Вопросы качества при исследовании уровня IgE антител Научный центр здоровья детей К.м.н. Геворкян А.К. г.Москва ФГБУ «НЦЗД» Минздрав РФ НИИ Гигиены и охраны здоровья детей и подростков НИИ педиатрии НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения Ученый совет ГУ НЦЗД РАМН MRT 3.0 Discovery 750 КТ Discovery 750HD Optima-430s 1,5 Tl Optima_MR_450w 1,5 Tl Rg Discovery 650XR Logic E 9 Voluson 730 expert Vivid E 9 Siemens S -2000 Siemens Antares Voluson E 8 Рентгеновское отделение КДЦ ЦИФРОВОЙ РЕНТГЕН ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ 5 г. 1 0 С2 За 2014г выявлено 16 фиброаденом у девочек-подростков размерами более 3 см. (прооперированы) Всего Консультации УЗИ м/ж Маммография Пункции 1968 1798 684 41 Из них ДЕНСИТОМЕТРИЯ 2014 год амб д/с к/с 1821 1651 684 33 44 44 0 6 103 103 0 2 Денсито метрия Всего 1536 Из них амб д/с к/с 195 567 774 34 лекции по молочной железе в 2014г в годах России: Владивосток, Хабаровск, Курск, Кировск, Челябинск, Орел, а также в Астане и Ташкенте. Лабораторные методы диагностики Преимущества использования тестов in vitro: Нет противопоказаний к обследованию (нет необходимости отмены лекарственных препаратов) Не вызывают дополнительной сенсибилизации, нет риска анафилактических реакций Нет возрастных ограничений, возможно проводить в самом раннем возрасте Большое число тестируемых аллергенов Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на расстоянии) Диагностика In vitro: Общий и специфический IgE Клеточные тесты (FLOW-CAST, EK-CAST, CAST-COMBI) Медиаторы эффекторных клеток в крови и моче, метаболиты медиаторов In vitro аллерготесты Дореволюционны е XXI столетия Дореволюционные тесты Фотометрическая детекция или Отсутствие автоматизации процесса Что должен знать клиницист об in vitro аллерготестах: Вопросы: 1.Единицы измерения sIgE? 2.Метод детекции sIgE? 3.Участие в программе внешнего контроля качества измерения sIgE? Звонок в лабораторию Правильные ответы: 1.kU/l 2.Автоматическая иммунофлуоресценция 3.Успешно участвуем в программе…, готовы предоставить копию сертификата Чувствительность in vitro аллерготестов Специфичность in vitro аллерготестов Ложноположительные результаты, которые ставят нас в тупик… Что означает качество, когда мы говорим о измерении IgE антител? Точность Воспроизводимость Предел определения Параллелизм Контроль качества Контроль качества IgE тестов Контроль качества осуществляется производителем во время производства реагентов и наборов «Внутренний» интра-лабораторный контроль качества – это второй уровень контроля качества клинической лаборатории «Внешний» межлабораторное профессиональное тестирование (e.g. UKNEQAS в Europe, CAP в USA и Quality Club для ImmunoCAP по всему миру) Стандартизация аллергенов Аллергон • Ведущий производитель аллегренсодержащего материала • Отделение /дочернее предприятие Phadia • >25 лет практического опыта 16 Клуб качества sIgE 17 Результаты: Воспроизводимость 90 80 EuroEQAS for specific IgE, Distribution 031, 2008 70 CV [%] 60 50 Hycor 40 DPC Microplate 30 DPC Immulite 20 Pharmacia CAP System™ 10 ImmunoCAP® 100 0 d1 Der. pteronyssinus e1 Cat k82 Latex m3 Aspergillus fumigatus Аллергены 18 m6 Alternaria alternata t3 Birch Важно понимать: что означает CV в kU/L 19 Измерение sIgE антител – наиболее сложная иммунологическая методика Низкая концентрация IgE в сыворотке Каждый аллерген содержит большое количество протеинов/компонентов, способных провоцировать ответ sIgE антител Для каждого аллергена тест должен быть достаточно чувствителен, чтобы связывать все sIgE антитела ко всем значимым компонентам Тест должен иметь достаточную ёмкость, чтобы связать все sIgE, конкурирующие с другими