том 7, 2009 (PDF 8.09 МБ)

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору
(Россельхознадзор)
Федеральное государственное учреждение
«Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Центр МЭБ по сотрудничеству в области диагностики
и контроля болезней животных для стран Восточной
Европы, Центральной Азии и Закавказья
Региональная референтная лаборатория МЭБ по ящуру
ТРУДЫ ФЕДЕРАЛЬНОГО ЦЕНТРА
ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ
ТОМ VII
Владимир 2009
УДК 619: 616. 98: 578
Т78
Труды Федерального центра охраны здоровья животных / ФГУ «Федеральный
центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). – Т. VII. – Владимир: Издательство
ООО «Транзит-ИКС», 2009. – 272 с.
Главный редактор: Евгений Васильевич Белик – директор ФГУ «Федеральный центр
охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), кандидат ветеринарных наук.
Редакционный совет:
Борисов В.В. – зам. директора по НИР и мониторингу, доктор ветеринарных наук (зам.
главного редактора); Дрыгин В.В. – зам. директора по НИР и развитию, доктор биологических
наук, профессор (зам. главного редактора); Борисов А.В. – доктор ветеринарных наук,
профессор (рецензент); Михалишин В.В. – доктор ветеринарных наук, профессор (рецензент);
Мищенко В.А. – доктор ветеринарных наук, профессор (рецензент); Перевозчикова Н.А. – доктор
биологических наук, профессор (рецензент); Пономарев А.П. – доктор биологических наук
(рецензент); Прунтова О.В. – доктор биологических наук (рецензент); Захаров В.М. – доктор
ветеринарных наук, профессор (рецензент).
Издание одобрено и рекомендовано к печати учёным советом ФГУ «ВНИИЗЖ»
В данном выпуске сборника содержится новая информация по результатам научных исследований в области вирусных болезней животных и птиц (ящур, бешенство, африканская
чума свиней, грипп птиц, ньюкаслская болезнь, инфекционная бурсальная болезнь, метапневмовирус птиц и др.), усовершенствования средств и методов специфической профилактики инфекционных болезней. С учётом новейших достижений современной иммунологии
и молекулярной биологии подробно освещается возможность применения высокочувствительных специфических методов индикации возбудителей и даётся сравнительная оценка
их эффективности.
Научные статьи в сборнике изложены в авторской редакции.
Сборник трудов адресован широкому кругу научных сотрудников, аспирантов, студентов и специалистов в области ветеринарной медицины, биологии.
The new information on results of researches in the field of viral diseases of animals and birds
(foot-and-mouth disease, rabies, African swine fever, avian influenza, Newcastle disease, infectious
bursal disease, avian metapneumovirus, etc.) and on the improvement of tools and methods for
specific prophylaxis of infectious diseases is contained in the given Collection issue. The possibility
of application of highly sensitive specific methods for agent identification is illustrated in detail
with due consideration of recent achievements in up-to-date immunology and molecular biology
and the comparative evaluation of their efficacy is demonstrated.
The Collection scientific papers are edited by authors.
The Collection of proceedings is addressed to a wide circle of researchers, post-graduates,
students and specialists working in the field of veterinary medicine, biology.
При перепечатке ссылка на сборник трудов обязательна.
ISBN 978-5-8311-0443-1
© ФГУ «ВНИИЗЖ», 2009
© Издательство ООО «Транзит-ИКС», 2009
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
3
УДК 619:616.98:578.835.2:001.891
РЕЗУЛЬТАТЫ МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ПО ЯЩУРУ В РОССИИ В 2008 ГОДУ
В.В. Борисов, А.М. Рахманов, Е.В. Белик, С.Р. Кременчугская,
Н.Е. Камалова, А.В. Каньшина, А.В. Щербаков,
А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, М.В. Сысолякина,
В.Н. Герасимов, Д.Н. Афонина, Т.К. Майорова
Резюме
Обобщены результаты эпизоотологических и серологических исследований в отношении ящура в 21 субъекте РФ в зоне высокой степени риска
заноса и распространения ящура, в которых осуществлялась профилактическая вакцинация животных против этой болезни. С помощью ИФА исследовано 12214 проб сывороток крови от КРС и МРС на наличие антител
к вирусу ящура типов А, О, Азия-1. Установлены различные уровни иммунных профилей у животных в разных населенных пунктах, хозяйствах, фермах и регионах РФ. Результаты исследований 3852 проб сывороток крови на
наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура свидетельствуют
об отсутствии инфицирования животных в буферной зоне РФ.
Введение
В соответствии с Постановлением Правительства РФ от 16.05.2005 г.
№ 303 (ред. от 05.06.2008 г. № 437) «О разграничении полномочий федеральных органов исполнительной власти в области обеспечения биологической и химической безопасности РФ» и Постановлением Правительства РФ от 02.02.2006 г. № 60 «Об утверждении положения о проведении
социально-гигиенического мониторинга» на Минсельхоз России, Россельхознадзор и подведомственные им территориальные органы, учреждения
и предприятия возложено обеспечение защиты сельскохозяйственных животных от опасных биологических агентов, проведение противоэпизоотических мероприятий и эпизоотологического мониторинга особо опасных
болезней животных с целью выработки рекомендаций по упреждению,
локализации и ликвидации эпизоотий на территории РФ.
Ящур в соответствии с современной международной классификацией включен МЭБ в список болезней, подлежащих обязательному декларированию, в категорию «Болезни разных видов животных» вследствие
того, что им могут болеть сельскохозяйственные и дикие животные более
100 видов (3, 6).
4
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире продолжает оставаться напряженной, поэтому велика вероятность заноса возбудителя в Россию,
которая в 2008 г., как и в 2007 г., являлась благополучной страной, осуществляющей региональную профилактическую вакцинацию животных против
него. В связи с этим необходимо осуществление систематических мониторинговых исследований в зонах высокой степени риска заноса и распространения ящура с целью контроля иммунного фона, а также выявления
возможного скрытого переболевания животных и вирусоносительства.
Материалы и методы
Проведен анализ официальных материалов МЭБ за 2007-2008 гг. о
возникновении и распространении ящура в различных странах, а также
отчетов МСХ РФ о выполнении по регионам планов профилактической
вакцинации животных против ящура в 2007-2008 гг. (7, 8, 11).
Для оценки иммунного фона и выявления возможного переболевания
ящуром ветеринарными специалистами госветслужб были отобраны пробы крови у животных в населенных пунктах, хозяйствах, фермах (объектах) 21 региона, и сыворотки крови с сопроводительными письмами
направлены в ФГУ «ВНИИЗЖ». Для сравнения следует отметить, что в
2007 г. мониторинговые исследования проводились в 16 регионах, в некоторых из них пробы сывороток отбирались и в 2008 г. Итого, за два года
мониторинговыми исследованиями было охвачено 29 регионов (см. рис.).
Во всех этих регионах осуществлялась профилактическая вакцинация животных с применением трехвалентной инактивированной сорбированной
вакцины против ящура типов А, О, Азия-1 производства ФГУП «Щелковский биокомбинат» и ОАО «Покровский завод биопрепаратов».
При отборе проб в основном использовали целевой рандомизированный кластерный метод, разработанный ВОЗ для оценки иммунного
статуса популяции и позволяющий определять иммунный фон с точностью + 5-10%. По возможности в обследуемых регионах определялось
по 4-7 районов наиболее высокого риска заноса ящура, в каждом из них
по 10 населенных пунктов, хозяйств, ферм, в которых отбирались по
8-10 проб крови, в основном от взрослых животных. В некоторых из них
отборы проб сывороток производились 2-3 раза в течение года.
Исследования доставленных проб сывороток от животных на наличие антител к вирусу ящура типов А, О и Азия-1 проводили с помощью
иммуноферментного анализа (ИФА), рекомендуемого для этих целей МЭБ
и ФАО (10), с использованием «Набора для определения противоящурных
антител в сыворотках крови сельскохозяйственных животных в ИФА»,
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
5
Рис. Регионы противоящурной буферной зоны РФ
и мониторинговых исследований в 2007-2008 гг.
утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ 03.02.2004 г. Всего
было исследовано 12214 проб сывороток крови, в том числе 11227 – от
КРС и 987 – от овец. Иммунными считали животных, титры антител в
сыворотке крови у которых были равны 1:32 и выше. Основное количество проб исследовали «точечным методом», т.е. в одном разведении 1:32.
Для более детального изучения напряженности иммунитета у животных
некоторые пробы сывороток исследовали в разведениях от 1:16 до 1:180
(4,0-7,5 log2).
Для подтверждения полученных результатов применяли реакцию
микронейтрализации (РМН) и коммерческие диагностические наборы
производства Всемирной референтной лаборатории МЭБ по ящуру (Пербрайт, Великобритания). Из 15 регионов РФ (Бурятия, Горный Алтай, Дагестан, Кабардино-Балкария, Калмыкия, Карачаево-Черкесия, Северная
Осетия, Краснодарский, Приморский, Хабаровский края, Владимирская,
Курганская, Московская, Читинская и Ярославская области) 3852 пробы сывороток крови от КРС и МРС исследовали на наличие антител к
неструктурным белкам вируса ящура в непрямом варианте ИФА с при-
6
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
менением набора, разработанного в ФГУ «ВНИИЗЖ» (Свидетельство
Россельхознадзора о государственной регистрации от 21.11.2008 г., регистрационный № ПВР-1-7.8/02281). Для подтверждения положительных
результатов использовали коммерческий референтный набор «Ceditest
FMDV-NS» (Нидерланды).
Результаты и обсуждение
По официальным данным, в 2007-2008 гг. неблагополучными по ящуру
были 58 стран, в т.ч. 28 азиатских, 24 африканских, 4 южноамериканских
и 2 европейских. При этом регистрировали ящур 6 известных типов (О, А,
Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3). Во многих государствах в эти годы выделяли вирус ящура 2-4 типов (Египет, Камерун, Кения, Афганистан, Вьетнам,
Индия, Иран, Непал, Пакистан, Турция, Венесуэла, Колумбия и другие). С
1999 г. определенное распространение в мире получил ящур типа Азия-1.
Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире в 2007 г. описана в нашей
предыдущей работе (4). В 2008 г. о возникновении вспышек ящура сообщили в МЭБ 18 азиатских, африканских и южноамериканских государств,
в т.ч. Израиль, Египет, Индия, Лаос, Непал, Шри-Ланка, Эквадор, Колумбия (тип О), Ботсвана, Намибия, Малави, ЮАР (тип САТ-2), Бахрейн, Индия, Колумбия (тип А), Индия, Непал, Китай (тип Азия-1), Ливан, Замбия,
Мозамбик, Нигерия (тип вируса не установлен).
Определенную озабоченность вызывает продолжающаяся эпизоотия
ящура типа Азия-1 в Китае. Первые случаи его в этой стране были отмечены среди КРС в Гонконге 9 марта 2005 г., а затем в 7 провинциях континентального Китая (5). Несмотря на уничтожение всех животных в ящурных
очагах, в течение 2006 г. возникло еще 16 вспышек в 7 провинциях, в 2007 г.
– 8 и в 2008 г. – 3 вспышки. Особого внимания заслуживает обнаружение
в 2007 г. вирусоносителей среди КРС в Синьцзян-Уйгурском автономном
районе, расположенном на северо-западе КНР и граничащем с Казахстаном,
Таджикистаном, Киргизией, Монголией и Россией, в котором еще в 2005 г.
отмечали ящур типа Азия-1. Вспышки его в данном автономном районе регистрировали и в последующем: в феврале 2008 г. и в январе 2009 г. Кроме
того, в январе 2009 г. в центральной части КНР в провинции Хубэй установлен ящур типа А, а в марте-апреле 2009 г. – типа Азия-1 во Внутренней
Монголии, в провинциях Сычуань, Хунань, Гуйчжоу и Шэньси. В первом
квартале 2009 г. вспышки ящура отмечены и в других странах: в Бахрейне,
Египте, Израиле, Палестине, Ливане, на Тайване (8, 9).
Необходимо отметить, что, по данным многих исследователей, ряд последних вспышек ящура типов О, А и Азия-1 был обусловлен антигенно-
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
7
измененными штаммами вируса. Это диктует необходимость проведения
систематических мониторинговых исследований, а при возникновении
новых случаев заболевания требуется оперативное выделение изолятов и
их изучение, в первую очередь степени их соответствия производственным штаммам, используемым для изготовления противоящурных вакцин.
Следовательно, эпизоотическая ситуация по ящуру в мире остается
довольно напряженной, в том числе и в сопредельных с Россией государствах. В современных условиях это диктует необходимость разработки и
осуществления эффективных мер по профилактике и борьбе с ящуром. В
России одним из основных мероприятий в данном направлении является проведение профилактической иммунизации животных против ящура,
а также осуществление исследований по выяснению иммунного фона у
вакцинированных животных, что способствует улучшению контроля за
вакцинацией и повышению ее эффективности.
Анализ результатов лабораторных исследований с учетом конкретных данных по населенным пунктам, хозяйствам, фермам свидетельствует о значительных колебаниях (от 0 до 100%) уровня иммунных животных
среди обследованного поголовья.
Для более детального изучения ситуации с использованием таблицы
случайных чисел из более чем 1500 объектов, сыворотки из которых исследовались в ФГУ «ВНИИЗЖ», были отобраны 120 населенных пунктов,
хозяйств, ферм. В связи с тем, что в тех или иных объектах даже одного
района (региона) профилактическая вакцинация животных осуществлялась по ряду местных причин в разное время, а отбор сывороток в них
в большинстве случаев происходил одномоментно, имеется возможность
проследить в динамике показатели иммунных животных среди обследованного поголовья в различные сроки после иммунизации.
Так, в Оренбургской области во многих обследованных объектах Адамовского, Акбулакского и Кувандыкского районов высокие показатели уровня иммунных животных (80-100%) отмечены через 10, 20 сут., 1, 1,5 и 2 мес.
после применения вакцины серии 6411 производства ФГУП «Щелковский
биокомбинат», а также через 2, 3 и 4 мес. после применения серии 7417 того
же производителя. В то же время в отдельных населенных пунктах, хозяйствах, фермах упомянутых районов уровни иммунных животных через 2 и
3 мес. после вакцинации были значительно ниже (30-66,7%).
В Наро-Фоминском районе Московской области, где применялась вакцина серии 14 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов», высокие уровни иммунных животных установлены в отдельных хозяйствах
через 16 сут. после иммунизации (100%) и через 48-52 сут. (80-100%). При
8
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
одновременном исследовании проб от животных из двух ферм одного хозяйства через 48 сут. после вакцинации на одной из ферм уровень иммунных животных равнялся 80-100%, а на другой – 50-62,5%. В Пушкинском
районе этой же области через 3 мес. после применения вакцины серии
6 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» во всех обследованных объектах установлен 100% уровень иммунных животных.
В Суздальском районе Владимирской области, где применялась вакцина серии 7405 производства ФГУП «Щелковский биокомбинат», в двух
соседних хозяйствах высокий уровень иммунных животных среди взрослого КРС (80-100%) наблюдался через 17 сут., 1,5, 3, 4 и 5,5 мес. после
вакцинации, в то время как среди молодняка КРС этот показатель был несколько ниже (73-91% через 1 мес. после вакцинации).
В ряде обследованных объектов Буденовского, Ипатовского и Левокумского районов Ставропольского края, где применялась вакцина серии
7410 производства ФГУП «Щелковский биокомбинат», наблюдался высокий уровень иммунного взрослого КРС (80-100%) через 1, 1,5 и 2 мес. после вакцинации. В то же время в отдельных случаях этот показатель был
гораздо ниже, например, 33-73% через 1,5 мес. после вакцинации. При
исследовании сывороток, отобранных у молодняка КРС в одном хозяйстве
через 1 мес. после вакцинации, уровень иммунных животных составлял
100%, а через 5,5 мес. он снижался до 25-50%.
В Омской области после применения вакцины серии 5 производства
ОАО «Покровский завод биопрепаратов» регистрировали высокий уровень иммунных животных (80-100%) через 1, 2, 3 и 4 мес., хотя в отдельных случаях и гораздо ниже (0-25% через 2 и 4 мес.).
В Республике Горный Алтай через 2 и 3 мес. после прививки КРС
вакциной серии 7408 производства ФГУП «Щелковский биокомбинат» в
ряде населенных пунктов, хозяйств и ферм уровень иммунных животных
составлял 90-100%, в то время как в других через 3 мес. таких животных
не выявляли.
В Хабаровском крае через 4 и 5 мес. после применения вакцины серии 7413 производства ФГУП «Щелковский биокомбинат» в большинстве
объектов уровень иммунных животных равнялся 80-100%, а в отдельных
– 25-50%. При исследовании сывороток от молодняка КРС этот показатель
был в пределах 16,7-33,3%.
В Приморском крае через 3 и 4 мес. после вакцинации иммунных
животных было 87,5-100%, а через 6,5 мес. – только 25-62,5%.
Подобных примеров можно было бы привести гораздо больше. В
целом же следует отметить, что почти в каждом регионе противоящур-
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
9
ной буферной зоны в разные сроки после вакцинации имелись объекты
(65,9%), в которых независимо от примененной противоящурной вакцины
был установлен высокий уровень иммунных животных (80-100%), достаточный для предупреждения эпизоотии ящура, и объекты (28,3%), в которых число иммунных животных было значительно ниже этих показателей
или такие животные вообще отсутствовали (5,8%), хотя в сопроводительных письмах указывалось, что они были привиты теми же вакцинами.
В ряде случаев показатели уровня иммунных животных значительно
отличались после применения одной и той же серии вакцины в разных хозяйствах одного района или даже на разных фермах одного хозяйства. Следует отметить, что в большинстве регионов процент иммунных животных к
вирусу ящура типа Азия-1 был выше, чем к вирусу ящура типов А и О.
Уровень иммунных животных в пределах 80% и выше при проведенных исследованиях отмечали у взрослого КРС в период от 10 сут. до 6 мес.
после вакцинации (сроки наблюдения).
Этот показатель в определенной мере был обусловлен временем, прошедшим после вакцинации животных. Отмечено отсутствие напряженного
иммунитета в первые дни после вакцинации и в отдаленные сроки, когда
пробы крови отбирались у молодняка КРС позже 3 мес. и у взрослых животных позже 6 мес. после вакцинации. На показатели уровня иммунных
животных могла влиять полнота охвата их вакцинацией, смешивание вакцинированных и невакцинированных животных, различные нарушения при
проведении профилактической иммунизации, непроизвольное введение
уменьшенной прививной дозы, в частности, при использовании неотрегулированного шприца-автомата, возможное применение некачественной
вакцины вследствие ее неправильной транспортировки, хранения и т.п.
Как следует из сопроводительных писем к доставленным пробам
сывороток крови, в ряде случаев промежуток между вакцинациями составлял 8-9 мес. К этому сроку среди поголовья почти отсутствовали иммунные животные.
Возможно, низкие показатели иммунного состояния среди вакцинированных животных в ряде случаев могут быть связаны с их пониженной
реактивностью или с воздействием на них различных иммунодепрессантов (инфекционных, инвазионных, токсических и других факторов, оказывающих иммуннодепрессивное действие и вызывающих развитие иммуннодефицитных состояний). У КРС иммуннодефицитные состояния
отмечаются после инфицирования возбудителями вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной
и парвовирусной инфекций, коронавирусной зимней дизентерии, лейкоза
10
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
и др. Иммуннодепрессантами являются микотоксины, которыми контаминированы корма, интенсивно применяемые антибиотики и сульфаниламиды. Отрицательно влияют на уровень поствакцинального иммунитета
истощение животных и гельминтозы (1, 2).
Выезжающие в командировки сотрудники ФГУ «ВНИИЗЖ» отмечали, что в обследуемых регионах имеются планы профилактической вакцинации животных и в основном они выполняются, хотя нередко не в полном
объеме, иногда с опозданием. Во многих местах допускается нарушение
схемы иммунизации животных, в частности, не выполняется обязательное
условие проведения ежеквартальной иммунизации молодняка КРС в возрасте 4-18 мес. и взрослых животных через каждые 6 мес. Условия хранения вакцины в большинстве случаев обеспечиваются на региональных
базах «Зооветснаба», но имеют место нарушения температурного режима
ее хранения в районах и непосредственно в хозяйствах.
Показатели уровня иммунных животных в определенной степени
зависят от выполнения планов профилактической вакцинации в том или
ином регионе. Анализ последних данных за 2007 г. свидетельствует о том,
что в целом по России в отношении КРС план был выполнен на 103%,
МРС – на 124,9%. Всего было сделано 11865,7 тыс. прививок КРС, 15092,5
тыс. – МРС, 116,7 тыс. – свиньям и 3,6 тыс. – верблюдам. В то же время из
36 регионов, в которых предусматривалась профилактическая вакцинация
КРС в 2007 г., план её был выполнен или перевыполнен только в 14. В
Калмыкии, Северной Осетии, в Краснодарском, Ставропольском, Хабаровском краях и в Волгоградской области выполнение его было в пределах 80-96%, в Бурятии, Кабардино-Балкарии, в Новосибирской, Омской,
Самарской, Сахалинской областях и ЕАО – 56-79%.
В 2008 г. с учетом предложений ветеринарных служб субъектов РФ
и финансовых возможностей поставок противоящурной вакцины за счет
федерального бюджета объемы вакцинации в России несколько увеличились: было сделано 13604,8 тыс. прививок КРС (выполнение плана при
этом составило 100,7%), 22389,2 тыс. МРС (97,9%), 75,2 тыс. свиньям и
8,8 тыс. верблюдам (при наличии в стране на 01.07.2008 г. 22645,5 тыс.
голов КРС, 23984,1 тыс. голов МРС и 17234,6 тыс. свиней). Из 36 регионов, в которых предусматривалась профилактическая вакцинация против
ящура в 2008 г., план был выполнен или перевыполнен в 26. В Республике
Тыва, в Иркутской и Самарской областях он оказался выполнен на 90-95%,
в Приморском крае, Читинской области и ЕАО – на 65-75%.
Невыполнение планов в ряде регионов отчасти можно связать с первоначальным завышением ветеринарными службами регионов планов
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
11
профилактической иммунизации с целью получения больших количеств
вакцины для создания переходного резерва, с одной стороны, и с продолжающимся снижением поголовья КРС, с другой стороны (в целом по
стране поголовье КРС за год уменьшилось почти на 2%).
В то же время приведенные данные свидетельствуют о том, что в некоторых регионах ветеринарными службами недостаточно внимания уделяется профилактической вакцинации животных против ящура. В связи с
низким уровнем иммунных животных среди обследованного поголовья в
ряде населенных пунктов, хозяйств, ферм в ответах по результатам проведенных исследований территориальным управлениям Россельхознадзора
и Управлениям (Департаментам) ветеринарии субъектов РФ рекомендовалось выяснять причины этих фактов и проводить профилактическую вакцинацию животных, придерживаясь схемы вакцинации и ревакцинации в
соответствии с инструкцией по применению вакцины.
С учетом полученных данных Россельхознадзор в своем письме от
13.01.2009 г. № ФС-НВ-2/62 в адрес руководителей органов управления
ветеринарией субъектов РФ и руководителей территориальных управлений Россельхознадзора противоящурной буферной зоны обратил внимание на имевшие место недостатки при проведении вакцинации животных
в 2008 г. во многих субъектах РФ Южного, Сибирского и Дальневосточного федеральных округов и потребовал обеспечить выполнение требований инструкции по применению противоящурных вакцин и полному
охвату поголовья КРС вакцинацией против ящура в буферной зоне.
Отрицательные результаты исследований сывороток крови от КРС и
МРС на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура свидетельствуют о том, что обследованные животные не были инфицированы
вирусом ящура, не болели и не являлись вирусоносителями.
Полученные результаты с учетом других имеющихся материалов
по контролю и надзору за ящуром в РФ (отсутствие с февраля 2006 г. на
территории РФ вспышек ящура и признаков активности вируса ящура,
наличие регламентной базы по предупреждению и борьбе с ящуром,
осуществление систематического надзора за болезнью, обеспечение
функционирования буферной зоны с использованием для профилактики ящура вакцин, отвечающих соответствующим требованиям) послужили основанием для подготовки досье «Результаты контроля и
надзора за ящуром животных в РФ, представляемые в МЭБ для признания страны, благополучной по ящуру, осуществляющей зональную
вакцинацию». Досье 02.02.2009 г. было передано в Россельхознадзор
для дальнейшего направления в МЭБ.
12
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Планом противоэпизоотических мероприятий против ящура животных
на территории субъектов РФ в 2009 г., утвержденном 15.12.2008 г. директором Департамента ветеринарии МСХ РФ И.К. Рождественским, территория
34 регионов включена в буферную зону РФ. В нее входят все субъекты РФ,
граничащие с Китаем, Монголией, Казахстаном, Азербайджаном и Грузией,
а также Московская и Владимирская области. В них должна осуществляться
систематическая профилактическая вакцинация животных против ящура с
поставками вакцины за счет федерального бюджета. Всего планом предусмотрена вакцинация 6125,5 тыс. голов КРС (29% общероссийского поголовья
КРС) и 9972,2 тыс. голов МРС (46% общероссийского поголовья МРС), на
что планируется использовать 27280,2 тыс. доз трехвалентной инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов А, О, Азия-1.
С целью контроля уровня популяционного противоящурного иммунитета в 2009 г. будет проводиться специальная мониторинговая программа, в соответствии с которой (указание Главного государственного ветеринарного инспектора Российской Федерации Н.А. Власова от 19.02.2009 г.
№ ФС-НВ-2/1374) на территории 22 регионов предусмотрен отбор сывороток крови от вакцинированных против ящура животных и направление
их для исследования в ФГУ «ВНИИЗЖ».
На ФГУ «ВНИИЗЖ» возложено проведение эпизоотологического
мониторинга, в том числе исследование сывороток крови от животных
с целью оценки состояния противоящурного иммунного фона среди поголовья КРС и исключения возможной циркуляции вируса ящура среди
вакцинированных животных. Следует отметить, что лабораторные исследования сывороток крови для оценки иммунного фона по плану Россельхознадзора для владельцев животных проводятся бесплатно.
Полученные результаты в определенной мере позволят также судить об
иммуногенности различных серий вакцин, о качестве проведенных ветеринарной службой прививок, о нарушениях при транспортировке, хранении и
применении вакцины, о соблюдении схемы иммунизации животных.
С учетом вышеизложенного, ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.03.2009 г. направило в упомянутые 22 региона рекомендации (№ 01-12/885) по организации качественного отбора проб сывороток крови животных, правильного оформления сопроводительных писем к ним (по определенной форме), целесообразности направления на курсы повышения квалификации
в ФГУ «ВНИИЗЖ» эпизоотологов и вирусологов для соответствующей
их подготовки с тем, чтобы иметь в каждом субъекте РФ ветспециалиста,
который мог бы квалифицированно организовывать мероприятия по выполнению мониторинговой программы и профилактике ящура в регионе.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
13
Заключение
Неблагополучная эпизоотическая обстановка по ящуру в мире и реальная возможность заноса его возбудителя на территорию России диктует необходимость усиления противоящурных мероприятий.
В связи с этим проведение серомониторинговых исследований в
буферной зоне позволит оценивать состояние иммунного статуса среди
вакцинированных животных, выявлять возможные нарушения при проведении профилактической иммунизации, случаи инфицирования (переболевания) животных и способствовать своевременному принятию мер по
недопущению возникновения и распространения ящура в стране.
Список литературы
1. Влияние физиологического и иммунобиологического статуса крупного рогатого скота на уровень поствакцинального иммунитета / В.А. Мищенко, А.В. Кононов, А.В. Мищенко [и др.] // Ветеринария Кубани. – 2008. – № 2. – С. 5-7.
2. Жаров, А.В. Роль иммунодефицитов в патологии животных / А.В. Жаров //
Ветеринарная патология. – 2003. – № 3. – С. 7-12.
3. Критерии включения болезней в список МЭБ // МЭБ. Санитарный кодекс
наземных животных. – 17-е изд. – Париж, 2008. – Т. 1. – С. 4-7.
4. Результаты мониторинговых исследований по ящуру в России в 2007 году
/ В.В. Борисов, А.М. Рахманов, Н.Е. Камалова [и др.] // Тр. Федерального центра
охраны здоровья животных. – Владимир, 2008. – Т. 6. – С. 34-43.
5. Эпизоотическая ситуация по ящуру типа Азия-1 в России в 2005 году и анализ эффективности мер борьбы / К.Н. Груздев, Т.З. Байбиков, В.Н. Герасимов [и
др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. –
Т. 4. – С. 3-19.
6. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]; под ред. А.Н.
Бурдова. – М.: Агропромиздат, 1990. – 320 с.
7. OIE. Disease Information. – 2007. – Vol. 20, №№1 – 52.
8. OIE. Disease Information. – 2008. – Vol. 21, №№1 – 52.
9. OIE. Disease Information. – 2009. – Vol. 22, №№1 – 18.
10. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals,
birds and bees). – 6th ed. – Paris, 2008. – Vol. 1. – 598 p.
11. OIE. World Animal Health in 2007. – Paris, 2008. – 603 p.
14
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
RESULTS OF FMD MONITORING IN RUSSIA IN 2008
V.V. Borisov, A.M. Rakhmanov, Ye.V. Belik,
S.R. Kremenchugskaya, N.Ye. Kamalova, A.V. Kanshina,
A.V. Scherbakov, A.V. Mischenko, V.A. Mischenko,
M.V. Sysolyakina, V.N. Gerasimov, D.N. Afonina, T.K. Mayorova
Summary
Results of FMD epidemiological and serological investigations in 21 Subjects
of the Russian Federation in a zone of high risk of FMD introduction and spread
were summarized. The preventive vaccination of animals against the disease was
carried out in those zones. 12,214 sera samples from cattle and small ruminants
were tested using ELISA for the presence of antibodies to A, O, Asia-1 FMD virus.
Levels of animal immune profiles in different settlements, establishments, farms
and regions of the RF were different. Results of 3,852 blood sera samples testing
for the presence of antibodies to FMD virus non-structural proteins evidenced
that animals in the buffer zone of the RF were not infected.
УДК 619:616.98:578.835.2:615.371
ЭЛЮЦИЯ СОРБИРОВАННОГО ВИРУСА ЯЩУРА
СОПОЛИМЕРАМИ ПОЛИАКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
Т.Н. Лёзова, Н.Д. Клюкина, Д.В. Михалишин, А.В. Борисов
Резюме
В работе показаны результаты определения наиболее эффективной
концентрации сополимеров полиакриловой кислоты (ПАК) и поливинилпирролидона (ПВПД) для элюирования вируса ящура с геля гидроокиси
алюминия (ГОА). Проведено сравнение методов элюции 1/3М фосфатнобуферным раствором (ФБР) и 0,5% раствором ПАК.
Введение
Для изготовления противоящурных вакцин важное значение имеет концентрирование антигена. С целью повышения содержания специфического
антигена в вакцинах применяют различные методы концентрирования вируссодержащих суспензий, такие, как метод сорбции вируса или антигена
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
15
на сорбенты, метод осаждения полиэтиленгликолем и ультрафильтрация.
При промышленном концентрировании вирусного антигена чаще применяют метод сорбции на ГОА. Потери при этом составляют менее 10% (1, 2).
Путем элюирования вируса ящура с ГОА стало возможным оценить
эффективность концентрирования вируса количественно. В многочисленных опытах были получены оптимальные условия сорбции и элюции вируса ящура на ГОА, которые показали, что сорбционное равновесие устанавливается в течение нескольких минут (меньше 5-ти минут), а элюция
вируса 1/3М ФБР наступает уже через 10 минут. Зависимости сорбции и
элюции от времени не наблюдалось. Отчетливо видна зависимость сорбции вируса от концентрации ГОА, находящейся в смеси. Возможность
удаления вируса с коллоидальной ГОА при помощи 1/3М ФБР (рН 7,5)
позволяет проводить прямое и точное изучение процесса сорбции вируса к ГОА. Сорбционная способность ГОА по отношению к вирусу ящура
сильно зависит от концентрации сопутствующих протеинов (3, 4).
Материалы и методы
В опытах использовали производственные штаммы культурального
вируса ящура типов О и Азия-1.
Для исследований использовали ГОА в концентрациях 0,2% и 0,3%.
Метод элюирования, предложенный Matheka в 1959 г. (3, 4), основан
на применении 1/3 М ФБР для проведения элюции.
После адсорбции вируса на ГОА смесь центрифугировали при 1000
об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляли, в ней проверяли содержание растворимых белков. Осадок промывали изотоническим
раствором NaCl или стерильной дистиллированной водой и опять центрифугировали. В надосадке определяли количество растворенных белков и
содержание общего вирусного белка.
Для изучения элюции была испытана ПАК и ее сополимеры. Адсорбированный на ГОА культуральный вирус ящура типа О промывали
стерильной дистиллированной водой и выполняли элюцию 0,25, 0,5 и 1%
концентрациями сополимеров ПАК:ПВПД 25:75 состава (мольн %), образцы № 2 и № 4 и сополимеров ПАК:ПВПД 50:50 состава (мольн %),
образцы № 1 и № 3. Работу проводили с неинактивированным вирусом. В
элюатах определяли титр инфекционной активности и рассчитывали потери вируса. В качестве контроля использовали очищенную суспензию.
Иммуногенную активность концентратов-элюатов исследовали в составе сорбированной противоящурной вакцины, изготовленной из вируса типа
Азия-1 Иран58/99. Антиген концентрировали сорбцией на ГОА и элюирова-
16
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ли 1/3М ФБР и 0,5% раствором ПАК молекулярной массой 800000Д (дальтон), получая 18-кратные концентраты. Исследование проводили на 15 подсвинках живой массой 50-80 кг. Для приготовления эмульсионной вакцины
использовали масляный адъювант Montanide ISA70 (SEPPIC, Франция) с соотношением водной и масляной фаз 40:60. В цельном виде прививная доза
вакцины 2 мл содержала 2 мкг 146S+75S компонентов. Вакцину вводили внутримышечно в цельном виде и в разведении 1:10, где содержание 146S+75S
компонентов равнялось 0,2 мкг. На 10 и 21 сутки после вакцинации (СПВ)
были отобраны пробы крови, и полученные сыворотки крови исследованы в
реакции нейтрализации в монослойной культуре клеток почки свиньи.
Контрольное заражение животных проводили на 21 сутки после
вакцинации адаптированным к свиньям вирусом ящура штамма Азия-1
№ 1737/Грузия/2000 в дозе 104 ИД50 в 0,2 мл под слизистую оболочку языка. Учет результатов проводили через 7 суток.
Результаты и обсуждение
Добавление в суспензию культурального вируса ящура 0,2% ГОА
уменьшило содержание растворенных белков с 572±25,6 мг% (р<0,001) до
478±20,1 мг%, а 0,3% ГОА –до 470±23,5 мг%. После слива надосадочной
жидкости и промывания осадка количество удаляемых растворимых белков
составило от 27,3 до 30,0 мг% при использовании забуференного изотонического раствора NaCl и от 30,3 до 32,0 мг% при использовании стерильной дистиллированной воды, а количество общего вирусного белка (ОВБ)
до 0,10 мкг/мл при промывании забуференным изотоническим раствором
NaCl и до 0,06 мкг/мл при промывании стерильной дистиллированной водой. Сравнительные результаты трех исследований представлены в табл. 1.
Таблица 1
Эффективность промывания адсорбированного на ГОА
антигена различными растворами
(n=3)
№
п/п
Концентрация Раствор для
ГОА, %
промывания
1
0,2
2
0,3
Кол-во удаляемых
Кол-во удаляемого
растворимых белков ОВБ при промывке,
при промывке, мг%
мкг/мл
раствор NaCl
27,3±3,67
0-0,04
вода
30,3±7,86
0,01-0,06
раствор NaCl
30,0±8,29
0,01-0,10
вода
32,0±12,68
0-0,01
17
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Данные опыта, представленные в табл. 1, показали, что потери общего вирусного белка незначительны.
Результаты элюирования вируса ящура с ГОА 0,25-1% концентрациями ПАК и ее сополимерами показаны в табл. 2.
Таблица 2
Влияние концентрации сополимеров ПАК на эффективность
элюции вируса ящура типа О с ГОА
(n=3)
Элюирующее Концентрация Титр инфекционности, Потери инфекционности,
вещество
вещества, %
lg ТЦД50/мл
lg ТЦД50/мл
ПАК Мм
0,8×106
образец № 1
образец № 3
образец № 2
образец № 4
Контроль
0,25
6,60±0,10 р<0,001
0,43
0,5
6,90±0,13 р<0,001
0,13
1,0
6,69±0,09 р<0,001
0,34
0,25
6,50±0,18 р<0,001
0,53
0,5
6,95±1,28 р<0,005
0,08
1,0
6,83±0,08 р<0,001
0,20
0,25
6,67±0,22 р<0,005
0,36
0,5
6,92±0,12 р<0,001
0,11
1,0
6,67±0,22 р<0,005
0,36
0,25
6,44±1,75 р<0,001
0,59
0,5
6,75±0,16 р<0,001
0,28
1,0
6,58±0,17 р<0,001
0,45
0,25
6,67±0,83 р<0,001
0,36
0,5
6,75±0,14 р<0,001
0,28
1,0
6,67±0,22 р<0,001
0,36
–
7,03±0,11 р<0,001
–
Анализируя данные табл. 2, видно, что образцы сополимеров № 1 и
№ 3 в концентрациях 0,5% эффективно элюировали вирус ящура типа О с
ГОА, т.к. потери вируса составили 0,08-0,11 lg ТЦД50/мл, соответственно,
при применении 0,5% раствора ПАК – 0,13 lg ТЦД50/мл, а у 0,5% концентраций сополимеров образцов № 2 и № 4 – 0,28 lg ТЦД50/мл.
Результаты иммуногенной активности эмульсионных вакцин из антигена, элюированного разными методами, представлены в табл. 3.
18
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 3
Иммуногенная активность эмульсионных противоящурных
вакцин типа Азия-1, изготовленных из концентрированного
антигена, полученного методом «сорбции-элюции»
№
Элюирующий
ж-ных
раствор
Разведение
вакцины
1
2
Титр ВНА, log 2
10 СПВ
21 СПВ
Наличие
генерализации
2,50
4,50
-
3,50
5,25
-
4,00
6,25
-
3,33±0,44
р<0,025
5,33±0,71
р<0,025
2,75
5,00
-
2,25
3,50
-
4,25
5,00
-
М±m
3,08±0,60
р<0,005
4,50±0,50
р<0,025
7
3,50
5,50
-
8
3,25
5,25
-
4,00
6,00
-
цельное
3
М±m
4
0,5% раствор
ПАК Мм
0,8×106
5
1:10
6
9
цельное
10
М±m
11
1/3М ФБР
12
13
1:10
14
М±m
15
контроль
-
3,00
4,00
3,44±0,45
р<0,005
5,19±0,25
р<0,001
3,25
4,00
-
2,75
5,25
-
2,25
4,50
-
3,00
5,00
-
2,81±0,30
р<0,005
4,69±0,42
р<0,005
-
-
+
ИмД50/мл
0,06
0,06
+
ВНА – вируснейтрализующие антитела
Как видно из данных табл. 3, оба раствора эффективно элюировали
антиген с ГОА. Эффективность обеих вакцин была достаточной, чтобы
защитить всех привитых животных при контрольном заражении. Таким
образом, в прививном объеме 2 мл содержалось 33 ПД50 для свиней.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
19
Уровень вируснейтрализующих антител в группах, привитых вакциной из антигена, элюированного ПАК, был практически одинаковым на
10 и 21 сутки после вакцинации с титром ВНА, индуцированных вакциной с антигеном элюированным с ГОА 1/3М ФБР. Это свидетельствует об
эффективности элюции антигена с ГОА раствором ПАК и о сохранности
элюированных антигенов.
Выводы
1. Исследования показали, что при отмывании изотоническим раствором NaCl и стерильной дистиллированной водой осадка, содержащего
ГОА и антиген, потери общего вирусного белка были незначительны и
составили до 0,10 мкг/мл.
2. Сополимеры ПАК и ПВПД эффективно элюируют антиген с ГОА
в концентрации 0,5%.
3. Иммуногенная активность антигена, элюированного 1/3М ФБР и
0,5% раствором ПАК, в составе вакцин была практически одинаковой.
Список литературы
1. Безаммиачный гель гидроокиси алюминия для противоящурных вакцин /
А.И. Абдулов, А.Я. Самуйленко, Н.Д. Скичко, В.И. Еремец // Науч. основы технологии пром. произ-ва вет. биол. преп.: тез. докл. 3-й Всесоюз. конф. – М., 1987. –
С. 159-160.
2. Воробьёв, А.А. Адъюванты / А.А. Воробьёв, Н.Н. Васильев. – М.: Медицина,
1969. – 206 с.
3. Matheka, H.D. Über das Verhalten des Maul-und-Klauenseuche Virus bei
Adsorption an Aluminiumhydrohyd und nachfolgender Elution. 1. Mitteilung.
Untersuchung der Faktoren, die Absorption und Elution beinflussen / H.D. Matheka //
Zbl. Bakt. Ι. Orig. – 1959. – Bd. 174, N 7-8. – S. 473-492.
4. Matheka, H.D. Über das Verhalten des Maul-und-Klauenseuche Virus bei
Adsorption an Aluminiumhydrohyd und nachfolgender Elution. 2. Mitteilung. Der
Einfluss von Fremdeiweiss auf den Absorptions und Elutions vorgang / H.D. Matheka //
Zbl. Bact. Ι. Orig. – 1959. – Bd. 174, N 7-8. – S. 493-505.
20
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ELUTION OF ADSORBED FMD VIRUS USING
POLYACRILIC ACID COPOLYMERS
T.N. Lyozova, N.D. Klyukina, D.V. Mikhalishin, A.V. Borisov
Summary
Results of determination of the most effective concentration of polyacrilic
acid copolymers and polyvinilpyrolidone (PVP) for FMD virus elution from
aluminium hydroxide gel (AHG) are shown in the paper. Elusion methods
using 1/3M phosphate-buffered solution (PBS) and 0,5% polyacrilic acid
solution were compared.
УДК 619:616.98:578.835.2:615.371
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА ЯЩУРА
МЕТОДОМ «СОРБЦИИ-ЭЛЮЦИИ»
ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН
Н.Д. Клюкина, Т.Н. Лёзова, Д.В. Михалишин,
А.В. Борисов, В.А. Стариков
Резюме
В работе показан новый метод концентрирования антигена вируса ящура. Вначале антиген адсорбируют на гель гидроокиси алюминия (ГОА), а затем его элюируют при помощи полиакриловой кислоты (ПАК) или сополимеров ПАК и поливинилпирролидона (ПВПД).
Данный метод обеспечивает дополнительную очистку концентратов от
балластных белков. Вакцины, приготовленные из концентрированных
антигенов, обладали высокой иммуногенностью и сохраняли свою активность в течение 18 месяцев.
Введение
При производстве противоящурных вакцин необходимо концентрирование антигена. Существует несколько способов концентрирования вируса ящура: метод сорбции вируса или антигена на сорбенты,
метод осаждения полиэтиленгликолем и метод проточной ультрафильтрации.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
21
При концентрировании вируссодержащей суспензии в больших объёмах применяют метод адсорбции. Сорбция вируса на гель ГОА обеспечивает концентрирование вируса более чем на 90% (1).
Полиэтиленгликоль начали применять для разделения и концентрирования белков, бактериофагов и вирусов (5). Метод позволяет концентрировать вирус ящура в 10-100 раз по объёму (4). Очистка вируса по балластному белку составляет 70-90% (3).
Ультрафильтрация представляет собой процесс, в результате которого
молекулы, имеющие больший размер, чем поры фильтров, задерживаются на них. При концентрировании этим методом выход вируса составляет
70-100%, при этом возрастает и количество балластного белка (3).
Перечисленные способы концентрирования имеют положительные и
отрицательные стороны. Мы поставили задачу разработать способ концентрирования вируса ящура – экономичный, легко воспроизводимый, не
требующий дорогостоящего оборудования, сохраняющий антиген в процессе концентрирования.
Материалы и методы
Работу проводили с инактивированным вирусом ящура типов А22
№ 550, Азия-1 Иран 58/99, С1 №564.
В качестве сорбента использовали 3% гель ГОА.
Для элюции использовали 0,5% раствор ПАК Мм 0,8×106 (рН 7,2-7,5)
или 0,5% растворы сополимеров ПАК, приготовленные на фосфатнобуферном растворе (ФБР).
В приготовленных концентратах антигена вируса ящура определяли
содержание балластных белков, вирусспецифических белков и количество
иммуногенных компонентов.
Определение иммуногенной активности вакцин проводили
SES-методом (2) на морских свинках массой 450-600 г.
Для приготовления вакцины использовали инактивированные концентраты вируса ящура типов А22 и Азия-1, из которых готовили вакцины
с содержанием 3 мкг/мл 146S+75S компонентов. В качестве адъюванта использовали ПАК и сополимеры ПАК:ПВПД 50:50 (мольн %) – образец
№1 и ПАК:ПВПД 25:75 (мольн %) – образец №4. Активность опытных
вакцин сравнивали с активностью сорбированной вакцины с сапонином.
Опытную вакцину типа А22 разводили в 40 раз 1% или 3% адъювантом, а
вакцину типа Азия-1 – в 54 раза. Прививная доза (2 мл) содержала 20 и
60 мг адъюванта, соответственно. Контрольную вакцину разводили ФБР.
Полученными разведениями вакцинировали морских свинок внутримы-
22
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
шечно в область правого и левого бедра по 1 мл. На каждую валентность
брали 10 морских свинок. Невакцинированные животные служили контролем вируса каждого типа.
Через 15 суток после вакцинации всех животных заражали адаптированным к морским свинкам гомологичным штаммом вируса ящура в дозе
10000 ГД50/0,1 мл интрадермально в плантарную поверхность одной из
задних лапок. Через 3, 5 и 7 суток после заражения осматривали каждую
морскую свинку на наличие генерализованной формы ящура. Генерализацией считали появление вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую
не вводили вирус.
Активность вакцин, приготовленных из антигена вируса ящура, концентрированного методом «сорбции–элюции», изучали на крупном рогатом скоте (КРС). Готовили вакцину с добавлением ПАК до 3%. Исследование проводили на 6 головах КРС живой массой 150-200 кг. В цельном виде вакцина содержала 6 мкг 146S+75S компонентов и 60 мг ПАК
в прививной дозе 2 мл. В качестве контрольной вакцины использовали
адсорбат-вакцину, содержащую ГОА и сапонин. На 10, 21, 28 и 35 сутки
после вакцинации (СПВ) отбирали пробы крови. Сыворотки крови исследовали в реакции нейтрализации в монослойной культуре клеток почки
свиньи (СП). Контрольное заражение животных проводили на 35 сутки
после вакцинации афтозным вирусом ящура типа С1 №564 в дозе 104 ИД50
в объеме 0,2 мл в две точки слизистой оболочки языка. Патологоанатомический осмотр проводили через 7 суток.
Результаты и обсуждение
Инактивированный вирус адсорбировали ГОА в концентрации
0,2%. После тщательного перемешивания смесь центрифугировали, а
надосадочную жидкость сливали. С целью дополнительного удаления
балластных белков осадок ресуспендировали дистиллированной водой
и опять центрифугировали. К полученному осадку добавляли 0,5%
раствор ПАК Мм 0,8×106 (рН 7,2-7,5) или 0,5% растворы сополимеров
ПАК на ФБР. Гель ГОА отделяли центрифугированием. Надосадочная
жидкость представляла собой очищенный концентрированный антиген
вируса ящура.
В концентрированных в 10 раз антигенах, полученных с помощью
метода «сорбции-элюции», исследовали количество балластных белков.
Результаты исследований суммированы в табл. 1.
23
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 1
Количество балластных белков в 10–кратных концентратах,
полученных методом «сорбции–элюции»
(n=4)
Кол-во балластного белка, мг%
№
п/п
Наименование
элюирующего раствора
Исходная суспензия
10-кратный концентрат
1
ПАК 0,8×106Д
572±25,61 р<0,001
341±60,38 р<0,025
2
Образец №4
572±25,61 р<0,001
344±92,16 р<0,05
3
Образец №1
572±25,61 р<0,001
310±69,93 р<0,025
Представленные в табл. 1 результаты опытов демонстрируют,
что концентраты содержали меньшее количество балластного белка
(310-344 мг%), чем очищенная суспензия антигена вируса ящура до концентрирования (572 мг%). Учитывая кратность концентрирования антигена, можно сделать заключение о том, что в процессе концентрирования
удалили 94-95% балластных белков. Концентраты антигена, полученные
методом «сорбции-элюции», не требовали дополнительной очистки, которая обычно сопровождается потерей антигена.
В дальнейшем концентраты, содержащие 0,5% растворы ПАК и ее
сополимеров, исследовали на компонентный состав. Концентраты перед
исследованием разводили до исходного объема и определяли в них общий
вирусный белок (ОВБ) и иммуногенные 146S+75S компоненты. Результаты представлены в табл. 2.
Результаты, приведенные в табл. 2, показывают, что при концентрировании антигенов вируса ящура типа Азия-1 потери общего вирусного
белка составили от 2 до 39,1%, а 146S+75S компонентов – от 4,2 до 27,9%
по отношению к исходной суспензии. Потери при концентрировании методом «сорбции-элюции» антигенов вируса ящура типа А22 составили
по ОВБ до 18,7%, а по 146S+75S компонентам – до 26,2%. Полученные
результаты свидетельствуют об эффективности предложенного метода
концентрирования вируса ящура. Сополимеры ПАК №1 и №4 обладают
элюирующими свойствами, но существенных преимуществ по сравнению
с ПАК не выявлено.
Следует полагать, что причиной неполного элюирования вируса ящура, возможно, служит высокая вязкость элюирующего раствора при смешивании его с ГОА.
24
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 2
Изучение эффективности концентрирования антигенов
с помощью метода «сорбции-элюции»
Тип
антигена
Азия-1
Азия-1
А22
А22
Характеристика
вирусной
суспензии
исходная
разведенная
до исходного
объема
исходная
разведенная
до исходного
объема
разведенная
до исходного
объема
исходная
разведенная
до исходного
объема
исходная
разведенная
до исходного
объема
разведенная
до исходного
объема
Элюирующее
вещество
Кол-во компонентов
ОВБ/146S+75S,
мкг/мл
Потери
ОВБ/146S+75S,
%
–
1,94/1,45
–
ПАК
1,91/1,39
2/4,2
–
2,20/1,72
–
ПАК:ПВПД
№ 4 25:75
1,34/1,24
39,1/27,9
ПАК:ПВПД
№ 1 50:50
1,79/1,65
19,6/4,1
–
2,16/2,02
–
ПАК
1,77/1,49
18,7/26,2
–
2,07/1,78
–
ПАК:ПВПД
№ 4 25:75
2,22/1,77
нет/0,6
ПАК:ПВПД
№ 1 50:50
2,42/1,97
нет/нет
Результаты определения иммуногенности вакцин с разным количеством адъюванта на морских свинках представлены в табл. 3.
Таблица 3
Влияние количества адъюванта на иммуногенность вакцин
№
п/п
1
2
№ вакцины
Адъювант и его содержание в
прививной дозе вакцины
1
2
3 – контроль
1
2
3 – контроль
образец № 1, 1% или 20 мг
образец № 4, 1% или 20 мг
ГОА 20 мг, сапонин 1,5 мг
образец № 1, 3% или 60 мг
образец № 4, 3% или 60 мг
ГОА 20 мг, сапонин 1,5 мг
Количество ИмД50 для КРС
в прививной дозе
А22
Азия-1
2,0
3,1
5,5
4,2
5,5
4,2
7,0
7,0
8,9
8,9
8,9
7,0
25
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
По результатам таблицы видно, что вакцины, содержащие в прививной дозе 20 мг адъюванта, стимулируют более слабый иммунный ответ в
сравнении с контрольной вакциной. Вакцины, содержащие антиген типа
Азия-1 с добавлением 20 мг и 60 мг адъюванта, обладали достаточной
иммуногенной активностью. Увеличение количества адъюванта в прививной дозе до 60 мг повысило иммуногенную активность вакцин типа А
приблизительно в 2 раза. Опытные вакцины по активности не уступали
контрольной. Поэтому, исходя из результатов табл. 3, в дальнейших опытах, проводимых на животных, мы применяли 3% концентрацию синтетического адъюванта, то есть 60 мг в прививной дозе.
Результаты изучения адъювантной активности ПАК в составе противоящурных вакцин представлены в табл. 4.
Таблица 4
Иммуногенная активность противоящурной вакцины
типа С для КРС
№
ж-ных
ХарактериПрививная
стика
доза, мл
вакцины
Титр ВНА, log 2
Наличие
генерализации
10 СПВ
21 СПВ
28 СПВ
35 СПВ
1
3,00
5,25
5,75
5,75
-
2
3,25
4,75
5,25
6,75
-
3,00
5,00
6,00
6,25
-
3
М±m
6 мкг
146S+75S
+60 мг ПАК
6 мкг
146S+75S
+30 мгГОА+
1,5 мг
М±m
сапонин
6
контроль
2,0
3,08±0,30 5,00±0,52 5,67±0,83 6,25±0,66
р<0,01
р<0,025
р<0,025
р<0,025
4
2,25
4,25
4,75
5,00
-
5
2,00
4,75
5,25
5,25
-
2,0
2,13±0,10 4,50±1,25 5,00±0,50 5,13±0,12
-
-
-
-
-
+
ВНА – вируснейтрализующие антитела.
Результаты опыта показывают, что в первые 10 суток после вакцинации у животных, привитых вакциной с ПАК, наблюдали более быстрое нарастание уровня вируснейтрализующих антител, чем у КРС,
иммунизированных адсорбат-вакциной с сапонином. В последующие
дни наблюдения гуморальный иммунитет у КРС, привитого опытной
и контрольной вакцинами, был одинаковым. Уровень антител к 35 суткам на вакцину с ПАК составил 6,25±0,66 log2, а на контрольную вакцину – 5,13±0,12 log2.
26
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Результаты, приведенные в табл. 4, показали, что вакцина с ПАК индуцировала напряженный иммунитет, достаточный для защиты животных
от контрольного заражения на 21-35 сутки после вакцинации. Сформировавшийся к 21 суткам после вакцинации уровень ВНА не снижался до
35 суток (срок наблюдения). Необходимо отметить, что растворы сополимеров ПАК в тех же концентрациях обладают меньшей вязкостью.
Эффективность противоящурной вакцины с ПАК для крупного рогатого
скота была сходной с контрольной сорбированной вакциной с сапонином.
Исследование иммуногенной активности сополимеров ПАК проводили на 11 головах КРС живой массой 150-200 кг, из них 1 – контрольное.
Готовили бивалентные вакцины из концентратов – элюатов вируса ящура
типов А22 и Азия-1. Опытные вакцины содержали по 0,87 мкг 146S+75S
компонентов вируса и по 60 мг адъюванта – образцы № 1 и № 4. На 10
и 21 сутки после вакцинации отбирали пробы крови. Сыворотки исследовали в реакции нейтрализации в монослойной культуре клеток СП.
Контрольное заражение проводили афтозным вирусом ящура типа Азия-1
Иран 58/99 на 21 сутки после вакцинации. Результаты исследований представлены в табл. 5.
Таблица 5
Иммуногенность бивалентных противоящурных вакцин
с сополимерами ПАК в качестве адъюванта на КРС
№ Характеристи- Прививная
п/п ка вакцины
доза, мл
1
2
3
4
5
образец №1
60мг+0,87мкг
146S+75S
компонентов
2,0
Титр ВНА против вируса, log 2
А22
Азия-1
10 СПВ
21 СПВ
10 СПВ
21 СПВ
5,00
5,25
5,00
5,75
Наличие
генерализации
-
5,25
5,75
5,25
6,00
4,50
5,50
5,00
5,50
-
5,25
5,50
4,50
5,25
-
4,50
6,50
5,00
6,25
-
4,90±0,17 5,70±0,22 4,95±0,12 5,75±0,18
р<0,001
р<0,001
р<0,001
р<0,001
М±m
6
5,00
6,00
4,75
4,75
-
7
5,25
6,25
4,50
5,00
-
4,75
6,25
4,25
6,00
-
4,75
5,75
4,50
5,75
-
5,00
6,00
4,75
5,25
-
8
9
10
образец №4
60мг+0,87мкг
146����������
S���������
+75������
S�����
компонентов
2,0
5,00±0,11 6,05±0,09 4,55±0,09 5,35±0,25
р<0,001
р<0,001
р<0,001
р<0,001
М±m
11
контроль
-
-
-
-
-
+
27
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Данные, представленные в табл. 5, показали, что оба образца вакцины
с сополимерами стимулировали у животных образование высокого уровня
гуморального иммунитета, способного защитить животных при контрольном заражении вирусом ящура Азия-1 Иран 58/99.
Приготовленные концентраты хранили при температуре 2-8ºС в течение 18 месяцев. Всего было исследовано 6 проб концентратов. Результаты
исследований концентратов, приготовленных методом «сорбции-элюции» с
помощью 0,5% растворов ПАК и ее сополимеров, представлены в табл. 6.
Таблица 6
Сохраняемость иммуногенных компонентов в концентратах
антигенов, приготовленных методом «сорбции-элюции»
№
п/п
Тип
вируса
ОВБ/146S+75S компонентов, мкг/мл
Элюирующее
в концентрате после
вещество в концентрате до хранения в течение потери,
хранения
%
18 мес.
1
Азия-1
ПАК
20,4/19,6
20,8/17,1
–/12,8
2
Азия-1
ПАК
23,4/10,4
21,2/11,3
9,4/–
3
Азия-1
ПАК
7,48/7,12
6,7/6,17
10,4/13,3
4
А22
образец № 4
9,0/7,33
12,4/8,31
–
5
А22
образец № 4
22,2/17,7
16,2/13,0
27/26,6
6
Азия-1
образец № 1
17,9/16,5
16,2/12,3
9,5/25,5
По результатам, приведенным в табл. 6, видно, что потери 146S+75S
компонентов при хранении концентратов с ПАК в течение 18 мес. составили примерно 13%, а концентратов, полученных методом «сорбции-элюции»
с применением сополимера № 1 и № 4 – 26%. Таким образом, можно сделать заключение, что концентраты, полученные методом «сорбции-элюции»
с применением полиакриловой кислоты, сохраняются лучше, чем полученные с использованием сополимеров образцов № 1 и № 4.
Выводы
1. Показана возможность получения 10-кратных концентратов вируса
ящура методом «сорбции-элюции».
2. Отмечено низкое содержание балластных белков в концентратах,
полученных методом «сорбции-элюции».
3. Вакцины, изготовленные из антигенов, концентрированных методом «сорбции-элюции», обладали достаточной иммуногенной активно-
28
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
стью для КРС и морских свинок. С увеличением количества адъюванта
возрастала и иммуногенная активность вакцин.
4. У КРС, привитого вакциной с ПАК, наблюдали более быстрое нарастание уровня ВНА по сравнению с контрольной адсорбат–вакциной с
сапонином.
5. Установлено, что концентраты антигена вируса ящура, полученные
методом «сорбции-элюции», сохраняют исходную активность при температуре 2-8ºС в течение 18 месяцев (срок наблюдения).
Список литературы
1. Воробьёв, А.А. Адъюванты / А.А. Воробьёв, Н.Н. Васильев. – М.: Медицина,
1969. – 206 с.
2. Методические указания по оценке на морских свинках иммуногенной активности вакцины против ящура из вируса типа А22, О и Азия-1, выращенного
в клетках ВНК-21 / Е.Л. Салажаев, А.Ф. Бондаренко, Е.В. Белик, Б.А. Глушко. –
М, 1990. – 5 с.
3. Сисягин, П.Н. Сравнительное изучение эффективности концентрирования
суспензии вируса ящура полиэтиленгликолем и проточной ультрафильтрацией /
П.Н. Сисягин, Ю.Г. Фраймович, В.В. Михалишин // Актуал. вопр. вет. вирусол. –
Владимир, 1976. – Ч. 1. – С. 27-28.
4. Rapid bacteriophage sedimentation in the presence polyethylene glycol and its
application to large scale virus purification / K.R. Yamamoto, B.M. Alberto, L. Lawhorue
[et al.] // Virology. – 1970. – Vоl. 40. – P. 734-744.
5. Vajda, B.P. Concentration and purification of viruses and bacteriophages with
polyethylene glycol / B.P. Vajda // Folia Microbiol. (Prague). – 1978. – Vоl. 22. – P. 70-73.
FMD VIRUS CONCENTRATION USING
«ADSORPTION-ELUTION» METHOD FOR FMD
VACCINE PRODUCTION
N.D. Klyukina, T.N. Lyozova, D.V. Mikhalishin,
A.V. Borisov, V.A. Starikov
Summary
A new method of FMD virus antigen concentration is demonstrated in the
paper. First, antigen is adsorbed onto aluminium hydroxide gel (AHG), then
it is eluted using polyacrilic acid (PAA) and polyacrilic acid copolymers and
polyvinilpyrolidone (PVP). This method provides additional purification of
concentrates from ballast proteins. Vaccines prepared from concentrated antigens
had high immunogenicity and maintained their activity during 18 months.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
29
УДК 619.616.98:578.835.2:615.371
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН ТИПА АЗИЯ-1
В.А. Стариков, В.В. Михалишин, Т.Н. Лёзова,
А.В. Борисов, Д.В. Михалишин
Резюме
В данной статье показаны результаты изучения иммуногенной активности моно – и биштаммовых противоящурных вакцин типа Азия-1
на морских свинках, крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях. Показана
устойчивость вакцинированных животных к контрольному заражению
против гетерологичного штамма вируса ящура.
Введение
Международный опыт профилактики ящура показывает, что осуществление только ветеринарно-санитарных мер не гарантирует защиту
от распространения заболевания. В последние годы в мире отмечается
тенденция к возрастанию числа вспышек ящура типа Азия-1. На территории РФ вирус ящура типа Азия-1 не встречался, в связи с этим на границе
сопредельных государств, неблагополучных по ящуру (Китай, Монголия),
не проводили профилактическую вакцинацию КРС и свиней против вируса этого типа.
В 2005-2006 гг. в Амурской и Читинской областях, в ряде районов
Хабаровского и Приморского краёв были зарегистрированы вспышки
ящура типа Азия-1. Благодаря своевременной диагностике и оперативно
принятым мерам, в том числе убою и уничтожению всех животных в первичном очаге, а также кольцевой вакцинации ящур был ликвидирован (3).
Экстренную вакцинацию с/х животных осуществляли сорбированными и
эмульсионными вакцинами, изготовленными на основе производственных
штаммов Азия-1 №1737/Грузия/2000, Азия-1 Иран58/99 и рекомендованного Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) и Продовольственной и сельскохозяйственной организацией при ООН (ФАО)
штамма Азия-1/Шамир3/89, как наиболее подходящего для защиты от
большинства полевых штаммов этого типа (4).
Исследование гуморального иммунитета у КРС, привитого трёхвалентной сорбированной вакциной, показало снижение иммунитета к вирусу типа Азия-1 в 2-3 раза через 3,5 месяца после вакцинации. Напряженность иммунитета у КРС против вируса ящура гомологичного (про-
30
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
изводственного) штамма была в 11-12 раз выше, по сравнению с таковой,
к гетерологичному штамму вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005.
Этим объясняется и то, что лишь 2 животных из 5 вакцинированных выдержали прямое заражение афтозным вирусом ящура штамм
Азия-1 № 1987/Амурский/2005 (2).
Целью нашей работы было изготовление вакцины, создающей достаточный иммунный ответ у сельскохозяйственных животных против полевых изолятов вируса ящура типа Азия-1.
Материалы и методы
Работу проводили с различными штаммами инактивированного вируса ящура: Азия-1/Шамир3/89, Азия-1 № 1987/Амурский/2005,
Азия-1 № 48, Азия-1 Иран58/99.
Инактивацию инфекционности вируса проводили аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в количестве 0,05% в течение 12 ч при 37ºС.
Авирулентность инактивированного антигена контролировали в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП).
Количество иммуногенных компонентов определяли иммунохимическим методом (1).
Антиген концентрировали методом преципитации полиэтиленгликолем и из полученных концентратов готовили сорбированные и эмульсионные вакцины.
Иммуногенную активность вакцин оценивали на морских свинках массой 450-600 г путем определения 50% иммунизирующей дозы (ИмД50 МС).
Эффективность сорбированных вакцин испытывали на КРС массой
250-300 кг. Гуморальный иммунитет оценивали по количеству вируснейтрализующих антител (ВНА), которое определяли на 10-е и 21-е сутки после
вакцинации (СПВ) в реакции нейтрализации на культуре клеток СП. Уровень иммунитета при контрольном заражении устанавливали на 21-е СПВ,
путём введения в слизистую оболочку языка афтозного вируса ящура (ВЯ)
штамм Азия-1 № 1987/Амурский/2005 в дозе 104 ИД50/0,2 см3 в две точки.
