Нарушения показателей иммунного ответа у детей Украины

ДІАБЕТIСЕРЦЕ
№2 / 2010
Нарушения показателей
иммунного ответа у детей Украины,
проживающих в 4-й зоне,
по истечении 23 лет после Чернобыльской катастрофы
Л.В. КУЗНЕЦОВА1, д. мед. н., професор; М.Р. ШЕЙХ САДЖАДЕ1,2,
В.Б. БОЖЕНКО2, Л.К. ТИТКОВА2, О.Ю. ВАСИЛЬЕВА2, А.В. ЮРКО2
/1 Национальная медицинская академия последипломного образования имени П.Л. Шупика, Киев;
2
Украинский специализированный
диспансер радиационной защиты
населения, Киев/
Резюме
Порушення показників імунної відповіді у дітей України, що проживають
у 4-й зоні, через 23 роки після Чорнобильської катастрофи
Л.В. Кузнєцова, М.Р. Шейх Саджаде, В.Б. Боженко, Л.К. Титкова, О.Ю. Васильєва, А.В. Юрко
В ході дослідження вивчався вплив показників складу імунної відповіді у дітей і підлітків України у зв’язку
з аварією на Чорнобильській АЕС. Досліджено 75 дітей, що мешкають у 60–90-кілометровій зоні, розподілені на три групи: 21 пацієнт у віці від 4 до 9 років (1-ша група), 28 дітей у віці від 10 до 13 років (2-га група),
26 дітей у віці від 14 до 18 років (3-тя група). Контрольну групу складали 20 практично здорових дітей, що
мешкають у м. Києві, донорів крові. Визначення клітин кілерів проводили за допомогою реакції розеткоутворення з еритроцитами, на яких адсорбовані моноклональні антитіла проти рецепторів CD16.
Циркулюючі імунні комплекси в сироватці крові визначали за допомогою метода спектрофотометрії.
Для оцінки доз опромінення досліджуваних дітей використовувався метод спектродозиметрії.
Підвищення процентної кількості CD16+ у 2-й та 3-й групах має достовірні відмінності порівняно з донорами. Рівень циркулюючих імунних комплексів у всіх групах має достовірні відмінності порівняно з показниками донорської групи. Таким чином, виявлено порушення функціонального стану неспецифічної резистентності імунної системи.
Ключові слова: імунний статус, радіація, циркулюючі імунні комплекси, Чорнобильська катастрофа
Summary
Impairment of Immunological Parameters in Ukrainian Children Related to Zone
4 after Chernobyl Accident
L.V. Kuznetsova, M.R. Sheikh Sajjadieh, V.B. Bojenko, L.K. Titkova, O.Yu. Vasilieva, A.V. Yurko
The aim of this study was determined change of non specific resistance immune reaction in Ukrainian children
after 22 years from Chernobyl accident. 95 participate indicated in four groups. Group I: 21 participate aged 4
to 9 years, that located at 60 to 90 km from center accident at zone 4, Group II: 26 participate aged 10 to 13
years from same location at zone 4, Group III: 28 participate aged 14 to 18 years from same location at zone 4
and Group IV: 20 health participate aged 5 to 15 years from Kiev that located 100 km from center accident. The
presences of radioactive substances inside the human body obtained by spectrometry. Peripheral blood
leukocytes from buffy coats were analyzed for cellular barriers to infection (CD16) by roseting method using
erythrocytes that conjugated with monoclonal antibody against antigen CD16. We analyzed the serum
concentration of circulation immune complex (CIC) by photometric method. Phagocytes activity performed
by using latex article (diameter 1.0 to 1,3) and phagocytic index calculated. Statistical analysis was done used
SPSS 12 for windows XP professional. P<0,05 was consider significant. Percent of CD16 in groups II and III increased
significantly in comparison to control group at P<0,05. Concentration of CIC increased significantly in all study
groups, comparison to control group at P<0,001. Phagocytes activity and phagocytic index decreased
significantly in all study groups comparison to control group at Р<0,001. The non specific resistance immune
reaction of study groups that located in region contamination radioactive has changed .Our data have shown,
this changed may be related to low dose radiation depended to 137Cs.
