ГАМК-эргическая синаптическая регуляция входов на клетки Кахаля–Ретциуса в неокортексе у мышей
реклама
Медико-биологические проблемы ГАМК-эргическая синаптическая регуляция входов на клетки Кахаля–Ретциуса в неокортексе у мышей А.Ю.Дворжак, Н.Н.Лысенко, О.Л.Мяхар, А.Г.Камкин Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра фундаментальной и прикладной физиологии МБФ, Москва (зав. кафедрой – проф. А.Г.Камкин) Клетки Кахаля–Ретциуса являются основными нейронами маргинальной зоны, развивающегося неокортекса, регулирующие созревание коры головного мозга. Они получают возбуждающие ГАМК-эргические входы, предположительно из вентрального таламуса и подпластинки. Синапсы на КР-клетках экспрессируют ГАМКБ-рецепторы, частично активированные экстраклеточной ГАМК. Целью нашей работы было изучение особенностей ГАМК-эргической регуляции функционирования разных входов на КР-клетках. Мы показали, что разные входы на КР-клетках обладают разной чувствительностью к внеклеточной ГАМК и выявили механизмы, обуславливающие эту разницу. Ключевые слова: клетки Кахаля–Ретциуса, ГАМК КБ-рецепторы, растекание медиатора (спилловер), экстраклеточная ГАМК, вызванные постсинаптические токи, синаптическая пластичность при парной стимуляции GABA-ergic synaptic regulation of inputs on Cajal – Retzius cells in mouse neocortex A.Yu.Dvorzhak, N.N.Lysenko, O.L.Myakhar, A.G.Kamkin N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Fundamental and Applied Physiology of MBF, Moscow (Head of the Department – Prof. A.G.Kamkin) Cajal-Retzius cells are the main population of neurons in the marginal zone of neocortex, regulating cellular migration in a cortical plate. They receive GABA-ergical inputs, probably from ventral thalamus and subplate. Synapses on CR cells express functional GABAB receptors, partially activated in control by ambient GABA. In this article we have described different sensitivity of inputs on CR cells to extra cellular GABA and reasons for this diversity. Key words: Cajal-Rertzius cells, GABAB receptors, spillover, extra cellular GABA, evoked postsynaptic currents, paired-pulse plasticity Ч астой причиной эпилепсии являются микроскопические или макроскопические нарушения в структуре коры больших полушарий мозга, возникающие вследствие патологического развития кортикального зачатка (мальформации кортикального развития – МКР). С помощью методов магнитно-резонансной томографии (МРТ) было показано, что рефрактерная эпилепсия у взрослых пациентов в 8–12% случаев ассоциирована с наличием МКР [1], а у детей с фармакорезистентной эпилепсией – в 25–40% случаев [2]. Вследствие действия повреждающих факторов на разных этапах развития мозга нарушается цитоархитектоника коры, что, в свою очередь, приводит к дисбалансу процессов торможения и возбуждения в коре, и впоследствии, к эпилепсии. У пациентов с МКР в 75% случаев следует ожидать возникноДля корреспонденции: Лысенко Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5035 E-mail: Lisenko_NN@rsmu.ru Статья поступила 30.04.2009 г., принята к печати 23.06.2010 г. 60 вения эпилептических приступов [2]. К сожалению, механизмы, приводящие к появлению МКР, изучены недостаточно. Основными причинами появления МКР являются нарушения клеточной миграции и синаптогенеза в кортикальной пластинке (КП). Процесс созревания КП сверху и снизу контролируется двумя временными, филогенетически наиболее древними, популяциями клеток, расположенными в маргинальной зоне (МЗ) и в подпластинке (ПП) соответственно [3]. На молекулярном уровне основным регулятором кортикогенеза является белок экстраклеточного матрикса рилин. У людей, гомозиготных по рилин-дефицитному гену, наблюдается полное нарушение структуры коры, проявляющееся сильным отставанием в развитии, генерализованными эпилептическими припадками, двигательными нарушениями и др. [4]. Основным источником рилина в коре являются рано созревающие нейроны МЗ клетки Кахаля–Ретциуса (КР-клетки) [5]. Они получают два типа возбуждающих ГАМК-эргических входов (ГАМК – гаммааминомасляная кислота). Первый тип – входы, генерирующие медленно нарастающие постсинаптические токи (медленные входы) и идущие предположительно из вентрального таламуса. Второй тип – входы, генерирующие быстро ГАМК-эргическая синаптическая регуляция входов на клетки Кахаля–Ретциуса в неокортексе у мышей нарастающие постсинаптические токи (быстрые входы), которые предположительно являются проекциями ГАМКэргических интернейронов ПП [6]. КР-клетки образуют глутамат-эргические проекции к незрелым нейронам КП и прочим нейронам МЗ [7], а также принимают непосредственное участие в работе нейронных сетей созревающего неокортеса [8]. Нарушение электрической активности в МЗ путем локальной депривации ГАМК-эргической передачи приводит к появлению фокальной дисплазии, гетеротопии и прочим МКР, которые локализуются в регионе повреждения in vivo [9]. Таким образом, электрическая активность КР-клеток, определяемая эффективностью синаптической передачи в ГАМК-эргических входах, по-видимому, играет ключевую роль в нормальном развитии коры. Известно, что в развивающемся неокортексе существует градиент внеклеточной ГАМК, направленный в сторону МЗ [10], а регуляция эффективности передачи сигналов на КР-клетки контролируется метаботропными ГАМКБрецепторами [11]. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей ГАМК-эргической регуляции работы разных входов на КР-клетки. Материалы и методы Исследования проводились в соответствии с правилами Департамента защиты здоровья и безопасности на производстве федеральной земли Берлин, Германия (Landesamt fuer Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin, T0406/03). Все эксперименты проводились на потомствах черных мышей линии C57BL/6J, взятых в постнатальный период со 2-го по 5-й (П2-П5) день (роды – П0). В работе были использованы следующие растворы. Раствор для препарирования содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 0,5 CaCl2 и 2,5 MgCl2 – и постоянно барбатировался (пробулькивался) газовой смесью, состоящей из 5% CO2 и 95% O2, pH раствора доводился до 7,3 c применением одномолярных растворов HCl и NaOH. Инкубационный раствор содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2 CaCl2 и 1 MgCl2 – и постоянно барбатировался газовой смесью, состоящей из 5% CO2 и 95% O2; pH = 7,3, осмолярность – 330 мОсмоль/л. Внутриклеточный раствор для заполнения пипеток содержал (в мМ): 100 калий-глюконата, 50 KCl, 5 NaCl, 0,5 СaCl2, 5 EGTA, 25 Hepes, 2 MgАТФ и 0,3 ГТФ. Перед использованием pH раствора доводился до 7,2 с помощью КОН, осмолярность – 320 мОсмоль/л. Приготовление переживающих срезов мозга начиналось с быстрой декапитации животного под эфирной анестезией. Затем из головы изымали мозг и перемещали его в чашку Петри, заполненную «ледяным» раствором для препарирования. Далее, используя вибратом (Integraslice 7550PSDS, Campden Instruments Ltd., Loughborough, Великобритания), делали сагиттальные срезы мозга толщиной 200 мкм. Затем препарирования переживающие срезы мозга перемещали в инкубационный раствор, где они инкубировались при ком- натной температуре (23–30°С) не менее 1 ч. После срезы перемещались в регистрационную камеру установки для исследований. Камера объемом 0,4 мл располагалась на предметном столике бинокулярного микроскопа (Axioscope FS, Zeiss, Oberkochen, ФРГ), установленного на антивибрационном столе (Pneumatic Isolation Mount XL-G, Newport, Калифорния, США). Визуальное наблюдение за объектом исследования проводили посредством водоиммерсионного объектива с 40-кратным увеличением (Zeiss, Oberkochen, ФРГ). В регистрационной камере переживающие срезы мозга постоянно омывали потоком инкубационного раствора при комнатной температуре. Для перфузии использовали гравитационную проточную систему, а скорость потока устанавливали мануально на уровне 2 мл/мин. Постсинаптические токи (ПСТ) записывались нами с помощью стандартной микроэлектродной техники фиксации потенциала на целой клетке (patch-clamp в конфигурации whole-cell). Для этого использовались стеклянные микропипетки из боросиликатного стекла, которые заполняли внутриклеточным