Киреева Елена, Егорова марина

М.В.Егорова (студентка), Е.В.Киреева (студентка)
РАЗВИТИЕ КОНЕЧНОСТЕЙ У ЛИЧИНОК ЛЯГУШКИ В НОРМЕ И ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Город Ярославль, ЯрГУ им.П.Г.Демидова
Актуальность
Сегодня, в связи с развитием фабрик, заводов, фармацевтических и
медицинских объектов, вопрос о загрязнении среды стал наиболее остро.
Многие отходы сельского хозяйства, медицинской и фармацевтической
промышленности (что является наиболее опасным) попадают в воду. И соединения, которые в обычном состоянии являются не опасными, в растворенном виде достигают максимума своей токсичности. Подводя итог выше
сказанному, можно сделать вывод, что водная среда подвергается сейчас
наибольшему загрязнению, и довольно часто необратимому. Поэтому, если найти гидробионтов, которые позволят провести экспресс анализ состояния того или иного водоёма, можно уже на ранних стадиях загрязнения определить его, и прибегнуть к мерам очистки.
На наш взгляд, такими объектами могут служить личинки лягушки
травяной.
Научная новизна
1)Уточнение сроков появления отдельных скелетных элементов, связок, суставов, мышц (всего того, что идет на формообразование).
2)Одновременно исследуется нормальное развитие и развитие при
действии различных токсикантов.
3)Возможна экспресс оценка (быстрое определение по анатомическим признакам).
4)Можно проводить анализ цитологический, гистологический, органный.
Практичность
1)Дешевая диагностика водоёмов
2)Достаточная показательность
3)Данная методика не требует дополнительного оборудования
Инновация
1)Раньше лягушек не использовали как тест объект.
2) С помощью этой методики можно проводить самые первые оценки
парковых ландшафтов и природных территорий.
3) Можно проводить оценку рыбохозяйственных прудов, грунтовых
вод.
Введение
Морфогенетический подход привлекает тем, что он допускает применение эксперимента и потому способен дать относительно строгую
причинную оценку конкретных нарушений в гистогенезе. Сравнительноанатомический материал дает возможность подвергнуть причинному анализу условия морфогенеза структур, влияние факторов среды на эмбриональные закладки.
Лягушка – наиболее распространённый объект экспериментальных
исследований, который используют практически во всех областях биологии (физиологии, биохимии, биофизике, зоологии), медицине, ветеринарии и др. Лягушки обитают в водной и наземной средах. Однако, в литературных источниках очень мало внимания уделяется развитию лягушки.
Их личинки – головастики абсолютно не похожи на взрослых особей [9],
являются уязвимым объектом для токсикантов водной среды.
Конечности амфибий являлись предметом многочисленных исследований. Классическая эмбриология занималась вопросом – как происходит
их развитие? Экспериментальная эмбриология выясняла взаимозависимость клеток и тканей в развитии конечностей. Конечности хвостатых амфибий являются излюбленным объектом специалистов по регенерации.
Аномалии развития конечностей могут являться маркерами нарушений
онтогенеза и свидетельством о загрязнении водных объектов, что может
служить экспресс-анализом среды.
Цели работы
Показать особенности развития задних и передних конечностей в
эмбриогенезе лягушки травяной Rana temporaria, выявить возможности
оценки водной среды по особенностям развития личинки.
Задачи
1)изучить особенности развития личинок
2)определить по показательным признакам стадии развития головастиков
3)выявить возможные аномалии в развитии личинок при наличии в
водной среде кадмия и тиреоидных гормонов.
Материалы и методы исследования
Исследования проводились методом лабораторной обработки. Выборка носит случайный характер. Объем выборки составил 124 особей.
Вылавливались из естественных водоемов на территории города Ярославля.
Личинки вылавливались случайным образом, после перехода на активное питание резко увеличивается асинхронность в развитии головастиков. В лаборатории головастики усыплялись раствором эфира. Фиксация
осуществлялась в стеклянной таре раствором 10-%ного формалина, предварительно спустив воду, в которой находились личинки лягушки. Затем
производился осмотр внешнего строения (жаберной крышки, жабр – если
они есть, ротового аппарата, конечностей) исследуемого материала, в ходе
которого были определены стадии развития головастиков. Для стадий 4148 диагностическими признаками являются строение рта и конечностей.
Приготовление препаратов производилось стандартным методом.
Фиксация материала
Для фиксации применялся формалин 40-%ый
в 20-40 раз превы-
шающий объем взятого материала. Головастики при фиксации завязывались в отдельный марлевый мешочек. По окончании фиксации излишнее
количество формалина необходимо удалить при помощи промывки в проточной воде в течение 24-48 суток [8].