Key words: non specific resistance immune reaction, Chernobyl’s children, circulation immune complex
В 1986 году 26 апреля произошла самая тяжелая в истории
атомной промышленности авария на 4-м блоке Чернобыльской
АЭС в бывшей Украинской Республике Советского Союза.
Взрывы, разрушившие корпус реактора Чернобыльской АЭС, и
последовавший за ними пожар, продолжавшийся 10 дней, привели к значительному выбросу радиоактивных материалов в
окружающую среду [1, 6, 7, 10, 11]. Облако, образовавшееся от
горящего реактора, разнесло различные радиоактивные материалы, прежде всего – радионуклиды йода и цезия, по большей
28
части территории Европы. Радиоактивный йод-131, составляющий
основную часть дозы облучения щитовидной железы, имеет короткий период полураспада (8 дней) и в течение первых недель
после аварии в основном распался. Радиоактивный цезий-137
(137Cs), являющийся источником внешнего и внутреннего облучения, имеет гораздо больший период полураспада (30 лет), и
измерения все еще показывают его присутствие в почве и некоторых пищевых продуктах во многих районах Европы [4, 5, 8,
13–15]. Наибольшие выпадения отмечались на значительных
Клінічні дослідження
территориях Советского Союза, расположенных вблизи реактора и относящихся теперь к территориям Беларуси, Российской
Федерации и Украины [1, 2]. Известно, что повреждение иммунологических функций организма может быть связано с риском
различных заболеваний и увеличением смертности населения.
Такие изменения могут быть обусловлены радиационноиндуцированным подавлением или стимуляцией иммунной системы. Одной из основных функций иммунной системы человека
является защита организма от инфекций, от некоторых заболеваний раком. Это достигается путем иммунного ответа и защитных
барьеров. Иммунный ответ, прежде всего, осуществляют лейкоциты. Существует две группы механизмов, которые лежат в основе функционирования иммунной системы: механизмы врожденного и приобретенного иммунитета. Механизмы врожденного
иммунитета включают кожу и слизистые оболочки, лизоцимы,
циркулирующие факторы (такие как система комплемента и
интерфероны), провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6 и ТNF-а),
фагоциты и естественные киллеры (NК-клетки). Одним из ведущих
клеточных факторов неспецифической резистентности является
фагоцитарный процесс, осуществляемый фагоцитами крови и
периферических органов. В систему мононуклеарных фагоцитов
входят моноциты крови и различные макрофаги (купферовские
клетки печени, альвеолярные макрофаги, макрофаги соединительной ткани, клетки Лангерганса, остеокласты). Все они возникают из гемопоэтической стволовой клетки, проходят ряд стадий (монобласт, промоноцит, моноцит, макрофаг) и созревают
под влиянием колониестимулирующего фактора, выделяемого
Т-лимфоцитами, зрелыми макрофагами и фибробластами. В
исследованиях in vitro было установлено, что активированные
макрофаги и лимфоциты образуют клеточные кооперации [3].
Первые обладают способностью изменять состояние внеклеточ-
Таблица 1. Активность
Группа
137
Cs по группам
Количество (n)
Возраст (M±m)
137
Cs, μci
Первая
21
6,4±1,8
50,48±13,5*
Вторая
28
11,4±1,0
48,57±14,5*
Третья
26
14,9±1,0
53,46±14,1*
Контрольная
20
10,2±3,3
30,05±0,4
Примечание: * – достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05).
ных протеинов коллагена, эластина, плазминогена и др. [4];
вторые вовлекаются в собственно защитные реакции [5]; третьи
являются факторами, регулирующими активность окружающих
клеток, в том числе лимфоцитов [6].
Таким образом, макрофаги могут быть эффекторными, антигенпредставляющими (для Т- и В-) и хелперными клетками. Кроме
того, макрофаги являются неспецифическими супрессорными
клетками, регулирующими разнообразие функций лимфоцитов.
