Моноклональные антитела в диагностике и терапии

реклама
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В
ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ
Оловникова Н.И.
Гематологический научный центр
РАМН, ООО «Гематолог»
Москва
ЦОЛИПК
ЦОЛИКЛОНЫ
ЦОЛИКЛОНЫ – ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ
АНТИТЕЛА К ЭРИТРОЦИТАРНЫМ АНТИГЕНАМ,
ВПЕРВЫЕ ПОЛУЧЕННЫЕ В ЦОЛИПКе
( ныне Гематологический научный
центр РАМН)
ПРЕИМУЩЕСТВА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ:
неограниченное количество
отказ от иммунизации доноров
стандартность
специфичность
возможность применять в простых тестах
стабильность
длительный срок хранения
Определение фенотипа крови доноров и создание
банка фенотипированной крови проводят с целью:
1. подбора совместимой для переливания крови, особенно
для реципиентов с иммунными антителами;
2. поиска эритроцитов редких фенотипов и создания панелей для определения специфичности иммунных антител.
Определение фенотипа крови реципиентов проводят:
1. больным с иммунными антителами;
2. больным, в анамнезе которых были несовместимые
трансфузии;
3. больным, которым необходимы многократные
трансфузии;
4. беременным и женщинам детородного возраста.
ИММУНОСЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ
(ФЕНОТИПИРОВАНИЕ)
РЕЗУС
АНТИ-
-D
-C
- CW
-c
-E
-e
АВО
АНТИ-
-A
-B
- AB
- A1
КЕЛЛ
АНТИ-
-K
-k
МАССОВОЕ И МЕТОДИЧЕСКИ ПРОСТОЕ ФЕНОТИПИРОВАНИЕ КРОВИ СТАЛО ВОЗМОЖНЫМ В СВЯЗИ С
ПОЯВЛЕНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ, т.к.
не стало ограничений в количестве реагентов
можно проводить определение всех антигенов
одновременно одним методом
можно выбирать адекватный метод тестирования
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ
1.Создание разнообразных тест-систем
о
л
с
У
е,
и
н
жне
авт о
м
я
и
ц
за
и
т
а
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ
2. Создание олигоклональных реагентов взамен моноклональных.
Эритротест-Цоликлон анти-А: смесь двух МКА, проявляющих разную активность
в отношении нормальных и слабых вариантов антигена А.
Эритротест-Цоликлоны анти-С, анти-с, анти-е также смеси двух МКА.
Эритротест-Цоликлон анти-D (для тестирования крови доноров): смесь
четырех МКА класса IgG, направленных к различным эпитопам антигена D.
Эритротест-Цоликлон анти-D супер – одно МКА класса IgM.
ПРОБЛЕМА ТЕСТИРОВАНИЯ Du
D weak (D слабый) – снижена экспрессия,
антиген не изменен
измененные
эпитопы
D partial (D частичный) – экспрессия разных
вариантов различна,
отсутствует ряд эпитопов
Тип DVI 1
Доноры DVI - Rh-положительные,
положительные
т.к.
1) Эритроциты DVI могут стимулировать
иммунный ответ (?);
2) При наличии анти-D антител у
реципиента посттрансфузионная
реакция при переливании ему
эритроцитов DVI неизбежна (!)
2
3
4
Реципиенты DVI ,
беременные женщины DVI –
Rh-отрицательные,
т.к. могут
вырабатывать антитела против
отсутствующих детерминант
при переливании D-положительных
эритроцитов.
РАЗНОВИДНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕРАПИИ
н
L
CDR
Fab
Fc
Н – тяжелые цепи; L – легкие цепи; Fab – Fab-фрагменты; Fc – Fc-фрагменты; CDR –
комплементарные области (гипервариабельные участки).
Строение молекулы IgG
Антиген-связывающий
участок
Вариабельная
часть (V)
Константная
часть (Fc)
Антитело-зависимая цитотоксичность – основной
иммунный механизм разрушения клеток-мишеней под
действием антител
FcgammaR
МКА
Антиген
Антитела
связываются с
антигеном на
поверхности
клетки-мишени.
Лимфоцит NK
распознает МКА
с помощью
рецепторов
Fcgamma.
Активированный
которые
NK лимфоцит вы- разрушают
брасывает перфо- клетку-мишень.