классами Ig. 20 Чрезвычайно низкая концентрация sIgE в сыворотке в сравнении с другими классами IG требует сверхчувствительной технологии измерения 21 Аллерген-специфические IgE методики Специфические IgE тесты не имеют противопоказаний и ограничений “Тестирование на аллерген-специфический IgE должно проводиться валидизированным методом и может быть выполнено в любом возрасте” “Большинство валидизированных sIgE методик используют метод ELISA-типа и обеспечивают количественные результаты. Эти тесты связывают сывороточные аллерген-специфические IgE антитела с экстрактом аллергена, адсорбированном на твердой фазе “sIgE уровни >0.1 kU/ml, также как >0.35 kU/ml считаются положительными, но существует значительная вариация между техниками, в основном из-за методологических отличий.” Eigenmann P.A. et al. Pediatric Allergy and Immunology 24 (2013) 195-209. Пример валидизированного теста Calibration(a) ImmunoCAP Specific IgE Calibrators Calibrator range: 0-100 kU/l. Reference material: The IgE calibrators are traceable (via an unbroken chain of calibrations) to the 2nd International Reference Preparation (IRP) 75/502 of Human Serum Immunoglobulin E from World Health Organisation (WHO). ImmunoCAP 250 PHADIA (ImmunoCAP) 25 ImmunoCAP™ обладает уникальной трехмерной твердой фазой с чрезвычайно Твердая высокой фаза связывающей способностью активированн активированн активированн ая ый бумажный ая поверхность диск; целлюлозная лунки “губка” активированн планшета ые шарики Классификация аллерген-специфических IgE тестов Качественные (Phadiatop, Phadiatop infant, fx5) Полуколичественные (Мультиаллергенные тесты) Количественные (ImmunoCAP) 27 Один день “из жизни” ImmunoCAP 250 28 October 19, 2015 Менеджмент качества: определение уровня специфического IgE Внутренние контроли 1) Обязательные контроли: При каждом запуске – контроли калибровочной кривой (верхний и нижний) 2) Дополнительные контроли: F1 (яичный белок) D1 клещ домашней пыли (Dermatophagoides pteronyssinus) E1 (кошка, эпителий и перхоть) F14 (соя) G6 (тимофеевка луговая) M6 (Alternaria alternata) T3(Береза бородавчатая) W1 (Амброзия высокая) Поликомпонентный положительный контроль отрицательный контроль Внешний контроль – Клуб качества (Phadia, Швеция): 4 раза в год по 4 “слепых” образца МЕТОДИКИ Общий IgE (2-5000kU/l) Специфический IgE (0 - 100 kUA/l) IgG (2-200 мгА/л) IgG4 (0-30 мгА/л) IgA Целиакия (1-100 мгА/л) IgG Целиакия (2-100 мгА/л) Эозинофильный катионный белок (2-200 мкг/л) Триптаза Аутоиммунитет (1-200 мкг/л) (0-600 мкгА/л) Идентификация >9 из10 Яичный белок Молоко Арахис Клещ домашней пыли Кошка Собака Травы Деревья Кустарники ЭКСКЛЮЗИВНЫЕ ТЕСТЫ IMMUNOCAP Phadiatop – скрининг атопии Phadiatop Infant – скрининг атопии у детей до 4-х лет Скрининг заболеваний соединительной ткани CTD Высокопроизводительная автоматическая платформа для аутоиммунных тестов Триптаза - маркер анафилаксии Тесты молекулярной аллергологии – более 100 аллергенкомпонентов Компонент-разрешающая (молекулярная) аллергодиагностика Аллергены яйца: Овомукоид – Gal d 1 Овальбумин – Gal d 2 Овотрансферрин – Gal d 3 Лизоцим – Gal d 4 Наличие множество Аллергены коровьего молока: •α-лактальбумин - Bos d 4 •β -лактоглобулин - Bos d 5 •Казеин - Bos d 8 •Лактоферрин коровы - Bos d •Бычий сывороточный альбумин – Bos d 6 аллергенных молекул в составе продукта/источника требует точного определения причинно-значимого аллергена для подбора лечебной тактики и создания прогноза заболевания Аллергены фруктов и овощей: Яблоко: Mal d1 (PR-10), Mal d3 (LTP), Mal d4 Персик: Pru p1 (PR-10), Pru p3 (LTP), Pru p4 Вишня: Pru av1, Pru av3, Pru av4 Морковь: Dau c1 (PR-10), Dau c3 (LTP), Dau c4 XVIII