для гистологического анализа почки
с трансплантатами фиксировали в 10 %
формалине и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Статистическую обработку данных
уровня половых гормонов в сыворотке крови проводили с помощью программного
приложения Excel. Данные представлены
как среднее X-значений, полученных в двух
аналогичных экспериментах и измеренных
в двух параллельных пробах, ± стандартная ошибка SX . Статистическую достоверность оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, достоверными
считались различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что на 30 день после
овариэктомии у крыс в сыворотке крови наблюдается уменьшение уровня эстрадиола на 78 % и прогестерона на 88 %
80
по сравнению с контрольными животными
(рис. 1).
У овариэктомированных животных
со всеми тремя видами трансплантаций
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
Експериментальнi дослiдження
Рис. 1. Концентрация эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови экспериментальных животных.
(Группы животных: 1 — интактный контроль; 2 — овариэктомированные; 3 — овариэктомированные
с изотрансплантацией; 4 — овариэктомированные с аллотрансплантацией; 5 — овариэктомированные
с претрансплантационным введением лимфоцитов и аллотрансплантацией.
*, # — уровень эстрадиола и прогестерона достоверно отличается от контроля, р < 0,05).
Рис. 2. Гистологические препараты трансплантатов овариальной ткани на 30 сутки после трансплантации
под капсулу почки: а — изотрансплантация (ок. 5, об. 4); б — аллотрансплантация (ок. 10, об. 4);
в — предтрансплантационное введение лимфоцитов и аллотрансплантация (ок. 5, об. 4);
г, д, е — увеличение полей зрения 1, 2, 3 (ок. 10, об. 40).
(группы 3, 4, 5) уровень прогестерона был
в 4–6 раз выше, чем у крыс без трансплантации (40,0 ± 10,0; 39,4 ± 3,1; 61,4 ± 11,9
против 10,7 ± 2,4 нмоль/л, соответственно).
По сравнению с контрольными значениями
полной компенсации уровня прогестерона
у животных с трансплантациями не наблюдалось. Уровень прогестерона в 3 и 4 группах животных составлял 48 и 47 %, а в 5
группе — 74 % от контроля.
Увеличение уровня эстрадиола было отмечено в 3 и 5 группах животных в среднем в два раза по сравнению с овариэктомиПроблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
рованными крысами (16,0 ± 4,0; 15,4 ± 5,4
против 7,8 ± 1,7 нмоль/л ×102 ). По сравнению с группой интактного контроля значения уровня эстрадиола в 3 и 5 группах составляли 46 и 44 %. В 4 группе животных не
наблюдалось повышения уровня эстрадиола по сравнению с овариэктомированными
крысами.
В группе животных с предтрансплантационным введением донорских лимфоцитов
(группа 5) уровень половых гормонов был
выше, чем у животных с аллотрансплантацией (группа 4).
81
Експериментальнi дослiдження
Гистологический анализ выявил достаточно хорошо сохранившуюся структуру
ткани изотрансплантатов (рис. 2, а). В этом
случае на 30 сутки после трансплантации наблюдалась морфологическая структура яичников, характерная для половозрелых животных. Выявлены различные стадии фолликулогенеза, вплоть до антральной, а также желтые тела. Образование
участков склерозированной ткани не обнаружено.
Подобная морфологическая картина отмечается при аллотрансплантации неонатальных яичников с предварительным интрапортальным введением донорских лимфоцитов (рис. 2, в). На гистологических
срезах (рис. 2, д, е) отмечены фолликулы различной степени зрелости (примордиальные, первичные, преантральные и антральные), а также желтые тела, что свидетельствует о функциональной полноценности данного трансплантата. Видно образование антрального фолликула с яйцеклеткой на стадии формирования граафового
пузырька (рис. 2, г). Внутренняя полость
фолликула окрашена эозином и окружена
многочисленными слоями клеток гранулезы. Часть площади трансплантата представлена склерозированной овариальной тканью, пронизанной густой сетью кровеносных сосудов. Также в исследуемых трансплантатах наблюдается образование кистоподобных полостей с прозрачным внутренним содержимым, выстланных высокопризматическим четко контурированным эпителием (рис. 2, в). Лимфоцитарный барьер между тканью почки и трансплантатом практически отсутствует.
Качественно иная картина наблюдается в развитии аллографтов неонатальных яичников у животных-реципиентов без
предтрансплантационного введения донорских лимфоцитов. Они представлены склерозированной овариальной тканью, с чет-
ко выраженным лимфоцитарным барьером
(рис. 2, б ). Структуры ткани, характерные
для овариальной, отсутствуют.