Патологоанатомический осмотр проводили через 7 суток после заражения.
Исследование иммуногенной активности эмульсионных вакцин проводили на подсвинках живой массой 50-80 кг. Напряженность иммунитета
изучали на 21-е СПВ в реакции нейтрализации на культуре клеток СП.
Результаты и обсуждение
Данные по изучению напряженности иммунитета у КРС, привитого сорбированной вакциной из культурального вируса ящура (КВЯ) штамм
31
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Азия-1/Шамир3/89 с содержанием 6 мкг 146S+75S компонентов в прививной дозе, представлены в табл. 1. Из данных табл. 1 видно, что после контрольного заражения наличие вторичных афт наблюдали у одного из 5 вакцинированных животных. Титры ВНА на 10-е СПВ против вируса ящура
штаммов Азия-1/Шамир3/89 и Азия-1 № 1987/Амурский/2005 были одинаковы и составляли 5,55±0,38 и 5,25±0,32 лог2, соответственно. На 21-е
СПВ против вакцинного штамма КВЯ титры остались прежними, тогда как
против вируса гетерологичного штамма Азия-1 № 1987/Амурский/2005
снизились на 1,3 лог2. Причиной снижения количества ВНА против вируса гетерологичного штамма уже на 21-е СПВ может быть недостаточное
содержание иммунизирующих компонентов в вакцине. Наиболее низкие
титры получили против вируса Азия-1 № 48, что указывает на различие
этих штаммов.
Таблица 1
Иммуногенность сорбированной вакцины из КВЯ Азия-1 на КРС
№
ж-ных
1
Характеристика
вакцины
M±m
Азия-1
/Шамир
3/89 –
6 мкг
146S+75S
ГОА –
20 мг
сапонин –
1,5 мг
6
Контроль
2
3
4
5
Титр ВНА у КРС против КВЯ, лог2
Наличие генерализации после
Азия-1 №1987/Амур- Азия-1
контрольного Азия-1/Шамир 3/89
ский/2005
№ 48
аражения ВЯ
Азия-1 №1987 / 10 СПВ 21 СПВ 10 СПВ 21 СПВ 21 СПВ
Амурский/2005
-
5,75
6,25
5,75
3,50
1,00
+
4,50
5,25
4,00
3,75
2,50
-
5,75
6,50
5,50
5,00
1,75
-
5,00
5,75
5,25
3,50
1,50
-
6,75
7,25
5,75
4,00
2,00
+
5,55±0,38 6,20±0,34 5,25±0,32 3,95±0,28 1,65±0,19
р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001
-
-
-
-
-
Следующий опыт по испытанию активности сорбированной вакцины из вируса ящура штамма Азия-1/Шамир3/89 против вируса штамма
Азия-1 № 1987/Амурский/2005 проводили, прививая КРС универсальной
сорбированной вакциной, содержащей в дозе 30 мкг иммуногенных компонентов. Вакцину испытывали после 12 месяцев хранения. Гуморальный
иммунитет исследовали на 10-е и 21-е СПВ против вируса ящура штаммов
Азия-1/Шамир3/89, Азия-1 № 1987/Амурский/2005, Азия-1 Иран58/99,
Азия-1 № 48. Результаты суммированы в табл. 2.
32
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 2
Иммуногенность универсальной моновалентной сорбированной
вакцины из КВЯ Азия-1/Шамир3/89
№
ж-ных
Титры ВНА у КРС против КВЯ, лог2
Наличие генерализации после
Азия-1 №1987/
Азия-1
Азия-1
контрольного
Азия-1/Шамир 3/89
Амурский/2005 Иран58/99 №48
заражения ВЯ
Азия-1 №1987 /
Амурский/2005
10 СПВ 21 СПВ 10 СПВ 21 СПВ 21 СПВ 21 СПВ
1
–
5,00
5,75
6,75
6,25
6,25
3,75
2
+
4,75
5,75
5,75
5,25
3,75
2,75
3
–
6,00
6,25
6,00
6,00
5,75
2,25
4
+
4,75
6,00
5,75
5,50
–
2,25
5
–
5,75
7,00
7,00
7,00
–
2,50
6
–
7,75
8,00
7,00
6,25
–
4,50
M±m
–
Контроль
+
5,67±0,47 6,46±0,36 6,38±0,25 6,04±0,25 5,25±0,76 3,33±0,39
р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,025 р<0,001
–
–
–
–
–
–
Результаты, представленные в табл. 2, отражают уровень гуморального иммунитета у КРС против вируса ящура гомологичного и гетерологичных штаммов. Увеличение количества антигена в прививной дозе в 5 раз
обеспечивало и повышение титров ВНА против гетерологичных штаммов
вируса ящура, таких, как Азия-1 № 1987/Амурский/2005, Азия-1 № 48,
Азия-1 Иран58/99, которые составили 6,04±0,25; 3,33±0,39; 5,25±0,76 лог2,
соответственно.
Контрольное заражение вирусом ящура Азия-1 № 1987/Амурский/2005
выдержали 4 животных из 6 вакцинированных.
Изучение иммуногенной активности сорбированной биштаммовой вакцины провели на морских свинках. Вакцина содержала в прививной дозе по 6 мкг 146S+75S компонентов вируса ящура штаммов
Азия-1/Шамир3/89 и Азия-1 №1987/Амурский/2005 и адъюванты:
ГОА – 24 мг, сапонин – 1,5 мг.
33
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 3
Иммуногенность биштаммовых противоящурных эмульсионных
вакцин типа Азия-1 на свиньях
Вакци- №
на
ж-ных
1
I
M±m
II
M±m
Количество ВНА на 19 СПВ против КВЯ, лог2
Азия-1/
Шамир3/89
Азия-1 №1987/
Амурский/2005
Азия-1
Иран58/99
4,25
4,75
4,75
2
3,5
6,0
4,75
3
3,75
5,0
4,75
4
4,0
4,5
4,75
Азия-1 №48
н/и
5
5,5
6,0
5,75
6
4,25
5,0
4,25
–
4,21±0,28
р<0,001
5,21±0,26
р<0,001
4,83±0,2
р<0,001
–
7
5,25
4,25
5,5
4,25
8
7,25
5,25
6,5
5,25
9
4,75
4,0
6,0
4,25
10
6,25
6,25
6,5
5,75
11
3,75
3,5
5,5
2,50
–
5,45±0,60
р<0,001
4,65±0,49
р<0,001
6,00±0,22
р<0,001
4,40±0,56
р<0,005
н/и – не исследовались
Результаты иммуногенной активности биштаммовой вакцины для
морских свинок представлены в табл. 4.
Таблица 4
Иммуногенность биштаммовой вакцины типа Азия-1
Разведение вакцины
Количество защищенных
животных
1:3
8/8
1:9
7/8
1:27
6/8
1:81
2/8
ИмД50 МС,
см3
0,05
Морских свинок заражали на 15-е СПВ гетерологичным штаммом
вируса ящура Азия-1 № 48.
34
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Биштаммовая вакцина типа Азия-1 имела высокую активность даже
против антигенно отличающегося штамма Азия-1 № 48 вируса ящура.
Прививная доза вакцины содержала 40 ИмД50 для морских свинок.
Проведенные исследования свидетельствуют о значительном антигенном отличии штамма Азия-1 № 48 вируса ящура от вакцинных штаммов
Азия-1 № 1987/Амурский/2005, Азия-1 Иран58/99, Азия-1/Шамир3/89.
Выводы
1. Универсальная вакцина из КВЯ Азия-1/Шамир3/89 способна защитить КРС от заражения вирусом гетерологичного штамма Азия-1 № 1987/Амурский/2005.
2. Биштаммовые вакцины обладают более высокой эффективностью
против гетерологичных штаммов по сравнению с вакцинами, изготовленными на основе одного штамма вируса ящура.
Список литературы
1. Бондаренко, А.Ф. Методика определения содержания вирусспецифического
белка и компонентного состава вируса ящура с помощью количественной РСК:
утв. директором ВНИЯИ / А.Ф. Бондаренко. – Владимир, 1987.
2. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного
рогатого скота, иммунизированного трёхвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лёзова, Н.Н. Ходакова [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2007. – Т. 5. – С. 75-82.
3. Эпизоотическая ситуация по ящуру типа Азия-1 в России в 2005 году и анализ
эффективности мер борьбы. / К.Н. Груздев, Т.З. Байбиков, В.Н. Герасимов [и др.] // Тр.
Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С. 3-19.
4. Annual OIE/FAO FMD Reference Laboratory Network Report / J.-F. Valarcher,
N. Ferris, N.J. Knowless [et. al.]. – Pirbright, 2005.
STUDY OF IMMUNOGENIC ACTIVITY OF ASIA-1 FMD
VACCINES
V.A. Starikov, V.V. Mikhalishin, T.N. Lyozova, A.V. Borisov,
D.V. Mikhalishin
Summary
Results of the study of immunogenic activity of mono- and bistrain Asia-1
FMD vaccines in guinea pigs, cattle and pigs are shown in this paper. The
resistance of vaccinated animals to challenge against heterologous FMD virus
strain is demonstrated.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
35
УДК 619:616.98:578.835.2:615.371-027.22
ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОИЗВОДСТВУ И КАЧЕСТВУ
ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН
А.И. Дудников, В.В. Михалишин
Резюме
В статье дан анализ требований к производству безопасных и эффективных инактивированных противоящурных вакцин.
Требования безопасности относятся к полноте инактивации вируса и
отсутствию остаточной вирулентности вакцины и ее контаминации.
Специфическая активность препаратов зависит от количества антигена и наличия адъювантов, составляющих основу вакцины, и включает
такие показатели, как антигенность, иммуногенность и протективность.
Для обеспечения гарантии качества необходимо выполнение национальных и международных стандартов, которыми следует руководствоваться при изготовлении препаратов.
Традиционные вакцины, содержащие в прививной дозе не менее
3 ПД50, рекомендуются для профилактической иммунизации. В программах борьбы и искоренения ящура целесообразно использование более высококачественных препаратов.
Введение
В комплексе мер профилактики и борьбы с ящуром, наряду с осуществлением ветеринарно-санитарных мероприятий и использованием
метода уничтожения (убоя) зараженных стад, основное место отводится
применению вакцин. Надлежащее производство безопасных и эффективных вакцин необходимо для охраны здоровья животных и успешного выполнения программы ликвидации ящура. Иммунизация животных
вакцинами высокого качества имеет первостепенное значение для использования в программах борьбы и искоренения заболевания. При этом
успешное применение вакцин требует, чтобы они были произведены с использованием необходимых стандартов, которые гарантируют получение
соответствующего препарата высокого качества.
На основании многолетнего изготовления вакцин и международного
опыта показаны требования и процедуры, которыми следует руководствоваться при изготовлении и контроле безопасных и эффективных препаратов.
В учреждении создана система обеспечения качества продукции, которая
гарантирует эффективность в течение всего производственного процесса.
36
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Результаты и обсуждение
Типы и формы вакцин. В практике отечественной и мировой биопромышленности противоящурная вакцина производится из инактивированного вируса, выращенного в суспензии клеток ВНК-21 с использованием
реакторов емкостью до двух тонн. В связи с плюрализмом вируса ящура
– наличием 7 типов (А, О, С, Азия-1, Сат-1, Сат-2 и Сат-3), вакцины производятся моновалентными и поливалентными.
В зависимости от используемых адъювантов вакцины подразделяются на сорбированные и эмульсионные. В сорбированных препаратах в качестве адъюванта используется гель гидроокиси алюминия, а в
эмульсионных – масляный адъювант, состоящий из минерального масла и
эмульгатора. Последние готовятся в виде эмульсий типа «вода-масло» или
множественной – «вода-масло-вода». Кроме того, иммуногенность вакцин
повышается при добавлении растительного адъюванта – сапонина.
Обеспечение качества. В ФГУ «ВНИИЗЖ» при разработке и изготовлении иммунобиологических препаратов и осуществлении научной и ветеринарной деятельности создана система менеджмента и обеспечения качества.
Система менеджмента и обеспечения качества сертифицирована на
соответствие требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9001-2001 (1).
Производство вакцин основано также на соблюдении международных правил GMP – надлежащей производственной практике (2) и четкой
системе государственного контроля как производства, так и препарата.
Кроме того, испытательные лаборатории при контроле соответствия
выполняют требования стандарта ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 (3).
Контроль готового препарата является одним из этапов системы обеспечения качества. Основной упор делается на создание надлежащих условий
производства, гарантирующих выпуск качественной продукции. Надлежащее производство требует выполнения процедур по обеспечению качества,
чтобы вызвать однообразие и постоянство технологического процесса. Поскольку производство допускает возможные вариации, необходимо тщательно контролировать этот процесс и защищать продукт от контаминации на всех
стадиях. В правилах GMP отражены требования к персоналу производства
вакцины, помещениям и оборудованию, процессу производства, контролю
качества сырья, материалов, продукции, а также требования к документации,
упаковке и маркировке, условиям транспортировки и хранения готового препарата. Одновременно для качественного обеспечения производства вакцин
должны быть изучены и охарактеризованы свойства вакцинного штамма,
клеточного субстрата, полуфабриката и готового препарата.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
37
Документация. Общие требования к производству и качеству вакцин изложены в международных и национальных документах. Международные требования представлены в руководстве МЭБ по наземным
животным, Европейской фармакопее и Директивах Европейского союза (8, 9, 10).
При разработке национальных требований к вакцине использованы
рекомендации МЭБ. Кроме того, нормативная документация представлена на основе законов «О ветеринарии», «О лекарственных средствах»
и «О технологическом регулировании», а также с использованием действующих стандартов на ветеринарные препараты: ГОСТ 4.492-89
«Система показателей качества продукции. Препараты биологические
ветеринарные. Номенклатура показателей» (4) и ГОСТ Р 52249-2004
«Правила производства и контроля качества лекарственных средств».
Основная нормативная документация включает:
− технологический регламент;
− стандарт организации;
− инструкцию по применению вакцины.
Для производства вакцины необходима также разрешительная документация:
− лицензия на производство и реализацию вакцины;
− сертификат производства препарата.
На предприятии существует система документирования, разработанная в виде стандарта организации. На всех этапах технологического процесса составлены стандартные операционные процедуры (СОПы).
На каждую серию вакцины составляется производственный протокол или специальный документ (досье), а также правила хранения и
транспортирования препаратов на всех этапах движения от предприятияизготовителя до потребителя, с учетом соблюдения «холодовой цепи».
Производственный вакцинный вирус. Исходный вакцинный вирус
после проведения всех исследований на типовую и вариантную принадлежность, определения антигенных и иммуногенных свойств служит источником посевного материала. Рабочий посевной материал готовится
посредством субкультивирования, но не более чем в 10 пассажах. Критерием, ограничивающим число пассажей, является его генетическая
стабильность. Вирус следует контролировать на контаминацию. Чистоту
определяют путем тестирования на отсутствие посторонних бактерий, вирусов, грибов и микоплазм.
Вакцинный вирус хранится в замороженном или сухом состоянии
при температуре -40°С или -70°С.
38
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Клеточные культуры. Для производства вакцин наиболее удобными
являются перевиваемые клетки. Они неприхотливы к питательной среде,
из них можно создать банк клеток и получить биомассу в большом объеме.
Клетки характеризуются по следующим показателям: история линии клеток, кариологическая характеристика, свобода от посторонних бактерий,
вирусов, грибов и микоплазм.
Особое внимание при культивировании клеток и вируса уделяется
биологическим добавкам (трипсин, сыворотка). Они используются только
из тех территорий, которые свободны от прионных заболеваний. При испытании клеток и вируса на чистоту обращают внимание на отсутствие
пестивирусов в сыворотке и других ингредиентах, происходящих от крупного рогатого скота.
Требования к производственным помещениям, оборудованию и персоналу. Помещения сооружены таким образом, чтобы обеспечить чистоту
продукта на протяжении всего процесса производства, защиту здоровья
сотрудников и предотвратить контаминацию. Помещения обеспечивают
выполнение необходимых функций, таких, как: хранение вируса, клеток
и других материалов; приготовление питательных сред; культивирование
клеток и вируса; изготовление вакцин. Для помещений, требующих условий асептики, установлены классы чистоты, начиная с 1-го класса и заканчивая 4-м классом.
Помещения имеют гладкие поверхности, удобные для уборки и дезинфекции, должную вентиляцию. В помещениях созданы условия для
соблюдения санитарно-гигиенического режима, техники безопасности и
пожарной безопасности.
Оборудование размещается таким образом, чтобы обеспечить непрерывность процесса, гарантировать асептичность и безопасность.
Руководители всех уровней и сотрудники персонально несут ответственность за изготовление, производство и контроль препаратов и имеют
полномочия, необходимые для выполнения своих обязанностей, оговоренных в должностных инструкциях.
Требования к производству вакцин. Современное производство вакцин зависит от уровня используемой технологии, разработка которой
включает: изучение антигенной и генетической структуры вируса, применение новых способов очистки, концентрирования и инактивации, поиски путей повышения иммуногенности вакцин, конструирование новых
препаратов.
Основными этапами в разработке технологии получения вакцин являются:
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
39
1. Изучение и характеристика исходного штамма.
2. Культивирование клеток и вируса.
3. Инактивация вируса, очистка и концентрирование антигена.
4. Составление вакцин (сорбированных и эмульсионных, моновалентных и поливалентных).
5. Розлив, фасовка, маркировка продукции.
6. Упаковка и хранение вакцины.
Показатели качества вакцин. Общие требования касаются безопасности и специфической активности вакцин.
Основными требованиями к специфической безопасности вакцин являются полнота инактивации вируса и отсутствие остаточной вирулентности. Полнота инактивации вируса ящура достигнута только при использовании препаратов этиленимина, а формолвакцины обладали остаточной
вирулентностью как при контроле на КРС при интрадермолингвальном
методе введения вакцины, так и при контроле антигена на культуре клеток
или новорожденных мышатах.
Вакцина должна быть безвредной, т.е. в тест-дозе не должна вызывать изменения клинического состояния здоровья животных. В связи с
наличием в вакцине консервантов и адъювантов не должна вызывать видимых изменений тканей в месте введения животным, а также общего отрицательного воздействия на организм (реактогенность).
Препараты клеток, вируса и готовая вакцина должны быть стерильными. Полное отсутствие живой микрофлоры проводят по ГОСТ 28085-89
«Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности» (5).
Специфическая активность вакцины в первую очередь зависит от количества антигена в единице объема (мкг/мл 146 S-компонента). Активность вакцины определяется при помощи статистически достоверного исследования на иммунизированных животных с последующим заражением
разрешающей дозой (104ИД50) гомологичного вируса.
При активной иммунизации определяется: антигенность, иммуногенность, протективность препарата. Антигенность вакцины характеризуется титром антител, определяемым в реакции серонейтрализации (РН) или
в иммуноферментном анализе (ИФА). Защитный титр антител крови в РН
составляет 1,5 lg, а в ИФА – 2,0 lg.
Иммуногенность вакцины определяется при ее титрации и характеризуется минимальной дозой, обеспечивающей защиту 50% привитых
животных (ИмД50/мл).
40
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Протективность вакцины характеризуется количеством ИмД50/мл в
прививном объеме, обеспечивающем развитие полноценного иммунитета.
В соответствии с международными требованиями протективность вакцины должна составлять не менее 3 защитных доз (<3,0 ПД50). Для быстрой
защиты рекомендуются препараты, содержащие не менее 6,0 ПД50. Вместе
с тем проведенными исследованиями установлено, что напряженность и
длительность иммунитета у животных, привитых вакцинами, содержащими <3,0 или 6,0 ПД50, не имеет существенного различия, а для быстрой защиты и создания напряженного иммунитета необходимы вакцины с более
высокой протективной активностью (6, 7).
Иммунологические требования к вакцине включают также специфичность, т.е. антигенную идентичность используемого типового штамма
вируса. Иммунитет, создаваемый вакциной, подразделяется на:
– полноценный, биологический, когда при контрольном заражении
вакцинированных животных вирус не взаимодействует с чувствительными клетками и не размножается;
– клинический, характеризуется снижением специфической защиты и
образованием первичных афт при контрольном заражении вакцинированных животных, при отсутствии генерализации;
– полное отсутствие иммунитета характеризуется образованием афт
после интрадермолингвального (внутрикожного) заражения и генерализацей процесса.
При изготовлении поливалентных вакцин установлено, что нет интерференции между отдельными компонентами, т.е. антиген одного типа не
вызывает снижения защитного иммунного ответа на другой компонент.
Тесты на иммуногенность можно проводить на восприимчивых животных (КРС, свиньи, овцы), на лабораторных животных (морские свинки,
взрослые белые мыши) или при помощи количественных методов in vitro.
Стабильность вакцины при хранении оценивают в тесте на иммуногенность и по физической стабильности сорбированных и эмульсионных
препаратов. В качестве консервантов в вакцине используется мертиолят,
2-феноксиэтанол. Допускается использование антибиотиков (неомицин,
канамицин и др. со слабыми аллергенными свойствами).
Концентрация водородных ионов вакцины (рН) должна соответствовать 6,5-7,5.
Использование вакцины в полевых условиях. В нашей стране до 50-х
годов прошлого столетия ящур регистрировался ежегодно.
Изготовление и исследование вакцин в широких производственных опытах проведено в 50-е годы в основном сотрудниками ВИЭВ
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
41
(Ратнер Л.С., Грибанов В.Н., Салажов Е.Л.) и ВГНКИ (Лихачев Н.В.,
Воинов С.И.), Главного управления ветеринарии и биопромышленности
(Бойко А.А., Рахманин П.П., Звягин И.В.), Курской и Кашинцевской биофабрик (Шевырев Н.С., Перминов Т.А., Хорьков И.А.). В полевых условиях установлена выраженная эффективность инактивированных вакцин.
Вместе с тем отмечены многие неконтролируемые факторы, которые затрудняют изготовление безопасных и эффективных вакцин.
Поэтому во ВНИЯИ проведены дальнейшие исследования по усовершенствованию вакцинных препаратов, отвечающих международным требованиям. Однако традиционные противоящурные вакцины, содержащие
в прививной дозе < 3,0 ПД, обеспечивают напряженный иммунитет только
на 3-4-й мес. у молодняка и на 6-й мес. у взрослых животных. Кроме того,
для иммунизации свиней рекомендуются только эмульсионные вакцины.
В 60-е годы ХХ века развернута программа ликвидации ящура на
основе систематической и массовой иммунизации. Уже в 70-е годы на
80-90% отмечено снижение количества неблагополучных пунктов, заболевших и павших животных. В 90-е годы ящур в стране ликвидирован,
и страна считается благополучной, проводящей вакцинацию, но с двумя
зонами:
– зона, благополучная по ящуру, в которой не проводится вакцинация;
– зона, благополучная по ящуру, в которой проводится вакцинация
(зона вдоль южных границ).
Общей целью поддержания буферной зоны является вакцинация не
менее 80% восприимчивой популяции. При этом полевая эффективность
вакцины полностью зависит от активности применяемой вакцины и охвата прививками восприимчивых животных.
Заключение
Производство безопасных и эффективных противоящурных инактивированных вакцин имеет первостепенное значение для профилактики
ящура, а также использования в программах борьбы и искоренения заболевания. Современное производство высокоактивных вакцин основано на
использовании национальных и международных стандартов и во многом
зависит от уровня используемой технологии. Среди факторов, влияющих
на уровень технологии, наиболее важными являются: изучение антигенной структуры вируса, способ получения биомассы, новые методы инактивации и очистки вируса, концентрирование антигена, поиск адъювантов
и конструирование новых вакцин.
42
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Оптимальная система гарантии качества включает производственный
процесс, а также тестирование сырья и материалов, полупродуктов и готового препарата. Традиционные вакцины с протективностью < 3,0 ПД50
рекомендуются для профилактики ящура, а для борьбы и искоренения заболевания необходимы более высокоактивные препараты.
Список литературы
1. ГОСТ Р ИСО 9001-2001. Система менеджмента качества. Требования. – М.:
Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2001. – 21 с.
2. ГОСТ Р 52249-2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. – М.: Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2004. – 211 с.
3. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. – М.: Стандартинформ, 2007. – 25 с.
4. ГОСТ 4.492-89. Система показателей качества продукции. Препараты биологические ветеринарные. Номенклатура показателей. – М.: Изд-во стандартов,
1990. – 16 с.
5. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического
контроля стерильности. – М.: Изд-во стандартов, 1989. – 10 с.
6. Михалишин, В.В. Адъюванты и их использование / В.В. Михалишин,
Н.С. Мамков // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных: матер. Междунар. науч. конф. «Инфекц. патология ж-ных», посвящ. 50-летию
ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2008. – Т. 6. – С. 340-371.
7. Усовершенствование существующих и разработка новых биологических
препаратов для профилактики и ликвидации ящура / А.И. Дудников, В.В. Михалишин, В.В. Борисов, С.К. Старов // Рос. вет. журнал. – 2008. – № 9. – С. 30-33.
8. EU Directives 92/18/EEC. Standards and protocols in respect of the testing of
veterinary medicinal products. – Ireland, 1992.
9. Council of Europe. European Pharmacopoeia. – 4th ed. – Strasbourg, 2002.
10. OIE. Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals,
Birds and Bees). – 6th ed. – Vol. 1-2. – Paris, 2008.
General Requirements for Quality and
Production of FMD Vaccines
A.I. Dudnikov, V.V. Mikhalishin
Summary
Requirements for production of safe and effective inactivated FMD
vaccines are analyzed in the paper.
Safety requirements include the completeness of the virus inactivation and
absence of residual virulence and contamination of the vaccine.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
43
The specific activity of preparations depends on antigen amount and
presence of adjuvants forming the basis of a vaccine and includes such criteria
as antigenicity, immunogenicity and protectiveness.
National and international standards that are used for production of
preparations shall be complied with in order to ensure quality.
Conventional vaccines containing at least 3 PD50 in an inoculation dose are
recommended for prophylactic vaccination. It is reasonable to use preparations
of higher quality for FMD eradication and control.
УДК 619:578.824.11:616-097
ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА
ЖИВОТНЫХ
А.В. Молодкин, Н.А. Назаров, Н.М. Михайлина,
А.О. Шепеляковская1, Ф.А. Бровко1, Х.М. Бозиев1,
Е.И. Сидина1, С.С. Рыбаков, А.Е. Метлин
Резюме
Получена панель из 22 клонов моноклональных антител к вирусу
бешенства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ». В ИФА установлена их высокая активность и специфичность к вирусному рибонуклеопротеину. Из
этих антител отобрано 4 клона с наибольшей активностью и специфичностью, выявляющих комплексы рибонуклеопротеина в реакции непрямой иммунофлуоресценции, для последующих испытаний их в качестве
диагностических антител.
Введение
Бешенство – остро протекающая вирусная болезнь теплокровных животных и человека, характеризующаяся признаками поражения центральной нервной системы и, как правило, смертельным исходом. Заражение
происходит при укусе или ослюнении поврежденных поверхностей кожи
или слизистых оболочек, возможен и аэрогенный путь передачи при высокой концентрации вируса бешенства в замкнутом пространстве (пещера
Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
г. Пущино, Московская область
1
44
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
и др.). Рыжие лисицы являются главным распространителем бешенства
и наиболее восприимчивым видом в европейских странах. Наибольшее
число случаев бешенства у людей возникает вследствие покуса собаками.
По данным ВОЗ, ежегодно в мире от бешенства умирают более 55000 человек, преимущественно в развивающихся странах Азии и Африки.
Бешенство широко распространено в мире (практически на всех
континентах земного шара, кроме Австралии и Антарктиды) и является
объектом постоянного повышенного внимания международных организаций медицинского и ветеринарного профиля (WHO/ВОЗ, FAO/ФАО,
OIE/МЭБ). Для обмена международным опытом ежегодно организуются конференции по бешенству в Евразии и на Американском континенте,
кроме того, 28 сентября объявлен всемирным днём борьбы с бешенством.
Рис. Динамика изменения числа случаев бешенства животных
в России за 9 лет
Несмотря на предпринимаемые усилия по вакцинации основных
хозяев вируса – домашних и диких плотоядных животных, для многих
стран бешенство остается серьезной проблемой, в том числе и для России
(рис. 1). Как видно из рисунка, на протяжении последних лет прослеживается заметная тенденция роста числа случаев бешенства на территории
Российской Федерации.
В России ежегодно регистрируются случаи заболевания бешенством
(гидрофобии) человека. По данным Роспотребнадзора РФ, в 2004 году
было выявлено 19 случаев гидрофобии, в 2005 – 14, в 2006 – 4. По данным
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
45
Европейского бюллетеня по бешенству (8), в 2007 и 2008 годах в Европейской части России было отмечено 12 случаев гидрофобии.
Заболевание входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, который
складывается из затрат на проведение профилактической вакцинации диких
и домашних животных, карантинных мероприятий в очагах инфекции, постэкспозиционного лечения людей, покусанных животными. В связи с этим, а
также с тем, что бешенство является болезнью с летальным исходом и имеет
важное социальное значение, необходима точная и своевременная диагностика заболевания, особенно в случае опасности передачи бешенства человеку.
Основными методами диагностики бешенства являются реакция
иммунофлуоресценции (РИФ) и биопроба на мышах. Сущность РИФ заключается в выявлении в отпечатках ткани головного мозга животных,
подозреваемых в заболевании бешенством, комплексов антигена вируса
бешенства с диагностическим антирабическим флуоресцирующим глобулином в полях зрения флуоресцентного микроскопа. Несмотря на высокую чувствительность РИФ, которая составляет более 99%, метод требует высококвалифицированной подготовки лабораторного персонала,
занимающегося диагностикой бешенства, и достаточно постоянной диагностической практики. Отчасти это связано с тем, что в основном для
диагностики бешенства используются поликлональные антирабические
антитела, которые имеют существенные недостатки, вытекающие из их
поликлональной природы, а именно: невозможность получения стандартизированных препаратов, необходимость использования для иммунизации животных и высокоочищенных антигенов.
В настоящее время в мире для диагностики инфекционных заболеваний, в т. ч. и бешенства, все большее применение находят моноклональные антитела (FITC Anti-rabies monoclonal globulin, FUJIREBIO
Diagnostics, Inc). Созданные на их основе диагностические тест-системы
обладают, как правило, большей чувствительностью и специфичностью по
сравнению с поликлональными аналогами. Кроме того, эти тест-системы
легко стандартизировать. В России для диагностики бешенства используют отечественные диагностические поликлональные антитела. Поэтому
разработка диагностикумов на основе моноклональных антител является
перспективным направлением. Помимо диагностических исследований,
моноклональные антитела необходимы при изучении антигенного разнообразия вируса бешенства и его эволюционного развития на территории
России и пограничных государств, а также для дифференциации полевых
изолятов вируса бешенства от его вакцинных штаммов (1, 3, 5, 7).
46
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
В данной статье изложены результаты работы по оценке моноклональных антител для диагностики бешенства животных.
Материалы и методы
Моноклональные антитела были получены сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН (г. Пущино, Московская обл.).
Для получения и изучения характеристик моноклональных антител
использовали антигены, полученные в ФГУ «Федеральный центр охраны
здоровья животных»:
– BALB/c мышей иммунизировали очищенным и концентрированным культуральным вирусом бешенства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ»
по ранее описанной методике (4);
– рибонуклеопротеин вируса бешенства (РНП ВБ) получали путем разрушения инфицированных вирусом штамма «ВНИИЗЖ» клеток
ВНК-21, с последующим ультрацентрифугированием осветленного клеточного гомогената в градиенте плотности хлористого цезия (2).
Гликопротеин ВБ (G-белок) получали путем обработки очищенного
вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ» тритоном Х 100 в конечной концентрации 2% в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем разрушенный препарат вируса подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия 1,16 – 1,36 г/см3 в течение 2 часов
при 70 000 g. С градиента отбирали верхний слой с содержащимся в нем
G-белком в объеме наносимой пробы и диализовали против фосфатносолевого буфера. Полученный препарат обрабатывали очищенными поликлональными антителами против РНП ВБ для связывания оставшегося
РНП. Образованный комплекс антитело-РНП удаляли с помощью белокАсефарозы. Рабочее разведение очищенного G-белка устанавливали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Концентрацию белка в очищенных препаратах определяли по
Lowry O.H. (6).
В непрямой реакции иммунофлуоресценции использовали флуоресцирующие антитела против иммуноглобулинов мыши производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в рабочем разведении, рекомендованном
производителем.
Результаты и обсуждение
Сотрудниками ФИБХ было получено 26 препаратов моноклональных
антител, реагирующих в ИФА с вирусом бешенства штамма «ВНИИЗЖ» с
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
47
активностью 1:62500 – 1:1562500 и выше. Используя в качестве антигенов
очищенный рибонуклеопротеин, гликопротеин вируса бешенства (ВБ) и
белки культуры клеток почки сирийского хомячка ВНК-21, в ИФА было
установлено, что 22 препарата (9 препаратов очищенных антител и 13 асцитов) моноклональных антител оказались специфичны только к РНП ВБ,
а 4 перекрестно реагировали со всеми антигенами.
Как известно, при диагностике бешенства в РИФ в препаратах ткани мозга выявляются специфические для инфекции тельца Бабеши-Негри
– скопления в цитоплазме пораженных клеток нуклеопротеина вируса
бешенства. Поэтому диагностическое значение имеют моноклональные
антитела, специфичные к N-белку, основному компоненту рибонуклеопротеинового комплекса.
Отобранные по результатам ИФА 22 варианта моноклональных антител, специфичных к РНП ВБ, исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ) с использованием препаратов лиофилизированной ткани головного мозга кроликов, инфицированных вирусом бешенства
эталонного лабораторного штамма CVS (положительный препарат) и неинфицированных кроликов (отрицательный препарат). Целью исследования было изучить способность антител выявлять внутриклеточные включения вируса бешенства и отобрать наиболее активные и специфичные.
Для оценки специфической активности антител в НРИФ их исследовали
в разведениях 1:32, 1:128, 1:256 и 1:512. При этом концентрацию очищенных антител предварительно приводили к одному значению – 0,6 мг/мл
(по препарату антител с наименьшим содержанием белка). По 4-крестовой системе оценивали в положительных препаратах количество и морфологию включений, интенсивность флуоресценции, а в отрицательных
препаратах – наличие неспецифического свечения. Как показали результаты исследования, в положительных препаратах со значительной частью
образцов моноклональных антител из асцитов в разведении 1:32 выявляли множественные включения разнообразной формы (звезды, запятые,
неопределенной формы) и величины с ярко-зеленой флуоресценцией на 4
креста, затрудняющей обнаружение включений ВБ характерной округлоовальной формы. Аналогичную картину наблюдали для этих антител в
разведении 1:32 и с отрицательными препаратами. В том же разведении
с образцами очищенных антител в положительных препаратах наблюдали включения типичной для бешенства формы и с такой же интенсивной
флуоресценцией, при отсутствии специфичного свечения в отрицательных препаратах. Поэтому для дальнейших исследований использовали
препараты очищенных моноклональных антител.
48
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Поскольку моноклональные антитела по природе моновалентны, то для
диагностики необходимо использовать комбинацию антител, по крайней мере
из трех вариантов к разным, преимущественно консервативным, антигенным
детерминантам, на тот случай, если некоторые из них будут повреждены. Для
составления подобных комбинаций по результатам проведенной НРИФ было
отобрано четыре варианта наиболее активных антител (№ 1, 16, 18, 20) с интенсивностью специфичной флуоресценции (ярко-зеленой или желтоватозеленой) в положительных препаратах на 4 или 3 креста в разведении 1:256 и
отсутствием флуоресценции в отрицательных препаратах.
Перед комбинированием все антитела привели к одной концентрации
– 0,6 мг/мл. В НРИФ исследовали комбинацию из 4-х (№ 1) антител и все
возможные комбинации из 3-х антител. Антитела смешивали в соотношении 1:1 (v/v). Приготовленные смеси исследовали в разведениях 1:32,
1:64, 1:128, 1:256, 1:512. Учет реакции проводили по системе 4-х крестов.
Результаты исследований представлены в таблице.
Как видно из таблицы, по активности и специфичности наилучшие показатели были у препаратов разных вариантов смеси из 3-х клонов моноклональных антител. Проведенные исследования показали, что данные комбинации антител с практически равной высокой активностью и специфичностью
выявляли цитоплазматические включения бешенства. Антитела отобранных
клонов в дальнейшем будут наработаны в необходимом количестве, помечены флуоресцентной меткой, и их комбинации будут испытаны в прямой реакции иммунофлуоресценции на полевых изолятах вируса бешенства.
Таблица
Результаты исследования специфической активности смесей
очищенных моноклональных антител в непрямой реакции
иммунофлуоресценции
Разведение
антител
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
Наличие и интенсивность флуоресценции разных комбинаций
моноклональных антител
№ 1*
№ 2*
№ 3*
№ 4*
№ 5*
К+
К–
К+
К–
К+
К–
К+
К–
К+
К–
3+
3+
4+
–
4+
–
4+
–
4+
–
3+
3+
4+
–
4+
–
4+
–
4+
–
2+
–
4+
–
4+
–
4+
–
4+
–
2+
–
4+
–
4+
–
4+
–
4+
–
1+
–
3+
–
3+
–
3+
–
3+
–
* – комбинации антител: № 1 – 1, 16, 18, 20; № 2 – 1, 16, 18; № 3 – 1, 16, 20; № 4 – 1,
18, 20; № 5 – 16, 18, 20;
«К+» – положительный препарат;
«К-» – отрицательный препарат
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
49
Поскольку полученные антитела с высокой активностью и специфичностью выявляют РНП ВБ, можно с большой долей вероятности предположить, что они специфичны к N-белку – основному компоненту рибонуклеопротеинового комплекса.
Выводы
Получена панель из 22 клонов моноклональных антител с высокой
активностью и специфичностью реагирующих с рибонуклеопротеином
вируса бешенства в ИФА и непрямой реакции иммунофлуоресценции. Из
четырех наиболее активных и специфичных клонов были составлены и
испытаны в непрямой реакции иммунофлуоресценции разные комбинации смесей из четырех и трех антител. Было установлено, что наибольшей и практически одинаковой специфической активностью обладали
препараты, состоящие из смеси не более трех видов антител. На основе
отобранных клонов будут в дальнейшем приготовлены флуоресцирующие
антитела и их смеси испытаны в качестве диагностических на большом
количестве полевых изолятов вируса бешенства.
Список литературы
1. Взаимодействие моноклональных антител к структурным белкам вакцинного вируса Внуково-32 с другими вирусами группы бешенства / С.В. Грибенча,
О.В. Василенко, В.А. Кузьмицкая [и др.] // Вопр. вирусол. – 1991. – № 5. – С. 399-402.
2. Назаров, Н.А. Сравнительная характеристика антител, полученных на
разные антигены вируса бешенства / Н.А. Назаров, А.Е. Метлин, С.С. Рыбаков
// Биолого-экол. пробл. заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей: матер. Междунар. науч.-практ. конф. – Покров,
2002. – С. 168-170.
3. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные
антитела к структурным белкам вируса бешенства, штамм Внуково-32 / С.В. Грибенча, О.В. Василенко, В.А. Фуралев [и др.] // Вопр. вирусол. – 1991. – № 4. –
С. 318-321.
4. Совершенствование метода очистки и концентрирования вируса бешенства /
А.П. Пономарёв, Н.А. Назаров, С.С. Рыбаков [и др.] // Нейроинфекции: бешенство,
губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и др. прионные болезни;
листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: матер. Междунар. конф. – Покров,
2001. – С. 49-51.
5. Monoclonal antibody characterization of rabies virus isolates from Russia, Finland
and Estonia / A.E. Metlin, J. Cox, S.S. Rybacov [et al.] // J. Vet. Med. – 2004. – Vol. 51. –
P. 94-96.
6. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough,
A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chemistry. – 1951. – Vol. 193. – P. 265-275.
50
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
7. Smith, J.S. Monoclonal antibodies for the identification of rabies and non-rabies
lyssaviruses / J.S. Smith, A.A. King // Laboratory Techniques in Rabies. – 4th ed. –
Geneva, 1996. – P. 145-156.
8. http://www.who-rabies-bulletin.org/Queries/Dynamic.aspx
Future Use of Monoclonal Antibodies in
Diagnosis of Rabies in Animals
A.V. Molodkin, N.A. Nazarov, N.M. Mikhaylina,
A.O. Shepelyakovskaya1, F.A. Brovko1, Kh.M. Boziev1,
Ye.I. Sidina1, S.S. Rybakov, A.Ye. Metlin
Summary
A panel of 22 clones of monoclonal antibodies against rabies virus
vaccine strain «ARRIAH» was obtained. Their high activity and specificity to
viral ribonucleoprotein was determined by ELISA. Among these antibodies
we chose 4 clones with the highest activity and specificity,that are used for
detecting ribonucleoprotein complexes by an indirect immonofluorescence test,
for their further testing as diagnostic antibodies.
УДК 619:616.98:578.834.1:636.22/.28:615.371
АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ
КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРС
С РАЗНЫМИ АДЪЮВАНТАМИ
А.В. Кононов, В.А. Мищенко, В.В. Думова,
С.В. Левченко, С.В. Хлебопашникова
Резюме
Создание напряженного и продолжительного иммунитета зависит от
правильности выбора и использования неспецифических стимуляторов
иммуногенеза – адъювантов. В опытах на лабораторных животных нами
показано, что использование сапонина в составе антигена масляных вакцин значительно повышает антигенную активность препарата.
Branch of M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAMS,
Puschino, Moskovskaya Oblast
1
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
51
Введение
Защита животных от инфекционных заболеваний является одной из
важнейших проблем ветеринарной науки и практики. С переводом животноводства на промышленную основу и повышением интенсификации
производства эта проблема стала более актуальной, а пути ее решения
значительно усложнились. Известно, что часто эффективность одной и
той же вакцины в лабораторных и полевых условиях существенно различается, что связано в первую очередь с наличием иммунодефицитных
состояний организма животных (3, 5).
Создание напряженного и продолжительного иммунитета при иммунизации КРС против вирусных болезней определяется состоянием организма
животного, количеством и качеством антигена в препарате, способом вакцинации (доза, место введения и др.), а также зависит от правильности выбора
и использования неспецифических стимуляторов иммуногенеза – адъювантов (1, 2). При повышенных дозах адъюванта может возникнуть иммуносупрессивное действие. При однократном введении антигена одновременно с
адъювантами иммунный ответ по антителообразующим клеткам увеличивается в несколько раз, а по титру антител – даже на порядок (2).
Роль адъювантов сводится к удержанию антигена на месте введения,
благодаря чему последующее его освобождение приводит к вторичному
иммунному ответу после первичной стимуляции. Существуют два основных способа действия адъювантов, один из них направлен на изменение
свойств антигена, другой – на стимуляцию организма (1, 2, 6).
Действие адъювантов зависит от исходного иммунного статуса, предшествующего вакцинации. Адъюванты меняют динамику развития иммунитета, они ускоряют развитие и повышают уровень иммунитета, увеличивают длительность сохранения иммунитета (1, 7, 8).
Адъюванты, в зависимости от их свойств, стимулируют гуморальный
и клеточный иммунитет.
В настоящее время существует несколько типов адъювантов (1, 2, 8):
1. Минерально-солевые адъюванты. Среди веществ неорганической
природы широко изучены адъювантные свойства таких, как гель гидроокиси алюминия (ГОА), фосфат алюминия, фосфат кальция, двуокись
кремния и др.
2. Адъюванты природного происхождения. Адъювантным действием обладают многие природные соединения различного происхождения:
белки, гликопротеиды, пептиды, полисахариды и др. Особенностью этих
адъювантов считается то, что они не создают депо антигена в организме и
напрямую стимулируют выработку антител.
52
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
3. Синтетические адъюванты. Наиболее широко используются производные мурамил дипептида (MDP). Главные усилия исследователей
направлены на получение синтетических аналогов, обладающих низкой
токсичностью.
4. Поверхностно-активные адъюванты и искомы. Сапонин и искомы являются иммуномодуляторами, способными стимулировать Th 1 и
Th 2 иммунные ответы. В составе вакцинных адъювантов в основном используются частично очищенные или определенные фракции QS 21 или
ISCOPREP сапонина.
5. Липосомы. Представляют собой везикулы, ограниченные двухслойной мембраной из лецитина или других липидов. Антигены, ассоциированные с липосомами, эффективны при Т-независимом иммунитете, к
которому относится Ig A.
6. Масляные адъюванты. Иммуностимулирующее действие масляных
адъювантов связано с корпускулированием антигенов, что способствует захвату антигена макрофагами. Многие механизмы действия адъювантов на
клеточном уровне остаются невыясненными, хотя большинство данных
свидетельствует о преимущественном вовлечении в иммунный ответ макрофагов и Т-хелперов по сравнению с Т-супрессорами и В-лимфоцитами.
Целью нашей работы являлась сравнительная оценка влияния различных типов адъювантов на антигенную активность вакцин.
Материалы и методы
Инактивированные вакцины с различными адъювантными композициями изготавливали в лаборатории болезней рогатого скота ФГУ «ВНИИЗЖ», используя штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса с гемагглютинирующей активностью не ниже 9,0 log2. Для инактивации вируса
использовали 6%-й раствор аминоэтилэтиленимина (инактивацию проводили при температуре 37ºС, конечная концентрация инактиванта – 0,1%).
Вакцину готовили по ранее разработанной схеме (4).
Для изготовления экспериментальных образцов инактивированных
вакцин с различными адъювантными композициями использовали масляный адъювант Montanide ISA70 производства фирмы «SEPPIC» (Франция),
10%-й сапонин и гель ГОА. Для определения безвредности образцы препаратов вводили подкожно белым мышам (10 голов на каждый вариант вакцины) в дозе 0,5 см3. Все образцы вакцин оказались безвредными для мышей.
Пробы сывороток крови от контрольных и опытных животных исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Титр вирусспецифических антител в сыворотках крови животных выражали в виде средних
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
53
по группе логарифмированных значений, обратных степени разведения. Результаты обрабатывали статистически общепринятыми методами.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований готовили опытные образцы инактивированных вакцин против коронавирусной инфекции КРС с различными
адъювантными композициями:
Образец № 1 – антиген адсорбировали на геле ГОА с добавлением
сапонина.
Образец № 2 – антиген эмульгировали с масляным адъювантом
Montanide ISA70.
Образец № 3 – антиген эмульгировали с масляным адъювантом
Montanide ISA70, при этом в конце эмульгирования добавляли сапонин.
Образец № 4 – сапонин добавляли (смешивали) с антигеном и эмульгировали с масляным адъювантом Montanide ISA70.
Антигенную активность опытных образцов вакцины против коронавирусной инфекции КРС определяли на лабораторных животных. В опыте
использовали 22 кролика с живой массой 2,0-2,5 кг. Было создано 4 группы животных, по 5 кроликов в каждой. Пятая группа (2 кролика) служила
контролем. Вакцину вводили внутримышечно в область заднебедренной
группы мышц в дозе 1 см3. Животных иммунизировали двукратно с интервалом 20-25 суток. Через 14 суток после ревакцинации животных обескровливали. Полученные результаты представлены на рис. 1.
Рис. Антигенная активность инактивированных вакцин против
коронавирусной инфекции КРС на основе разных адъювантов
54
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
На рисунке показано, что в первой опытной группе (образец вакцины № 1) после ревакцинации на 35-е сутки происходило незначительное
увеличение уровня антител к коронавирусу до значения 3,7 log2; во второй опытной группе (образец вакцины № 2) уровень антител поднимался
до значения 7,2 log2; в третьей опытной группе (образец вакцины № 3)
уровень антител составлял 6,9 log2; в четвертой опытной группе (образец
вакцины № 4) – 8,0 log2. В контрольной группе животных титр антител
оставался нулевым.
Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальный уровень антител к коронавирусу формировался после вакцинации лабораторных животных эмульсионной вакциной, в которую сапонин добавляли в
антиген до эмульгирования.
Выводы
Опытные образцы инактивированных вакцин против коронавирусной инфекции КРС с различными адъювантными композициями являются безвредными для лабораторных животных. Установлено, что наиболее
высоким иммуностимулирующим эффектом обладает образец вакцины
№ 4, когда сапонин смешивали с антигеном и эмульгировали с масляным
адъювантом.
Список литературы
1. Медуницын, Н.В. Вакцинология. Изд. 2-е, перераб. и доп. / Н.В. Медуницын –
М.: Триада-Х, 2004. – 448 с.
2. Михалишин, В.В. Адъюванты и их использование / В.В. Михалишин,
Н.С. Мамков // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир,
2008. – Т. 6. – С. 340-371.
3. Особенности иммунодефицитов у крупного рогатого скота / В.А. Мищенко,
А.В. Мищенко, А.В. Кононов [и др.] // Ветеринария. – 2006. – № 11. – С. 17-20.
4. Пат. 2342157 Российская Федерация, МПК А61К39/215. Вакцина против
коронавирусной инфекции крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная / В.А. Мищенко, В.В. Думова, В.В. Лисицын [и др.]; ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл.
27.04.07; опубл. 27.12.08.
5. Полевая эффективность противовирусных вакцин для крупного рогатого
скота / В.А. Мищенко, Д.К. Павлов, А.В. Кононов [и др.] // Вет. патология. – 2007. –
№ 2. – С. 235-238.
6. Шемельков, Е.В. Антигенная активность вакцины против инфекционных болезней свиней при включении в ее состав адъювантов / Е.В. Шемельков,
Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский // С.-х. биология. – 2008. – № 4. – С. 101-105.
7. Addition of saponin to double oil emulsion FMD vaccines enhances specific
antibody responses in cattle and pigs / E. Smitsaart, A.M. Espinoza, R. Sanguinetti [et al.]
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
55
// Europ. Commiss. Control FMD. Sess. Ress. Group Stand. Techn. Comm. – Chania,
Grete, 2004. – P. 344-351.
8. Singh, M. Advances in vaccine adjuvants / M. Singh, D. O’Hagan // Nature Bio. –
1999. – Vol. 17. – P. 1075-1081.
ANTIGENICITY OF BOVINE CORONAVIRUS INFECTION
VACCINE WITH DIFFERENT ADJUVANTS
A.V. Kononov, V.A. Mischenko, V.V. Dumova,
S.V. Levchenko, S.V. Khlebopashnikova
Summary
The induction of strong and long-lasting immunity depends on the right
choice and application of nonspecific immunogenesis stimulators – adjuvants.
Experiments in laboratory animals revealed that the use of saponins as part of
oil vaccine antigen lead to a considerable increase in antigenic activity of the
preparation.
УДК 619:616.98:578.833:636.4
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА,
ВЫЗВАВШЕГО ВСПЫШКУ АТИПИЧНОГО
РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО
СИНДРОМА СВИНЕЙ В ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
А.В. Щербаков, А.М. Тимина, М.В. Челышева, А.В. Каньшина
Резюме
Проведен филогенетический анализ вируса, ответственного за вспышку
атипичного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в Иркутской области РФ в 2007 г. Установлено, что иркутский изолят принадлежит к высокопатогенному штамму вируса РРСС, вызвавшему эпизоотию атипичного РРСС в Китае. Уровень нуклеотидной гомологии иркутского и высокопатогенных китайских изолятов составлял 100% для ORF7 и 99,68-99,84%
для ORF5. Показано, что иркутский изолят имеет делецию 90 н.о. в ORF1b,
которая является маркерным признаком высокопатогенного штамма.
56
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Введение
В июне 2006 г. в нескольких хозяйствах КНР были зарегистрированы вспышки болезни свиней, сопровождавшиеся высоким уровнем
заболеваемости и летальности среди пораженных животных. Заболевание приобрело форму эпизоотии и к сентябрю 2006 г. охватило уже почти половину страны (5). Болезнь была первоначально идентифицирована китайскими ветеринарными специалистами как «КЧС-подобная»,
поскольку ее клинические проявления были типичны для классической
чумы свиней: высокая температура (40-42°С), депрессия, отказ от корма, эритематозные высыпания, одышка и т.д. На вскрытии у больных и
погибших животных наблюдали многочисленные поражения внутренних органов: очаги гиперплазии лёгких в сочетании с крупными кровоизлияниями и отёком, инфаркты в селезёнке и расширение мочевого
пузыря, многочисленные кровоизлияния в почках, гнилостное разложение сердечной мышцы, жёлтовато-белые очаги некроза или кровоизлияния в печени, незначительное размягчение мозга, выпот крови
за пределы сосудов и образование студенистых отёков под мозговой
оболочкой, ярко выраженные кровоизлияния в лимфатических узлах,
артриты с опуханием суставов и язвы в кишечнике (4, 5).
Масштабные диагностические исследования, проведенные в нескольких научных центрах КНР, позволили исключить вирусы классической и африканской чумы свиней, а также бактериальные патогены
как возможную причину заболевания, и установить, что возбудителем
болезни является высокопатогенный штамм вируса РРСС американского генотипа (4, 5, 6).
Эпизоотия заболевания, обусловленного высокопатогенным штаммом вируса РРСС, уже в 2006 г. охватила более 10 провинций Китая и
поразила более 2 млн свиней, из которых около 400 тысяч погибли (5).
В 2007 г. масштабы эпизоотии выросли, заболевание вышло за границы
Китая, и было зарегистрировано во Вьетнаме и Таиланде (7). РРСС в КНР
получил название атипичного в связи с тем, что его проявления сильно
отличались от обычной формы этого заболевания. Это, прежде всего, высокая контагиозность атипичной формы (заболевание способно поразить
всех свиней в стаде в течение 3-5 дней) и высокий уровень летальности
среди заболевших животных (от 20% до 50%) (4).
В августе – сентябре 2007 г. вспышка атипичного РРСС была зарегистрирована в Иркутской области РФ. Данная статья описывает диагностику этого заболевания, проводившуюся в ФГУ «ВНИИЗЖ», а также филогенетические свойства вируса, вызвавшего эту вспышку.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
57
Материалы и методы
Патологический материал. Для диагностических исследований использовали пробы органов от трех больных или павших животных из
частного сектора с. Казарки и двух животных из муниципального сельскохозяйственного предприятия (МСП) «Лена» Усть-Кутского района Иркутской области. Дополнительно исследовали тканевой материал от здоровой
свиньи из частного сектора с. Казарки. Семь проб сывороток крови были
взяты у больных животных из МСП «Лена».
Выделение РНК и ДНК из 10%-й суспензии органов осуществляли
с использованием 6 М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F.
ПЦР и ОТ-ПЦР. Обнаружение в патологическом материале вирусов
и патогенных бактерий методом ПЦР проводили в соответствии с методическими указаниями, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» и утвержденными Россельхознадзором.
Секвенирование ПЦР-продуктов осуществляли на автоматическом
секвенаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы MEGA 3.1.
Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению антител к вирусам
КЧС и РРСС проводили в соответствии с методическими указаниями, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» и утвержденными Россельхознадзором.
Результаты и обсуждение
В августе – сентябре 2007 г. в с. Казарки и расположенном вблизи
него муниципальном сельскохозяйственном предприятии «Лена» УстьКутского района Иркутской области было зарегистрировано массовое
заболевание свиней, сопровождавшееся высоким уровнем летальности
среди заболевших животных. В МСП «Лена» из 138 свиней заболели 106,
из них 66 пали. В личных подсобных хозяйствах жителей с. Казарки из
348 свиней заболели 119, погибли 34, 39 были вынужденно забиты, еще
175 уничтожены (7).
Клинические и патологоанатомические признаки болезни напоминали классическую чуму свиней. У больных животных наблюдали высокую температуру, отказ от корма, одышку, кашель, парез конечностей,
дрожание тела, гиперемию кожи, гнойный конъюнктивит. Лечебные мероприятия были неэффективными, и происходила быстрая гибель больных
животных. На вскрытии обнаруживали многочисленные кровоизлияния
на слизистой оболочке гортани, кишечника, мочевого пузыря, на поверх-
58
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ности почек, геморрагическое воспаление (мраморность) лимфоузлов,
воспаление лимфатических фолликулов толстого кишечника, крупозную
пневмонию.
Иркутская областная ветеринарная лаборатория установила наличие
антител к вирусу КЧС в одной из пяти проб сывороток крови от больных свиней, не вакцинированных против КЧС. На этом основании был
поставлен предварительный диагноз на классическую чуму свиней. Для
подтверждения диагноза в ФГУ «ВНИИЗЖ» были доставлены пробы внутренних органов от пяти больных свиней, три из которых были из частного
сектора с. Казарки и две из МСП «Лена». Дополнительно была получена
проба органов от здоровой свиньи из с. Казарки. Для исследований были
получены также семь проб сывороток крови от больных животных.
Однако проведенные нами исследования не подтвердили диагноз на
КЧС. Полимеразная цепная реакция показала отсутствие вируса КЧС в
патологическом материале, а иммуноферментный анализ продемонстрировал отсутствие антител против вируса КЧС во всех поступивших сыворотках крови.
В связи с этим были проведены дополнительные исследования, и
методом ПЦР были исключены такие патогены, как вирус африканской
чумы свиней, Pasteurella multocida, сальмонеллы (т.е. возбудители клинически сходных с КЧС заболеваний), а также вирус болезни Ауески, вирус гриппа свиней, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae,
Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis и некоторые другие. В
пробах органов от одной свиньи из хозяйства «Лена» был обнаружен цирковирус свиней типа 2, однако у четырех других животных ЦВС-2 отсутствовал.
В то же время в патматериале от всех больных свиней методом мультиплексной ОТ-ПЦР был выявлен вирус РРСС американского генотипа.
В тканевом материале от здоровой свиньи из с. Казарки вирус РРСС отсутствовал.
Поступившие из МСП «Лена» сыворотки крови от семи больных свиней были исследованы на наличие антител к вирусу РРСС. ИФА проводили в двух вариантах: в одном в качестве антигена использовали рекомбинантный нуклеокапсидный белок вируса РРСС европейского генотипа,
в другом – американского. В первом случае антитела к вирусу РРСС в исследованных сыворотках выявлены не были, тогда, как во втором во всех
сыворотках были обнаружены антитела к вирусу РРСС. Таким образом,
дифференцирующий ИФА показал наличие антител именно к американскому генотипу вируса РРСС в исследованных сыворотках.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
59
Рис. 1. Дендрограмма, отражающая положение изолята
Иркутск/2007 на филогенетическом древе вируса РРСС
американского генотипа. Основана на сравнении полных
нуклеотидных последовательностей гена нуклеокапсидного белка
(ORF7)
ВШ – вакцинный штамм
Важная диагностическая задача заключалась в определении происхождения выявленного вируса РРСС. В молекулярно-эпизоотологических
исследованиях РРСС традиционно используют филогенетический анализ
генов ORF7 и ORF5, кодирующих нуклеокапсидный белок и поверхностный гликопротеин-5, соответственно. Структура ORF7 отличается несколько большим консерватизмом по сравнению с ORF5, однако на основании отличий именно в ORF7 различают несколько подтипов в пределах европейского генотипа вируса РРСС (1, 3). Поскольку исследования
структуры генов нуклеокапсидного белка и поверхностного гликопротеина-5 дополняют друг друга, мы определили нуклеотидные последовательности как ORF7, так и ORF5 иркутских изолятов.
Филогенетический анализ показал, что по структуре ORF7 вирусы,
выявленные в трех пробах из с. Казарки и в двух пробах из МСП «Лена»,
идентичны между собой и имеют 100% гомологию с китайскими изолятами, выделенными в 2006-2007 гг. во время эпизоотии атипичного РРСС
60
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
(рис. 1). Иркутские и китайские изоляты формируют обособленный кластер, существенно отличающийся от других изолятов американского генотипа вируса РРСС.
Рис. 2. Дендрограмма, отражающая положение иркутских изолятов
на филогенетическом древе вируса РРСС американского генотипа.
Основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей
гена гликопротеина-5 (ORF5)
ВШ – вакцинный штамм
Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения первичной
структуры ORF5, в целом соответствовало дендрограмме для ORF7. Однако
в структуре ORF5 обнаружились некоторые (хотя и минимальные) отличия
между изолятами (рис. 2). Иркутские изоляты № 1 и 4 были идентичны между собой и всего по одному нуклеотидному основанию (н.о.) отличались от
целой группы китайских изолятов: 07NM и др. Мутация была локализована в
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
61
третьей позиции триплета, являлась «молчащей» и не приводила к изменению
аминокислотного остатка (а.о.). Изоляты № 2 и 3 отличались от 1-го и 4-го по
одному н.о., причем замена была значимой и приводила к изменению а.о. в
шестой позиции гликопротеина-5. Изолят № 5 отличался от остальных значимой заменой в 103 позиции ORF5. Таким образом, уровень нуклеотидной
гомологии ORF5 иркутских и китайских изолятов составлял 99,68-99,84%.
Рис. 3. Дифференциация высокопатогенного штамма от
«классических» штаммов вируса РРСС американского
генотипа в ОТ-ПЦР по размеру ампликона
1 –штамм БД/Resp MLV («классический» штамм американского генотипа);
2 – иркутский изолят (высокопатогенный штамм);
3 – ДНК-маркер GeneRuller 100bp (Fermentas)
Китайские исследователи, определившие полные последовательности
генома нескольких десятков изолятов, выделенных во время эпизоотии,
установили, что возможным маркером патогенности вируса – возбудителя
атипичной формы РРСС является делеция 90 н.о. в ORF1b, кодирующей
неструктурный протеин NSP2 (5, 6). Для того чтобы определить наличие
маркерной делеции у иркутского изолята, мы разработали метод, позволяющий дифференцировать высокопатогенный штамм от «классических»
штаммов вируса РРСС американского генотипа непосредственно в ПЦР
62
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
по размеру ампликона и не требующий для штаммовой идентификации
проведения нуклеотидного секвенирования. В результате амплификации
фрагмента ORF1b у иркутского изолята синтезировался ампликон длиной
235 п.н., а у «классического» штамма – 325 п.н. (рис. 3). Полученный результат доказывает наличие у иркутского изолята делеции в ORF1b, являющейся маркерным признаком высокопатогенного штамма вируса РРСС.
Таким образом, в результате проведенных нами исследований было
установлено, что вирус, выявленный в патматериале от больных свиней
из с. Казарки и МСП «Лена» Усть-Кутского района Иркутской области,
принадлежит к высокопатогенному штамму американского генотипа вируса РРСС, вызвавшему эпизоотию атипичной формы репродуктивнореспираторного синдрома свиней в Китае в 2006-2008 гг.
Необходимо отметить, что другая – «типичная» – форма РРСС хорошо знакома российским ветеринарным специалистам и вирусологам. Вирус
РРСС широко распространен в свиноводческих хозяйствах РФ (1, 2). Им
инфицировано большинство крупных свинокомплексов, за исключением
тех, которые были созданы в последние годы и укомплектованы импортными племенными животными. В российских хозяйствах вирус РРСС вместе с
другими патогенами (цирковирусом типа 2, микоплазмами, стрептококками,
Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae)
участвует в развитии комплекса респираторных болезней свиней. Инфицируя неимунных супоросных свиноматок, вирус РРСС может вызывать у
них репродуктивную патологию, которая выражается в абортах, рождении
мертвых и нежизнеспособных поросят. Однако до недавнего времени в
России не было зарегистрировано ни одного случая заболевания с высокой смертностью среди поросят послеотъемного возраста, обусловленного
РРСС как моноинфекцией. Таким образом, вспышка в Иркутской области
– это первый официально подтвержденный случай атипичного РРСС в России, вызванный высокопатогенным штаммом вируса.
Выводы
1. Проведен филогенетический анализ вируса, ответственного за
вспышку атипичного РРСС в Иркутской области РФ в 2007 г. Установлено,
что иркутский изолят принадлежит к высокопатогенному штамму вируса
РРСС, вызвавшему эпизоотию атипичного РРСС в Китае.
2. Уровень нуклеотидной гомологии иркутского и высокопатогенных
китайских изолятов составляет 100% для ORF7 и 99,68-99,84% для ORF5.
3. Показано, что иркутский изолят имеет делецию 90 н.о. в ORF1b,
которая является маркерным признаком высокопатогенного штамма.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
63
Список литературы
1. Генетическое разнообразие вируса репродуктивно-респираторного синдрома
свиней / А.В. Щербаков, В.Ф. Ковалишин, В.А. Пыльнов [и др.] // Актуал. пробл.
инфекц. патологии животных: матер. Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию
ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 150-155.
2. Этиологическая структура инфекционных болезней свиней в животноводческих хозяйствах России / А.В. Щербаков, В.Ф. Ковалишин, А.С. Яковлева,
Е.В. Шабаева // Актуал. пробл. инфекц. патологии животных: матер. Междунар.
науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 146-150.
3. Definition of subtypes in the European genotype of porcine reproductive and
respiratory syndrome virus: nucleocapsid characteristics and geographical distribution
in Europe / T. Stadejek, M. Oleksiewicz, A. Scherbakov [et al.] // Arch. Virol.- 2008. –
Vol. 153, № 8. – P. 1479-1488.
4. Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome
virus in the Mid-Eastern region of China / Y.Li, X. Wang, K. Bo [et al.] // Vet. J. – 2007. –
Vol. 174, № 3. – P. 577-584.
5. Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in
China and molecular dissection of the unique hallmark / K. Tian, X. Yu, T. Zhao [et al.]
// PLoS ONE. – 2007. – Vol. 2, № 6. – P. 526.
6. Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged
in China / X.J. Zhou, X.F. Hao, Z.J. Tian [et al.] // Transbound Emerg. Dis. – 2008. –
Vol. 55, № 3-4. – P. 152-64.
7. (OIE WAHID, 2007) (www.oie.int/wahis/public.php?page=home).
Phylogenetic characterization of the virus
responsible for atypical REPRODUCTIVE AND
RESPIRATORY SYNDROME SWINE OUTBREAK in the
Irkutskaya Oblast of the Russian Federation
A.V. Scherbakov, A.M. Timina, M.V. Chelysheva, A.V. Kanshina
Summary
The phylogenetic analysis of the virus, responsible for an outbreak of
atypical PRRS in the Irkutskaya Oblast, Russian Federation, in 2007, was
performed. The Irkutsky isolate was identified as a highly pathogenic isolate
of PRRS virus responsible for atypical PRRS epidemic in China. The level of
nucleotide homology between Irkutsky and highly pathogenic Chinese isolates
was 100% and 99.68 – 99.84% for ORF 7 and ORF5, respectively. The Irkutsky
isolate was demonstrated to have a 90 bp deletion in ORF1b, that is a marker
feature of a highly pathogenic strain.
64
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
УДК 619:616.98:579:636.4
РЕСПИРАТОРНЫЕ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ
В.С. Русалеев, А.В. Потехин, О.В. Бородина
Резюме
В статье представлен материал по инфекционным болезням свиней с
респираторным синдромом. На основании анализа результатов эпизоотологического обследования хозяйств и лабораторных исследований было
установлено, что причиной возникновения респираторных заболеваний
послужило сочетанное воздействие патогенов бактериальной, вирусной и
микоплазменной природы, обусловивших тяжелую патологию дыхательной системы у подсвинков.
Введение
Инфекционные болезни свиней с респираторным синдромом являются одной из актуальных проблем ветеринарии. Они регистрируются главным образом у поросят 2-4-месячного возраста и наносят свиноводческим
хозяйствам значительный экономический ущерб.
Эпизоотические острые формы респираторных инфекций наблюдают обычно при первичном заносе биологического агента на свиноферму.
На практике ветеринарным специалистам чаще всего приходится сталкиваться с так называемой энзоотической формой респираторной патологии – когда возбудитель обнаружен и регистрируется в свинокомплексе на
протяжении достаточно длительного времени.
Развитие респираторной патологии у свиней обусловлено, как правило, воздействием на организм ассоциации «абиогенных» и «биогенных» факторов.
К «абиогенным» факторам относят неблагоприятные условия окружающей среды и микроклимата в помещениях: высокую и низкую температуру,
резкие ее колебания, высокую влажность воздуха, содержание в нем больших концентраций вредных газов, сквозняки, перегруппировки и перевозки
животных, создание групп из животных различного возраста, скученность
и т.д. Все эти факторы, особенно их сочетания, в той или иной мере могут
оказывать отрицательное воздействие на иммунную систему, обусловливая
ее угнетение и снижение резистентности организма молодых животных.
«Биогенными» факторами являются различные бактерии, вирусы и
микоплазмы.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
65
Распространено мнение, что начало респираторной патологии дают
вирусы и микоплазмы, которые размножаются в клетках дыхательных
путей, «прокладывая дорогу» бактериям. Согласно другой концепции все
биологические агенты, вызывающие легочную патологию, подразделяются на 2 группы: первичные и вторичные. Первичные патогены – это
те, которые способны самостоятельно вызвать инфекционный процесс
(Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma
hyopneumoniae, вирусы РРСС, гриппа, болезни Ауески, респираторный
коронавирус) (1, 3, 4, 5).
Вторичные патогены – это так называемые условно-патогенные
микроорганизмы, проявляющие свое болезнетворное действие на фоне
ослабления резистентности организма (Pasteurella multocida, Haemophilus
parasuis, Streptococcus suis, Мycoplasma hyorchinis, цирко- и цитомегаловирусы) (1, 3, 4, 5).
Согласно сообщениям отечественных и зарубежных авторов при респираторной патологии в большинстве случаев приходится иметь дело со
смешанной инфекцией. При этом из патологического материала можно
выделить от одного до пяти видов бактерий, один или два вида микоплазм
и такое же количество вирусов.
Материалы и методы
С целью выяснения причин массовых респираторных заболеваний
молодняка свиней проводили эпизоотологическое обследование свиноводческих хозяйств Московской, Новгородской, Новосибирской, Вологодской, Орловской, Рязанской, Белгородской и Самарской областей, а
также Краснодарского и Хабаровского краев. Лабораторное исследование патологического материала от павших и вынужденно убитых животных проводили с использованием бактериологического и молекулярногенетического (ПЦР) методов.
Результаты и обсуждение
При клиническом обследовании у животных в возрасте от 1,5 до
4,0 месяцев отмечали повышение температуры тела (до 41,5оС), затрудненное дыхание, кашель, уменьшение аппетита, снижение эффективности усвояемости кормов, замедление роста.
При патологоанатомическом вскрытии трупов павших и вынужденно
убитых свиней регистрировали гиперемию слизистой оболочки гортани
и трахеи. У всех животных отмечали двусторонние изменения в легких.
Пораженные участки были темно-красного цвета, плотной консистенции.
66
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
С поверхности разреза обильно стекала пенистая жидкость. При сверхостром и остром течении плевропневмонии у свиней обнаруживали резко
очерченные участки геморрагической пневмонии и фибринозный плеврит.
При хроническом течении в легких наблюдали инкапсулированные омертвевшие участки, а также поражение суставов. Бронхиальные и средостенные лимфоузлы увеличены, рыхлые, с кровоизлияниями.
У многих поросят в воспаленной легочной ткани встречали единичные или множественные инкапсулированные абсцессы от 0,5 до 3,0 см в
диаметре. В ряде случаев в грудной и брюшной полостях обнаруживали экссудат соломенно-желтого или красноватого цвета, пленки фибрина,
иногда спайки между долями легких, между легочной и костальной плеврой. Патологические изменения при остром и подостром течении полисерозита у поросят характеризовались серозно-фибринозным плевритом,
перикардитом и перитонитом. При хроническом течении болезни отмечали массивные отложения фибрина на серозных оболочках с развитием
слипчивого воспаления между поверхностями прилегающих органов с серозными покровами. Постоянно регистрировали увеличение и гиперемию
средостенных и, меньше, подчелюстных лимфоузлов.
При бактериологическом исследовании патологического материала,
проводимом лабораторией микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ» в течение последних нескольких лет, чаще всего удавалось выделить P. multocida (8 изолятов), далее следовали H. parasuis и A. рleuropneumoniae (по 6 изолятов).
За это время бактерии B. bronchiseptica нам не удалось изолировать ни разу.
Общее представление об основных инфекционных агентах, обнаруживаемых в ПЦР и имеющих место у животных свиноводческих хозяйств
Российской Федерации, дает материал таблицы (2). Структура биологических агентов, выявляемых в свинокомплексах РФ, в целом соответствует
таковой в других странах мира (6). Однако результаты ПЦР-исследований
не дают прямого ответа на вопрос о роли каждого из обнаруженных в
данный момент патогенов в респираторной патологии свиней, особенно
если речь идет о необлигатно-патогенных микроорганизмах. Результаты
ПЦР-анализа свидетельствуют лишь о том, какие биологические агенты
циркулируют в свиноводческом хозяйстве. Поскольку респираторную патологию во многих случаях вызывает ассоциация биологических агентов,
то понять, какой из них в данный момент является ведущим, непросто.
При постановке диагноза необходимо учитывать комплекс признаков: эпизоотологические данные, клинические признаки болезни, патологоанатомические изменения и результаты бактериологического анализа
патологического материала.
67
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица
Результаты ПЦР-исследований патологического материала
от свиней с респираторным синдромом
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
Обнаруженные биологические агенты
Бактерии
Вирусы
Микоплазмы
H. рarasuis
Московская обл.
ЦВС-2
–
A. рleuropneumoniae
P. multocida (D)
ЦВС-2
Новгородская
H. рarasuis
M. hyopneumoniae
РРСС
обл.
стрептококки
M. hyorhinis
ЦМВ
стафилококки
Новосибирская
ЦВС-2
P. multocida (D)
M. hyopneumoniae
обл.
РРСС
стрептококкки
M. hyorhinis
ЦВС-2
РРСС
H. рarasuis
M. hyopneumoniae
Вологодская обл.
ЦМВ
стрептококки
M. hyorhinis
ЛГВ
ЦВС-2
Орловская обл.
H. рarasuis
–
РРСС
ЦВС-2
M. hyopneumoniae
Рязанская обл.
H. рarasuis
РРСС
M. hyorhinis
Регион
Краснодарский
край
H. рarasuis
ЦВС-2
РРСС
ПВИС
M. hyorhinis
M. hyopneumoniae
M. hyopneumoniae
M. hyorhinis
8
Хабаровский
край
P. multocida (A)
H. рarasuis
ЦВС-2
РРСС
ВБА
ЦМВ
ЛГВ
9
Белгородская
обл.
P. multocida
H. рarasuis
A. рleuropneumoniae
сальмонеллы
ЦВС-2
РРСС
ЦМВ
ЦВС-2
РРСС
M. hyopneumoniae
10
Самарская обл.
ЦМВ
M. hyorhinis
ЛГВ
ЦВС-2 – цирковирус свиней типа 2; РРСС – вирус респираторно-репродуктивного
синдрома; ЦМВ – цитомегаловирус; ЛГВ – лимфотропный герпесвирус; ВБА – вирус болезни Ауески; ПВИС – парвовирусная инфекция свиней
P. multocida (A)
H. рarasuis
стрептококки
68
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Выделение возбудителя болезни, его идентификация в совокупности
с положительными результатами экспериментального заражения лабораторных животных являются прямым доказательством патогенности и, соответственно, этиологической роли выделенного микроорганизма в возникновении заболевания.
В качестве примера необходимости проведения бактериологического анализа могут служить результаты исследования патологического материала, проводимого лабораторией микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ».
Так, за период с 2000 по 2006 гг. нами было исследовано 293 пробы патологического материала и выделено 8 изолятов пастерелл, 6 актинобацилл и такое же количество гемофилюсов. Необходимо отметить, что
H. рarasuis выделяли от поросят, начиная, как правило, с трехнедельного
возраста, тогда как A. рleuropneumoniae и P. multocida изолировали от
свиней более старшего возраста. При этом не все выделенные бактерии P. multocida и H. рarasuis являлись патогенными и, соответственно,
не все они являлись первопричиной респираторной патологии у свиней.
Так, например, из 6 изолятов H. рarasuis патогенными оказались только
4, а из 8 изолятов P. multocida 3 принадлежали к серогруппе D по капсульному антигену и, соответственно, их роль как первичного этиологического агента в развитии острой респираторной патологии исключалась. Таким образом, выделение и анализ изолятов на патогенность являются важным и объективным инструментом выявления первопричины
респираторной патологии, кроме того, бактериологическая диагностика
создает основу для анализа, проведения и оценки результатов профилактических и противоэпизоотических мероприятий, а также помогает
в выявлении изменений в характере развития эпизоотического процесса
респираторных инфекций.
Заключение
На основании анализа результатов эпизоотологического обследования
хозяйств и лабораторных исследований было установлено, что причиной
возникновения респираторных заболеваний послужило сочетанное воздействие патогенов бактериальной, вирусной и микоплазменной природы,
обусловивших тяжелую патологию дыхательной системы у подсвинков.
При этом был рекомендован комплекс лечебно-профилактических мер,
выполнение которых позволило купировать возникшие в хозяйствах массовые заболевания.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
69
Список литературы
1. Орлянкин, Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней / Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. – 2005. – № 11. – С. 3-6.
2. Тимина, А.М. Разработка методов лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней: автореф. дис. … канд. вет. наук / Тимина Анна Михайловна. – Владимир, 2006. – 27 с.
3. De Jong, M.F. Progressive atrophic rhinitis // Diseases of Swine. – 8th ed. – Ames,
Iowa, USA, 1999. – P. 355-384.
4. Gueirard, P. Virulence of Bordetella bronchiseptica: role of adenylate cyclasehemolysin / P. Gueirard, N. Guiso // Infect. Immun. – 1993. – Vol. 61. – P. 4072-4078.
5. Magyar, T. The pathogenesis of turbinate atrophy in pigs caused by Bordetella
bronchiseptica / T. Magyar, N. Chanter, A.J. Lax [et. al.] // Vet. Microbiol. – 1988. –
Vol. 18. – P. 135-146.
6. Turk, J. Summary of porcine respiratory disease diagnosis at the Missouri
Veterinary Medical Diagnostic Laboratory for the years 1984-1986 / J. Turk, M. Turk,
W. Fales // J. Vet. Diagn. Invest. – 1989. – Vol. 1. – P. 183-184.
PORCINE RESPIRATORY INFECTIONS OF BACTERIAL
ETIOLOGY
V.S. Rusaleyev, A.V. Potekhin, O.V. Borodina
Summary
The paper shows data on porcine infectious diseases with a respiratory
syndrome. The analysis of results of epidemic farm monitoring and results of
laboratory investigations provided basis for the statement that the respiratory
diseases were caused by joint effect of pathogens of bacterial, viral and
micoplasmal nature, which were responsible for heavy pathology of respiratory
system in gilts.
70
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
УДК: 619:616.98:578.823.91:636.4:616-078
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К РОТАВИРУСУ
СВИНЕЙ МЕТОДОМ ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ
А.С. Оганесян, О.П. Бьядовская, О.Г. Андреева,
Л.Б. Прохватилова
Резюме
Разработана иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к ротавирусу в пробах сывороток крови свиней. В качестве антигена
использовали культуральный инактивированный очищенный концентрированный ротавирус свиней штамм «KR-47». Представлены результаты
сравнительного исследования сывороток крови свиней с помощью предложенного варианта ИФА и иммуноферментного теста Ingezim rotavirus
(INGENASA, Испания). Определена относительная специфичность и
чувствительность разработанного метода. Данная тест-система была применена при исследовании широты распространения ротавируса среди
свиней в хозяйствах Центрального федерального округа Российской Федерации (ЦФО РФ).
Введение
Ротавирусная инфекция свиней – высококонтагиозная вирусная болезнь животных всех возрастов, однако чаще её регистрируют у 3-8-недельных поросят (до и после отъёма). Клинические признаки болезни: рвота,
анорексия, профузный понос, дегидратация организма и смертность заболевших поросят. Возбудитель инфекции – РНК–содержащий безоболочечный вирус из семейства Reoviridae, рода Rotavirus. В настоящее время различают 4 серогруппы ротавируса, поражающих свиней: А, В, С, Е.
Наиболее часто встречается вирус серогруппы А (до 89%). Представители этой группы классифицируются в соответствии с комбинацией
двух видов серотипов, называемых G-серотипом, определяемым антигенностью белка наружного капсида VP7, и P-серотипом, ассоциированным с
антигенностью белка наружного капсида VP4.
Многочисленные серотипы обеспечивают большую иммунологическую
вариабельность ротавирусов, а циркуляция ротавируса в хозяйствах, как правило, постоянна. Вирус распространяется фекально-оральным путем (3, 5).
Серологические исследования показывают высокий процент серопозитивности (77-100%) взрослых животных к серогруппам А, В и С. У по-
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
71
росят 3-8-недельного возраста процент серопозитивности к группам В и С
сильно варьирует, тогда как к группе А он всегда высок. Большой интерес
представляет инаппарантная форма инфекции, которая характеризуется
персистированием ротавируса в организме при отсутствии клинических
признаков гастроэнтерита и обнаружении ротавируса свиней в фекалиях
клинически здоровых животных (1).
Диагностику ротавирусной инфекции осуществляют комплексно на
основании данных эпизоотической обстановки в хозяйстве, районе или
регионе, анализа клинических признаков инфекции, патологоморфологических изменений в органах и тканях, взятых от больных и павших животных, и проведения лабораторных исследований.
В настоящее время имеется много методов диагностики ротавирусной инфекции у отдельного животного, которые дают чёткие и однозначные результаты, однако ведение мониторинга в популяции и установление контроля над инфекцией на уровне свиноводческого хозяйства или
комплекса основывается, как правило, на серологических исследованиях
из-за удобства исследования большого количества проб.
Серодиагностика ротавирусной инфекции на основе иммуноферментного анализа (ИФА) даёт результаты, которые легко и однозначно интерпретируются и удобны для дальнейшей обработки. Данные, полученные на основе ИФА, используются для диагностики заболевания, мониторинга инфекции, оценки иммунного статуса поголовья, установления или
подтверждения благополучия популяции по заболеванию и мониторинга
эффективности изменений условий содержания животных.
Для выявления антител и определения их количества в сыворотках
крови используется непрямой вариант ИФА методом одного разведения,
который в последнее время получил наибольшую актуальность при проведении скрининговых исследований в виду простоты исполнения (8). На
основе ИФА разработаны различные тест-системы, выпущены многочисленные диагностические наборы (4, 5).
Этот же подход был использован в нашей работе, поскольку при
определении уровня поствакцинальных антител, а также при изучении
широты распространения данного вируса в свиноводческих хозяйствах
часто возникает необходимость исследования большого количества образцов сывороток крови. В связи с этим целью нашей работы явилась
разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к
ротавирусу свиней при тестировании сывороток крови в одном разведении и апробация её для проведения серологических исследований в
свиноводческих хозяйствах.
72
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Материалы и методы
Антиген. В работе использовали инактивированный концентрированный антиген ротавируса свиней группы А серотипа G4 P7 (штамм
«КR-47»), полученный в монослойных перевиваемых культурах клеток
RSK и MARK-145.
Вирусную суспензию подвергали замораживанию и оттаиванию с
последующим центрифугированием при 3000 g в течение 15 минут для
освобождения от клеточного детрита.
После этого проводили концентрирование с помощью осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000) и центрифугирования при 6000 g и 11000 g
с последующим ультрацентрифугированием через слой 30%-го раствора
сахарозы при 55000 g в течение 80 минут. Степень очистки контролировали электронно-микроскопическим методом.
Титр антигена определяли в непрямом сэндвич-варианте ИФА.
При проведении непрямого варианта ИФА все компоненты реакции вносили в объёме 50 мкл/лунку. Разведения антигена готовили на
0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,6. В качестве блокирующего буферного раствора применяли трис-буферный раствор (ТБР) рН
7,4-7,6 с 10% сыворотки крови лошади. Для разведения исследуемых проб
сыворотки крови и конъюгата использовали 3% раствор лошадиной сыворотки на промывочном буфере. Промывочный буфер готовили из трисбуферного раствора (ТБР) с добавлением 0,05% Tween-20. Между этапами реакции несвязавшиеся компоненты удаляли путём промывания лунок
планшета 3-4 раза промывочным буфером. Для выявления связавшихся
антител использовали препарат антител против иммуноглобулинов свиньи, меченных пероксидазой хрена (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва).
Индикацию проводили с помощью добавления хромоген-субстратного
раствора АБТС (2,2’-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновая кислота)
(Sigma). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «Униплан» (г. Москва) при длине волны 405 нм.
Разведения сывороток готовили с двукратным шагом от 1:20 до
1:2560. В качестве положительного контроля использовали сыворотку
крови свиней, специфичную к ротавирусу, с титром в непрямом варианте
ИФА 1:160-640. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови свиней, не содержащую антител к ротавирусу, с титром в непрямом варианте ИФА меньше, чем 1:20. Результаты анализа выражали в
виде титра сыворотки. Титром сыворотки считали ее максимальное разведение, при котором величина оптической плотности в 2 раза превосходила
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
73
оптическую плотность в лунках с отрицательной контрольной сывороткой. Положительными считали пробы сывороток крови с титром 1:160 и
выше. Данное разведение применяли в качестве рабочего при исследовании сыворотки в одном разведении и определяли значение отношения S/P
(отношение оптической плотности пробы к оптической плотности положительного контроля за вычетом оптической плотности отрицательного
контроля из каждой величины).
В основу определения оптимального разведения сыворотки был положен метод регрессионного анализа. Позитивный и негативный порог
(ПНП) реакции рассчитали по методу Snyder (8). Для определения ПНП
было исследовано 100 заведомо серонегативных к ротавирусу свиней проб
сывороток крови от поросят. Произведён подсчёт среднего значения и его
стандартного отклонения. Сумма среднего значения и двух стандартных
отклонений явилась верхней границей отрицательных значений, а сумма
среднего значения и трёх стандартных отклонений – нижней границей положительных значений.
Относительную чувствительность и специфичность разработанной тест-системы определяли в сравнении с набором Ingezim rotavirus
(INGENASA, Испания). Статистическую обработку данных проводили с
помощью компьютерной программы STATISTICA 6 (StatSoft, Inc., 2001).
Исследование широты распространения ротавируса в свиноводческих хозяйствах. Исследование проводили в свиноводческих хозяйствах
6 областей Центрального федерального округа Российской Федерации
(n1=6). Всего исследовано 847 образцов сыворотки крови свиней группы
доращивания из 28 хозяйств (n2=28). Для обеспечения минимальной территориальной репрезентативности определяли хозяйства в географически
удалённых друг от друга точках для каждой обследуемой области, где и
проводили пробоотбор. Минимальный объём выборки определяли, исходя из 95% уровня вероятности и 10% превалентности болезни в стаде,
что давало нам для бесконечно большой популяции значение в 30 проб из
хозяйства (2). Пробы сыворотки крови отбирали одномоментно в свиноводческих хозяйствах Московской (n=2), Костромской (n=2), Владимирской (n=4), Белгородской (n=8), Воронежской (n=6) и Смоленской (n=6)
областей. Некоторые группы поголовья рассматривались нами как имеющие более высокую вероятность инфицирования ротавирусом, т.е. как
группы риска (2, 3). Это, как правило, поросята старше 3 недель, поэтому
для обследования нами была выбрана группа доращивания, не подвергавшаяся вакцинации против данной инфекции, в которую входили поросята
2-4-месячного возраста.
74
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Результаты и обсуждение
В практике рутинных серологических исследований широко используют метод одного разведения, что позволяет анализировать большое
количество проб, снижая затраты на проведение работы. Рядом авторов
были предложены различные способы преобразования значений оптической плотности, измеренной в отдельном разведении сыворотки, в титр
антител. Широкое распространение получил метод регрессионного анализа, в котором используется линейная зависимость lg Т от lg S/P. Эта
зависимость описывается формулой:
lg T =A+B lg (S/P),
где lg T – десятичный логарифм титра антител в пробе сыворотки;
lg (S/P) – десятичный логарифм отношения S/P пробы сыворотки крови.
Для определения оптимального разведения сыворотки предварительно в непрямом варианте ИФА методом последовательных разведений
тестировали сыворотки крови свиней с различным уровнем антител к
ротавирусу (60 сывороток). Для разведений 1:80, 1:160, 1:320 вычисляли
значения S/P: S/P 80, S/P 160, S/P 320 по формуле:
S/P = (OП – NC)/(PC – NC),
где ОП – оптическая плотность образца;
NC – оптическая плотность отрицательной сыворотки;
PC – оптическая плотность положительной сыворотки.
Полученные результаты для соответствующих разведений подвергали статистической обработке, которая позволила рассчитать значения
коэффициента корреляции (r), стандартную ошибку и построить линию
регрессии для каждого выбранного разведения (табл. 1). Наиболее высокий коэффициент корреляции r = 0,851 с наименьшей стандартной ошибкой получился для разведения 1:160. Поэтому данное разведение было
выбрано в качестве рабочего. Определить значение титра можно по калибровочной прямой (см. рис.). Уравнение линейной регрессии определения
числового значения титров, исходя из значений оптической плотности исследуемых сывороток, имело вид: lg T = 1,1079+1,8052 lg S/P.
Полученное уравнение будет достоверно для определенных значений
отрицательного и положительного контролей. В случае перехода к другим сериям контрольных сывороток параметры уравнения должны быть
определены заново.
75
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Коэффициенты корреляции lg титра и lg S/P проб
для различных разведений образцов сывороток
Таблица 1
Кратность разведения
Коэффициент
корреляции
Стандартная ошибка
1:80
0,849
0,020902
1:160
0,851
0,020701
1:320
0,850
0,028021
Рис. Регрессионная зависимость между логарифмом титра антител
(lg T) к ротавирусу свиней, определённого методом
последовательных разведений, и логарифмом отношения S/P (lg S/P)
Определение допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток. Для получения достоверных результатов при определении титра антител методом одного разведения определили допустимые
величины оптической плотности контрольных сывороток, исследованных
в разведении 1:160.
76
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 2
Результаты измерения оптической плотности положительного
и отрицательного контролей в разведении 1:160
Контрольные
сыворотки
Положительный
контроль (Р)
Отрицательный
контроль (N)
Разница контролей
(P-N)
Среднее значение
оптической плотности
Доверительный
интервал (95%)
0,753
0,654 – 0,853
0,215
0,15 – 0,279
0,538
0,504 – 0,574
Было показано, что наиболее приемлемыми значениями оптической
плотности контрольных сывороток являются значения, лежащие в диапазоне: для положительного контроля – от 0,654 до 0,853, для отрицательного контроля – от 0,15 до 0,279. В табл. 2 показаны результаты анализа
значений оптической плотности контрольных сывороток, исследованных
в разведении 1:160.
Определение позитивно-негативного порога. Для объективной оценки результатов реакции необходимо установить позитивно-негативный порог (ПНП). Поэтому 90 заведомо отрицательных сывороток крови свиней,
протестированных с помощью коммерческого набора Ingezim rotavirus,
исследовали методом последовательных разведений.
В качестве положительного и отрицательного контролей были взяты стандартные контрольные сыворотки. ПНП определяли, рассчитывая
среднее значение оптической плотности 90 заведомо отрицательных сывороток (оптическая плотность 0,151), прибавляя удвоенное значение стандартного отклонения (0,060). ПНП, полученный в виде прямой, отражает
верхнюю границу отрицательных величин (оптическая плотность 0,271).
Таким образом, оптическая плотность, соответствующая наименьшему
положительному значению, равнялась 0,331 (ПНП).
Для данных значений показателей вычисляли S/P – отношения, которые приняли в качестве критериев для разграничения различных результатов реакции. Было установлено, что сыворотки следует считать
отрицательными, если S/P<0,30, или положительными, если S/P>0,50.
Существующий между ними интервал значений соответствовал сомнительным результатам. В дальнейшем при оценке сывороток, тестированных методом одного разведения, предложено значение S/P выражать в
виде процента реактивности. Формула для расчета S/P имеет вид:
77
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
S/P = (ОП –NC) / (PC –NC)×100%
Были рассчитаны соответствующие границы пороговых значений: при величине S/P больше 50% реакция считается положительной,
если значение S/P меньше 30% – реакция отрицательная, а диапазон
значений S/P от 30% до 50% характеризует сомнительные результаты
реакции.
Определение воспроизводимости реакции. Для определения лабораторной воспроизводимости метода были протестированы пробы сыворотки крови животных, серопозитивных (n=14) и серонегативных (n=16) к
ротавирусу свиней. Исследования проводили в течение трёх дней на различных планшетах (в трёх повторностях на каждом планшете). При этом
для группы положительных проб величина стандартного отклонения от
среднего значения титра антител не превышала ±0,2, а серонегативные
пробы так и оставались серонегативными. Таким образом, можно сделать
вывод о воспроизводимости реакции (6).
Сравнительные исследования набора Ingezim rotavirus (INGENASA,
Испания) с разработанным вариантом ИФА. Для подтверждения специфичности нашей тест-системы были использованы специфические сыворотки крови против вирусов болезни Ауески, классической чумы свиней,
репродуктивно-респираторного синдрома свиней, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, которые показали отсутствие перекрёстной реакции
в разработанном варианте ИФА. Для сравнения 100 сывороток крови свиней с различным уровнем антител к ротавирусу были протестированы в
обоих наборах. На основе полученных данных, представленных в табл. 3,
была рассчитана относительная чувствительность (ОЧ=(A/B)x100%) и
специфичность (ОС=(С/D)х100%) тест-системы по отношению к набору
Ingezim rotavirus (INGENASA, Испания).
Таблица 3
Обнаружение антител к ротавирусу свиней в сыворотках крови
свиней в непрямом варианте ИФА и тест-системе Ingezim rotavirus
Результаты теста
Ingezim rotavirus
(INGENASA)
Положительные
Отрицательные результаты
результаты разработанного разработанного варианта
варианта ИФА
ИФА
Положительно
50 (В)
49 (А)
1
Отрицательно
50 (D)
0
50 (С)
Всего
100
100
78
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 4
Серопревалентность к ротавирусу свиней в популяции ЦФО РФ
В том числе
серопозитивных
№
Область ЦФО Всего проб
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
40
4
30
0
Владимирская
33
4
30
3
30
2
30
5
30
10
Воронежская
30
13
30
0
35
0
30
0
Костромская
30
0
24
0
30
5
30
0
30
2
Белгородская
30
1
30
24
30
11
30
3
30
5
Московская
30
15
30
14
25
6
30
3
Смоленская
30
0
30
2
30
9
Всего
847
141
M±m
30,25±2,67
5,04±5,09
F>F0,95
423,76>4,019
Показатель
серопревалентности
внутри стад
между стад
10,00%
0,00%
75,00%
12,12%
10,00%
6,67%
16,67%
33,33%
66,66%
43,33%
0,00%
0,00%
0,00%
n<3
0,00%
0,00%
16,67%
0,00%
6,67%
75,00%
3,33%
80,00%
36,67%
10,00%
16,67%
n<3
50,00%
46,67%
24,00%
10,00%
83,33%
0,00%
6,67%
30,00%
16,65%
71,43%
16,77±19,76% 75,00±6,53%
-
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
79
Установлено, что результаты тестирования проб в тестах не совпадают лишь в одном случае (получен 1 отрицательный результат исследования пробы сыворотки, показавший в тест-системе Ingezim rotavirus наличие антител к ротавирусу свиней), и относительная чувствительность
непрямого варианта ИФА составила 98%, а специфичность – 100%.
Серопревалентность к ротавирусу в популяции свиней ЦФО. К данным о превалентности болезни, полученным при исследовании проб, доставленных в лабораторию из хозяйств, следует относиться с осторожностью, т.к. очевидно, что убиваемые животные не являются типичными
представителями популяции или выбраковываются по хозяйственным
причинам. Карантинные (или вновь завезённые) животные также не являются репрезентативными представителями поголовья, т.к. находятся
вне прямого контакта с популяцией, хотя косвенный контакт всегда присутствует (2).
Учитывая данный факт, для исследования мы использовали полевые
образцы сыворотки крови, полученные в ходе организованного и проведённого совместно с отделами Департамента ветеринарии соответствующих областей независимого отбора проб. Исследования выполнены в
ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир) и на базе свиноводческих хозяйств различных форм собственности ЦФО.
При том, что среднее количество проб для каждого из хозяйств
стабильно (M±m=30,25±2,67), разброс в числе серопозитивных животных достаточно велик (M±m=5,04±5,09). Дисперсионный анализ свидетельствует о крайне высокой неоднородности числа серопозитивных
животных в стадах (F>F0,95, 423,76>4,019). Заметны существенные различия в числе серопозитивных животных для хозяйств Владимирской,
Воронежской, Белгородской и Смоленской областей, для которых число
кластеров для отбора больше трёх (n2>3). В среднем по ЦФО РФ ротавирус свиней широко распространён (показатель серопревалентности
между стад ЦФО в нашем обследовании достиг уровня 75,00±6,53%),
при распространении внутри стад в – среднем 16,77%. Однако для
стад, имеющих животных, серопозитивных к ротавирусу, показатель
серопревалентности внутри них показал значительную вариабельность
23,15±19,28%. При этом 8 из 21 серопозитивных стад имели показатель
серопревалентности к ротавирусу внутри стада в интервале до 10%, в
пяти стадах показатель варьировал от 10% до 20%. В интервалах показателя серопревалентности внутри стад от 20% до 30% и от 30% до
40% было по 2 серопозитивных хозяйства, и в интервале от 40% до
50% – 3 стада, и лишь в одном из серопозитивных стад показатель се-
80
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ропревалентности внутри стада к ротавирусу свиней достиг значения
80,00%. Большинство серопозитивных хозяйств (38%) показало значение серопревалентности внутри стад на уровне до 10%, что свидетельствует о достаточно низком распространении ротавируса свиней
среди поросят группы доращивания. Однако постоянное присутствие
источника инфекции в стадах является фактором риска, прежде всего
для младшей группы животных. Показатель же межстадной серопревалентности (75%) является индикатором широкого территориального
распространения возбудителя ротавирусной инфекции. Таким образом,
предположение, что свиньи, вероятно, играют важную роль в качестве
резервуара и распространителя, вновь возникающих штаммов ротавирусов (7), диктует необходимость проведения постоянного мониторинга популяции по данной инфекции.
Выводы
Предложенная методика для выявления антител к ротавирусу в сыворотках крови свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании сывороток крови в одном разведении является
воспроизводимой, специфичной, а результаты реакции коррелируют с
таковыми, полученными с помощью набора фирмы Ingenaza. Показан
достаточно высокий уровень относительной чувствительности (98%)
и относительной специфичности (100%) теста, что позволяет использовать его для обнаружения антител при проведении серологического
мониторинга в свиноводческих хозяйствах при исследовании большого количества проб.
Результаты проведённого исследования широты распространения
ротавируса в популяции свиней ЦФО свидетельствуют о необходимости
ведения непрерывного мониторинга по ротавирусной инфекции в стадах.
Список литературы
1. Белянко, Л.В. Ротавирусный гастроэнтерит свиней и его лабораторная
диаг-ностика / Л.В. Белянко, Т.А. Савельева // Вет. наука – производству: межвед.
сб. – Минск, 1996. – Вып. 29. – С. 4-5.
2. Дудников, С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики / С.А. Дудников. – Владимир: Демиург, 2004. – 460 с.
3. Егорова, А.И. Ротавирусная инфекция свиней / А.И. Егорова, С.Г. Ерофеев //
Ветеринария. – 2002. – № 7. – С. 16-19.
4. Иммуноферментный метод детекции изотип-специфических антител к ротавирусу свиней / О.А. Верховский, Ю.Н. Федоров, Б.Г. Орлянкин [и др.] // Междунар.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
81
науч.-произв. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения члена-корреспондента
ВАСХНИЛ В.Т. Котова. – Воронеж, 1999. – С. 93-95.
5. Инфекционная патология животных: в 2 т. Т.2. / под ред. А.Я. Самуйленко,
Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина.– М.: Академкнига, 2006. – 807 с.
6. Jakobson, R.H. Validation of serological assays for diagnosis of infectious
diseases // Rev.Sci. Techn. OIE. – 1998. – Vol. 17, N 2. – P. 469-486.
7. Phylogenetic analysis of porcine rotavirus in Argentina: Increasing diversity
of G4 strains and evidence of interspecies transmission / G.I. Parra, G. Vidales,
J.A. Gomez [et al.] // Vet. Microbiology. – 2008. – Vol. 126. – P. 243-250.
8. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 2.
Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum
dilution / D.B. Snyder, W.W. Marquardt, E.T. Mallison [et al.] // Avian Dis. – 1982. –
Vol. 27. – P. 474-484.
DEVELOPMENT of ELISA test-system for detection
of antibodies to porcine retrovirus using
a single dilution method
A.S. Oganesyan, O.P. Byadovskaya, O.G. Andreyeva,
L.B. Prokhvatilova
Summary
An ELISA test-system for detection of antibodies to rotavirus in porcine
sera was developed. Cultural inactivated purified concentrated porcine
rotavirus KR-47 strain was used as antigen. Results of comparative testings of
porcine sera with the developed ELISA and Ingezim rotavirus ELISA test-kit
(INGENAZA, Spain) are given. The relative specificity and sensitivity of the
developed method were determined. The given ELISA test-system was used for
determination of a level of rotavirus spread in pigs on pig farms of the Central
Federal Okrug of the Russian Federation (CFO RF).
82
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
УДК 619:579:573.6.086.83:57.083.3
РАЗРАБОТКА НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE В СЫВОРОТКАХ
КРОВИ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ
Н.Б. Шадрова, М.А. Балашова
Резюме
Представлены результаты разработки непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием липополисахаридного
«mix» антигена Actinobacillus pleuropneumoniae серотипов 1, 2 и 6 для выявления антител в сыворотках крови свиней методом одного разведения.
Введение
A. pleuropneumoniae является возбудителем актинобациллезной
плевропневмонии свиней – инфекционного контагиозного заболевания,
которое характеризуется септикотоксемией, геморрагической и гнойнонекротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом,
перикардитом и артритами (1, 7).
Болезнь широко распространена во многих странах мира и причиняет значительный экономический ущерб за счет большого падежа свиней,
затрат на лечение больных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий (12).
Одной из проблем данного заболевания является возможное субклиническое течение инфекции (часто после лечения антибиотиками), а также бактерионосительство без внешних проявлений болезни, которое представляет потенциальную опасность при формировании нового, смешанного стада (6, 8). В таком случае вспышка происходит внезапно, болезнь
носит острый характер, часто с привлечением сопутствующей микрофлоры, что влечет за собой значительный экономический ущерб. Поэтому выявление серологическими методами животных-бактерионосителей является важным звеном в противоэпизоотических мероприятиях при данном
заболевании (8).
Принятые в нашей стране методические указания по лабораторной
диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней, утвержденные в
1981 г., не предусматривают проведения серологических исследований (2).
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
83
В то же время в ряде стран ЕС широкое распространение нашли методы
выявления антител с помощью как традиционных серологических реакций, так и иммуноферментного анализа. В Канаде и Дании серологические методы используют для эпидемиологического надзора за поголовьем
свиней (9, 12).
В настоящее время различают 15 серотипов A. pleuropneumoniae,
в связи с этим ряд исследователей применяет в качестве антигена для
ИФА «mix» антиген, состоящий из наиболее «актуальных» серотипов
A. pleuropneumoniae (10, 11).
На территории РФ (2, 6) чаще других выделяют серотипы 1, 2 и 6
(3, 4), поэтому целью нашей работы было изучение возможности использования «mix» антигена (серотипов 1, 2 и 6) для выявления антител к бактериям A. pleuropneumoniae.
Материалы и методы
Бактерии A. pleuropneumoniae. В работе использовали изоляты
Actinobacillus pleuropneumoniae, выделенные на территории РФ, в лабораториях микробиологии и диагностики бактериальных инфекций
ФГУ «ВНИИЗЖ»: Г-1 (серотип 1), Ш-1 (серотип 2), К-2 (серотип 6).
Сыворотки. Использовали полевые сыворотки свиней, доставленные
из свиноводческих хозяйств различных регионов России и сыворотки иммунизированных животных.
Конъюгат антисвиных антител, меченных пероксидазой. Применяли коммерческий препарат антисвиных антител, меченных пероксидазой хрена, полученный из ВНИИ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва.
Растворы. Антиген разводили в карбонатно-бикарбонатном буфере
(КББ), рН 9,6. Для блокирования свободных мест применяли 1% раствор
сухого обезжиренного молока фирмы Applechem, разведенного в буфере
ТБС с рН 7,4, содержащем 0,02М Tris-HCl, 0,15M NaCl, 0,05% Tween-20.
Сыворотки и конъюгат разводили в буфере ТБС. Несвязавшиеся компоненты реакции удаляли путем отмывания в буфере ТБС. Субстратом служил
раствор АБТС (2,2-азиноди-(3-этилбензотиазолин-сульфонат) фирмы ICN,
останавливали реакцию 1% раствором ДСН (додецил-сульфанат натрия).
Получение липополисахаридного антигена. Липополисахаридный
антиген A. pleuropneumoniae получали по методике S. Radacovicii (13).
Непрямой вариант ИФА выполняли по стандартной методике (5).
Учитывали реакцию спектрофотометрически при длине волны 405 нм. По
измеренным оптическим плотностям образца положительной (К+) и от-
84
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
рицательной (К-) контрольных сывороток рассчитывали величину S/P (14),
которая выражалась в виде:
S/P = (ОП – К-)/(К+ – К-)
(1),
где ОП – оптическая плотность исследуемых сывороток.
Статистический метод. Для обработки данных ИФА использовали
компьютерную программу «Statistica».
Результаты и обсуждение
Первым этапом нашей работы было получение липополисахаридных
антигенов (ЛПС АГ) каждого изолята A. pleuropneumoniae: серотип 1 (изолят Г-1), серотип 2 (изолят Ш-1), серотип 6 (изолят К-2) из 18-часовых
агаровых культур. Активность антигенов проверяли в непрямом варианте ИФА (Н-ИФА) с контрольными сыворотками (рис. 1). За оптимальное
принимали такое разведение антигена, при котором оптическая плотность
контрольной положительной сыворотки составляла 0,8-1,0 единиц. В качестве положительных контрольных сывороток использовали сыворотки,
полученные при иммунизации свиней антигенами A. pleuropneumoniae
серотипов 1, 2, 6; в качестве отрицательной – сыворотку от животных, доставленную из благополучного по АРР хозяйства, предварительно протестированную в реакции агглютинации (РА).
Рис. 1. Активность контрольных сывороток свиней в разведении
1:400 с ЛПС АГ A. pleuropneumoniae Г-1, Ш-1, К-2 (по данным ИФА)
Исходя из полученных данных, оптимальная концентрация антигенов при нанесении на планшеты была установлена для:
ЛПС АГ A. рleuropneumoniaе штамм Г-1 – 1:6400 (log2 – 12,64);
ЛПС АГ A. рleuropneumoniaе штамм Ш-1 – 1:3200 (log2 – 11,64);
ЛПС АГ A. рleuropneumoniaе штамм К-2 – 1:6400 (log2 – 12,64).
85
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Для получения «mix» антигена антигены смешивали в соответствии
с определенными рабочими разведениями для каждого серотипа. Активность антигенов в составе «mix» антигена оставалась удовлетворительной
(табл. 1).
Таблица 1
Активность моно- и «mix» антигенов
с гипериммунными сыворотками крови свиней в ИФА
(n=3)
Сыворотка
положительная
Значение S/P / антигены
Г-1
серотип 1
Ш-1
серотип 2
К-2
серотип 6
«mix»
антиген
Г-1(серотип 1)
1,0+0,12
0,28+0,05
0,32+0,06
0,92+0,11
Ш-1(серотип 2)
0,35+0,05
1,0+0,09
0,5+0,03
0,85+0,10
К-2 (серотип 6)
0,39+0,07
0,42+0,04
0,96+0,11
0,83+0,13
С целью определения оптимального рабочего разведения сывороток
вычисляли зависимость титра антител, определенного методом последовательных разведений сывороток, от значений lg S/P, подсчитанных на
140 сыворотках для разведений 1:100, 1:200, 1:400. Для каждого разведения была построена отдельная линия регрессии. Результаты регрессионного анализа для трех разведений сыворотки представлены в табл. 2.
Таблица 2
Константы линий регрессии для трех разведений
сывороток крови свиней
(n=3)
Разведение
А*
В*
Коэффициент
корреляции
Стандартная
ошибка
1:100
3,5603
1,0401
0,7932
0,07021
1:200
3,4019
1,0624
0,8053
0,06102
1:400
3,5923
1,3999
0,9195
0,04211
* – коэффициенты уравнения линейной регрессии
Данные статистической обработки показывают, что все представленные разведения имеют сильную корреляционную связь, однако разведение
1:400 имеет оптимальные значения коэффициента корреляции и стандартной ошибки. Это разведение было принято в качестве рабочего.
В соответствии со значениями оптических плотностей исследуемых
сывороток с помощью программы «Statistica» была построена калибро-
86
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
вочная прямая и выведено уравнение линейной регрессии зависимости
lg титра (Т) от lg S/P (рис. 2).
Уравнение расчета титра антител имело вид:
lg T= 3,5923+1,3999 х lg S/P (2).
Рис. 2. Уравнение линейной регрессии и калибровочная прямая
для определения титра антител к бактериям A. pleuropneumoniae
(«mix» антиген) в Н-ИФА при разведении сывороток 1:400
При тестировании проб в одном разведении необходимо определить
допустимые величины оптической плотности для контрольных положительных и отрицательных сывороток. Для их определения были проанализированы соответствующие значения оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток и разницы между ними
в разведении 1:400 (табл. 3).
Данные, представленные в табл. 3, показывают, что допустимые значения оптической плотности контрольных сывороток должны быть следующие: для отрицательного контроля не выше 0,20; допустимая разница
между контролями больше 0,5.
87
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными и пробы должны быть исследованы повторно.
Таблица 3
Средние значения оптической плотности контрольных сывороток
(n=3)
Положительный
контроль
Отрицательный
контроль
Разница
между контролями
Среднее значение
0,95+0,26
0,14+0,06
0,81+0,32
95% доверительный интервал
0,69-1,21
0,08-0,20
0,49-1,13
Для интерпретации результатов реакции установили позитивнонегативный порог (ПНП). Сто заведомо отрицательных сывороток крови
свиней, предварительно протестированных в РА, исследовали в Н-ИФА в
разведении 1:400.
ПНП определяли путем расчета средних значений оптической плотности отрицательных сывороток, прибавляя три значения стандартного отклонения. Статистические параметры для расчета ПНП представлены в табл. 4.
Таблица 4
Статистические параметры для расчета ПНП
(n=3)
Разведение
Среднее
значение ОП
1:400
0,212
Мин. значение Макс. значение
ОП
ОП
0,093
0,290
Стандартное
отклонение
0,034
Принимая во внимание среднюю величину оптической плотности отрицательных сывороток в данном разведении, с учетом трех стандартных
отклонений, по формуле (1) вычисляли значение S/P, соответствующее
позитивно-негативному порогу. Было установлено, что пороговое значение S/P составило 0,2.
По формуле (2) был найден наивысший отрицательный титр
Тmax= 1:410. С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах
одного разведения, где Т/2 < T > Tx2, выделялась сомнительная зона. Титр
антител в пределах 0-1:410 считали отрицательным, 1:411-1:820 – сомнительным, от 1:821 и выше – положительным.
Таким образом, были установлены пороговые значения S/P и титра
для разных групп сывороток. Данные приведены в табл. 5.
88
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 5
Пороговые значения S/P и титра сывороток крови свиней
(n=3)
Параметры
Группы сывороток
отрицательные
сомнительные
положительные
S/P
0-0,20
0,21-0,33
0,34 и выше
Титр
0-1:410
1:411-1:820
1: 821 и выше
Специфичность «mix» антигена проверяли в Н-ИФА с сыворотками, полученными на антигены бактерий других родов семейства Pasteurellaceae и бактерий других семейств (Enterobacteriaceae,
Mycoplasmaceae) (табл. 6).
Из результатов проверки следует, что «mix» антиген
A. pleuropneumoniae специфичен только к гомологичным сывороткам и не
специфичен к сывороткам, полученным на антигены бактерий других родов
семейства Pasteurellaceae и бактерий других семейств (Enterobacteriaceae,
Mycoplasmaceae).
Таблица 6
Оценка специфичности «mix» антигена
A. pleuropneumoniae в Н-ИФА
№
Положительные сыворотки
Значение S/P
1
A. pleuropneumoniae (серотип 1)
0,92+0,11
2
A. pleuropneumoniae ( серотип 2)
0,85+0,10
3
A. pleuropneumoniae ( серотип 6)
0,83+0,13
4
Рasteurella multocida
0,14+0.03
5
Salmonella choleraesuis
0,08+0,03
6
Haemophilus parasuis
0,12+0,04
7
Mycoplasma hyopneumoniae
0,08+0,05
Для определения относительной чувствительности и специфичности разработанного Н-ИФА, в сравнении с коммерческим набором
ИФА «CIVTEST APP» (Испания), параллельно протестировали 212 сывороток крови свиней. Результаты тестирования представлены в табл. 7.
89
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 7
Результаты тестирования 212 сывороток крови свиней,
полученные по данным серологических тестов
Результаты
Н-ИФА
«CIVTEST APP»
Положительные
132А
138В
Отрицательные
64
65Д
Сомнительные
16
9
Всего
212
212
С
Относительная чувствительность вычислялась как:
А/В х 100%,
где А – количество проб при тестировании в Н-ИФА, совпадающих с положительными пробами в «CIVTEST APP»;
В – количество положительных проб в «CIVTEST APP».
Специфичность вычислялась как:
С/Д х 100%,
где С – количество отрицательных результатов в Н-ИФА, совпадающих с
отрицательными пробами в «CIVTEST APP»;
Д – количество отрицательных проб в «CIVTEST APP».
Относительная чувствительность непрямого варианта ИФА составила 95,6%, специфичность – 98,4%.
Выводы
На основе липополисахаридного «mix» антигена разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител к бактериям A. pleuropneumoniae
серотипов 1, 2, 6 в сыворотках крови свиней и определены допустимые
критерии количественной оценки результатов.
Список литературы
1. Диагностика гемофилезной плевропневмонии свиней / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев [и др.] // Ветеринария. – 1981. – № 12. – С. 66-68.
2. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции / под
ред. Б.И. Антонова. – М.: Агропромиздат, 1986. – 352 с.
3. Русалеев, В.С. Актинобациллезная плевропневмония свиней / В.С. Русалеев,
А.А. Фроловцева, Д.А. Бирюченков // Всерос. вет. конгр. 15-й Моск. Междунар.
вет. конгр. по болезням мелких дом. ж-ных. Проблемы инфекц. патологии свиней. – М., 2007. – С. 38-39.
90
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
4. Скородумов, Д.И. Актинобациллезная (гемофилезная) плевропневмония и
гемофилезный полисерозит свиней (этиология, лабораторная диагностика, основы специфической профилактики актинобациллезной плевропневмонии): автореф
дис. … докт. вет. наук / Д.И. Скородумов – М., 1997. – 32 с.
5. Шадрова, Н.Б. Выявление антител к бактериям Actinobacillus
pleuropneumoniae в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием липополисахаридного антигена / Н.Б. Шадрова, О.В. Прунтова,
М.А. Коржавина // Вет. патология. – 2007. – № 4. – С. 68-72.
6. Aarestrup, F.M. Susceptibility testing of Actinobacillus pleuropneumoniae in
Denmark. Evaluation of three media of MIC-determinations and tablet diffusion tests /
F.M. Aarestrup, N.E. Jensen // Vet. Microbiol. – 1999. – Vol. 64. – P. 299-305.
7. Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs: the pole of virulence factors
in pathogenesis and protection / F. Haesebrouck, K. Chiers, I. van Overbeke [et al.] //
Vet. Microbiol. – 1997. – Vol. 58, N 2/4. – P. 239-249.
8. Desrosiers, R. Epidemiology, diagnosis and control of swine diseases. Howard
Dunne Memorial Lecture / R. Desrosiers // Proc. Am. Ass. Swine Vet. Ann. Mtg. – Des
Moines, Iowa, 2004. – P. 9-37.
9. Desrosiers, R. Porcine pleuropneumonia associated with Haemophilus
pleuropneumoniae serotype 3 in Quebec / R. Desrosiers, K.R. Mittal, R. Malo // Vet.
Rec. – 1984. – Vol. 115. – P. 628-629.
10. Development and evaluation of a mixed long-chain lipopolysaccharide based
ELISA for serological surveillance of infection with Actinobacillus pleuropneumoniae
serotypes 2, 6 and 12 pig herds / J. Grondahl-Hansen, K. Barfod, J. Klausen [et al.] // Vet.
Microbiol. – 2003. – Vol. 96. – P 41-51.
11. Development and evaluation of a mixed-antigen ELISA for serodiagnosis of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes 1, 5 and 7 infections in commercial swine
herds / J.T. Bosse, R. Friendship, S. Rosendal [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. – 1993. –
Vol. 5. – P. 359-362.
12. Diseases of Swine // еd. by B.E. Straw [et al.]. – 9th ed. – Ames, Iowa: Blackwell
Publ., 2006. – P. 563-576.
13. Radacovicii, S. Lipopolysaccharides of Actinobacillus pleuropneumoniae
(serotype 1): a readly obtainable antigen for ELISA serodiagnosis of pig
pleuropneumoniae / S. Radacovicii, M. Gottschalk, J.D. Dubreuli // Vet.
Microbiol. – 1994. – Vol. 39. – P. 219-230.
14. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 2.
Comparison of computation methods for measuring antibody titres in a single serum
dilution / D.G. Snyder, W.W. Marguardt, E.T. Mallinson [et al.] // Avian Dis. – 1983. –
Vol. 27. – P. 474-484.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
91
DEVELOPMENT of Indirect ELISA for detection
of antibodies to Actinobacillus
Pleuropneumoniae bacteria in porcine sera
with a single dilution method
N.B. Shadrova, M.A. Balashova
Summary
The development of indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
with lipopolysaccharide «mix» antigen of serotype 1, 2 and 6 Actinobaccilus
pleutopneumoniae for the antibody detection in porcine sera using a single
dilution method is described in the paper.
УДК 619:616.98:579.843.96:616-076
ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА АpxIV
В СЕРОДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
А.В. Каньшина, А.С. Яковлева, А.В. Щербаков
Резюме
Экспрессией в Е. coli получен рекомбинантный токсин ApxIV
A. pleuropneumoniae.
На основе рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для определения антител к A. pleuropneumoniae в сыворотках
крови свиней. Установлено, что специфичность и чувствительность разработанного теста относительно коммерческого набора «IDEXX CHEKIT
APP-ApxIV» (IDEXX, США) составляет 100 и 95,7%, соответственно.
Проведен мониторинг актинобациллёзной инфекции в 55 хозяйствах
24 регионов Российской Федерации, установлены хозяйства, инфицированные и свободные от А. pleuropneumoniae.
Введение
Actinobacillus pleuropneumoniae является этиологическим агентом
плевропневмонии свиней – заболевания, вызывающего большие потери в
промышленном свиноводстве.
92
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
По структуре капсулярных полисахаридов и липополисахаридов различают 15 серотипов A. pleuropneumoniae, которые относятся к двум биоварам: NAD-зависимому биовару I и NAD-независимому биовару II (4, 6).
Серотипы различаются по вирулентности: 1, 2, 5, 7, 9, 10 и 11 серотипы
являются высоковирулентными, серотипы 3, 4, 6, 8 и 12 – низковирулентными (2).
Лабораторная диагностика актинобациллёзной плевропневмонии
основана на обнаружении у больных животных возбудителя болезни или
антител к нему. Для серологической диагностики традиционно используются тесты на основе липополисахаридов (ЛПС). Реакции на основе
ЛПС являются типоспецифичными, что, учитывая существование 15
серотипов A. pleuropneumoniae, делает серодиагностику трудоемким и
затратным процессом. Кроме того, недавно было показано, что непатогенные виды актинобацилл индуцируют у свиней выработку антител, перекрестно реагирующих с серотипами 1 и 9 A. pleuropneumoniae
(5). Это снижает диагностическую специфичность серодиагностики на
основе ЛПС-тестов.
В 2004 г. Dreyfus et al. показали, что перспективным методом серодиагностики актинобациллёзной инфекции является иммуноферментный
анализ на основе рекомбинантного токсина ApxIV. Этот токсин является
высокоиммуногенным, он специфичен только для A. pleuropneumoniae и
продуцируется всеми 15 серотипами бактерии (3, 7). Кроме того, ApxIV
продуцируется бактерией только in vivo (т.е. при инфицировании животных), но не в условиях in vitro (при культивировании на питательных
средах). Таким образом, обнаружение антител к ApxIV является по сути
DIVA-тестом, позволяющим дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных.
В 2007 г. фирма IDEXX сообщила о разработке диагностического набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV», который основан на использовании
ApxIV в качестве антигена и «является единственным серологическим тестом, перекрывающим все серотипы Actinobacillus pleuropneumoniae без
ложноположительных результатов, вызванных перекрестными реакциями
с другими бактериями» (2).
В России аналогичные тест-системы не разрабатывались. Цель нашей
работы заключалась в получении рекомбинантного белка ApxIV и разработке на его основе ИФА для выявления антител к A. pleuropneumoniae в
сыворотках крови свиней.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
93
Материалы и методы
Микроорганизмы. Для молекулярного клонирования гена ApxIV использовали штамм №27088 A. pleuropneumoniae из коллекции микроорганизмов лаборатории микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ».
Выделение бактериальной ДНК из суспензии осуществляли с использованием 6 М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F.
ПЦР. Для проведения ПЦР собирали реакционную смесь, которая содержала 5 мкл 10× буфера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg2+, 0,2 мМ dNTPs,
2 ед. Taq-ДНК-полимеразы, по 20 пмоль праймеров, 5 мкл раствора бактериальной ДНК и воду до конечного объема 50 мкл. Реакцию проводили
на ДНК-амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). Программа
включала 35 циклов ПЦР при следующем температурном режиме: 30 сек
денатурации при 94ºС, 30 сек отжига праймеров при 55º С и 40 сек элонгации при 72ºС. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 2,0% агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при
силе тока 50 мА.
Молекулярное клонирование гена ApxIV осуществляли по общепринятым методикам (1).
Экспрессия рекомбинантного белка. Культивирование Е. coli проводили в орбитальном шейкере при 150 об/мин и 37ºС. В дневную культуру
клеток, достигшую логарифмической фазы роста, добавляли индуктор
IPTG (Promega, США). Уровень экспрессии и размер рекомбинантного
белка определяли с помощью электрофореза в 12%-м ПААГе.
Сыворотки крови свиней. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови, в которой антитела к A. pleuropneumoniae
были определены с помощью коммерческого набора «IDEXX CHEKIT
APP-ApxIV» (IDEXX, США).
В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку, полученную от здорового животного, не имеющего антител
к A. pleuropneumoniae.
Для определения специфичности метода использовали сыворотки крови от животных, имеющих антитела к Pasteurella multocida, Haemophillus
parasuis, сальмонеллам, а также к вирусам репродуктивно-респираторного
синдрома свиней и цирковирусу свиней 2-го типа.
Для определения чувствительности метода применяли сыворотки
крови от свиней с разным уровнем антител.
Все сыворотки были проверены в ИФА с использованием коммерческого набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX, США). Постановку
94
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
и интерпретацию результатов реакции проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Непрямой вариант ИФА. Метод последовательных разведений сывороток крови в ИФА проводили по общепринятой схеме с небольшими модификациями. Рекомбинантный белок (концентрация 5 мкг/мл) адсорбировали на 96-луночные полистироловые планшеты фирмы «Nunc» (Дания)
в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) по 100 мкл на лунку.
Планшеты инкубировали в течение 16-18 ч при 4ºС. Затем отмывали 3 раза
буфером PBST (на 1 л раствора: NaCl – 8,0 г; KCl – 0,2 г; Na2HPO4 – 2,8 г;
K2HPO4 – 0,2 г; Tween-20 – 0,05%; рН 7,3). Лунки планшетов блокировали
10%-м раствором молока в PBST, внося по 100 мкл раствора в каждую из
них, и инкубировали в течение часа – при 37ºС. Планшеты отмывали трехкратно раствором PBST. Методом последовательных двукратных разведений
одновременно с исследуемой сывороткой крови наносили отрицательную и
положительную контрольные сыворотки, начиная с разведения 1:20. Инкубировали планшеты в термостатируемом шейкере 1 ч при 37ºС. Повторили
отмывку планшетов. Затем вносили также по 100 мкл на лунку антивидовой
конъюгат (Sigma, США) в рабочем разведении и инкубировали планшеты в
аналогичных условиях. После отмывки добавляли субстрат ABTS в том же
объеме. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 1%-го раствора додецилсульфата натрия. Учет результатов производили на спектрофотометре «SPECTRA SHELL» (Tecan, Австрия) при длине волны 405 нм.
Таким образом, методом последовательных двукратных разведений
сывороток крови в ИФА определяли титр антител в пробах. Титром исследуемой сыворотки считали последнее ее разведение, в котором значение
оптической плотности (ОП) вдвое превышало среднее значение оптической плотности отрицательного контроля.
Непрямой вариант ИФА для выявления антител к A. pleuropneumoniae
по одному разведению сывороток крови проводили по вышеприведенной
схеме, но исследуемые и контрольные сыворотки вносили в буфере в разведении 1:20.
Методом одного разведения в ИФА определяли значение процента
позитивности (ПП) по формуле:
(ОП пробы – ОП К-) / (ОП К+ – ОП К-) × 100%,
где ОП пробы – оптическая плотность исследуемой сыворотки;
ОП К- – оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки;
ОП К+ – оптическая плотность положительной контрольной сыворотки.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
95
Диагностическую чувствительность и специфичность вычисляли по
формулам, рекомендованным МЭБ:
Дчув = (ИП / ИП + ЛО) х 100%; Дспец = (ИО / ИО + ЛП) х 100%,
где ИП – истинноположительный результат;
ЛО – ложноотрицательный результат;
ИО – истинноотрицательный результат;
ЛП – ложноположительный результат.
Результаты и обсуждение
Ген, кодирующий токсин ApxIV A. pleuropneumoniae, амплифицировали методом ПЦР. В реакции использовали праймеры, содержащие сайты рестрикции Bam HI и Hind III. После обработки соответствующими
рестриктазами ампликон клонировали в экспрессирующий плазмидный
вектор. В результате трансформации рекомбинантной плазмидой компетентных клеток E. coli получили клоны, экспрессирующие рекомбинантный токсин A. pleuropneumoniae, содержащий на N-конце шесть остатков
гистидина. Очистку рекомбинантного белка проводили методом металлхелатной хроматографии. Со 100 мл культуры E. coli было получено
6,8 мг очищенного препарата рекомбинантного белка (4 мл раствора белка
с концентрацией 1,7 мг/мл).
Антигенную активность белка проверяли в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками свиней, взятыми в разведении
1:20. Рекомбинантный белок разводили от 1:100 (17 мкг/мл) до 1:6400
(0,260 мкг/мл). Зависимость средней оптической плотности контрольных сывороток от концентрации рекомбинантного антигена представлена на рисунке.
Максимальное разведение белка, при котором еще проявлялась его
антигенная активность, составляла 1:6400 (0,260 мкг/мл). Концентрацию
белка, равную 1,06 мкг/мл, выбрали рабочей в ИФА.
Для определения рабочего разведения сывороток крови методом
последовательного титрования в ИФА исследовали 110 сывороток крови свиней с разным уровнем антител. Для каждой сыворотки вычислили титр и процент позитивности. С помощью компьютерной программы определили коэффициент корреляции, стандартную ошибку,
построили отдельные линии регрессии для разведений 1:20, 1:40, 1:80,
соответственно. Результаты регрессионного анализа по всем данным
представлены в табл. 1.
96
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
концентрация антигена (мкг/мл)
Рис. Антигенная активность рекомбинантного белка ApxIV
в непрямом ИФА с контрольными сыворотками
Таблица 1
Значения коэффициента корреляции и стандартной ошибки
для различных разведений сывороток
Разведение
Коэффициент
корреляции
Стандартная ошибка
1:20
0,93
0,042
1:40
0,91
0,056
1:80
0,90
0,123
Из данных табл. 1 следует, что каждое из представленных разведений
имеет сильную корреляционную связь, однако наибольшее значение коэффициента корреляции соответствует разведению 1:20 при наименьшем
значении стандартной ошибки 0,042.
Для определения позитивно-негативного порога (ПНП) реакции в
ИФА исследовали 91 пробу заведомо отрицательную сыворотку крови
свиней в рабочем разведении. Получили среднее значение ОП отрицательных сывороток для разведения 1:20, равное 0,206 оптических единиц
(о.е.). Прибавляя к данной величине два и три значения стандартного отклонения, рассчитали нижнюю и верхнюю границы ПНП, что составило
0,272 о.е. и 0,305 о.е. В качестве критерия для разграничения специфической и неспецифической реакций приняли процент позитивности, кото-
97
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
рый вычислили для каждого из вышеопределенных значений. Установили,
что сыворотки следует считать отрицательными, если процент позитивности меньше 14%, и положительными, если процент позитивности больше
17%. Поскольку полученные значения ПНП отличались незначительно, то
для увеличения специфичности подняли границу до 20% и отказались от
сомнительной зоны.
Для получения достоверных результатов при определении уровня
антител по одному разведению сыворотки необходимо было определить допустимые значения ОП контрольных сывороток, исследованных в разведении 1:20. Показано, что оптимальными значениями
ОП контрольных сывороток являются значения, лежащие в диапазоне:
для положительного контроля – от 0,828 до 1,468, для отрицательного
контроля – до 0,224.