Существенную роль в резистентности, осуществляемой макрофагами, играет синтез этими клетками колониестимулирующих
факторов (G-CSF, GM-CSF) миело- и моноцитопоэза костного
мозга [7].
Естественные клетки киллеры (NK) были впервые описаны как
антиопухолевые клетки, которые осуществляют антителонезависимый лизис клеток-мишеней без предварительной сенсибилизации, которая необходима для активации цитотоксических
Т-клеток. NK представляют собой небольшие лимфоцитоподобные клетки, не относящиеся к типу Т- и В-клеток, характеризующиеся довольно высокой активностью рецепторного аппарата.
Они происходят из больших гранулярных лимфоцитов (LGL) и
лизируют опухолевые и инфицированные вирусами клетки. NK
обеспечивают первую линию защиты против опухолевых клеток
и внутриклеточных инфекций до включения иммунных механизмов
[8]. Они дифференцируются из общей лимфоидной клеткипредшественника и несут на своей мембране дифференцировочные маркеры СD8, СD56 и СD16 (Fc gamma receptor-III).
Содержание их в периферической крови составляет 9–18%.
Главной биологической функцией антител является нейтрализация в организме чужеродных антигенов. Антиген распознают и
связывают естественные иммуноглобулины, выработанные при
предыдущей встрече организма с антигеном. В результате образуются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Естественные
антитела связывают антигены с образованием иммунных комплексов, которые фагоцитируются и разрушаются макрофагами. При
инфекции, вакцинации и воспалительном процессе факторы
неспецифической резистентности организма первыми сталкиваются с «чужими» антигенами и участвуют в иммунном ответе [9,
10]. В начальный период происходит захват и расщепление чужеродных веществ макрофагами, передача антигенной информации Т-, В-лимфоциту. Роль стимулятора макрофага в этот период
исполняют нормальные антитела, комплемент, С-реактивный
протеин, лизоцим, пропердин. В период развития иммунного
Рис. 1. Percent CD16+ cell, X-Bar control charts
29
ДІАБЕТIСЕРЦЕ
ответа цитокины фагоцитов, медиаторы тимуса
и неспецифические митогены Т-хелпера усиливают дифференцировку и бластную трансформацию лимфоцитов.
Цель работы – изучить воздействие показателей ионизирующего излучения в малых дозах
и других влияющих факторов на состояние
эффективности иммунного ответа неспецифической резистентности у детей и подростков, проживающих в 4-й зоне, в связи с аварией на
Чернобыльской АЭС.
Материалы
и методы исследования
Таблица 2. Состояние иммунного ответа у детей Украины, проживающих в 4-й зоне
Показатель
CD 16+, %
30
Контрольная
группа
Группа 1
р
Группа 2
р
Группа 3
р
15,9±2,2
17,5±5,8
0,229
18,8±4,4
0,02
18,3±5,1
0,05
Плазмаферез, %
73±4,0
60,1±12,9
0,001
68±10,9
0,003
63,7±9,9
0,001
Фагоцитарное
число
6,1±0,6
4,3±0,7
0,000
4,9±0,6
0,000
4,7±0,9
0,000
Циркулирующие иммунные
комплексы, ортодианизидин
25,8±5,5
45,5±17,9
0,000
46,7±20,1
0,000
51,2±18,7
0,000
Нейтрофилы, %
56,6±5,4
47,5±9,5
0,002
50,6±7,2
0,01
48,4±9,4
0,004
Моноциты, %
3,5±1,4
3,0±2,2
0,4
3,7±2,4
0,6
2,8±1,7
0,2
Исследовано 75 детей, проживающих в
60–90-километровой зоне, которые были разделены на три группы: 21 пациент в возрасте от 4 до 9 лет
(1-я группа), 28 детей в возрасте от 10 до 13 лет (2-я группа),
26 детей в возрасте от 14 до 18 лет (3-я группа). Контрольную
группу составляли 20 практически здоровых детей, проживающих в г. Киеве, доноров крови (табл. 1). Кровь брали из вены в
пробирку с гепарином (концентрация гепарина 200–250 ED/ML).