рины и протеазы,
Гемолитическая болезнь плода (новорожденного) –
I беременность
результат иммунологического конфликта
плода и матери, несовместимых по
резус резус
+
антигену резус RhD
После первых родов D+ эритроциты
плода, попавшие в кровь резус-отрицательной матери, вызывают у нее анти-D ответ.
Иммунные анти-D антитела принадлежат
к иммуноглобулинам класса IgG,
которые при следующей беременности
проходят через плаценту и вызывают
разрушение D+ эритроцитов плода,
что приводит к гемолитической
болезни.
+
+
+
+
+
+
II беременность
Введение анти-резус
иммуноглобулина после родов
предотвращает резусиммунизацию женщины, т.е.
вызывает антигенспецифическую
иммуносупрессию
I беременность
II беременность
Эффекты, которые вызывает анти-резус иммуноглобулин,
введенный после родов:
D+ эритроциты плода быстро (в течение суток) исчезают из
циркуляции матери, если препарат введен в достаточном
количестве(20 мкг/1мл эритроцитов)
Разрушение эритроцитов происходит без участия системы
комплемента, т.е. не наблюдается внутрисосудистого гемолиза
Выведение эритроцитов происходит в селезенке при участии
макрофагов, несущих рецепторы к Fc фрагментам антител
Анти-резус иммуноглобулин вызывает временную толерантность
к D+ эритроцитам и предотвращает появление анти-D антител
Анти-резус иммуноглобулин не эффективен, если сенсибилизация
уже произошла, даже при низком титре иммунных антител
Способность антител прочно связываться с D антигеном
и быстро выводить D+ эритроциты из кровотока не
обеспечивали профилактики анти-резус иммунизации
Свойство анти-D
Специфическое связывание с D антигеном
на эритроцитах
Разрушение D+ эритроцитов in vitro в реакции антитело-зависимой цитотоксичности
Ускорение клиренса D+ эритроцитов из
кровотока через селезенку
Длительная циркуляция в крови,
соответствующая сроку жизни IgG
Ингибирование иммунного ответа на D
антиген
МКА
анти-D
ИГ
анти-D
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
Иммунные реакции на эритроциты,
сенсибилизированные анти-D антителами
Активация
системы
комплемента
Активация/супрессия
иммунокомпетентных
клеток, несущих
Fcγ - рецепторы
Три типа активирующих рецепторов и один тип ингибирующего
рецептора экспрессируются на иммунокомпетентных клетках.
Разные типы рецепторов опосредуют разные типы ответа при
взаимодействии с Fc участком молекулы IgG.
Активирующие рецепторы: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIII
Ингибирующий рецептор: FcγRIIb
NK- лимфоцит
макрофаг
FcγRI
IgG
В-лимфоцит
FcγRIIB
FcγRIIa
FcγRIII
ИГ-рецептор
АГ эритроцита
(D)
активация
активация
подавление
Схема реакции антитело-зависимой цитотоксичности
(АЗЦ)
моноцит NK
б)
а)
ЭР
анти-D
в)
гемоглобин
FcγRI
FcγRIIа
FcγRIII
В реакции АЗЦ разрушение
D+ Эр осуществляется двумя
типами эффекторных клеток,
несущих FcγR –
моноцитами с FcγRI и FcγRIIa,
NK лимфоцитами с FcγRIII.
-D И
Г
Эффективность гемолиза, опосредованная FcγRI и FcγRIII, у монои поликлональных анти-D антител принципиально различны
140
Fcγ( I + III)
120
FcγIII
100
80
60
отан
лизс,%
40
20
0
G-7
G-12
G-17
G-48
анти-D ИГ
анти-D
МКА, которые взаимодействуют только с FcγRI, но
не с FcγRIII, не обладают иммуносупрессорным эффектом.
Использование при отборе анти-D МКА реакции АЗЦ позволило
найти МКА, опосредующие лизис через FcγRIII. МКА с таким
свойством встречаются очень редко: их около 1% от общего
числа полученных.