раствором. Сопротивление микроэлектродов, заполненных раствором, лежало в диапазоне 3–5 МоМ. Электрофизиологический сигнал регистрировали с помощью patch-усилителя (EPC-7, List, Darmstadt, США) и оцифровывали 16-битным аналогово-цифровым преобразователем (ITC-16, HEKA Elektronik, Lambrecht, США) под контролем программы TIDA 5.0 (HEKA Elektronik, США). Регистрируемый сигнал фильтровался при 3 кГц, оцифровывался на частоте 10 кГц и записывался на жесткий диск ЭВМ. Контактная разность потенциалов (электрод – жидкость) была не более 5 мВ и не компенсировалась. Потенциал реверсии по Cl- был –20 мВ. При работе с patch-clamp в режиме фиксации потенциала (voltage-clamp) мембранный потенциал удерживали на уровне 70 мВ. Сопротивление доступа контролировалось гиперполяризационной ступенькой в 10 мВ. Для дальнейшей обработки использовали только данные, полученные от клеток с последовательным сопротивлением менее 40 МОм. Компенсация последовательного сопротивления не применялась. Клетки, показавшие изменение последовательного сопротивления более чем на 20% в течение всего эксперимента, не допускались до обработки. Идентификация клеток Кахаля–Ретциуса производилась на основании подробного морфологического описания КР-клеток в неокортексе у мышей [12]. Идентификация КР-клеток осуществлялась визуально на основании следующих морфологических критериев: 1) локализация в маргинальной зоне коры; 2) горизонтальная ориентация; 3) большая овоидная сома; 4) наличие одного толстого дендритного ствола, направленного параллельно поверхности мягкой оболочки мозга (рис. 1А). Для экспериментов использовались клетки, локализованные в 17 и 18 полях зрительной коры. Правильность выбора клетки контролировали следующими электрофизиологическими критериями: 1) относительно деполяризованный мембранный потенциал –40–50 мВ; 2) наличие токов, активируемых гиперполяризацией (Ih-токов); 3) низкий паттерн генерации потенциалов при деполяризации (обычно не более 1 потенциала действия); 4) наличие спонтанных ГАМК-эргических ПСТ (рис. 1Б и В). 61 А.Ю.Дворжак и др. / Вестник РГМУ, 2010, №4, с. 60–66 Вызванные постсинаптические токи (вПСТ) вызывали фокальной электрической стимуляцией в маргинальной зоне зрительной коры с помощью униполярного электрода (хлорсеребряный электрод, опущенный в заполненную инкубационным раствором стеклянную микропипетку). Собранный и заполненный таким образом стимулирующий электрод имел сопротивление 10 МОм. В экспериментах с применением электрической стимуляции к внутриклеточному раствору (в patch-пипетку) добавляли вещество QX-314 в концентрации 2 мМ для предотвращения возникновения потенциалов действия в тестируемых нейронах. Для стимуляции использовался стимулятор, подключенный к цифровому аналоговому преобразователю, и программу TIDA 5.0. Стимуляция осуществлялась прямоугольными электрическими импульсами тока с длительностью 0,5 мс. Амплитуда тока стимуляции подбиралась таким образом, чтобы она соответствовала минимальной стимуляции, то есть стимуляции одного отдельного аксона. Стимуляция считалась минимальной, если она удовлетворяла следующим критериям: 1) стабильная латентность вПСТ (не более 20% флуктуаций); 2) полное исчезновение вПСТ при снижении тока стимуляции более чем на 20%; 3) отсутствие изменений формы и амплитуды вПСТ при повышении тока стимуляции на 20%. Обычно сила стимулирующего тока при минимальной стимуляции была между 1 и 2 мкА. Регистрируемые вПСТ разделялись на две группы, соответствующие двум популяциям синапсов на КР-клетках, согласно кинетике нарастания. Вызванные постсинаптические токи считались медленными (вПСТм), если время нарастания было ≥ 1 мс, и быстрыми (вПСТб), если время нарастания было < 1 мс [6]. А Б В Р Рис. 1. И 1 Идентификация ф КР-клеток. КР А. Ф А Фотография ф КР КР-клетки. Б. Реакция КР-клетки на деполяризацию (ступенька вверх) и гиперполяризацию (ступенька вниз) в режиме current-clamp (верхняя запись – один потенциал действия и два локальных ответа; нижняя запись – эффект открытия Ih каналов при гиперполяризации). В. Пример спонтанных ПСТ в КР-клетки в контрольных условиях (верхняя запись), в присутствии 10 мкМ бикукулина (средняя запись) и после 10-минутной отмывки (нижняя запись). 