Методы специфической аллергодиагностики
реклама
Аллергодиагностика in vitro. Кирилл Архипов Заместитель директора по маркетингу «Алкор Био» Санкт-Петербург, Россия Заболеваемость аллергическими заболеваниями Западная Европа 25 - 30% Отдельные экологически неблагоприятные регионы 50 - 60% Промышленные районы России 15 - 35% Заболеваемость среди детей в крупных промышленных городах 10 - 40% (Р.М. Хаитов, И.С. Гущин, 1998, «Молодежь Эстонии» 18.07.05) Заболеваемость бронхиальной астмой в Латвии % от общей численности населения 6% 5% 4% 3% 2% 1% 1971 1981 0% Год (Ежедневная газета Латвии 15.09.2005) 1992 Методы специфической диагностики 1. Сбор аллергологического анамнеза 1. Аллергологическое обследование Проведение тестов in vivo: Кожные пробы Провокационные тесты с аллергенами Диагностика in vitro: Определение общего IgE Определение уровня специфических IgE Определение уровня специфических IgG Кожное тестирование – основной метод специфической аллергодиагностики Аллерген воздействует на клетки кожи • Prick (укольный) тест • Скарификационные пробы • Внутрикожные пробы • Patch (аппликационный) тест Укольный тест • Учёт реакции через 15 минут по отношению к (+) и (–) контролям. • Самый специфичный из всех кожных тестов. Внутрикожная проба • Учёт реакции через 20 минут по отношению к (+) и (–) контролям и через 24 часа. • Самый чувствительный из всех кожных тестов. Аппликационный path-тест • Для выявления аллергических реакций замедленного типа на контактные аллергены. • Учёт реакции через 48 и 72 часа • Для диагностики пищевой аллергии при атопическом дерматите у детей - Положительная проба ассоциируется с поздней фазой клинической реакции, наблюдаемой при пищевом провокационном тесте. Провокационные пробы Аллерген воздействует на клетки шокового органа • • • • Конъюктивальный тест Эндоназальный тест Ингаляционный тест Пищевой провокационный тест Показания Показания кк проведению проведению провокационных провокационных проб проб • Несоответствие результатов кожных тестов данным анамнеза Анамнез положительный, а кожные тесты отрицательные Кожные пробы положительные, а симптомов болезни при контакте с аллергеном нет • Уточнение причинной значимости и чувствительности к аллергену перед проведением СИТ Назальный провокационный тест • Аллерген в виде пудры, с хорошей назальной абсорбционной способностью, стандартизован и дозы оттитрованы в AU. • Капсулы содержат порошок аллергена в 2-х дозировках и плацебо, пригодны для распыления с помощью ингалятора. Пищевой провокационный тест • Тест двойного- слепого плацебо контролируемого провокационного исследования - "золотой стандарт" диагностики пищевой аллергии. • Желатиновые капсулы содержат 10-кратно увеличивающиеся дозы высушенного пищевого продукта и плацебо. Преимущества использования тестов in vitro • Нет противопоказаний к обследованию • Не вызывают дополнительной сенсибилизации, нет риска анафилактических реакций • Нет возрастных ограничений, возможно проводить в самом раннем возрасте • Любое число тестируемых аллергенов, выявление поливалентной сенсибилизации. • Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на расстоянии) Показания к определению концентрации специфических IgE • Необходимость уточнения причинно-значимого аллергена во всех случаях, особенно при сомнительных результатах кожного тестирования • Дифференциальная диагностика аллергических и неаллергических (псевдоаллергических) заболеваний Показания к определению концентрации специфических IgE Затруднение или невозможность проведения тестов in vivo: • • • • • • • • ранний детский возраст пациенты с высокой степенью сенсибилизации обострение