G-112
Анти-D, 100 нг/мл
G-108
Поликлональная иммунная сыворотка
содержит смесь антител с разными свойствами
различные клоны
плазматических клеток
секретируют
различные антитела
поликлональная
сыворотка
Схема получения клеточных линий, секретирующих
моноклональные антитела человека
В клетка
В-клеточные линии
Структурные и функциональные характеристики
анти-D МКА
МКА
Лег- Под- ЛинияАктивность в Секвенирокая класс продуцент АЗЦ (% от анти- вание Fc
цепь
резус ИГ)
G-108
κ
IgG1
G-112
κ
IgG1
G-12
κ
IgG1
ЛБЛ
ГГ
ЛБЛ
ГГ
ЛБЛ
ГГ
101
53
78
35
19
26
IGHG1*03
Н/д
IGHG1*03
Н/д
IGHG1*03
IGHG1*03
ЛБЛ – лимфобластоидная линия человека; ГГ – гетерогибридома человек-мышь
IGHG1*03 - аллотип IgG1; Н/д – не делали
Таким образом, функционально различные антитела имеют
идентичную аминокислотную последовательность. Это означает,
что их различия определяют посттрансляционные модификации
молекулы иммуноглобулина.
гликозилирование
Структура олигосахарида, присоединенного
к Asn 297 тяжелой цепи IgG человека
VH
CH1
CH2
CH3
Cиаловая к-та (NeuAc)
Asn297
Галактоза
Манноза
N-ацетилглюкозамин
Фукоза
Указанные стрелками сахара могут отсутствовать, что дает
около 30 вариантов (гликоформ), которые обнаруживаются в
нормальном IgG человека
Клетки человека, секретирующие МКА, можно сливать с клетками
других видов и получать гетерогибридомы, секретирующие МКА
человека. Аминокислотная последовательность МКА после слияния
не изменяется, однако в гибридных клетках структура сахара будет
формироваться с участием ферментов миеломной клетки.
Человек/мышь
Мышиная миелома
Р3-Х63-Ag8.653
В-лимфобластоидные
клетки человека
Крысиная миелома
YB2/0
Человек/крыса
В клетках грызунов МКА гликозилируются иначе,
чем в клетках человека.
Влияние линии-продуцента на эффективность гемолиза,
опосредованного FcγRIII: мышиная миелома снижает,
а крысиная повышает сродство анти-D IgG1 МКА к FcγRIII
МКАG-108
3F8
МКА
IgG1
анти-D ИГ
человек
МКА G-12
анти-D ИГ
человек
Вывод:
успех в создании моноклонального
анти-D препарата для профилактики
гемолитической болезни новорожденных
зависит не только от свойств МКА, но и от
клеточной системы для продукции антител
ПРЕПАРАТЫ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, РАЗРЕШЕННЫЕ ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
НАИМЕНОВАНИЕАНТИТЕЛ по USAN
КОММЕРЧЕСКИЕ НАЗВАНИЯ
ФИРМА-ПРОИЗВОДИТЕЛЬ
Ortho Biotech
США, 1994/97
Centocor; Eli Lilly
CD3
Химерные F(ab), IgG1
gpIIb-IIIa, интегрин
αv/β3
Мышиные, IgG2a
Химерные, IgG1
ЕрСАМ
CD20
Разрушение ЕрСАМ+ клеток
Разрушение В-Лф
Zenapax®
Гуманизированные IgG1
CD25
Блокировка IL-2R
Palivizumab
Synagis®
Гуманизированные IgG1
F-белок RSV
Блокировка белка F вируса
Basiliximab
Simulect®
Химерные, IgG1
CD25
Блокировка IL-2R
Trastuzumab
Herceptin®
Infliximab
Remicade®
Gemtuzumab ozogamicin
Mylotarg®
Alemtuzumab
MabCampath®
Гуманизированные IgG1 HER2/neu, рецептор
Разрушение EGF+-клеток
rEGF
Химерные, IgG1
TNF-α
Блокировка активности TNF-α Воспалительные заболевания, США, 1998; EC, 1999
РА, болезнь Крона
Гуманизир.–калиСD33
Разрушение миелоидных
ОМЛ
США 2000
хеамицин, IgG4
предшественников
Гуманизированные IgG1
CD52
Разрушение CD52+ клеток
ХЛЛ
США, 2000; EC, 2001
Ibritumomab tiuxetan
Мышиные- 111 In или - 90 Y,
IgG1
Человеческие, IgG1
CD20
Разрушение В-Лф
В-НХЛ
Adalimumab
Zevalin®
IDEC-Y2B8
Humira®
TNF-α
Блокировка активности TNF-α
Tositumomab
Efalizumab
Bexxar®
Raptiva®; Xanelim
Мышиные- 131 I, IgG2a
Гуманизированные IgG1
CD20
CD11a
химерные -131 I
Гистон Н1-ДНК
Abciximab
ReoPro®
Edrecolomab
Rituximab
17-1А; Panorex®
Rituxan®, MabThera®
Daclizumab
TNT-131 I
Omalizumab
Cetuximab
Xolair®
Erbitux®
Гуманизированные IgG1
IgE
Химерные, IgG1
HER1, рецептор EGF
Bevacizumab
Avastin®
Гуманизированные IgG1
Natalizumab
Tysabri®, Antegren®
Монафрам™
Nimotuzumab
TheraCIM h-R3, Theraloc
Tocilizumab
ACTEMRA 200
Panitumomab
Vectibix™, ABX-EGF
Ranibizumab
Lucentis
ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
РЕГИСТРАЦИЯ
АНТИГЕН/ ЭПИТОП
Orthoclone-OKT3®
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
CША, 1986
ТИП МКА
Мышиные, IgG2a
Muromonab-CD3
Профилактика острого
отторжения при трансплантации
почек
Препятствие взаимодействию Профилактика тромбоза артерий
тромбоцитов с фибриногеном
при коронаропластике
Блокировка активности Ткиллеров
Рак прямого кишечника
В-НХЛ
Германия, 1995
J&J, GlaxoSmithKline
США, 1997; ЕС, 1998Genentech; Biogen IDEC
Профилактика отторжения при США, 1997; EC, 1999
трансплантации почки
Профилактика инфекции RSV США, 1998; EC, 1999
Roche (Швейцария)
Профилактика отторжения при США, 1998; EC, 1998
трансплантации почки
Опухоли молочной железы
США 1998; EC, 2000
Novartis
MedImmune
Genentech
Centocor
Wyeth-Ayerst
Laboratories
Genzyme
РА, псориазный артрит
США, 2002 ; ЕС,
2004
США, 2002; EC, 2003
Abbott Laboratories
Разрушение В-Лф
Блокировка активации Т-Лф
В-НХЛ
Псориаз
США, 2003
США, 2003
GlaxoSmithKline
Genentech; Xoma
НД
Рак легких
КНР, 2003
Препятствие выходу IgE
Блокировка EGFR
Аллергическая астма
Рак прямого кишечника
США, 2004
США, 2004
MediPharm Biotech
(КНР)
Genentech
ImClone Systems
США, 2004
Genentech
США, 2004
Biogen Idec, Elan
РФ, 2004
Фрамон ООО (Россия)
vEGF
Инактивация vEGF при
Рак прямого кишечника
связывания с vEGF-R
Гуманизированные IgG4 α4-субъед. Инегри- Угнетение миграции иммун-ных
Множественный склероз
клеток в очаг воспаления
нов α4β1 и α4β7
Мышиные F(ab)’2
gpIIb-IIIa
Препятствие взаимодействию Профилактика тромбоза артерий
тромбоцитов с фибриногеном
при коронаропластике
Biogen Idec
Гуманизированные
EGF-R
Инактивация EGF-R
Крупноклеточный рак легких
КНР, 2005
YM Bioscience (Канада)
Гуманизированные, IgG1
IL-6
Связывание IL-6
Болезнь Castleman
Япония, 2005
Chugai Pharma USA
Человеческие IgG2
EGF-R
Рак прямого кишечника
США, 2006
Abgenix, Amgen
Гуманизированные, IgG1
Fab
vEGF
Снижение содержания EGF-R в
опухолевой клетке
Блокировка ангиогенеза
Возрастная дегенерация
роговицы глаза
США, 2006
Genentech; Novartis
Работа по исследованию функциональных свойств
моноклональных анти-D препаратов выполнена в
лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН
с участием сотрудников
отдела заготовки крови ГНЦ РАМН,
стационара дневного пребывания ГНЦ РАМН,
станции переливания крови ДЗ г. Москвы,
при финансовой поддержке РФФИ и ООО«Гематолог»
Возможные иммунные реакции организма на введение
по-разному гликозилированных анти-D МКА человека
МКА с «чужим»
сахаром
Рецепторы системы
врожденного иммунитета
Взаимодействие с FcγRIIb
на В клетках
МКА со «своим»
сахаром, способное взаимодействовать с FcγRIII
Взаимодействие с FcγR
на макрофагах селезенки
Реакции воспаления,
презентация АГ,
синтез антител
Инактивация антигенспецифических клонов
В-клеток,
нет синтеза антител
Фагоцитоз,
невоспалительный
путь клиренса АГ,
нет синтеза антител
Скачать