62 Для характеристики кратковременной пластичности входов и оценки эффектов разных веществ на вПСТ в КРклетках использовали парную стимуляцию. Суть протокола заключается в том, что на вход подаются пары импульсов с межимпульсным интервалом 50 мс и интервалом между парами 10 с [6]. В процессе обработки из полученных данных выбрасывали записи (не более 20% от общего количества), загрязненные посторонними сильно выраженными шумами, а оставшиеся записи усредняли не менее чем по 40 парам. После этого определяли средние амплитуды вПСТ на первый импульс (вПСТ1) и на второй импульс (вПСТ2). Согласно биномиальной модели синаптической передачи, средняя амплитуда вПСТ пропорциональна вероятности высвобождения медиатора, количеству мест высвобождения и квантовой амплитуде. Для оценки кратковременной пластичности синаптических входов использовали отношение средних амплитуд вПСТ2 к вПСТ1 (paired-pulse ratio – PPR): Средняя амплитуда в ПСТ2 . PPR = Средняя амплитуда в ПСТ1 Известно, что PPR негативно коррелирует с вероятностью высвобождения медиатора, однако механизмы такой парной пластичности до конца не изучены [13]. Если парной стимуляции первый потенциал действия (ПД), приходящий к пресинаптической терминали, повышает в ней концентрацию Са+2, что ведет к возникновению вПСТ1 и временному повышению вероятности высвобождения медиатора. Если на фоне повышенной концентрации Са+2 придет второй ПД, то вПСТ2 будут в среднем по амплитуде выше вПСТ1. Этот эффект возможен только при изначально низкой вероятности высвобождения медиатора, он был назван парной фассилитацией и характеризуется PPR > 1. В случае, если изначально вероятность высвобождения медиатора в синапсе высока, первый ПД вызовет большой выброс медиатора из пресинаптической терминали, и истощит ее. Если на этом фоне придет второй ПД, то из-за недостатка медиатора вПСТ2 в среднем по амплитуде будут меньше вПСТ1. Этот эффект был назван парной депрессией и характеризуется PPR < 1. Все данные обрабатывались после завершения экспериментов с помощью программы PeakCount 3.2 (программа написана Henneberger C, Институт нейрофизиологии, Берлин). Эта программа предназначена для автоматического поиска и количественного описания мПСТ. Каждое событие, найденное программой, подвергали визуальному контролю. Такие количественные параметры, как амплитуда, время нарастания и временная константа спада моноэкспоненциальной аппроксимации, также контролировали мануально. На выходе программа выдавала массив данных по каждому событию, который затем подвергался статистическому анализу и последующей обработке с помощью программ Prism 4.03 (GraphPad Prism, США), Corel Draw 12 (Corel Corporation, США) и приложений MS Office 2003. Все результаты представлены как «среднее ± стандартная ошибка среднего» (СОС); количество данных (n); вероятность ошибки (p). Все бары на графиках, отображающие ошибку, также отображают СОС. Различия между средними значениями тестировались с помощью парного теста Стьюдента (t-тест), в противном случае это оговаривается отдельно. На диаграммах уровень значимости обозначен звездочками: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001; нз – различия не значимы. ГАМК-эргическая синаптическая регуляция входов на клетки Кахаля–Ретциуса в неокортексе у мышей Все использованные в работе реактивы были куплены в компании Sigma-Aldrich (Мюнхен, ФРГ). Результаты исследования и их обсуждение Вызванные ПСТ, регистрировавшиеся в КР-клетках, полностью, но обратимо блокировались бикукуллином, блокатором ГАМКА-рецепторов, в концентрации 10 мкМ (рис. 1В). Потенциал реверсии этих токов составлял –12 мВ (данные не представлены), что, с поправкой на внутриклеточный раствор, соответствует потенциалу реверсии по Cl–. Вместе эти данные указывают на то, что регистрировались токи, обусловленные активацией ГАМКА-рецепторов. Время нарастания вПСТ варьировало в пределах от 0,4 до 2 мс, что позволяло разделить их на вПСТм и вПСТб согласно описанному выше правилу. Далее исследовали роль ГАМКБ-рецепторов в регуляции ГАМК-эргической синаптической передачи на КРклетки, изучая эффекты 1 мкМ CGP-55845 (селективный блокатор ГАМКБ-рецепторов) и 10 мкМ баклофена (селективный агонист ГАМКБ-рецепторов) на вПСТ. Согласно полученным данным, CGP-55845 значимо снижал PPR как А Б PPR (%) 250 *** ** 200 вПСТб (с 144 ± 16% в контроле до 89 ± 8%; n = 8; p < 0,001), так и вПСТм (с 113 ± 9% в контроле до 87 ± 7%; n = 5; p < 0,05), а баклофен, наоборот, увеличивал PPR как вПСТб (до 217 ± 26%; p < 0,001), так и вПСТм (до 199 ± 16%; p < 0,01) (рис.2). Таким образом, ГАМК-эргическая синаптическая передача в быстрых и медленных входах динамически подавляется внеклеточной ГАМК через ГАМКБрецепторы. Однако степень подавления для разных синапсов в контрольных условиях различна. Для медленных входов уровень активации ГАМКБ-рецепторов соответствует 21 ± 9% (в присутствии CGP-55845 уровень активации равен 0, а в присутствии баклофена – 100%), а для быстрых входов – 46 ± 18% (разница значима, p < 0,05; непарный t-тест). Причиной разной чувствительности синапсов к внеклеточной ГАМК может быть разная плотность ГАМКБрецепторов на пресинаптической терминали. Однако степень модуляции ГАМКБ-рецепторами синаптической передачи (отношение PPR под действием баклофена к PPR под действием CGP) значимо не различалась (непарный t-тест). Ранее уже отмечалось, что постсинаптические ГАМКАрецепторы в медленных входах гораздо ближе к состоянию насыщения, нежели в быстрых [14]. Следовательно, меньшая чувствительность медленных входов к ГАМК может быть обусловлена большей насыщаемостью постсинаптических рецепторов. Для проверки этой гипотезы проводили эксперименты с ИЦСЖ, содержащей 1 мМ Ca+2. Понижение концентрации Са+2 во внеклеточном растворе ведет к снижению вероятности высвобождения медиатора из пресинаптической мембраны, что в свою очередь уменьшает концентрацию медиатора в синаптической щели и понижает насыщенность рецепторов на постсинаптической мембране. Таким образом, понижение экстраклеточной концентрации Са+2 должно нивелировать эффект большей насыщенности постсинаптических рецепторов в медленных входах. Однако полученные результаты опровергли эту гипотезу. Если в быстрых синапсах CGP-55845 значимо снижал PPR (с 239 ± 25% в контроле до 137 ± 14% в присутствии CGP-55845; n = 6; p < 0,001), то в медленных синапсах это [Ca+2] = 1мM PPR (%) 300 ** *** 150 * 100 50 H3 n=5 n=8 200 CGP Контроль n=6 вПСТм вПСТб Баклофен Рис. 2. Разная степень подавления вПСТб и вПСТм ГАМКБрецепторами: А. Примеры усредненных записей вПСТб и вПСТм в присутствии 1мкМ CGP-55845, в контроле и в присутствии 10мкМ баклофена. Артефакты стимуляции удалены. Б. Результаты статистической обработки данных. В контрольных условиях вПСТб «подавлен» ГАМКБ-рецепторами значительно сильнее, нежели вПСТм. n=4 100 0 0 вПСТм вПСТб Контроль CGP Рис. 3. Эффекты CGP-55845 на PPR вПСТ в растворах с пониженной концентрацией Са+2. 63 А.Ю.Дворжак и др. / Вестник РГМУ, 2010, №4, с. 60–66 ** 150 * H3 n=4 50 * n=8 100 0 вПСТб Контроль вПСТм SNAP SNAP+CGP Рис. 4. Эффекты SNAP и CGP-55845 в присутствии SNAP-5114 на PPR вПСТм и вПСТб в нормальных растворах. снижение было незначимым (со 147 ± 14% в контроле до 129 ± 17% в присутствии CGP-55845; n = 4; p = 0,15) (рис. 3). Причиной разных эффектов модуляторов ГАМКБрецепторов на разных типах синапсов может быть разная локальная концентрация экстраклеточной ГАМК. Для верификации сделанного предположения был использован селективный блокатор ГАМК транспортеров 2/3 (ГАТ 2/3), SNAP-5114 в концентрации 40 мкМ. Ранее было показано, что ГАТ2/3 является основным источником ГАМК в МЗ неокортекса [11]. Подобно CGP-55845, SNAP-5114 значимо понижал PPR как в быстрых синапсах (с 139 ± 27% в контроле до 81 ± 16% в присутствии SNAP-5114; n = 8; p < 0,01), так и в медленных контактах (с 93 ± 7% в контроле до 78 ± 8% в присутствии SNAP-5114; n = 4; p < 0,05). Любопытно, что в присутствии SNAP-5114 CGP-55845 продолжал значимо снижать PPR в быстрых входах (до 74 ± 6% в присутствии SNAP-5114+CGP-55845; p < 0,05) и не оказывал значимых эффектов на PPR в медленных входах (77 ± 7% в присутствии SNAP-5114+CGP-55845; p = 0,13) (рис. 4). Далее мы количественно оценили вклад ГАТ2/3 транспортеров в экстраклеточную концентрацию ГАМК. Для этого мы исследовали эффекты различных концентраций ГАМК (на фоне SNAP-5114) на вПСТ. SNAP5114, как уже отмечалось выше, повышал амплитуду вПСТ и снижал PPR. ГАМК на фоне SNAP-5114 с увеличением концентрации сначала компенсировала эффекты SNAP-5114 примерно до 0,5 мкМ, а потом начинала подавлять амплитуду и повышать PPR по отношению к контролю. Эффекты ГАМК на фоне SNAP-5114 у вПСТб и вПСТм сильно не различались (рис. 5). Для вПСТб рассчитанная по PPR концентрация ГАМК, обусловленная работой ГАТ 2/3 транспортеров, составила 0,57 ± 0,21 мкМ (n = 8), а для вПСТм – 0,45 ± 0,06 мкМ (n = 9); различия этих значений не значимы (p = 0,57; непарный t-тест) (рис. 6). Таким образом, разные типы синапсов не различаются по концентрации окружающих их ГАМК. Полученные результаты продемонстрировали, что разные входы на КР-клетки обладают разной чувствительностью к внеклеточной ГАМК. Ранее было показано, что КРклетки в МЗ развивающегося неокортекса у мышей полу- 64 чают два типа ГАМК-эргических входов, различающих, в частности, по эффективности синаптической передачи [6]. Известно, что синапсы на КР-клетках экспрессируют функциональные ГАМКБ-рецепторы, что позволяет этим входам регулировать свою эффективность в зависимости от концентрации внеклеточной ГАМК [11]. В экспериментах с баклофеном и CGP-55845 было показано, что медленные синапсы менее чувствительны к экстраклеточной ГАМК, нежели быстрые синапсы. Причиной этого может быть разная плотность ГАМКБ-рецепторов на пресинаптической мембране. Однако эксперименты с CGP-55845 и баклофеном показали, что диапазоны ингибирующего действия ГАМКБрецепторов на вПСТ значимо не различаются, а следовательно выдвинутая гипотеза неверна. Другой причиной наблюдаемого наблюдаемого феномена может быть разная природа ГАМКБ-рецепторов на разных аксонах, приходящих к КР-клеткам. Ген, кодирующий ГАМКБ(1) субъединицу, транскрибируется из двух различных промоторов, в результате чего образуются две изоформы этой субъединицы ГАМКБ(1А) и ГАМКБ(1Б). Таким образом, существует две различные изоформы ГАМКБ-рецепторов: ГАМКБ(1А,2) и ГАМК(1Б,2). На примере гиппокампа было показаА Б 250 PPR(SNAP)/PPR (контроль), % PPR (%) 200 200 150 100 50 0 0 вПСТм 0,5 1,0 [ГАМК], мкМ 1,5 2,0 вПСТм Рис. 5. Определение концентрации ГАМК в околосинаптическом пространстве для быстрых и медленных входов: А. Примеры усредненных записей вПСТб и вПСТм в контроле в присутствии SNAP-5114 и 0,5 мкМ ГАМК на фоне SNAP-5114. Б. Зависимости PPR вПСТб (белые кружки, бары вниз) и вПСТм (черные кружки, бары вверх) от разных концентраций ГАМК, подаваемой на фоне SNAP-5114. ГАМК-эргическая синаптическая регуляция входов на клетки Кахаля–Ретциуса в неокортексе у мышей [ГАМК], мкМ р = 0,57 0,8 0,6 0,4 0,2 n=9 n=8 0 вПСТм вПСТб Рис. 6. Зависимость концентрации внеклеточной ГАМК от типов синапсов. но, что ГАМКБ(1А,2) локализуются на пресинаптической мембране, а ГАМКБ(1Б,2) на постсинаптической [15]. Таким образом, маловероятно, что разная чувствительность разных входов на КР-клетки обусловлена разными пресинаптическими ГАМКБ-рецепторами. Показано, что в медленных синапсах постсинаптические ГАМКА-рецепторы способны полностью насыщаться выбросом ГАМК из одной синаптической везикулы [14]. Это может объяснить меньшую чувствительность этих синапсов с CGP55845, по сравнению с быстрыми синапсами. Однако эксперименты с пониженным содержанием Са+2 в ИЦСЖ опровергли эту возможность. В итоге, исключив все прочие возможности, мы сделали вывод, что основной причиной большей, по сравнению с медленными синапсами, «задавленности» быстрых синапсов ГАМКБ-рецепторами является большая околосинаптическая концентрация внеклеточной ГАМК. Далее анализировалась причина этой разности. Основными источниками ГАМК во