Читать полный текст статьи в формате pdf - АГ-инфо
реклама
ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Смолянинов А.Б., Жаров Е.В., Котелевская Е.А., Смирнова С.А., Масленикова И.И. Аллогенная трансплантация стволовых клеток и роль главного комплекса гистосовместимости (система HLAтипирования: как устроена и работает) СанктПетербургский государственный университет, кафедра госпитальной терапии Покровский банк стволовых клеток, Центр клеточной и генной терапии, СанктПетербург Центр восстановительной медицины, г. Москва В начале XIX века в процессе экспериментов с пересадкой органов и тканей у мышей было замечено, что трансплантируемый ор$ ган не приживается в теле хозяина. Тог$ да учeные предположили, что это как$ то связано с генетическими особеннос$ тями организма. В результате изучения данного вопроса в 1930$х годах Дж. Снелл и П. Горер идентифицировали некий участок генома как отвечающий за совместимость между донором и ре$ ципиентом. Они ввели понятие «гисто$ совместимость» и обозначили данный участок хромосомы как «Главный ком$ плекс гистосовместимости». Но основ$ ную работу по исследованию функций и строения комплекса у человека проде$ лал иммунолог, лауреат Нобелевской премии, Джон Доссе. Систему рецепто$ ров на поверхности клеток человека, от$ ветственных за гистосовместимость он назвал Human Leukocyte Antigen (HLA) [1]. Именно благодаря этим выдающим$ ся учeным была раскрыта тайна оттор$ жения тканей после трансплантации и появилась возможность решить данную проблему. Необходимо совпадение у донора и реципиента антигенов главно$ го комплекса гистосовместимости. Та$ ким образом, главный комплекс гисто$ совместимости (major histocompability complex, MHC) представляет собой группу генов и кодируемых ими рецеп$ торов, расположенных на поверхности клеток. Они играют важнейшую роль в распознавании чужеродных агентов и развитии иммунного ответа [2]. Опреде$ ление главного комплекса гистосовмес$ тимости очень важно для транспланта$ ции стволовых клеток пуповинной кро$ ви и костного мозга. Проведение транс$ плантации стволовых клеток пуповин$ ной крови или костного мозга без оцен$ ки HLA$типа гемопоэтических стволо$ вых клеток запрещено. Поэтому очень важно разобраться с тем, что же из себя представляет главный комплекс гисто$ совместимости и HLA$типирование. АГинфо ● 3/2009 Комплекс генов MHC расположен на коротком плече 6$ой хромосомы (6p21.31) и занимает участок ДНК око$ ло 3500 тыс. п.о. [3]. Основными особен$ ностями комплекса являются его значи$ тельная полигенность, то есть наличие нескольких неаллельных генов, белко$ вые продукты которых имеют похожее строение и выполняют идентичные функции, а также ярко выраженный по$ лиморфизм – присутствие многих ал$ лельных форм одного и того же гена. Все гены комплекса наследуются по ко$ доминантному типу [4], то есть оба ал$ леля дают равноценный вклад в форми$ рование фенотипа [5]. Выделяют несколько основных классов системы HLA: I, II и III. Первые антигены MHC были выявлены сероло$ гическими методом, их обозначили: HLA$A, HLA$B, HLA$C. Следующий локус обнаружили в результате экспе$ римента по индукции пролифирации в смешанной культуре лимфоцитов доно$ ра и реципиента; его обозначили HLA$ D. Затем идентифицировали серологи$ чески локус, который был близко сцеп$ лен с HLA$D, он был назван HLA$DR (от D$related). Еще два последующих локуса обозначили соседними с R буквами P и Q – HLA$DP, HLA$DQ [2]. Позже, выяснили, какие белковые продукты кодируют разные структур$ ные гены из комплекса MHC, гены ком$ плекса разделили на три группы. Каж$ дая группа включает гены, контролиру$ ющие синтез полипептидов сходного строения и с одинаковыми функциями одного из трех классов [4]. К I классу отнесли локусы HLA$A, HLA$B, HLA$ C, а ко II классу – HLA$D, HLA$DP и HLA$DQ. Гены класса III ответственны за синтез одного из компонентов систе$ мы комплемента, фактора некроза опу$ холей – α и β, ферментов, участвующих в синтезе гормонов [2]. Среди них также выделяют суперсе$ мейства C (факторы комплемента, кото$ рые вовлечены в процессы элиминации чужеродных антигенов) и G (функции окончательно не выяснены, но предпо$ лагается, что продукты экспрессии от$ дельных генов данного семейства участ$ вуют в процессе созревания лейкоци$ тов) [6]. Схема расположения в геноме локусов комплекса генов MHC показа$ на на рис. 1. Кроме перечисленных, ре$ гион на хромосоме каждого класса со$ держит и другие гены, правда половина из них не экспрессируются [7]. Структура молекул MHC Молекула MHC I класса (рис. 2) со$ стоит из одной гликозилированной тя$ желой белковой цепи (45 кДа), некова$ лентно связанной с β2$микроглобули$ ном (12 кДа) – полипептидом, который встречается также в свободной форме в сыворотке крови. Тяжелая белковая цепь молекул MHC$I класса состоит из внеклеточной части, трансмембранного сегмента и цитоплазматического хвос$ тового домена. Внеклеточный участок аминокислотной последовательности белка образует 3 домена. Они обознача$ ются α1, α2, α3. каждый из них содержит примерно 90 аминокислотных остатков. В α2$ и α3$доменах имеется по одной внутрицепочечной дисульфидной связи, замыкающей петлю из 63 и 86 а. к. о. со$ ответственно. Домен α3 гомологичен по аминокислотной последовательности С$доменам иммуноглобулинов. В зави$ симости от вида и гаплотипа внеклеточ$ ная часть тяжелых цепей молекул MHC$ I класса в разной степени гликозилиро$ Рисунок 1. Расположение генов главного комплекса гистосовместимости человека на 6ой хромосоме [8]. 3 ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ фидная связь внутри β1$домена замыка$ ет петлю из 64 аминокислотных остат$ ков. Межцепочечные различия по моле$ кулярной массе у продуктов МНС клас$ са II обусловлены разной степенью гли$ козилирования: домены α1, α2 и β1 N$ гликозилированы, а β2 нет [10]. Пептид$связывающий участок фор$ мируют совместно α1 и β1 домены. Он «открыт» с обеих сторон, что позволяет связывать более длинные пептиды, чем в случае МНС$I, – до 30 остатков амино$ кислот. Якорные остатки для большинст$ ва изученных аллельных вариантов МНС$ II находятся в позициях 1, 4, 6 и 9 [2]. Рисунок 2. Схематическое изображение структуры гена тяжeлой цепи [9] и строения моле кулы белка MHCI [3]. вана. Трансмембранный сегмент состо$ ит из 25 преимущественно гидрофобных аминокислотных остатков и пронизыва$ ет липидный бислой [2]. Белок β2$микроглобулин (β2m) име$ ет неизменную последовательность. Экспрессирующий его ген находится на 15$й хромосоме. По структуре этот бе$ лок соответствует С$домену иммуног$ лобулинов [10]. β2m кодируется геном, не сцепленным с MHC. Домены α1 и α2 формируют углубле$ ние размером около 2,5 нм. Именно в этом углублении располагается пептид$ антиген, предназначенный для распоз$ навания Т$лимфоцитами. Пептид не сорбируется на молекулу рецептора из$ вне клетки, а конъюгируется с α$цепью нековалентными связями, но с доста$ точной афинностью внутри клетки при фолдинге белка. На поверхности клеток не может быть молекул MHC без пепти$ дов, так как они просто не могут быть экспрессированы и не примут правиль$ ной конформации, если ещe внутри клетки не вступят в связь с пептидом оп$ ределeнной длины. Белки MHC$I связывают пептиды длиной 8–10 аминокислотных остатков, 4 фиксируя пептид по обоим концам мо$ лекулы – С и N. Молекулы MHC разных аллельных вариантов связывают пепти$ ды с определeнными остатками амино$ кислот в так называемых якорных пози$ циях: это С$концевой остаток, 2$й или 5$ й с N$конца. Такая высокая специфич$ ность между белком и пептидом обу$ славливает полиморфизм генов MHC и наличие нескольких белков со сходными функциями на каждой клетке [2]. Продукты МНС$генов класса II – это гетеродимерные гликопротеины (рис. 3), состоящие из тяжeлой (α) и легкой (β) полипептидных цепей. α$це$ пи имеют молекулярную массу 30–34 кДа, β$цепи – от 26 до 29 кДа в зависи$ мости от локуса кодирующего их гена. Внеклеточная часть обеих цепей сверну$ та в два домена (α1 и α2 или β1 и β2) и со$ единена коротким пептидом с транс$ мембранным сегментом длиной пример$ но 30 аминокислотных остатков. Транс$ мембранный сегмент переходит в цито$ плазматический домен (10–15 остат$ ков). Подобно α3$домену класса I и β2m, домены α2 и β2 класса II имеют струк$ турные характеристики константных доменов иммуноглобулинов. Дисуль$ Функции рецепторов главного комплекса гистосовместимости Основной функцией белков MHC яв$ ляется регуляция иммунного ответа. Именно молекулы антигенов HLA обес$ печивают представление чужеродных ан$ тигенов Т$лимфоцитам. Они образуют комплекс с пептидами, полученными в ре$ зультате внутриклеточного протеолиза. По современным представлениям систе$ ма HLA, обеспечивая регуляцию иммун$ ного ответа, осуществляет такие важней$ шие физиологические функции, как взаи$ модействие иммунокомпетентных клеток организма, распознавание клеток, запуск и реализация иммунного ответа [2]. Для того чтобы Т$лимфоциты узна$ вали чужеродные антигены, рецепторы на их поверхности должны быть сфор$ мированы так, чтобы иметь сродство к антигенпредставляющим клеткам (АПК) собственного организма. А так как по$ давляющее большинство Т$лимфоцитов не распознают свободных нативных ан$ тигенов, АПК должны представить дан$ ный антиген на своей мембране в ком$ плексе с MHC$I/II. Поэтому сущность дифференцировки лимфоцитов состоит в экспрессии антигенраспознающего ре$ цептора. Антигенраспознающий рецеп$ тор Т$лимфоцитов обозначают TCR (T$ cell receptor). С помощью TCR клетка Т$ лимфоцита связывается с комплексом MHC$I или MHC$II с пептидом$антиге$ ном. Один определeнный участок моле$ кулы TCR вступает в химическую связь с молекулой MHC$I/II, а второй его уча$ стков тот же момент времени связывает пептид$антиген. Этот феномен называ$ ют двойным распознаванием или MHC$ рестрикцией Т$лимфоцитов. Каждый конкретный Т$лимфоцит взаимодействует с молекулами либо I класса, либо II класса MHC. Но со сто$ АГинфо ● 3/2009 ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Рисунок 3. Схема структуры генов обоих цепей и строения молекулы белка МНСII [3]. роны Т$лимфоцита есть ещe одна из двух мембранных молекул, вступающих в связь с молекулами MHC на АПК – это молекулы CD4 и CD8. Их называют ко$ рецепторными молекулами Т$лимфоци$ тов. Молекула CD4 имеет химическое сродство и вступает в связь с инвариант$ ной частью молекулы MHC$II (β2$доме$ ном), молекула CD8 – с инвариантной частью молекулы MHC$I (α3$доменом). В процессе дифференцировки Т$ лимфоцитов в тимусе первоначально на мембране клетки присутствуют совме$ стно CD4 и CD8 рецепторы. Затем начи$ нается синтез TCR. Каждый вариант TCR клетка экспрессирует и пытается связаться с комплексами пептид$МНС, экспрессированными на мембранах эпи$ телиальных клеток тимуса. В данном случае пептидные антигены являются продуктами катаболизма собственных белков АПК. Тимоциты, связавшиеся с комплексом пептид$МНС с правильной (средней по силе) афинностью, получа$ ют сигнал на выживание и продолжают дифференцировку. Тимоциты, которые не связались ни с каким из доступных АГинфо ● 3/2009 комплексов, не получают сигнала на вы$ живание, и в них инициируется про$ грамма на апоптоз, они разрушаются. Это так называемая позитивная селек$ ция тимоцитов. Если TCR связывает комплекс со слишком высокой аффин$ ностью, то тимоцит также может погиб$ нуть. Это называют негативной селек$ цией тимоцитов. На короткое время с мембраны тимоцитов исчезают обе мо$ лекулы корецепторов CD4 и CD8, затем экспрессируется одна из них в зависи$ мости от того, к молекуле МНС какого класса имеет сродство TCR данного ти$ моцита. Таким образом, при трансплантации гемопоэтических клеток костного мозга у людей строго необходимо совпадение