новый безреагентный метод идентификации вегетативных

Метод оценки структурных параметров стеблевого слоя льняной тресты
1
УДК 578.08+576.80
НОВЫЙ БЕЗРЕАГЕНТНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ВЕГЕТАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ
С.Н. Сизиков, М.С. Молчанов
В статье показана возможность использования нового безреагентного метода идентификации бактерий
вегетативной формы, заключающегося в сравнении скорости электрофоретического разделения пробы,
регистрируемой как при воздействии высокочастотного электромагнитного поля на микроорганизмы, так и без
такового.
Безреагентный
метод,
биологические
агенты,
вегетативные
бактерии,
биорезонанс,
электрофоретическое разделение, резонансная частота, импеданс (реактивное сопротивление).
Анализ информационных источников, выпускаемых в рамках экологической безопасности,
свидетельствует, что в условиях сложных технических и биотехнологических производств
вероятность возникновения экологических и техногенных аварий и катастроф, связанных в том числе
с выбросом во внешнюю среду опасных для человека бактериальных агентов (БА), крайне велика.
Объективные предпосылки требуют правильной и своевременной оценки сложившейся чрезвычайной
ситуации на основе применения экспрессных средств анализа для принятия своевременных и
адекватных мер [1].
Наиболее перспективным направлением в области аналитических методов идентификации
БА считаются безреагентные методы, то есть такие методы, при применении которых не
используются запасы расходных материалов (реактивов, сред, диагностических препаратов). Среди
них следует выделить метод пиролизной масс-спектрометрии и цитоморфометрический, а также
методы денситометрии и диэлектрофореза, которые осуществляются на основе электрофизических
характеристик микроорганизмов. Цитоморфометрический метод и методы денситометрии и
диэлектрофореза применяются комплексно в лабораторной установке электрооптической системы
детекции клеток (ЭОСДК), разработанной в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. ЭОСДК
позволяет определить в совокупности 19 параметров конкретной частицы патогена: радиус,
площадь, цвет, коэффициент поляризации, дипольный момент, индекс агрегации, индекс деструкции
в электрическом поле, скорость поступательного движения БА, жесткость, вязкость, электрическую
емкость, проводимость мембраны, проводимость цитоплазмы, частотную границу между областями
положительного и отрицательного диэлектрофореза (равновесную частоту), амплитудно-частотную
характеристику поляризации. Также установка позволяет установить концентрацию
микроорганизмов в суспензии, процентное соотношение интактных и инфицированных вирусом
клеток, бактерий. Совокупное множество параметров является надежной базой для детекции
конкретных микроорганизмов, их морфометрических характеристик и физиологических параметров.
Предлагаемый подход позволяет описать клетки микроорганизмов 10–38 параметрами, что
значительно больше, чем предлагают любые другие методы.
Анализ высокосложных биологических систем с помощью пиролизной масс-спетромет-рии
осуществляется при частичном пиролитическом разложении пробы на компоненты, которые затем
анализируются масс-спектрометри-чески. Масс-спектры пиролизатов биологических систем могут
содержать свыше 100 линий, что в ряде случаев позволяет выявлять очень тонкие различия между
анализируемыми образцами БА. Пиролизную масс-спетрометрию используют для обнаружения
вирусов, бактериальных клеток и спор и для идентификации различных видов микроорганизмов.
Однако это же затрудняет проведение идентификации из-за гетерогенности одних и тех же видов БА.
Тем не менее, такие системы используются сейчас в США и Германии. Основными недостатками этих
систем являются: высокая стоимость; высокая квалификация обслуживающего персонала. Это
затрудняет использование масс-спектромет-ров в экологической практике [1].
Предлагаемый нами безреагентный (биорезонансный) метод идентификации БА
бактериальной природы заключается в сравнении скорости электрофоретического разделения
пробы, регистрируемой как при воздействии высокочастотного электромагнитного поля на
микроорганизмы, так и без такового. Метод относится к экспрессным (результат получают не
позднее 1 ч с начала анализа) и позволяет осуществлять распознавание клеток в водной суспензии
при ее электрофоретическом разделении. Достоинство предлагаемого метода заключается в
невысокой стоимости применяемой аппаратуры и в оперативности получаемого конечного
результата анализа.
Известно, что деятельность живых организмов, в том числе и БА, сопровождается
появлением небольших постоянных и переменных электрических токов и связанных с ними
электрических и магнитных полей [2].
Метод оценки структурных параметров стеблевого слоя льняной тресты
2
Суть явления биорезонанса, которое положено в основу специфического анализа
предлагаемым методом, сводится к многократному усилению амплитудного эффекта при
совпадении внешней частоты, воздействующей на тот или иной биообъект с его собственной
частотой [3].