основного заболевания декомпенсированные состояния болезней сердца, печени, почек и системы крови период после острой аллергической реакции невозможность отмены антигистаминных, гормональных и других препаратов измененная реактивность кожи исследование с большим количеством аллергенов одновременно Показания к определению концентрации специфических IgE • Выявление скрытой (субклинической) сенсибилизации – обнаружение высоких уровней специфических IgE-антител при отсутствии клинических проявлений свидетельствует о повышенном риске возникновения аллергических реакций на данные аллергены • Мониторинг концентрации IgE при проведении специфической иммунотерапии. Классификация тест-систем по принципу анализа • • «Классический» иммуноанализ (RIA, ELISA, LIA) - аллергосорбентный тест - реверсивный аллергосорбентный тест («capture») Экспресс методы (Иммуноблот, Иммунохроматография) Аллергосорбентный тест Ig G IgG IgE IgE Меченое антитело к IgE IgG Специфический IgE Аллерген IgG IgE Ig G Ig G G Ig IgG IgG IgG Аллерген IgG I gG IgG IgE IgE IgG Аллергены иммобилизованы на твердой фазе (лунка, бумажный диск, нитроцеллюлёзная мембрана) IgG Ig G Особенности аллергосорбентных тест-систем • Высокие требования к сорбционной емкости твердой фазы • Фиксированные панели аллергенов (лунки, мембраны) • Для тест-систем на дисках: большая трудоемкость, невозможность полной автоматизации • Количественный или полуколичественный результат Сравнительные характеристики тестсистем, «аллергосорбентный тест» Производитель Количество аллергенов Носитель для аллергенов Длительность теста Себестоимость 1 анализа, руб «АллергоИФА спец IgE» Алкор Био 293 Жидкие 1 час 45 мин ? «C.A.R.L.A.» RADIM 293 Жидкие 1 час 45 мин 77 ФГУП «Аллерген» полуколич. 96 Лунка 3 часа 20 Иммунотэкс (Ставрополь) полуколич. 170 Лунка 3 часа 20 Hycor Biomedical 800 Бумажный диск D-r Fuke (Германия) микропланшетный формат 970 Бумажный диск 3 часа 110 Spec. IgE ELISA Allergopharma (Германия) 360 Бумажный диск 8-16 часов 140 R-biopharm (Германия) 600 Бумажный диск 3 часа 140 100 Реверсивный аллергосорбентный тест («capture», REAST) • Используются жидкие биотинилированые аллергены • На твердой фазе иммобилизованы антитела к IgE IgG IgG I gE IgE IgG IgG IgE IgG Специфический IgE Антитело к IgE Ig G IgG Ig G IgG IgG I gG Ig G Специфические антитела к IgE Ig G Ig G Ig E Меченый аллерген IgG Ig G IgE Особенности реверсивных аллергосорбентных тест-систем • Емкость твердой фазы имеет меньшее значение • Нет фиксированных панелей аллергенов – свободный выбор в каждом анализе • Возможна постановка на автоматических анализаторах • Количественный результат Сравнительные характеристики тест-систем, «реверсивный аллергосорбентный тест», (REAST, «Capture») Производитель Количество аллергенов Длительность теста Себестоимость 1 анализа, руб «АллергоИФА спец IgE» Алкор Био 293 1 час 45 мин ? «C.A.R.L.A.» RADIM 293 1 час 45 мин 77 D-r Fuke (Германия) Микропланшетный формат 300 3 часа 120 Экспресс-тесты Носитель для аллергена нитроцеллюлезная мембрана Особенности тест-систем для экспресс-диагностики • • • • • • • Предназначены для качественной оценки Фиксированные панели аллергенов Спектр аллергенов ограничен Высокая стоимость анализа Специальное оборудование для «количественной» оценки Требуют большого объема крови (от 250 мкл) Просты в использовании Сравнительные характеристики тестсистем, иммуноблоты Производитель Количество аллергенов Длительность теста Cтоимость 1 анализа, руб «АллергоИФА спец IgE» Алкор Био 293 1 час 45 мин ? «C.A.R.L.A.», RADIM 293 1 час 45 мин 77 Иммунотех (Москва) 25 4 часа 14 (360) «Allergodip» (Allergopharma, Германия) 