по МНС: не столько для избежания от$ торжения трансплантата реципиентом, сколько для обеспечения возможности дифференцировки иммунокомпетент$ ных Т$лимфоцитов из стволовых клеток костного мозга донора в тимусе реци$ пиента [2]. Рассмотрим процесс представления «своих» и чужеродных антигенов моле$ кулами МНС, схема данного цикла представлена на рис. 4. Пептиды, образующие комплекс с белками МНС$II образуются в резуль$ тате протеолиза белков, захваченных клеткой посредством эндоцитоза или фагоцитоза. В эндоплазматическом ре$ тикулуме молекула МНС$II находится в комплексе с инвариантной полипептид$ ной цепью – Ii. Эта Ii цепь закрывает об$ ласть связывания с пептидами и в даль$ нейшем обеспечивает экспозицию моле$ кул МНС$II внутрь везикул – эндосом или фаголизосом. В мембранных внут$ риклеточных структурах есть специаль$ ная область M$II$С (MHC class II com$ partment), с которой сливаются эндосо$ мы и лизосомы с поглощeнным внекле$ точным содержимым. Только при учас$ тии пептида молекула MHC$II прини$ мает правильную конформацию и экс$ прессируется на мембране. Если клетка не располагает доста$ точным количеством чужого пептидно$ го материала, то молекулы MHC$II свя$ зывают короткий фрагмент, образую$ щийся при протеолитическом расщеп$ лении инвариантной цепи CLIP (class II linked invariant$chain peptide). В наслоении пептида участвует ещe одна молекула – HLA$DM. HLA$DM на какое$то время стабилизирует пустые молекулы MHC$II (без пептида). Таким образом, молекулы MHC$II представля$ ют антиген при развитии защитных им$ мунных реакций на внеклеточные и вези$ кулярные инфекции. Поскольку ком$ плексы антигенов$петидов с молекулами MHC$II распознают исключительно CD4+ Т$лимфоциты, то и в защите от внеклеточных и везикулярных инфекций главную роль играют реакции, обеспечи$ вающие именно CD4 Т$лимфоцитами. Те же пептиды, которые образуются при расщеплении протеасомами в цито$ плазме клетки, образуют комплекс с молекулами MHC$I. Расщепление бел$ ков протеасомами происходит при их неправильном фолдинге. Протеасомы – это мультипротеазные комплексы из 28 субъединиц. Два из трeх вариантов субъединиц протеасом – LMP2 и LMP7 – кодируются генами, расположенными внутри комплекса MHC. Ещe нескон$ формированные молеклы MHC$I, нахо$ дящиеся в эндоплазматическом ретику$ луме, вступают в связь с данными пеп$ тидами и, образовав биологически пра$ вильную конформацию, направляются для экспрессии на клеточную мембрану. 5 ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Рисунок 4. Представление антигена молекулами МНСI и МНСII. В процессе поставки пептидов к эндо$ плазматическому ретикулуму участву$ ют два АТФ$связывающих полипептида TAP$1 и TAP$2 (transporters associated with antigen processing). В мембране эн$ доплазматического ретикулума эти два полипептида формируют гетеродимер, ориентированный гидрофобными уча$ стками в полость ретикулума, а АТФ$ связывающими участками – в сторону цитозоля. TAP имеют сродство к пепти$ дам с гидрофобными или основными ос$ татками аминокислот на С$конце. Гены TAP$1 и TAP$2 расположены внутри комплекса MHC. В плане защиты от ин$ фекции этот механизм работает приме$ нительно в первую очередь к вирусным, а также цитозольным бактериальным внутриклеточным инфекциям. Поэтому CD8+ Т$лимфоциты обеспечивают про$ тивовирусную защиту, так как в ком$ плексе с MHC$I только CD8+ Т$лимфо$ циты распознают пептидные антигены. В отсутствие инфекций молекулы MHC$I и MHC$II формируют комплек$ сы с эндогенными (собственными) пеп$ тидами. При взаимодействии рецептора Т$лимфоцита TCR с молекулой MHC, связанной с «собственным» пептидом, не происходит инициации иммунного ответа [2]. Номенклатура HLA Номенклатура HLA аллелей и локу$ сов определяется Номенклатурным Ко$ 6 митетом по факторам системы HLA (WHO). Этот комитет следит за наимено$ ванием новых аллелей и регулярно пуб$ ликует обновления списка вновь откры$ тых аллелей HLA. База данных Комитета IMGT/HLA (www.ebi.ac.uk/imgt/hla) осуществляет централизованное хране$ ние последовательностей аллелей, на$ званных Номенклатурным Комитетом. Список вновь открытых на основании сиквенирования HLA аллелей, утверж$ дается Номенклатурным Комитетом по факторам HLA системы и ежемесячно публикуется в журнале Tissue Antigens. Кроме того, полный список аллелей публикуется каждые несколько лет в Tissue Antigens, European Journal of Immunogenetics и Human Immunology. Каждый аллель гена ГКГ имеет уни$ кальное название. Оно включает бук$ венное обозначение гена, в зависимости от белка, которое он кодирует, а также номер, включающий от 4 до 8 цифр. Первые две цифры обозначают но$ мер серологического типа белка, третья и четвeртая – подтип. Номера присваи$ вались в таком порядке, в котором про$ изошло открытие этого типа или подти$ па антигена. Аллели, чьи номера отли$ чаются в первых четырeх цифрах, могут отличаться на один или несколько нук$ леотидов, но при этом меняется амино$ кислотная последовательность кодиру$ емого белка. Пятая и шестая цифры но$ мера определяют аллели, имеющие за$ мену нуклеотида в кодирующей после$ довательности, которая не приводит к изменению аминокислотного остатка. А седьмая и восьмая цифры используются для идентификации аллелей, у которых есть замена нуклеотида в интроне или фланкирующих областях. Также используются дополнитель$ ное буквенное обозначение экспресси$ онного статуса генов: N – неэкспрессирующиеся аллели («Null»); L – низкая экспрессия на клеточную поверхность («Low»); S – ген экспрессирует растворимую молекулу белка, но белок не присутст$ вует на поверхности клетки («Secreted»); С – белок секретируется в цитоплаз$ му, но не присутствует на клеточной мембране («Cytoplasm»); А – аномальная экспрессия, когда есть сомнения, что белок будет синтези$ роваться («Aberrant»); Q – есть сомнения в том, будет ли экспрессироваться белок, хотя ранние исследования данной мутации показы$ вали, что белок экспрессировался («Questionable») [11]. Определение типа белка ГКГ может проходить в нескольких форматах: – низкое разрешение (два знака) HLA$A*24 – среднее разрешение (четыре зна$ ка) HLA$A*2402 – высокое разрешение (восемь зна$ ков) HLA$A*24020102 Так как полиморфизм не приводя$ щий к замене аминокислоты или в неко$ дирующей области не вызывает измене$ ние структуры белка, приводящее к им$ мунологической реакции, для точного типирования достаточно определить только первые четыре знака, поэтому типирование среднего разрешения час$ то называют высоким. HLA/типирование Определение белков ГКГ у человека или, как его называют, HLA$типирова$ ние, проводят для решения целого спек$ тра задач. Идентификация личности и определение отцовства Как упоминалось выше, гены ГКГ отличаются повышенной степенью по$ лиморфизма, то есть набор антигенов лейкоцитов, эксперссирующихся у кон$ кретного человека служит биологичес$ ким паспортом личности. Известно бо$ АГинфо ● 3/2009 ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Рисунок 5. Схема правил номенклатуры HLA [12]. лее чем 220 HLA$A, 460 HLA$B, 110 HLA$C, 360 HLA$DRB1, 22 DQA1, 48 DQB1, 20 DPA1, 96 DPB1 аллелей. Как видно, возможность совпадения комби$ нации основных белков ГКГ крайне ма$ ла [13]. Таким образом, по результатам HLA$типирования биологического ма$ териала можно установить личность че$ ловека, а также при полном совпадении одного аллеля из двух в каждом локусе определяется родственная связь между родителем и ребeнком. Подбор доноров для трансплантации органов и тканей HLА$несовместимость является главной причиной клинических и имму$ нологических проблем после транс$ плантации и основным лимитирующим фактором выбора донора для транс$ плантации [14]. При аллотрансплантациях органов и тканей большинство Т$лимфоцитов не распознают чужие молекулы MHC, но 1–10% Т$лимфоцитов «ошибаются" и принимают чужие