Все микроорганизмы, в том числе и патогенные, имеют уникальный собственный частотный
колебательный диапазон. Причем основная часть различных видов патогенов имеет свой частотный
диапазон в пределах значений от 70 до 460 кГц. При этом вирусам и бактериям присуща более узкая
полоса резонансных частот в пределах от 280 до 420 кГц. В целом, чем больше размеры
микроорганизма, тем ниже его собственная резонансная частота. В этом же диапазоне, однако с
меньшей энергией, колеблются и погибшие микроорганизмы [4].
При идентификации микроорганизмов решается лишь техническая задача по регистрации
момента наступления бирезонанса.
Для получения экспериментальных данных было собрано электронное устройство,
основными элементами которого являются две электрофоретические колонки. На одну из колонок
предусматривается воздействие электромагнитного излучения задаваемой частоты. Конструкции
колонок позволяют определять значение полного сопротивления (импеданса) [5] водной среды в
заключительной стадии электрофоретического разделения.
Проба, имеющая подозрение на присутствие в ней микроорганизмов бактериальной природы,
подвергается предварительной фильтрации от крупных загрязнений. Далее готовится водная
суспензия на основе анализируемой пробы (концентрация бактерий в суспензии должна быть не ниже
1 · 103 КОЕ мл-1).
Сравнивая изменения реактивного сопротивления [5] по времени его замера в опытной и
контрольной электрофоретической колонке на соответствующей частоте генерации
электромагнитного излучения, можно построить спектрограмму, являющуюся характеристичной
для бактерий того или иного вида. Спектрограмма представляет собой зависимость величины
скорости изменения импеданса, полученной на соответствующей частоте электромагнитного
излучения. Время анализа на одной частоте не превышает 8–10 мин. Для построения
спектрограммы необходимы результаты, полученные на 5–6 частотах.
Идентификация БА представляет собой сравнение построенной спектрограммы с имеющейся
в базе данных спектрограммой. В целом экспрессность идентификации БА может быть повышена
путем использования дополнительных пар электрофоретических колонок.
Нами проведено опробование электронного устройства, работающего на основе предлагаемого
метода, при использовании водных суспензий бифидумбактерина и лактобактерина.
На генераторе устанавливали частоту из выбранного диапазона. В заранее подготовленные
электрофоретические колонки с помощью дозатора добавляли расчетное количество водной
бактериальной суспензии. За 8 мин получали несколько значений реактивного сопротивления в
электрофоретических колонках. Полученные значения использовали для построения
спектрограмм.
Построенные спектрограммы представляют собой графики, характеристичные для бифидои лактобактерий. В целом можно заключить, что спектрограммы могут быть использованы в
качестве идентификационного признака разных видов бактериальных клеток.
Выводы
Показана возможность идентификации микроорганизмов бактериальной природы
безреагентным методом, заключающимся в сравнении скорости электрофоретического разделения
пробы, регистрируемой как при воздействии высокочастотного электромагнитного поля на
микроорганизмы, так и без такового.
Для этого разработано устройство, позволяющее регистрировать эффект биорезонанса по
скорости изменения измеряемого значения импеданса в заключительной стадии
электрофоретического разделения бактериальной суспензии.
Разработанное электронное устройство позволяет определять наличие бактерий
вегетативной формы, находящихся в водной суспензии в концентрациях не ниже 1 · 103 КОЕ мл-1.
Идентификация заключается в сравнении построенной спектрограммы с имеющейся в базе
данных. Результат идентификации может быть получен с помощью разработанного устройства не
позднее 60 мин с начала анализа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Метод оценки структурных параметров стеблевого слоя льняной тресты
3
1. Храмов Е.Н. Современные методы и средства экстренной индикации патогенов (потенциальных
агентов биотерроризма) / Е. Н. Храмов // Сб. докл. I Российского симпозиума по биологической
безопасности «Проблемы биологической безопасности Российской Федерации». – М., 2003.
2. Щукин Е.Д. Коллоидная химия / Е. Д. Щукин, А. В. Перцов, Е. А. Амелина. – М. : Высшая школа,
1992.
3. Широносов В.Г. Резонанс в физике, химии и биологии / В. Г. Широносов. – Ижевск :
Удмуртский ун-т, 2001.
4. Кларк Х. Неизлечимых болезней нет : пер. с анг. / Х. Кларк, И. М. Крамаренко, А. Б.
Ксенофонтов. – СПб. : Будущее земли, 2003.
5. Тихомиров А.М. Импеданс биологических тканей и его применение в медицине : метод.
материалы Российского гос. мед. ун-та / А. М. Тихомиров. – М. : Из-во РГМУ, 2006.
NEW REAGENTLESS METHOD OF VEGETATIVE BACTERIA IDENTIFICATION
C.N. Sizikov, M.S.Molchanov
Article deals with possibilities of new reagentless method of vegetative form bacteria identification. Means are
confined with comparison of electrophoretic separation speed, registered on high-frequency electromagnetic field
exposure to microorganisms or without any exposure.
Reagentless method, biology agents, vegetative bacteria, bioresonance, electrophoretic distribution,
resonance frequency, impedance (reactance)
Рекомендована кафедрой химии КГТУ
Поступила 4.05.2010