В табл. 2 показаны результаты анализа значений оптической плотности контрольных сывороток, исследованных в разведении 1:20.
Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными и пробы должны быть исследованы заново.
Таблица 2
Допустимые значения ОП контрольных сывороток
Отрицательный
контроль (N)
Положительный
контроль (P)
Разница между
контролями (P-N)
Среднее
значение
0,128
1,148
1,02
Доверительный
интервал
не более 0,224
0,828 – 1,468
не менее 0,600
Специфичность ИФА на основе рекомбинантного белка определяли
по результатам тестирования 93 сывороток крови свиней, не имеющих
антител к A. pleuropneumoniae. Для определения чувствительности протестировали 164 серопозитивные к A. pleuropneumoniae сыворотки крови.
Все сыворотки предварительно исследовали с использованием коммерческого набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX, США).
Результаты исследования сывороток на наличие антител к
A. pleuropneumoniae представлены в табл. 3.
По результатам исследования 164 положительных сывороток чувствительность разработанной тест-системы относительно коммерческого
набора составила 95,7% (7 ложноотрицательных результатов).
98
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
При исследовании 93 отрицательных сывороток крови свиней относительная специфичность разработанной тест-системы составила 100%
(ни одного ложноположительного результата).
Таблица 3
Результаты исследования сывороток крови свиней
с использованием разработанной тест-системы и коммерческого
набора «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX)
Статус животного
Непрямой вариант ИФА
IDEXX CHEKIT
APP-ApxIV (IDEXX)
отр. – 93
отр. – 93
пол. – 157
отр. – 7
пол. – 164
Животные, не
инфицированные
A. pleuropneumoniae
(93 сыворотки)
Животные,
инфицированные
A. pleuropneumoniae
(164 сыворотки)
Согласованность двух тестов определяли по методу капа-статистики.
Полученные данные представлены в табл. 4.
Таблица 4
Согласованность результатов двух иммуноферментных
тест-систем для выявления антител к A. pleuropneumoniae
в сыворотках крови свиней
Сравниваемые
тест-системы
Результат в наборе «IDEXX
CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX)
Всего
Выявленная
превалентность
в непрямом ИФА
положительно
отрицательно
157
0
157
(157+0)/257=0,61
7
93
100
(7+93)/257=0,39
Всего
164
93
Выявленная
превалентность в
наборе
«IDEXX CHEKIT
APP-ApxIV» (IDEXX)
(157+7)/
257=0,64
(0+93)/
257=0,36
положиРезультат в
тельно
непрямом
варианте
отрицательИФА
но
257
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
99
Расчет k-критерия:
– абсолютная
согласованность
результатов
ИФА
–
(157+93)/264=0,95;
– случайная согласованность положительных результатов –
0,64×0,61=0,39;
– случайная согласованность отрицательных результатов –
0,36×0,39=0,14;
– обобщенная случайная вероятность согласованности результатов –
0,39×0,14=0,055;
– наблюдаемая согласованность результатов без учета случайностей –
0,95-0,055=0,895;
– неслучайная максимально возможная согласованность методов –
1-0,055=0,945;
– k-критерий (капа-статистика) – 0,895/0,945=0,95.
Полученное в нашем случае значение k-критерия, равное 0,95, свидетельствует об очень хорошей согласованности результатов двух тестсистем.
Таким образом, в результате проведенных исследований получен рекомбинантный белок ApxIV и на его основе разработан непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к A. pleuropneumoniae. Показано, что
разработанный метод очень хорошо согласуется с коммерческим набором
«IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» (IDEXX, США) – значение k-критерия составляет 0,95.
Разработанный непрямой вариант ИФА использовали в мониторинговых исследованиях, проводившихся в 2007-2008 гг. В ходе
мониторинга определили свиноводческие хозяйства РФ, в которых
циркулирует A. pleuropneumoniae, а также хозяйства, свободные от
этого патогена. Всего было исследовано более 5000 сывороток крови свиней из 55 свиноводческих хозяйств 24 регионов РФ. Только в
6 хозяйствах все обследованные животные были серонегативными к
A. pleuropneumoniae.
На наличие антител к A. pleuropneumoniae также было исследовано
около 1200 сывороток крови племенных свиней, ввезенных в Российскую
Федерацию в 2007-2008 гг. из Великобритании, Германии, Ирландии, Канады, Литвы и Польши. Серонегативными к A. pleuropneumoniae были
животные, завезенные из Канады и Польши. Максимальное количество
серопозитивных животных выявили среди литовских и ирландских свиней: 100% и 85,9%, соответственно.
100
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Выводы
1. Методом молекулярного клонирования и экспрессии в Е. coli получен рекомбинантный токсин ApxIV A. pleuropneumoniae.
2. На основе рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для определения антител к A. pleuropneumoniae в сыворотках
крови свиней.
3. Установлено, что специфичность и чувствительность разработанного теста относительно коммерческого набора «IDEXX CHEKIT
APP-ApxIV» (IDEXX, США) составляет 100 и 95,7%, соответственно.
4. Проведен мониторинг актинобациллезной инфекции в 55 хозяйствах РФ, установлены хозяйства, инфицированные и свободные от
A. pleuropneumoniae. Исследование сывороток крови племенных животных, ввезенных в Российскую Федерацию в 2007-2008 гг., показало отсутствие антител к A. pleuropneumoniae у свиней, импортированных из
Канады и Польши.
Список литературы
1. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. – М.: Мир, 1984. – 480 с.
2. Actinobacillus pleuropneumoniae (APP): a contagious economic threat. – Режим
доступа: http://www.idexx.com.
3. Frey, J. RTX toxins in Pasteurellaceae / J. Frey, P. Kuhnert // Int. J. Med.
Microbiol. – 2002. – Vol. 292. – P. 149-158.
4. Inzana, T. Serotype specificity and immunogenicity of the capsular polymer of
Haemophillus pleuropneumoniae / T. Inzana, B. Mathison // Infect. Immun. – 1987. –
Vol. 55. – P. 1580-1587.
5. Non-pathogenic Actinobacillus isolates antigenically and biochemocally similar to
Actinobacillus pleuropneumoniae: a novel species? / M. Gottschalk, A. Broes, K. Mittal
[et al.] // Vet. Microbiol. – 2003. – Vol. 92. – P. 87-101.
6. Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar
15 / P. Blackall, H. Klassen, H. Bosch [et al.] // Vet. Microbiol. – 2002. – Vol. 84. –
P. 47-52.
7. Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis of A. pleuropneumoniae infection,
development and prevalidation of the ApxIV ELISA / A. Dreyfus, A. Schaller, S. Nivolett
[et al.] // Vet. Microbiol. – 2004. – Vol. 99. – P. 227-238.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
101
USE OF RECOMBINANT ApxIV PROTEIN FOR
SERODIAGNOSTICS OF INFECTION CAUSED BY
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
A.V. Kanshina, A.S. Yakovleva, A.V. Scherbakov
Summary
Recombinant ApxIV A.pleuropneumoniae toxin was produced by
expression in E.coli. Indirect ELISA for detection of A.pleuropneumoniae
antibodies in blood sera samples from pigs was developed on the basis of
recombinant antigen. It was found that specificity and sensitivity of the developed
test against «IDEXX CHEKIT APP-ApxIV» commercial test (IDEXX, USA)
is 100 and 95,7%, respectively. The monitoring of actinobacillosis infection
was conducted in 55 premises of 24 Regions of the Russian Federation,
A.pleuropneumoniae infected and free premises were identified.
УДК: 619:616.98:578.835.1:616-076
ОЦЕНКА И ПРИМЕНЕНИЕ НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
ДЛЯ СЕРОМОНИТОРИНГА ВЕЗИКУЛЯРНОЙ
БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ
Н.Н. Луговская, Е.Н. Харитонова,
С.Р. Кременчугская, В.В. Борисов
Резюме
Разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа (Н-ИФА)
для обнаружения антител к вирусу везикулярной болезни свиней (ВБС).
Аналитическая чувствительность Н-ИФА при исследовании проб сывороток крови экспериментально зараженных свиней с известным вируснейтрализующим титром составила 2,0 log2. Показана эффективность Н-ИФА
при выявлении специфических антител к вирусу ВБС в сравнении с традиционными методами: реакцией микронейтрализации, блокирующим и
конкурентным вариантами ИФА, а также с референтным тестом Ceditest®
SVDV (Cedi-Diagnostics B.V., Нидерланды). Применение Н-ИФА позволяло обнаруживать специфические антитела в пробах сывороток крови сви-
102
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ней на 6 сут. после экспериментального заражения свиней вирусом ВБС. У
свиньи, находившейся в контакте с инфицированными животными, антитела выявляли через 11 сут. после начала эксперимента.
Введение
В настоящее время, когда в отечественном свиноводстве значительно
возрос объем внешнеэкономических связей, огромное значение приобретают меры, направленные на сохранение санитарно-эпидемиологической
безопасности. К таким мерам можно отнести разработку и внедрение простых и надежных скрининговых методов диагностики инфекционных болезней у импортируемых сельскохозяйственных животных.
Особое место в инфекционной патологии свиней занимает везикулярная болезнь (ВБС), которую вызывает РНК-содержащий вирус из рода
энтеровирусов семейства Picornaviridae. Это контагиозная болезнь, поражающая домашних и диких свиней разных возрастов и пород, характеризующаяся острым течением, высокой температурой и образованием везикул на носовом зеркале, в области венчика копытец, межкопытцевой щели
и мякишей. Заболевание часто протекает в легкой форме, однако его опасность состоит в том, что по клиническим признакам оно сходно с другими
инфекционными болезнями свиней, сопровождающимися везикулярным
синдромом, такими, как ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема, в связи с чем ВБС занесена Всемирной организацией здравоохранения животных (OIE) в список болезней, подлежащих обязательному
уведомлению. Принимаются строгие меры борьбы, так как при вспышке
болезни возникает серьёзная угроза маскировки эпизоотии ящура и других везикулярных инфекций свиней (1, 2, 3, 4, 13).
Начиная с 1966 г., когда была зарегистрирована первая вспышка ВБС
в Италии, очаги болезни обнаруживали в разных странах Европы и Азии,
а также в Австралии (7, 9, 11, 12, 14, 15, 16). Территория Российской Федерации считается свободной от ВБС, однако необходим жесткий контроль
при импорте свиней из стран Европы. Эффективность контроля ВБС зависит от быстрого обнаружения инфицированных и контактировавших с
ними животных.
Наиболее распространенный в лабораторной серодиагностике ВБС
блокирующий вариант иммуноферментного анализа (ИФА) при высокой
специфичности и чувствительности имеет ряд существенных недостатков:
длительность постановки, сложность в получении компонентов и стандартизации реакции и в связи с этим, зачастую, низкая воспроизводимость
результатов. Это все вызывает определенные трудности при проведении
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
103
мониторинговых исследований на ВБС. Использование непрямого варианта ИФА (Н-ИФА) позволяет решить эти проблемы, что делает его ценным инструментом при массовом скрининге большого количества проб
сывороток крови. Выявление антител к вирусу ВБС в реакции Н-ИФА также выгодно отличается от традиционных серологических методов, таких
как реакция нейтрализации, реакция связывания комплемента и реакция
диффузной преципитации, простотой и скоростью постановки реакции,
возможностью компьютерной обработки результатов исследований, что
не исключает комплексное использование перечисленных методов для ретроспективной диагностики ВБС.
Целями нашей работы являлись разработка и оценка тест-системы
для выявления антител к вирусу ВБС на основе Н-ИФА, обладающей простотой постановки, высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью, а также сравнение данной реакции с традиционным
блокирующим вариантом ИФА, конкурентным вариантом ИФА, с референтным тестом Ceditest® SVDV (Cedi-Diagnostics B.V., Нидерланды), в
котором используется конкурентный вариант ИФА с моноклональными
антителами, и реакцией микронейтрализации при исследовании проб сывороток крови свиней, экспериментально зараженных вирусом ВБС.
Материалы и методы
Вирус. Антиген вируса ВБС для ИФА получали из вируссодержащей
суспензии вирулентного штамма Одесса 72 (О-72), репродуцированного в
перевиваемой культуре клеток IB-RS-2. Вирусные частицы преципитировали 8% раствором полиэтиленгликоля (м.м. 6000 Д) с добавлением NaCl
до конечной концентрации 0,9% с последующей обработкой хлороформом
и концентрировали ультрацентрифугированием в 300 раз. Перед нанесением на планшеты антиген инактивировали при 56°С в течение 1 часа.
Сыворотки. Исследуемым материалом служили: 43 пробы сывороток
крови от свиней, экспериментально зараженных вирусом ВБС; 22323 пробы сывороток крови от клинически здоровых, не вакцинированных против
ВБС свиней, поступавших из свиноводческих хозяйств РФ с ноября 2007 г.
по январь 2009 г.; лиофилизированные пробы сывороток крови экспериментально зараженных вирусом штамма О-72 свиней разных серий, хранившиеся в музее штаммов лаборатории ящура и везикулярных болезней
ФГУ «ВНИИЗЖ»; гетерологичные пробы сывороток, полученные от свиней после заражения вирусами, вызывающими везикулярные инфекции
(энтеровирус свиней, везикулярная экзантема, ящур); пробы сывороток
против возбудителей других болезней свиней, таких как репродуктивно-
104
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
респираторный синдром, классическая чума, парвовирусная инфекция,
цирковирусная инфекция, болезнь Ауески, трансмиссивный гастроэнтерит и микоплазмоз.
В качестве контрольных сывороток использовали сыворотку крови
свиньи, не имеющую антител к вирусу ВБС (отрицательный контроль),
и сыворотку крови от переболевшей ВБС свиньи (положительный контроль).
Реакция микронейтрализации (РМН). Реакцию микронейтрализации
выполняли, как описано ранее (5, 14). Вируснейтрализующим титром
антител исследуемой пробы сыворотки, выраженным в log2, считали предельное разведение сыворотки, при котором происходила нейтрализация
инфекционного действия 100 ТЦД вируса ВБС в 50% зараженной культуры клеток IB-RS-2. Положительным считали значение титра, соответствующее 5,5 log2.
Непрямой вариант ИФА (Н-ИФА). Реакцию Н-ИФА проводили по
стандартной схеме, как описано ранее (10), с некоторыми модификациями.
Контрольные и исследуемые пробы вносили непосредственно в лунки планшета в разведении 1:20 в повторностях в буферном растворе ТБСТ
(0,02М Трис-НСl, 0,15М NaCl, 0,05% Твин-20), дополненном 5% фетальной сывороткой (ФС-ТБСТ). Антисвиной иммунопероксидазный конъюгат (производство филиала «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН) использовали в рабочем разведении в ФС-ТБСТ 1:2000. Окрашивание производили с помощью субстратной смеси АБТС. Реакцию учитывали с помощью многоканального спектрофотометра. Значения оптической плотности (ОП) контрольных и исследуемых проб переводили в
значение процента позитивности (PР) по формуле:
где ОП – среднее значение оптической плотности исследуемой пробы;
ОП- – среднее значение оптической плотности отрицательного контроля;
ОП+ – среднее значение оптической плотности положительного контроля.
Позитивно-негативный порог (ПНП) для проведения качественного
анализа устанавливали, как описано ранее (10). Значения РР ≥ 20% считали положительными.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
105
Конкурентный вариант ИФА (К-ИФА). Реакцию К-ИФА проводили,
как описано Chénard et al., 1998 (15), и Mackay et al., 2001 (8), с небольшими модификациями.
Значение процента ингибирования (PI) вычисляли по формуле:
где ОП – среднее значение оптической плотности исследуемой пробы;
ОПКА – среднее значение оптической плотности контроля антигена.
Значения РI ≥ 60% считали положительными.
Блокирующий вариант ИФА (Б-ИФА). Реакцию Б-ИФА проводили,
как описано ранее (7, 9, 11), с некоторыми модификациями. Значение
РI ≥ 50% считали положительными.
Референтный тест для выявления антител против вируса ВБС. В
качестве референтного теста для выявления антител против вируса ВБС использовали Ceditest® SVDV (Cedi-Diagnostics B.V., Нидерланды), рекомендованный для использования Всемирной организацией охраны здоровья
животных (OIE). Тест проводили согласно инструкции производителя.
Валидация ИФА. Диагностические специфичность и чувствительность определяли, как описано ранее (10). Диагностическую точность
(ДТ) высчитывали по формуле:
где N1 – количество подтвержденных заведомо положительных проб;
N2 – количество подтвержденных заведомо отрицательных проб;
n – общее количество исследованных проб.
Результаты и обсуждение
Для объективной оценки уровня антител к вирусу ВБС на основе
анализа результатов исследования в Н-ИФА 215 проб сывороток крови
от невакцинированных свиней установили позитивно-негативный порог,
который составил 20%. Это было также подтверждено при изучении распределения значений РР для заведомо положительных на наличие антител к вирусу ВБС и заведомо отрицательных проб. Выборка включала
4045 проб, из которых 50 – пробы сывороток крови от экспериментально
зараженных свиней и 3395 проб – от клинически здоровых свиней. Данные анализа представлены на рис. 1.
106
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Для изучения специфичности и чувствительности Н-ИФА исследовали 33 пробы сывороток крови свиней, из них 14 – содержащих и 19 – не
содержащих антитела к вирусу ВБС. Пробы сывороток были получены
после заражения или иммунизации животных вирусом ВБС или другими
инфекционными агентами. Данные представлены в табл. 1.
Рис. 1. Распределение значений РР для заведомо положительных
на наличие антител к вирусу ВБС и заведомо отрицательных проб
Из данных табл. 1 следует, что реакция имела выраженную специфичность, т.е. гетерологичные пробы демонстрировали значения процента
позитивности (РР), не превышающие отрицательные пороговые значения
(15%), в то время как гомологичные пробы, представляющие собой сыворотки, отобранные после заражения свиней вирусом ВБС, показывали
положительные значения РР (>20%).
Аналитическая чувствительность или предел обнаружения Н-ИФА
для выявления антител к вирусу ВБС при ранее проведенном исследовании проб сывороток с известным вируснейтрализующим титром составила 2,0 log2 (данные не показаны).
Воспроизводимость результатов реакции изучали, тестируя панель
проб сывороток крови свиней к разным возбудителям в нескольких повторностях на одном и двух планшетах (табл. 2). Как показывает анализ
табл. 2, результаты Н-ИФА были воспроизводимы. Значение стандартного отклонения от среднего значения РР для положительных к вирусу
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
107
ВБС проб сывороток не превышало 7%, для отрицательных – 3%. Коэффициент вариаций (CV) значений РР для положительных проб составил
4,0-8,5%, что соответствовало международным стандартам, принятым для
валидации серологических методов OIE. Значение CV для большинства
испытуемых проб, не превышающее 20%, говорит об адекватной воспроизводимости результатов на данной стадии разработки тест-системы (13).
Данную тест-систему использовали при проведении опыта по освежению вируса ВБС штамм О-72 на свиньях. Все пять опытных свиней содержались в одном помещении и находились в постоянном контакте друг
с другом. Двух свиней, обозначенных как 1/1 и 1/2, заражали 10% афтозной суспензией, содержащей не менее 105,0 ТЦД50/мл вируса ВБС. Вирусный материал вводили внутрикожно в венчик копытец и в носовое зеркало
рыла по 0,6-0,7 мл. Первичные афты первого пассажа использовали для
приготовления 10% афтозной суспензии для проведения второго пассажа
на свиньях, обозначенных как 2/1 и 2/2, которых заражали с интервалом
в 2 сут. Кровь у свиней, находившихся в эксперименте, отбирали с интервалом в 2-5 сут. Всего было получено 43 пробы сывороток крови, которые исследовали в непрямом и конкурентном вариантах ИФА. Результаты
исследований сравнивали с результатами, полученными с использованием традиционного блокирующего варианта ИФА и референтного набора
Ceditest SVDV. Данные представлены на рис. 2.
Таблица 1
Исследование проб сывороток крови свиней на наличие антител
к вирусу ВБС в Н-ИФА
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Пробы сывороток крови свиней к
возбудителям
ВБС, б/н, 21 сут. п/з*
ВБС, с.7, 21 сут. п/з
ВБС, с.8, 21 сут. п/з
ВБС, с.10, 21 сут. п/з
ВБС, с.11, 21 сут. п/з
ВБС, б/н, 1:10
ВБС, с.7, 1:10
ВБС, с.7, 1:100
ВБС, с.8, 1:10
ВБС, с.8, 1:100
ВБС, с.10, 1:10
Н-ИФА,
РР, %
1
2
141
76
111
116
148
72
64
41
79
49
86
139
85
119
120
153
70
62
35
76
43
84
Качественная
РМН с
характеристика вирусом ВБС,
проб
log2
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
полож.
>11,0
11,0
>11,0
>11,0
11,0
н/и**
н/и
н/и
н/и
н/и
н/и
108
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
12
13
14
ВБС, с.10, 1:100
ВБС, с.11, 1:10
ВБС, с.11, 1:100
44
82
36
42
87
32
полож.
полож.
полож.
н/и
н/и
н/и
15
Энтеровирус свиней, 21 сут. п/з
12
12
отриц.
<1,0
16
Везикулярная экзантема свиней,
С-72, 21 сут. п/з
-1
1
отриц.
<1,0
17
Везикулярная экзантема свиней,
А-48, 21 сут. п/з
-5
-8
отриц.
<1,0
18
Ящур, О/Приморский/00, 7 сут. п/з
1
5
отриц.
<1,0
19
Ящур, О/Приморский/00, 10 сут. п/з
-8
3
отриц.
<1,0
20
Ящур, О/Приморский/00, 11 сут. п/з
-3
1
отриц.
<1,0
21
Репродуктивно-респираторный
синдром свиней
6
1
отриц.
<1,0
22
Репродуктивно-респираторный
синдром свиней
-8
3
отриц.
<1,0
23
Классическая чума свиней
9
9
отриц.
<1,0
24
Классическая чума свиней
2
-1
отриц.
<1,0
25
Парвовирусная инфекция свиней
-1
1
отриц.
<1,0
26
Цирковирусная инфекция свиней -2
-6
-1
отриц.
<1,0
27
Болезнь Ауески
-8
-7
отриц.
<1,0
28
Трансмиссивный гастроэнтерит
свиней
-7
-6
отриц.
<1,0
29
Трансмиссивный гастроэнтерит
свиней
0
7
отриц.
<1,0
30
Микоплазмоз
(Mycoplasma hyopneumoniae)
-9
-5
отриц.
<1,0
31
Нормальная (отрицательная)
1
-3
отриц.
<1,0
32
Нормальная (отрицательная)
-12
-12
отриц.
<1,0
33
Нормальная (отрицательная)
12
-14
отриц.
<1,0
* п/з – после заражения;
**н/и – не исследовали
Как видно из рис. 2, использование данных тест-систем, основанных
на разных вариантах ИФА, показало их достаточную эффективность при
обнаружении специфических антител к вирусу ВБС в пробах сывороток
крови экспериментально зараженных свиней. В К-ИФА обнаруживали
специфические антитела в среднем на 4-5 сут., Н-ИФА – на 6 сут., в то
109
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
время как в Б-ИФА и Ceditest-ИФА выявляли антитела к вирусу ВБС на
4 сут. после заражения животных вирусом ВБС (животные 1/1 и 1/2).
Однако по своей специфичности первые две реакции не уступали
Ceditest SVDV и Б-ИФА, что было также подтверждено при статистической обработке полученных в ходе исследований данных.
Таблица 2
Исследование воспроизводимости результатов Н-ИФА
для выявления антител к вирусу ВБС
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Пробы сывороток крови свиней
к возбудителям
1 планшет
1
2
Везикулярная болезнь свиней, №1 117
103
Везикулярная болезнь свиней, №2
73
65
Везикулярная болезнь свиней, №3
92
81
Везикулярная болезнь свиней, №4
89
85
Везикулярная болезнь свиней, №5 111
117
Везикулярная болезнь свиней, №6
64
63
Везикулярная болезнь свиней, №7
44
43
Везикулярная болезнь свиней, №8
57
55
Везикулярная болезнь свиней, №9
53
60
Везикулярная болезнь свиней, №10 73
65
Везикулярная болезнь свиней, №11 61
68
Везикулярная болезнь свиней, №12 75
72
Везикулярная экзантема свиней
3
3
Энтеровирус свиней
4
6
Ящур, О/Приморский/00
-4
-7
Респираторно-репродуктивный
-3
-3
синдром свиней
Классическая чума свиней
3
1
Трансмиссивный
гастроэнтерит
-4
-6
свиней
Парвовирусная инфекция свиней
-5
-5
Цирковирусная инфекция свиней-2 -8
-4
Болезнь Ауески
-5
-1
Микоплазмоз
-1
-2
(Mycoplasma hyopneumoniae)
Проба нормальной сыворотки
0
2
свиньи
Н-ИФА, РР, %
2 планшет
сред.+
1
2
ст.откл.
114
109 110,75±6,1
69
64 67,75±4,1
86
83
85,5±4,8
89
83
86,5±3
104
102 108,5±6,9
68
62 64,25±2,6
50
49
46,5±3,5
62
57
57,75±3
63
60
59±4,2
76
64
69,5±5,9
63
66
64,5±3,1
72
79
74,5±3,3
5
5
4±1,2
9
8
6,75±2,2
-4
-3
-4,5±1,7
2
1
-0,75±2,6
2
4
2,5±1,3
-4
-5
-4,75±0,96
-2
-5
-3
-5
-6
-4
-4,2±1,5
-5,75±1,7
-3,25±1,7
0
0
-0,75±0,96
-3
0
-0,25±2,1
110
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Рис. 2. Выявление специфических антител в пробах сывороток
крови экспериментально зараженных вирусом ВБС (1/1, 1/2, 2/1, 2/2)
и контактных (контроль) свиней в ИФА
(■ – Ceditest, ▲ – К-ИФА, ♦ – Б-ИФА, × – Н-ИФА) и РМН
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
111
У животных 2/1 и 2/2, находившихся до заражения в контакте с инфицированными свиньями в течение 4 сут., специфические антитела обнаруживали на 2 сут. после заражения в Ceditest, Б-ИФА и К-ИФА, а в Н-ИФА –
на 4-5 сут. У контактной свиньи антитела к вирусу ВБС выявляли во всех
четырех реакциях на 11 сут. (рис. 2), что доказывает контактную передачу
вируса от зараженных свиней.
По данным Reid et al. (15), при экспериментальном заражении свиней культуральной вирусной суспензией, содержащей вирус ВБС штамм
UKG 27/72 в титре 107,0 ТЦД50/мл, обнаруживали специфические антитела
в конкурентном варианте ИФА с использованием моноклональных антител (5В7 МАС ELISA) на 4 сут. после заражения, а у контактных свиней –
на 8-10 сут.
Ko et al. (12) при тестировании проб сывороток крови свиней, инфицированных тремя разными штаммами вируса ВБС, в К-ИФА, основанном
на применении моноклональных антител к вирусу ВБС 3Н10, меченных
биотином, и рекомбинатного антигена, состоящего из вирусоподобных
частиц (VLP-ELISA), детектировали раннюю выработку антител на 3 сут.
после заражения.
При подсчете диагностической чувствительности установлено, что
реакция К-ИФА не уступала по данному показателю Ceditest и Б-ИФА
(90,5%), в отличие от Н-ИФА, диагностическая чувствительность которого для тестируемых проб была несколько ниже и составила 85,7%.
Однако более низкая чувствительность Н-ИФА компенсировалась
высокой диагностической специфичностью – 99,2%, и точностью реакции – 95,7%.
При сопоставлении рассматриваемых тест-систем с референтным набором подсчитывали согласованность тестов по методу капа-статистики
(6). Значение k-критерия составило для К-ИФА – 0,97, для Н-ИФА – 0,98,
что показало хорошую согласованность данных методов с референтным.
При параллельном тестировании сывороток в РМН, К-ИФА и Н-ИФА
полученные результаты также были сопоставимы, и корреляция с результатами РМН составила 0,68 и 0,66, соответственно.
Не очень высокие значения коэффициента корреляции связаны, вероятно, с тем, что в РМН и данных вариантах ИФА выявляли разный спектр
специфических антител к вирусу ВБС: в РМН – только вируснейтрализующие, в ИФА – все вирусспецифические антитела.
При сравнении схем постановки реакции наиболее быстрой, простой
и воспроизводимой оказалась реакция Н-ИФА. Эта реакция удобна при
первичном скрининге большого количества сывороток. Результаты реак-
112
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ции хорошо согласовывались с результатами РМН, референтного теста
Ceditest® SVDV, Б-ИФА и К-ИФА, что позволило включить данную тестсистему в схему мониторинговых исследований на ВБС, которая состояла
из следующих этапов:
– первичный скрининг сывороток крови свиней в Н-ИФА и/или
К-ИФА;
– тестирование сомнительных проб в референтной тест-системе;
– подтверждение результатов в РМН;
– при получении положительных результатов во всех трех реакциях –
повторные исследования парных проб сывороток крови от этих животных
через 2-3 недели.
В представленном варианте Н-ИФА исследовали 22323 пробы сывороток крови от клинически здоровых свиней, не вакцинированных против ВБС.
Из исследованных в Н-ИФА проб 99,4% проб имели отрицательные значения РР (<15%), что свидетельствовало об отсутствии в них специфических
антител к вирусу ВБС; 0,58% показали сомнительный результат. Все подозрительные пробы повторно исследовали в Н-ИФА для исключения технической
ошибки. Затем пробы, сомнительный результат которых был подтвержден,
тестировали в референтной тест-системе Ceditest® SVDV и РМН.
Данная схема проверки сывороток крови свиней на наличие специфических антител показала свою эффективность и рекомендована для использования при проведении мониторинговых исследований на ВБС.
Заключение
Таким образом, разработанный вариант непрямого иммуноферментного
анализа для выявления антител к вирусу везикулярной болезни свиней имел
выраженную специфичность и чувствительность. Использование данного варианта ИФА позволило дифференцировать антитела к вирусу ВБС от антител
к другим инфекционным возбудителям, в том числе к вирусам, вызывающим
везикулярный синдром у свиней, таким, как вирусы ящура и везикулярной
экзантемы, энтеровирус, и получать воспроизводимые результаты.
Список литературы
1. Бакулов, И.А. Новая форма везикулярных болезней свиней и меры ее профилактики / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Международный сельскохозяйственный
журнал. – 1975. – № 6. – С. 87-90.
2. Инфекционная патология животных: в 2-х т. / под ред. А.Я. Самуйленко,
Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. Т. 1. [Вирусные инфекции]. –
М.: Академкнига, 2006. – 911 с.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
113
3. Малярец, П.В. Везикулярная болезнь свиней / П.В. Малярец, И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Сельское хозяйство за рубежом. Животноводство. – 1973. –
№ 9. – С. 29-34.
4. Особенности культивирования возбудителей везикулярной болезни свиней
и изучение иммунологического родства штаммов вируса / Л.Н. Соколов, В.К. Спирин, А.И. Егорова, В.А. Мищенко // Вет. медицина: мiжвiд. тем. наук. зб. – Харкiв,
2003. – Т. 82, С. 528-531.
5. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко,
Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – М.: «Колос», 1999. – 272 с.
6. Челышева, М.В. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка Р65 для определения антител к Mycoplasma hyopneumoniae
/ М.В. Челышева, А.В. Щербаков // Вет. патология. – 2006. – Т. 4, № 19. –
С. 109-113.
7. Armstrong, R.M. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the
detection and quantification of antibodies against swine vesicular disease virus (SVDV)
/ R.M. Armstrong, I.T. Barnett // J. Virol. Methods. – 1989. – Vol. 25. – P. 71-79.
8. A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth
disease virus / D.K.J. Mackay, A. Naci Bulut, T. Rendle [et. al.] // J. Virol. Methods. –
2001. – Vol. 97, No. 1-2. – P. 33-48.
9. Dekker, A. Validation of a screening liquid phase blocking ELISA for swine
vesicular disease / A. Dekker, P.L. Moonen, C. Terpstra // J. Virol. Methods. – 1995. –
Vol. 51. – P. 343-348.
10. Detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus by a
recombinant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay /
N.N. Lugovskaya, A.V. Scherbakov, A.S. Yakovleva [et. al.] // J. Virol. Methods. –
2006. – Vol. 135. – P. 292–296.
11. Kitching, R.P. Rapid correlation between field isolates and vaccine strains
of foot-and-mouth disease virus / R.P. Kitching, R. Rendle, N.P. Ferris // Vaccine. –
1988. – Vol. 6. – P. 403-408.
12. Noninfectious virus-like particle antigen for detection of swine vesicular disease
virus antibodies in pigs by enzyme-linked immunosorbent assay / Y.-J. Ko, K.-S.
Choi, J.-J. Nah [et. al.] // Clinic. Diagn. Labor. Immunol. – 2005. – Vol. 12, No. 8. –
P. 922-929.
13. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals,
Birds and Bees). Vol. 1-2. Chapter 1.1.4.; 2.8.9. – Paris, 2008. – P. 34-45; 1139-1145.
14. Radial immunodiffusion and serum neutralization techniques for the assay of
antibodies to SVD / S.M. Golding, R.S. Hedger, P. Talbot, J. Watson // Res. Vet. Sci. –
1976. – Vol. 40. – P. 142-147.
15. Use of automated real-time reverse transcription-polimerase chain
reaction (RT-PCR) to monitor experimental swine vesicular disease virus infection in
pig / S.M. Reid, D.J. Paton, G. Wilsden [et. al.] // J. Comp. Pathol. – 2004. – Vol. 131. –
P. 308-317.
114
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
16. Validation of a monoclonal antibody-based ELISA to detect antibodies directed
against swine vesicular disease virus / G. Chénard, M. Bloemraad, J.A. Kramps [et. al.]
// J. Virol. Methods. – 1998. – Vol. 75, № 1. – P.105-112.
ASSESSMENT AND USE OF INDIRECT ELISA FOR
SEROMONITORING OF SWINE VESICULAR DISEASE
N.N. Lugovskaya, Ye.N. Kharitonova,
S.R. Kremenchugskaya, V.V. Borisov
Summary
The indirect ELISA for detection of antibodies to swine vesicular disease
(SVD) was developed. The analytical sensitivity of indirect ELISA at testing
of blood sera samples from experimentally infected pigs with a known virusneutralizing titre was 2.0 log2. The efficacy of indirect ELISA for detection of
specific antibodies to swine vesicular disease was shown in comparison with
conventional methods: microneutralisation test, blocking and competitive ELISA
as well as reference test Ceditest ® SVDV (Cedi-Diagnostics B.V., Netherlands).
The use of ELISA made it possible to detect specific antibodies in blood
sera samples from pigs at day 6 after experimental infection of pigs with
swine vesicular disease virus. One pig that contacted with infected animals
demonstrated antibodies 11 days after the experiment started.
УДК 619:578.823.91:636.22/.28:616-079.4
АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА РОТАВИРУСОВ: ОБЗОР
С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова, В.А. Мищенко
Резюме
Ротавирусы являются одной из наиболее частых причин диареи у молодняка сельскохозяйственных животных. Многие методы диагностики
ротавирусной инфекции, а также средства ее профилактики базируются на антигенных свойствах ротавирусов. В обзоре рассмотрены вопросы антигенной характеристики ротавирусов, классификации антигенных
свойств ротавирусов и антигенной характеристики российских изолятов
ротавирусов крупного рогатого скота.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
115
Введение
Ротавирусы относятся к семейству Reoviridae, роду Rotavirus. Представители данного рода имеют сферическую форму. При исследовании с
помощью электронного микроскопа они напоминают колесо с широкой
ступицей, отходящими от него короткими спицами и четко очерченным
гладким ободом (24). Название рода было предложено на основании
этого сходства (от лат. rota – колесо) (25). Геном ротавирусов состоит из
11 сегментов двухцепочечной РНК и заключен в трехслойный капсид, не
имеющий липидной оболочки. Наружный капсидный слой представлен
в основном белком VP7, образующим внешнюю гладкую поверхность
вириона. Из этой поверхности выступают шипы, являющиеся димерами
белка VP4. Средний капсидный слой содержит белок VP6 и составляет
51% от массы всего вириона. Сердцевина вириона состоит из белков VP1,
VP2 и VP3 (12).
Все ротавирусы делят на группы согласно их антигенным свойствам
в таких реакциях, как, например, иммунофлюоресценция, ИФА, иммунная электронная микроскопия (17). Ротавирусы, принадлежащие к разным
группам, не имеют антигенного родства. В настоящее время насчитывают
до 7 групп ротавирусов. Они маркируются буквами от А до G (5, 29). Ротавирусы разных групп не имеют внешних структурных различий и отличаются друг от друга только антигенными свойствами. Считается, что
групповые антигенные детерминанты присутствуют на всех структурных
белках, но в основном групповая специфичность обуславливается белком
VP6 вследствие его преобладания в вирионе (18).
Ротавирусы группы А обнаружены практически у всех видов млекопитающих и птиц, которые были исследованы (17). Ротавирусы других
групп менее распространены. Ротавирусы группы В выделены от свиней,
крупного рогатого скота и овец. Ротавирусы группы С встречаются у свиней и крупного рогатого скота. Ротавирусы групп D, F и G найдены только
у кур, а ротавирусы группы E – только у свиней (6). Несмотря на такое
групповое разнообразие, подавляющее большинство ротавирусов, обнаруживаемых у животных с симптомом диареи, относится к группе А.
При более детальном анализе антигенных свойств ротавирусы группы А иногда классифицируют на подгруппы. При этом выделяют 4 подгруппы: I, II, I+II, не I и не II (4, 17). Однако такая классификация не имеет
широкого применения.
Ротавирусы группы А, кроме того, классифицируют на серотипы. В
типичном случае это делают по результатам двусторонней реакции ней-
116
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
трализации. При этом считается, что два вируса относятся к разным серотипам, если имеется двадцатикратная и более разница между титрами
гомологичных и гетерологичных нейтрализующих антител (20).
Ротавирусы, как и все вирусы с сегментированным геномом, способны к так называемой реассортации геномных сегментов, когда в одной
клетке оказывается сразу два вириона, и получившиеся в процессе репликации дочерние вирионы могут содержать различные комбинации геномных сегментов родительских вирионов. К реассортации способны только
представители одной группы (17).
Каждый геномный сегмент ротавируса содержит один ген, кодирующий один белок. Нейтрализующие антитела направлены к двум поверхностным протеинам – VP4 и VP7 (21). Эти белки кодируются разными
генами, расположенными на разных геномных сегментах. Каждый белок
имеет свои антигенные свойства. Причем у разных вирусов свойства каждого белка различны. Вследствие реассортации геномных сегментов у ротавирусов могут встречаться практически любые комбинации белков VP4
и VP7. То есть антигенные свойства белка VP4 никак не связаны c антигенными свойствами белка VP7.
В связи с этим антигенные свойства поверхностных белков VP4 и
VP7 рассматривают отдельно друг от друга, и для характеристики ротавирусов была принята бинарная классификация серотипов. Так, серотип, обусловленный антигенной специфичностью белка VP4, получил название
Р-серотип (от англ. protease sensitive), а серотип, обусловленный белком
VP7, – G-серотип (от англ. glycoprotein) (17). А само явление, при котором
могут возникать различные комбинации P- и G-серотипов, получило название «независимая сегрегация серотипов» (30).
В настоящее время на основании результатов реакции нейтрализации
выделяют 14 G-серотипов и 11 Р-серотипов (12).
В связи с наличием бинарной классификации определение серотипов
классическим способом с помощью реакции нейтрализации затруднено,
поскольку G- и Р-серотипы как бы маскируют друг друга. Другой возможный способ определения серотипов основан на использовании моноклональных антител. Антитела, полученные к белку с определенной серотипспецифичностью, реагируют со штаммами того же серотипа. Этот способ
быстрее реакции нейтрализации. Однако было показано, что до 30% полевых изолятов не удается типировать этим методом (28).
В ряде исследований было установлено, что нуклеотидные последовательности гена VP4 у штаммов одного Р-серотипа отличаются друг
от друга, как правило, не более чем на 11% (19). Аналогичные цифры
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
117
получены для гена VP7 штаммов, относящихся к одному G-серотипу
(7). При строгом соблюдении терминологии, с помощью анализа нуклеотидных последовательностей биологические объекты можно классифицировать только на генотипы. Однако в данном случае было показано, что ротавирусы, относящиеся к одному и тому же генотипу, с
другой стороны, относятся к одному и тому же серотипу. Поэтому многие авторы на основании только молекулярно-биологических исследований делают вывод о серотипе ротавируса (8, 16, 27).
Стоит заметить, что на основании анализа генома описано
15 G-генотипов и, как минимум, 20 Р-генотипов (17). То есть серологические исследования штаммов ротавирусов не успевают за молекулярнобиологическими.
Помимо этого, анализ последовательностей штаммов разных G- и
P-серотипов позволил выявить участки нуклеотидных последовательностей, характерные для вирусов каждого конкретного серотипа. Если
к этим участкам подобрать соответствующие олигонуклеотиды, то с помощью полимеразной цепной реакции можно амплифицировать участки
генов VP4 и VP7 (8, 11, 13, 15, 23). Поскольку расположение олигонуклеотидов подбирается таким образом, что каждому исследуемому серотипу
соответствует фрагмент кДНК определенной длины, то в одной реакции
по длине фрагмента можно определять сразу несколько серотипов.
Дополнительным преимуществом молекулярно-биологических методов характеристики ротавирусов является то, что они позволяют определять серотипы ротавирусов очень быстро.
Как правило, ротавирусы, поражающие животных определенного
вида, относятся к ограниченному набору серотипов. Например, крупный
рогатый скот чаще всего поражается ротавирусами G-серотипов 6, 8 и 10
и Р-серотипов 1, 5 и 11 (3, 9, 14, 28, 32); ротавирусы свиней чаще всего
относятся к G-серотипам 4, 5 и 11 и Р-серотипам 6 и 7 (13) и т.д. Однако
эти закономерности распределения серотипов ротавирусов по животнымхозяевам соблюдаются нестрого, возможно, из-за того, что эти вирусы
сравнительно легко преодолевают межвидовые барьеры, и у различных
животных часто выявляют ротавирусы «нетипичных» серотипов. Так, например, в Германии от теленка был выделен штамм, характеризующийся
G- и Р-серотипами, обычными для ротавирусов птиц (16).
В ФГУ «ВНИИЗЖ» были разработаны методы определения G- и
Р-серотипов ротавирусов крупного рогатого скота на основе нуклеотидного
секвенирования и полимеразной цепной реакции. Нами было исследовано
около 30 полевых изолятов ротавирусов крупного рогатого скота, выявлен-
118
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ных в материалах, поступавших из различных хозяйств европейской части
Российской Федерации, где отмечались вспышки диареи у молодняка (1, 2).
В табл. 1 и 2 представлены данные, полученные нами, в сравнении с
результатами других исследователей из разных регионов мира. Как видно из
таблиц, в распределении ротавирусов крупного рогатого скота по серотипам
прослеживаются определенные закономерности. Практически во всех регионах мира ротавирусы крупного рогатого скота в антигенном отношении ограничены определенным кругом серотипов. Интересное исключение представляют 3 изолята, выявленные на территории Российской Федерации и охарактеризованные с помощью анализа генома как ротавирусы серотипа Р7. Все
описанные на данный момент зарубежные штаммы ротавирусов серотипа Р7
выделены от свиней. Преобладающими серотипами ротавирусов крупного
рогатого скота как у нас, так и за рубежом являются серотипы G6 и P5.
Таблица 1
Частота встречаемости ротавирусов крупного рогатого скота
различных Р-серотипов (%)
Регион
США (9)
США (8)
Япония (26)
Япония (31)
Япония (22)
Россия (2)
Р1
2,2
1,2
10
0
11,2
3,7
Р5
20,4
64
52,5
67,1
45,8
48,1
Серотипы
P7
НТ*
НТ
НТ
НТ
НТ
11,1
Р11
9,3
28
25
26,3
40,9
33,3
*НТ – не тестировался
Таблица 2
Частота встречаемости ротавирусов крупного рогатого скота
различных G-серотипов (%)
Регион
Великобритания (28)
США (3)
США (8)
Канада (10)
Япония (22)
Япония (26)
Россия (1)
*НТ – не тестировался
G6
66
58
73,2
51,3
59,1
70
47
Серотипы
G8
0,6
НТ*
7,0
НТ
0,7
НТ
30
G10
7,4
18
19,8
33,7
38,1
17,5
19
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
119
Таким образом, представители рода Rotavirus являются в антигенном отношении чрезвычайно разнообразными. Ротавирусы разных
групп вообще не проявляют между собой антигенного родства. В то время как другие вирусы, относящиеся к разным родам, порой имеют такое
родство, например, вирус диареи крупного рогатого скота и вирус классической чумы свиней. Ротавирусы только одной группы А классифицируются на 14 G- и 11 Р-серотипов (а генотипов еще больше), которые к
тому же могут сочетаться в различных комбинациях. Ротавирусы других
групп еще мало изу-чены и, вероятно, по мере изучения их также будут
классифицировать на серотипы.
Список литературы
1. Аянот, П.К. Использование ПЦР и сравнительного анализа нуклеотидной
последовательности гена VP7 для выявления ротавирусов крупного рогатого скота и определения их G-серотипов / П.К. Аянот, С.А. Чупин, Г.Н. Дороненкова,
В.А. Кудрявцев // Молекул. генетика. – 2003. – № 2. – С. 25-32.
2. Чупин, С.А. Применение ПЦР для определения Р-типов ротавирусов КРС /
С.А. Чупин, В.А. Кудрявцев, Г.Н. Дороненкова, П.К. Аянот // Актуал. пробл. патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: матер. конф. молодых ученых. – Владимир, 2002. – С. 106-113.
3. A novel group A rotavirus G serotype: serological and genomic characterization of
equine isolate F123 / G.F. Browning, T.A. Fitzgerald, R.M. Chalmers, D.R. Snodgrass //
J. Clin. Microbiol. Rev. – 1991. – Vol. 29, N 9. – P. 2043-2046.
4. A survey of G6 and G10 serotypes of group A bovine rotaviruses from diarrheic
beef and dairy calves using monoclonal antibodies in ELISA / A. Lucchelli, S.Y. Kang,
M.K. Jayasekera [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. – 1994. – Vol. 6. – P. 175-181.
5. Antigenic characterization of human and animal rotaviruses by immune adherence
hemagglutination assay (IAHA): evidence for distinctness of IAHA and neutralization
antigens / A.Z. Kapikian, W.L. Cline, H.B. Greenberg [et al.] // Infect. Immun. –
1981. – Vol. 33. – P. 415-425.
6. Bridger, J.C. Non-group A rotaviruses / J.C. Bridger // Viral Infections of
the Gastrointestinal Tract / ed. by A.Z. Kapikian. – 2nd ed. – New York, 1994. –
P. 369-408.
7. Bridger, J.C. Novel rotaviruses in animals and man / J.C. Bridger // Novel
Diarrhoea Viruses. – Chichester, 1987. – P. 5-23.
8. Chang, K.O. The characterization of VP7 (G type) and VP4 (P type) genes of
bovine group A rotaviruses from field samples using RT-PCR and RFLP analysis /
K.O. Chang, A.V. Parwani, L.J. Saif // Arch. Virol. – 1996. – Vol. 141. – P. 1727-1739.
9. Characterization of field strains of group A bovine rotaviruses by using polymerase
chain reaction-generated G and P type-specific cDNA probes / A.V. Parwani, H.A. Hussein,
B.I. Rosen [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1993. – Vol. 31, N 8. – P. 2010-2015.
120
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
10. Comparison of polymerase chain reaction and monoclonal antibodies for
G-typing of group A bovine rotavirus directly from fecal material / H.A. Hussein,
E. Frost, B. Talbot [et al.] // Vet. Microbiol. – 1996. – Vol. 51. – P. 11-17.
11. Determination of bovine rotavirus G and P serotypes by polymerase chain
reaction / Y. Isegawa, O. Nakagomi, T. Nakagomi [et al.] // Mol. Cel. Probes. – 1993. –
Vol. 7. – P. 277-284.
12. Estes, M.K. Rotaviruses and their replication / M.K. Estes // Fields Virology / ed.
B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley. – 3rd ed. – Philadelphia, 1996. – P. 1625-1655.
13. Gouvea, V. Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR /
V. Gouvea, N. Santos, M.C. Timenetsky // J. Clin. Microbiol. – 1994. – Vol. 32, N 5. –
P. 1338-1340.
14. Identification of four VP4 serological types (P serotypes) of bovine rotavirus
using viral reassortants / D.R. Snodgrass, Y. Hoshino, M. Fitzgerald [et al.] // J. Gen.
Virol. – 1992. – Vol. 73. – P. 2319-2325.
15. Identification of human and bovine rotavirus serotypes by polymerase chain
reaction / K. Taniguchi, F. Wakasugi, Y. Pongsuwanna [et al.] // Epidemiol. Infect. –
1992. – Vol. 109. – P. 303-312.
16. Isolation of avianlike group A rotavirus from a calf with diarrhea / H. Brussow,
O. Nakagomi, G. Gerna, W. Eichhorn // J. Clin. Microbiol. – 1992. – Vol. 30. –
P. 67-73.
17. Kapikian, A.Z. Rotaviruses / A.Z. Kapikian, R.M. Chanock // Fields Virology / ed.
B.N. Fields, D.M. Knipe., P.M Howley. – 3rd ed. – Philadelphia, 1996. – P. 1657-1708.
18. Liu, M. Identification of the simian rotavirus SA11 genome segment 3 product /
M. Liu, P.A. Offit, M.K. Estes // Virology. – 1988. – Vol. 163. – P. 26-32.
19. Molecular and antigenic analyses of serotypes 8 and 10 of bovine rotaviruses in
Thailand / K. Taniguchi, T. Urasawa, Y. Pongsuwanna [et al.] // J. Gen. Virol. – 1991. –
Vol. 72. – P. 2929-2937.
20. Nomenclature of human rotaviruses: designation of subgroups and serotypes //
Bul. WHO. – 1984. – Vol. 62, N 3. – P. 501-503.
21. Offit, P.A. Identification of the two rotavirus genes determing neutralization
specificities / P.A. Offit, G. Blavat // J. Virol. – 1986. – Vol. 57, N 1. – P. 376-378.
22. Okada, N. Bovine rotavirus G and P types and sequence analysis of the VP7 gene
of two G8 bovine rotaviruses from Japan / N. Okada, Y. Matsumoto // Vet. Microbiol. –
2002. – Vol. 84. – P. 297-305.
23. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid
from stool specimens / V. Gouvea, R.I. Glass, P. Woods [et al.] // J. Clin. Microbiol. –
1990. – Vol. 28, N 2. – P. 276-282.
24. Relation between viruses from acute gastroenteritis of children and new born calves
/ T.H. Flewett, A.S. Bryden, H.A. Savies [et al.] // Lancet. – 1974. – Vol. 2. – P. 61-63.
25. Relative frequencies of G (VP7) and P (VP4) serotypes determined by
polymerase chain reaction assays among Japanese bovine rotaviruses isolated in cell
culture / Y. Suzuki, T. Sanekata, M. Sato [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1993. – Vol. 31,
N 11. – P. 3046-3049.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
121
26. Restriction endonuclease analysis of the VP7 genes of human and animal
rotaviruses / V. Gouvea, C. Ramirez, B. Li [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1993. – Vol. 31,
N 4. – P. 917-923.
27. Rotavirus serotypes 6 and 10 predominate in cattle / D.R. Snodgrass, T. Fitzgerald,
I. Campbell [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1990. – Vol. 28, N 3. – P. 504-507.
28. Saif, L.J. Nongroup A rotaviruses of humans and animals / L.J. Saif, B. Jiang //
Rotaviruses / ed. R.F. Ramig. – Berlin; Heidelberg, 1994. – P. 339-371.
29. Taniguchi, K. Independent segregation of the VP4 and the VP7 genes in bovine
rotaviruses as confirmed by VP4 sequence analysis of G8 and G10 bovine rotavirus
strains / K. Taniguchi, T. Urasawa, S. Urasawa // J. Gen. Virol. – 1993. – Vol. 74,
Pt. 6. – P. 1215-1221.
30. The distribution of G and P types within isolates of bovine rotavirus in Japan /
H. Ishizaki, T. Sakai, T. Shirahata [et al.] // Vet. Microbiol. – 1996. – Vol. 48. – P. 367-372.
31. Three-dimensional structure of rotavirus / B.V. Prasad, G.J. Wang, J.P. Clerx,
W. Chiu // J. Mol. Biol. – 1988. – Vol. 199. – P. 269-275.
32. Two-way cross-neutralization mediated by a shared P (VP4) serotype between
bovine rotavirus strains / Y. Matsuda, Y. Isegawa, G.N. Woode [et al.] // J. Clin.
Microbiol. – 1993. – Vol. 31, N 2. – P. 354-358.
ANTIGENICITY OF ROTAVIRUSES: OVERVIEW
S.A. Chupin, L.B. Prokhvatilova, V.A. Mischenko
Summary
Rotaviruses are one of the most common causes of diarrhea in young
farm animals. Many methods for diagnosis of rotavirus infection as well as
its preventive agents are based on rotavirus antigenicity. The overview deals
with issues of rotavirus antigenicity, classification of rotavirus antigenicity and
antigenic characteristics of Russian bovine rotavirus isolates.
122
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
УДК 619:616.98:579.887.111:636.4
РЕЗУЛЬТАТЫ МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИИ,
ОБУСЛОВЛЕННОЙ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE,
В СВИНОВОДЧЕСКИХ ХОЗЯЙСТВАХ
И ДИКОЙ ФАУНЕ РОССИИ
М.В. Челышева, А.М. Тимина, Е.С. Орлова, А.В. Щербаков
Резюме
Проведен мониторинг микоплазменной инфекции в свиноводческих
хозяйствах и дикой фауне России. Результаты серомониторинга показали,
что M. hyopneumoniae циркулирует в 74 из 132 обследованных хозяйств
РФ. Методом ПЦР M. hyopneumoniae обнаружена в 21% проб патологического материала от свиней с респираторной патологией. Установлено, что
племенные свиньи, ввезенные в Россию в 2005-2008 гг. из Канады, Эстонии, Чехии и Ирландии, серонегативны к M. hyopneumoniae. У животных,
импортированных из Литвы, Великобритании, Германии, Венгрии, Франции, Испании и Дании, обнаружены антитела к данному виду микоплазм.
Показано, что M. hyopneumoniae широко распространена в популяции диких кабанов Центрального федерального округа РФ.
Введение
Mycoplasma hyopneumoniae является этиологическим агентом энзоотической пневмонии свиней – хронического респираторного заболевания
животных всех возрастов, характеризующегося лихорадкой, катаральной
пневмонией, сухим кашлем, отставанием в росте и развитии поросят (5, 8).
В условиях современного промышленного свиноводства энзоотическая пневмония как самостоятельное заболевание встречается редко, а
M. hyopneumoniae вместе с другими патогенами вирусной и бактериальной природы участвует в развитии так называемого «комплекса респираторных болезней свиней» (4, 6, 8).
Лабораторная диагностика микоплазменной инфекции основана на
обнаружении у больных животных микоплазмы или антител к ней. Ранее
нами были разработаны методы обнаружения M. hyopneumoniae: полимеразная цепная реакция и непрямой вариант иммуноферментного анализа
для выявления антител к M. hyopneumoniae (2, 3).
Цель данной работы заключалась в изучении ситуации по микоплазменной инфекции в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне России с
использованием этих методов.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
123
Материалы и методы
Патологический материал. В работе использовали свежие или замороженные кусочки лёгких от свиней с респираторными нарушениями, а также
материал от клинически здоровых животных. Кроме этого, использовали
пробы внутренних органов от диких кабанов из охотхозяйств России.
Сыворотки крови свиней. Использовали сыворотки крови от клинически здоровых или подозреваемых в заболевании свиней разных возрастных групп, полученные из свиноводческих хозяйств различных регионов
России, сыворотки крови от диких кабанов из охотхозяйств РФ, а также
сыворотки крови свиней, завезенных в свиноводческие хозяйства России
из Канады, Англии, Дании, Польши, Эстонии, Литвы, Чехии, Германии,
Венгрии, Ирландии, Франции и Испании.
ПЦР. Обнаружение M. hyopneumoniae и других патогенов в пробах
органов свиней и диких кабанов методом ПЦР проводили в соответствии
с методическими указаниями, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» и
утвержденными Россельхознадзором (3).
ИФА. Сыворотки крови исследовали на наличие антител к
M. hyopneumoniae в непрямом варианте ИФА, как описано ранее (2). Для
подтверждения положительных результатов сыворотки выборочно исследовали в наборе «M. hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США).
Результаты и обсуждение
Использование полимеразной цепной реакции для исследования патологического материала от свиней. Чтобы определить роль
M. hyopneumoniae в респираторной патологии свиней с использованием ПЦР, было исследовано более 600 образцов патологического материала, полученных из различных свиноводческих хозяйств РФ. Пробы были получены в период 2005-2008 гг. от свиней с поражениями
респираторного тракта из 151 хозяйства 42 регионов РФ. Среди них
были крупные свинокомплексы, средние и небольшие фермы, а также
частные хозяйства.
Поводом для исследований служили любые нарушения со стороны
респираторной системы у свиней разного возраста. Например, частое затрудненное дыхание, сухой кашель, усиливающийся при смене положения тела, незначительная лихорадка, удушье в сочетании с ухудшением
аппетита и отставанием в росте, истощением и анемией. Для анализа отбирали образцы ткани, имеющие характерные макроскопические изменения: серозно-катаральные очаги воспаления в верхушечных и средних
124
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
долях легких, отек паренхимы легких, бронхи с признаками воспаления,
увеличенные регионарные лимфоузлы.
Рис. Видовое соотношение микоплазм у свиней
с респираторным синдромом
Параллельно пробы патологического материала исследовали на наличие M. hyorhinis, также часто участвующей в развитии респираторной
патологии. Проведенный нами анализ ситуации показал, что в российских
свиноводческих хозяйствах у поросят с респираторными заболеваниями в
42,2% случаев обнаруживали патогенные микоплазмы: M. hyopneumoniae
была выявлена в 9,1% проб, а M. hyorhinis – в 21%. При этом в 12,1%
исследованных образцов патологического материала оба этих вида были
выявлены одновременно (см. рис.).
При исследовании различных возрастных групп животных – от новорожденных поросят до свиноматок – выявили зависимость частоты обнаружения M. hyopneumoniae в патматериале от возраста животных.
У свиней с респираторной патологией M. hyopneumoniae наиболее часто обнаруживали у поросят в послеотъёмный период (возраст 2-4 мес.)
и в период откорма (4-6 мес.): 26,6 и 24,2%, соответственно. У больных
животных в возрасте старше 6 мес. M. hyopneumoniae была выявлена в
16,3% случаев. Частота выявления M. hyopneumoniae у поросят-сосунов с
респираторной патологией была значительно меньше. Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о том, что респираторные
заболевания, ассоциированные с M. hyopneumoniae, присущи главным образом поросятам послеотъёмного периода и периода откорма, что согласуется с данными иностранной литературы (6, 7).
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
125
Необходимо отметить, что в наших исследованиях практически не было
хозяйств, где M. hyopneumoniae была бы обнаружена в качестве единственного инфекционного агента. Все исследованные случаи респираторных заболеваний имели форму смешанной инфекции. Наряду с M. hyopneumoniae
в материале от больных поросят часто обнаруживали вирус репродуктивнореспираторного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа и различные бактерии: Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae,
Haemophilus parasuis, Streptococcus suis и другие. По данным зарубежных
исследователей, ярко выраженные клинические признаки болезни развиваются у молодняка свиней при одновременном заражении M. hyopneumoniae
и вирусом РРСС, M. hyopneumoniae и ЦВС2 или M. hyopneumoniae и вирусом
гриппа свиней (4, 6). Другие авторы (5) предполагают, что M. hyopneumoniae
индуцирует замедленное формирование неполноценного иммунного ответа, и животные становятся восприимчивыми к развитию вторичных инфекций, вызываемых Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus
pleuropneumoniae и т.д. Наши исследования подтвердили, что респираторные заболевания свиней в хозяйствах РФ являются результатом совместного действия M. hyopneumoniae с другими патогенами.
В табл. 1 приведены результаты обследования нескольких свинокомплексов, в которых у свиней с респираторной патологией была выявлена
M. hyopneumoniae. Как видно из табл. 1, во всех случаях в лёгких поросят
одновременно с M. hyopneumoniae обнаруживали другие инфекционные
агенты вирусной и бактериальной природы. Практически в каждом случае
выявляли ЦВС2 и бактерии семейства Pasteurellaceae. Очень часто обнаруживали вирус РРСС. В одном из хозяйств Белгородской области был
выявлен вирус гриппа свиней. Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о том, что в российских хозяйствах микоплазменная инфекция в большинстве случаев сопровождается наслоением других
бактериальных и вирусных инфекций, что приводит к развитию у свиней
комплекса респираторных болезней.
Использование иммуноферментного анализа для мониторинга микоплазменной инфекции. Для мониторинга микоплазменной инфекции
наиболее эффективным методом является ИФА, позволяющий выявлять
антитела к M. hyopneumoniae в сыворотках крови свиней. Ранее нами
был разработан непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к
M. hyopneumoniae. Метод основан на использовании рекомбинантного видоспецифичного белка Р65, и получаемые с его использованием результаты очень хорошо согласуются с результатами контроля с использованием
набора «M. hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США) (2).
126
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 1
Результаты комплексного исследования
патологического материала от свиней с респираторной патологией
на наличие инфекционных агентов
№
Регион
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Самарская обл.
Новгородская обл.
Ярославская обл
Владимирская обл.
Московская обл.
Костромская обл.
Ульяновская обл.
Воронежская обл.
Белгородская обл
Респ. Мордовия
Обнаруженные возбудители
Микоплазмы
(Mhp и Mhr)
Mhp, Mhr
Mhp, Mhr
Mhp
Mhp
Mhp
Mhp, Mhr
Mhp, Mhr
Mhp, Mhr
Mhp, Mhr
Mhp, Mhr
Другие бактерии
Вирусы
Pm, Hps, Str
Pm, Hps, Str
Str
Hps
Hps, Sal
Hps, App, Str
Pm Hps, Sal
Pm, App, Sal
Pm, Hps
Hps, Str
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС, ПВИС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, РРСС
ЦВС2, ВГС
ЦВС2, РРСС
Mhp – М. hyopneumoniae;
Mhr – М. hyorhinis;
РРСС – вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней;
ПВИС – парвовирус свиней;
ЦВС2 – цирковирус свиней второго типа;
ВГС – вирус гриппа свиней;
Pm – Pasteurella multocida;
Hps – Haemophilus parasuis;
App – Actinobacillus pleuropneumoniae;
Str – Streptococcus;
Sal – Salmonella
С применением разработанного метода в 2005-2008 гг. было исследовано более 9000 проб сыворотки крови свиней, полученных из 132 свиноводческих хозяйств различных регионов Российской Федерации. В 74 хозяйствах у
свиней обнаружили антитела к M. hyopneumoniae, в 58 хозяйствах животные
оказались серонегативными в отношении данного вида микоплазм. Таким
образом, результаты серомониторинга подтвердили широкое распространение микоплазменной инфекции в свиноводческих хозяйствах РФ.
Мониторинг микоплазменной инфекции проводился и на импортном
племенном поголовье. На наличие антител к M. hyopneumoniae были исследованы сыворотки крови от 4906 племенных животных, закупленных
рядом российских хозяйств в Канаде, Польше, Эстонии, Литве, Великобритании, Германии, Венгрии, Франции, Чехии, Ирландии, Испании и
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
127
Дании. 11% импортированных свиней оказались серопозитивными в отношении M. hyopneumoniae.
Таблица 2
Результаты исследования сывороток крови от импортированных
племенных свиней на наличие антител к M. hyopneumoniae
Страна-экспортер
Количество
поступивших проб
Канада
Эстония
Чехия
Ирландия
Польша
Франция
Дания
Германия
Великобритания
Литва
Венгрия
Испания
717
83
210
107
1443
558
1104
97
178
126
108
175
Количество
положительных
проб*
0
0
0
0
3
22
115
28
70
56
95
154
Количество
положительных
проб, %
0
0
0
0
0,2
3,9
10,4
28,9
39,3
44,4
88,0
88,0
* Для подтверждения положительных результатов исследования использовали
коммерческий набор «M. hyopneumoniae Antibody Test Kit» фирмы IDEXX (США)
Как видно из табл. 2, антитела к M. hyopneumoniae были обнаружены
у свиней, ввезенных в РФ из Франции, Дании, Германии, Литвы, Венгрии
и Испании. Данный факт свидетельствует о том, что многие племенные
хозяйства в Европе неблагополучны в отношении этого инфекционного
агента. Необходимо отметить, что M. hyopneumoniae не входит в утвержденный список патогенов, от которых должны быть свободны ввозимые в
Россию племенные свиньи (1), поэтому формально нарушений со стороны стран-экспортеров не было.
Ситуация с племенными животными из Польши требует особого анализа. Все племенные свиньи, импортированные из Польши в 2005-2007 гг.,
были серонегативными к M. hyopneumoniae. Однако в 2008 г. у нескольких
животных были выявлены антитела к данному виду микоплазм. Вероятно,
это связано с большим объемом импорта племенных животных из Польши, вследствие чего из-за нехватки последних в Россию начали поступать
свиньи из товарных хозяйств Польши.
Мониторинг микоплазменной инфекции в дикой фауне. С использованием ПЦР на наличие M. hyopneumoniae исследовали патологический
128
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
материал от диких кабанов, павших или отстрелянных с диагностической целью во Владимирской, Московской, Смоленской, Ярославской и
Тверской областях. Данный материал был исследован также на наличие
M. hyorhinis с целью установить доминирующий у кабанов вид микоплазм.
Результаты исследования отражены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты исследования патологического материала
от диких кабанов на наличие M. hyopneumoniae методом ПЦР
Владимирская обл.
Количество
исследованных
проб
18
Регион
Из них положительно на наличие
M. hyopneumoniae
M. hyorhinis
8
0
Московская обл.
12
4
0
Смоленская обл.
24
10
0
Тверская обл.
40
14
2
Ярославская обл.
4
0
0
M. hyopneumoniae у кабанов выявили в 36 из 98 исследованных проб
(36,7%), в то время как M. hyorhinis – всего лишь в 2 пробах (2,0%).
Методом ИФА на наличие антител к M. hyopneumoniae были исследованы 58 сывороток крови диких кабанов из различных регионов России.
Полученные результаты отражены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты исследования сывороток крови диких кабанов
на наличие антител к M. hyopneumoniae
Регион
Результаты исследования сывороток (исслед./полож.)
Владимирская обл.
2/1
Московская обл.
2/2
Тверская обл.
16 / 7
Белгородская обл.
9/3
Смоленская обл.
23 / 9
Читинская обл.
5/0
Как видно из табл. 4, серопозитивных животных выявили во всех
пяти областях Центрального федерального округа России. Небольшое
число исследованных сывороток не позволяет сделать каких-либо выводов в отношении Читинской области.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
129
Итак, проведенные исследования позволили установить, что
M. hyopneumoniae широко распространена в популяции диких кабанов
Центрального федерального округа России, и эти животные могут служить природным резервуаром данного возбудителя.
Выводы
1. Результаты серомониторинга свиноводческих хозяйств и дикой фауны России показали, что M. hyopneumoniae циркулирует в 74 из 132 обследованных хозяйств РФ.
2. С помощью ПЦР M. hyopneumoniae обнаружена в 9% проб, а
M. hyorhinis – в 21% проб патологического материала от свиней с респираторной патологией. В 12% исследованных образцов патматериала оба
вида микоплазм были выявлены одновременно.
3. Установлено, что племенные свиньи, ввезенные в Россию в
2005-2008 гг. из Канады, Эстонии, Чехии и Ирландии, серонегативны к
M. hyopneumoniae. У животных, импортированных из Литвы, Великобритании, Германии, Венгрии, Франции, Испании и Дании, обнаружены
антитела к этому виду микоплазм.
4. Показано, что M. hyopneumoniae широко распространена в популяции диких кабанов Центрального федерального округа РФ.
Список литературы
1. Ветеринарные требования при импорте в РФ племенных и пользовательных
свиней. – Режим доступа: http://www.mcxpx.ru/base_gvc/vetzac/document/351.html/.
2. Челышева, М.В. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка Р65 для определения антител к Mycoplasma hyopneumoniaе /
М.В. Челышева, А.В. Щербаков // Вет. патология. – 2006. – № 4. – С. 109-113.
3. Щербаков, А.В. Обнаружение и видовая идентификация микоплазм с использованием полимеразной цепной реакции / А.В. Щербаков, М.В. Челышева,
А.М. Тимина // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир,
2007. – Т. 5. – С. 202-211.
4. Immune response of gnotobiotic piglets against Mycoplasma hyopneumoniae /
J. Muneta, J. Minagawa, J. Shimoji, J. Ogawa // J. Vet. Med. Sci. – 2008. – Vol. 70. –
P. 1065-1070.
5. Minion, C.F. Molecular pathogenesis of mycoplasma animal respiratory pathogens
/ С.F. Minion // Frontiers in Bioscience. – 2002. – Vol. 7. – P. 1410-1422.
6. Rautiainen, E.J. Mycoplasma hyopneumoniae – aspects of epidemiology, protection
and control / Faculty of Veterinary Medicine of the University of Helsinki. – 2001.
7. Seroepidemiology of M. hyopneumoniae in pigs from farrow-to-finish farms /
E.A. Leon, F. Madec, N.M. Taylor, M. Kobisch // Vet. Microbiol. – 2001. – Vol. 78. –
P. 331-341.
130
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
8. Tracker, E. L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae / E.L. Tracker // Anim.
Health Res. Rev. – 2004. – Vol. 5. – P. 317-332.
Results of MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
infection monitoring on pig farms and
in wild fauna of Russia
M.V. Chelysheva, A.M. Timina, Ye.S. Orlova, A.V. Sherbakov
Summary
The monitoring of mycoplasmal infection on pig farms and in wild
fauna of Russia was carried out. The seromonitoring results revealed
that M. hyopneumoniae circulates on 74 out of 132 farms of the RF.
M. hyopneumoniae was detected by PCR in 21% of pathological material
samples from pigs with respiratory pathology. It is established that breeding
hogs imported to Russia in 2005-2008 from Canada, Estonia, Czech Republic
and Ireland are seronegative to M. hyopneumoniae. Antibody to that type of
mycoplasma was detected in animals imported from Lithuania, Great Britain,
Germany, Hungary, France, Spain and Denmark. It was demonstrated that
M. hyopneumoniae is widely spread in wild boar populations of the Central
Federal Okrug of the RF.
УДК 619:616.98:578.825.1:616-078
ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ
БОЛЕЗНИ АУЕСКИ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ СВИНЕЙ
ПРИ ТЕСТИРОВАНИИ ИХ В ОДНОМ РАЗВЕДЕНИИ
Е.А. Яснева, Г.А. Блотова, В.И. Диев
Резюме
Статья посвящена разработке тест-системы на основе иммуноферментного анализа для количественного определения антител в сыворотках
крови свиней к вирусу болезни Ауески при исследовании их в выбранном рабочем разведении. Определены допустимые величины показателей
оптической плотности для отрицательного и положительного контролей,
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
131
значения величин оптической плотности для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций, а также установлено
единственное рабочее разведение сыворотки, которое может быть использовано для прогнозирования значения титра антител.
Введение
Болезнь Ауески (БА) – остро протекающее в виде эпизоотий и спорадических случаев контагиозное вирусное заболевание сельскохозяйственных (в основном свиней) и диких животных, пушных зверей и грызунов,
наносящее значительный экономический ущерб странам с развитым свиноводством, в том числе и Российской Федерации.
Серологическая диагностика занимает одно из наиболее важных
мест в эпизоотологии БА. Исследования, направленные на обнаружение
и определение концентрации сывороточных антител к вирусу БА, имеют
важное научное и практическое значение как для ретроспективного эпизоотологического анализа, так и для оценки эффективности специфической
профилактики этого заболевания.
Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу БА в сыворотках крови свиней, а также присутствие
вируса и его антигенов в биологических материалах, основано на иммуноферментном анализе (ИФА) (1, 2, 4-9), достоинствами которого
являются высокая чувствительность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность
автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая
регистрацию и обработку получаемых результатов.
При использовании тест-системы ИФА для диагностических целей
необходимо стремиться к методической простоте и однозначности трактовки результатов. В последнее время многими диагностическими центрами широко применяется метод оценки результатов реакции по одному разведению исследуемой сыворотки, что обеспечивает значительную
экономию дорогостоящих компонентов, времени и существенно снижает
стоимость постановки одного анализа.
Данные литературы относительно диагностики БА в непрямом варианте ИФА способом одного разведения отсутствуют, поэтому целесообразно было изучить возможность использования принципа расчета титра на основе S/P-показателя, установленного для единственного разведения испытуемой сыворотки.
132
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Материалы и методы
Антиген. В работе использовали антиген вируса болезни Ауески
штамм «ВК», полученный методом, описанным ранее (3).
Сыворотки. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови свиней, не имеющую антител к вирусу БА. В качестве положительного – гипериммунную сыворотку, полученную после трехкратной
иммунизации свиней вакцинным штаммом «ВК» БА.
Конъюгат. Использовали коммерческий антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG свиньи (фирма «Sigma»).
Иммуноферментный анализ. Непрямой вариант иммуноферментного
анализа проводили по стандартной схеме. На сенсибилизированные антигеном планшеты наносили контрольные и испытуемые пробы сывороток
крови свиней и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Образовавшийся
комплекс антиген-антитело выявляли добавлением антивидового пероксидазного конъюгата, взятого в рабочем разведении. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С. Между этапами реакции несвязавшиеся компоненты
удаляли путем промывания лунок планшета 3-4 раза промывочным буферным раствором. Индикацию реакции проводили с помощью субстрата
ОФД в 0,05 М фосфатно-цитратном буферном растворе (рН-5,0) с добавлением 0,02% перекиси водорода. Планшеты инкубировали при комнатной температуре от 5 до 15 мин. Реакцию останавливали добавлением в
лунки планшетов по 50 мкл 10%-й серной кислоты. Показания оптической плотности (ОП) содержимого каждой лунки измеряли с помощью
спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.
Обработка результатов. Использовали стандартные способы статистической обработки выборок варьирующих переменных, определяли
средние оценки выборок и доверительные интервалы, оценивали взаимосвязь между lg(S/P) и lgT и определяли коэффициенты корреляции и
регрессии (А и В) для уравнения lgT = А + В х lg(S/P). Значение S/P показателя рассчитывали по формуле:
где ОП исслед. сыв. – оптическая плотность исследуемой сыворотки;
ОП отр.контр. – оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки;
ОП полож.контр. – оптическая плотность положительной контрольной сыворотки.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
133
Графические построения и расчеты производили с помощью компьютерной программы Statistica (Correlation matrices) или Microsoft Exсel.
Результаты и обсуждение
Выбор оптимальных разведений сыворотки. Для определения оптимального разведения предварительно методом последовательных разведений исследовали 30 сывороток крови свиней с различным содержанием
антител к вирусу БА. Для разведений 1:80, 1:160, 1:320 и 1:640 исследовали
зависимость (для всех исследуемых сывороток) между S/P-показателями
этих разведений (S/P80, S/P160, S/P320, S/P640) и установленными величинами
Т для данных сывороток. Для каждого из указанных разведений между
значениями lgT и lg(S/P) определяли коэффициент корреляции, который
составил 0,94; 0,95; 0,95; 0,96 соответственно разведениям сывороток 1:80,
1:160, 1:320 и 1:640. Установленные оценки имели высокую степень достоверности (р≤0,05). Полученные уравнения линейной регрессии также
были достаточно адекватны (р≤0,05) и позволяли для заданных величин
S/P-показателей вычислять прогнозируемые величины титров.
Однако для практического применения решили рекомендовать регрессионную модель, установленную для разведения 1:160 (рис. 1). Как видно,
по мере увеличения испытанных разведений степень корреляции увеличивалась, но использовать высокое разведение сывороток в качестве единственного считали нецелесообразным, т.к. сыворотки с низкой активностью
могли быть «не прочитанными», т.е. оказаться ниже показателя отрицательного контроля. С другой стороны, при использовании наиболее низкого разведения (1:80) значения ОП-показателей высокоактивных сывороток для
данного разведения могли находиться в зоне верхнего «плато».
Таким образом, уравнение для вычисления логарифмического значения титра при тестировании сывороток в разведении 1:160 имеет вид:
lgT = 2,9967 х [lg(S/P)] + 4,0044
Например, определив значение оптической плотности исследуемой
сыворотки (0,854) и значения оптической плотности контрольных сывороток: отрицательной (0,140) и положительной (0,998), вычисляем S/P отношение:
S/P = (0,854 – 0,140) / (0,998 – 0,140) = 0,832
Подставляем значение S/P в формулы и находим значение титра:
lgT = 2,9967 х lg 0,832 + 4,0044 = 3,767; Т = 5847
134
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Рис. 1. Распределение значений lgT соответственно показателям
lg(S/P) и величине разведения сывороток 1:160
Определение допустимых величин показателей оптической плотности
для отрицательного и положительного контролей. На различных планшетах в 30 повторностях анализировали вариации значения оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении
1:160. Полученные значения ОП позволили вычислить соответствующие
средние величины и их статистические характеристики в виде дисперсий (σ)
и 95,5%-х доверительных интервалов (2хσ), которые составили для отрицательного контроля 0,072÷0,172, для положительного – 0,323÷1,065 (табл. 1).
Определение значений величин оптической плотности для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций. Соблюдая ранее разработанные условия проведения анализа (величина разведения контрольных и исследуемых сывороток, а также соответствующие допустимые значения ОП), в трех повторностях тестировали пробы сывороток, не имеющих антител к вирусу БА, и образцы сывороток,
имеющих специфические антитела к данному заболеванию. Определяли
средние значения оптических показателей для отрицательных и положительных сывороток, а также их дисперсию, позволяющую прогнозировать ожидаемые значения нижней и верхней границ доверительного
интервала, соответственно. Верхняя граница доверительного интервала для отрицательных сывороток составила значение 0,175 (р≤0,045), а
нижняя граница доверительного интервала для положительных сывороток – 0,142 (табл. 2). Так как установленная удвоенная величина отрицательного контроля (см. табл. 1) составила 0,244, то обе вышеприведенные критериальные оценки для отрицательных и положительных
образцов оказались ниже данного значения.
135
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 1
Результаты измерения значений оптической плотности
положительного и отрицательного контролей
№ повторности
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Хср
95% дов. интервал
Характеристика сыворотки
отрицательная
0,100
0,200
0,140
0,133
0,119
0,115
0,113
0,118
0,118
0,177
0,116
0,114
0,122
0,127
0,118
0,120
0,110
0,130
0,122
0,100
0,115
0,128
0,118
0,112
0,119
0,117
0,128
0,112
0,142
0,117
0,122
0,122±0,050
(0,072÷0,172)
положительная
0,453
0,713
0,457
0,614
0,724
0,689
0,523
0,461
0,496
1,065
0,512
0,453
0,744
0,851
0,725
0,987
0,805
1,076
1,100
0,678
0,559
1,205
0,489
0,488
0,98
0,611
0,568
0,690
0,453
0,468
0,687
0,693±0,370
(0,323÷1,065)
136
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Таблица 2
Величины значений оптической плотности неспецифически
и специфически реагирующих сывороток
Наименования
сывороток
Средние значения оптической плотности
0,100; 0,106; 0,111; 0,111; 0,111; 0,113; 0,115; 0,117; 0,117; 0,117;
0,118; 0,121; 0,122; 0,122; 0,123; 0,124; 0,125; 0,127; 0,127; 0,127;
отрицательные 0,128; 0,130; 0,130; 0,131; 0,131; 0,131; 0,132; 0,133; 0,133; 0,134;
0,134;0,137; 0,142
верхняя граница доверительного интервала (р≤0,045) 0,175
0,303; 0,436; 0,448; 0,448; 0,498; 0,563; 0,568; 0,578; 0,587; 0,611;
0,647; 0,655; 0,678; 0,690; 0,725; 0,770; 0,774; 0,774; 0,783; 0,785;
положительные 0,801; 0,805; 0,823; 0,851; 0,864; 0,870; 0,939; 0,980; 1,076; 1,107;
1,163; 1,164
нижняя граница доверительного интервала (р≤0,045) 0,142
Определение ожидаемого диапазона вариации показателей титров.
Известно, что экспериментально полученные оценки результатов анализа
являются вариабельными. Такого рода вариации обусловлены совокупностью объективных причин, присущих данному методу. Очевидно, что
интерпретация результатов будет корректной, если величина вариации
определена.
Исследовали статистические характеристики величин титров в повторных экспериментах. Для испытания использовали 5 сывороток крови
свиней, обладающих различной активностью по отношению к антигену
вируса болезни Ауески. Пробы сывороток были расфасованы по 100 мкл,
заморожены (-60°С) и использованы строго однократно. Оценку величины титра проводили на основании S/P-показателей, полученных при
разведении 1:160 по соответствующей формуле (рис. 1). Эксперименты
проводили ежедневно в течение 5 суток. В каждом эксперименте все сыворотки испытывались параллельно на одной плашке (одна повторность).
Таким образом, одновременно было проведено 5 повторных испытаний.
Полученные результаты представлены в табл. 3.
Было определено, что практически во всех случаях диапазон вариаций единичных измерений титров находится в границах одного
двоичного шага. Установленные величины средних квадратичных отклонений были достаточно близкими по значениям, логарифмической
размерности и находились в интервале 0,11÷0,14. На этом основании
137
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
сделали заключение, что при использовании предлагаемой методики
ожидаемое среднее квадратичное отклонение (±σ) логарифмических
величин титров будет находиться в установленных границах. Для удобства практического использования границы предлагаемого интервала
могут быть определены как 0,1÷0,15. Взятая в виде медианы в ранжированном ряду величина среднего квадратичного отклонения соответствовала значению ±σ = 0,122.
Таблица 3
Определение диапазона вариации показателей титров
№
повторности
Титр сывороток, lg
1
2
3
4
5
1
3,317
3,993
3,387
4,337
3,115
2
3,378
4,102
3,286
4,137
2,918
3
3,238
3,918
3,170
3,987
2,979
4
3,397
4,130
3,213
4,103
2,850
5
3,628
3,839
3,430
4,195
3,130
σ
0,146
0,121
0,111
0,128
0,122
Рис. 2. Распределение значений lgT в зависимости
от метода тестирования сывороток
138
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Сравнение оценок титров сывороток, установленных методом
одного разведения и последовательных двукратных разведений. Сыворотки крови свиней, обладающие различной специфической активностью,
исследовали в непрямом варианте ИФА методом одного разведения и последовательных двукратных разведений. Таким образом, получали параллельно установленные показатели lgT, между которыми исследовали наличие связи и устанавливали коэффициент корреляции (рис. 2).
Проведенные исследования показали, что коэффициент корреляции
между установленными значениями lgT составил 0,98, что характеризует
устойчивую взаимосвязь между исследуемыми показателями.
Выводы
Разработанная тест-система на основе непрямого варианта ИФА,
основанного на методе одного разведения, может быть использована для
практического применения при исследовании сывороток крови свиней,
содержащих антитела к вирусу болезни Ауески.
Список литературы
1. Иммуноферментный метод при диагностике болезни Ауески / В.А. Мищенко, Л.Н. Корниенко, М.Г. Костюченко [и др.] // Болезнь Ауески свиней: сб. науч.
работ. – Владимир, 2001. – С. 41–42.
2. Оганесян, А.С. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови
свиней / А.С. Оганесян // Вет. патология. – 2004. – № 6. – С. 103-106.
3. Яснева, Е.А. Оптимизация условий постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител в сыворотках крови свиней на
вирус болезни Ауески штамм «ВК» и «К» / Е.А. Яснева, А.В. Константинов // Вет.
патология. – 2007. – № 4. – С. 51–55.
4. An indirect double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) using baculovirus-expressed antigen for the detection of antibodies to
glycoprotein E of pseudorabies virus and comparison of the method with blocking
ELISAs / T.G. Kimman, O. de Leeuw, G. Kochan [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. –
1996. – Vol. 3. – P. 167 – 174.
5. Banks, M. Aujeszky’s disease ELISA using glycoprotein gE (gI) expressed in
baculovirus / M. Banks, B. Tehranchi, S. Weightman // Proc.3rd Congr. Europ. Soc. Vet.
Virol. – Interlaken, Switzerland, 1995. – P. 137-141.
6. Grom, J. Aujeszky’s disease virus antibodies detected by gE,gB,gC ELISA /
J. Grom, N. Linde, B. Klingeborn // Proc. 3rd Congr. Europ. Soc. Vet. Virol. – Interlaken,
Switzerland, 1995. – P. 142–146.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
139
7. Kit, M. Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between
pseudorabies (Aujeszky’s disease) – infected and vaccinated pigs / M. Kit, S. Kit //
Vet. Microbiol. – 1991. – Vol. 28. – P. 141-155.
8. Quist, P. Monoclonal blocking ELISA detecting serum antibodies to the
glycoprotein gII of Aujeszky’s disease virus / P. Quist, K.J. Sorenses, A. Meyling //
J. Virol. Methods. – 1989. – Vol. 24. – P. 169-180.
9. Sorensen, K.J. Aujeszky’s disease blocking ELISA for the delection of
serum antibodies / K.J. Sorensen, J.C. Lei // J. Virol. Methods. – 1986. – Vol. 13. –
P. 171-181.
TEST SYSTEM ON THE BASIS OF enzyme-linked
immunoSORBENT assay FOR DETECTION OF ANTIBODY
TO Aujeszky’s disease VIRUS IN SWINE SERA when
testing THEM IN ONE DILUTION
Ye.A. Yasneva, G.A. Blotova, V.I. Diev
Summary
The paper is devoted to the development of a test-system on the basis of
enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody to Aujeszky’s
disease virus in swine sera when testing them in the selected working dilution.
The permissible optical density values for positive and negative controls, values
of optical density for the differentiation of nonspecific, ambiguous and specific
reactions were determined and the only serum working dilution which can be
used for the prediction of antibody titre values was established.
140
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
УДК 619:616. 98:578.835.2.616.036.22
ВСПЫШКА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В ГРУЗИИ:
РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ ПРИЧИН ЗАНОСА
АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ НА ТЕРРИТОРИЮ
РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ
Х.В. Саргсян1, Г.В. Григорян1, К. Чумбуридзе2
Введение
Расширение международных связей и совершенствование транспортных средств повлияли на изменение ареалов трансграничных болезней
животных (ТБЖ), очаги которых сохранились в развивающихся странах.
ТБЖ не только являются одним из основных факторов, сдерживающих развитие животноводства во всем мире, но и имеют негативные последствия
для международной торговли в глобальном масштабе (4, 10). К числу особо опасных ТБЖ относится и африканская чума свиней (АЧС), экономический ущерб от которой исчисляется миллионами долларов (9, 11). В июне
2007 г. Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ) объявила о вспышке АЧС на территории Грузии, где заболевание за сравнительно
короткий период времени приняло характер опустошительной эпизоотии
и охватило поголовье свиней почти во всех регионах. Целью данной работы было изучение естественной истории возникновения АЧС в регионе, а
также выявление комплекса факторов, имеющих отношение к возможному
заносу заболевания на территорию Республики Армения (РА).
Материалы и методы
Для выявления причин, имеющих отношение к вспышке АЧС в регионе, в период с июня по август 2007 г. нами было проведено предварительное описательно-эпизоотологическое обследование ситуации по АЧС в
Грузии. Надо отметить, что данный метод включает несколько подходов к
проведению исследования, однако комплексное их применение оказалось
невозможным из-за высокой «политической» чувствительности проблемы и низкой аналитической значимости доступной информации. С целью
сбора эпизоотологических данных нами был проведен опрос ветеринарных специалистов, экспертов международных организаций, егерей и фермеров. Предполагаемый сценарий эпизоотии АЧС был воспроизведен при
Научный центр животноводства и ветеринарии Республики Армения
Европейская Комиссия по вопросам ветеринарного здравоохранения в Закавказском регионе (Делегация Европейской Комиссии в Грузии)
1
2
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
141
помощи эпизоометрических показателей отчетов Национальной службы
по безопасности питания, фитосанитарии и ветеринарии Министерства
сельского хозяйства Грузии (НСБПФВ МСХГ), а также характеристики
общей тенденции в динамике эпизоотического процесса (2).
Для выявления возможных путей заноса АЧС на территорию РА был
проведен качественный анализ факторов (биотических, абиотических, антропогенных), имеющих отношение к распространению инфекции. С этой
целью проводили опрос ветеринарных специалистов на предмет особенностей содержания и разведения свиней в Грузии, а также анализ динамики
популяции восприимчивых к АЧС животных на протяжении последних лет.
Проведен осмотр хозяйств, где были зарегистрированы случаи массового
падежа свиней от заболевания (в т.ч. и в приграничных с Арменией регионах Грузии). В качестве источника данных использовали годовые отчеты
Департамента статистики Министерства экономического развития Грузии
(ДС МЭРГ). Для проведения качественного анализа эпизоотической ситуации применяли базовые принципы оценки риска в ветеринарии (1).
Результаты и обсуждение
АЧС вызывается икосаэдрическим ДНК-содержащим вирусом, который является единственным представителем семейства Asfaviridae (5).
К инфекции восприимчивы свиньи как домашних, так и диких пород. В
странах Восточной и Южной Африки АЧС имеет стереотип природноочаговой инфекции с естественной циркуляцией и внутрисемейной передачей вируса между популяциями клещей семейства Ornitodoros и диких
свиней. Основными путями распространения инфекции являются контакт
домашних свиней с дикими (бородавочник, кустарниковая свинья, гигантская лесная свинья), а также инвазия восприимчивого поголовья клещами
Ornitodoros moubata (3, 6). У диких африканских свиней АЧС протекает
бессимптомно, однако при заносе вируса в популяции домашних свиней
заболевание принимает острое течение и сопровождается практически
100% летальностью (11, 12). Источником распространения АЧС на более
длинные дистанции являются контаминированные мясопродукты, а также
мусор и пищевые отходы с кораблей, самолетов и т.д. (9).
До середины прошлого века нозоареал АЧС ограничивался только
африканским континентом, где регулярно имели место вспышки инфекции, обусловленные наличием природных очагов. После выноса АЧС за
пределы Африки в конце 50-х гг. XX в. эпизоотическая ситуация в мире
значительно обострилась, и вспышки этого экзотического заболевания
были официально зарегистрированы в ряде стран Европы, Южной Амери-
142
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
ки и Карибского бассейна. Во всех указанных регионах заболевание было
успешно ликвидировано, за исключением острова Сардиния (Италия), где
по причине формирования природных очагов заболевание циркулирует до
настоящего времени (7, 8). По некоторым данным, в 1976-1977 гг. АЧС
была зарегистрирована и на территории бывшего СССР (РСФСР, Украинская ССР, Молдавская ССР). Опросы грузинских ветеринарных специалистов показали, что в 1977 г. вспышки АЧС имели место также в Советской
Грузии (на территории Абхазской АССР), однако, как и в предыдущих
случаях, очаги заболевания были ликвидированы путем тотального уничтожения больного и подозрительного поголовья свиней.
Эксперты американской Программы по снижению биологической
угрозы (ПСБУ) предполагают, что заболевание было занесено из Китайской
Народной Республики (КНР), где за указанный период времени был зарегистрирован массовый падеж свиней от неизвестной болезни с аналогичными
клиническими признаками. Анализ данных ПСБУ показал, что в первой половине февраля в КНР (северная провинция Шаньси) имела место вспышка
заболевания, в результате которой пало около 2 тыс. свиней. Надо отметить,
что в указанный период в Грузию из КНР через порт Поти действительно
было завезено две партии свиного сала (57 и 67 тонн), однако дальнейший
анализ данных показал, что течение заболевания в КНР сопровождалось
геморрагическим воспалением легких с фибринозным плевритом, причем
80% от количества павших свиней составляли поросята. В результате лабораторного исследования выяснилось, что падеж свиней в Шаньси был вызван не АЧС, а репродуктивно-респираторным синдромом («синее ухо»).
В настоящее время существуют различные мнения относительно причин эпизоотии АЧС на территории Грузии, однако процесс воспроизведения
предполагаемого сценария эпизоотического процесса требует правильного
понимания и анализа комплекса факторов риска, сопряженных со вспышкой инфекции. К моменту рассматриваемых событий уровень свиноводства
в Грузии был сходен с таковым в РА. К 2007 г. в стране насчитывалось около
350 (по неофициальным данным – более 450) тыс. голов домашних свиней.
В Грузии функционировало несколько сравнительно крупных коммерческих
свиноводческих хозяйств, которые занимались откормом свиней высокопродуктивных пород (Крупная белая и Ландрас) и поставкой сырья предприятиям по производству мясопродуктов, а также объектам общественного
питания. Остальная часть поголовья состояла из свиней преимущественно
местных пород (Кахетинская, Сванетинская и Лесогорная). В некоторых районах юго-восточной части Грузии (Телави, Кварели, Гурджиани и т.д.) можно
было встретить помеси указанных пород с Северокавказской породой.
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
143
При анализе эпизоотической ситуации в первую очередь необходимо
учитывать степень влияния эндемичных инфекционных болезней на динамику поголовья домашних свиней в Грузии на протяжении последних
лет. В соответствии с данными НСБПФВ МСХГ, сокращение поголовья
свиней началось только в 2007 г., когда в результате эпизоотии АЧС пало и
было уничтожено больше 80 тыс. домашних свиней. В то же время данные
ДС МЭР дают основание предположить, что значительное сокращение количества животных было зафиксировано еще задолго до начала эпизоотии АЧС, в 2004-2006 гг. Так, если средний показатель отхода домашних
свиней (падеж вследствие инфекционных, инвазионных и внутренних заболеваний, вынужденный убой, убой на мясо и т.д.) до 2004 г. составлял
27 тыс. свиней в год, то в 2004-2006 гг. этот показатель возрос и составил
60,0; 39,6 и 62,2 тыс. животных, соответственно. Учитывая отсутствие
информации в архивных отчетах НСБПФВ МСХГ, можно предположить,
что истинная причина явления остается невыясненной (рис. 1).
Рис. 1. Динамика поголовья свиней в Грузии (2000-2007 гг.)
Специалисты НСБПФВ МСХГ считают, что эпизоотия АЧС была
результатом именно заноса инфекции (источник не был идентифицирован), а уже дальнейшее распространение было обусловлено влиянием
ряда экономических и социальных факторов. Согласно общему мнению,
исходной точкой распространения АЧС является морской порт Поти. По
данным НСБПФВ МСХГ, во второй половине марта 2007 г. сотрудниками
ветеринарной службы порта (Самегрело и Земо Сванетия) было отмечено массовое заболевание и падеж свиней в окрестностях. Клинические
144
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
и патологоанатомические признаки заболевания напоминали таковые при
классической чуме свиней (КЧС), однако геморрагическая инфильтрация
селезенки и лимфатических узлов (висцеральных и мезентериальных)
была более выраженной. Надо отметить, что в то время не было предпринято соответствующих мер по уточнению этиологии заболевания и
предотвращению его дальнейшего распространения. Более того, с позволения сотрудников портовой ветеринарной службы свиньи с клиническими признаками заболевания были подвергнуты убою с последующей
реализацией мяса на местных рынках.
Таким образом, уже на начальном этапе вспышки инфекции были созданы благоприятные условия для ее заноса в другие регионы страны. Уже
через 3 суток падеж свиней от заболевания c аналогичными признаками
был зафиксирован уже в противоположном районе Грузии, на ферме предприятия по производству мясопродуктов в Рустави (Квемо Картли). В течение последующих дней заболевание и падеж свиней были зафиксированы
в двух подсобных хозяйствах дачного поселка Михиани, расположенного в
нескольких километрах от столицы Грузии. В апреле 8 вспышек инфекции
было зарегистрировано в ряде сакребуло регионов Самегрело, Земо Сванетия и Квемо Картли, в результате чего пало и было уничтожено около
13 тыс. домашних свиней. В результате низкой интенсивности противоэпизоотических мероприятий уже в мае эпизоотия охватила поголовье свиней в
приграничных с РА районах Грузии. Так, например, в Маленьком Дманиси
(Квемо Картли) от заболевания пало около 2 тыс. свиней, однако сотрудники НСБПФВ МСХГ и Национальной ветеринарной лаборатории (НВЛ) на
протяжении всего указанного периода сакребуло не посещали.
Рис. 2. Динамика начала эпизоотии АЧС в Грузии (01.01.07 – 01.06.07)
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
145
Во второй половине мая эпизоотия достигла пика интенсивности
(рис. 2). Так, помимо Самегрело и Земо Сванетии, вспышки заболевания уже регистрировались в Имеретии, Кахетии и остальных регионах
Грузии, где, по различным данным, пало, и было уничтожено больше
50 тыс. свиней. Диагностические исследования были проведены лишь
после того, как эпизоотия достигла пика интенсивности, и распространение заболевания приобрело катастрофические масштабы. В начале
мая с целью уточнения диагноза были отобраны образцы патологического материала в очагах инфекции, а уже во второй половине месяца
НСБПФВ МСХГ официально оповестила МЭБ о вспышке цирковирусной инфекции в Самегрело и Земо Сванетии. Согласно информации
МЭБ, заболело всего 3 свиньи, падежа отмечено не было, однако 3 тыс.
восприимчивых животных было уничтожено с целью ликвидации инфекции. Предварительный диагноз был поставлен в НВЛ и в дальнейшем подтвержден в НВЛ Украины. Так как вспышки инфекции продолжали регистрироваться в стране, то в конце мая НСБПФВ МСХГ
направила образцы патологического материала во Всемирную справочную лабораторию МЭБ (Пербрайт, Великобритания) для уточнения
диагноза на предмет экзотической инфекции. Поэтому только в июне
выяснилось, что заболевание и падеж свиней в Грузии были вызваны
вирусом АЧС.
К концу июня наблюдалось относительное сокращение количества вспышек заболевания, однако к этому времени эпизоотия АЧС уже
охватила поголовье свиней в 52-х из 65-ти районов Грузии, в т.ч. и в
приграничных с РА регионах (рис. 3). После получения лабораторного
подтверждения диагноза 6 июня, НСБПФВ МСХГ оповестила МЭБ о
55-ти пунктах, неблагополучных по АЧС, причем данные, представленные в официальных отчетах, свидетельствовали о 100% летальности в
очагах инфекции. Через четыре дня после оповещения в стране было
повторно зарегистрировано несколько вспышек АЧС, в результате которых пало, и было уничтожено больше 1,5 тыс. домашних свиней.
Дальнейшие попытки НСБПФВ МСХГ локализовать инфекцию также
не увенчались успехом – на протяжении последующих двух месяцев от
заболевания пало и было уничтожено 25 тыс. животных. Сразу же после объявления МЭБ об эпизоотии АЧС в Грузии ГИБППВ МСХ РА наложила запрет на импорт свиней, свинины и продуктов из нее, а также
усилила ветеринарный контроль на границе с Грузией.
146
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Дата
Рис. 3. Динамика продолжения эпизоотии АЧС в Грузии
(06.06.07 – 30.07.07)
В результате качественной оценки риска заноса и распространения ТБЖ в свиноводческих хозяйствах Грузии был выявлен ряд факторов, предположительно повлиявших на интенсивность и скорость
эпизоотического процесса. Одним из таких факторов является уровень
биологической безопасности (ББ) в свиноводческих хозяйствах. При
осмотре немногочисленных фермерских хозяйств c замкнутым содержанием свиней был выявлен ряд нарушений зоогигиенических и
ветеринарно-санитарных требований. Например, по причине отдаленности в приграничных с Арменией сакребуло фермеры сами следили
за состоянием здоровья свиней и качеством кормов, а ветеринара вызывали только в случае явного заболевания животных. Имели место
взаимные консультации с посещением соседних хозяйств и осмотром
животных, что существенно повышало риск распространения ТБЖ. В
отличие от подсобных хозяйств, эпизоотическая ситуация, качество
кормов, а также процесс их приготовления на коммерческих фермах
находились под регулярным контролем ветеринарных специалистов.
Это дает основание предположить, что к началу эпизоотии АЧС ББ таких хозяйств находилась на удовлетворительном уровне.
Следующим важным фактором, который мог оказать влияние на
характер течения АЧС в Грузии, является плотность восприимчивых
животных на определенной территории. Так, по данным ДС МЭРГ, в
коммерческих хозяйствах с регламентированным закрытым режимом
работы (и технологией ремонта свинопоголовья через воспроизводство) содержалось всего 0,6% от общего количества домашних свиней
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
147
в стране. Основная часть поголовья (99%) была сконцентрирована в
индивидуальных крестьянских хозяйствах. Количество животных в
хозяйствах указанных регионов было невелико, однако суммарное его
количество в отдельных сакребуло могло достигать от 30 до 40 тыс.
голов. Содержание свиней было наиболее распространено в регионах
Самегрело и Земо Сванетии, Имеретии, Кахетии и Квемо Картли, где
содержалось больше 60% от основного свинопоголовья. В большинстве сакребуло указанных регионов летом практиковалось выгульное
содержание свиней, а замкнутое содержание превалировало в отдельных районах Самцхе Джавахетии и Аджарии.
Выводы
Проведение качественного анализа риска показало, что в 2007 г.
существовал высокий риск заноса и распространения ТБЖ в свиноводческих хозяйствах Грузии. Анализируя влияние различных (биотических, абиотических, антропогенных) факторов на распространение
АЧС, можно предположить, что наиболее уязвимой являлась популяция
животных, рассредоточенная в подсобных крестьянских хозяйствах,
причем максимальную угрозу занос и распространение АЧС представляли для регионов Самегрело и Земо Сванетия, Имеретия, Кахетия и
Квемо Картли.
Анализ эпизоотической ситуации показал, что причиной формирования первичных очагов и последующего распространения АЧС в Грузии
послужило пренебрежение базовыми принципами контроля ТБЖ. Необходимо также отметить, что эпизоотическое проявление заболевания свидетельствует о смещении баланса в пользу микроорганизма. Как правило,
это происходит при попадании в популяцию нового штамма микроорганизма, возникшего из существующих штаммов в результате мутаций, или
при заносе извне нового возбудителя, с которым данная популяция ранее
не встречалась.
Принимая во внимание, что в мае-июне 2007 г. выгульное содержание
свиней широко практиковалось по обе стороны грузино-армянской границы, и то, что Грузия является основным транзитным пунктом при импорте
в РА, можно предположить, что к моменту наложения ветеринарных ограничений АЧС могла быть уже занесена в Армению. Качественный анализ
риска показал, что занос инфекции мог иметь место в результате влияния
как биотических (контакт здоровых свиней с инфицированными, инвазия
поголовья клещами), так и антропогенных факторов (приграничная торговля, миграция и т.д.).
148
Ящур и другие болезни крупного рогатого скота и свиней
Список литературы
1. Дудников, С.А. Анализ риска в ветеринарии: принципы и методология /
С.А. Дудников, Е.В. Гусева. – Владимир, 2001. – С. 5-17.
2. Дудников, С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики / С.А. Дудников. – Владимир: Демиург, 2005. –
С. 227-243.
3. Co-circulation of genetically distinct viruses in an outbreak of African swine fever
in Mozambique: no evidence for individual co-infection / A.D. Bastos, M.-L. Penrith,
F. Macone [et al.] // Vet. Microbiol. – 2004. – Vol. 103. – P. 162-182.
4. Economic costs of the foot and mouth disease outbreak in the United Kingdom
in 2001 / D. Thomson, P. Muriel, D. Russel [et al.] // Rev. Sci. Techn. Offi. Int. Epiz. –
2002. – Vol. 21. – P. 675-687.
5. Family Asfaviridae / L.K. Dixon, J.V. Costa, J.M. Escribano [et al.] // Virus
Taxonomy: 7th Rep. Int. Comm. Taxonomy of Viruses. – San Diego, Calif., 2000. –
P. 159-165.
6. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene
characterization / A.D.S. Bastos, M.-L. Penrith, C. Cruciere [et al.] // Arch. Virol. – 2003. –
Vol. 148. – P. 693-706.
7. International disease monitoring, April to June 2007 / M. Sabirovic, L. Raw,
S. Hall [et al.] // Vet. Rec. – 2007. – Vol. 160. – P. 717-722.
8. International disease monitoring, July to September 2007 / M. Sabirovic, L. Raw,
S. Hall [et al.] // Vet. Rec. – 2007. – Vol. 161. – P. 643-646.
9. Otte, M.J. Transboundary animal diseases: Assessment of socio-economic impact
and institutional responses / M.J. Otte, R. Nurgent, A. Mcleod // FAO Livestock Policy
Discussion. – Rome, 2004. – № 9. – P. 6-8.
10. Suitability of currently available vaccines for controlling the major transboundary
diseases that afflict sub-Saharan Africa / G.R. Thomson, B. Dungu, K. Tounkara [et al.]
// Develop. Biol. – 2003. – Vol. 114. – P. 229-241.
11. The impact of transboundary animal diseases in the absence of an early warning
system // EMPRES Transboundary Animal Dis. Bull. – 2002. – № 20/1. – P. 3-4.
12. Vallee, I. African swine fever virus infection of porcine aortic endothelial
cells leads to inhibition of inflammatory responses, activation of the thrombotic state,
and apoptosis / I. Vallee, S.W.G. Tuit, P.P. Powell // J. Virol. – 2001. – Vol. 75. – P.
10372-10382.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
149
AFRICAN SWINE FEVER OUTBREAK IN GEORGIA:
RETROSPECTIVE ANALYSIS OF COURSES OF AFRICAN
SWINE FEVER INTRODUCTION IN THE TERRITORY
OF THE REPUBLIC OF ARMENIA
H.V. Sargsyan1, G.V. Grigoryan1, K. Chumburidze2
Introduction
The development of international relations and improvement of means
of transport influenced the change in geographical range of transboundary
animal diseases, whose foci remained in developing countries.
Transboundary animal diseases are not only one of the main factors
hindering the development of worldwide livestock production but they also
produce negative effects on the global international trade (4, 10). Among
the most dangerous transboundary diseases is African Swine Fever (ASF),
which causes economic damages amounting to millions dollars (9, 11). In
June 2007 the World Animal Health Organization (OIE) announced the ASF
outbreak in the territory of Georgia, where the disease became a devastating
epidemic, which covered swine population in almost all regions. The work
was aimed at examination of the natural history of the ASF emergence in
the region as well as at detection of a complex of factors related to possible
disease introduction in the Republic of Armenia (RA).
УДК 619: 616.476-022.6: 615,371
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ
А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов
Резюме
В статье дана сравнительная оценка иммунобиологических свойств
штаммов «БГ» и «К-58» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц,
используемых для изготовления вакцинных препаратов против ИББ.
Research Centre for Livestock Production and Veterinary Medicine of the Republic of Armenia
European Commission in Veterinary Public Health in Transcaucasia (UC Delegation in Georgia)
1
2
150
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Введение
Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ, болезнь Гамборо) – это
вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями,
диареей (4). ИББ зарегистрирована во всех странах мира.
Экономический ущерб от ИББ очень велик и обусловлен гибелью
цыплят, составляющей при остром течении заболевания до 20-70%, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, возникновением вторичных инфекций.
Штаммы вируса ИББ птиц, используемые для производства вакцинных
и диагностических препаратов, должны обладать высокой биологической и
антигенной активностью и быть свободными от контаминации бактериальной и грибковой микрофлорой, микоплазмами и чужеродными вирусами.
Кроме того, известной особенностью возбудителя ИББ является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая
в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая
от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов.
В связи с этим выбор вакцинного штамма вируса ИББ необходимо
проводить с учётом антигенной структуры эпизоотического штамма, а
для приготовления вакцин использовать штамм, обладающий наибольшей
степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическим штаммом вируса ИББ (1).
В зарубежной и отечественной практике известен ряд штаммов вируса ИББ, используемых для изготовления диагностических и вакцинных
препаратов для защиты от данной инфекции: «SR-1», «1/РУ», «Сheville»,
«ГКВ №2105» (1), BIA 52|70 (6, 13, 17), «Винтерфилд-2512» (14, 15, 16),
D-78, ATCCNVR-2041, GP/82, NCAJM №V(P)-001033, «ВНИВИП» (2, 5, 7),
«КБК» (8, 11), «Био-92» (10).
Общим недостатком известных штаммов является их низкая антигенная и иммуногенная активность.
Наиболее перспективным по совокупности существенных признаков является штамм «БГ» вируса ИББ птиц, репродуцируемый на 9-11-суточных эмбрионах кур и используемый для изготовления диагностических и вакцинных
препаратов (15). Данный штамм был получен сотрудниками ФГУ «ВНИИЗЖ».
Исходный вирус для получения этого штамма выделен из фабрициевых сумок больных бройлеров птицефабрики «Уральская» Оренбургской области в
1993 г. Производственный штамм «БГ» получен путем многократных последовательных пассажей на 10-суточных эмбрионах СПФ-кур.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
151
Полученный штамм проявляет высокую инфекционную, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, а также высокую степень гомологии по сравнению с многочисленной
группой изолятов, выделенных на территории РФ.
Вышеуказанный штамм репродуцируется в 10-суточных эмбрионах
и предназначен для использования в качестве сырья для приготовления
живой и инактивированной вакцин и диагностических препаратов.
Вакцины, полученные на его основе, преодолевают у цыплят в раннем
возрасте материнский иммунитет к ИББ, стимулируют выработку высоких
титров антител к вирусу и позволяют защитить птицу к моменту её контакта с вирулентным штаммом вируса ИББ. За 15 лет использования живых и
инактивированных вакцин из штамма «БГ» данный препарат занял лидирующее место по результатам коммерческой реализации среди вакцин против
ИББ, что свидетельствует о его высокой эффективности и надёжности (9).
Сотрудниками лаборатории респираторных вирусных болезней птиц
ФГУ «ВНИИЗЖ» были проведены работы по поиску и селекции новых
штаммов вируса ИББ, пригодных для изготовления вакцин против ИББ и
диагностических наборов. Результатом проведённых исследований было
получение нового вакцинного штамма вируса ИББ – «К-58» (12). Исходный вирус для получения штамма «К-58» выделен из фабрициевых
сумок больных бройлеров на птицефабрике «Васильевская» Пензенской
области в 1994 г.
Производственный штамм «К-58» получен путем многократных
перемежающих пассажей исходного изолята на 10-суточных эмбрионах
СПФ-кур и СПФ-цыплятах. После получения положительных результатов (отсутствие реактогенности, онкогенности, высокая иммуногенность,
отсутствие реверсибельности при проведении пяти пассажей на чувствительных цыплятах) и в соответствии с программой по депонированию
были проведены опыты по определению видовой и штаммовой принадлежности штамма «К-58», по контролю на отсутствие контаминации бактериальной и грибковой микрофлорой, микоплазмами и чужеродными
вирусами, а также электронно-микроскопическое исследование на морфологическое соответствие.
Учитывая, что штамм «БГ» по своей антигенной и иммуногенной
активности превосходит все известные штаммы вируса ИББ, из которых
готовили вакцинные препараты, применяемые на территории Российской
Федерации и стран СНГ, целью настоящих исследований явилось проведение сравнительной оценки иммунобиологических свойств штаммов
«БГ» и «К-58» вируса ИББ.
152
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Материалы и методы
В работе использовали два штамма вируса ИББ птиц: «БГ» и «К-58».
Предварительно проверенной на инфекционную активность, отсутствие контаминации микоплазмами и посторонними вирусами, матровой
расплодкой инокулировали 9-11-суточные эмбрионы СПФ-кур следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки (ХАО) делали насечку, не повреждая ее, и затем с помощью шприца вводили вирусосодержащий материал на ХАО в количестве
0,2 см3. Отверстие в скорлупе заклеивали лейкопластырем.
Инфицированные эмбрионы инкубировали при температуре 37,5°С
в течение 48-120 ч. После 48 ч овоскопию проводили через каждые 3 ч и
отбирали павшие эмбрионы, которые разделывали и замораживали при
температуре минус 60°С.
Полученный вирусосодержащий материал размораживали, измельчали, экстрагировали при 4°С в течение 45 мин, дважды промораживалиоттаивали, добавляли фосфатный буферный раствор рН 7,6 и центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин.
В полученной вирусосодержащей жидкости определяли инфекционную активность титрованием на 10-суточных эмбрионах СПФ-кур.
Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина (3).
Вирусосодержащую суспензию после добавления стабилизаторов
фасовали по 4,0 см3 в стерильные пенициллиновые флаконы, промораживали при температуре минус 70°С необходимое время и подвергали лиофилизации.
Для определения иммуногенности были использованы сухие вирусвакцины, изготовленные на основе исследуемых штаммов вируса ИББ,
которые хранили при положительной температуре (6±2°С). В опытах использовали цыплят 14-суточного возраста. Иммунизацию проводили двукратно методом выпаивания с водой с интервалом 10 суток. Через 14 суток после второй вакцинации отбирали пробы крови, получали сыворотки
и исследовали их методом ИФА.
Результаты исследований
На первом этапе проводили сравнительную оценку гибели инфицированных эмбрионов во время инкубирования при температуре 37,5°С. В
табл. 1 представлены данные овоскопии эмбрионов и гибели их в различные сроки после заражения различными штаммами вируса ИББ.
153
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Данные овоскопии инфицированных эмбрионов
Штамм
вируса
ИББ
Кол-во
зараж-х
СПФ КЭ,
шт.
Количество павших эмбрионов
по часам
24-48 ч
неспец.
гибель
шт.
%
72 ч
шт.
%
«К-58»
2328
45
1,9 2283 98,1
–
«БГ»
2094
38
1,8 1884 90,0
61
Итого КЭ
%
павших
после заражения
за 72-96 ч
шт. %
шт.
–
2283 98,1
–
96 ч
шт.
Таблица 1
живых
2,9 1945 92,9 111
%
–
5,3
Полученные данные свидетельствуют о том, что неспецифическая гибель эмбрионов в течение первых 48 ч инкубирования при заражении обоими штаммами вируса ИББ птиц практически одинаковая (1,9% и 1,8%),
в то время как максимальная специфическая гибель наблюдается после
48 ч. Так, количество павших эмбрионов за 72 ч инкубирования составило
98,1% для штамма «К-58» и 90,0% – для штамма «БГ». То есть первый
вызывает большую специфическую гибель эмбрионов по сравнению со
вторым. Следует также отметить, что почти 100% гибель эмбрионов при
инфицировании штаммом «К-58» наблюдается за 72 ч инкубирования, в
то время как 5,3% эмбрионов, заражённых штаммом «БГ», остаётся живыми даже после 96 ч инкубирования.
Кроме того, проведена сравнительная оценка иммунобиологических
свойств (инфекционной и иммуногенной активности) штаммов «К-58» и
«БГ» вируса ИББ птиц. Результаты проведённых исследований представлены в табл. 2.
Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о более высокой инфекционной активности штамма «К-58». Так, инфекционная активность штамма «К-58» более, чем на 1,0 lg ЭИД50/см3 превышает таковую
штамма «БГ». Ввиду того, что доверительные интервалы не перекрываются, различия являются существенными.
Результаты, полученные при проведении сравнительной оценки иммуногенной активности изучаемых штаммов вируса ИББ птиц, свидетельствуют о том, что штамм «К-58» является более эффективным, так как он
индуцирует в 1,5 раза более высокую выработку антител по сравнению со
штаммом «БГ».
В таблице также представлены данные сравнительной оценки иммуногенной активности вирусвакцин, изготовленных из штаммов «К-58»
154
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
и «БГ» вируса ИББ птиц, в зависимости от сроков их хранения. Исходя
из полученных результатов, очевидно, что у обеих вирусвакцин, хранившихся при положительной (6±2°С) температуре в течение как шести, так
и двенадцати месяцев (срок наблюдения), иммуногенная активность по
сравнению с исходной не снижалась.
Таблица 2
Сравнительная оценка иммунобиологических свойств различных
штаммов вируса ИББ
Наименование штаммов
№
опыта
БГ №102-ДЕП
К-58 №122-ДЕП
Титр антител
Титр антител
Инфекц.
Инфекц.
В ИФА
в ИФА
активность,
активность,
lg ЭИД50/см3 исход. 6 мес. 12 мес. lg ЭИД50/см3 исход. 6 мес. 12 мес.
1
6,20
7177
6150
5800
7,70
8872
6100
7530
2
6,20
2641
3835
4140
7,95
7928
7200
7600
3
6,70
5448
4700
3185
7,70
5528
6891
5980
4
6,95
3444
5100
4500
7,95
5779
6880
6315
5
6,70
3819
4115
3900
8,00
8289
7350
7500
6
6,2
2188
3452
3215
7,7
8133
6230
6185
7
6,7
2218
4385
4091
7,95
2847
4580
6800
8
6,7
4396
4100
3890
7,7
7641
6800
6935
9
6,2
1538
3145
2918
7,95
3338
7915
6818
10
6,2
7808
5650
4910
8,0
6941
7218
3900
Средн.
6,48±0,1
4067
4463
4054
7,86±0,03
6529
6717
6556
Выводы
Проведённые исследования показали, что штамм «К-58», полученный сотрудниками лаборатории респираторных вирусных болезней птиц
ФГУ «ВНИИЗЖ» по сравнению со штаммом «БГ» вируса ИББ обладает
более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью:
– штамм «К-58» вызывает 100% специфическую гибель у инфицированных эмбрионов за 72 ч, в то время, как около 5,3% эмбрионов, инфицированных штаммом «БГ», остаются еще живыми даже после 96 ч
инкубирования;
– инфекционная активность вируса штамма «К-58» на 1,0 lg ЭИД50/см3
выше по сравнению с таковой у штамма «БГ»;
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
155
– вирус штамма «К-58» индуцирует титр антител в 1,5 раза более высокий по сравнению с таковым у штамма «БГ»;
– иммуногенная активность вирусвакцин, изготовленных на основе
штаммов «К-58» и «БГ» вируса ИББ, при хранении их при положительной
температуре (6±2°С) в течение 6 и 12 месяцев не снижалась по сравнению
с исходными препаратами.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о более высокой эффективности штамма «К-58», который расширяет арсенал штаммов вируса ИББ птиц, пригодных для изготовления высокоспецифических
и чувствительных, высокоиммуногенных, безвредных вакцинных препаратов и заслуживает быстрейшего внедрения в практику специфической
профилактики ИББ в птицеводческих хозяйствах.
Список литературы
1. А.с. 1761802 СССР, МПК5 С12N 7/00. Штамм вируса болезни Гамборо для
получения биологических препаратов и их оценки / Алиев А.С.; ВНИВИП. - Заявл.
26.11.90; опубл. 15.09.92.
2. А.с. 1824443 СССР, МПК5 С12N 7/00. Способ профилактики болезни Гамборо / Алиев А.С.; ВНИВИП. - Заявл. 19.03.91; опубл. 30.06.93.
3. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медгиз, 1962. – 180 с.
4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев,
Н.В. Фомина. – М.: ВНИТИБП, 1998. – С. 65-84.
5. Пат. 4530831 США, МПК3 А61К 39/12, Infectious bursal disease vaccine /
Liiееtticken H.D., Cornellisen D.R., Aczo N.V. - Заявл. 02.11.82; опубл. 23 07.85.
6. Пат. 100319 Румыния, МПК4 А61К 39/12. Inactivated vaccine against avian
busita oobtaining process / Coman T., Coman S. - Заявл. 13.01.88; опубл. 29.10.90.
7. Пат. 203781 Венгрия, МПК4 С12N 7/00. Process for producing inactivated
vaccine against infecting bursitis / Palya V., Gerhardt S., Benyeda J. [et al.]. - Заявл.
16.12.88; опубл. 30.09.91.
8. Пат. 2054038 Российская Федерация, МПК4 С12N 7/00. Штамм вируса
инфекционной бурсальной болезни птиц / Алиев А.С., Дьяченко В.Н. - Заявл.
01.06.1993; опубл. 10.02.1996.
9. Пат. 2127602 Российская Федерация, МПК6 А61К 39/12. Штамм «БГ» вируса
инфекционной бурсальной болезни птиц / Борисов А.В., Кузнецов В.Н., Гусев А.А.
[и др.]; ВНИИЗЖ; ВГНКИ. - Заявл. 24.11.97; опубл. 20.03.99.
10. Пат. 2191825 Российская Федерация, МПК7 С12N 7/00. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц «Био-92» для производства вакцин, диагностических и других биопрепаратов / Соловьев Б.В., Слепенко Т.Б.,
Смоленский В.И. – Заявл. 07.03.01; опубл. 27.10.02.
156
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
11. Пат. 2205021 Российская Федерация, МПК7 А61К 39/12. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц / Алиев А.С., Алиева А.К.,
Оганесян В.А. – Заявл. 18.07. 01; опубл. 27.05.03.
12. Пат. 2268936 Российская Федерация, МПК7 С12N 7/00. Штамм «К 58» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц для изготовления диагностических
и вакцинных препаратов / Борисов А.В., Кузнецов В.Н., Кузнецов Ю.В., Смоленский В.И.; ВНИИЗЖ. - Заявл. 05.07. 04; опубл. 27.01.06.
13. Lucia, B. Infectious bursal disease emulsified vaccine: effect upon neutralizingantibody levels in the dam and subsequent protection of the progeny / В. Lucia,
S.B. Hitcher // Avian Dis. – 1979. – Vol. 23. - P. 466-478.
14. Winterfield, R.W. Immunity response to the infectious bursal agent /
R.W. Winterfield // Avian Dis. – 1969. – Vol. 13. - P. 548-557.
15. Winterfield, R.W. Immunity response and pathogenicity of different strains of
infections bursal disease virus applied as vaccines / R.W. Winterfield // Avian Dis. –
1978. – Vol. 22. - P. 721-731.
16. Winterfield, R.W. Characteristics of apparent derivatives of the 2512 strains of
infectious bursal disease virus when used as vaccines / R.W. Winterfield, A.S. Dhillon,
H.L. Thacker // Avian Dis. – 1981. – Vol. 25, N 4. - P. 900-910.
17. Wyeth, P.Y. The use of an inactivated infectious bursal disease oil emulsion
vaccine in commercial broiler parent chickers / P.Y. Wyeth, G.A. Gullen // Vet. Rec. –
1979. – Vol. 104. - P. 188-193.
Comparative evaluation of immunobiological
properties of various strains of infectious
bursal disease virus
A.V. Borisov, V.N. Kuznetsov
Summary
The comparative evaluation of BG and K-58 strains of infectious bursal
disease virus used for IBD vaccine production is described in the paper.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
157
УДК 619:616.98:616.476-022.6:615.371
Изучение антигенных свойств опытных
образцов инактивированной эмульсионной
вакцины против Инфекционной
бурсальной болезни
А.В. Селиверстов
Резюме
В статье представлены результаты исследования влияния антигенов
различных штаммов вируса ИББ в составе опытных образцов эмульсионной вакцины на динамику и уровень формирования специфических гуморальных антител. В опыте было использовано несколько опытных образцов эмульсионной вакцины из штаммов «К-58», «Винтерфилд-2512»,
«БГ» вируса ИББ и их смеси. Исследования проводили на цыплятах трех
возрастных групп.
По результатам проведенных опытов было установлено, что штамм
«К-58» вируса ИББ в составе эмульсионной вакцины обладает наибольшей антигенной активностью и может быть использован для дальнейшего
изучения и применения его в качестве антигенного компонента для инактивированных вакцин.
Введение
Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) – высококонтагиозное вирусное заболевание кур, сопровождающееся поражением фабрициевой
сумки, в меньшей степени – других лимфоидных органов и почек, наличием кровоизлияний в мышцах бедра, груди, крыла и в слизистой оболочке
железистого желудка (1, 7, 8, 9, 11).
Помимо того, что инфекционная бурсальная болезнь вызывает высокую
смертность, она индуцирует иммунодепрессию, повышающую восприимчивость птиц к адено- и реовирусной инфекциям, инфекционной анемии, кокцидиозу, колибактериозу, сальмонеллезу и другим заболеваниям. В результате
иммунодепрессивного действия вируса ИББ отмечается неудовлетворительная реакция цыплят на вакцинацию против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита, болезни Марека и других болезней (3, 8, 10).
По данным Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, за 2007 год ИББ в заразной патологии птиц составила 2,9% (6).
Общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают полного оздоровления птицеводческих хозяйств от инфекционной бурсаль-
158
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ной болезни. Высокая устойчивость вируса ИББ во внешней среде в большинстве случаев является причиной его длительного персистирования в
птицехозяйстве и эндемичности заболевания в регионе. Поэтому применение живых и инактивированных вакцин во всех странах мира, включая
Российскую Федерацию, является единственным надёжным направлением в профилактике и ликвидации этой инфекции.
В практике промышленного птицеводства существует 2 подхода к защите цыплят от ИББ:
– создание у молодняка высокого уровня антител путем вакцинации
родительского поголовья;
– проведение вакцинации цыплят по мере снижения у них уровня материнских антител.
Эффективность иммунизации живыми вакцинами, как правило,
предполагает соблюдение ряда обязательных требований, предусматривающих обеспечение максимальной однородности титров материнских
антител, поэтому при применении живых вакцин возникает проблема выбора оптимального времени для вакцинации. Но самым главным является
то, что живые вакцины обусловливают иммуносупрессии (5, 2).
Применение же инактивированных вакцин против ИББ при вакцинации родительского поголовья, за 30 суток до яйцекладки, обеспечивает
получение однородных титров пассивных антител у молодняка и устойчивость к заражению до 20-25-х суток жизни.
По данным зарубежных и отечественных авторов, для защиты цыплят с
материнскими антителами от ИББ рекомендуется применять инактивированные вакцины. Инактивированные вакцины обеспечивают образование напряжённого иммунитета и могут вводиться цыплятам с первых суток жизни.
Но известной особенностью возбудителя ИББ является антигенная
изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки на разных территориях. В связи с этим
выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц должен проводиться с учетом
антигенной структуры эпизоотического изолята, а для изготовления вакцинных препаратов необходимо использовать производственные штаммы,
обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ (4).
Цель нашей работы состояла в том, чтобы провести сравнительную
оценку иммунобиологических свойств штаммов «К58», «БГ» и «Винтерфилд-2512» вируса ИББ в составе инактивированной эмульсионной вакцины, и в выборе наиболее антигенно активного штамма для конструирования эмульсионной вакцины. Для достижения поставленной цели была
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
159
изучена иммуногенная активность опытных образцов эмульсионной вакцины против ИББ на цыплятах трех возрастных групп.
Материалы и методы
Антигенные компоненты. Для оценки иммуногенной активности использовали вирус ИББ штаммов «К-58», «БГ», «Винтерфилд-2512».
Вирус репродуцировали в 9-11-суточных эмбрионах СПФ-кур. Из полученного вируссодержащего материала готовили 20% вируссодержащие
суспензии, которые подвергали очистке с помощью хлороформа с последующим центрифугированием.
В очищенных вируссодержащих суспензиях определяли инфекционную активность методом титрования в 9-11-суточных эмбрионах СПФ-кур.
Для инактивации вируса в вируссодержащие суспензии добавляли
аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), конечная концентрация которого составляла 0,3%. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при температуре 37оС в течение 24 ч. Образцы инактивированных суспензий контролировали на авирулентность путем проведения двукратных «слепых»
пассажей в развивающихся 9-11-суточных эмбрионах СПФ-кур.
Адъювант. При изготовлении эмульсионных вакцин использовали масляный адъювант Монтанид ISA70 фирмы «SEPPIC» (Франция). Антигенный
компонент объединяли с адъювантом в соотношении 30:70 и эмульгировали в
гомогенизаторе Silverson Sealed Unit в течение 6 мин при 6000 об/мин.
Безвредность вакцины определяли путем введения 0,9 см3 (3 прививных объема) вакцины 30-40-суточным цыплятам.
Сыворотки крови исследовали в иммуноферментном анализе с использованием диагностических наборов фирмы Synbiotics.
Результаты и обсуждение
Для проведения экспериментальных исследований было изготовлено
несколько опытных образцов инактивированной эмульсионной вакцины,
содержащих инактивированный вирус ИББ штаммов «БГ», «К-58», «Винтерфилд-2512» и их смесь (вирус брали в равных соотношениях).
Изучение иммуногенной активности опытных образцов эмульсионной вакцины проводили на цыплятах разного возраста:
1 группа – цыплята 7-суточного возраста;
2 группа – цыплята 23-суточного возраста;
3 группа – цыплята 45-суточного возраста, предварительно иммунизированные живой вакциной.
160
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Каждую группу разбивали на 5 подгрупп по 10 цыплят. Одна подгруппа в каждой группе была контрольной, а цыплятам других подгрупп
вводили опытные образцы вакцины из разных штаммов вируса ИББ.
Вакцину вводили по 0,3 см3 в мышцу бедра. Через 21 сутки у птиц
брали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие
антител против вируса ИББ.
В табл. 1 и 2 представлены сравнительные данные по титру гуморальных антител к антигенным компонентам, входящим в состав каждого
образца вакцины.
Таблица 1
Уровень антител на 21 сутки после вакцинации цыплят 1 и 2 групп
опытными образцами вакцин из различных штаммов вируса ИББ
(n=5)
Возраст
цыплят,
сут.
Титры антител к вирусу ИББ
до
«Винтервакцинации фильд-2512»
«БГ»
«К-58»
смесь
штаммов
7
177±38
1900±288
1114±252
2943±224
1787±226
23
387±61
3976±492
4008±398
4814±714
4597±375
Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что титры гуморальных антител у 7-суточных цыплят, иммунизированных вакциной, изготовленной с
использованием антигенного компонента из штамма «К-58», значительно
выше, чем у цыплят, привитых вакцинами, на основе других штаммов вируса ИББ.
Далее опыты были проведены на цыплятах 45-суточного возраста,
предварительно вакцинированных живой вакциной. Данные исследований представлены в табл. 2.
Таблица 2
Уровень антител на 21 сутки после вакцинации 45-суточных цыплят
опытными образцами вакцин из различных штаммов вируса ИББ
(n=3)
Титры антител к вирусу ИББ
Титры антител
Параметры после вакцинации «Винтерсмесь
«БГ»
«К-58»
живой вакциной филд-2512»
штаммов
Титры
4567±39
6379±59
6074±230
6582±19
6182±164
Увеличение
титра
-
1812±26
1507±234
2015±43
1615±173
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
161
Данные табл. 2 показывают, что различия в иммуногенной активности опытных образцов инактивированной вакцины из различных штаммов вируса ИББ после бустерной вакцинации незначительны. Поэтому
следующим этапом нашей работы было изучение динамики иммунного
ответа после применения экспериментальных образцов инактивированной эмульсионной вакцины против инфекционной бурсальной болезни в
продолжительный период времени. В данном опыте использовали цыплят
двух возрастных групп – 7-суточных и 23-суточных.
Рис. 1. Динамика образования антител к вирусу ИББ у 23-суточных
цыплят, привитых опытными образцами эмульсионной вакцины
Результаты тестирования специфических антител (рис. 1) к вирусу
ИББ в сыворотке крови привитых 23-суточных цыплят продемонстрировали преимущество эмульсионной вакцины из штамма «К-58» перед другими образцами. Так, на 35 сутки после прививки вакциной из штамма
«К-58» титры гуморальных антител находились на уровне 1:7800, тогда
как титры антител после вакцинации образцами вакцин из других штаммов доходили до значения 1:6800.
В ходе проведенного исследования на цыплятах 7-суточного возраста
было установлено, что преимущество также имеет образец эмульсионной
вакцины из штамма «К-58» (рис. 2). При этом в группе с цыплятами, привитыми этим образцом вакцины, увеличение титра гуморальных антител уже на 14 сутки после иммунизации более значительно, чем в других
162
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
группах. Пик наибольшего содержания антител в крови у цыплят, привитых образцами вакцины из штамма «БГ» и смеси штаммов, приходится на
35 сутки после вакцинации, в то время как в группах, иммунизированных
образцами вакцин из штаммов «К-58» и «Винтерфилд-2512», увеличение
титра антител происходит до 42 суток.
Рис. 2. Динамика образования антител к вирусу ИББ у 7-суточных
цыплят, привитых опытными образцами эмульсионной вакцины
Выводы
В представленной работе показаны результаты изучения иммуногенных свойств опытных образцов инактивированной эмульсионной вакцины на основе штаммов «К-58», «БГ» и «Винтерфилд-2512» вируса ИББ и
их смеси. По завершении проведенных исследований было определено,
что показатели уровня гуморальных антител и динамики их формирования у разных групп цыплят были различными. Но наиболее значительные результаты были получены при вакцинации птиц инактивированной
эмульсионной вакциной против ИББ, изготовленной из штамма «К-58».
Таким образом, штамм «К-58» вируса ИББ в составе опытных образцов инактивированной эмульсионной вакцины обладает наибольшей
антигенной активностью и может быть использован для дальнейшего
изучения и применения его в качестве антигенного компонента для изготовления инактивированных вакцин против ИББ.
Список литературы
1. Бакулин, В.А. Болезнь Гамборо / В.А. Бакулин // Зооиндустрия. – 2005. –
№ 4. – C. 4-6.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
163
2. Болезнь Гамборо: оценка оптимального срока вакцинации по формуле Девентера / Интервет // Ветеринария в птицеводстве. – 2007. – № 3. – C. 18-22.
3. Джавадов, Э.Д. Вирусиндуцированные иммуносупрессии и способы их
предупреждения в промышленном птицеводстве / Э.Д. Джавадов, В.И. Смоленский, Ф.И. Полежаев // Ветеринария в птицеводстве. – 2004. – № 5-6. – С. 35-61.
4. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма «К-58» вируса инфекционной бурсальной болезни / Ю.В. Кузнецов, В.Н. Кузнецов, А.В. Борисов [и др.]
// БИО. – 2006. – № 5. – С. 2-5.
5. Прудников, В.С. Морфологическая оценка иммунного статуса птиц /
В.С. Прудников, И.Н. Громов, Б.Я. Бирман // Эпизоотология, иммунология, фармакология, санитария. – 2006. – № 1. – C. 36-42.
6. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации за 2007 год / И.К. Рождественский, О.Б. Литвинов, Н.А. Яременко [и др.] // Ветеринарная жизнь. – 2008. –
№ 9. – С. 7.
7. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells /
J.C. Rodríguez-Lecompte, R. Niño-Fong, A. Lopez [et al.] // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Diseases. – 2005. – Vol. 28. – P. 321-337.
8. Mundt, E. Development of a vaccine for immunization against classical as well as
variant strains of infectious bursal disease virus using reverse genetics / E. Mundt, N. de
Haas, A.A.W.M. van Loon // Vaccine. – 2003. - Vol. 21. - P. 4616-4624.
9. Protection against very virulent infectious bursal disease virus in chickens
immunized with DNA vaccines / S.J. Kim, H.W. Sung, J.H. Han [et al.] // Vet. Microbiol. –
2004. - Vol. 101. - P. 39-51.
10. Rautenschlein, S. Differences in the immunopathogenesis of infectious bursal disease
virus (IBDV) following in ovo and post-hatch vaccination of chickens / S. Rautenschlein,
C. Haase // Vet. Immunol. Immunopathol. – 2005. - Vol. 106. - P. 139- 150.
11. Structure-dependent efficacy of infectious bursal disease virus (IBDV)
recombinant vaccines / J.L. Martinez-Torrecuadrada, N. Saubi, A. Pagès-Manté [et al.]
// Vaccine. – 2003. - Vol. 21. - P. 3342-3350.
Antigenic Properties of Experimental Samples
of Inactivated Emulsion Vaccine against
infectious bursal disease
A.V. Seliverstov
Summary
The paper provides research results on effect of antigens of different IBD
virus strains in experimental samples of emulsion vaccine on dynamics and
level of specific humoral antibody induction. Some experimental samples of
the emulsion vaccine from IBD virus strains «K-58», «Winterfield-2512»,
164
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
«BG» and their mixture were used for the research. Chicks of three age-groups
were used in experiments.
Based on the research results it was determined that IBD virus strain
«K-58» in the emulsion vaccine possessed the highest antigenic activity and
could be used either for further research or as an antigenic component for
inactivated vaccines.
УДК 619:616.98:579.881.11:578.831.1:615.371
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ
АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ СИНДРОМА
ГИДРОПЕРИКАРДИТА КУР И НЬЮКАСЛСКОЙ
БОЛЕЗНИ В СОСТАВЕ АССОЦИИРОВАННОЙ
ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ВАКЦИНЫ
А.А. Перепеча, С.В. Фролов, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов,
А.В. Борисов, А.Б. Сарбасов, В.Ю. Кулаков
Резюме
Определены величины оптимальных концентраций инактивированных вирусов синдрома гидроперикардита кур и ньюкаслской болезни в
составе ассоциированной вакцины. В качестве оценок концентраций использовали инфекционные титры вирусов до инактивации. Ассоциированный препарат имел необходимый уровень антигенной активности и
протективной функции.
Введение
Основным средством борьбы с синдромом гидроперикардита кур
(СГПК) является иммунизация поголовья инактивированными вакцинами. Для профилактики ньюкаслской болезни (НБ) также могут быть использованы инактивированные вакцины (2, 3, 4, 5, 7).
В последнее время в РФ эпизоотическая ситуация по СГПК характеризуется увеличением числа неблагополучных пунктов, в связи с чем возникает необходимость расширения профилактических мероприятий. Эффективным профилактическим препаратом против СГПК является сорбированная органно-тканевая инактивированная вакцина (2, 5, 6). Однако во
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
165
многих случаях возникает необходимость вакцинации родительских стад
одновременно против СГПК и НБ, что диктует целесообразность разработки ассоциированной вакцины, включающей антигены обоих возбудителей. Такая двухвалентная вакцина позволила бы сократить количество
прививок, снизить стрессовое воздействие на птицу и уменьшить соответствующие трудозатраты.
При разработке ассоциированных вакцин одним из важных этапов
является оптимизация количества каждого антигена и достижение при
этом желаемой эффективности смешанного препарата в отношении соответствующих возбудителей. В этой связи целью настоящей работы было
установление оптимальных концентраций антигенов вирусов СГПК и НБ
в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины.
Материалы и методы
Вирусные материалы и тест-системы. В качестве материала, содержащего вирус СГПК, использовали ткань печени цыплят, зараженных производственным штаммом КР-95 №114, из которой готовили 20% суспензию (2).
Тест-системой для определения инфекционности возбудителя служили 3-суточные цыплята, выведенные из СПФ-яиц. Величину инфекционного титра
вируса определяли по Керберу (1) в летальных дозах для цыплят (ЛД50).
Материалом, содержащим вирус НБ, была экстраэмбриональная
жидкость, полученная из развивающихся 11-суточных СПФ-эмбрионов
кур, зараженных штаммом «Ла-Сота». Тест-системой для определения
инфекционности возбудителя являлись 11-суточные СПФ-эмбрионы кур.
Величину инфекционного титра вируса определяли по Керберу в эмбриональных инфекционных дозах (ЭИД50).
Вирусные антигены. Исследуемые вирусы инактивировали. С этой
целью в состав вирусных материалов добавляли аминоэтилэтиленимин
в конечной концентрации 0,035М. Экспозицию проводили в течение 24 ч
при температуре 37°С. Инактивант нейтрализовали тиосульфатом натрия
в эквимолярном соотношении. Полноту инактивации контролировали на
соответствующих тест-системах. Таким образом получали антигенные
материалы (антигены) вирусов СГПК и НБ.
Вакцины. Предлагаемая форма ассоциированной вакцины представляла собой эмульгированную в масляном адъюванте (Montanide ISA70 VG,
S����������������������������������������������������������������
ЕРР�������������������������������������������������������������
IC�����������������������������������������������������������
, Франция) смесь равных частей исследуемых вирусных антигенов (водная фаза). Соотношение водной и масляной фаз составляло 30:70
по объему. Сохраняя указанное соотношение фаз, в водной фазе готовили
166
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
различные концентрации антигенов, для чего использовали последовательные трехкратные разведения.
Вакцинация птицы. Для испытания образцов ассоциированной вакцины, содержащих различные концентрации антигенов, формировали отдельные группы цыплят не менее чем 10 голов. Были образованы 9 опытных и одна контрольная группы птиц. Цыплят опытных групп прививали
в объеме 0,5 см3 однократно, подкожно, в область средней трети шеи.
Определение протективного действия ассоциированной вакцины
против вируса СГПК. Цыплят всех опытных и контрольной групп через
21 сутки после вакцинации заражали вирусом СГПК (штамм «КР 95 №114»)
в дозе 4 lgЛД50. Вирус вводили внутримышечно, в область бедра в объеме
1,0 см3. Во всех группах определяли процент заболевших птиц, у которых
при вскрытии были обнаружены характерные для данного заболевания патологии печени, почек и перикарда. Протективное действие вакцины выражали в процентах от числа незаболевших (защищенных) птиц.
Определение действия антигена НБ в составе ассоциированной вакцины. От цыплят опытных групп через 21 сутки после вакцинации проводили отбор образцов крови и в РТГА определяли средние титры сывороточных антител к антигену НБ.
Проведение контроля. В контрольной группе определяли заболеваемость птиц после заражения вирусом СГПК, а также проводили серологические исследования на присутствие иммунных к вирусу НБ особей.
Опыт считали успешным при условии, что заболеваемость СГПК интактных птиц составляла 100%, и особи, сероположительные к вирусу НБ, отсутствовали.
Результаты и обсуждение
В качестве базовой оценки концентрации данного антигена в цельном вирусном материале приняли инфекционный титр вируса (T0), установленный до процедуры инактивации. Средняя величина (n=4) инфекционного титра вируса СГПК составила 5,45+0,21 lgЛД50/см3, аналогичный показатель (n=3), установленный для вируса НБ, был равен
9,50±0,17 lgЭИД50/см³.
На различных этапах работы антигенный материал имел соответствующую степень разбавления (D):
– на этапе получения антигенной смеси D1=1/2;
– составления препарата D2=1/33;
– при проведении последовательных разведений водной фазы вакцины:
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
167
Dj=kj,
где k – кратность разведений;
j – номер шага.
Оценкой содержания антигена (Tag) в данном образце вакцины считали условный показатель (lgTag = lgT0 – ������������������������������
lgΣD��������������������������
), характеризующий концентрацию частиц инактивированного вируса или «титр антигена» в составе
препарата. Для обоих антигенов обозначения их концентраций приняли
одинаковыми.
Определение оптимальной концентрации антигена СГПК. В группах вакцинированных птиц, образованных соответственно величинам Tag,
устанавливали процент защищенных особей (Сprot) после искусственного
заражения вирусом СГПК.
Исследовали связь между показателями lgTag и Cprot. Для удобства
проведения вычислительных операций величины Сprot заменяли на их
линейные эквиваленты. С этой целью использовали табличные значения
функции, обратной интегралу вероятности нормального распределения:
Yprot=f(Сprot),
где Сprot – процент защищенных (незаболевших) птиц;
величина Yprot=0 соответствует Сprot=50%.
При этом, ориентируясь на получение более осторожных результатов,
предельные значения экспериментальных оценок Cprot=0% или Cprot=100%
принимали как Cprot=1% или как Cprot=99%, соответственно. Полученные
результаты в графическом виде представлены на рис. 1.
Представленное на рис. 1 регрессионное уравнение позволило произвести расчет ожидаемой концентрации антигена в см3 вакцины (lg“Тag),
которая при искусственном заражении обусловит защиту 95% привитого
поголовья, что соответствует табличному эквиваленту Yprot=1,64.
Искомое значение составило lg“Тag=-[(-11,48)-1,64]/2,99=4,39, или
“Тag≈2,4×104 условных единиц инактивированного вируса СГПК. Ориентируясь на более осторожный прогноз, использовали верхнюю границу
доверительного интервала полученной оценки, которая имела величину
(lgТag)+p≤0,05≈4,6, или (Тag)+p≤0,05≈4×104.
Так был вычислен пороговый критерий для вирусного сырья по содержанию антигена СГПК при изготовлении ассоциированной вакцины, т.е. минимальная величина инфекционного титра вируса СГПК (“Т0) до инактивации:
lg“Т0 =(lgТag)+p≤0,05+lg1/D1+ lg1/D2=4,6+0,301+0,477≈5,38(lgLD50/см³),
или “Т0≈(2,4 ×105) LD50/см³
168
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Рис. 1. Протективное действие ассоциированной вакцины
против вируса СГПК
Yprot – распределение преобразованных процентов защищенных птиц после
искусственного заражения вирусом СГПК соответственно концентрации антигена
данного вируса в вакцине (lgTag);
R2=0,919 – коэффициент детерминации;
lgTag/см³ – оценка концентрации вирусного антигена, производная от величины
титра инфекционного вируса до инактивации (lg LД50/см3).
Рис. 2. Действие антигена вируса НБ в составе
ассоциированной вакцины
lgTser – распределение средних титров сывороточных антител, установленных в
РТГА с антигеном вируса НБ соответственно концентрации антигена данного
вируса в вакцине lgTag;
lgTag – оценка концентрации вирусного антигена, производная от величины титра
инфекционного вируса до инактивации (lgLД50/см3).
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
169
Определение оптимальной концентрации антигена НБ. В группах
вакцинированных птиц, образованных соответственно величинам Tag,
устанавливали средние титры антител (Тser) к вирусу НБ.
Анализировали связь между концентрацией антигена НБ в составе
препарата (lgТag) и интенсивностью поствакцинального гуморального
иммунного ответа, показателями которого являлись оценки lgТser. Полученные результаты в графическом виде представлены на рис. 2. Анализ результатов проводили, исходя из положения о пороговом значении
протективного титра антител к вирусу НБ. В РТГА данная величина соответствует 1:32.
Используя регрессионное уравнение, представленное на рис. 2, определили ожидаемую концентрацию антигена в см3 вакцины (lg“Тag), которая способна обеспечить пороговый протективный титр сывороточных
антител. Искомое значение составило:
lg“Тag=-[(-7,09)-1,505]/1,18=7,28, или
“Тag≈1,9×107 условных единиц инактивированного вируса НБ.
Для повышения надежности прогноза использовали верхнюю границу
доверительного интервала полученной оценки, которая имела величину:
(lgТag)+p≤0,05≈7,5, или (Тag)+p≤0,05≈3×107
На этом основании был вычислен пороговый критерий для вирусного
сырья по содержанию антигена НБ при изготовлении ассоциированной
вакцины, т.е. минимальная величина титра инфекционного вируса НБ
(“Т0) до инактивации:
lg“Т0 =(lgТag)+p≤0,05+lg1/D1+ lg1/D2=7,5+0,301+0,477≈8,28(lgЭИД50/см³),
или “Т0≈(1,9 ×108) ЭИД50/см³
Выводы
При составлении ассоциированной инактивированной эмульсионной
вакцины против СГПК и НБ для достижения оптимальных концентраций
антигенов пороговыми критериями для вирусного сырья являются следующие значения инфекционных титров вируса: для СГПК – 5,38 lgLD50/см³,
или 2,4×105LD50/см³; для НБ – 8,28 lgЭИД50/см³, или 1,9×108ЭИД50/см³.
Предложенные критерии являются действительными, если антигены объединяются в равных объемах.
170
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Список литературы
1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медицина, - 1962. – 179 с.
2. Борисов, В.В. Синдром гидроперикардита кур: протективная эффективность
эмульсионной вакцины из вируса, полученного в культуре клеток // В.В. Борисов,
Д.С. Сурнев, Е.В. Ельникова // Совр. вопр. вет. мед. и биол.: сб. науч. тр. – Уфа,
2000. – С. 44-46.
3. Ельников, В.В. Разработка технологи изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и реовирусного теносиновита птиц: автореф…канд. вет. наук / Ельников Василий Викторович. – Владимир,
2003. – 26 с.
4. Инактивированные вакцины – возможные варианты применения в промышленном птицеводстве / В.В. Борисов, А.В. Борисов, С.К. Старов [и др.] // Матер.
конф. по птицеводству. – Зеленоград, 2003. – С. 208-209.
5. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста / Н.А. Лагуткин, А.Р. Арсентьев, Ж.А. Краснопевцева, В.И Ватропин // Вопр. вет. вирусологии,
микробиологии и эпизоотологии. - Покров, 1992. - Ч. 2. - С. 248-251.
6. Borisov, V.V. Hydropericardium syndrome in chickens in Russia / V.V. Borisov,
A.V. Borisov, A.A. Gusev // Proc. 11th Int. Congr. World Vet. Poultry. Assoc. – Budapest,
Hungary, 1997. – P. 258.
7. Development and test of inactivated autogenous vaccine against hydropericardium syndrome in Russia / V.V. Borisov, D.S. Surnev, A.V. Borisov, A.A. Gusev // Proc.
12th Int. Сongr. World Vet. Poultry Assoc. – Cairo, Egypt, 2001. – Р 367.
DETERMINATION OF OPTIMAL CONCENTRATIONS
OF ANTIGENS OF CHICKEN HYDROPERICARDITIS
SYNDROME AND NEWCASTLE DISEASE VIRUSES IN
ASSOCIATED INACTIVATED EMULSION VACCINE
A.A. Perepecha, S.V. Frolov, V.V. Borisov, D.L. Dolgov,
A.V. Borisov, A.B. Sarbasov, V.Yu. Kulakov
Summary
Optimal concentrations of inactivated viruses of chicken hydropericarditis
syndrome and Newcastle disease in the associated vaccine were determined.
Infectious virus titres before inactivation were used for the assessment of
concentrations. The associated preparation had an adequate level of antigenic
activity and protectivity.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
171
УДК 619:578.831.3:636.52/.58:57.082.26
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПРОДУКЦИИ
МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ ШТАММ «PV03-B»
В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КУРИНЫХ
ФИБРОБЛАСТОВ
Н.И. Герасимова, С.К. Старов, Т.Б. Манин,
И.А. Борисова, А.Б. Сарбасов
Резюме
В статье представлены экспериментальные данные по изучению
особенностей репродукции метапневмовируса птиц штамм «PV03-B» в
первично-трипсинизированной культуре клеток куриных фибробластов.
Введение
Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц – высококонтагиозное вирусное заболевание индеек, кур и других видов домашней и
дикой птицы. Болезнь проявляется синдромом опухшей головы или
SHS (Swollen Head Syndrome): увеличением инфраорбитальных синусов, выделением из глаз и ноздрей, а также наличием респираторного
синдрома (кашель, хрипы, чихание, угнетенное состояние) (4). Эпизоотический анализ показывает, что МПВИ чаще наблюдается в птицеводческих хозяйствах мясного направления и вызывает значительный экономический ущерб, который слагается из 100% заболеваемости
птиц, гибели их до 30%, снижения продуктивности, увеличения затрат
на ветеринарно-санитарные мероприятия (1).
Возбудителем МПВИ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Paramyxoviridae роду Metapneumovirus подсемейства
Pneumоvirinae, он имеет сложную структуру, покрыт липопротеидной
оболочкой. Первоначально вирус выделен в Южной Африке в конце 70-х
годов, в последующие годы его обнаруживали в Европе, Азии, Южной
Америке. С 1995 г. заболевание регистрируется в РФ (2, 3).
Для специфической иммунопрофилактики МПВИ применяют живые и инактивированные вакцины. Биологические свойства метапневмовирусов (МПВ) птиц и их тропизм обуславливают хорошую адаптацию к первичным культурам клеток: фибробластов эмбрионов кур,
фибробластов эмбрионов индейки и перевиваемым культурам клеток:
фибросаркомы японской куропатки (QT-35), фибробластов эмбрионов
172
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
кур (DF-1), почек детенышей хомяка (BHK-21), эмбриона макаки-резус
(МА-104), детенышей обезьяны (BGM-70), африканской зеленой мартышки (Vero).
В настоящее время вакцины против МПВИ готовят, в основном
используя перевиваемую культуру клеток Vero. Но часто перевиваемые
клеточные линии бывают контаминированы микоплазмами. Поэтому
возникла необходимость получения альтернативной культуры, в качестве которой использовали первичную культуру клеток куриных фибробластов (КФ).
Целью исследований явилось изучение особенностей репродукции
МПВ птиц штамм «PV03-B» в первичной культуре клеток КФ.
Материалы и методы
Вирус. МПВ птиц штамм «PV03-B», адаптированный к первичной культуре клеток КФ, 10 пассаж с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД50/см3.
Культура клеток. Для культивирования МПВ птиц и определения его
инфекционной активности использовали первично-трипсинизированную
культуру клеток КФ, полученную из 12-суточных SPF-эмбрионов кур
фирм Hy-Vac (США), Lohmann (Германия). Трипсинизацию эмбрионов
проводили по общепринятой методике. Посевная концентрация клеток
составляла 0,6-0,7 млн/см3. Культуру клеток выращивали в течение 1, 2,
3 и 4 суток.
Питательные среды и растворы. В качестве ростовой среды использовали полусинтетическую монослойную питательную среду ПСП с 10%
сыворотки крови КРС, рН 7,0 – 7,1.
В качестве поддерживающей среды использовали питательную среду
ПСП с 2% инактивированной сыворотки крови КРС, рН 7,3 – 7,5.
Монослой культуры клеток отмывали солевым раствором Хенкса,
рН 7,1 – 7,2.
Трипсинизацию куриных эмбрионов проводили 0,25% раствором
трипсина, рН 7,5.
Для предотвращения бактериального пророста сред и растворов добавляли антибиотики в общепринятой дозировке.
Сосуды и установка. Культивирование культуры клеток КФ и
МПВ птиц проводили в роллерных сосудах ёмкостью 3 дм3 при температуре 37,5±0,5ºС. Скорость вращения сосудов на установке стеллажноярусного типа при выращивании клеток составила 4-6 об/час, при культивировании вируса в круговом монослое первичной культуры клеток
КФ – 10-12 об/час.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
173
МПВ птиц титровали в односуточной монослойной первичной культуре клеток КФ методом последовательных 10-кратных разведений. Титр
вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3.
Стерильность вируса определяли по ГОСТ 28085-89. Контроль клеток, вируса и сыворотки на контаминацию микоплазмами проводили в
среде Кагана.
Результаты и обсуждение
При изготовлении вакцины необходимо знать время максимального
накопления МПВ птиц в первичной культуре клеток КФ, поскольку титр
вируса является одним из основных показателей, характеризующих качество полученного вируссодержащего материала.
Первым этапом наших исследований было определение влияния возраста культуры клеток КФ на накопление МПВ птиц штамм «PV03-B».
1-, 2-, 3- и 4-суточные культуры клеток КФ заражали вирусом с множественностью инфицирования, равной 0,1 ТЦД50/кл. Титр инфекционной активности вируса определяли через 72 ч после заражения. Результаты исследований по определению влияния возраста культуры клеток КФ
на титр МПВ птиц представлены в табл. 1.
Таблица 1
Накопление МПВ птиц штамм «PV03-B» в первичной культуре
клеток КФ в зависимости от возраста заражаемой культуры
Возраст культуры,
сут.
Качество монослоя
Титр вируса,
lg ТЦД50/см3
1
редкий
5,25±0,25
2
средней плотности
6,83±0,29
3
плотный
7,42±0,14
4
плотный
7,0±0,25
В редком монослое суточной культуры клеток КФ МПВ птиц размножался быстро, судя по цитопатическому действию (ЦПД), которое было
выраженным, охватывало весь монослой с появлением округлых клеток,
образованием крупных симпластов и окон. Инфекционный титр вируса
составлял 5,25±0,25 lg ТЦД50/см3.
В 2-суточной культуре КФ из-за большего количества выросших клеток, по сравнению с суточной культурой, монослой имел среднюю плотность. ЦПД МПВ птиц было четким и характеризовалось округлением,
174
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
слиянием клеток, появлением симпластов и окон во всем монослое. Титр
вируса находился в пределах 6,83±0,29 lg ТЦД50/см3.
Размножение МПВ птиц в 3-суточной первичной культуре клеток КФ
с плотным монослоем сопровождалось развитием ЦПД, которое начиналось через 24 ч и достигало максимума через 72 ч после заражения. Оно
проявлялось округлением клеток и изменением характерного морфологического рисунка культуры через 24 ч роста вируса, слиянием отдельных
клеток и образованием симпластов, формированием крупных симпластов
с вакуолизацией цитоплазмы через 48 ч и появлением окон в монослое
через 72 ч после инфицирования. Поражение монослоя было на 85-90%,
титр вируса достигал 7,42±0,14 lg ТЦД50/см3.
В 4-суточной культуре клеток КФ монослой был плотным, в цитоплазме клеток отмечали зернистость. Размножение вируса, по сравнению
с 3-суточной культурой, с деструктивными изменениями в клетках происходило слабее. ЦПД вируса развивалось медленнее и было менее выраженным. Поражение монослоя составляло 80-85%, титр вируса был в
пределах 7,0±0,25 lg ТЦД50/см3.
Установлено, что в 1- и 2-суточных культурах клеток КФ из-за меньшего количества клеток в монослое и в 4-суточной культуре, где клетки
были менее чувствительными к вирусу, МПВ птиц штамм «PV03-B» на
72 ч имел инфекционные титры ниже, чем в 3-суточной культуре КФ: от
5,25±0,25 до 7,0±0,25 lg ТЦД50/см3.
3-суточная культура клеток КФ являлась наиболее пригодной для
выращивания МПВ птиц, накопление вируса в ней было максимальным,
титр вируса составлял 7,42±0,14 lg ТЦД50/см3.
Таким образом, физиологическое состояние клеточной популяции и
количество клеток являются важным фактором, определяющим интенсивность размножения МПВ птиц, степень проявления ЦПД и титр вируса.
Вторым этапом исследований было определение накопления МПВ
птиц штамм «PV03-B» в первичной культуре клеток КФ в зависимости от
множественности заражения.
3-суточную культуру клеток КФ заражали вирусом множественностью инфицирования 0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл и инкубировали при температуре 37,5±0,5ºС в течение 72 ч.
Полученный вируссодержащий материал замораживали на 24 ч при
температуре минус 40ºС и оттаивали при комнатной температуре 18-22ºС.
Путем встряхивания отделяли льдинками инфицированные клетки с внутренней поверхности стекла роллерного сосуда. После оттаивания вируссодержащую суспензию титровали в первичной культуре клеток КФ. На-
175
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
копление МПВ птиц при культивировании в однослойной культуре клеток
КФ в зависимости от множественности заражения представлено в табл. 2.
Таблица 2
Накопление МПВ птиц штамм «PV03-B» в первичной культуре
клеток КФ в зависимости от множественности заражения
Вирус
МПВ птиц
штамм «PV03-B»
Множественность
заражения,
ТЦД50/кл
Поражение
монослоя, %
Титр вируса,
lg ТЦД50/см3
1,0
100
7,08±0,14
0,1
70 – 80
7,42±0,14
0,01
50 – 60
6,58±0,14
Из табл. 2 следует, что при заражении культуры клеток КФ МПВ
птиц множественностью инфицирования 0,1 ТЦД50/кл на 72 ч культивирования титр вируса с 70-80% поражением монослоя составлял
7,42±0,14 lg ТЦД50/см3. При множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл
поражение монослоя было 100%, но активность вируса не превышала
7,08±0,14 lg ТЦД50/см3. При инфицирующей дозе заражения 0,01 ТЦД50/кл
поражение монослоя к 72 ч составляло 50-60%, а титр вируса достигал
6,58±0,14 lg ТЦД50/см3. Следовательно, для получения максимального накопления вируса целесообразно использовать множественность заражения, равную 0,1 ТЦД50/кл.
Из полученных результатов исследований можно сделать вывод, что
3-суточная культура клеток КФ, имеющая наибольшее количество жизнеспособных чувствительных клеток, и множественность заражения 0,1 ТЦД50/кл
являются оптимальными параметрами при культивировании МПВ птиц.
С установлением оптимального возраста культуры для заражения и
множественности инфицирования вируса стало возможным определение
срока максимального накопления МПВ птиц штамм «PV03-B» в культуре
клеток КФ.
В опыте использовали 40 роллерных сосудов с 3-суточной первичной
однослойной культурой клеток КФ, из них 4 – контрольные: 2 – со сменой
ростовой среды на поддерживающую (контроль среды), 2 – без смены среды (контроль культуры). Культуру клеток КФ инфицировали МПВ птиц с
множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл.
Ежедневно в течение 4 суток прекращали инкубировать по 3 роллерных сосуда с зараженной культурой клеток КФ на каждую фракцию. Инфекционную активность вируса определяли методом титрования в пер-
176
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
вичной культуре клеток КФ: в культуральной жидкости; инфицированных
клетках КФ после двукратной отмывки монослоя солевым раствором
Хенкса и снятия их со стекла механическим путем; общей вируссодержащей суспензии после замораживания-оттаивания. Данные о репродукции
МПВ птиц представлены в табл. 3.
Таблица 3
Репродукция МПВ птиц штамм «PV03-B»
в монослое культуры клеток КФ
Вирус
МПВ птиц
штамм
«PV03-В»
Фракции
исследуемого
материала
Время культивирования, сут.
Титр вируса, lg ТЦД50/см3
1
2
3
4
внутриклеточная
5,25±0,25 7,33±0,29 7,83±0,14 7,17±0,14
внеклеточная
3,17±0,29 6,33±0,14 6,83±0,29 6,75±0,25
общая
5,00±0,25 6,83±0,29 7,42±0,14 7,00±0,25
Из данных, представленных в табл. 3, следует, что МПВ птиц штамм
«PV03-B» имел максимальное накопление вируса на 3 сутки культивирования после заражения во всех 3 фракциях в титре 7,83±0,17; 6,83±0,29
и 7,42±0,14 lg ТЦД50/см3, соответственно. Значительный выход вируса в
культуральную среду происходил на 3-4 сутки, тем самым увеличивая титр
вируса во «внеклеточной фракции» до 6,83±0,29 – 6,75±0,25 lg ТЦД50/см3.
Основная масса репродуцируемых вирионов МПВ птиц накапливалась в клетках КФ. Поэтому при получении вируссодержащей суспензии,
идущей на изготовление вакцины, следует во время оттаивания материала путем встряхивания льдинками тщательно отделять инфицированные
клетки с поверхности сосуда и разрушать их. Это обеспечивает наибольший выход вируса из инфицированных клеток.
Таким образом, проведенные исследования по изучению культуральных свойств МПВ птиц штамм «PV03-B» позволили определить оптимальные условия культивирования вируса: возраст культуры клеток КФ, используемой для заражения – 3-суточный, время культивирования вируса – 72 ч,
множественность инфицирования – 0,1 ТЦД50/кл. При соблюдении установленных условий можно получить культуральный вируссодержащий материал с титром инфекционной активности 7,42±0,14 ТЦД50/см3.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
177
Выводы
1. Оптимальными условиями выращивания МПВ птиц штамм
«PV03-B», позволяющими получить высокоактивный вируссодержащий культуральный материал с титром инфекционной активности
7,42±0,14 lg ТЦД50/см3, являются: возраст первично трипсинизированной
монослойной культуры клеток КФ, используемой для заражения – 3 суток; множественность инфицирования штамм «PV03-B» – 0,1 ТЦД50/кл.;
оптимальный срок сбора вируса – 72 ч после заражения.
2. Основная масса МПВ птиц находится в клетках КФ, титр вируса
составляет 7,83±0,14 lg ТЦД50/см3.
Список литературы
1. Борисова, И.А. Пневмовирусная инфекция птиц / И.А. Борисова,
С.К. Старов // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир,
2006. – Т. 4. – С. 281-296.
2. Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using
monoclonal antibodies / J.K.A. Cook, B.V. Jones, M.M. Ellis [et al.] // Avian Pathol. –
1993. – Vol. 22. – P. 257-273.
3. Avian pneumovirus (APV) RNA from wild and sentiml birds in the United
States has genetic homology with RNA from APV isolates from donustik turkins /
H.J. Shin, M.K. Vjenga, B.M. Comb [еt al.] // J. Clin. Miсrobiol. – 2000. – Vol. 38. –
P. 4282-4284.
4. Experimental infections of turkeys, chickens, ducks, geese, guinea fowl, pheasants
and pigeons with turkey rhinotracheitis virus // R. Gough, M.S. Collins, W.J. Cox,
N.J. Chettle // Vet. Rec. – 1988. – Vol. 123. – P. 58-59.
Peculiarities of Reproduction of Avian
Metapneumovirus Strain «PV03-B» in Primary
Chicken Fibroblast Cell Culture
N.I. Gerasimova, S.K. Starov, T.B. Manin,
I.A. Borisova, A.B. Sarbasov
Summary
Experimental data on peculiarities of reproduction of avian
metapneumovirus strain «PV03-B» in primarily trypsinized chicken fibroblast
cell culture are provided in the paper.
178
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
УДК 619:578.831.3:636.52/.58:57.082.26
НАКОПЛЕНИЕ МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ
В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КУРИНЫХ
ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ
СПОСОБАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Н.И. Герасимова, А.А. Антонычев, Л.М. Обухова,
С.К. Старов, Т.Б. Манин, Д.Ю. Козлов
Резюме
Проведены исследования по сравнению способов выращивания метапневмовируса птиц штамм «PV03-B» с целью использования при изготовлении вакцин и диагностических наборов. Роллерные способы выращивания обеспечивали высокое накопление вируса в первичной культуре
клеток куриных фибробластов.
Введение
Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц встречается преимущественно в бройлерных хозяйствах на откормочных площадках, а также
в репродукторах у кур родительского стада, наносит значительный экономический ущерб (снижение продуктивности, гибель птиц, увеличение
затрат на ветеринарно-санитарные мероприятия) (4).
Метапневмовирус (МПВ) птиц является типично респираторным патогеном и чаще всего проявляется при смешанной инфекции с другими
вирусами, бактериями и микоплазмами.
Специфическая профилактика МПВИ проводится как живыми, так и
инактивированными вакцинами зарубежного производства. В последнее
время были разработаны и всесторонне испытаны новые отечественные
инактивированные моно- и ассоциированные вакцины против МПВИ,
которые показали высокую эффективность при применении в товарных
бройлерных хозяйствах ряда регионов РФ.
Несмотря на широкий спектр предложенных вакцин против МПВИ,
работы по получению новых препаратов не прекращаются и экономически оправданы.
Одной из основных задач при изготовлении высокоэффективных вакцин является качество и количество специфического антигена в прививной дозе. Увеличение количества антигена возможно с помощью подбора
высокоиммуногенных производственных штаммов вирусов (5, 6, 8, 11),
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
179
чувствительных клеточных систем (1, 2, 3, 5, 9) и эффективных способов
культивирования вирусов (7, 10, 12).
Целью данной работы являлось сравнение способов выращивания
МПВ птиц штамм «PV03-B» с целью дальнейшего его использования для
изготовления вакцин и диагностических наборов.
Материалы и методы
Вирус. МПВ птиц штамм «PV03-B» с инфекционной активностью
7,0 lg ТЦД50/см3.
Культура клеток. Культивирование МПВ птиц и определение его
инфекционной активности проводили в первично трипсинизированой
культуре клеток куриных фибробластов (КФ) СПФ-эмбрионов кур фирм
Lohmann (Германия), Hy-Vac (США).
Питательные среды и растворы. В качестве ростовой среды для культуры клеток КФ использовали полусинтетическую монослойную питательную
среду ПСП с добавлением 10% сыворотки крови КРС, pH среды 7,0-7,2.
В качестве поддерживающей среды для вируса использовали питательную среду ПСП с 2% инактивированной при 58ºС в течение 20 мин
сыворотки крови КРС, pH среды 7,3-7,5.
Монослой культуры клеток КФ отмывали солевым раствором Хенкса,
рН 7,1-7,2.
Корректировку pH среды проводили 7,5% раствором бикарбоната
натрия.
При получении суспензии клеток из эмбрионов кур для разрыхления
межклеточных связей и отделения клеток во время трипсинизации использовали диспергирующий раствор (0,25% раствор трипсина), pH 7,5.
Для предотвращения бактериального пророста сред и раствора Хенкса добавляли антибиотики в общепринятой дозировке.
Сосуды и роллерная установка. Выращивание культуры клеток КФ
и МПВ птиц проводили в плоских 1,5 дм3 матрасах и роллерных бутылях
емкостью 3 дм3.
Роллерные сосуды помещали на роллерную установку промышленного типа. Скорость вращения бутылей для культуры клеток КФ составляла 4-6 об/час, для вируса – 10-12 об/час.
Первичную монослойную культуру клеток КФ готовили по общепринятой методике, используя посевную концентрацию клеток для матрасов
250-300 тыс/см3, для роллерных сосудов – 600-800 тыс/см3. Культуру клеток
КФ выращивали в течение 2-3 сут. при температуре 37,5±0,5ºС до формирования сплошного плотного монослоя без признаков дегенерации клеток.
180
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Из сосудов с культурой клеток КФ сливали ростовую среду, монослой
отмывали солевым раствором Хенкса и вносили вирус с множественностью
инфицирования (М) 0,3-0,5 ТЦД50/кл. Через 1 ч контакта вируса с клетками
заливали поддерживающую среду в матрасы по 150 см3, в роллерные сосуды – по 300 см3, и культивировали вирус 72 ч при температуре 37,5±0,5ºС.
Инфицированную и контрольную культуры клеток ежедневно просматривали под микроскопом на наличие характерных морфологических
изменений клеток (ЦПД). В момент наивысшей дегенерации клеток монослоя (70-80%) на 72 ч проводили однократное замораживание-оттаивание
вируссодержащей культуральной жидкости и исследовали ее на стерильность, инфекционную активность вируса.
Инфекционную активность МПВ птиц штамм «PV03-B» определяли
титрованием в суточной культуре клеток КФ по ЦПД. За титр вируса считали наивысшее его разведение, вызывающее четкое ЦПД в 50% культуры
клеток КФ. Титр вируса выражали в lg ТЦД50/см3 и рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина.
Стерильность вирусного сырья определяли в соответствии с
ГОСТ 28085-89. Контроль культуры клеток КФ и сыворотки на контаминацию микоплазмами проводили в среде Кагана.
С целью повышения антигенной активности МПВ птиц штамм
«PV03-B» были сформированы четыре группы роллерных сосудов (по
6 шт.) с культурой клеток КФ.
В роллерные сосуды 1-й группы после контакта вируса с клетками
вносили по 100 см3 поддерживающей среды.
В роллерные сосуды 2-й группы на 48-часовой монослой клеток вносили одновременно с поддерживающей средой вирус и «свежие» или хранившиеся клетки КФ в концентрации 500 тыс/см3.
В роллерные сосуды 3-й группы после контакта вируса с клетками с
поддерживающей средой вносили «свежие» или хранившиеся клетки КФ
в концентрации 500 тыс/см3.
В роллерные сосуды 4-й группы через 24 ч культивирования клеток КФ вносили «свежие» или хранившиеся клетки КФ в концентрации
500 тыс/см3. Через 48 ч после внесения клеток монослой отмывали солевым раствором Хенкса и инфицировали вирусом. Через 1 ч контакта
вируса с клетками в сосуды вносили по 300 см3 поддерживающей среды и
культивировали вирус в течение 72 ч.
При отработке способов культивирования вируса во 2, 3 и 4 группах
возникла необходимость в проведении новой трипсинизации или использовании хранящихся клеток.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
181
Для определения влияния времени хранения первичнотрипсинизированных клеток КФ на их рост культуру клеток КФ выращивали в роллерных сосудах из клеточных суспензий, находившихся при
4ºС в течение 1, 3 и 5 сут. Концентрация клеток при посеве составляла
600-800 тыс/см3. Внося 300 см3 поддерживающей среды ПСП, монослой
клеток инфицировали вирусом с М=0,3-0,5 ТЦД50/кл. Через 72 ч определяли инфекционную активность вируса.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований было изучено влияние продолжительности хранения первичной культуры клеток КФ на качество монослоя
и репродукцию МПВ птиц штамм «PV03-B». Результаты исследований
представлены в табл. 1.
Во всех случаях хранения клеток в суспензии в течение 3 сут. со сменой среды наблюдался сплошной, плотный монослой, при заражении которого титр вируса был 7,12±0,13 – 7,35±0,13 lg ТЦД50/см3. Хранение клеток
в течение 3 сут. без смены среды приводило к снижению титра вируса на
0,5 lg ТЦД50/см3, и качество монослоя было удовлетворительным. После
хранения клеток без смены среды и со сменой в течение 5 сут. потенция роста клеток была понижена, в результате чего формировался неравномерный
монослой, который был рыхлым и легко отслаивался при встряхивании. Но,
несмотря на удовлетворительное состояние монослоя, вирус репродуцировался, и титр его составил 5,48±0,50 и 6,12±0,13 lg ТЦД50/см3. Следовательно, первично трипсинизированную культуру клеток КФ после 3 сут. хранения при температуре 4ºС со сменой среды можно использовать в опытах.
Таблица 1
Влияние продолжительности хранения суспензии клеток КФ
на качество монослоя и репродукцию МПВ птиц штамм «PV03-B»
(n=3)
Срок
хранения, Метод хранения
сут.
без смены среды
1
со сменой среды
3
5
Живые
клетки,
%
97
Качество
монослоя
Титр вируса,
lg ТЦД50/см3
сплошной, плотный
7,38±0,12
99
сплошной, плотный
7,35±0,13
без смены среды
75
сплошной, неплотный
6,61±0,13
со сменой среды
95
сплошной, плотный
7,12±0,13
без смены среды
70
70-80 %
5,48±0,50
со сменой среды
90
сплошной, неплотный
6,12±0,13
182
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
При отработке способов культивирования МПВ птиц в первичной
культуре клеток КФ отмечено: в 1-й группе опыта через 48 ч культивирования вируса наблюдалось закисление pH среды из-за уменьшенного
объема поддерживающей среды, в нее добавляли 7,5% бикарбонат натрия
до значения pH среды 7,4-7,5 для поддержания инфекционной активности
вируса; во 2, 3 и 4-й группах в течение 24 ч культивирования вируса при
просмотре под микроскопом отмечали максимальное прикрепление внесенных клеток; в 4-й группе через 24 ч после дополнительного внесения
на монослой «свежих» или хранившихся клеток почти все добавленные
клетки прикреплялись, а через 48 ч отмечали образование полислоя.
Данные культивирования МПВ птиц в монослое культуры клеток КФ
в матрасах и вращающихся бутылях при обычном методе, уменьшенном
объеме поддерживающей среды, внесении дополнительных клеток культуры КФ представлены в табл. 2.
Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что при
роллерном культивировании МПВ уровень накопления вируса выше, чем
при стационарном. При роллерных методах культивирования наибольшая
активность вируса отмечена в полислойной культуре клеток КФ.
Таблица 2
Накопление МПВ птиц штамм «PV03-B» в культуре клеток КФ
при различных способах культивирования
(n=3)
Репродукция вируса в культуре клеток КФ, lg ТЦД50/см3
В роллерных сосудах
В
матрасах
7,08±0,14
Обычный
метод
Уменьшенный
объем среды
(1 группа)
7,33±0,14
7,83±0,14
РоллерноВнесение клеток
Полислой
суспензионный
со средой
(4 группа)
(2 группа)
(3 группа)
7,90±0,08
8,05±0,14
8,54±0,13
Использование однослойной стационарной первичной культуры
клеток КФ позволило получить вирус с титром 7,08±0,14 lg ТЦД50/см3,
пригодный для производства вакцины. При этом столкнулись с рядом
трудностей, связанных с излишними затратами рабочего времени и материалов. Более выгодной оказалась роллерная культура, которая имела
оптимальное отношение полученной площади культивирования к объему
питательной среды, создавая благоприятные условия для накопления клеток и размножения вируса. Титр вируса составлял 7,33±0,14 lg ТЦД50/см3.
Уменьшение объема поддерживающей среды в 3 раза повышало титр вируса на 0,5 lg. При роллерно-суспензионном культивировании вируса титр
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
183
достигал 7,90±0,08 lg ТЦД50/см3. Внесение клеток вместе с поддерживающей средой на инфицированный монослой культуры КФ способствовало
повышению титра вируса до 8,05±0,14 lg ТЦД50/см3. Используя полислойный метод, получали титр вируса 8,54±0,13 lg ТЦД50/см3.
Для изготовления вирусного сырья в больших объемах приемлем
более простой обычный метод культивирования МПВ птиц в роллерных
сосудах. Полислойный метод культивирования МПВ птиц можно использовать при получении диагностических наборов на МПВИ птиц.
Выводы
1. Инфекционная активность МПВ птиц штамм «PV03-B», выращенного в первичной однослойной культуре клеток КФ в роллерных сосудах,
выше, чем в матрасах в стационарных условиях.
2. Первично трипсинизированную культуру клеток КФ после 1-, 2-,
3-суточного хранения при температуре 4ºС со сменой среды можно использовать для проведения исследований и наработки вакцин.
3. МПВ птиц с наибольшим титром (8,54±0,13 lg ТЦД50/см3) был получен при полислойном методе культивирования.
4. Предложенные методы культивирования МПВ птиц могут быть использованы для повышения эффективности производства вакцин и диагностических наборов, снижения затрат технологического процесса и себестоимости вакцин.
Список литературы
1. Биотехнология клеток животных: в 2 т. Т. 2 / под ред. Р.Д. Спиера,
Дж.Б. Гриффита. – М.: Агропромиздат, 1989. – 165 с.
2. Гусев, А.А. Развитие биотехнологии культур клеток во «ВНИИЗЖ» /
А.А. Гусев, Ш.К. Куляшбекова, В.Н. Герасимов // Современные аспекты патологии
животных: матер. конф., посвящ. 40-летию со дня основания «ВНИИЗЖ». – Владимир, 1998. – С. 168-173.
3. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре. Методы и применение в биотехнологии / Л.П. Дьяконов, З.И. Ситьков. – М.: Компания Спутник, 2000. – 400 с.
4. Изучение биологических свойств изолята метапневмовируса птиц
аMPV/B/2-07 / З.Б. Хлебовец, А.Э. Меньщикова, М.Е. Качалова [и др.] // Вет. патология. – 2007. – № 4 (23). – С. 141-146.
5. Инфекционная патология животных: в 2-х томах / под ред. А.Я. Самуйленко,
Б.В. Соловьёва, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. – М.: Академкнига, 2006. – 1911 c.
6. Ковалишина, Н.И. Изучение биологических свойств парвовируса собак
штамма R-72 / Н.И. Ковалишина, В.Ю. Фоменко, С.К. Старов // Достижения молодых ученых – в вет. практику: матер. конф. – Владимир, 2000. – С. 123-124.
184
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
7. Культивирование штамма вируса болезни Ауески, маркированного по гликопротеину Е, для изготовления вирусвакцины / Т.И. Корпусова, Б.Л. Манин,
В.М. Захаров [и др.] // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных:
матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 390-393.
8. Оптимизация параметров культивирования штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц / С.В. Фролов, Т.Б. Манин, А.В. Борисов [и др.] // Тр. Федерального
центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2007. – Т. 5 – С. 131-136.
9. Пат. 2061753 РФ, МПК6С12N5/06. Штамм культивируемых клеток гонад
Copra hircus L – продуцентов вирусов животных. / Е.Е. Федорова, Г.А. Худяков,
Н.И. Герасимова [и др.]; ВНИИЗЖ. – Заявл.02.08.94; опубл. 10.06.96.
10. Способ повышения биологической активности и иммуногенных свойств производственного штамма FS-126 вируса герпеса индеек / Ш.К. Куляшбекова, А.А. Гусев, Ж.А. Шажко [и др.] // Современные аспекты патологии животных: матер. конф.,
посвящ.40-летию со дня основания «ВНИИЗЖ». – Владимир, 1998. – С. 146-152.
11. Ходакова, Н.Н. Адаптация вируса ящура к перевиваемым клеточным культурам свиного происхождения / Н.Н. Ходакова // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: матер. Междунар. научн.-практ. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 393-394.
REPLICATION OF AVIAN METAPNEUMOVIRUS IN
CHICKEN FIBROBLAST PRIMARY CELL CULTURE AT
DIFFERENT TYPES OF CULTIVATION
N.I. Gerasimova, A.A. Antonychev, L.M. Obukhova,
S.K. Starov, T.B. Manin, D.Yu. Kozlov
Summary
Investigations on comparison of methods of «PV03-B» avian
metapneumovirus growing for production of vaccines and diagnostic kits
were conducted. Roll-bottle growing methods provided a high level of virus
replication in chicken fibroblast primary cell culture.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
185
УДК 619:578.831.3:636.52/.58:57.082.26
ВЛИЯНИЕ ПОЛИОНОВ НА РЕПРОДУКЦИЮ
МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
VERO
Н.И. Герасимова, Л.В. Бурдейная, А.М. Евсеев,
С.К. Старов, Т.Б. Манин, Д.Ю. Козлов
Резюме
Проведены исследования по определению влияния полионов на репродукцию метапневмовируса птиц в культуре клеток Vero. Установлено,
что выращивание вируса при введении трипсина в дозах 20, 30 мкг/см3,
ДЕАЕ-декстрана в дозе 30 мкг/см3 способствовало повышению инфекционной активности на 1,0 lg.
Введение
Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц – высокопатогенное
заболевание верхних дыхательных путей кур и индеек, чаще всего проявляется при смешанной инфекции с вирусами, бактериями, микоплазмами и наносит значительный экономический ущерб птицеводству мясного
направления (снижение продуктивности, гибель, увеличение затрат на
ветеринарно-санитарные мероприятия) (1, 2, 3).
Борьба с этим заболеванием осуществляется с применением живых и
инактивированных вакцин зарубежного производства. В настоящее время
в РФ разработаны и успешно применяются инактивированные моно- и
ассоциированные вакцины против МПВИ в товарных бройлерных хозяйствах и у кур родительских стад.
Успех вакцинации зависит от качества и количества специфического антигена в прививной дозе вакцины. Увеличение количества антигена
возможно с помощью подбора высокоиммуногенных штаммов, чувствительных культур клеток, способов культивирования, концентрирования
вируса, применения полионов (4, 5, 6). Полионы – вещества, которые ингибируют макромолекулярный синтез, то есть в результате обработки полионами мембрана клеток претерпевает определенную деструкцию, утрачивает механизмы, препятствующие адсорбции и проникновению вируса
в клетку, выключению её защитных механизмов.
Целью исследований являлось изучение влияния полионов на метапневмовирус (МПВ) птиц, выбор их оптимальных доз при культивировании МПВ птиц в перевиваемой культуре клеток Vero.
186
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Материалы и методы
Вирус. МПВ птиц штамм «PV03-B», 5 пассаж в культуре клеток Vero
с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦД50/см3.
Культура клеток. Для культивирования МПВ птиц и определения его
инфекционной активности использовали перевиваемую культуру клеток
почки африканской зеленой мартышки (Vero).
Среды и растворы. В качестве ростовой среды при культивировании культуры клеток Vero использовали полусинтетическую суспензионную питательную среду ПСС с добавлением 10% сыворотки крови
КРС, рН 7,0 – 7,1.
В качестве поддерживающей среды для выращивания вируса использовали питательную среду ПСС с добавлением 2% инактивированной при
58ºС в течение 20 минут сыворотки крови КРС, рН 7,5 – 7,6.
Монослой культуры клеток отмывали солевым раствором Хенкса,
рН 7,1 – 7,2.
Доза инфицирования составила 0,5 ТЦД50/кл. За титр вируса считали
наивысшее его разведение, вызывающее четкое цитопатическое действие
(ЦПД) в 50% инфицированной культуры клеток Vero. Титр вируса выражали в lg ТЦД50/см3 и рассчитывали по методу Кербера в модификации
Ашмарина.
В качестве стимуляторов роста МПВ птиц использовали полионы в
дозах: протаминсульфат 50 и 100 мкг/см3; диметилсульфоксид (ДМСО)
1%; гепарин 30 ЕД/см3; трипсин 20 и 30 мкг/см3; ДЕАЕ-декстран 30, 40 и
50 мкг/см3.
Стерильность вируссодержащего сырья определяли в соответствии с
ГОСТ 28085-89.
Контроль клеток и сыворотки на наличие микоплазм проверяли методом высева на 0,3% полужидкий агар PPLO.
Культуру клеток Vero готовили по разработанному в ФГУ «ВНИИЗЖ»
регламенту, используя посевную концентрацию клеток 100-120 тыс/см3.
Культуру выращивали в матрасах емкостью 1,5 дм3 в течение 3 суток
при температуре 37,5±0,5ºС в стационарных условиях до формирования
сплошного монослоя.
Перед внесением полионов ростовую среду из матрасов сливали. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса.
Для опыта формировали 2 группы (по 3 шт.) матрасов.
В 1-й группе на отмытый монослой клеток за 4 ч до заражения вносили полионы, инокулят удаляли, а культуру клеток инфицировали вирусом.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
187
Контакт вируса с клетками осуществляли в течение 1 ч. Далее в каждый
сосуд заливали по 150 см3 поддерживающей среды.
Во 2-й группе после контакта вируса с клетками вместе с поддерживающей средой вносили полионы.
Размножение вируса определяли по наличию ЦПД в зараженной
культуре.
На первом этапе размножения вируса происходило сглаживание
характерного рисунка культуры клеток Vero, на втором этапе – клетки
сливались и образовывали симпласты. На 24 и 48 ч культивирования вируссодержащую суспензию замораживали при температуре минус 40ºС.
Через 24 ч содержимое сосудов оттаивали при комнатной температуре и,
встряхивая, тщательно отбивали льдинками инфицированные клетки с
внутренней поверхности сосудов. Вирусный материал проверяли на стерильность и определяли инфекционную активность титрованием в суточной культуре клеток Vero.
Результаты и обсуждение
При цитологическом анализе опытов отмечено, что ДЕАЕ-декстран
при постоянном присутствии в дозе 50 мкг/см3 или контактном внесении
обладал цитотоксическим действием. Это приводило к значительному
увеличению межклеточных пространств в культуре клеток Vero, зернистости и вакуолизации цитоплазмы, появлению гигантских клеток, которые отторгались от стекла, образуя на вторые сутки в монослое пустоты.
В контрольной культуре и в дозах 30 и 40 мкг/см3 подобных изменений
не наблюдалось. Однако при обработке ДЕАЕ-декстраном в дозах 30 и
40 мкг/см3 в инфицированной культуре клеток Vero ЦПД было четче, развивалось раньше и более интенсивно на 24 ч после внесения вируса.
Трипсин в дозах 20 и 30 мкг/см3 не вызывал визуально деструктивных
изменений клеток, ускорял срок наступления ЦПД на 6-7 ч.
1% раствор ДМСО, протаминсульфат в дозах 50 и 100 мкг/см3 изменений в клетках не вызывали.
Гепарин в дозе 30 ЕД/см3 не оказывал токсического действия на клетки.
Накопление МПВ птиц штамм «PV03-B» в культуре клеток Vero при
постоянном присутствии и контактной обработке клеток полионами представлено в таблице.
Из данных таблицы видно, что культивирование МПВ птиц в культуре клеток Vero при контактном введении или постоянном присутствии
ДЕАЕ-декстрана в дозе 30 мкг/см3 способствовало повышению инфекционной активности вируса на 1,0 lg, по сравнению с контролем, титр ви-
188
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
руса составлял 7,97±0,14 – 8,04±0,16 lg ТЦД50/см3, соответственно. Доза
50 мкг/см3 токсична для клеток, титр вируса был в пределах от 2,67±0,18
до 4,08±0,14 lg ТЦД50/см3.
Таблица
Влияние полионов на репродукцию МПВ птиц штамм «PV03-B»
в культуре клеток Vero
Полионы
Концентрация
50 мкг/см3
Протаминсульфат
100 мкг/см3
ДМСО
1%
Гепарин
30 ЕД/см3
20 мкг/см3
Трипсин
30 мкг/см3
30 мкг/см3
ДЕАЕ-декстран
40 мкг/см3
50 мкг/см3
Контроль
–
Введение
полионов
Титр вируса, lg ТЦД50/см3
время культивирования, ч
24
48
конт.
6,67±0,18
7,17±0,14
пост.
6,58±0,14
7,08±0,14
конт.
6,47±0,14
7,08±0,14
пост.
6,24±0,16
6,83±0,14
конт.
5,08±0,14
6,33±0,18
пост.
5,17±0,14
6,47±0,14
конт.
5,08±0,14
6,24±0,16
пост.
5,17±0,14
6,48±0,06
конт.
6,08±0,14
7,83±0,14
пост.
6,17±0,14
8,05±0,14
конт.
6,47±0,14
7,97±0,14
пост.
6,83±0,14
8,08±0,14
конт.
6,24±0,16
7,97±0,14
пост.
6,48±0,06
8,04±0,16
конт.
6,02±0,14
7,75±0,25
пост.
6,12±0,14
7,83±0,14
конт.
4,08±0,14
3,42±0,14
пост.
3,33±0,18
2,67±0,18
–
5,08±0,14
7,08±0,14
конт. – контактное введение;
пост. – постоянное присутствие.
Культивирование МПВ птиц при постоянном присутствии трипсина в дозах 20 и 30 мкг/см3 повышало титр вируса на 1,0 lg и составило 8,0 lg ТЦД50/см3. Характерно, что на 24 ч титр вируса при дозе
30 мкг/см3 был выше, чем в контроле и при дозе 20 мкг/см3.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
189
Репродукция вируса при культивировании в присутствии протаминсульфата в дозах 50 и 100 мкг/см3 прошла в короткий срок и на 24 ч титр
вируса составлял 6,67±0,18 – 6,47±0,14 lg ТЦД50/см3, соответственно.
Гепарин в дозе 30 ЕД/см3 и 1% ДМСО на 48 ч не способствовали повышению инфекционной активности МПВ птиц: титр вируса был ниже, чем в контроле, и составил 6,24±0,16 – 6,48±0,06 и
6,33±0,18 – 6,47±0,14 lg ТЦД50/см3, соответственно.
Из представленных результатов следует, что в основе механизма
усиления репродукции МПВ птиц штамм «PV0З-В» и повышения чувствительности культуры клеток Vero лежит инактивирующее действие
полионов на вирусиндуцированный интерферон, подавление интерферонгенеза в инфицированных клетках, повышение проницаемости клеточной мембраны.
Выводы
1. Выращивание МПВ птиц при контактном введении или постоянном присутствии ДЕАЕ-декстрана в дозе 30 мкг/см3 способствует более
интенсивному проявлению ЦПД через 24 ч, повышению к 48 ч на 1,0 lg
инфекционной активности вируса, по сравнению с вирусом, выращенным без ДЕАЕ-декстрана, и накоплению вируса в титре 7,97±0,14 и
8,04±0,16 lg ТЦД50/см3, соответственно.
2. Доза 50 мкг/см3 ДЕАЕ-декстрана является токсичной дозой и в инфицированной культуре Vero вызывает деструктивные изменения.
3. Использование трипсина в концентрациях 20 и 30 мкг/см3 при контактном введении и постоянном присутствии позволяет ускорить срок наступления ЦПД на 6–7 ч, и при постоянном присутствии в течение 48 ч
повысить концентрацию метапневмовируса птиц на 1,0 lg. Титр вируса
составил 8,0 lg ТЦД50/см3.
Список литературы
1. Выявление и типирование метапневмовирусов птиц в Российской Федерации / З.Б. Хлебовец, А.С. Пронин, И.А. Борисова [и др.] // Тр. Федерального центра охраны и здоровья животных. – Владимир, 2007. – Т. 5. – С. 317-325.
2. Серологический мониторинг по птичьему метапневмовирусу (Avian
Pneumovirus – APV) в России // Матер. конф. по птицеводству. – Звенигород,
2003. – С. 222-223.
3. Борисова, И.А. Пневмовирусная инфекция птиц / И.А. Борисова,
С.К. Старов // Тр. Федерального центра охраны и здоровья животных. – Владимир,
2006. – Т. 4. – C. 281-296.
190
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
4. Оптимизация системы культивирования ротавируса крупного рогатого скота
/ О.Н. Окулова, Т.В. Жбанова, В.А. Мищенко [и др.] // Актуал. пробл. патологии
с.-х. животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. – Минск, 2000. – 171 c.
5. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев. – М.: Колос, 1976. – 234 с.
6. Kaverin, N. Impairment of multicicle influenza virus growth in Vero (WHO)
cells by loss of tripsin аctivity / N. Kaverin, R. Webster // J. Virol. – 1995. – Vol. 69. –
P. 2700-2703.
Effect of Polyons on Reproduction of Avian
Metapneumovirus in Vero Cell Culture
N.I. Gerasimova, L.V. Burdeynaya, A.M. Yevseyev,
S.K. Starov, T.B. Manin, D.Yu. Kozlov
Summary
The effect of polyons on reproduction of avian metapneumovirus in Vero
cell culture was studied. It was determined that the virus replication during
inoculation of tripsin (at a dose of 20, 30 µg/cm3) and DEAE-dextran (at a dose
of 30 µg/cm3) caused an increase in infectious activity by 1,0 lg.
УДК 619:616.98:578.826:615.371
Определение оптимальной концентрации
рекомбинантного белка фибера вируса ССЯ-76
В составе вакцины
Е.А. Авситидийский, С.В. Фролов,
А.В. Щербаков, В.В. Борисов
Резюме
Были изготовлены и испытаны на цыплятах экспериментальные образцы рекомбинантной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 с различной концентрацией белка фибера вируса в прививном
объёме. Показано, что вакцины с концентрацией белка от 50 до 200 мкг
вызывали у привитых птиц формирование высоких титров специфических
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
191
антител к вирусу ССЯ-76, сходных с уровнями, индуцируемыми серийной
инактивированной вакциной. В результате была определена минимальная
концентрация рекомбинантного белка в прививном объёме вакцины, необходимая для образования протективных титров антител – 50 мкг.
Введение
Одна из наиболее важных экономических задач в промышленном птицеводстве состоит в том, чтобы с помощью эффективной вакцинации минимизировать потери, вызываемые вирусными болезнями (3, 5, 6, 7). К числу
таких болезней относится синдром снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), вызываемый вирусом семейства Adenoviridae. Для профилактики ССЯ-76 широко применяют инактивированные вакцины. Технологические параметры изготовления традиционной инактивированной вакцины против ССЯ-76 были
разработаны в конце прошлого века и состоят из следующих стадий: получение вируссодержащего материала в утиных эмбрионах, его инактивация и
эмульгирование в масляном адъюванте. Чаще всего при промышленном производстве вакцин против данного заболевания культивирование вируса проводится в коммерческих утиных эмбрионах, которые могут быть источником
патогенов, а также содержать IgY, что может препятствовать максимальной
наработке вируса ССЯ-76. Использование для репродукции вируса коммерческих утиных эмбрионов в таких вакцинах имеет ряд негативных моментов
для организма птицы, связанных с воздействием необоснованно большого
диапазона антигенов. Более того, при использовании инактивированных вакцин всегда есть риск неполной инактивации вируса (3, 5, 6, 11).
В последнее время появились сообщения о создании и испытании
нового типа вакцин против гриппа птиц и ССЯ-76, созданных с использованием рекомбинантной технологии, лишенной вышеописанных недостатков (4, 6, 8, 10, 11).
Наиболее важным внешним капсидным полипептидом вируса
ССЯ-76 является гексон. К другим капсидным белкам относятся структурные пентон-белок и фиберные белки, которые вступают во взаимодействие с клеточными рецепторами во время проникновения вируса в
клетку. Пять пентонных субьединиц составляют основу для тримерного
фиберного белка, аминокислотную последовательность которого у вируса
ССЯ-76 можно распределить на три домена: амино-концевой, осевой и
«knob»-домен. Карбокси-концевой отрезок, именуемый «knob», является
антигенной детерминантой и вступает в связь с IgG (1, 5, 6, 8, 9, 10).
В этой связи нами были изготовлены и испытаны опытные образцы
вакцин с различной концентрацией рекомбинантного белка.
192
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Материалы и методы
Антиген. Рекомбинантный белок фибера вируса ССЯ-76 с концентрацией 2 мг/мл изготовлен в лаборатории диагностики особо опасных болезней
животных ФГУ «ВНИИЗЖ» по методике, описанной E. Fingerut et al. (6).
Изготовление вакцин. Для определения оптимальной концентрации
антигена в прививном объёме вакцины (0,5 см3) были изготовлены 5 образцов препарата, содержащих 1, 50, 100, 150 и 200 мкг рекомбинантного
белка. Антиген объединяли с масляным адъювантом Montanide ISA70VG
(SEPPIC, Франция) в весовом соотношении 30:70 и гомогенизировали
прокачиванием эмульсии через стерильную инъекционную иглу диаметром 1,2 мм с помощью стерильного одноразового шприца типа «Луер»
ёмкостью 10 см3. В качестве положительного контроля использовали стандартную коммерческую инактивированную эмульсионную вакцину против ССЯ-76 производства ФГУ «ВНИИЗЖ» (серия № 77 от 07.2008 г.).
Животные. Было сформировано семь опытных групп серонегативных к вирусу ССЯ-76 цыплят в возрасте 60-70 суток кросса «Хайсекс коричневый» по 10 голов в каждой, доставленных из ГУП п/ф «Кинешемская» Ивановской области.
Серологические исследования. Кровь для исследования отбирали у
птиц до вакцинации, а также через 14 и 28 суток после неё. Полученные
сыворотки исследовали на наличие антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), уровень которых выражали в виде среднего логарифма с основанием 2 (log2). Вакцину считали иммуногенно активной, если у
привитых птиц через 28 суток после вакцинации титры антител к вирусу
ССЯ-76 имели значение не ниже 5 log2 (4).
Статистическая обработка результатов исследований. Для обработки результатов исследований использовали статистические методы,
применяемые в биологии (2).
Результаты и обсуждение
Для определения оптимальной концентрации рекомбинантного белка
в прививном объёме вакцины изучали иммуногенную активность образцов, которую оценивали по титрам антигемагглютинирующих антител к
вирусу ССЯ-76 у птиц после прививки. Было сформировано 7 групп цыплят по 10 голов, которых иммунизировали внутримышечно в прививном
объёме 0,5 см³ следующими препаратами:
группа 1 – вакциной, содержащей в дозе 1 мкг рекомбинантного белка;
группа 2 – вакциной, содержащей в дозе 50 мкг рекомбинантного белка;
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
193
группа 3 – вакциной, содержащей в дозе 100 мкг рекомбинантного белка;
группа 4 – вакциной, содержащей в дозе 150 мкг рекомбинантного белка;
группа 5 – вакциной, содержащей в дозе 200 мкг рекомбинантного белка;
группа 6 – серийной инактивированной вакциной (сер. №77 от 07.2008г.);
группа 7 – не вакцинировали (контрольная группа).
У привитых цыплят отбирали кровь на 14 и 28 сутки после иммунизации и получали сыворотки, которые тестировали в РТГА. Затем с
использованием статистических методов проводили обработку отдельных вариационных рядов и определяли достоверность различий между
средними значениями титров опытных и контрольной групп. На рис. 1
в виде диаграммы представлены результаты определения антигенной
активности вакцин с различной концентрацией рекомбинантного белка
вируса ССЯ-76.
серия
№ 77
Рис. Иммуногенная активность вакцин на основе рекомбинантного
белка вируса ССЯ-76
Как видно из диаграммы, представленной на рисунке, иммунизация
птиц вакцинами на основе рекомбинантного белка вызывала у них формирование достаточно высоких уровней антител к возбудителю ССЯ-76,
причем динамика их формирования в зависимости от срока иммунизации была схожей с динамикой, вызванной коммерческой инактивированной вакциной. Так, через 14 и 28 суток после вакцинации титры антител у птиц опытных групп были схожи с уровнем антигемагглютининов
у птиц, привитых стандартной вакциной, и находились в пределах от
8,3±0,9 до 11,8±0,1 log2 (Р≥0,05), соответственно. При этом титры антител
194
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
5,2±0,5 – 8,2±0,5 log2 (Р<0,01) у цыплят, привитых препаратом с содержанием в дозе 1 мкг рекомбинантного белка, имели существенные различия
в течение всего срока наблюдения.
Полученные нами результаты согласуются с данными исследований (6, 11), в которых был получен высокий иммунный ответ на введение субъединичных эмульсионных вакцин против ССЯ-76. Образцы
с концентрацией рекомбинантного белка в прививном объёме от 50
до 200 мкг вызывали у птиц формирование сравнимого уровня гуморального иммунитета, что позволило нам в конечном итоге определить
минимальную концентрацию рекомбинантного белка вируса ССЯ-76 в
вакцине, равную 50 мкг.
Таким образом, исследования по определению иммуногенной активности рекомбинантного белка в составе инактивированной маслянной
вакцины позволили сделать вывод о перспективности дальнейших исследований по разработке такой вакцины.
Выводы
1. Рекомбинантный белок в составе инактивированной вакцины вызывал формирование у цыплят антигемагглютинирующих антител, по
уровню сравнимых с традиционной вакциной.
2. Оптимальная концентрация рекомбинантного белка в составе инактивированного масляного препарата – 50 мкг.
Список литературы
1. Анализ полипептидов сердцевины вирионов возбудителя синдрома снижения яйценоскости кур / Г.К. Юров, В.А. Кадыков, Г.Л. Неугодова, Б.С. Народицкий
// Вопр. вирусологии. – 1998. – № 5. – С. 232-235.
2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медицина, 1962. – 179 с.
3. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов,
Т.И. Алипер. – М.: Библионика, 2007. – С. 269-274.
4. Уласов, И.В. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген
фибера вируса ССЯ-76, и изучение иммунного ответа лабораторных животных на
введение этих плазмид (генетическая иммунизация): автореф. дис. … канд. биол.
наук / Уласов Илья Валентинович. – М., 2000. – 23 с.
5. Фомина, Н.В. Аденовирусная инфекция птиц: в 2 т – Т. 2. / Н.В. Фомина. –
М.: Колос, 1995. – С. 122-124.
6. A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its
fiber protein / E. Fingerut, B. Gutter, G. Gallini [et al.] // Vaccine. – 2003. – Vol. 21. –
P. 2761-2766.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
195
7. Baxendale, W. The results of field trials conducted with an inactivated vaccine
against the egg-drop syndrome 76 (EDS-76) / W. Baxendale, D. Lutticken, R. Hein,
I. McPherson // Avian Pathol. – 1980. – Vol. 9. – P. 77-91.
8. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity /
H. Gahery-Segard, F. Farace, D. Goderin [et al.] // J. Virol. – 1998. – Vol. 72, № 3. – P.
2388-2397.
9. Nazerian, K. Structural polypeptides of type II avian adenoviruses analyzed by
monoclonal and polyclonal antibodies / K. Nazerian, L.F. Lee, W.S. Payne // Avian Dis. –
1991. – Vol. 35, № 3. – P. 572-578.
10. Protective immunity against avian influenza induced by a fowl pox virus
recombinant / J. Taylor, R. Weinberg, Y. Kawaoka [et al.] // Vaccine. – 1988. – Vol. 6,
№ 6. – P. 504-508.
11. Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus
propagation in duck eggs / B. Gutter, E. Fingerut, G. Gallili [et al.] // Avian Pathol. –
2008. – Vol. 37, № 1. – P. 33-37.
Determination of Optimal Concentration of
EDS-76 Virus Fiber Recombinant Protein in a
Vaccine Formulation
Ye.A. Avsitidiysky, S.V. Frolov, A.V. Scherbakov, V.V. Borisov
Summary
Experimental samples of recombinant vaccine against egg-drop
syndrome-76 with various concentrations of the virus fiber protein in an
inoculation volume were prepared and tested in chicks. It was shown that
vaccines with the protein concentration of 50 to 200 µg induced high specific
antibody titers against EDS-76 virus in inoculated birds that were similar to
levels induced by a serial inactivated vaccine. As a result, we determined a
minimal concentration of the recombinant protein in the inoculation volume of
the vaccine necessary to induce protective antibody titers – 50 µg.
196
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
УДК 619:578.832.1:636.5:57.082.26
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ ВИРУСА ГРИППА
ПТИЦ ПОДТИПА H5N2
А.С. Иголкин, И.А. Чвала, Т.Б. Манин, С.К. Старов
Резюме
В статье представлены данные по изучению оптимальных параметров культивирования вируса гриппа птиц штамм
«A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)».
Введение
Во время эпизоотии среди кур в 1878 г. F. Perrancito впервые описал
тяжелое, быстро распространяющееся заболевание, вызвавшее высокую
смертность у кур, которой было дано название «классическая чума птиц».
Высокопатогенный грипп птиц (чума птиц, ВПГП) – крайне контагиозная, пантропная, системная болезнь домашних и диких птиц различных видов, способная протекать в форме эпизоотий и наносить большой
экономический ущерб в сфере производства птицеводческой продукции и торговле (7). Возбудителем заболевания является вирус семейства
Orthomyxoviridae, рода Influenzaevirus, тип А (5). По строению поверхностных гликопротеинов вирусы гриппа птиц (ВГП) разделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (Н1-16) и 9 подтипов по нейраминидазе (N1-9)
(1). Установлено, что антитела хозяина к H- и N-антигенам обеспечивают
основу гуморального иммунитета, при этом ведущую роль играют протективные антитела к H-антигену. В настоящее время принято считать, что
высокопатогенными подтипами ГП являются H5 и H7. Однако далеко не
все штаммы ВПГ, имеющие антигены H5 или H7, высокопатогенны для
домашней птицы (6).
Существование большого количества вирусных серотипов, наряду с известным внутривидовым антигенным плюралитетом, создает
серьезные трудности при отборе штаммов для производства противогриппозных вакцин. При этом некоторые изоляты при культивировании не достигают достаточно высокого титра, позволяющего производить отвечающие современным требованиям эффективные вакцины,
не прибегая к дорогостоящей процедуре предварительного концентрирования. Кроме того, имеются трудности противоположного свойства,
связанные со значительной патогенностью высокопатогенных изолятов
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
197
ВГП для эмбрионов кур, являющихся основной системой для культивирования ВГП (2).
В настоящее время специфическая профилактика ГП в РФ основана
на применении инактивированных вакцин на основе высокопатогенного
вируса ГП подтипа H5N1. Такие вакцины хорошо себя зарекомендовали
во время эпизоотий ВПГП 2005-2007 гг. на территории различных субъектов РФ. Для профилактики гриппа птиц в различных странах широко
применяются инактивированные вакцины, изготовленные из штаммов
аутогенных, циркулирующих в конкретном эпизоотическом очаге, или гомологичных по H, но гетерогенных по N. Применение последних позволяет проводить дифференциацию вакцинированной птицы и птицы, зараженной «полевым» вирусом, что является важным моментом в развитии
стратегии по борьбе с ВГП.
Цель данной работы – подобрать оптимальные условия культивирования ВГП штамм «A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)» в куриных эмбрионах для изготовления вакцины, а также сравнить с таковыми условия
культивирования ВГП, используемого в производстве (штамм ВНИИЗЖ
№125-ДЕП «Новосибирский» вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5N1).
Согласно опубликованным данным, оптимальными параметрами культивирования штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N1, позволяющими получать высокоактивный вируссодержащий
материал, являются: заражающая доза – 87-127 ЭЛД50; возраст куриных
эмбрионов (КЭ), используемых для заражения – 11-13 сут; время инкубирования эмбрионов – 48 ч. Соблюдение указанных параметров позволяет
получать вируссодержащую жидкость с титром инфекционной активности 9,75±0,05 lg ЭЛД50 /мл (4).
Материалы и методы
Штамм вируса. В работе был использован ВГП штамм
«A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)», пятый пассаж.
Культивирование вируса. Заражение эмбрионов производили в аллантоисную полость по стандартной методике (2). Вируссодержащий материал вносили шприцом с тонкой короткой иглой в объёме 0,2 мл/эмбр.
Культивирование ВГП проводили в 9-12-суточных куриных эмбрионах.
Инкубацию зараженных эмбрионов проводили в течение 24 – 96 ч в термостате при температуре 37,5±0,2°С. После 24 ч охлаждения при 2-6°С
эмбрионы вскрывали, отбирали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) в
стеклянные флаконы. Освобождение ЭЭЖ от крупнодисперсных частиц
проводили методом низкоскоростного центрифугирования.
198
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Титрование вируса. Титр вируса в каждой группе ЭЭЖ определяли
заражением 11-суточных КЭ последовательными 10-кратными разведениями материала и в реакции гемагглютинации. Инфекционный титр
(ЭИД50) рассчитывали по методу Кербера в интерпретации Ашмарина.
Куриные эмбрионы. Для культивирования ВГП использовали 9-12-суточные эмбрионы СПФ-кур фирмы Hy-Vac (США), которые инкубировали при температуре 37,5±0,2°С и влажности 60%.
Растворы и реактивы. При получении и исследовании вируссодержащих суспензий пользовались стерильным физиологическим буферным
раствором (pH = 7,02-7,2). Для обработки яиц перед заражением и перед
вскрытием использовали 70% этиловый спирт.
Результаты и обсуждение
Перед нами была поставлена задача – оптимизировать следующие
условия культивирования ВГП штамм «A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)»:
возраст эмбрионов, заражающую дозу штамма, величину накопления вируса в ЭЭЖ и объем ЭЭЖ – для дальнейшего его практического использования в изготовлении экспериментального образца вакцины.
На первом этапе исследования нами была проведена работа по оценке патогенности ВГП штамм «A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)». Для
этого было сформировано 3 опытных и одна контрольная группы (по 15
эмбрионов в каждой). Эмбрионы опытных групп заражали исследуемым
штаммом в дозе 100, 1000 и 10000 ЭИД50, инкубировали в течение 96 ч с
овоскопированием через каждые 24 ч и отбором павших эмбрионов. Результаты биопробы представлены в табл. 1.
Таблица 1
Протокол учета гибели эмбрионов кур
Специфическая гибель КЭ в различные сроки
Заражающая доза,
ЭИД50
24 ч
48 ч
72 ч
96 ч
10000
0/15*
0/15
4/15
15/15
1000
0/15
0/15
0/15
13/15
100
0/15
0/15
0/15
12/15
* – в числителе – количество погибших эмбрионов; в знаменателе – общее количество зараженных данной дозой вируса эмбрионов
Было установлено, что ВГП штамм «A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)»
является слабопатогенным для КЭ, т.к. даже при инфицировании эмбрионов в дозе 10000 ЭИД50 через 72 ч погибло только 26,6% эмбрионов. При
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
199
снижении заражающей дозы до 100 ЭИД50 все эмбрионы в течение 72 ч
оставались живыми. Массовая гибель КЭ наблюдалась через 96 ч и составила 80-100% во всех исследуемых группах, поэтому в дальнейших исследованиях мы будем ограничиваться 72 ч инкубации инфицированных КЭ.
Таблица 2
Влияние возраста КЭ и заражающей дозы ВГП штамм
«A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)»
на инфекционную активность ЭЭЖ
Возраст КЭ, Срок инкубации
сут.
после заражения, ч
48
9
72
48
10
72
48
11
72
48
12
72
Заражающая доза,
lg ЭИД50
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
100
1000
10000
Титр инфекционной
активности,
lg ЭИД50
9,0
9,25
8,5
8,5
8,75
8,75
9,25
9,5
9,0
9,0
9,25
8,75
9,0
9,25
8,75
9,25
9,5
9,0
9,25
8,75
9,0
10,25
10,25
9,75
На 2-м этапе наших исследований было необходимо определить
значение оптимальной заражающей дозы для эмбрионов различного
возраста и периода инкубации. Для этого было сформировано 4 опытные группы 9-12-суточных КЭ (по 90 шт. в каждой). В аллантоисную
200
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
полость эмбрионов каждой опытной группы был инокулирован вирус
ГП в дозе от 100 до 10000 ЭИД50. Эмбрионы инкубировали в течение
48-72 часов (табл. 2).
Из данных табл. 2 видно, что максимальное количество вируса (до
10,25 lg ЭИД50) при инкубировании в течение 72 ч накапливается при заражении 11-12-суточных КЭ в дозе 100-1000 ЭИД50. Заражение КЭ в дозе
10000 ЭИД50 не ведет к бóльшему накоплению вируссодержащего материала и обусловливает гибель эмбрионов на ранних сроках инкубирования,
что, в свою очередь, не способствует накоплению вируса в них.
На 3-м этапе нашего исследования предполагалось определить количественные и качественные показатели ЭЭЖ, а также гемагглютинирующую активность культивируемого вируса. Для этого было сформировано
4 опытные группы 9-12-суточных КЭ (по 60 шт. в каждой). В аллантоисную
полость эмбрионов каждой опытной группы был инокулирован ВГП в дозе
от 100 до 1000 ЭИД50. Эмбрионы инкубировали в течение 72 ч (табл. 3).
Таблица 3
Влияние возраста КЭ, инфицированных ВГП,
на количество и качество вируссодержащей жидкости
Возраст
КЭ, сут.
9
10
11
12
Срок инкубации
Средний объем
Заражающая
после
ЭЭЖ, от 1 КЭ,
доза, lg ЭИД50
заражения, ч
мл
100
8,14±0,94
48
8,76±1,02
1000
100
10,62±1,06
72
1000
10,29±1,07
100
9,47±0,96
48
1000
9,63±0,88
100
10,33±1,43
72
1000
9,64±0,97
100
10,78±1,21
48
1000
11,25±1,06
100
12,57±2,66
72
1000
11,6±2,49
100
13,33±1,44
48
1000
13,21±1,56
100
16,13±2,54
72
1000
13,67±1,64
Средний
гемагглютинирующий титр, log2
8
8
8
8
7
8
8
8
7
8
7-8
6
7
7
8
7
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
201
В ходе проведения эксперимента и анализа полученных результатов
нами было установлено, что ЭЭЖ удовлетворительного качества (прозрачная, без примеси белка и желтка), обладающую высоким титром гемагглютинирующей активности, можно получать культивированием КЭ в
возрасте 11-12 сут. в течение 72 ч.
Выводы
В результате проведенной экспериментальной работы и анализа
полученных данных установлено, что оптимальными условиями культивирования ВГП штамм «A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)» являются:
11-12-суточный возраст КЭ, используемых для заражения; заражающая
доза 100-1000 ЭИД50; время инкубирования эмбрионов – 72 ч. Соблюдение указанных параметров культивирования позволяет получать высокоактивный и высококачественный вируссодержащий материал с титром
инфекционной активности до 10,25 lg ЭИД50.
При проведении сравнительного анализа результатов, полученных
в ходе нашего эксперимента, и опубликованных данных, касающихся культивирования штамма ВНИИЗЖ №125-ДЕП «Новосибирский»
ВГП типа А подтипа Н5N1, можно сделать вывод, что ВГП штамм
«A/duck/Primorie/2621/01 (H5N2)» менее патогенен и обладает аналогичными свойствами, а в некоторых показателях и превосходит показатели используемого в производстве ВГП подтипа H5N1 штамм «Новосибирский».
Список литературы
1. Грипп: обзор литературы / Н.С. Дудникова, В.В. Дрыгин, Л.О. Щербакова,
А.В. Андриясов. – Владимир, 2005. – 59 с.
2. МЭБ. Санитарный кодекс наземных животных. – 17-е изд. – Париж, 2008. –
Гл. 10. Грипп птиц. – С. 460-480.
3. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко,
Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – М.: Колос, 1999. – С. 53-67.
4. Оптимизация параметров культивирования штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц / С.В. Фролов, Т.Б. Манин, А.В. Борисов, [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2007. – Т. 5. – С. 131-137.
5. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных /
А.А. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин [и др.]. – М.: Колос, 1984. – С. 457-466.
6. Alexander, D.J. Ortomyxovirus infections / D.J. Alexander // Viral Infections of
Vertebrates / ed. J.B. McFerran, M.S. McNulty. – Amsterdam, The Netherlands, 1993. –
Vol. 3. – P. 287-316.
7. Mayo, M.A. Virus taxonomy-Houston 2002 / M.A. Mayo // Arch. Virol. – 2002. –
Vol. 147. – P. 1071-1076.
202
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
OPTIMIZATION OF H5N2 AVIAN INFLUENZA VIRUS
CULTIVATION IN CHICKEN EMBRYOS
A.S. Igolkin, I.A. Chvala, T.B. Manin, S.K. Starov
Summary
Data on the study of optimal parameters of cultivation of «A/duck/
Primorie/2621/01 (H5N2)» avian influenza virus are presented in the paper.
УДК 619:579:616-078:636.5
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММА «З-1»
ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE,
ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ РФ
А.В. Чернышов, О.И. Ручнова
Резюме
В статье представлены результаты исследования морфологических,
культуральных, биохимических и патогенных свойств штамма «З-1»
Ornithobacterium rhinotracheale, выделенного на территории РФ, и его
чувствительности к антибактериальным препаратам.
Введение
Одной из актуальных проблем в птицеводстве являются болезни респираторного тракта. К их числу относится заболевание, вызываемое бактериями вида Ornithobacterium rhinotracheale.
Это высококонтагиозное заболевание, часто встречающееся у мясных пород кур и индеек, а также племенной птицы. Болезнь характеризуется слабыми респираторными симптомами у молодых птиц. Основной ущерб промышленному птицеводству наносится за счет высокого уровня выбраковки птицы
(до 50%) из-за отставания в росте. При посмертной диагностике наблюдают
аэросаккулиты, одно- или двусторонние пневмонии, пенистые скопления в
грудной полости, анемичность, перикардиты и перитониты (3, 4, 5, 6, 7).
При исследовании сывороток крови птиц из хозяйств РФ в ИФА были
выявлены положительные пробы, которые свидетельствовали о возможной циркуляции этого возбудителя на территории РФ (4).
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
203
Мониторинговые исследования по орнитобактериозу в РФ не проводятся, а также отсутствуют нормативные документы по выделению
данного возбудителя. Поэтому исследования в этом направлении являются актуальными.
Целью данной работы явилось изучение морфологических, культуральных, биохимических и патогенных свойств, чувствительности к антибактериальным препаратам бактерий штамма «З-1» O. rhinotracheale.
Материалы и методы
В данной работе использовали штамм №51463 O. rhinotracheale,
полученный из Американской коллекции типовых культур и штамм
«З-1», депонированный в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ»,
выделенный из легких цыплят-бройлеров с респираторным синдромом.
Морфологию клеток определяли посредством световой микроскопии.
Для этого использовали мазки, выращенной на плотной питательной среде
культуры O. rhinotracheale штамм «З-1», окрашенные по Граму (2). Морфологические свойства колоний изучали при выращивании на прозрачных плотных питательных средах, содержащих V (дрожжевой экстракт) и
Х (экстракт эритроцитов крови лошади) факторы роста.
С целью изучения культуральных свойств штамма «З-1»
O. rhinotracheale определяли его потребность в ростовых факторах.
Для этого производили посевы на следующие питательные среды: 1,5%
агар на основе перевара по Хоттингеру с добавлением V- и Х-факторов
роста; простые питательные среды (МПА, МПБ, 1,5% агар на основе
перевара по Хоттингеру) и среды Эндо и МакКонки. Чашки с посевами
инкубировали 24-72 ч при температуре 37ºС.
Биохимические свойства определяли в соответствии с Наставлением по применению систем индикаторных бумажных для идентификации
микроорганизмов (СИБ) (пр-во Нижегородского госпредприятия по производству бактерийных препаратов), и путем посева на среды Гисса (2).
Продукцию оксидазы определяли в тесте с 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина. Продукцию каталазы определяли в тесте с 3% раствором перекиси водорода. Гемолитическую способность исследовали путем
посева на кровяной агар (1).
Патогенные свойства определяли при экспериментальном заражении
естественно восприимчивых животных (цыплята-бройлеры, в возрасте
21 сутки) в инфраорбитальные синусы и лабораторных животных (белые
мыши массой 18-20 г) внутрибрюшинно.
204
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли
диско-диффузионным методом (2) с применением дисков, пропитанных
различными антибиотиками (НИЦФ, г. Санкт-Петербург).
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы морфологию колоний определяли при
культивировании суточной культуры штамма «З-1» O. rhinotracheale на
плотной питательной среде, содержащей X-фактор. Прозрачные колонии правильной округлой S-формы с ровными краями, гладкой блестящей поверхностью размером от 0,5 до 1,0 мм слизистой консистенции
наблюдали через 48-72 ч инкубации при 37ºС. При культивировании
штамма «З-1» O. rhinotracheale на 1,5% агаре на основе перевара по
Хоттингеру с добавлением V- и X-факторов рост колоний наблюдали
через 24 ч инкубации.
На питательных средах без добавления X-фактора (МПА, 1,5% агар на
основе перевара по Хоттингеру, МакКонки и Эндо) рост O. rhinotracheale
не наблюдали. На МПБ с добавлением дрожжевого экстракта через 48 ч
наблюдали небольшое помутнение и образование незначительного осадка,
при встряхивании – в виде тонкой «косички».
Морфологию клеток O. rhinotracheale изучали посредством световой
микроскопии. В мазках наблюдали отрицательно окрашенные по Граму мелкие полиморфные палочки, расположенные одиночно, парами и цепочками.
Ферментативные свойства штамма «З-1» определяли в сравнении с
типовым штаммом №51463 АТСС и сопоставляли с данными литературных источников (6, 7).
Согласно полученным результатам (табл. 1), штамм «З-1»
O. rhinotracheale соответствует типовому штамму №51463 O. rhinotracheale
и данным литературы (5, 7). В то же время по таким признакам, как окисление глюкозы, сахарозы, лактозы и мальтозы штамм «З-1» отличается от
штамма №51463 АТСС O. rhinotracheale.
Патогенные свойства штамма «З-1» O. rhinotracheale для лабораторных животных изучали на белых мышах посредством внутрибрюшинного
введения суспензии суточной культуры в объеме 0,5 см3, концентрации
1х1010 м.к./см3. Наблюдение вели в течение 10 суток. Гибели мышей не
наблюдали.
Патогенность для восприимчивых животных исследовали путем экспериментального заражения цыплят-бройлеров. Перед заражением сыворотки
крови цыплят исследовали на отсутствие антител к орнитобактериям в тестсистеме ИФА (FlockChek O. rhinotracheale Antibody Test Kit, IDEXX). Цыплят-
205
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
бройлеров разделили на две группы: опытную и контрольную. Опытную
группу (10 голов) заражали суспензией суточной культуры бактерий штамма «З-1» O. rhinotracheale в объеме 0,5 см3 в концентрации 1х1010 м.к./см3 в
инфраорбитальные синусы. Контрольной группе вводили физиологический
раствор в том же объеме. Наблюдение за птицей вели в течение 12 суток.
Таблица 1
Биохимические свойства штамма «З-1»
Ornithobacterium rhinotracheale в сравнении с типовым штаммом
и данными литературных источников
Результаты
№
п/п
Наименование теста
«З-1»
Штамм
По данным По данным
№ 51463 АТСС
P. Vandamme P. van Empel
(типовой)
1
Каталаза
–
–
–
–
2
Оксидаза
+
+
+
+
3
β-галактозидаза
+
+
+
+
4
Рост на агаре МакКонки
–
–
–
–
5
Индол
–
–
н/д
–
6
Уреаза
–
–
н/д
+/–
7
Глюкоза
+
–
–
н/д
8
Сахароза
+
–
–
н/д
9
Лактоза
+
–
+
+
10
Арабиноза
–
–
н/д
н/д
н/д
11
Манноза
+
+
+
12
Мальтоза
+
–
–
+
13
Маннит
+
+
н/д
н/д
14
Дульцит
+
–
н/д
н/д
н/д
15
Сорбит
–
–
н/д
16
Инозит
–
–
н/д
н/д
17
Аргининдекарбоксилаза
–
+
н/д
–/+
18
Лизиндекарбоксилаза
–
–
н/д
–
19
Орнитиндекарбоксилаза
–
–
н/д
–
20
Образование сероводорода
–
–
н/д
н/д
21
Гемолиз
–
–
н/д
–
« – » – отрицательная реакция;
« + » – положительная реакция;
«+/-» – большинство штаммов положительные;
«-/+» – большинство штаммов отрицательные;
«н/д»– нет данных
206
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
В ходе опыта была отмечена слабовыраженная респираторная клиническая картина. При вскрытии птиц опытной группы на 12 сутки наблюдали следующие патологоанатомические изменения: аэросаккулиты,
серозные синуситы (рис. 1А), одно- или двустороннюю крупозную пневмонию в стадии красной гепатизации (рис. 2А), наложения фибрина на
костальной поверхности легких (рис. 2В).
А
Рис. 1. Инфраорбитальный синус: А – серозное воспаление,
кровоизлияния на слизистой оболочке
Рис. 2. Патологические изменения в легких:
А – крупозная пневмония в стадии красной гепатизации;
В – наложения фибрина на поверхности легкого
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
207
При исследовании патологического материала от экспериментально
зараженных цыплят-бройлеров из легких была выделена культура бактерий, по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам
идентифицированная как O. rhinotracheale.
При вскрытии птиц контрольной группы патологоанатомические изменения не выявлены.
Результаты оценки чувствительности O. rhinotracheale штамм «З-1» к
антибактериальным препаратам представлены в табл. 2.
При оценке резистентности O. rhinotracheale штамм «З-1» к антибактериальным препаратам установили ее высокую чувствительность ко II и
III поколениям цефалоспоринов (цефуроксиму, цефиксиму, цефоперазону), группе пенициллинов (бензилпенициллин, ампициллин, амоксиклав),
нитрофурановым препаратам (фурадонин) и III поколению фторхинолонов (байтрил). Штамм оказался чувствительным ко II поколению фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин), III поколению аминогликозидов
(амикацин) и тетрациклинам (тетрациклин). Наблюдалась резистентнось
штамма «З-1» к группе линкосамидов (клиндомицин), II поколению аминогликозидов (гентамицин) и ко-тримоксазолу.
Выводы
1. Для роста O. rhinotracheale штамм «З-1» требуются питательные
среды, содержащие Х-фактор роста. При выращивании орнитобактерий
на 1,5% агаре на основе перевара по Хоттингеру, с добавлением V- и
X-факторов, рост наблюдали через 24 ч инкубации. В то время как на средах с добавлением только Х-фактора – через 48-72 ч.
2. Штамм «З-1» O. rhinotracheale отличается от типового штамма
№51463 АТСС O. rhinotracheale по следующим биохимическим признакам: окисление глюкозы, сахарозы, лактозы и мальтозы.
3. Экспериментальное заражение цыплят-бройлеров суспензией
O. rhinotracheale штамм «З-1» в инфраорбитальные синусы вызывает
слабовыраженную клиническую картину. При вскрытии птицы, подвергнутой диагностическому убою, наблюдали поражение респираторного
тракта, свойственное орнитобактериальной инфекции.
4. O. rhinotracheale штамм «З-1» не патогенен для белых мышей при
внутрибрюшинном заражении суспензией культуры.
5. Штамм «З-1» высокочувствителен ко II и III поколениям цефалоспоринов, группе пенициллинов, нитрофурановым препаратам, III поколению фторхинолонов и резистентен к группе линкосамидов, II поколению аминогликозидов и ко-тримоксазолу.
208
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Таблица 2
Чувствительность штамма «З-1» Ornithobacterium rhinotracheale
к антибактериальным препаратам
№
п/п
1
Тетрациклин
Зона подавления
роста (мм)
17
2
Доксициклин
14
3
Фурадонин
22
4
Офлоксацин
15
5
Норфлоксацин
12
6
Ципрофлоксацин
17
Наименование антибиотика
7
Бензилпенициллин
23
8
Ампициллин
26
9
Амоксиклав
32
10
Гентамицин
13
11
Амикацин
17
12
Клиндомицин
0
13
Цефуроксим
35
14
Цефиксим
35
15
Цефоперазон
28
16
Левомицетин
18
17
Ко-тримоксазол (сульфаметоксазол/триметоприм)
11
18
Байтрил
29
< 15 мм – микроорганизм не чувствителен или малочувствителен к
антибактериальным препаратам;
15-20 мм – чувствителен;
>20 мм – высокочувствителен
Список литературы
1. Костенко, Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии /
Т.С. Костенко, В.Б. Родионова, Д.И. Скородумов. – М.: Колос, 2001. – 344 с.
2. Микробиологические и вирусологические методы в ветеринарной медицине: справочное пособие / А.Н. Головко, В.А. Ушкалов, В.Г. Скрыпник [и др.]. –
Харьков: ХТМТ, 2007. – 512 с.
3. Татарчук, О.П. Орнитобактериоз и борьба с Ornithobacterium rhinotracheale
в мясном птицеводстве / О.П. Татарчук // Вет. жизнь. – 2007. – № 22. – С. 5.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
209
4. Шурахова, Ю.Н. Ornithobacterium rhinotracheale: распространение и диагностика / Ю.Н. Шурахова, А.Б. Кононенко, О.Н. Виткова // III Междунар. вет.
конгр. по птицеводству. – М., 2007. – С. 181-183.
5. Van Empel, P. Identification and serotyping of Ornithobacterium rhinotracheale
/ P. van Empel, H. van den Bosch, P. Loeffen // J. Clin. Microbiol. – 1996. – Vol. 35. –
P. 418-421.
6. Lafay, D. Ornithobacterium rhinotracheale: patogenicite et importance en
medicine veterinaire: these doct. vet. / D. Lafay. – Toulouse, 2000. – 83 p.
7. Ornithobacterium rhinotracheale gen. nov., sp. nov., isolated from the avian
respiratory tract / P. Vandamme, P. Segers, M. Vancaneyt [et al.] // Int. J. Syst.
Bacteriol. – 1994. – Vol. 44. – P. 24-37.
STUDY OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF
ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE «Z-1» STRAIN
ISOLATED IN THE TERRITORY OF THE RF
A.V. Chernyshov, O.I. Ruchnova
Summary
The paper contains the findings of investigation of morphological, cultural,
biochemical and pathogenic properties of «Z-1» strain Ornithobacterium
rhinotracheale isolated in the territory of the RF as well as its antibacterial
sensitivity.
УДК 619:616.98:578.835.11:616 – 087.371
МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ВИРУСНОГО
ГЕПАТИТА УТЯТ В УТИНЫХ ЭМБРИОНАХ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ
В.Ю. Фоменко, С.В. Глейзер, В.Н. Ирза,
А.В. Борисов, В.П. Князев, Т.А. Тетерина
Резюме
В статье приведены данные об усовершенствовании технологии
изготовления вакцины против вирусного гепатита утят, производство
которой осуществлялось прямым заражением утиных эмбрионов вирусом вирусного гепатита утят штамма «ВГНКИ-К» с целью наработ-
210
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ки вирусного материала для изготовления нового варианта препарата.
Биологические свойства вакцины изучены лабораторными методами и
в комиссионных испытаниях в производственных условиях, прошедших с положительным результатом.
Введение
Известно более двух десятков вирусных и бактериальных болезней
уток, из которых приоритетное место в инфекционной патологии занимает
вирусный гепатит утят (ВГУ). Санитарным кодексом наземных животных
МЭБ (2008 г.) ВГУ включен в перечень особо опасных болезней (1, 3).
Наиболее эффективной формой биопрепарата против ВГУ уже длительное время остаются вакцины, содержащие живой аттенуированный
вирус. Тем не менее, многие вопросы биотехнологии изготовления таких
вакцин еще недостаточно изучены (2, 4, 5).
В ФГУ «ВНИИЗЖ» с 1999 г. для наработки вируссодержащего материала при изготовлении живой вакцины используют трансплантаты утиных эмбрионов (УЭ), культивируемые в питательной среде в реакторах
КС-40. Данный способ позволяет получать сырье с инфекционной активностью вируса в нем до 7,0 lg ЭЛД50/0,2 см3, однако он энергоемок и требует значительных материальных и трудовых затрат.
Поэтому целью данной работы было проведение исследований по
подбору оптимальной системы культивирования вируса ВГУ и созданию
нового варианта вакцины.
Материалы и методы
Вирусы. В работе использовали следующие штаммы вируса вирусного гепатита утят:
– вирулентный штамм «Орех», представляющий собой суспензию печени утят, погибших после экспериментального заражения;
– вакцинный штамм «ВГНКИ-К», представляющий собой аттенуированный вирус, адаптированный к первично трипсинизированной монослойной
культуре клеток фибробластов утиных эмбрионов и утиным эмбрионам.
Эмбрионы. Для работы использовали:
– утиные эмбрионы ГУП ППЗ «Благоварский» (Башкортостан);
– инкубационное яйцо уток фирмы «Charles River» (Венгрия);
– эмбрионы СПФ-кур (СПФ-КЭ) фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия).
Культуры клеток. В исследованиях использовали первично трипсинизированные культуры клеток:
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
211
– монослойную культуру клеток фибробластов УЭ (ККУФ) ГУП ППЗ
«Благоварский»;
– монослойную культуру клеток фибробластов СПФ-КЭ (КККФ) фирмы «Lohmann Tierzucht».
Перевиваемые линии клеток:
– свиную почку эмбриональную версенизированную (СПЭВ);
– почку сибирского горного козерога (ПСГК).
Эмбрионы в возрасте 9-12 суток заражали в аллантоисную полость по
общепринятой методике в дозе 100-1000 ЭЛД50/0,2 см3. Гибель в течение
первых 12 ч считали неспецифической. Эмбрионы, погибшие после этого
срока, помещали в холодильник при температуре от 2 до 8оС и вскрывали
не позднее, чем через 8 ч.
Монослойные культуры клеток фибробластов утиных и куриных эмбрионов готовили по общепринятым методикам. Для выращивания использовали суспензию с концентрацией клеток 1,0-1,5 млн/см3 на среде
ПСП с 10% сыворотки КРС. Рассев производили в 3-литровые роллерные
сосуды в объеме 300 мл, которые инкубировали при температуре 37оС в
установках с частотой вращения 18-20 об/ч до формирования сплошного
клеточного монослоя (48-72 ч).
Заражение культур клеток проводили после предварительной отмывки средой Хенкса в дозе 10 ЭЛД50/кл с контактом 1 ч при температуре 37оС,
с последующим доливом среды Хенкса и инкубацией при 37оС. Зараженные культуры снимали через 72 ч и промораживали при минус 20оС.
Активность полученного вируссодержащего материала (20% суспензии эмбрионов на ФБР и клеточных суспензий) определяли титрованием
на 11-12-суточных УЭ. Титр рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина.
Результаты и обсуждение
Для адаптации и репродукции вируса ВГУ были испытаны: утиные
эмбрионы, инкубационное яйцо уток, эмбрионы СПФ-кур, первично
трипсинизированные культуры клеток этих эмбрионов, а также некоторые
перевиваемые линии клеток.
Следует отметить 2-3-суточное отставание в развитии УЭ фирмы «Charles River» по сравнению с УЭ ГУП ППЗ «Благоварский». Разница в весе 16-17-суточных УЭ составляла от 1,0 до 1,5 г. «Подращивание» венгерских эмбрионов перед заражением передержанием до
15-16 суток приводило к снижению активности вируса в материале на
0,5-0,8 lg ЭЛД50/0,2 см3 из-за понижения чувствительности УЭ. Кроме
212
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
того, в процессе инкубации эмбрионов до 15-16-суточного возраста отмечали неспецифическую гибель до 25% венгерских эмбрионов, что
заметно снижало пригодность импортируемых из Венгрии яиц для
производства вируссодержащего материала.
В связи с этим для дальнейших исследований в качестве оптимальной биосистемы выбраны УЭ ГУП ППЗ «Благоварский».
На первом этапе наших исследований были проведены опыты по изучению влияния заражающей дозы на гибель УЭ различного возраста и активность вируса в получаемом материале. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Биологическая активность вируса вирусного гепатита утят штамма
«ВГНКИ-К» в вируссодержащем материале, полученном на основе
утиных эмбрионов и эмбрионов СПФ-кур
(n=3)
Система Возраст
культивиро- эмбр.,
вания
сут.
Вес
эмбр.,
г
Доза
Время Общая
Активность
вируса,
гибели, гибель,
вируса,
ЭЛД50/0,2см3
сут.
%
lg ЭЛД50/0,2см3
100
9-10
6,0-7,0
Утиные
эмбрионы
500
1000
100
11-12
10,0-11,0
500
1000
100
Эмбрионы
СПФ-кур
9-10
4,5-5,5
500
1000
2
3-4
5
2
3-4
5
1-3
2
3-4
5
2
3-4
5
1-3
3
3-4
5
2
3-4
5
1-3
50
80
95
30
70
80
20
40
60
5,50 + 0,50
6,50 + 0,50
5,50 + 0,25
6,00 + 0,25
6,75 + 0,25
6,00 + 0,25
4,75 + 0,25
5,25 + 0,25
6,25 + 0,25
5,25 + 0,25
5,75 + 0,25
6,50 + 0,50
5,75 + 0,50
4,50 + 0,25
5,00 + 0,50
5,25 + 0,25
4,75 + 0,25
5,50 + 0,25
5,75 + 0,50
5,00 + 0,25
5,75 + 0,25
213
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Данные, представленные в табл. 1, показывают, что наиболее активный
вирус в материале можно получить при заражающей дозе 500 ЭЛД50/0,2см3
и использовании УЭ, погибших на 3-4 сутки после инъекции вируса.
Несмотря на то, что активность вируса несколько выше при заражении 9-10-суточных эмбрионов, количество получаемого материала почти
в два раза меньше, чем при использовании их в возрасте 11-12 суток.
Вариант с использованием СПФ-КЭ уступал таковому при использовании УЭ как по весу получаемого сырья, так и по активности вируса в
материале.
Результаты испытаний культур клеток различного происхождения
для репродукции вируса ВГУ представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 2, вирус сохраняет высокую инфекционную активность для УЭ только при пассировании на утиных фибробластах. Тем
не менее этот способ трудоемок, требует больших материальных затрат и
дает низкий уровень выхода сырья.
Таким образом, оптимальной системой для наработки вируссодержащего материала являются утиные эмбрионы в возрасте 11-12 суток.
Таблица 2
Биологическая активность вируса вирусного гепатита утят штамма
«ВГНКИ-К» в вируссодержащем материале, полученном на основе
первичных и перевиваемых культур клеток
(n=3)
Культура клеток
Первично
трипсинизированная
Перевиваемая
Множествен- Активность вируса в пассажах,
lg ЭЛД50/0,2см3
ность заражения, ЭЛД50/кл 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж
куриные
фибробласты
10
6,50+0,25 5,75+0,50 4,75+0,25
утиные
фибробласты
10
6,75+0,25 6,50+0,50 6,75+0,25
СПЭВ
10
2,25+0,25
0
0
ПСГК
10
1,00+0,25
0
0
Проведенные исследования позволили разработать технологию изготовления нового варианта вакцины против ВГУ – эмбрионального,
которая включает следующие этапы: инкубацию эмбрионов до 11-12-суточного возраста весом 10-11 г; инъекцию вируса штамма «ВГНКИ-К» в
аллантоисную полость в дозе 500 ЭЛД50/0,2см3; инкубацию при 37оС; отбор погибших эмбрионов для приготовления вируссодержащего материа-
214
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ла; измельчение и гомогенизацию эмбрионов; получение 2% суспензии
(гомогената) на основе ФБР; фасовку вакцины; контроль препарата. Полученные результаты послужили основой для усовершенствования технологии и разработки НД на «Вакцину против вирусного гепатита утят из
штамма «ВГНКИ-К» эмбриональную».
Экспериментальные серии вакцины прошли комиссионные испытания на базе ФГУ «ВНИИЗЖ» и ФГУ «ВГНКИ» по следующим показателям: внешний вид; цвет; рН; контаминация бактериальной и грибковой
флорой; контаминация микоплазмами; контаминация гемагглютинирующими вирусами; инфекционная активность; безвредность; иммуногенность, которые показали ее соответствие требованиям СТО.
Таблица 3
Биологические показатели экспериментальных серий
«Вакцины против вирусного гепатита утят из штамма
«ВГНКИ-К» эмбриональной»
Биологическая
Выживаемость
Безвредность для
Серия активность вируса в
вакцинированных утят при
утят при введении
препарата
вакцине,
заражении вирулентным
10-кратной дозы
3
lg ЭЛД50/0,2см
вирусом, %
1
5,00
безвредна
90
2
4,25
безвредна
90
3
4,75
безвредна
90
4
5,00
безвредна
100
Как видно из табл. 3, активность вируса в препаратах серий 1-4 составляла от 4,25 lg ЭЛД50/0,2см3 до 5,0 lg ЭЛД50/0,2см3, что обеспечивало
устойчивость при внутримышечном заражении вирулентным штаммом
«Орех» вируса ВГУ 90-100% вакцинированной птицы.
Проведенные успешные испытания позволили зарегистрировать препарат в ФГУ «ВГНКИ» для внедрения в производство и использования в
целях профилактической иммунизации птицы.
Выводы
1. Разработан метод культивирования вируса вирусного гепатита утят
штамма «ВГНКИ-К» в утиных эмбрионах.
2. Вакцина на основе получаемого вируссодержащего материала является высокоиммуногенным препаратом и может применяться для профилактики вирусного гепатита утят.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
215
Список литературы
1. Музика, Д.В. Епiзоотологiчний монiторинг вiрусних хвороб у диких птахiв в
Украiнi 2006 года: автореф. дис…канд. вет. наук / Музика Д.В. – Харьков, 2006. – 20 с.
2. Паникар, И.И. Оздоровление хозяйств от вирусного гепатита утят / И.И. Паникар // Ветеринария. – 1979. – № 4. – С. 35-36.
3. МЭБ. Санитарный кодекс наземных животных: в 2 т. Т. 1-2. – Париж, 2008.
4. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel liniage close to
the genus Parechovirus in the famili Picornaviridae / M.-C. Kim, Y.-K. Kvon [et al.] // J.
Gen. Virol. – 2006. – Vol. 87. – P. 3307-3316.
5. Serological studies on the immune response against duck hepatitis virus vaccine /
N.A. Hussein [et al.] // Ass. Vet. Med. J. – 1993. – Vol. 28, N 56. – P. 140-156.
Method of duck hepatitis virus cultivation in
duck embryos for vaccine production
V.Yu. Fomenko, S.V. Gleyzer, V.N. Irza, A.V. Borisov,
V.P. Knyazev, T.A. Teterina
Summary
Data on the improvement of the technology for duck hepatitis virus vaccine
production by direct inoculation of duck embryos with «VGNKI-K» strain of duck
hepatitis virus for virus propagation to produce a new variant of the preparation
are given in the paper. Biological properties of the vaccine were examined with
laboratory methods and commissioning tests with a positive result.
УДК: 619:616-07:573.6.086.83:57.083.3
РАЗРАБОТКА ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ
ДЛЯ ОБРАБОТКИ, УЧЁТА И ХРАНЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИФА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ
РАЗНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ
Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин
Резюме
Статья посвящена разработке программного обеспечения для обработки, учёта и хранения результатов ИФА при диагностике заболеваний
разных видов животных. Разработанная программа «ELISA7» может при-
216
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
меняться в лабораториях ветеринарного профиля при работе с наборами
для иммуноферментной диагностики болезней кур, свиней и КРС.
Введение
Создание эффективной лабораторно-диагностической ветеринарной
службы предусматривает усовершенствование существующих методов
диагностики, разработку, производство и внедрение в практику диагностических наборов нового поколения, проведение диагностических исследований на современном уровне. В настоящее время иммуноферментный
анализ (ИФА) является одним из наиболее распространенных методов
диагностики инфекционных заболеваний (3) при проведении рутинных
исследований в ветеринарии. Благодаря простоте и высокой чувствительности твердофазные иммуноферментные системы удобны для скрининга
больших количеств образцов малого объёма в лабораториях с самым простым оснащением. Эти преимущества особенно важны при эпизоотологических обследованиях, массовой диагностике инфекционных заболеваний, а также контроле эффективности вакцинации сельскохозяйственных
животных и птиц на крупных предприятиях.
Преимущества метода ИФА (2): скорость, чувствительность, специфичность, безопасность при проведении исследований, возможность автоматизации процесса. Необходимость учёта результатов исследования
значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, проведение большого объёма расчётов при их обработке, а также хранение
полученных массивов данных для последующего анализа делает актуальной задачу автоматизации учета реакции и использование компьютера для
хранения, обработки и анализа данных, полученных с помощью ИФА.
Ранее была разработана программа «СИНКО ИФА. Болезни птиц»
(1), которая представляет собой модульную программную систему, написанную на языке программирования Visual Basic версии 3.0, и позволяет считывать с ридера или вводить с клавиатуры данные по оптической
плотности, указывать расположение испытуемых и контрольных проб на
планшете, рассчитывать по формулам, предложенным разработчиками
коммерческих наборов, значения титров или других показателей, принятых для характеристики исследуемых материалов, сохранять как первичные (оптические плотности), так и обработанные (значения титров)
данные. Кроме этого, программа реализует поиск в сформированной базе
данных, которая хранится в формате Access версии 1.0. Однако программа
«СИНКО ИФА. Болезни птиц» не может быть использована в работе с наборами ИФА для диагностики заболеваний других видов животных.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
217
Целью нашей работы была разработка программы, позволяющей работать с тест-системами на основе ИФА для серологической диагностики
заболеваний других видов животных.
Методы
Для написания программы «ELISA7» использовали язык программирования Visual Basic версии 3.0 фирмы Microsoft.
Для создания исходных файлов базы данных была использована
СУБД (Система Управления Базами Данных) Microsoft Access версии 1.0.
Результаты и обсуждение
В 2000 году программа «СИНКО ИФА. Болезни птиц» была зарегистрирована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам (Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2000611338
от 22 декабря 2000 года). С тех пор программа непрерывно пополняется и
совершенствуется. Например, описания ИФА-наборов были выделены в отдельную базу данных, что позволило, заменяя только этот файл, дополнять
список наборов, не переустанавливая программу полностью и не затрагивая базу, хранящую данные тестов. Кроме того, в 2003 году была написана
вспомогательная программа AT_Kit, позволяющая вносить описания новых
ИФА-наборов не только квалифицированному программисту, но и обычному
пользователю. Текущая рабочая версия 3.43A от 2008 года работает в операционной среде Windows 3.X, Windows 9X и Windows XP, позволяет непосредственно из программы подключаться к различным базам данных и сохраняет
подключение к последней базе данных по желанию пользователя, способна
восстанавливать базу данных при незначительных повреждениях (потеря или
частичная потеря записи), позволяет проводить сжатие базы данных. Предусмотрен поиск данных в базе результатов теста по дате анализа, исполнителю,
хозяйству, производителю наборов, заболеваниям, возрасту птицы.
По мере появления новых моделей спектрофотометров-ридеров для
них были написаны коммуникационные модули. Если первый вариант
программы работал с тремя моделями спектрофотометров-ридеров, то
в настоящее время программа совместима с четырнадцатью моделями
спектрофотометров-ридеров отечественного и зарубежного производства. В настоящее время программа способна работать со следующими
моделями спектрофотометров-ридеров: ANTHOS 2001; ANTHOS 2010;
ANTHOS 2020; Bio-Rad PR2100; Bio-Rad 680XR; BIO-TEK ELx800; SLT
Spectra; TECAN SunRise; ИФА-ОЭП 7.1; ИФА-ОЭП-PC; УНИПЛАН 1994;
218
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
УНИПЛАН 1996; УНИПЛАН 1998; УНИПЛАН 2006. Возможно расширение этого списка при наличии у прибора компьютерного выхода и надлежащего технического описания прибора у производителя.
Программа предусматривает возможность работы с 67 наборами зарубежных (IDEXX, KPL, Guildhay, BioChek) и отечественных (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
производителей, в которых используется непрямой вариант постановки
реакции при тестировании проб в одном рабочем разведении для ИФАдиагностики таких заболеваний птиц, как ньюкаслская болезнь, грипп птиц,
инфекционный бронхит кур, инфекционная бурсальная болезнь, реовирусная
инфекция, энцефаломиелит птиц, микоплазмозы, пастереллез птиц, лейкозы,
ринотрахеит птиц, ретикулоэндотелиоз птиц, сальмонеллезы, инфекционная
анемия цыплят, синдром снижения яйценоскости-76 и другие.
Работа над программным обеспечением с рабочим названием «ELISA7»,
предназначенным для тестирования с применением наборов для диагностики заболеваний разных видов животных, была начата в мае 2005 года.
Программа «ELISA7» по многим параметрам отличается от программы «СИНКО ИФА. Болезни птиц», хотя она также написана на языке программирования Visual Basic версии 3.0, и база данных хранится в
формате Access версии 1.0 (Это позволило сохранить работоспособность
программы на старых моделях компьютеров, не способных работать под
операционной системой Windows XP). Но структура базы данных претерпела кардинальные изменения: введены новые поля, идентифицирующие
группу и вид животного, для которого ставится тест, введено поле «заболевание», позволяющее делать выборку данных именно по заболеванию,
а не по конкретному ИФА-набору на данное заболевание.
В программе «ELISA7» предусмотрено несколько структурноразличных вариантов росписи планшета (на данный момент – три) и
принципиальная возможность включения в программу новых типов.
Значительные изменения произошли в структуре поля, описывающего параметры и настройки ИФА-набора, понадобилось внести не только
параметр, отвечающий за выбор типа росписи плашки, но и дополнительные контроли – буфер (чистый буфер – заведомо отрицательная проба) и
положительный стандарт (сильноположительная проба).
В июле 2007 года первая рабочая версия программы «ELISA7» была
запущена для отладочной и тестовой эксплуатации в лаборатории диагностики особо опасных инфекций, с сентября 2008 года она используется в
лаборатории для учёта и обработки результатов тестирования на выявление антител к вирусу классической чумы свиней и вирусу репродуктивнореспираторного синдрома свиней с применением наборов производства
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
219
ФГУ «ВНИИЗЖ». В настоящее время проводится работа по внесению
параметров расчёта для наборов по выявлению антител к микоплазмам,
возбудителям цирковирусной инфекции и везикулярной болезни свиней,
разработанных в ФГУ «ВНИИЗЖ».
В перспективе новая версия программы «ELISA7» предусматривает создание универсального программного обеспечения, в которое планируется перенести имеющиеся описания ИФА-наборов производства
ФГУ «ВНИИЗЖ» из программы «СИНКО ИФА. Болезни птиц».
Таким образом, создано новое программное обеспечение, позволяющее автоматизировать ИФА-диагностику заболеваний разных видов
животных и использующееся в настоящее время для исследования сывороток крови свиней на наличие возбудителей экономически значимых
заболеваний с применением тест-систем на основе ИФА, разработанных
в ФГУ «ВНИИЗЖ», которое может быть применено в лабораторной практике при проведении серологического мониторинга.
Список литературы
1. Компьютерная программа «Иммуноферментный анализ» / Ю.В. Зинковский,
Н.С. Мудрак, С.Н. Колосов, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых – в вет.
практику: матер. конф. молодых учёных. – Владимир, 2000. – С. 173-179.
2. Мудрак, Н.С. Создание иммуноферментных тест-систем для серологической диагностики в птицеводстве с применением компьютерной программы для
учёта, обработки и хранения результатов анализа / Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин //
Вет. патология. – 2006. – № 4. – С. 156-159.
3. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. Simultaneous
measurement of antibody titres to infectious bronchitis, infectious bursal disease, and
Newcastle disease viruses in a single serum dilution / D.B. Snyder, W.W. Marquardt,
E.T. Mallinson, [et al.] // Avian Dis. – 1984. – Vol. 28, – P. 12-24.
DEVELOPMENT OF SOFTWARE FOR PROCESSING,
RECORDING AND STORING ELISA RESULTS FOR
DIAGNOSIS OF DIFFERENT ANIMAL SPECIES DISEASES
Yu.V. Zinkovsky, S.N. Kolosov, N.S. Mudrak, V.V. Drygin
Summary
The paper is devoted to the development of software for processing, recording
and storing ELISA results for diagnosis of different animal species diseases. The
developed program «ELISA7» can be used in veterinary laboratories to work
with ELISA kits for diagnosis of poultry, porcine and bovine diseases.
220
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
УДК 619:616.152.11.3:57.086.3
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ОБРАЗЦОВ КРОВИ И ОРГАНОВ КРОЛИКОВ,
ИНОКУЛИРОВАННЫХ СУСПЕНЗИЯМИ НАНОБАКТЕРИЙ
А.П. Пономарев, А.А. Пичуева, Т.Б. Никешина,
Е.В. Белик, И.А. Пронин, Ю.А. Костыркин
Резюме
В данном сообщении представлены фотографические свидетельства
присутствия в крови животных микроорганизмов с явно выраженными
признаками прокариот, которые по морфологии и физико-химическим
признакам идентифицированы как нанобактерии. При инокулировании
животных суспензиями нанобактерий установлена цикличность их появления и исчезновения из крови животных с периодом 3-4 суток. Во время
отсутствия нанобактерий в крови их можно выявить в суспензиях, приготовленных из фрагментов почки и других паренхиматозных органов
убитого кролика. При увеличении продолжительности опыта с инокулированными животными до 4-6 месяцев нанобактерии в концентрациях
109-1010 клеток/мл в крови выявляются постоянно.
Введение
Лабораторные животные, разводимые в питомниках для экспериментальных целей, не защищены от проникновения и распространения различных возбудителей, в том числе и представителей
условно-патогенной микрофлоры. Данные литературы свидетельствуют о том, что на смену хорошо изученным патогенным бактериям все
активнее приходят возбудители, которые раньше считались условнопатогенными или сапрофитами (2).
В публикации В.В. Макарова (3) указывается на то, что в обобщенной
форме инфекции и инфекционные болезни делятся на две категории – экзогенные и эндогенные (цитируется по И.В. Давыдовскому, 1956, 1962).
Различия между данными категориями состоят в том, что первые возникают в результате заражения извне, а вторые – являются результатом активации собственной «условно-патогенной микрофлоры». В.В. Макаров,
опять же ссылаясь на И.В. Давыдовского, отмечает одно важнейшее обстоятельство, что «приоритеты массовой заболеваемости объективно и
неизбежно перешли к эндогенным аутоинфекциям за счет убиквитарных
условных патогенов». Термин «условный патоген» говорит о том, что при
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
221
определенных обстоятельствах он представляет реальную угрозу здоровью живого организма.
Одним из звеньев патогенеза при различных заболеваниях является формирование иммунодефицитного состояния, к которому причастны
представители условно-патогенной микрофлоры. Кроме того, их широкое
распространение, отсутствие четких клинических проявлений, бессимптомное носительство в ассоциации с другими возбудителями приводит,
как следствие, к осложнению течения инфекционного процесса. У конвенциональных животных по условиям категорийности должны отсутствовать
патогенные микроорганизмы, опасные для человека и животных (1).
В связи с выявлением в крови животных и человека неизвестных ранее
микроорганизмов – нанобактерий, и связанного с ними большого количества заболеваний, чрезвычайно актуален вопрос контроля контаминации
крови животных. Совершенно очевидно то, что от состояния крови, обусловленного не только функциональной активностью основных клеток, но
и её стерильностью, зависят общие показатели здоровья живого организма.
В задачу настоящей работы входило проведение на основе метода
электронной микроскопии исследований по выявлению контаминирующих агентов в крови и в паренхиматозных органах кроликов до и после
инокулирования суспензиями, содержащими нанобактерии.
Материалы и методы
Животные. Для опытов брали конвенциональных животных – кроликов массой от 2,0 до 2,5 кг, выращенных в обычных контролируемых условиях по открытой системе при хорошем зоогигиеническом уровне. Обычно
данные животные имеют полный набор микроорганизмов, свойственных
нормальной микрофлоре, но при этом не исключается вероятность наличия
условно-патогенной микрофлоры (2). В качестве основного исследуемого
материала использовали кровь, забор которой у кроликов осуществляли из
краевой вены уха. 4-5 капель крови сразу же из иглы вносили в пробирки
типа Эппендорф с 1 мл буферного раствора STE. Во избежание бактериальной контаминации образцы разведенной крови сразу же замораживали в
термосе с жидким азотом. Для контроля крови на предмет выявления контаминирующих агентов было использовано порядка 200 кроликов.
Для электронно-микроскопического контроля образцы разведенной
крови готовили по следующей методике. После оттаивания проводили
первое центрифугирование образцов крови при 3000 об/мин (500 g) в течение 10-15 мин. Осадки, содержащие разрушенные эритроциты и другие
клетки крови, удаляли, а надосадочную жидкость повторно центрифуги-
222
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ровали при 7000 об/мин (2000 g) в течение 30 мин. После центрифугирования жидкость из пробирок полностью отсасывали. Затем к осадку добавляли 30-50 мкл буфера STE, ресуспендировали активным перемешиванием и далее использовали при подготовке препаратов для электронной
микроскопии. Присутствие нанобактерий в образцах устанавливали по их
морфологическим признакам и с учетом количественной характеристики.
Инокуляция нанобактерий животным. В опытах по экспериментальному заражению использовали не менее 50 кроликов. Материалом для заражения служили образцы крови от крупного рогатого скота и кроликов, в образцах которых были выявлены клетки нанобактерий. Для инокуляции готовили
очищенные двукратным центрифугированием образцы разведенной крови.
Подготовленные образцы крови, как описано выше, для контроля под
электронным микроскопом ресуспендировали не в 50 мкл буферного раствора, а в 1 мл и затем инокулировали животным. Инокуляцию проводили
в краевую вену уха объёмом суспензии нанобактерий 1 мл при концентрации клеток 107-108 клеток/мл.
До инокуляции и через 4 часа после инокуляции у животных контролировали температуру тела. Затем в течение всего опыта проводили ежедневный контроль температуры и забор крови для контроля под электронным микроскопом.
У животных до инокуляции проводили контрольный забор крови из
ушной вены. Четыре-пять капель крови сразу же помещали в пробирки
типа Эппендорф с 1 мл буфера STE рН 7,4 и замораживали при температуре жидкого азота (-196ºС).
Электронная микроскопия. Образцы крови наносили на поддерживающие угольно-парлодионовые пленки-подложки, контрастировали 4% раствором ФВК рН 6,8 и исследовали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония) при инструментальном увеличении 9000-20000.
Результаты и обсуждение
В опытах по контролю крови использовали несколько групп кроликов численностью от 10 до 60 особей, которые поступали в лабораторию
для контроля иммуногенной активности противовирусных вакцин. Всего
было задействовано в опытах более 200 животных, от которых получали
кровь. От убитых животных отбирали фрагменты паренхиматозных органов для приготовления 10% суспензий и последующей подготовки соответствующих препаратов для электронной микроскопии (5).
Электронно-микроскопический анализ крови животных. Анализируя
образцы крови из различных партий кроликов, следует указать на то, что в
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
223
большинстве случаев нам не удавалось обнаружить «чистых» животных. Так,
в партии из 40 голов без признаков контаминации крови было только 11 особей. В другой крупной партии животных из 60 голов кровь была контаминирована у 50 особей. Преимущественно контаминирующими агентами были
нанобактерии в различных морфологических формах своего существования.