молекулы MHC за свои, но поражeнные чужеродными агентами, и активируют иммунный от$ вет. Но даже если донор и реципиент совпадают по главным молекулам MHC, трансплантат всe равно отторгается, это происходит из$за присутствия ми$ норных антигенов гистосовместимости. Минорные антигены гистосовместимос$ ти – это антигены, которые связывают$ ся с MHC$I белками и реагируют с CD8+ Т$лимфоцитами, то есть практи$ чески любые белки организма донора. Поэтому реакция «трансплантат против хозяина» может возникнуть даже при самом тщательном подборе донора по МНС генам [2]. В любом случае перед трансплантацией необходимо прово$ дить иммуносупрессивную терапию. По американской программе по под$ бору доноров костного мозга (the National Marrow Donor Program (NMDP) [15] существуют следующие требования совпадения HLA для транс$ плантации: – при пересадке костного мозга должны совпадать 5 из 6 антигенов HLA$A, $B и $DRB1, но они должны быть определены по высокому разреше$ нию; АГинфо ● 3/2009 – в случае введения пуповинной кро$ ви 4 из 6 антигенов должны совпадать, причeм HLA$A и $B достаточно типиро$ вать по низкому разрешению, а $DRB1 по высокому. Определение предрасположенности к различным заболеваниям Изучение связи между полиморфиз$ мом белков ГКГ и предрасположеннос$ ти к заболеваниям началось с подтверж$ дения в 1973 году того, что наличие ан$ тигена HLA$B27 приводит к развитию у человека анкилозирующего спондило$ артрита – болезни Бехтерева (90–93%) [9]. Несомненным остаeтся факт ассо$ циации некоторых аллелей локусов HLA$DQB1 и HLA$DQА1 с целиалкией [16]. Кроме того, при определении раз$ личных антигенов ГКГ можно рассчи$ тать относительный риск возникновения целого ряда заболеваний, таких как – синдром Рейтера, ревматоидный артрит, ишемическая болезнь сердца (ИБС), ги$ пертоническая болезнь, сахарный диа$ бет первого типа, системная красная волчанка (СКВ), язвенная болезнь две$ надцатиперстной кишки, атрофический гастрит, псориаз, гипертериоз, болезнь Аддисона, рассеянный склероз, склеро$ дермия, хронический аутоиммунный ге$ патит, экзема, заболевания щитовидной железы, бронхиальная астма, синдром Гудпасчера и многие другие. Таким образом, своевременное оп$ ределение HLA$антигенов до появления симптомов, позволяет выявлять группу риска по развитию того или иного забо$ левания. При появлении симптомов воз$ можно проведение ранней диагностики заболеваний [9]. Диагностика бесплодия у супругов, возникающая из"за сходства MHC антигенов В результате исследований причин необъяснимого бесплодия супружеских пар была обнаружена связь между сов$ падением антигенов HLA у будущих ро$ дителей и репродуктивных проблем. Выяснилось, что зародыши, несущие от$ цовские HLA антигены, отличавшиеся от материнских антигенов (гистонесов$ местимая беременность) имеют преиму$ щество в выживании по сравнению с за$ родышами, унаследовавшими отцовские HLA антигены, не отличавшиеся от ма$ теринских антигенов (гистосовмести$ мая беременность) [17]. Это можно объ$ яснить с точки зрения естественного от$ бора, так как его основная цель – разно$ образить формы существования на зем$ ле. Как уже упоминалось ранее, при на$ следовании антигенов ГКГ ребенок по$ лучает по одному гену каждого локуса от обоих родителей, т.е. половина анти$ генов тканевой совместимости наследу$ ется от матери и половина от отца. Та$ ким образом, ребенок является наполо$ вину чужеродным для организма мате$ ри. Это отличие является нормальным физиологическим явлением, запускаю$ щим иммунологические реакции, на$ правленные на сохранение беременнос$ ти. Формируется клон иммунных кле$ ток, вырабатывающий специальные «за$ щитные» (блокирующие) антитела про$ тив отцовских HLA$антигенов. Эти ан$ титела блокируют HLA$антигены отца от клеток иммунной системы матери. Несоответствие супругов по HLA$ антигенам и отличие зародыша от мате$ ринского организма является важным моментом, необходимым для сохране$ ния и вынашивания беременности. При нормальном развитии беременности «блокирующие» антитела к отцовским антигенам появляются с самых ранних сроков беременности. Сходство супругов по антигенам ГКГ приводит к тому, что антитела к от$ цовским рецепторам не вырабатывают$ ся и клетки плода считаются клетками матери как «свои», но изменeнные, а значит – заражeнные или с нарушенной физиологией, следовательно, они под$ вергаются иммунной атаке и плод от$ торгается [18]. Методы HLA/типирования Определение антигенов системы HLA проводят несколькими способами. Изначально антигены ГКГ определяли серологическим методом: из перифери$ ческой крови выделяли лимфоциты, за$ тем наблюдали микролимфоцитотокси$ ческую реакцию с гистотипируюшими сыворотками. Позже, с развитием моле$ кулярно$генетических методов для точ$ ной идентификации МНС антигенов стали использовать полимеразную цеп$ ную реакцию (ПЦР). Генетические ме$ тоды позволили значительно расширить спектр выявляемых антигенов. Одним из первых молекулярно$ге$ нетических методов определения анти$ генов МНС является анализ полимор$ физма длины рестрикционных фраг$ ментов (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism). Он основан на наличии специфических сайтов рестик$ ции на каждом гене. При расщеплении 7 ОБЗОРНАЯ ИНФОРМАЦИЯ данного гена определeнной эндонукле$ азой рестрикции при электрофоретиче$ ском разделении фрагментов цепи ДНК должны быть идентифицированы фраг$ менты определeнной длины. При отсут$ ствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах будет выяв$ ляться один крупный фрагмент, соот$ ветствующий по длине последователь$ ности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии ре$ стрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутство$ вать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморф$ ным сайтом рестрикции и одним из бли$ жайших константных сайтов рестрик$ ции. Затем осуществляется гибридиза$ ция данных фрагментов по Саузерну с меченными олигонуклеотидами. В на$ стоящий момент, описанный метод при$ меняется редко из$за сложной проце$ дуры, которая не подходит для рутин$ ных исследования диагностических ла$ бораторий. Более совершенными методами яв$ ляются гибридизация продуктов ампли$ фикации со специфическими олигонук$ леотидами, мобилизованными на мемб$ ране (Sequence$Specific Oligonucleotide (SSO) probe) и амплификация геномной ДНК со специфическими праймерами и последующим разделением продуктов амплификации в геле (Sequence$Specific Priming (SSP)). При определении МНС$антигенов SSO$методом первоначально проводят амплификацию одного целого гена HLA. Затем продукты ПЦР гибридизу$ ют с меченными специфическими оли$ гонуклеотидами, находящимися на ней$ лоновой или целлюлозной мембране (стрипе). После того как отмоют все не связавшиеся фрагменты ДНК, происхо$ дит окраска меченных олигонуклеоти$ дов. Таким образом выявляются отли$ чия генов вплоть до одного нуклеотида. Недостатком этого метода является то, что очень сложно разделить гетерози$ готные аллели на хромосоме человека. SSP$метод позволяет разделить ал$ лели, так как амплификация гена проис$ ходит в лунках с разными праймерами специфичными к полиморфным после$ довательностям. Идентификация гена происходит по наличию продукта ПЦР. Визуализацию продуктов ПЦР произ$ водят электрофоретическим разделени$ ем в агарозном геле. 8 Описанные выше методы позволяют определить МНС$антиген только на низком разрешении и с определeнной вероятностью. Единственным методом, осуществляющим типирование высоко$ го разрешения, является секвенирова$ ние последовательности генов. Данная довольно сложная процедура в послед$ ние несколько лет стала гораздо проще благодаря созданию полностью автома$ тических систем ДНК$секвенирования. Первым этапом для точного определе$ ния последовательности является выяв$ ления аллелей, которые затем по от$ дельности проходят этап амплификации с флуоресцентными терминирующими дидезоксинуклеотидами. Последней стадией является разделение продуктов реакции с помощью капиллярного элек$ трофореза и детекция флуоресцентных меток лазером. Современные техноло$ гии позволяют в компьютерной про$ грамме кроме точного определения по$ следовательности нуклеотидов гена идентифицировать его номер по между$ народной номенклатуре за минимальное время. К сожалению ДНК$секвенирова$ ние до сих пор самая дорогостоящая процедура и не может быть использова$ на повсеместно [19]. В тоже время про$ цедура ДНК$секвенирования и проведе$ ния HLA$типирования разрешена в кли$ нической практике Росздравнадзором для подготовки стволовых клеток пупо$ винной крови и костного мозга к транс$ плантации у онкогематологических па$ циентов. Более того, проведение транс$ плантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток у человека запрещено без выполнения HLA$типирования. Современные банки стволовых кле$ ток пуповинной крови и костного мозга должны иметь в обязательном порядке HLA$типирование низкой или высокой степени разрешения при создании реги$ стра доноров стволовых клеток пупо$ винной крови или костного мозга. Литература 1. Simmons J.G. Doctors and Discoveries: Lives That Created Today's Medicine/ J.G. Simmons – Boston: Houghton Mifflin. – 2002. – 459 p. 2. Хаитов Р.М. Иммунология: учебное пособие/ Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович – 2$е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 2002. – 536 с. 3. Abbas A.K. Cellular and Molecular Immunology/Abbas A.K., Lichtman A.H., Pillai S – 6th ed. Philadelphia: Saunders Elsevier. – 2007. – 566 p. 4. Галактионов В.Г. Иммунология: учеб. для вузов/ В.Г. Галактионов – 3$е изд., пе$ рераб. и доп. – М.: Академия, 2004. – 528 с. 5. Жимулев, И.Ф. Общая и молекулярная генетика: учебное пособие/ И.Ф. Жиму$ лев – Новосибирск: Сиб. унив. изд$во. – 2002. – 459 с. 6. Ribas G., Neville M., Wixon J.L., et.al. Genes encoding three new members of the leukocyte antigen 6 superfamily, together with genes encoding the regulatory nuclear chloride ion channel protein (hRNCC) and an N omega – dimethylarginine dimethy$ laminohydrolase homologue, are found in a 30 – kb segment of the MHC class III region // J. Immunol. – 1999. – № 163 (1). – P.278 – 87. 7. Bodmer W.F. The HLA system: structure and function //J. Clin. Pathol. – 1987. – № 40. – P. 948–958. 8. Справочник по иммунотерапии для практического врача / Н.Н. Володин, С.В. Димитрюк, М. В. Дегтярева, П.Р. Симбир$ цева. – СПб.: Диалог. – 2002. – 478 с. 9. Marsh S. G. E. The HLA Factsbook/ Marsh S. G. E., Parham P., Barber L. D./ Academic Press. – 2000. – 398 с. 10. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл – М.: Мир, 2000 – 593с. 11. Rubinstein P. HLA matching for bone marrow transplantation – how muchis enough? // N. Engl. J. Med., No. 25, 345. 12. Румянцев, А.Г., Трансплантация ге$ мопоэтических стволовых клеток у де$ тей: руководство для врачей/ А.Г. Румян$ цев, А.А. Масчан – М.: Медицинское ин$ формационное агенство. – 2003. – 912 с. 13. The National Marrow Donor Program http://www.marrow.org 14. Орешко Л.С. Роль главного комплек$ са гистосовместимости при целиакии // Вестник Санкт$Петербургского Универ$ ситета. – Сер. 11. – 2007. – Вып. 4. 15. Болдырева М.Н. HLA (класс II) и ес$ тественный отбор. "Функциональный" генотип, гипотеза преимущества "функ$ циональной" гетерозиготности: дис. … д$ ра мед. наук: 14.00.36: защищена 26.12.07/ М.Н. Болдырева; Институт иммунологии ФМБА России. – М., 2007. – 224 c. 16. Christiansen O.B. A fresh look at the causes and treatments of recurrent miscar$ riage, especially its immunological aspects// Human Reproduction Update. – 1996. – Vol.2, N.4. – P.271–293. 17. Erlich H.A., Opelz G., Hansen J. HLA DNA Typing and Transplantation // Immunity. – 2001. – № 14. – P.347–356. АГинфо ● 3/2009