36 24 часа 70 (630) «FastCheckPOC» (DST Diagnostische, Германия) 24 30 мин. 50 (600) 32 аллергена 12 смесей 30 мин. от 200 40 130 мин. 85 (850) «ALFA» (Dr Fooke, Германия) «RIDA AllergyScreen» (R-biopharm, Германия) Автоматические системы в аллергодиагностике • Alisei Q.S. (RADIM), Италия • IMMULITE 2000 (DPC, США) • ImmunoCap (Phadia, Германия-Швеция) • MAST-CLA (Hitachi, США) • HYTEC 288 Plus (Hycor Biomedical, США-Германия) Автоматические системы в аллергодиагностике ImmunoCap (Phadia, Германия-Швеция) Более 700 аллергенов Длительность 1 цикла с максимальной загрузкой около 4 часов Максимальное количество анализов за 1 цикл - 46 Стоимость 1 исследования 150 – 300 руб. Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» для количественного определения специфических антител класса IgE в сыворотке крови человека Состав тест-системы «АллергоИФА-специфический IgE» Набор на 96 определений • Комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов • Калибровочные пробы, содержащие известные количества общего • • • • • • IgЕ: 0, 0,5, 1, 5, 25 и 100 МЕ/мл – 6 флаконов (по 0,5 мл) Конъюгат Анти-IgE-биотин Конъюгат стрептавидин-пероксидаза Концентрированный буферный раствор для промывки лунок Раствор ТМБ Стоп-реагент Контрольная сыворотка Аллергены • 293 отдельных наименований аллергенов и смесей в 13 группах • Полностью готовы к использованию, разлиты во флаконы, в объёме, расcчитанном на 24 определения • Свободный выбор аллергенов для тестирования, в зависимости от потребностей • Тест-система полностью совместима с аллергенами производства компании RADIM (Италия) • Также комплектуется аллергенами производства Алкор Био Аллергены производства Алкор Био Наименование аллергена 1Молоко коровье, f2 2Белок яйца, f1 3Шерсть кошки, e1 4Клещ дом.пыли (Derm.pter.), d1 5Домашняя пыль, h1 6Треска, f3 7Береза, t3 8Полынь, w6 9Тимофеевка, g6 10Ольха серая, t2 11Овсяница, g4 12Плевел (райграсс), g5 13Мятлик, g8 Аллергены Группа аллергенов Количество в ассортименте Смеси аллергенов 18 Пищевые аллергены 109 Пыльца деревьев 31 Эпидермальные и белки животного происхождения 24 Сорные травы 24 Луговые травы 19 Плесневые и дрожжевые грибы 22 Профессиональные аллергены 15 Лекарственные вещества 10 Яды насекомых 10 Клещевые аллергены 8 Аллергены домашней пыли 2 Паразитарные аллергены 2 Схема постановки анализа на планшете 96 определений. Аллергены (до 82 наименований) ырот арбилаК Бланк Контрольная сыворотка Метод, заложенный в основу тест-систмы «АллергоИФА-специфический IgE» Количественный иммуноферментный метод определения концентрации специфического IgE, вариант “capture” (реверсивный аллергосорбентный тест) Меченый аллерген Специфический IgE Антитело к IgE Требования, предъявляемые к диагностическим тест-системам • Высокая точность и надежность результата • Удобство использования • Экономичность • Универсальность Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» Специфичность исключение из участия в реакции антител, относящихся к не IgE классам иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM), а также других неспецифических факторов Чувствительность Единая твердая фаза от 0,15 МЕ/мл. для образцов и калибровочных проб Количественный результат (в классах и в МЕ/мл) Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» Полностью готовые к использованию реагенты Длительность исследования – 1 час 45 минут Возможность полной автоматизации Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» Аллергены используются по отдельности, исходя из потребности конкретной лаборатории Технология «Breakable strips» позволяет свободно варьировать количество