Заливка материала
Заливали материал в парафин. Для этого головастиков сначала сутки
промывают в проточной воде, затем переносят в батарею спиртов от 70%го до 96%-го за трое суток. Далее головастиков погружают еще раз в 96%ый спирт на 12 часов и после следует обезвоживание в ацетоне. После
ацетона головастиков переносят в ксилол, выдерживают их по 30 мин. 3
раза. Материал на 45 мин. по две порции переносят в насыщенный раствор
парафина в ксилоле, который помещают в термостат при температуре 37 о,
затем переносят последовательно в первый и второй чистый парафин, в
каждом по 30 мин. Для окончательной заливки нужен расплавленный парафин. В бумажную коробочку наливают немного парафина, переносят
головастика, доливают остальную часть парафина так, чтобы полностью
закрыть головастика. [8].
Изготовление срезов
Срезы изготавливали на микротоме при помощи ножа. Получаемые
срезы снимали с ножа кисточкой, слегка смоченной водой, или изогнутой
препаровальной иглой и переносили в воду, нагретую до 40 о, для расправления срезов. Срезы помещают на обезжиренные стекла, покрытые
глицерином. При помощи препаровальной иглы срезы равномерно распределяют на стекле. После заполнения стекла срезами, его помещают в тер-
мостат при температуре 37 о на несколько часов или держат стекло над
пламенем горелки до того, пока не растопится парафин [8].
Окраска материала
В данной работе использовалась окраска материала гематоксилинэозином. Перед окраской материала необходимо удалить парафин, помещая на несколько минут стекла со срезами последовательно в 3 порции
ксилола. Затем срезы пропускали через трехкратную батарею 96%-ых
спиртов. Потом промывали в дистиллированной воде и затем непосредственная окраска сначала в гематоксилине (0,5 сек), а потом через промывку
в дистиллированной воде красят эозином(30-40 сек).
После окраски необходимо провести срезы через 3 раствора 96%-го
спирта (по 1 мин) и столько же через ксилол. В окончании срезы обрабатывают бальзамом [8].
Результаты работы
В процессе проведения исследования были изучены 124 особи (непрерывная серия развития охватывает интервал от 41 до 48-ой стадии). В
качестве конкретных объектов описания выбраны задние и передние конечности. Конечность личинок условно разделена на два отдела поперечной плоскостью, рассекающей конечность в том месте, где ее медиальная
пластинка переходит в поверхность тела животного. Отдел, который расположен впереди от этой плоскости, назван основанием, а лежащий позади от нее – свободным.
В норме, пояс задней конечности. Рис. 1. Пояс задней конечности
или таз на раннем этапе развития состоит, как и плечевой пояс, из двух
хрящевых полуколец. В последствии они срастаются между собой и образуют большой непарный костно-хрящевой кружок. От него отходят два
длинных отростка – крылья подвздошных костей. Правая и левая седалищные кости разделены только у головастика. Можно видеть деструкцию
хряща в центральной области, а на периферии – хрящевую ткань не подверженную деструкции. В среде с кадмием нарушается закладка костной
ткани (останавливается на стадии хряща). В среде с тиреодными гормонами отмечается ускорение образования костной ткани конечностей.
рис.1.п.к. – подвздошная кость
Кости задних конечностей при соединении между собой образуют
суставы:
Тазобедренный сустав. Рис.2. Тазобедренный сустав образован сочленением головки бедренной кости с вертлужной впадиной таза. Впадина
по краю снабжена фиброзным кольцом – вертлужной губой, которая охватывает головку бедренной кости. От этой губы начинается довольно
большая и свободная капсула. Процесс деструкции хряща слабо развит.
рис.2.п.к.- подвздошная кость, г.б.к. – головка бедренной кости, в.п.
– вертлужная впадина, с.с.к. – свободная суставная капсула, в.г. – вертлужная губа
Бедренная кость. Рис.3. Бедренная кость является одной из самых
длинных костей в скелете лягушки. Ее срединная часть – диафиз – слегка
S-изогнута. На проксимальном конце кости находится почти шарообразная головка бедра, входящая в вертлужную впадину таза. Процесс деструкции хряща слабо развит.
рис.3.д.б.к. – диафиз бедренной кости, с.к. – седалищная кость 9-ый
позвонок (крестец).
Рис.4. Девятый позвонок является крестцовым. Его тело выпуклое
спереди и снабжено двумя выпуклыми бугорками сзади. Поперечные отростки крестцового позвонка более расширены, чем прочие, и направлены
немного вверх и назад. Наблюдается деструкция хряща в теле позвонка и
разрушение хряща распространяется к основанию невральных дуг.
рис.4.д.п. – дуга позвонка, п.я. – пульпозное ядро, о.п. – основание
позвонка
Большеберцовая и малоберцовая кости. Рис.5. Большеберцовая и малоберцовая кости в ходе развития срастаются и образуют кость голени.
Закладываются на 41 стадии, а процессы созревания хряща начинаются на
стадии 43. зрелый хрящ преобладает со стадии 48.Под действием токсикантов в водной среде наблюдали удлинение передних и задних конечностей, увеличение размеров хвоста, отсутствие процессов его элиминации,
что свидетельствует о продлении личиночной стадии развития, следовательно, о торможении процессов развития всего организма.
рис.5.б. к. – большеберцовая кость, м.к. – малоберцовая кость
В начале развития конечности лягушки травяной имеют вид бугорков, широким основанием сидящих на теле животного. Разрастаясь в длину, они принимают в поперечном сечении форму овала. По мере удлинения степень уплощенности свободного отдела возрастает. Это уплощение
является относительным и определяется более интенсивным ростом по
преаксиально-постаксильной оси, чем по медио-латеральной. Степень уплощенности увеличивается в дистальном направлении, достигая максимума в районе окончания свободной конечности.
На самых ранних этапах своего развития почки конечностей состоят
из внешне гомогенной массы мезодермальных клеток, одетых эктодермальным слоем. Очень скоро в мезодерму врастают кровеносные сосуды,
образующие первичную капиллярную сеть, в которой затем оформляются
крупные стволы. Нервы проникают в конечности позднее, когда там уже
присутствуют хрящевые и мышечные компоненты. Сами эти компоненты
развиваются в строго ограниченных зонах почки конечности: хрящи – в
центре, мускулы – на периферии.
В почках конечностей имеется структурный комплекс, который мог
бы претендовать на роль организующего фактора, определяющего как саму множественность скелетных элементов, так и их местоположение. Речь
идет о кровеносной системе, представленной сетью сосудов, в принципе
одинаково расположенных в передних и задних конечностях. Принято
считать, что эмбриональная кровеносная сеть обеспечивает рост конечности, но не влияет на их структуру. Полагают, что, напротив, топография
сосудов конечности зависит от расположения скелетно-мышечных компонентов, которые они питают [13]. Но магистральные артерии и вены конечностей определяются задолго до появления самых первых хрящевых
закладок и потому могут влиять на развитие скелета [5].
В данной работе нами была обнаружена десинхрония в развитии головастиков, увеличение размеров конечностей (в среднем на 20%), хвоста
и общей длины тела головастиков под воздействием кадмия (в дозе ниже
санитарной – 0,00033 мг\л) и тиреоидных гормонов. Показано нарушение
гистогенеза закладки передних и задних конечностей в высоких дозах
кадмия. Кроме того, отсутствуют процессы элиминации хвоста, что свидетельствует о продлении личиночной стадии развития, следовательно, о
торможении процессов развития всего организма.
Таким образом, результаты могут дать возможность быстрой оценки
качества водоема только по морфологии личинок лягушки, могут быть использованы в биомониторинге водоема (по удлинению конечностей и хвоста), могут быть моделями возможных нарушений эмбриогенеза позвоночных животных, обитающих в загрязненной среде. Результаты могут
использоваться экологическими службами Ярославля и области в экспресс-оценке водных объектов города и природных водоемов.
Заключение
1)определили по показательным признакам личинок с 41 по 48 стадии и изучили особенности их развитие.
2)обнаружили десинхронию в развитии головастиков, увеличение
различных частей тела головастиков в среде с кадмием (в дозе ниже санитарной – 0,00033 мг\л) и тиреоидными гормонами (в дозе – 1,7 мг\л).
3)показали отсутствие процессов элиминации хвоста и остановку
развития головастиков на личиночной стадии развития.
4)данный метод исследования может являться экспресс-анализом загрязненных водных объектов.
Список литературы.
1)Борхвардт В.Г. Морфогенез и эволюция осевого скелета. Л.: Издательство Ленинградского университета, 1982. 144с.
2)Борхвардт В.Г. Развитие конечностей у личинок сибирского углозуба, Salamandrella keyserlingii. Зоологический журнал. Том 73, выпуск 5,
1994
3)Борхвардт В.Г. Формирование скелета конечностей тетрапод по
данным экспериментальной и сравнительной эмбриологии. Вестник СПб
университета, № 21, 1993
4)Борхвардт В.Г., Ивашинцова Е.Б. Некоторые закономерности в
варьировании лапок скелета сибирского углозуба, Salamandrella keyserlingii. Зоологический журнал. Том 72, выпуск 6, 1993
5)Борхвардт В.Г., Моисеева А.А., Леденцова А.В. Формирование мезоподиального скелета сибирского углозуба, Salamandrella keyserlingii на
постметаморфозных стадиях онтогенеза. Зоологический журнал. Том 71,
выпуск 2, 1992
6)Гилберт С. Биология развития. В 3 х томах. Том 1. М.: Мир, 1993.
320с.
7)Зуссман М. Биология развития. М.: Мир, 1977
8)Комарова И.П., Тятенкова Н.Н. Методические указания для выполнения курсовых работ и дипломных работ по морфологии. Я.: Ярославский государственный университет, 1996, 16 с.
9)Объекты биологии развития. Под редакцией Астаурова Б.П. М.:
«Наука», 1975
10)Токин Б.П. Общая эмбриология. Учеб. для биол. спец. университетов. М.: «Высшая школа», 1987
11)Холмогоров Ю.В. Развитие задних конечностей у личинок лягушки травяной, Rana temporaria (Amphibia, Ranidae) в норме и в эксперименте. Дипломная работа, Ярославль, 2008
12)Шмальгаузен И.И. развитие конечностей амфибий. М., 1915
13)Мажуга П.М. Функциональная морфология кровеносных сосудов
конечностей человека и животных. Киев, 1966.