внеклеточном пространстве могут быть ГАМКтранспортеры ГАТ2/3 [11] и сами синапсы, за счет вытекания ГАМК из синаптической щели (спилловер) [16]. В экспериментах со SNAP-5114 (блокатор ГАТ2/3 транспортеров) и CGP-55845 (блокатор ГАМКБ-рецепторов) на фоне SNAP-5114 было показано, что большая часть внеклеточной ГАМК, но не вся, обусловлена работой ГАТ2/3 транспортеров. Также из полученных результатов можно сделать вывод, что спилловер оказывает значимый вклад в экстраклеточную ГАМК только в быстрых синапсах. Для оценки вклада ГАТ2/3 транспортеров во внеклеточную ГАМК вокруг быстрых и медленных синапсов по кривой «доза – ответ» для разных концентраций ГАМК в присутствии SNAP-5114 определялась экстраклеточная концентрация ГАМК. Полученные результаты показали, что эта концентрация для быстрых и медленных входов значимо не различается и лежит в районе 0,5 мкМ. Таким образом, был сделан вывод о том, что большее подавление быстрых синапсов внеклеточной ГАМК, по сравнению с медленными синапсами, обусловлено наличием в быстрых синапсах эффекта спилловер. Ранее было показано, что ГАМК в эмбриональный и ранний постнатальный период оказывает на постсинаптиче- скую клетку деполяризующее воздействие [17]. В условиях отсутствия тормозных медиаторов метаботропная регуляция передачи информации, опосредованная, в частности, ГАМКБ-рецепторами, является, по-видимому, основным механизмом, защищающим КР-клетки и всю нейронную сеть развивающегося неокортекса от перевозбуждения. Помимо этого разные способы регуляции эффективности синаптической передачи, опосредованные внеклеточной ГАМК, позволяют по-разному обрабатывать приходящую информацию. Так, было показано, что быстрые входы способны передавать информацию одинаково эффективно как на высокочастотных, так и на низкочастотных уровнях кодировки, в то время как медленные входы могут передавать только низкочастотную импульсацию [6]. Эту особенность быстрых входов можно объяснить функциональной связью между активностью синапсов и концентрацией околосинаптической ГАМК, опосредованной эффектом спилловер. При высокой частоте приходящей к синапсу импульсации повышается околосинаптическая концентрация ГАМК и усиливается активация ГАМКБ-рецепторов, что, в свою очередь, понижает вероятности высвобождения медиатора из пресинаптической мембраны, защищая тем самым пресинаптическую терминаль от истощения. Таким образом, спилловер позволяет быстрым синапсам обрабатывать информацию с кодировками в широком диапазоне частот. Медленные входы такой возможности лишены. Известно, что в МЗ экспрессируются два типа ГАМК транспортеров: ГАТ1 на нейронах, ответственные за обратный захват ГАМК, и ГАТ3 на глии [18]. Недавно было показано, что ГАТ3 могут не только закачивать ГАМК в клетку, но и работать в обратном направлении [11]. Таким образом, у кортикальных астроцитов имеется возможность контролировать эффективность синаптической передачи на КР-клетки через изменение концентрации внеклеточной ГАМК. Нарушения системы ГАМК-эргической регуляции эффективности синаптической передачи на КР-клетки вследствие, например, мутаций в генах ГАМКБ-рецепторов или ГАМКБтранспортеров, могут приводить к избыточному возбуждению, либо, наоборот, к функциональной депривации КРклеток. В первом случае избыточный вход Cа+2 и Na+ может привести к гибели клетки. Поскольку КР-клетки являются основным источником рилина, главного регулятора клеточной миграции в коре, то гибель этих клеток приведет к нарушению клеточной миграции и возникновению МКР. Функциональная депривация КР-клеток вызовет понижение внутриклеточной концентрации Са+2, что может привести к снижению синтеза и/или выбросу рилина с последующим формированием МКР. Эта гипотеза частично подтверждается тем фактом, что локальное приложение мусцимола (агониста ГАМКА-рецепторов) бикукуллина (блокатора ГАМКАрецепторов) к МЗ новорожденных крыс in vivo вызывает различные формы МКР, локализованные в области приложения препарата [9]. Таким образом, как гипер-, так и гипорегуляция эффективности синаптической передачи на КР-клетки может привести к одинаковым формам МКР и, как следствие, к эпилепсии и другим формам неврологических расстройств в детском или во взрослом возрасте. 