Известно, что при аутологической или
сингенной трансплантации ткани в большинстве случаев не наблюдается отторжения [5]. Ауто- и изотрансплантат, пересаженный гетеротопически, может претерпевать дегенеративные структурно-функциональные изменения лишь в связи с недостаточностью васкулярной поддержки [14].
Это наблюдается и в нашем случае, когда
при изотрансплантации сохраняется морфологическая структура ткани, но уровень
гормональной активности ее снижен. При
аллотрансплантации без применения иммуносупрессии развивается классический иммунный ответ, который приводит к деструкции пересаженной ткани на 25–30 сутки после трансплантации.
Однако предтрансплантационное введение донорских лимфоцитов в портальную
вену печени позволило добиться того, что
на 30 сутки аллографт яичников сохранял
способность к выработке половых гормонов и морфологическую структуру, подобную нативной. Это свидетельствовует о том,
что такой подход способствовал пролонгированию выживаемости аллотрансплантата без использования экзогенных иммуносупрессантов.
Наше исследование было сфокусировано
на изучении возможности продления функционирования трансплантата эндокринной
ткани путем предтрансплантационного введения в организм реципиента клеток, несущих донорские антигены. В предыдущих
работах такая возможность была продемонстрирована при трансплантации печени [15],
островков Лангерганса [16], кожи и почки [17]. Нами была установлена лучшая выживаемость трансплантата ткани яичников
при донор-специфической сенсибилизации
организма реципиента.
ВЫВОДЫ
Предтрансплантационное введение в организм реципиента клеток, несущих донорские антигены, позволяет пролонгиро-
82
вать выживаемость аллогенного трансплантата ткани яичников у овариэктомированных животных.
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
Експериментальнi дослiдження
ЛИТЕРАТУРА
1. Грищенко В. I. Сучаснi аспекти репродуктологiї, перинатальної медицини та крiобiологiї [Текст]
/ В. I. Грищенко // Збiрник наукових робiт. . — Х.: [б. в.],
2003. — 274 с.
2. Грязнова И. М. Пересадка ткани яичника
в амниотической оболочке эффективный метод оперативного лечения яичниковой недостаточности [Текст]
/ И. М. Грязнова, Л. В. Балиос //Современные методы
оперативного лечения в акушерстве и гинекологии. —
М.: [б. и.], 1983. — С. 109–113.
3. Трансплантология [Текст]: Руков. для врачей
/ под ред. В. И. Шумакова. . — М.: Медицина, 1995. —
575 с.
4. Penfornis A. Immunosuppressive drug-induced
diabetes [Text] / A. Penfornis, S. Kury-Paulin // Diabetes
Metabol. — 2006. — Vol. 32, № 5. — P. 539–546.
5. Денисов В. К. Трансплантология [Текст]: учеб.
пособие / В. К. Денисов // К.: Наукова думка, 1998. —
248 с.
6. Prolonged cardiac allograft survival following portal
venous inoculation of allogeneic cells: What is «hepatic
tolerance?» [Text] / S. Kenick, R. P. Lowry, R. D. S. Forbes,
R. Lisbona // Transplant. Proc. — 1987. — Vol. 19. —
P. 478–479.
7.
Kamei
T.
Pretransplant
portal
venous
administration of donor antigen and portal venous allograft
drainage synergistically prolong rat cardiac allograft
survival [Text] / T. Kamei, M. P. Callery, M. W. Flye
// Surgery. — 1990. — Vol. 108. — P. 415–422.
8. Studies on the induction of tolerance to
alloantigens. 1. The abrogation of potentials for delayedtype hypersensitivity responses to alloantigens by portal
venous inoculation with allogeneic cells [Text] / J. H. Qian,
T. Hashimoto, H. Fujiwara, T. Hamaoka // J. Immunol. —
1985. — Vol. 134. — P. 3656–3662.
9. Prolongation of rat kidney graft survival after
inoculation of allogeneic spleen cells: the effect of various
routes of cell transfer [Text] / A. Oko, I. Idasiak-Piechocka,
K. Pawlaczyk [et al.] // Ann. Transplant. — 2002. — Vol. 7,
№ 2. — P. 51–53.
10. Impact of 70 % partial hepatectomy on
administration
of
donor
leukocytes
in
cardiac
transplantation in rats [Text] / Y. Sato, O. Farges,
D. Buffello [et al.] // Transplant. Proc. — 1998. — Vol. 30. —
P. 3873–3875.
11. Repeating intraportal donor-specific transfusion
may induce tolerance following adult living-related donor
liver transplantation [Text] / Y. Sato, T. Ichida,
H. Watanabe [et al.] // Hepatogastroenterology. — 2003. —
Vol. 50, № 51. — P. 601–606.
12.