Для данных реакций достаточно 3 мл крови. Принцип метода
основан на выделении клеток киллеров с помощью реакции
розеткообразования с эритроцитами, на которых адсорбированы моноклональные антитела против рецепторов CD16
(Гранум-Харьков).
Определение уровня ЦИК спектрофотометрическим методом
проводили на сыворотке крови. Метод основан на селективной
преципитации комплексов антиген–антитело в 3,75% растворе
полиэтиленгликоля 6000 (СФ-46-ЛОМО, СССР) [11].
Для оценки доз облучения обследованных детей использовали метод спектродозиметрии (Гамма полос, Москва).
Определение фагоцитарной активности проводили с использованием в качестве стандартного объекта монодисперсных
частиц латекса диаметром 1,0–1,3 мкм. Для оценки поглотительной способности фагоцитов в культуру вносили по 0,1 мл взвеси
частиц латекса из расчета 100 частиц на 1 клетку и инкубировали
в питательной среде в течение 1 ч при 37 ос. По истечении этого
времени клетки отмывали 5 раз раствором Хенкса от незахваченных частиц латекса. Покровное стекло вынимали, высушивали на
Рис. 2. Phagocyte activation, X-Bar control charts
№2 / 2010
воздухе и окрашивали по Май Гимзу. В препаратах подсчитывали
процент фагоцитирующих клеток [12].
При статистической обработке результатов исследования
были использованы следующие показатели: среднее значение
показателя (М) и среднеквадратическое отклонение (sd).
Достоверность различий между сравниваемыми величинами
оценивали по критерию Стьюдента (two tail).
Результаты и их обсуждение
Согласно оценкам эффективные средние дозы облучения до
2009 года в Киевской области составляли от 30 до 90 микро кюри.
По оценке результатов проведенного исследования определено,
что относительная доза облучения (137Cs) у исследованных групп
имеет достоверно более высокий уровень в сравнении с контрольной группой.
По оценке результатов проведенного исследования определено, что изменение количества клеток киллеров (рис. 1) у пациентов
обследованных групп свидетельствует о достоверно более высоком
уровне относительного числа клеток киллеров (CD16+) в сравнении
с таким же показателем в контрольной группе. Повышение процентного количества CD16+ во 2-й и 3-й группах имеет достоверные
различия по сравнению с донорами, р<0,05 (табл. 2).
Результаты, характеризующие способность фагоцитирующих
клеток крови, свидетельствуют о том, что у исследованных групп
Клінічні дослідження
имеет место существенное (по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе) снижение способности гранулоцитов и моноцитов периферической крови. Снижение количество
гранулоцитов во всех группах имеет достоверные различия по
сравнению с донорами, р<0,05 (табл. 2).
Во всех трех группах больных в большинстве случаев фагоцитарные показатели (рис. 2) достигали нижней границы нормы
(фактор переноса, фагоцитарный индекс), что было значительно
ниже в сравнении с контролем (р<0,001).
Нарушение функций нейтрофилов в виде снижения фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса, также у больных выявлено повышение концентрации иммуноглобулинов [14], изменения субпопуляции Т-клеток, в том числе снижение фракций СD3+,
СD4+ и повышение СD8+ [15] все это может характеризовать
функциональное состояние неспецифической резистентности
иммунной системы.
Исследователями доказано, что фагоцитарные клетки, которые несут на своей мембране дифференцировочные маркеры
Fc gamma receptor-III (СD16+), могут проявлять более высокую
активность иммунного ответа под влиянием Т-клеток, но при этом
снижается их фагоцитарная активность [13].
У здоровых лиц уровень ЦИК был в пределах нормальных
значений (25,8±5,5). В первой группе уровень ЦИК составил
45,5±17,9, во 2-й – 46,7±20,1, в 3-й – 51,2±18,7, что было значительно
выше, чем в группе контроля, р<0,001 (рис. 3).