65 А.Ю.Дворжак и др. / Вестник РГМУ, 2010, №4, с. 60–66 Литература 1. Sisodiya S. M. Surgery for malformations of cortical development causing epilepsy // Brain. – 2000. – № 123 ( Pt 6) – P.1075–1091. 2. Leventer R. J., Guerrini R., Dobyns W. B. Malformations of cortical development and epilepsy // Dialogues. Clin. Neurosci. – 2008. – № 10(1). – P.47–62. 3. Meyer G. Genetic control of neuronal migrations in human cortical development. – 2007. – 189 с. 4. Hong S. E., Shugart Y. Y., Huang D. T., Shahwan S. A., Grant P. E., Hourihane J. O., Martin N. D., Walsh C. A. Autosomal recessive lissencephaly with cerebellar hypoplasia is associated with human RELN mutations // Nat. Genet. – 2000. – № 26(1). – P.93–96. 5. Frotscher M. Cajal-Retzius cells, Reelin, and the formation of layers // Curr. Opin. Neurobiol. – 1998. – № 8(5). – P.570–575. 6. Kirmse K., Dvorzhak A., Henneberger C., Grantyn R., Kirischuk S. Cajal Retzius cells in the mouse neocortex receive two types of pre- and postsynaptically distinct GABAergic inputs // J. Physiol. – 2007. – № 585(Pt 3). – P.881–895. 7. Soda T., Nakashima R., Watanabe D., Nakajima K., Pastan I., Nakanishi S. Segregation and coactivation of developing neocortical layer 1 neurons // J. Neurosci. – 2003. – № 23(15). – P.6272–6279. 8. Aguilo A., Schwartz T. H., Kumar V. S., Peterlin Z. A., Tsiola A., Soriano E., Yuste R. Involvement of cajal-retzius neurons in spontaneous correlated activity of embryonic and postnatal layer 1 from wild-type and reeler mice // J. Neurosci. – 1999. – № 19(24). – P.10856–10868. 9. Heck N., Kilb W., Reiprich P., Kubota H., Furukawa T., Fukuda A., Luhmann H. J. GABA-A receptors regulate neocortical neuronal migration in vitro and in vivo. // Cereb. Cortex. – 2007 Jan. – № 17(1). – P.138–148. 10. Behar T. N., Li Y. X., Tran H. T., Ma W., Dunlap V., Scott C., Barker J. L. GABA stimulates chemotaxis and chemokinesis of embryonic cortical neurons via calciumdependent mechanisms // J. Neurosci. – 1996. – № 16(5). – P.1808–1818. 11. Kirmse K., Kirischuk S. Ambient GABA constrains the strength of GABAergic synapses at Cajal-Retzius cells in the developing visual cortex // J. Neurosci – 2006. – № 26(16). – P.4216–4227. 66 12. Radnikow G., Feldmeyer D., Lubke J. Axonal projection, input and output synapses, and synaptic physiology of Cajal-Retzius cells in the developing rat neocortex // J. Neurosci. – 2002. – № 22(16). – P.6908–6919. 13. Zucker R. S., Regehr W. G. Short-term synaptic plasticity // Annu. Rev. Physiol. – 2002. – № 64. – P.355–405. 14. Dvorzhak A., Myakhar O., Kamkin A., Kirmse K., Kirischuk S. Postsynaptically different inhibitory postsynaptic currents in Cajal-Retzius cells in the developing neocortex // Neuroreport. – 2008. – № 19(12). – P.1213–1216. 15. Bettler B., Kaupmann K., Mosbacher J., Gassmann M. Molecular structure and physiological functions of GABA(B) receptors // Physiol. Rev. – 2004 July. – V.84(3). – P.835–867. 16. Kullmann D. M. Spillover and synaptic cross talk mediated by glutamate and GABA in the mammalian brain // Prog. Brain Res. – 2000. – № 125. – P.339–351. 17. Luhmann H. J., Prince D. A. Postnatal maturation of the GABAergic system in rat neocortex // J. Neurophysiol. – 1991. – № 65(2). – P.247–263. 18. Conti F., Minelli A., Melone M. GABA transporters in the mammalian cerebral cortex: localization, development and pathological implications // Brain Res. Brain Res. Rev. – 2004. – № 45(3). – P.196–212. Информация об авторах: Дворжак Антон Юрьевич, аспирант кафедры фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5035 Е-mail: a_dvorzhak@mail.ru Камкин Андрей Глебович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной физиологии медикобиологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5035 E-mail: Andre.kamkin@`rsmu.ru Мяхар Ольга Леонидовна, аспирант кафедры фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5035