Практикум по эндокринологии [Текст]
/ Я. М. Кабак // М.: Сов. наука, 1968. — С. 61–64.
13. Лимфоциты: Методы [Текст] / под ред. Дж.
Клауса// М.: Мир, 1990. — 395 с.
14. EG-VEGF and the concept of tissue-specific
angiogenic growth factors [Text] / J. LeCouter, N. Ferrara
// Cell. Develop. Biol. — 2002. — Vol. 13. — P. 3–8.
15. Permanent acceptance of liver allografts by
intraportal injection of donor spleen cells in rats [Text]
/ Y. Nakano, M. Monden, L. A. Valdevia [et al.]
// Surgery. — 1992. — Vol. 111. — P. 668–676.
16. Induction of allogeneic islet survival by
intrahepatic islet pre-immunization and transient
immunosuppression [Text] / J. A. Goss, M. W. Flye,
P. E. Lacy // Diabetes. — 1996. — Vol. 45. — P. 144–147.
17. Manipulation of xenogeneic skin and/or renal graft
survival in the rat-mouse concordant combination by portal
vein pretransplant transfusion [Text] / R. M. Gorczynski,
X. M. Fu, S. Chung [et al.] // Transplant. Immunol. —
1995. — Vol. 3. — P. 321–329.
ПЕРЕДТРАНСПЛАНТАЦIЙНЕ УВЕДЕННЯ ДОНОРСЬКИХ ЛIМФОЦИТIВ
ПРОЛОНГУЄ ВИЖИВАННЯ АЛОГЕННОЇ ТКАНИНИ ЯЄЧНИКIВ
У ОВАРIЕКТОМОВАНИХ ТВАРИН-РЕЦИПIЄНТIВ
Божок Г. А., Кiрошка В. В., Тiщенко О. 1 , Легач Є. I.
Институт проблем крiобiологiї i крiомедицини НАН України, м. Харкiв;
1 Харкiвський нацiональний унiверситет iм. В. Н. Каразiна, м. Харкiв
Вивчено вплив передтрансплантацiйного уведення донорських лiмфоцитiв на виживання
алогенної тканини яєчникiв у оварiектомованих щурiв-реципiєнтiв. Виживання трансплантату
оцiнювали за рiвнем статевих гормонiв у сироватцi кровi та збереженiстю структури тканини
трансплантату на гiстологiчних зразках. Встановлено краще виживання алотрансплантату за
умов донор-специфiчної сенсибiлiзацiї органiзму реципiєнта.
К л ю ч о в i с л о в а: яєчник, оварiектомiя, трансплантацiя, донор-специфiчна толерантнiсть, естрадiол, прогестерон.
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009
83
Експериментальнi дослiдження
ПРЕДТРАНСПЛАНТАЦИОННОЕ ВВЕДЕНИЕ ДОНОРСКИХ ЛИМФОЦИТОВ
ПРОЛОНГИРУЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ АЛЛОГЕННОЙ ТКАНИ ЯИЧНИКОВ
У ОВАРИЭКТОМИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ-РЕЦИПИЕНТОВ
Божок Г. А., Кирошка В. В., Тищенко Ю. О. 1 , Легач Е. И.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков;
1 Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина, г. Харьков
Изучено влияние предтрансплантационного введения донорских лимфоцитов на выживаемость аллогенной ткани яичников у овариэктомированных крыс-реципиентов. Выживаемость
трансплантата оценивали по уровню половых гормонов сыворотки крови и сохранности структуры ткани трансплантата на гистологических образцах. Установлена лучшая выживаемость
аллотрансплантата при донор-специфической сенсибилизации организма реципиента.
К л ю ч е в ы е с л о в а: яичник, овариэктомия, трансплантация, донор-специфическая
толерантность, эстрадиол, прогестерон.
PRETRANSPLANT ADMINISTRAION OF DONOR LYMPHOCYTES PROLONGS
ALLOGENEIC OVARY TISSUE SURVIVAL IN OVARIECTOMIZED RECIPIENT
ANIMALS G. A. Bozhok, V. V. Kiroshka, J. O. Tischenko 1 , E. I. Legach
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, NAS of Ukraine, Kharkiv;
1 Karazin Kharkiv National University
The influence of pretransplant administration of donor lymphocytes on survival of allogeneic
ovary tissue in ovariectomized rats-recipients was studied. Transplantation outcome was evaluated
by the sex hormone level in the blood plasma and preservation of allograft tissue structure on the
histological specimens. The best transplantation outcome was observed under the conditions of donorspecific sensibilization of recipients’ organism.
K e y w o r d s: ovary, transplantation, ovariectomy, donor-specific tolerance, estradiol, progesterone.
84
Проблеми ендокринної патологiї № 4, 2009