анализируемых проб Достаточно стандартного ИФА оборудования (Спектрофотометр вертикального сканирования, Шейкер, позволяющий производить встряхивание с частотой 500-800 об./мин) Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» Стоимость реагентов для определения концентрации специфического IgE к 1 аллергену от 60 руб. Срок хранения набора 12 месяцев Набор реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» ТИП АНАЛИЗА ОБЪЕМ ПРОБЫ «Capture» вариант ИФА Колориметрическая детекция при 450, 50 МКЛ 405 и 620 нм ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ 0,15 МЕ/мл КАЛИБРОВКА УЧЕТ ОТВЕТА 0; 0,5; 1; 5; 25; 100 МЕ/мл Количественный МЕ/мл, В класс. от I до V СТОИМ. 1 ИССЛ. от 60 руб. Интерпретация результатов определения IgEантител Общий IgE: интерпретация результатов диагностики in vitro • • • • • Повышение уровня общего IgE может быть вызвано не только атопией, а целым рядом других заболеваний, в т.ч. глистными инвазиями, иммунодефицитами, бронхопульмональным аспергиллезом и др.. Нормальный уровень общего IgE в сыворотке крови не отрицает наличия сенсибилизации. Примерно у трети больных атопическими заболеваниями уровень общего IgE может находиться в пределах нормы (30-100 кЕ/л). При сенсибилизации к одному (нескольким) аллергенам содержание общего IgE может быть в пределах нормы, а специфического IgE повышено. Концентрация общего IgE в сыворотке крови может быть в пределах нормы при неатопических состояниях - неиммунной природы хронической рецидивирующей крапивнице и ангионевротическом отеке. Верхняя границы нормы общего IgE (100 кЕ/л) у представителей зон, эндемичных по гельминтозам, может быть выше обычной. Специфический IgE: интерпретация результатов диагностики in vitro • • • • • • Отрицательный результат исследований на специфический IgE может быть обусловлен стратегией скрининга (отсутствовал тест на этот аллерген) Отсутствие специфического IgE в сыворотке периферической крови не исключает возможности участия в патогенезе IgE-зависимого механизма аллергической реакции, так как возможен местный синтез IgE или связывания синтезированного Ig E тканями, что может происходить без изменения концентрации специфического IgE в периферической крови. Антитела других классов, особенно IgG (IgG4), специфичные к аллергену, в определенных случаях могут быть причиной ложноотрицательных результатов. Высокий уровень аллергенспецифического иммуноглобулина Е характеризует наличие высокого уровня сенсибилизации только по отношению к конкретному изучаемому аллергену. При высоких концентрациях общего IgE чаще могут возникать ложноположительные результаты исследований на специфические IgE, т.к. в таких условиях повышается вероятность связывания неспецифических IgE с аллергеном. Окончательное заключение и интерпретация лабораторных данных должны быть сделаны специалистом-аллергологом на основании сопоставления результатов лабораторных исследований с клинической картиной и данными аллергологического анамнеза. Ложноположительные результаты • Ложноположительные результаты м.б. из-за перекрёстного реагирования аллергенов. • IgE-антитела нередко обнаруживаются у лиц без клинических проявлений гиперчувствительности к данному аллергену. Ложноотрицательные результаты • Количество свободно циркулирующих в кровотоке IgE-антител ниже чувствительности используемой тест-системы. • Наличие в сыворотке IgG-антител к данному аллергену. • Не IgE-опосредованный механизм аллергии. • Практически все IgE-антитела фиксированы на клетках. • Несоответствие структуры аллергена in vitro, аллергену образующемуся в организме (лекарственные, пищевые аллергены) Спасибо за внимание!