Конгресс педиатров с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» Аллергены березы: Bet v1 (PR-10) Bet v2 (профилин) Bet v4 (Са-связывающий белок) Bet v6 (изофлавонредуктаза) Аллергены тимофеевки: Phl p1, Phl p2, Phl p4, Phl p5b, Phl p7, Phl p11, Phl p12 Аллергия на клещей домашней пыли •Der p1 – аллерген dermat.pteronyssinus •Der p2 – аллерген dermat.pteronyssinus •Der p10 – тропомиозин Аллергия на собаку •Can f 1 - липокалин •Can f 2 - липокалин •Can f 5 – простатический калликреин •Can f 3 – сывороточный альбумин Аллергия на кошку • Fel d 1 – секреторный гликопротеин •Fel d 2 – сывороточный альбумин • Fel d 3 - цистатин • Fel d 4 – липокалин Школа детского аллерголога-иммунолога Методы обнаружения антител sIgE к аллергокомпонентам Иммунохимически е анализаторы -Высокая точность определения -Индивидуальный подбор аллергенов Микрочипы (microarray) - Точность определения уступает, но достаточно хорошая -Только панели аллергенов -Высокая стоимость исследования -Высокая стоимость исследования -Ограниченный набор аллергокомпонентов (десятки) -Широкий набор аллергокомпонентов (сотни) Компонент-разделенная аллергодиагностика - возможность определять sIgE к специфическим аллергенным белкам или компонентам белка Смесь аллергенов и неаллергенных молекул Компонент A Компонент B Компонент C Нативный аллергенный экстракт Нативные/рекомбинантные белки А, В, С Цельный аллерген Аллергенные компоненты XVIII Конгресс педиатров с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» Школа детского аллерголога-иммунолога Клиническая значимость диагностики с аллергокомпонетами Определение сенсибилизации к аллергокомпонентам: - необходимо для установления правильного диагноза - позволяет предсказывать случаи перекрестной реактивности - позволяет прогнозировать пищевым продуктам развитие толерантности к некоторым - наличие или отсутствие сенсибилизации к минорным аллергенам влияет на прогноз заболевания: легкие симптомы (ОАС) или анафилаксия - является основой назначения специфической прогнозирования ее эффективности иммунотерапии и Молекулярная диагностика аллергии на куриное яйцо • • • • Аллергия на куриное яйцо – одна из наиболее часто встречающихся у детей Распространенность: 1-2% Некоторые пациенты переносят употребление отварных/печеных яиц Часто проходит к дошкольному возрасту Пациент А. АтД п.4 С 3-х мес В 2года: кожн. тестир. – кур. яйцо Диета +симпт.средства Терапия 3 года: нарушение диеты АтД, бронхообструкция 20 кЕ/л IgE к яйцу (белок) АтД, аллергический В 5 лет: нарушение ринит, бронхообструкция диеты Пациент Б. АтД п.5 Диета + симпт.средства АтД, бронхообструкция 25 кЕ/л Нет симптомов Аллергены белка куриного яйца 1. Овальбумин (Gal d2) – наиболее общий аллерген в белке 2. Овомукоид (Gal d1) – аллерген с наибольшей иммуногенностью для детей 3. Овотрансферин (кональбумин) (Gal d3) 4. Лизоцим (Gal d4) Содержание в Температурна Аллерген белке яйца Овомукоид 11% Лизоцим 3,4% Кональбумин 13% Овальбумин 54% я стабильность Аллергенна я активность ++++ +++ +++ ++ ++ + + ++ Benhamou AH, state of the art for egg allergy, Allergy 2010, 65:283–289 Ando H. JACI 2008: Уровень sIgE к овомукоиду у детей с персистирующей аллергией на яйца значительно выше, чем у детей, которые «переросли» аллергию к куриному яйцу sIgE к экстракту аллергенов яйца А. 20 кЕ/л Б. 25 кЕ/л sIgE к овомукоиду 12 кЕ/л 0,4 кЕ/л Нарушение элиминационной диеты АтД, аллергический ринит, бронхообструкция Нет симптомов sIgE при лекарственной аллергии 38 In vitro тесты Доступны только для нескольких препаратов 39 http://www.phadia.com/en/Allergen-information/ImmunoCAP-Allergens/Drugs/ БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !