Клеточные источники развития и регенерации печени

Г|:=!
ииниИТТ!
11|1«м* т ••*•»*•
•• *»ниим1м||*11*|
РОССИЙСКДЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦННСКНЯ НАУИ
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
ПОСТАНОВЛЕНИЕ
БЮРО ОТДЕЛЕНИЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК
г. Москва
Протокол №3
«19» февраля 2013г.
Научный доклад: «Клеточные источники развития и регенерации печени»
Докладчик - директор Института фундаментальной медицины и биологии Казанского
(Приволжского) федерального университета, д.м.н., профессор А.П. КИЯСОВ
Заслушав и обсудив научный доклад директора Института фундаментальной медицины и
биологии Казанского (Приволжского) федерального университета профессора А.П. Киясова
«Клеточные источники развития и регенерации печени»,
Бюро Отделения медико-биологических наук РАМН о т м е ч а е т :
В
научных
исследованиях
А.П. Киясова
использованы
теоретические,
экспериментальные и клинические данные по изучению фундаментальных механизмов
развития и регенерации печени, основанные на регистрации фенотипических характеристик и
динамики их изменения различных клеточных типов печени в ходе пренатального онтогенеза,
репаративной регенерации и в условиях ш V^^^о, что позволило внести существенные
коррективы в теорию развития печени млекопитающих и по-новому взглянуть на клеточные
источники регенерации органа.
А.П.
Киясовым
и
его
научной группой
разработана
научная концепция
дифференцировки основного эпителиального клеточного типа печени, гепатоцитов, из двух
клеточных источников: 1) энтодермального эпителия передней кишки и 2) десмин-позитивных
клеток окружающей печень мезенхимы и их потомков, звёздчатых клеток печени, т V^VО и т
Vи^о, доказана возможность независимой дифференцировки эпителиальных клеток печени,
гепатоцитов и холангиоцитов из общей эпителиальной клетки-предшественницы, а также
перспективность применения звёздчатых клеток печени для разработки методов клеточной
терапии заболеваний печени, введены новые трактовки понятий «гепатобласты»,
«холангиобласты»,
в
клиническую
и
лабораторную
практику
внедрены
иммуногистохимические методы диагностики и прогнозирования хронических гепатитов.
В представленных исследованиях доказаны положения, раскрывающие закономерности
цито- и гистогенеза печени человека и крысы, особенности межклеточных взаимодействий
между клетками печени мезенхимного и энтодермального происхождения в ходе
пренатального развития и репаративной регенерации, что имеет важное значение для
понимания процессов регенерации и канцерогенеза печени, раскрыты
противоречия
трансформационной теории развития холангиоцитов на основании детального анализа
фенотипов эпителиальных клеток печени человека в пренатальном онтогенезе человека.
На
основании
проведенных
исследований
сформулированы
методические
рекомендации «Патогистологическая диагностика хронических вирусных гепатитов» (МЗ РФ),
материалы которых используются в деятельности специализированных отделений, получен
патент, создана система практических рекомендаций по применению маркёров отдельных
клеточных типов печени в диагностике опухолевых заболеваний печени и прогнозировании
течения и исхода регенераторного процесса. Результаты проведенных исследований могут
быть использованы в практической гепатологии, морфологической диагностике заболеваний
печени, в учебном процессе государственных образовательных учреждений биологического и
медицинского профиля и последипломной подготовки врачей.
Авторской группой определены перспективы использования полученных результатов в
эмбриологии, гистологии, фундаментальной и клинической гепатологии,
регенеративной
медицине. Факты, свидетельствующие
о возможности мезенхимально-эпителиальной
трансдифференцировки звёздчатых клеток печени в гепатоциты, открывают перспективы
применения этой популяции клеток для разработки методов клеточной терапии заболеваний
печени.
Результаты научных исследований, полученные
А.П. Киясовым, позволяют
рассматривать разработанное направление как перспективное в формировании концепции
применения методов клеточной терапии острых и хронических заболеваний печени. По
данной проблеме опубликовано более ста научных работ в отечественной и зарубежной
литературе, полученные результаты доложены и обсуждены на крупнейших международных
конгрессах по клеточной биологии, гепатологии и гастроэнтерологии, получены патенты.
Бюро отделения медико-биологических наук РАМН ПОСТАНОВИЛО:
1. Одобрить научные исследования, проводимые профессором А.П. Киясовым по новому
направлению
«Клеточные источники развития и регенерации печени». Отметить их
научную значимость и перспективность.
2. Рекомендовать профессору А.П. Киясову:
- расширить комплексные научные исследования по проблеме поиска и идентификации
региональных стволовых клеток в органах пищеварительной системы.
- подготовить методические рекомендации по внедрению методики морфологической
оценки печени после проведения трансплантаций с использованием биомедицинских
клеточных технологий.
- представить материалы научного доклада для публикации в журнале «Вестник РАМН»
Срок - 2й квартал 2013г.
Академик-секретарь
ОМБН РАМН
академик РАМН
^ци^им^1/^
с
В.П.Чехонин
Ученый секретарь
ОМБН РАМН
к.б.н.
•>—-//7
г ^\ ь-~1 Л
К.А.Павлов
К заседанию Бюро ОМБН РАМН
«19» февраля 2013 г.
СПРАВКА
к научному докладу д.м.н., проф. А.П. Киясова на тему:
«Клеточные источники развития и регенерации печени»
Регенеративная медицина - наиболее бурно развивающаяся область медицинской
науки. При этом круг направлений, в которых проводятся исследования, весьма широк. Это
изучение свойств различных популяций стволовых клеток - эмбриональных, кроветворных,
мезенхимных, индукция плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток,
выявление эффектов трансплантации стволовых клеток, изучение возможностей и
перспектив их генетической модификации.
Одним из наиболее
перспективных направлений представляется
поиск и
идентификация региональных стволовых клеток с последующей разработкой методов
направленного воздействия на пул эндогенных стволовых клеток в каждом органе. Тем
удивительнее факт, что в таком органе, как печень, известном своими колоссальными
способностями к регенерации с древнейших времен, региональная стволовая клетка до сих
пор не идентифицирована.
Необходимость идентификации региональной стволовой клетки печени продиктована
значительной
распространённостью
хронических
диффузных
заболеваний
печени,
недостаточной эффективностью существующих методов их лечения, и, как следствие, высокой частотой развития фиброза и цирроза печени в исходе этих заболеваний. Около 500
миллионов людей в мире страдают только от вирусных гепатитов, ежегодная смертность от
хронических гепатитов достигает одного миллиона человек, этот показатель входит в первую
десятку среди всех причин смерти и лидирует в гастроэнтерологии [Ни е1 а!., 2010]. В случае
развития тяжелого фиброза/цирроза печени единственным методом лечения становится
трансплантация органа. Однако существующий дефицит донорских органов, большие листы
ожидания,
высокая
стоимость
трансплантации
и
необходимость
последующей
иммуносупрессивной терапии (Ьогегшш, Апёгеопе, 2007) диктуют необходимость поиска
новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Идентификация стволовой клетки
печени позволила бы перейти к разработке принципиально новых методов лечения
хронических диффузных заболеваний печени, основанных на стимуляции собственных
стволовых клеток в печени больного и применении клеточной терапии, в том числе и
генетически модифицированными стволовыми клетками.
Основной клеточный тип печени, гепатоциты, несмотря на высокий уровень
дифференцировки, несомненно, обладают свойствами стволовых клеток, на что указывает
как их весьма высокий пролиферативный потенциал, так и способность выбрасывать из
цитоплазмы флуоресцентные красители, а также экспрессия маркеров стволовых клеток, в
частности, С-кп.
Второй тип клеток, который традиционно рассматривается как региональные
стволовые клетки печени - это овальные клетки. Впервые эти клетки были описаны в 1958
году Вильсоном и Ледуком, которые установили, что целостность паренхимы может
восстанавливаться, несмотря на отсутствие пролиферации гепатоцитов. В последующем
такая возможность была подтверждена на различных моделях химического повреждения
печени веществами, одновременно с повреждением блокирующими пролиферацию
гепатоцитов.
Овальные
клетки
расцениваются
как
бипотентные эпителиальные
предшественники гепатоцитов и холангиоцитов. Однако овальные клетки не обнаружены в
здоровой печени млекопитающих, да и в случае регенерации печени они появляются в
паренхиме лишь на фоне одновременного химического повреждения и блокирования
пролиферации гепатоцитов. Кроме того, было установлено, что в действительности фенотип
так называемых овальных клеток не отличается от фенотипа низкодифференцированных
гепатоцитов - гепатобластов, что позволяет исключить данный клеточный тип из числа
клеточных типов, претендующих на роль стволовой клетки печени.
Результаты исследований, выполненных в последние годы, также внесли существенные
коррективы в общепринятую теорию, рассматривающую овальные клетки как стволовые
клетки печени. Так, в 1999 году впервые было показано, что гепатоциты могут развиваться
из кроветворной стволовой клетки, то есть клетки не энто-, а мезодермальной (Ре1;егзеп е1 а!.,
1999). В исследованиях, выполненных в рамках республиканской программы по развитию
клеточных технологий в Республике Татарстан, было показано, что ауто-трансплантация
кроветворных стволовых клеток больным с алкогольным циррозом печени приводит к
снижению активности воспаления, выраженности фиброза и напряженности регенераторного
процесса, восстановлению нормальной морфологии синусоидных капилляров и уменьшению
риска канцерогенеза в печени. Изучение в экспериментах на животных клеточных
механизмов, лежащих в основе полученного эффекта, позволило установить, что нативные и
трансфецированные трейсерным геном зеленого флуоресцентного белка кроветворные
стволовые
клетки, трансплантированные
крысам
после
частичной
гепатэктомии,
дифференцируются в гепатоциты, секретирующие характерные для них функциональные
белки, а также в холангиоциты.
Возможность гепатоцитарной дифференцировки кроветворных стволовых клеток, то
есть клеток мезенхимного происхождения, в гепатоциты, обосновывает поиск региональной
стволовой клетки среди мезенхимных клеток печени. Также накапливается
все больше
сведений о ключевом влиянии на развитие печени окружающей ее мезенхимы (Ье Воиапп,
1975; Рикис1а-Та1га, 1981; 1ип§ е1 а!., 1999). В связи с этим возникает вопрос, могут ли
постоянно присутствующие в печени мезенхимные синусоидные клетки быть источником
образования гепатоцитов в ходе развития и регенерации, и какие именно клетки в составе
окружающей печень мезенхимы являются главными для формирования её микроокружения.
Для ответа на эти вопросы необходимы комплексные морфологические исследования
эмбрионов и плодов человека и крысы различных сроков гестации с использованием
иммуногистохимического выявления белков, специфических для определённых клеточных
популяций печени и стволовых клеток.
Среди клеток мезенхимного происхождения наиболее перспективным кандидатом на
роль стволовой клетки печени может стать популяция звёздчатых клеток печени, поскольку
именно они находятся в печени в непосредственном контакте с гепатоцитами, вырабатывают
важнейшие факторы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку клеток (Васпет е1
а!., 1992; ЗсЫгтаспег е1 а!., 1992; Мах^еИ е* а!., 1994; Ескагё!, 1996; АзаЫпа е* а!., 2002;
Рпеётап, 2008), и могут быть получены из кроветворной стволовой клетки (ВаЬа е1 а!.,
2004). Кроме того, они экспрессируют ряд маркеров стволовых клеток, в частности, С-к11. В
этой связи исследования по изучению стволовых потенций данной клеточной популяции как
в онтогенезе, так и при репаративной регенерации, а также в условиях т уИго, являются
весьма актуальными.
Результаты
изучения
закономерностей дифференцировки
клеток
печени в
пренатальном онтогенез печени человека и крысы позволили заключить, что звездчатые
клетки печени не только служат основным клеточным компонентов микроокружения для
дифференцировки гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных стволовых клеток в период
печеночного этапа кроветворения, но и сами имеют фенотипические признаки, общие с
гепатоцитами: так, звездчатые клетки печени экспрессируют цитокератины 18 и 19, тогда как
гепатоциты, напротив, экспрессируют характерный для звездчатых клеток белок
промежуточных филаментов десмин. Более того, как минимум часть этих клеток содержит
также маркеры прогениторных клеток, в частности, Вс1-2. Данные факты позволили сделать
вывод о возможности дифференцировки гепатоцитов не только из энтодермальной кишечной
клетки-предшественницы, но и из мезенхимной десмин-позитивной клетки - звездчатой
клетки печени.
Дифференцировка звездчатых клеток печени крысы в гепатоциты, экспрессирующие
цитокератины, гамма-глутамилтранспептидазу и а-фетопротеин была выявлена в чистой
культуре этих клеток. При этом был установлен ключевой фактор, необходимый для такой
дифференцировки - установление непосредственных межклеточных контактов между
клетками при формирования монослоя.
Однако данная популяция клеток обладает своеобразным дуализмом: с одной
стороны, они проявляют свойства стволовых клеток, тогда как с другой оказывают
несомненное влияние на дифференцировку других клеток. Как уже говорилось выше, в
пренатальном гистогенезе печени они необходимы для дифференцировки гепатоцитов,
холангиоцитов и клеток крови. В экспериментах т \Иго также показано, влияние
кондиционированной среды звездчатых клеток печени на гепатоцитарную дифференцировку
мезенхимных стволовых клеток является более выраженным по сравнению с добавлением
искусственных факторов роста в среду культивирования. Кроме того, в этих экспериментах
при совместном культивировании популяций звездчатых
и мезенхимных клеток
оригинальным способом с помощью флуоресцентного мечения удалось показать отсутствие
слияния клеток этих популяций, следовательно, изменение фенотипа культивируемых
клеток, связано не со слиянием двух разных клеточных типов, а с дифференцировкой
каждого из них.
Поскольку гипотеза о звёздчатых клетках как стволовых клетках печени находит все
больше подтверждений, возникает закономерный вопрос о возможности трансплантации
этих клеток для восстановления печени после её повреждений различной природы. Основная
проблема при решении этой задачи связана с тем, что задача направленной
дифференцировки звёздчатых клеток остается нерешённой. Будут ли трансплантированные
клетки
дифференцироваться
в
гепатоциты,
или
основным
направлением
их
дифференцировки станет трансдифференцировка в миофибробласты?
Эксперименты по трансплантации звездчатых клеток печени, трансфецированных
геном зеленого флуоресцентного белка (ОРР), интактным крысам, крысам после частичной
гепатэктомии и после повреждения четыреххлористым углеродом (ЧХУ) показали, что уже
через 1 сут после трансплантации в печени крыс-реципиентов контрольной и обеих
экспериментальных групп появляются СРР+ клетки, идентичные по размерам и форме
гепатоцитам, что было подтверждено как флуоресцентной микроскопией, так и
иммуногистохимическим окрашиванием с антителами к данному белку. СРР+ клетки были
локализованы преимущественно в первой зоне ацинуса, что подтверждает их миграцию в
печень с портальным
кровотоком. Данный факт свидетельствует о
возможности
дифференцировки звездчатых клеток печени в гепатоциты в условиях т V^Vо, однако нельзя
исключить и возможность образования СРР+ гибридных клеток путем слияния (газюп)
гепатоцитов реципиента и трансплантированных звездчатых клеток печени.
Если у интактных крыс и крыс с токсическим повреждением печени ЧХУ на всех
исследованных сроках ОРР+ гепатоциты в печени были единичными в препарате, то у крыс,
перенесших операцию частичной гепатэктомии, число ОРР+ гепатоцитов было значительно
выше - до 15-20 клеток в поле зрения через 1 сутки после операции и трансплантации
клеток., Количество ОРР+ гепатоцитов в экспериментальной группе крыс, перенесших
частичную гепатэктомию, было существенно больше, чем в контроле и второй
экспериментальной группе (повреждение печени ЧХУ). Очевидно, что основным стимулом,
усиливающим образование гепатоцитов из трансплантированных звездчатых клеток печени,
служит дефицит паренхиматозных клеток, вызванный удалением 2/3 печени. Постепенное
снижение числа гепатоцитов в течение эксперимента, по-видимому, связано с тем, что к
концу первой недели после частичной гепатэктомии масса печени у крысы достигает
контрольных значений, и процесс регенерации в целом можно считать завершённым. На
этом фоне отмечается появление отдельных мелких округлых клеток, экспрессирующих
ОРР, в синусоидах и в портальных трактах.
В случае трансплантации звездчатых клеток печени интактным крысам (в отличие от
экспериментальных животных) единичные СРР+ клетки, имеющие меньшие размеры и
округлую или более вытянутую (треугольную или близкую к веретенообразной) форму по
сравнению с гепатоцитами, появляются уже через сутки после трансплантации в синусоидах
печени и в портальных трактах.
Таким образом, свежевыделенные звездчатые клетки печени, трансфецированные
геном СРР и трансплантированные в воротную вену крысам, мигрируют в печень
реципиента, заселяют её и сохраняют свою жизнеспособность в течение не менее чем двух
недель после введения (максимальный срок эксперимента). Более того, они уже в первые
сутки после трансплантации дифференцируются в гепатоциты, по-видимому, сначала
заселяясь в синусоиды (пространство Диссе). При этом максимальное число ОРР+
гепатоцитов отмечено после трансплантации крысам, перенесшим частичную гепатэктомию.
Число донорских гепатоцитов при этом не меньше, а в некоторых образцах больше, чем
после трансплантации фракции мононуклеаров пуповинной крови человека (Апёгееуа е1 а!.,
2010). Более того, несомненным преимуществом трансплантации звездчатых клеток печени
является более раннее появление таких гепатоцитов (уже через 1 сутки, тогда как после
трансплантации клеток пуповинной крови - только через 5 суток), что может иметь важное
практическое значение в ситуациях, требующих быстрого восстановления паренхиматозных
клеток печени.
При иммуногистохимическом окрашивании гистологических срезов печени всех
групп с антителами к ОРР нами не было выявлено клеток внутрипеченочных желчных
протоков, экспрессирующих этот протеин, что позволяет сделать вывод о том, что
звездчатые клетки печени, трансплантированные интактным и экспериментальным крысам,
не способны дифференцироваться в холангиоциты, в отличие от мононуклеаров пуповинной
крови человека, для которых такой путь дифференцировки был установлен (Апйгееуа е1 а!.,
2010).
В ответ на трансплантацию звездчатых клеток печени в печени крыс-реципиентов во
всех группах животных (контроль, частичная гепатэктомия, токсическое повреждение ЧХУ)
происходило увеличение десмин+ звездчатых клеток печени уже через двое суток после
трансплантации. Клетки имели выраженные разветвлённые отростки, через 7 суток после
введения число десмин-позитивных клеток становилось несколько выше, а через 14 суток их
количество снижалось, отростки клеток укорачивались. Ни на одном из изученных сроков ни
в одной из групп не было отмечено трансдифференцировки звездчатых клеток печени
реципиента и донора в миофибробласты,. Отсутствие трансдифференцировки звездчатых
клеток печени в миофибробласты свидетельствует о низком риске развития фиброза печени
в результате трансплантации этих клеток.
Трансплантация звездчатых клеток печени не приводит к существенным изменениям
активности пролиферации гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток в процессе
регенерации печени после частичной гепатэктомии и повреждения ЧХУ. Установлено,
однако, что трансплантация свежевьщеленных звездчатых клеток печени приводит к резкому
снижению активации стволового компартмента в печени крыс-реципиентов,
обычно
наблюдаемой после частичной гепатэктомии и повреждения печени ЧХУ (ОЬ е1 а!., 2002;
Оагхгоу е! а!., 2008), что проявилось в практически полном отсутствии клеток,
экспрессирующих такие маркеры стволовых и прогениторных клеток как С-кй, Ок14, Вс1-2.
Данный факт согласуется с полученными нами ранее данными о том, что трансплантация
крысам, перенесшим частичную гепатэктомию, мононуклеаров пуповинной крови человека
также приводит к значительному (но не такому выраженному, как после трансплантации
ЗКП) снижению в печени крыс-реципентов числа С-К11+ гепатоцитов и синусоидных клеток
(Апйгееуа е1 а!., 2010). Очевидно, таким образом,
что после
трансплантации
стволовых/прогениторных клеток в активации собственных стволовых клеток, по-видимому,
не возникает необходимости, то есть введенных клеток достаточно для восстановления
утраченной паренхимы печени. Эти же клетки обеспечивают, вероятно, и паракринную
регуляцию регенераторации. Единичные клетки печени, расположенные главным образом в
синусоидах, подвергались апоптозу, на что указывала экспрессия ими каспазы-3.
Таким образом, звездчатые клетки печени, являются одним из главных кандидатов на
роль региональной стволовой клетки печени. Выделенные, а затем трансплантированные
интактным крысам, крысам после частичной гепатэктомии или токсического повреждения
печени, звездчатые клетки могут дифференцироваться в гепатоциты и не способствуют
развитию фиброза печени, что подтверждает их важную роль в регенерации печени и
возможную принадлежность к прогениторным клеткам печени. Следовательно, значение
звёздчатых клеток печени не ограничено только накоплением ретиноидов, синтезом
межклеточного вещества и участием в ремоделировании матрикса печени. Это важнейший
клеточный тип, участвующий в регенерации печени и необходимый для дифференцировки её
эпителиальных клеток. Полученные факты открывают новые перспективы для разработки
методов адресной активации звездчатых клеток печени, и применения этих клеток для
клеточной терапии заболеваний печени.