Литература
8.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
International nuclear safety advisory group. Summary Report on the Post-accident
Review Meeting on the Chernobyl Accident, Safety Series No. 75-INSAG-1, IAEA. –
Vienna, 1986.
Izrael Y.A. et al. Chernobyl: Radioactive Contamination of the Environment. –
Leningrad: Gidrometeoizdat, 1990.
Dayer M. How T-lymphocytes are activated and become activators by cell
interaction // Eur. Respir. J. – 2003. –Vol. 22. – P. 10s-15s.
Rezzonico R., Burger D., Dayer J.M. Direct contact between T lymphocytes and
human dermal fibroblasts or synoviocytes downregulates types I and III collagen
production via cellassociated cytokines // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273. –
P. 18720–18728.
Sebbag M., Parry S.L., Brennan F.M., Feldmann M. Cytokine stimulation of
T-lymphocytes regulates their capacity to induce monocyte production of tumor
necrosis factor-α, but not interleukin-10: Possible relevance to pathophysiology of
rheumatoid arthritis // Eur. J. Immunol. – 1997. – Vol. 27. – P. 624–632.
Weaver C.T., Unanue E.R. T-cell induction of membrane IL-1 on macrophages //
J. Immunol. – 1986. – Vol. 137. – P. 3868–3873.
Jay M. Prevost, Jennifer L. Pelley, Weibin Zhu. Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor (GM-CSF) and Inflammatory Stimuli Up-Regulate Secretion of the
Soluble GM-CSF Receptor in Human Monocytes: Evidence for Ectodomain Shedding
of the Cell Surface GM-CSF Receptor α Subunit // J. of Immunology. – 2002. –
Vol. 169. – P. 5679–5688.
Выводы
У большинства обследованных, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях, наблюдаются изменения
иммунного статуса. Таким образом, выявлено нарушение функционального состояния неспецифической резистентности иммунной системы.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Vivier E., Nunes J.A., Vely F. Natural killer cell signaling pathways // Science. –
2004. – Vol. 306 (5701). – P. 1517–1519.
Lambert P.H., Dixon F.J., Zubler R.H. et al. A WHO collaborative study for the
evaluation of eighteen methods for detecting immune complexes in serum //
J. Clin. Lab. Immunol. – 1978. – Vol. 1. – P. 1–15.
Ritzmann S.E., Daniels J.C. Immune complexes: characteristics, clinical correlations
and interpretative approaches in the clinical laboratory // Clin. Chem. – 1982. –
Vol. 28. – P. 1259–1271.
Фролов В.М., Рычнев В.Е. Исследование циркулирующих иммунных комплексов
их диагностическое и прогностическое значение // Лабор. дело. – 1986. –
№3. – С. 159–161.
Фролов В.М. Определение фагоцитарной активности моноцитов
периферической крови / В.М. Фролов, Н.А. Пересадин, Л.А. Гаврилова //
Лабор. дело. – 1989. – №8. – С. 121–122.
Grage-Griebenow E., Flad H.D., Ernst M. et al. Human MO subsets as defined by
expression of CD64 and CD16 differ in phagocytic activity and generation of oxygen
intermediates // Immunobiology. – 2000. – Vol. 202 (1). – P. 42–50.
Кузнецова Л.В., Шейх Саджаде М.Р., Боженко В.Б. и др. Изучение показателей
гуморального иммунитета у детей Украины, проживающих на радиоактивнозагрязненной территории по истечении 22 лет после Чернобыльской
катастрофы // Імунологія та алергологія. – 2009. – №2 (in press).
Кузнецова Л.В., Шейх Саджаде М.Р., Боженко В.Б. и др. Клиническая
интерпретация показателей Т-лимфоцитарного иммунитета у детей
Чернобыля // Сб. науч. работ сотрудников НМАПО им. П.Л. Шупика. – 2009. –
Вып. 19, кн. 2 (in press).
31