Морфология контаминирующих микроорганизмов представлена структурами в виде наносфер диаметром от 5-10 до 300-500 нм, палочко- и нитевидными клетками с признаками бинарного деления, почкующимися сферами
и другими менее определенными формами клеток. К нитевидным формам
относятся клетки, у которых длина во много раз превышает диаметр.
В партиях животных от 10 до 15 голов «чистых» животных могло
быть не более 3 особей. Следует отметить, что понятие «чистые» животные скорее всего имеет условный характер. Это связано с тем, что в крови
могут присутствовать наночастицы в концентрации 105-106 наночастиц/мл,
которую мы относили к фоновой концентрации. Кроме того, даже если в
крови животного не выявляли нанобактерии, но по каким-то причинам
приходилось его убивать, то при контроле образцов суспензий, приготовленных из паренхиматозных органов, могли выявлять у отдельных особей
нанобактерии в высоких концентрациях. Особо показательными были суспензии, приготовленные из фрагментов почек, которые содержали повышенные концентрации нанобактерий в стадии активного размножения.
Инокуляции животных суспензиями, содержащими нанобактерии.
Опыты проводили на группах кроликов численностью от 10 до 15 особей.
Результаты одного из типовых опытов по инокуляции группы кроликов из
15 животных описаны ниже. При контроле животных до инокуляции у трех
особей в крови были выявлены наносферы в концентрации 109-1010 наносфер/мл (рис. 1). Остальные, как обычно, были контаминированы другими
формами нанобактерий в концентрациях 105-106 нанобактерий/мл.
Всех кроликов разделили на 5 групп. Первым трем кроликам, у которых были выявлены наносферы, в краевую вену уха инокулировали по
1 мл физиологического раствора. Следующим по порядку группам кроликов были инокулированы суспензии с нанобактериями, приготовленными
отдельно из фрагментов почки, селезенки, печени и легкого от убитого
кролика. Характерная морфология клеток нанобактерий в суспензиях для
инокуляции, приготовленных из фрагментов печени (а) и почки (б), представлена на рис. 2. Клетки имели палочко- и нитевидные формы различного диаметра и длины, среди которых отмечено присутствие почкующихся
клеток, у которых от материнской клетки отпочковывается от одной до
пяти наносфер диаметром 50-80 нм.
224
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
а)
б)
Рис. 1. Наносферы диаметром 10-30 нм в виде цепочечных
образований, × 36000 (а); рассредоточенные наносферы диаметром
от 10-20 до 150-200 нм, × 50000 (б)
а)
б)
Рис. 2. Морфология нанобактерий из образцов суспензий,
использованных для инокуляции кроликам: ните- и палочковидные
формы различного диаметра и длины, почкующиеся клетки, × 40000
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
225
На третьи сутки после инокуляции у всех животных в крови были
выявлены нанобактерии самой разнообразной морфологии, в том числе и
у тех животных, которым ввели физраствор. Популяция клеток нанобактерий представлена структурами с различными морфологическими формами и размерами (рис. 3). Нанобактерия нитевидной формы с минимальными параметрами в стадии бинарного деления имеет следующие размеры:
длина дочерних клеток 220 и 260 нм и диаметром, соответственно, 43 и
22 нм с промежуточной капсулой диаметром 54 нм и небольшими сферическими утолщениями на окончаниях. Клетка в виде прямой палочки
имеет длину 650 нм и диаметр 108 нм. Клетки сферической формы имеют диаметр от 100 до 530 нм. Кроме того, в популяции можно выделить
нитевидные формы клеток длиной до 1 мкм и диаметром около 50 нм. У
почкующихся клеток дочерние наночастицы в большинстве своём имеют
диаметр от 50 до 150 нм (стрелка).
Наблюдаемая гетерогенность популяции клеток нанобактерий отражает пластичность их строения, обусловленную отсутствием ригидной
клеточной стенки, и их способность к трансформации, что является характерным свойством прокариот. Возможной причиной появления структур сферической формы различного размера является воздействие среды
в виде буферного раствора STE при разведении крови и последующих
операциях переосаждения и ресуспендирования в данном буфере, солевой состав которого отличается от состава плазмы крови. В этом случае
нитевидные формы клеток трансформируются до сферических форм как
более устойчивые вследствие уменьшения активной поверхности клеток.
Из геометрических представлений известно, что среди всех тел равного
объёма шар имеет наименьшую поверхность, а среди всех тел одинаковой
поверхности он имеет наибольший объём.
Температурная реакция кроликов на введение препаратов, содержащих нанобактерии. Группу из 10 кроликов инокулировали суспензиями из крови КРС, в содержимом которых были выявлены нитевидные и другие формы нанобактерий. Цель опыта состояла в определении температурной реакции кроликов на введение суспензий нанобактерий. До инокуляции средняя температура тела кроликов массой от
2 до 2,5 кг была равна 39,0±0,1ºС. Через 2 часа после инокуляции температура повысилась до 39,7±0,1ºС и через 7 часов – до 40±0,1ºС. Затем на
протяжении 15 суток температуру контролировали три раза в день.
Результаты тщательной термометрии показали следующее распределение по температурной шкале: 39,4±0,1ºС – 4 кролика, 39,6±0,1ºС –
4 кролика и 39,7±0,1ºС – 2 кролика. Полученные данные соответствуют
226
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Рис. 3. Морфология нанобактерий из крови кролика,
инокулированного суспензией, приготовленной из почки убитого
кролика, × 46000
верхней температурной границе физиологической нормы, которая для
данного вида животных равна 38,5÷39,5ºС.
При периодическом электронно-микроскопическом контроле образцов крови установлен цикличный характер выявления нанобактерий с интервалом в 3-4 дня. При этом высокие концентрации нитевидных форм
нанобактерий сменялись на структуры в виде наносфер, а затем все возвращалось в прежних высоких концентрациях.
Содержание лейкоцитов в крови кроликов при их инокуляции суспензиями нанобактерий. В следующем комплексном опыте использовали группу
кроликов из 10 животных, у которых проводили забор крови сразу после их
поступления из вивария. При контроле «нулевых» проб крови в образцах
определяли количество лейкоцитов в камере Горяева. Подготовку препаратов
для электронной микроскопии проводили путем разведения образцов крови
1:10, их замораживания при -196ºС, оттаивания при комнатной температуре и
последующего двукратного центрифугирования при 500 g и 2000 g.
Результаты контроля показали, что в крови 4 кроликов была выявлена
контаминация на минимальном уровне, то есть содержание контаминирующих наночастиц не превышало 105-106 наносфер/мл и обозначено как «чисто». В образцах крови оставшихся 6 животных выявлены наносферы диаме-
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
227
тром от 5-10 до 40-50 нм в концентрациях от 107 до 1010 наносфер/мл, которые
ранее нами были идентифицированы как нанобактерии (4, 5). По морфологическим и концентрационным характеристикам нанобактерии, выявленные в
образцах крови, идентичны структурам, представленным на рис. 1.
Из подсчета количества лейкоцитов и сопоставления с данными электронно-микроскопического контроля следует, что у
первых 4 кроликов среднее значение лейкоцитов было равно
(7,41±1,62) × 103 клеток/мл, а в крови кроликов с повышенной контаминацией наночастицами – (13,7±1,7) × 103 клеток/мл. Отсутствие чистых животных
не оставило нам выбора и поэтому использовали имеющихся в наличии.
После проведения «нулевого» контроля кроликов разделили на пять
групп по две головы, которые затем были использованы для проверки размножения нанобактерий из различных источников. Заражение кроликов
проводили подготовленными суспензиями нанобактерий путем инокуляции в краевую вену уха.
Первые две пары «условно чистых» кроликов инокулировали суспензиями, полученными из образцов крови от двух коров с лейкозоположительным диагнозом по РИД (КРС-1 и КРС-2). В крови от данных
животных под электронным микроскопом установлено присутствие нитевидных форм и сферических наночастиц в концентрациях 108 клеток/мл.
Объём инокулята – 1 мл каждому кролику.
Для третьей пары кроликов в качестве инокулята использовали стерильный буферный раствор STE рН 7,4 – 1 мл на каждую голову.
Четвертую пару кроликов инокулировали вакцинным вариантом вируса классической чумы свиней (ВКЧС). Исходный материал представлял
собой замороженную 10% суспензию, приготовленную из селезенки и
лимфоузлов кроликов, зараженных ВКЧС. Этот препарат готовили так же
как и образцы крови, то есть после оттаивания суспензию по 1 мл центрифугировали при 500 g, затем надосадочную жидкость повторно центрифугировали при 2000 g. Полученные осадки ресуспендировали каждый
в 1 мл буферного раствора. Электронно-микроскопический контроль показал, что конечные препараты содержали наночастицы диаметром от 20
до 200 нм, распределенные как относительно равномерно на поверхности
пленки-подложки, так и в виде колоний. Часть наносфер образовывала
кластерные структуры в виде цепочек, соединенных перемычками из их
цитоплазматического вещества. Концентрация наносфер в препаратах для
инокуляции составляла порядка 108-109 наносфер/мл (рис. 4).
Последний препарат для инокуляции был взят после размножения нанобактерий на искусственной питательной среде Игла МЕМ. Для
высева на среду была использована кровь кролика в разведении 1:250.
228
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Рис. 4. Морфология наночастиц из образца 10% суспензии ВКЧС,
использованной для инокуляции кроликам, × 60000
После 2 месяцев инкубации в среде были выявлены наносферы диаметром от 20 до 100 нм в концентрации больше 109 наносфер/мл. Для
инокулирования брали по 1 мл среды без дополнительной обработки.
До заражения и через 4 часа после заражения, а затем дважды в день
проводили термометрию кроликов в течение 15 суток. У зараженных кроликов проводили забор крови для подсчета содержания лейкоцитов и контроля образцов под электронным микроскопом. Было проведено 10 взятий
крови для анализов (всего 100 образцов).
Анализируя изменения температуры тела кроликов, следует отметить,
что на протяжении всего опыта у животных температура тела находилась
в пределах физиологической нормы (38,5÷39,5ºС). Количество лейкоцитов, при физиологической норме для кроликов в среднем 8,0 (6,5-9,5) ×
103 клеток/мл, колебалось практически у каждого из животных в довольно
широком диапазоне. Эти колебания не зависели от вида препарата, использованного для инокулирования.
Попытки установить определенную зависимость между выявляемой
микрофлорой в образцах крови и повышенными или пониженными концентрациями лейкоцитов не привели к успеху. Электронная микроскопия
в образцах крови позволила установить присутствие гетерогенной популяции нанобактерий, представленной клетками в виде нитей, торов, коротких палочек и, почти во всех случаях, наносфер диаметром от 10-20 до
100-200 нм и в концентрациях от 107 до 1010 наносфер/мл.
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
229
Наиболее интересными оказались образцы крови от кроликов, инокулированных буферным раствором STE. На четвертые сутки после инокуляции в крови кроликов были выявлены наносферы в концентрации
109 наносфер/мл и нитевидные клетки нанобактерий. Идентичная картина
наблюдалась и в крови кроликов, инокулированных препаратами крови от
коров с лейкозоположительным диагнозом. В данных образцах крови, помимо наносфер и нитевидных форм клеток, присутствовали наносферы в
виде цепочечных образований. Из результатов контроля следует, что наносферы были выявлены практически во всех образцах крови от 10 животных.
При третьем заборе крови на 7 сутки после инокуляции наиболее выраженными по присутствию нанобактерий оставались предыдущие образцы с добавлением образцов, инокулированных препаратом, полученным из
образцов крови КРС-1 и КРС-2. Морфология клеток нанобактерий характеризуется появлением протяженных нитей со сферическими утолщениями
на концах. На данный период после заражения у всех животных количество лейкоцитов находилось в повышенной концентрации от 9,0 × 103 до
23,4 × 103 клеток/мл и во всех образцах были выявлены нанобактерии, морфология которых отличалась выраженным полиморфизмом (рис. 5).
На рис. 5а популяция нанобактерий представлена нитевидными
структурами, резко различными по диаметру и длине, среди которых присутствуют сферические клетки на начальной стадии почкования (обозначение стрелкой). По центру снимка расположена нитевидная клетка длиной 2,5 мкм и диаметром 100 нм, в структуре которой цитоплазматическое
вещество, окаймленное оболочкой, расположено по всей длине клетки. На
окончании клетки видна сферическая капсула, образующаяся в процессе
бинарного деления материнской клетки на две дочерние. К примечательной стороне данной популяции следует отнести то, что утонченные клетки диаметром 20-30 нм имеют выраженную фрагментацию цитоплазматического вещества по всей длине нитей. Возможно предположить, что
данные клетки нанобактерий находятся на стадии отмирания.
На рис. 5б представлена электронная микрофотография нанобактерий и классических бактериальных клеток в завершающей стадии бинарного деления из образца крови кролика, инокулированного суспензией из
крови КРС-1. Бактериальные клетки имеют следующие параметры: при
диаметре 0,55 мкм их длина равна 1,35-1,4 мкм. Клетки нанобактерий
сферической формы имеют диаметр 400 нм, а наносферы, отпочковывающиеся от материнских клеток, имеют диаметр от 60 до 110 нм.
На рис. 5в видны нитевидные формы клеток различного диаметра,
а также почкующиеся клетки – от одной материнской отпочковывается
одновременно от 2 до 5 наносфер диаметром 50-80 нм (стрелка).
230
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
а)
б)
в)
г)
Рис. 5. Нанобактерии из образцов крови кроликов,
инокулированных различными препаратами, × 40000
На рис. 5г – клетки нанобактерий аморфного строения, которые можно
выявить в общей массе нанобактерий с характерной нитевидной структурой.
Данные снимки приведены с целью показать возможные жизненные формы нанобактерий в образцах крови кроликов, инокулированных
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
231
различными препаратами. При этом следует отметить одну важнейшую
особенность поведения нанобактерий в крови кроликов. Казалось бы, что
при таких высоких концентрациях клетки нанобактерий должны постоянно выявляться при каждом заборе. Но эксперименты показали, что на
следующие сутки после забора нанобактерии могут исчезать из крови и
через 3-4 суток опять выявляться в прежних высоких концентрациях. Кроме того, при следующем заборе в образцах крови могут преобладать наносферы в виде цепочечных образований, в виде биопленок и наносферы,
рассредоточенные на поверхности пленки-подложки. Объяснение выявленному феномену пока не найдено. Результаты ряда опытов указывают
на цикличность их выявления в крови в течение месяца.
Из данных литературы известно, что при попадании в кровь животного нанобактерии тут же оказываются в почках (7, 8). Мы провели подобный опыт, когда в крови нанобактерии не выявляли, а накануне они были.
Животного в этот же день убивали, извлекали паренхиматозные органы и
готовили препараты для электронной микроскопии. Результаты контроля
постоянно свидетельствовали о том, что почки животных контаминированы в высокой степени нанобактериями в активной форме размножения.
Увеличение продолжительности опыта до 6 месяцев содержания животных, инокулированных суспензиями с нанобактериями, и электронномикроскопические контроли крови показали, что цикличность выявления
нанобактерий не проявляется, и они в высоких концентрациях регулярно
выявляются в образцах крови (рис. 6).
По-видимому, в начальном этапе опыта, примерно в течение месяца,
нанобактерии могли аккумулироваться в почках и по мере их накопления
переходить в кровь. Когда же их концентрация в организме животных достигает высоких значений, они выявляются в крови постоянно.
В образцах крови помимо нанобактерий почти регулярно выявляли
клетки лимфоцитов, которые утратили свои исходные гидродинамические
свойства и не осаждались при первом центрифугировании (500 g). Часть
клеток сохраняла целостность с различными нарушениями внутренней
структуры. Другие клетки были поражены нанобактериями. На рис. 7 показана клетка лимфоцита из образца крови кролика, отобранной через
6 месяцев после инокуляции его суспензией нанобактерий. Третья часть
клеток лимфоцитов была разрушена до фрагментов, некоторые из которых могли находиться в комплексе с нанобактериями.
Отсутствие клинических признаков заболевания животных при повышенных концентрациях нанобактерий в крови и паренхиматозных органах
не является критерием их устойчивости. Присутствие нанобактерий в крови
животных создает дополнительную нагрузку на иммунную систему организ-
232
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ма, а паразитирование нанобактерий на лимфоцитах способствует возникновению иммунодефицита и, как следствие, снижению резистентности животных к различным возбудителям вирусной или бактериальной этиологии.
Рис. 6. Морфология нанобактерий, выявляемых в содержимом
суспензии, приготовленной из образца крови кролика, × 40000
Рис. 7. Клетка лимфоцита диаметром 3,5 мкм из крови кролика,
пораженная нанобактериями, находящимися в различном
морфологическом состоянии, × 33000
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
233
Выводы
1. В крови клинически здоровых кроликов выявлены нанобактерии в
различных жизненных формах: наносферы диаметром 10÷150 нм в виде
цепочечных образований и в составе биопленок, а также палочко- и нитевидные структуры диаметром от 30-40 до 150-180 нм и длиной до 1 мкм
(отдельные имеют длину 2,5 мкм). Кроме того, в состав популяции входят клетки сферической, тороидальной формы и клетки, образующиеся
вследствие трансформации нитевидных форм.
2. При внутривенной инокуляции кроликам суспензии с нанобактериями отмечается цикличность их выявления в крови с периодичностью
в 3-4 суток в течение месяца. При увеличении продолжительности выдерживания инокулированных кроликов до 6 месяцев нанобактерии в крови
выявляются постоянно в форме наносфер или в виде нитевидных и других
структур в концентрациях 109-1010 клеток/мл.
3. Отсутствие выраженных клинических признаков заболевания после инокуляции свидетельствует о том, что нанобактерии относятся к
убиквитарной эндогенной микрофлоре, которая, паразитируя на лимфоцитах крови, вызывает поражение иммунной системы живого организма.
Список литературы
1. Андросик, Н.Н. Современные аспекты этиопатогенеза и иммунопрофилактики
болезней, обусловленных условно патогенной микрофлорой / Н.Н. Андросик // Актуал.
пробл. патологии с.-х. ж-ных: Междунар. науч.-практ. конф. – Минск, 2003. – С. 10-12.
2. Балтрашевич, А.К. Категоризация лабораторных животных по микробному
фактору / А.К. Балтрашевич, Г.И. Подопригора, Т.П. Комаровская // Актуал. вопр.
стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований. – М., 1988. – С. 3-6.
3. Макаров, В.В. Факторные болезни: так что же это такое? / В.В. Макаров //
Вет. консультант. – 2008. – № 6. – С. 3-7.
4. Пономарев, А.П. Электронно-микроскопические исследования отдельных
микроорганизмов, относящихся к нано- и микромиру / А.П. Пономарев, Е.В. Белик // Нанотехнологии: наука и производство. – 2008. – № 4. – С. 12-20.
5. Пономарев, А.П. Выявление нанобактерий в крови кроликов методом электронной микроскопии / А.П. Пономарев, Е.В. Белик, А.А. Молева // Вестн. РАСХН.
2008. – № 5. – С. 82-86.
6. Пономарев, А.П. Электронная микроскопия нанобактерий, выявляемых в
крови животных / А.П. Пономарев // Тр. Федерального центра охраны здоровья
животных. – Владимир, 2008. – Т. 6. – С. 447-464.
7. Пономарев, А.П. Нанобактерии – новые представители мира бактерий: обзор
лит. / А.П. Пономарев, О.А. Борисова, О.В. Кухаркина. – Владимир, 2008. – 48 с.
8. Kajander, E.O. Characteristics of nanobacteria and their possible role in stone
formation / E.O. Kajander, N. Ciftcioglu, K. Aho // Urol. Res. – 1999. – Vol. 31. – P. 47-54.
234
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Electron-Microscopic Analysis of Blood and
Organ Samples OF RABBITS Inoculated with
Nanobacteria Suspensions
A.P. Ponomaryov, A.A. Pichuyeva, T.B. Nikeshina,
Ye.V. Belik, I.A. Pronin, Yu.A. Kostyrkin
Summary
This report provides photographic evidence of prokaryote-like microorganisms
in animal blood. Taking into account their morphology and physico-chemical
characteristics the organisms are identified as nanobacteria. During inoculation of
animals with nanobacteria suspensions we determined the cycling of organisms
occurrence in blood and disappearance from it (period of 3-4 days). While being
absent in blood, the nanobacteria could be detected in suspensions prepared from
kidney fragments and other parenchymal organs of a dead rabbit. If we increase
duration of the experiment with inoculated animals up to 4-6 months, nanobacteria
are detected on a permanent basis at concentration of 109-1010 cells/ml.
УДК 619:639.3.091:616-002.4:616-076
ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ
ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
Л.Ю. Апасова, Н.В. Мороз, С.С. Рыбаков, Т.Б. Еремеева
Резюме
Был получен очищенный и концентрированный препарат вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани. Осаждение вируса проводили с помощью ПЭГ-6000 и ультрацентрифугированием, очистку – в градиенте хлористого цезия. Степень очистки проверяли методом SDS-ПААГ
электрофореза.
Введение
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) – острая вирусная болезнь лососевых рыб, выращиваемых в искусственных условиях и обитающих в естественных водоемах. Она характеризуется развитием септиче-
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
235
ского процесса, некротическими изменениями гемопоэтической ткани, кровоизлияниями в органы и ткани, приводящими к массовой гибели рыб (4, 7).
Возбудителем является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Rhabdoviridae, роду Novirhabdovirus, виду Infectious hematopoietic necrosis
virus (IHNV). Он широко распространен на западе Северной Америки (8, 10).
Транспортировка контаминированной вирусом икры и инфицированной рыбы привела к распространению вируса в Европе и Юго-Восточной
Азии (Корея, Тайвань, Япония, Китай).
В настоящее время распространение вируса ИНГТ представляет угрозу
для водоемов России. Впервые это заболевание обнаружено в 2000 г. у молоди форелевого хозяйства в Московской области (9). В естественных условиях
вирус ИНГТ впервые выделили на Камчатке от половозрелой нерки (1).
При вспышке заболевания в рыбхозах смертность рыб нередко достигает 100%, что приводит к большим экономическим потерям (11). Это наиболее
опасное и экономически значимое вирусное заболевание лососевых рыб.
Своевременное выявление ИНГТ позволяет проводить адекватные
мероприятия, обеспечивающие защиту рыб. При проведении диагностических исследований важную роль играют иммунологические методы (реакция нейтрализации, реакция иммунофлуоресценции, иммуноферментный анализ), основанные на использовании специфических
высокоактивных сывороток. Для получения последних необходима гипериммунизация животных концентрированными и очищенными вирусными препаратами.
Цель нашего исследования – подбор оптимальных методов и условий
очистки и концентрирования вируса ИНГТ и оценка степени его очистки.
Материалы и методы
Концентрирование и очистку вируса ИНГТ осуществляли в три стадии.
1. Осветление клеточного лизата.
2. Концентрирование вирусной суспензии.
3. Очистка концентрированной суспензии.
В работе использовали штамм «Аркус 32/87» культурального вируса ИНГТ лососевых рыб, культивированный на перевиваемой культуре
клеток ЕРС (эпидермальные новообразования больного оспой карпа), с
титром инфекционной активности от 6,35 до 9,6 lg ТЦД50/см3.
Для очистки и концентрирования вируса ИНГТ использовали следующие методы: осаждение вируса полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) с последующей очисткой в градиенте хлористого цезия (CsCl) и осаждением
вируса ультрацентрифугированием.
236
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 25 мин при
2500 об/мин (ротор J–698). Затем супернатант с добавлением ПЭГ-6000
центрифугировали в течение 60 мин при 5000 об/мин (ротор JA–10). Осадок ресуспендировали в 1:300-1:350 от исходного объема 0,15М ФБР рН 7,4.
После этого препарат вируса подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия (CsCl): 1,25; 1,16 и 1,07 г/см3, соответственно в концентрациях 30, 20 и 10% в течение 2,5 ч при 25000 об/мин
(ротор АН–650). Опалесцирующую вируссодержащую зону в слое CsCl с
концентрацией 20% отбирали и осаждали в течение 1,5 ч при 25000 об/мин
(ротор АН–650). Очищенный вирус ресуспендировали в ФБР. Полученный
препарат вируса ИНГТ, концентрированный в 1600–2000 раз по объему, после очистки хранили при минус 20°С до использования.
Плотность опалесцирующей зоны (препарата) в градиенте CsCl определяли на рефрактометре. Концентрацию белка в полученных препаратах
определяли по методу Лоури (6).
Результаты и обсуждение
В ходе исследований была проведена очистка и концентрирование
четырех объемов культуральной вирусной суспензии ИНГТ. Полученные
результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты очистки и концентрирования вируса ИНГТ
№
препарата
1
2
3
4
Инфекционная
активность виру- Содержание
Исходная
Объем
инфекционная са после концен- белка по Лоури,
вирусной
трирования,
мг/см3
активность
3
суспензии,
lg
ТЦД
/см
вируса,
50
см3
lg ТЦД50/см3
№ элюата
1
2
1
2
2100
9,6
11,85
7,85
4,25
0,55
1650
7,85
10,1
–
1,2
–
1700
6,35
9,35
6,85
0,85
0
1960
7,35
10,1
7,1
1,5
0,3
Объем
концентрированного
вируса, см3
1
1
1
1
1
2
1
–
0
1
Из табл. 1 видно, что чем выше титр исходной вирусной суспензии,
тем больше содержание вирусного белка в очищенном концентрированном препарате.
При очистке препарата в градиенте в слое с концентрацией 20% CsCl
наблюдали опалесцирующую зону, плотность которой составила 1,16 г/см3.
В слое с концентрацией 10% CsCl была отобрана зона, плотность которой составила 1,07 г/см3. Согласно данным литературы, плотность вируса
237
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
ИНГТ в градиенте CsCl составляет 1,14-1,19 г/см3 (2), следовательно, опалесцирующая зона в слое с плотностью 1,16 г/см3 CsCl содержит вирус.
Результаты электрофореза представлены на рисунке.
Молекулярный вес структурных белков вируса инфекционного некроза
гемопоэтической ткани и результаты электрофореза представлены в табл. 2.
Таблица 2
Молекулярный вес структурных протеинов вируса ИНГТ.
Идентификация белков ИНГТ методом SDS–ПААГ электрофореза
Белки
ИНГТ
L
G
N
P (M1)
M (M2)
Рабдовирусы рыб:
сравнительное исследование структуры
белков*
190 000
72 000
38 000
25 000
19 000
Физико-химическая и
серологическая характеристика пяти рабдовирусов рыб**
>150 000
88 000
55 000
40 000
35 000
Исследование образца №1
после очистки
170 000
70 000
40 000
32 000
26 000
* – по данным G. Lenoir and P. de Kinkelin (5);
** – по данным Hill B.J. (3)
Рис. Электрофорез очищенного и концентрированного вируса ИНГТ
М – маркер молекулярного веса белков (Pharmacia);
1 – первый элюат очищенной вирусной суспензии ИНГТ;
2 – второй элюат очищенной вирусной суспензии ИНГТ;
I – IV – четыре препарата культуральной вирусной суспензии ИНГТ после очистки
и концентрирования
238
Актуальные вопросы болезней птиц и других видов животных
По результатам электрофореза, титрования и определения содержания белка в препарате по методу Лоури во втором элюате остается незначительное количество вируса. Однако вирус в нем достаточно хорошо
очищен, что видно на электрофореграмме, и может быть использован для
иммунизации животных.
В дальнейшем будет продолжена отработка технологии очистки и
концентрирования вируса ИНГТ. Планируется использовать препараты
для получения специфических высокоактивных гипериммунных сывороток с целью использования их в реакции нейтрализации, реакции иммунофлуоресценции, иммуноферментном анализе.
Выводы
Таким образом, проведенные исследования показали, что представленный метод очистки и концентрирования культуральной суспензии вируса ИНГТ позволяет получить довольно чистый антиген, о
чем свидетельствуют результаты электрофореза. Полученный продукт
вполне пригоден для гипериммунизации лабораторных животных с целью получения поликлональных сывороток для разработки серологических тест-систем.
Список литературы
1. Рудакова, С.Л. Некроз гемопоэтической ткани у производителей нерки и
предполагаемые источники инфекции / С.Л. Рудакова // Вопр. рыболовства. – 2003. –
Т. 4, № 1 (13). – C. 93-102.
2. De Kinkelin, P. Le virus d’Egtved. 2. Purification / P. De Kinkelin // Ann. Rech.
Vet. – 1972. – Vol. 3. – P. 199–208.
3. Hill, B.J. Physico-chemical and serological characterization of five Rhabdoviruses
infecting fish / B.J. Hill // J. Gen. Virol. – 1975. – Vol. 27. – P. 369–375.
4. LaPatra, S.E. The use of serological techniques for virus surveillance and certification
of finfish / S.E. LaPatra // Annu. Rev. Fish. Dis. – 1996. – Vol. 6. – P. 15–28.
5. Lenoir, G. Fish Rhabdoviruses: comparative study of protein structure / G. Lenoir,
P. De Kinkelin / J. Virol. – 1975. – Vol. 16, № 2. – P. 259–262.
6. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough,
A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chemistry. – 1951. – Vol. 193. – P. 265–275.
7. Noga, E.J. Fish Disease: Diagnosis and Treatment. / E.J. Noga. – London etc.:
Mosby, 1995. – P. 211–213.
8. A contagious disease of salmon possibly of virus origin / R.R. Rucker,
W.J. Whipple, J.R. Parvin, C.A. Evans // U.S. Fish Wildl. Serv. Fish Bull. – 1953. –
№ 54. – P. 35–46.
9. Infectious haematopoietic necrosis (IHN): the first confirmed finding in Russia
/ I.S. Shchelkunov, O.A. Kupinskaya, L.V. Didenko, A.F. Bykovsky // 10th Int. Conf.
EAFP. Diseases of Fish and Shellfish: Book and Abstracts. – Dublin, 2001. – P. 44.
Вопросы биотехнологии
239
10. Watson, S.W. A virus disease of sockeye salmon: interim report / S.W. Watson,
R.W. Guenther, R.R. Rucker // U.S. Fish Wildl. Serv. Spec. Sci. Rep. Fish. – 1954. –
№ 138. – P. 1–36.
11. Wolf, K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases / K. Wolf. – N.Y., Ithaca: Cornell
Univer. Press, 1988. – 478 p.
Purification and Concentration of salmon
infectious hematopoietic necrosis virus
L.Yu. Apasova, N.V. Moroz, S.S. Rybakov, T.B. Yeremeyeva
Summary
Purified and concentrated infectious hematopoietic necrosis virus was
produced. The virus was precipitated with polyethylene glycol (PEG-6000) and
ultracentrifugation and purified using cesium chloride gradient. The virus was
tested for purification degree with SDS-PAAG electrophoresis.
УДК 619:576.3:57.082.26
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИКИ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРВИЧНО
ТРИПСИНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК
ПОЧКИ ТЕЛЁНКА
Н.И. Герасимова, Б.Л. Манин, С.К. Старов
Резюме
Представлены результаты исследований по усовершенствованию
методики культивирования первично трипсинизированных клеток почки
телёнка, с помощью которой из одной посевной дозы первичных клеток
путем последовательных переносов взвеси неприкрепившихся клеток
можно получить несколько монослойных культур, тем самым увеличив
общее количество клеток.
Введение
Для культивирования вирусов в научно-исследовательских и производственных целях используют первичные культуры клеток из по-
240
Вопросы биотехнологии
чечной ткани животных (1, 2, 4, 7). Первичной называется культура,
полученная из ткани и выращенная in vitro до первого пересева (1,
3, 6). Выбор почечной ткани обусловлен легкой дезагрегацией ткани
детергентами, относительной неприхотливостью клеток к условиям
культивирования, широким спектром чувствительности к вирусам
животных и человека (1, 3, 4). Первичная культура клеток из почки
телёнка относительно гетерогенна. Монослой культуры клеток почки
телёнка (ПТ) формируется из эпителиоподобных и веретенообразных
клеток, имеет характерный морфологический рисунок, при заражении
вирусами проявляет специфические цитопатические изменения клеток
(1, 3, 5).
В первичной пристеночной культуре ПТ большая часть посеянных
жизнеспособных клеток не прикрепляется к субстрату и не участвует в
формировании монослоя, а остается во взвешенном состоянии и удаляется во время смены питательной среды (4, 8).
Целью исследований явилось изучение жизнеспособности неадгезированных клеток и возможности выращивания из них серий монослойных культур, времени и уровня адгезии клеток, а также роста прикрепившихся клеток.
Материалы и методы
Первично трипсинизированные клетки ПТ получали по общепринятой методике (2, 3). Количество жизнеспособных клеток подсчитывали в камере Горяева, используя 0,2% раствор трипанового синего для
окрашивания клеток.
Первичную культуру клеток ПТ культивировали в матрасах РУ в ростовой среде, состоящей из 0,5% ГЛА на солевом растворе Хенкса с 10%
сыворотки крови КРС (рН 7,1-7,2), а также в кондиционированной среде
с гомологичных клеток. Кондиционированная среда – жидкость, полученная в результате инкубации питательной среды с растущими клетками (2).
Для снятия со стекла и диспергирования клеток использовали 0,25% раствор трипсина. Прикрепленные клетки и монослой культуры ополаскивали солевым раствором Хенкса. Через 1, 3, 24 ч подсчитывали количество
адгезированных и находящихся в суспензии клеток, а также учитывали
качество монослоя и индекс пролиферации.
Методом многократных последовательных переносов взвеси неприкрепившихся клеток определяли их способность к адгезии и выращиванию в пристеночных культурах в обычных лабораторных условиях.
241
Вопросы биотехнологии
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований определяли начальную адгезию первичных клеток ПТ, формирование монослоя и индекс пролиферации.
Суспензию клеток в концентрации 100; 200; 300; 400 тыс/см3 высевали в матрасы РУ. Через 1, 3, 24 ч считали количество адгезированных
клеток. Уровень адгезии клеток устанавливали после удаления из матрасов взвеси неприкрепившихся клеток, ополаскивания прикрепившихся
клеток солевым раствором Хенкса и путем подсчета снятых трипсином со
стекла клеток. На 3 сутки культивирования однослойной культуры клеток
ПТ отмечали формирование монослоя и учитывали индекс пролиферации.
Полученные результаты представлены в таблице.
Из данных таблицы видно, что в течение 24 ч число адгезированных
в матрасах клеток при разных посевных концентрациях находилось примерно на одном уровне. Седиментация и адгезия клеток почти полностью
завершилась спустя 1 ч после высева в матрасы первичной клеточной суспензии. При подсчете прикрепившихся клеток через 1 ч было замечено,
что во время слива надосадка некоторые клетки сползали из-за слабой
связи с субстратом. Крепкая связь клеток с поверхностью сосудов формировалась спустя 3 ч, вследствие чего снижалась вероятность случайного
их отслоения, с другой стороны – клетки ещё не начали активно пролиферировать и не могли изменить истинной картины адгезии.
Таблица
Адгезия, формирование монослоя, пролиферативная активность
первичной культуры клеток ПТ в зависимости от посевной дозы
400
ФормироКоличество
вание
Индекс
клеток в
монослоя
пролифемонослое
на
рации на
на 3 сутки,
3 сутки,
3 сутки
тыс/см3
1ч
3ч
24 ч
%
16,0±0,35 18,0±0,42 20,0±1,33
100
78±1,73
3,8
300
12,0±0,27 13,5±0,31 15,0±0,10
100
42±0,93
2,8
200
8,0±0,18 9,0±0,20 10,0±0,66
60
15±0,33
1,5
100
4,0±0,09 4,5±0,11 5,0±0,31
10
5±0,11
0
Посевная
концентрация клеток,
тыс/см3
Количество
адгезированнных клеток,
тыс/см3
Количество взвешенных в культуральной жидкости клеток во всех
случаях через 1, 3, 24 ч после высева суспензии оставалось на одном уровне, что свидетельствует о прекращении процесса адгезии в одно и то же
время при всех испытанных концентрациях.
242
Вопросы биотехнологии
Из приведенных данных об адгезии клеток можно сделать заключение о существовании предела первоначальной адгезии первично трипсинизированных клеток в пристеночной культуре, достижение которого препятствует дальнейшему их прикреплению к стеклу.
Также установлено, что со снижением посевных концентраций клеток индекс пролиферации снижается, монослой клеток формируется не
везде. Так, на третьи сутки культивирования в матрасах, засеянных в концентрациях 300; 400 тыс. кл/см3, количество клеток увеличилось в 3,8 и
2,8 раза, соответственно, с образованием 100% монослоя. В матрасах с
концентрацией 200 тыс. кл/см3 их количество возросло в 1,5 раза, монослой сформировался на 60%, а при концентрации 100 тыс. кл/см3 количество клеток практически не изменилось. По-видимому, при посевных
концентрациях 300; 400 тыс. кл/см3 неприкрепившиеся клетки обогащают
среду метаболитами, индуцирующими клеточную пролиферацию.
Посевная доза 300 тыс. кл/см3 является оптимальной из-за удачного
соотношения адгезированных и неадгезированных клеток и создает эффективную кондиционированную среду.
Однослойная первичная культура клеток ПТ малопроизводительна, что
связано с невысокими сборами жизнеспособных клеток при дезагрегации
ткани, а главное – с низким (до 4-5%) прикреплением клеток к субстрату.
Поэтому вторым этапом наших исследований явилось определение
рационального использования неприкрепившихся клеток для повышения
результативности выращивания первичной культуры клеток ПТ.
Материалом для исследований служили 2-суточные неприкрепившиеся клетки, полученные при посеве первично трипсинизированных клеток в оптимальной концентрации 300 тыс/см3. Переживающие в течение
5 суток взвешенные в среде клетки высевали в матрасы РУ и учитывали
время образования монослоя. Было обнаружено, что, несмотря на отмирание клеток в течение 5 суток, количество жизнеспособных взвешенных
клеток оставалось равным числу адгезированных и выросших в суточных
культурах клеток, а при посевах в новую посуду они не только прикреплялись к стеклу, но и начинали пролиферировать.
Проводили опыты по последовательному многократному переливу
неадгезированных клеток (от 2-3 до 10 раз) из матраса в матрас с одинаковыми и возрастающими промежутками времени (от 1 до 48 ч).
Отмечено, что уровень начальной адгезии клеток во всех случаях был
примерно равным и сопоставимым с таковым показателем у контрольных
культур. Однако дальнейшее культивирование в свежих ростовых средах
не завершалось формированием монослоя, в то время как употребление
кондиционированных сред обеспечивало активный рост клеток.
Вопросы биотехнологии
243
Поэтому были проведены исследования по культивированию из одной
оптимальной посевной дозы целой серии монослойных культур в матрасах РУ путем многократных последовательных переливов взвеси неприкрепившихся клеток и доращивания их в кондиционированной среде.
Предложено 4 варианта, дающих гарантию успешного выращивания
клеток в пристеночных культурах.
1 вариант. Через 48 ч культивирования первично трипсинизированных клеток ПТ ростовую среду с взвешенными в ней клетками переливали в новый матрас. На 5 сутки в обоих матрасах формировался почти
одинаковый монослой. Таким образом, из одной посевной дозы получали
две равноценные монослойные культуры.
2 вариант. Через 24 ч после посева клеток ПТ ростовую среду с неприкрепившимися клетками переносили в новый матрас, из которого
через 48 ч также переливали неприкрепившиеся клетки в следующий
новый матрас. То есть из одной посевной дозы получали 3 монослойные культуры.
3 вариант. Из одной посевной концентрации клеток путем последовательных переносов через 8, 16, 24 ч после посева получали 4 монослойные культуры клеток ПТ.
4 вариант. Из одной посевной дозы через 3, 8, 12, 24 ч после посева
клеток путем последовательных переносов неприкрепившихся клеток получали 5 монослойных культур клеток ПТ.
Во всех вариантах были получены полноценные монослои первичной культуры клеток ПТ. Отличие заключалось в том, что происходила
задержка формирования монослоя пропорционально кратности последовательных переносов. В 1 и 2 вариантах монослои формировались на
5 сутки, в 3 и 4 вариантах – на 6-7 сутки.
Таким образом, благодаря серийному выращиванию первичной культуры клеток ПТ из одной посевной дозы можно получить несколько монослойных культур, повышающих суммарное количество клеток.
Выводы
1. Скорость адгезии первично трипсинизированных клеток ПТ не зависит от их посевной концентрации и только 4-5% клеток через 1 ч после
посева прикрепляются к субстрату.
2. Неприкрепившиеся клетки обогащают среду метаболитами, индуцирующими клеточную пролиферацию.
3. Применение серийного выращивания первичной культуры клеток
ПТ увеличивает общее количество клеток в 5 раз.
244
Вопросы биотехнологии
Список литературы
1. Биотехнология клеток животных: в 2 т. Т. 1 / под. ред. Р.Д. Спиера, Дж.Б. Гриффита. – М.: Агропромиздат, 1989. – 165 с.
2. Культивирование клеток и тканей животных: учебно-метод. пособие. – Ч. 1 /
Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков [и др.]. – Ставрополь, 1986, – 96 с.
3. Животная клетка в культуре. Методы и применение в биотехнологии / под
ред. Л.П. Дьяконова, В.И. Ситькова. – М: Компания Спутник, 2000. – 101 с.
4. Завьялова, Г.Н. Экспериментальное обоснование промышленной технологии получения первичных культур клеток: дис. … канд. биол. наук / Завьялова
Галина Николаевна. – Владимир, 1970. – 140 с.
5. Кучмасов, И.С. Экспериментальное обоснование и разработка промышленной технологии культивирования клеток для выращивания вируса ящура: дис. …
докт. биол. наук / Кучмасов Иван Семенович. – Владимир, 1974. – 374 с.
6. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев. – Москва: Колос, 1976. – 303 с.
7. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов,
Т.И. Алипер. – М.: Библионика, 2007. – 524 с.
8. Юрков, С.Г. Адгезия и трансформация клеток гемопоэтической системы /
С.Г. Юрков, Н.Н. Аверина, А.Н. Курносов // Вопр. вет. вирусол., микробиол. и
эпизоотол.: тез. докл. науч. конф. – Покров, 1985. – С. 100-102.
improvement OF Methods FOR Cultivation
OF Primarily trYpsinized Calf kidney cells
N.I. Gerasimova, B.L. Manin, S.K. Starov
Summary
Results of improving methods for cultivation of primarily trypsinized
calf kidney cells are provided in the paper. The methods help to obtain
several monolayer cultures from one inoculation dose of primary cells
using successive transfers of non-attached cell suspension, thus increasing
the total number of cells.
Вопросы биотехнологии
245
УДК 619:615.3:005.6
СИСТЕМА МЕНЕДЖМЕНТА
И ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА
А.И. Дудников, В.Г. Патрикеев, С.В. Диев
Резюме
В данной статье рассматриваются основные положения сертифицированной системы менеджмента качества, функционирующей в ФГУ «ВНИИЗЖ» и соответствующей требованиям стандарта
ГОСТ Р ИСО 9001-2001. Показана целесообразность комплексного использования и других стандартов на систему менеджмента.
Введение
В ФГУ «ВНИИЗЖ» сертифицирована система менеджмента качества (СМК) на соответствие требованиям национального стандарта
ГОСТ Р ИСО 9001–2001 (1), основным назначением которой является
удовлетворение запросов потребителей (заказчиков). В учреждении все
большее значение придается использованию системного подхода, согласно которому координируются все действия по планированию, разработке
и производству лекарственных средств и осуществлению ветеринарной
деятельности для достижения наивысшего уровня конкурентоспособности, улучшения качества и эффективности продукции (услуг), удовлетворения клиентов и усовершенствования технологии производства.
В современных условиях проблема качества продукции (услуг) решается в процессе управления учреждением в целом, поэтому акцент делается
не только на качество продукта, а на процесс, в результате которого он появляется. Для этого применяется «процессный подход», когда вся деятельность рассматривается как совокупность взаимосвязанных процессов (изучение рынка, планирование, направление разработки, производство и т.п.).
Работа по результативному функционированию СМК направлена на
дальнейшее применение «системного» и «процессного» подходов для постоянного совершенствования процессов, научно-технической продукции
и развития учреждения.
Учитывая особенности и высокие международные требования к разработке и производству лекарственных средств, для гармоничного совмещения требования базового стандарта дополняются практикой надлежащего производства GMP – Good Manufacturing Practice for Medicinal
Products (2), которая направлена на обеспечение качества и безопасности
246
Вопросы биотехнологии
всех видов лекарственных препаратов. Стандарт GMP не требует отдельной системы менеджмента, а требует включения в общую (базовую)
систему менеджмента. Кроме того, в базовой системе менеджмента необходимо использовать и другие стандарты, отражающие разные нужды
и ожидания заинтересованных сторон. Хотя многие организации, в том
числе и биологической промышленности, идут по пути создания интегрированных систем менеджмента (4, 5). В связи с растущим числом используемых стандартов целесообразно их комплексное применение в базовой
системе менеджмента качества.
Результаты и обсуждение
Общие требования к СМК. Глобализация рынка и экономики указывает на пользу внедрения в учреждении системы управления качеством в
соответствии с требованиями стандарта ИСО – Международной организации по стандартизации.
Система менеджмента качества на основе стандарта ИСО – объективная необходимость деятельности учреждения для повышения уровня защиты жизни и здоровья животных, охраны окружающей среды, роста конкурентоспособности учреждения и повышения качества продукции (услуг).
Эффективная система менеджмента качества разработана и функционирует так, чтобы удовлетворялись запросы и ожидания потребителей (заказчиков) при планировании, разработке и изготовлении лекарственных
средств, а также осуществлении научной и ветеринарной деятельности.
Руководство учреждения обязуется соответствовать требованиям
стандарта и постоянно повышать результативность и эффективность СМК
за счет выполнения следующих принципов:
− реализация «системного» и «процессного» подходов в СМК;
− лидерство руководства и непрерывное вовлечение сотрудников в
деятельность;
− поддержание взаимовыгодных отношений с поставщиками и потребителями;
− принятие решений только на основе достоверных фактов;
− постоянное улучшение СМК и научно-технической деятельности.
Таким образом, в учреждении документально оформлена, функционирует в рабочем состоянии СМК.
Общие требования к составу документации. Одним из основных
моментов работы СМК является ее документирование. В соответствии с
требованиями стандарта разработана следующая документация:
− политика в области качества;
Вопросы биотехнологии
247
− руководство по качеству;
− документированные процедуры (стандарты организации, регламенты);
− положения о подразделениях и должностные инструкции;
− прочая документация (описывающая систему, процессы, процедуры
и продукцию, а также записи, отражающие результаты деятельности);
− законодательные и нормативные документы.
Ответственность руководства. Руководители учреждения и подразделений играют ведущую роль в определении, применении и совершенствовании СМК. Они разрабатывают и реализуют политику и цели в
области качества, что способствует реальному движению в сторону улучшения качества разработок и оказания услуг.
В учреждении назначен представитель руководства по СМК, а в подразделениях – ответственные сотрудники по качеству.
Руководители подразделений создают и поддерживают внутреннюю
среду, в которой всех сотрудников полностью вовлекают в решение задач
подразделений и учреждения.
Высшее руководство ежегодно анализирует СМК с целью обеспечения ее пригодности и улучшения.
В результате анализа руководством рекомендовано дополнить базовую
СМК системой обеспечения качества на основе стандарта GMP и стандартом
оценки соответствия продуктов и кормов нормативным требованиям (3).
Такое комплексное применение стандартов обеспечит:
− минимизацию функциональной разобщенности в учреждении, возникающей при использовании отдельных систем (стандартов);
− согласованность действий;
− уменьшение объема документов.
Управление ресурсами. В учреждении управление ресурсами включает процесс идентификации, обеспечения и распоряжения физическими
и людскими ресурсами. Для постоянного повышения удовлетворенности
потребителей, поддержания в рабочем состоянии СМК, улучшения качества разработок и изготовления продукции, а также оказания ветеринарных услуг определены основные ресурсы.
На основании требований заказчика (Россельхознадзор МСХ РФ) дирекцией принимаются меры по расширению услуг, включая проведение
ветеринарно-санитарного надзора за болезнями животных в мире и стране, анализа риска и мониторинга.
Согласно стандарту качества сотрудники должны быть компетентными в соответствии с полученным образованием, подготовкой и опытом.
Постоянно проводится обучение специалистов высшей квалификации че-
248
Вопросы биотехнологии
рез аспирантуру, докторантуру и соискательство, а также осуществляется
базовая подготовка специалистов:
− повышение квалификации инженерно-технического состава, рабочих;
− освоение смежных профессий;
− обучение ветеринарно-санитарным правилам, технике безопасности, законодательным и нормативным актам.
В рабочем состоянии поддерживается инфраструктура: здания, оборудование и производственная среда. Вместе с тем проводится поэтапная
перестройка помещений в соответствии с требованиями стандарта GMP.
Процессы жизненного цикла продукции. Жизненный цикл продукта –
временный интервал между возникновением идеи (концепции) получения
соответствующего препарата (продукта) до его снятия с производства и
применения.
Существует шесть основных фаз жизненного цикла продукта:
− концепция, технико-экономическое и научно-техническое обоснование;
− планирование и разработка;
− производство и обслуживание;
− мониторинг и измерение продукции;
− сохранение соответствия продукции.
В соответствии с требованиями потребителей и заказчиков учреждение проводит планирование и выполнение научно-исследовательских работ, а также научно-технической деятельности.
Используемая методология позволяет обеспечить высокое качество
продукции (услуг) уже на стадии планирования с полным учетом требований и пожеланий потребителей (заказчиков). Полное удовлетворение
требований потребителей при осуществлении научно-исследовательских
работ (по планам НИР) обеспечивает выдачу следующей продукции:
− информация (эпизоотологическая, социальная, экономическая);
− новые услуги (методики, анализы, правила по профилактике и ликвидации опасных и особо опасных болезней животных);
− новые виды (животные, микроорганизмы).
При осуществлении научно-технической деятельности (контракты,
договора) разрабатываются и производятся диагностикумы, сыворотки,
вакцины и др. препараты.
Учреждением осуществляется постоянная связь с потребителями путем предоставления информации о продукции и оказываемых услугах, а
также участие в разработке и осуществлении мер профилактики и борьбы
с болезнями животных.
Вопросы биотехнологии
249
Для проведения НИР, разработки и опытно-промышленного производства организация закупает соответствующее сырье и материалы, которые проходят входной контроль. Учреждение планирует и обеспечивает
производство и контроль продукции в требуемых условиях. Сохранение
соответствия продукции предусматривает совокупность действий по
идентификации, изготовлению, упаковке и отправке продукции, обеспечивающих ее сохранность на всех стадиях жизненного цикла.
Измерение,
анализ
и
улучшение.
Согласно
стандарту
ГОСТ Р ИСО 9001 – 2001 измерениям подлежат:
− удовлетворенность потребителей;
− результативность СМК;
− характеристики продукции и процессов;
− компетентность сотрудников.
Для оценки соответствия деятельности и демонстрации эффективности работы в подразделениях проводится внутренний аудит (проверка), а
также мониторинг и измерение процессов и продукции.
Эффективным инструментом работы в области качества лекарственных средств и оценки соответствия безопасности продукции и кормов
служат испытательные лаборатории. Это специализированные научно–
контрольные подразделения, в которых отдел биологического и технического контроля осуществляет входной контроль сырья и материалов,
технологический контроль и контроль готовых препаратов, а испытательная лаборатория проводит оценку безопасности и качества продуктов и
кормов. Их деятельность осуществляется в соответствии со стандартом
ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 – 2006, включающим требования к лабораториям и системе менеджмента.
Таким образом, стандартизация и поддержание в рабочем состоянии
СМК, соответствующей требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9001 – 2001,
позволяет обеспечить удовлетворенность потребителей в получении качественной продукции, надлежащих ветеринарных услуг, а также повысить
доверие к учреждению.
Заключение
В ФГУ «ВНИИЗЖ» сертифицирована и функционирует система менеджмента качества, соответствующая требованиям стандарта
ГОСТ Р ИСО 9001 – 2001, применительно к планированию, разработке и
производству лекарственных средств, а также осуществлению научной и
ветеринарной деятельности.
250
Вопросы биотехнологии
Вместе с тем, существующую систему менеджмента, с помощью
которой учреждение осуществляет свою деятельность, целесообразно
дополнить стандартом надлежащей производственной практики GMP и
стандартом соответствия контроля продуктов и кормов.
Список литературы
1. ГОСТ Р ИСО 9001-2001. Система менеджмента качества. Требования. – М.:
Стандарт России: Изд-во стандартов, 2001. – 21 с.
2. ГОСТ Р 52249-2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. – М.: Госстандарт России; Изд-во стандартов, 2004. – 211 с.
3. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. – М.: Стандартинформ, 2007. – 25 с.
4. Организация интегрированной системы менеджмента качества на ФГУП
«Курская биофабрика» // Как это было. К 110-летию Рос. агробиол. пром-сти и
Курской биофабрики: факты, события, воспоминания / В.М. Безгин, В.Е. Козлов,
П.П. Рахманин [и др.]. – Курск, 2006. – Гл. 14. – С. 450 – 474.
5. Токарик, Э.Ф. Интегрированная система менеджмента биофармпредприятия агробиологической промышленности: экономический аспект эффективности
/ Э.Ф.Токарик, А.И. Шурыгин, А.В. Спиридонов // Матер. Междунар. юбилейной
науч.-практ. конф., посвящ. 110-летию Курской биофабрики и агробиол. пром-сти
России. – Курск, 2006. – С. 57-66.
Quality management system
A.I. Dudnikov, V.G. Patrikeyev, S.V. Diev
Summary
Main components of the certified quality management system, that is
used in the FGI «ARRIAH» and complies with GOST R ISO 9001-2001
standard requirements, are described in the paper. The practicability of
complex application of other standards for the quality management system
is demonstrated.
Вопросы биотехнологии
251
УДК 576. 35:576 085. 23
ВЕРТИКАЛЬНОЕ ДВИЖЕНИЕ ДНК-КОНТАМИНАЦИИ
(ХЛАМИДИЙ) В СУБКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ
ЭМБРИОНА ГУСЯ
Б.Л. Манин, Е.Г. Кузнецова, Н.В. Коропова
Резюме
В статье приведены данные о субкультивированиии клеток эмбриона
гуся. В процессе культивирования к 28-му пассажу отмечено увеличение
вакуолизации клеток, которое сопровождалось частичной дегенерацией
монослоя. Вакуолизация коррелирует с увеличением ДНК-светящихся
внутриклеточных включений. По нашему предположению – это ретикулярные тельца хламидий Parachlamydiacea acanhamoebae, распространяющиеся вертикально.
Введение
Наличие латентной контаминации клеточных культур – явление нежелательное. В настоящее время ПЦР-диагностика позволяет выявить
минимальное количество любых микроорганизмов и вирусов.
Роль латентной контаминации в клетках и клеточных культурах неоднозначна. Борхсениус С.Н. и др. (2), исследовавшие микоплазменную
контаминацию, указывают на то, что микоплазмы не индуцируют образование злокачественных опухолей у животных. Более того, они могут ингибировать вирусную трансформацию (саркома Рауса) в клеточных культурах. Помимо микоплазм, в клеточных культурах могут персистировать
и активно размножаться хламидии. Обнаружение их серологическими и
другими методами порой затруднено.
В данной работе сделана попытка выявления ДНК-контаминации
(хламидий) в клетках эмбриона гуся цитохимическим методом.
Материалы и методы
Трипсинизацию 12-суточных эмбрионов гуся проводили согласно
общепринятой методике (1).
Изучение нативных клеточных препаратов проводили с помощью инвертированного, фазово-контрастного и люминесцентного микроскопов.
При исследовании цитохимическим методом изучаемые препараты выращивали на покровных стёклах, окрашивали акридиновым оранжевым и
просматривали в люминесцентном микроскопе.
252
Вопросы биотехнологии
В работе использовали среды Игла, ПСП, ПСС, 0,4% ГЛА и
ДМЭМ (F-12).
Первично трипсинизированные клетки 12-суточных эмбрионов гуся
(КЭГ) были получены на 1-м пассаже из лаборатории парамиксовирусных
инфекций. Первичная клеточная культура была необходима для выделения вируса энтерита гусей.
Клетки были переданы в лабораторию культур клеток, где проводилось субкультивирование КЭГ до 30 пассажа. Субкультура была
адаптирована к среде Игла (по прописи «ВНИИЗЖ» с 0,25% ГЛА). Использовались сертифицированные, без латентного присутствия микоплазм и вирусов, фетальные сыворотки КРС фирм Bioclot и HeyClone.
Кратность рассева не превышала 1:2.
Результаты и обсуждение
При субкультивировании клеток эмбриона гуся были выявлены следующие закономерности. После трипсинизации (снятия клеток с субстрата)
монослой диспергировался до отдельных клеток и клеточных агрегатов. Отдельно адгезированные клетки не сразу приступали к делению. Основной
рост монослоя происходил в клеточных агрегатах, которые образовывали
тканеподобную структуру. От этих агрегационных центров шло разрастание колонии. Монослой формировался в псевдосинцитий, а затем в 2- или
3-слойную структуру. Клетки секретировали внеклеточный матрикс, который
агрегировал клетки и препятствовал полноценному диспергированию клеток
при трипсинизации. Характерную морфологию имели интерфазные клетки.
Фибробластоподобные и веретенообразные клетки формировали монослой,
характерный для первичных клеток, полученных из птичьих эмбрионов.
С последующими пассажами морфология клеток не менялась, но к
10-му пассажу появились гигантские клетки размером до 40 мкм. Деление
клеток происходило по обычному типу: в профазе идёт округление клетки,
её поверхность лишается крупных цитоплазматических выростов, после
чего она делится на две дочерние клетки. После деления дочерние клетки
долгое время (до 8 часов) имеют аморфную структуру, они выбрасывают
во все стороны крупные цитоплазматичекие выросты. Адгезия их происходит в местах, где есть колонии, включающие более 2-х клеток. Здесь
они принимают морфологию адгезированных клеток стационарной фазы
роста (веретенообразную, фибробластоподобную).
В процессе пассирования (к 20-му пересеву) была отмечена вакуолизация клеток на всех стадиях клеточного цикла. Этот процесс периодически
сопровождался спонтанной дегенерацией монослоя. Для выяснения дина-
Вопросы биотехнологии
253
мики появления этого артефакта были исследованы клетки, замороженные
на 4-, 7-, 13- и 28-м пассажах. Вакуолизация, наблюдаемая методом фазовоконтрастной микроскопии, начинает проявляться с 4 пассажа (рис. 1).
Рис. 1. Присутствие единичных вакуолей в клетках эмбриона гуся
на 4-м пассаже
Рис. 2. Вакуолизация КЭГ на 28-м пассаже
К 7-му пассажу степень вакуолизации была на уровне 5-10%, а к 28-му
достигла 60-70% (рис. 2). При этом пролиферация клеток значительно замедлялась. В большинстве клеток ядра разрушались раньше цитоплазмы клеток.
254
Вопросы биотехнологии
Рис. 3. ДНК-светящиеся включения в клетках КЭГ
Рис. 4. ДНК-светящиеся включения в клетках КЭГ
Были проведены исследования цитохимических препаратов вышеуказанных пассажей (окраска акридиновым оранжевым) и сравнение их с
нативными препаратами в фазовом контрасте. Оказалось, что содержимое вакуолей контрастируется в цитохимических препаратах как ДНКсодержащие частицы полиморфной структуры (т. е. разные по размеру,
однородные по содержанию), светящиеся ярко-зелёным цветом, но более
однородно, чем ядра соматических клеток (рис. 3 и 4).
При критическом (значительном) содержании ДНК-светящихся
включений первоначально разрушались ядра, а затем и сами клетки.
ДНК-контаминанты выходили во внеклеточное пространство и длитель-
Вопросы биотехнологии
255
ное время, не разрушаясь, присутствовали в культуральной среде. При таком развитии биологической системы помутнения в самой культуральной
среде не наблюдали. На бактериальных средах МПБ, МПА, тиогликолевая
и среда Сабуро не выявляли признаки присутствия артефактов культуральных контаминантов. ПЦР-диагностика показала латентное присутствие
микоплазм. На цитохимических препаратах микоплазмы не были обнаружены. По литературным данным (4), ярко-зелёное свечение полиморфных
гранул, (при исследовании в люминесцентном микроскопе) соответствует
хламидийной контаминации. Цитопатичекие проявления также подтверждали наличие этой инфекции. Но ПЦР-исследование культуры клеток на
наличие хламидий sр. (общий праймер для всех хламидий) показало отсутствие этого микроорганизма.
Известно, что хламидии относятся к внутриклеточным контаминантам (2, 4). Существуют клеточные линии, хронически контаминированные
хламидиями, например, ПС (почка сайгака) (5), которая используется как
модельная система. Для вирусологических целей присутствие хламидий
нежелательно, так как они могут влиять на нормальную репродукцию вирусов. Но в данном случае, по нашим предположениям, хламидии, обнаруженные цитохимическим методом и не подтвержденные с помощью ПЦР,
могли попасть в эмбрионы гусей из водоёмов, а конкретнее – из поедаемого животными планктона, в котором присутствуют амёбы. Естественным
паразитом амёб (возможно – симбионтом) является Рarachlamydiaceae
acanhamoebae, которая по современной классификации относится к семейству Parachlamydiaceae (3, 4). Различия в последовательностях ДНК
с другими семействами хламидий достигают более 20%. Представители
семейства Parachlamydiaceae не идентифицируются моноклональными
антителами, специфическими для антигенного комплекса ЛПС (липополисахарида) семейства Chlamydiaceae (4). Вероятно, поэтому праймеры,
предназначенные для патогенных хламидий теплокровных животных, не
улавливают ДНК парахламидий.
Очевидно, что многие латентные контаминанты клеточных культур
передаются вертикально от животных-доноров. При отсутствии в питательных средах факторов гуморального и клеточного иммунитета латентные
микроорганизмы могут постепенно количественно изменяться в сторону
увеличения. В данном случае могла сработать такая цепь передачи: от амёб,
контаминированных парахламидиями, через гусей – в эмбрионы и, после
трипсинизации последних – в клеточную культуру. Также очевидно, что без
специфической санации происходит нарастание цитопатического действия
ДНК-контаминанта при длительном пассировании клеток эмбриона гуся.
256
Вопросы биотехнологии
Выводы
1. Субкультивирование клеток эмбриона гуся в течение 28 пассажей
привело к увеличению вакуолизации цитоплазмы, которая в итоге проявилась как фактор ЦПД.
2. Степень вакуолизации коррелируется с количеством ДНК-полиморфных частиц, которые, вероятно, соответствуют ретикулярным тельцам парахламидий.
3. В рассматриваемом случае, при субкультивировании на протяжении 28 пассажей, латентная контаминация в клетках эмбриона гуся распространялась «вертикально».
Список литературы
1. Животная клетка в культуре. Методы и применение в биотехнологии / под
ред. Л.П. Дьяконова, В.И. Ситькова. – М: Компания Спутник, 2000. – С. 101.
2. Микоплазмы. Молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, патогенность, диагностика. / С.Н. Борхсениус,
О.А. Чернова, В.М. Чернов, М.С. Вронский. – СПб.: Наука, 2002. – 319 с.
3. Орлянкин, Б.Г. Современная классификация хламидий / Б.Г. Орлянкин // Ветеринария. – 2006,- № 1. – С. 23-26.
4. Равилов, А.З. Хламидиоз животных / А.З. Равилов, Х.З. Гафаров, Р.Х. Равилов. – Казань: Фэн, 2004. – 368 с.
3. Российская коллекция клеточных культур (РККК) / под ред. Г.П. Пинаева. –
СПб., 2004. – 186 с.
Vertical Movement of DNA Contamination
(Chlamydia) in Subcultivated Goose Embryo
Cells
B.L. Manin, Ye.G. Kuznetsova, N.V. Koropova
Summary
The information on subcultivation of goose embryo cells is provided in
the paper. An increase in cell vacuolation followed by a partial degeneration
of the monolayer was observed by cultivation passage 28. The vacuolation
correlates with the increase in DNA-fluorescent inclusion bodies. We assume
that these are Chlamydial reticular bodies (Parachlamydiacea acanhamoebae)
that spread vertically.
257
Список авторов
СПИСОК АВТОРОВ
Авситидийский Е.А., аспирант, ведущий ветеринарный врач,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: avsitidiysky@arriah.ru
Андреева О.Г., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Антонычев А.А., ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Апасова Л.Ю., младший научный сотрудник, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Афонина Д.Н., аспирант, ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Балашова М.А., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир;
е-mail: mail@arriah.ru
Белик Е.В., директор ФГУ «ВНИИЗЖ», кандидат ветеринарных наук,
г. Владимир; е-mail: belik@arriah.ru
Блотова Г.А., научный сотрудник, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Бозиев Х.М., научный сотрудник, филиал института биоорганической
химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
г. Пущино, Московская область
Борисов А.В., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: borisov1@arriah.ru
Борисова И.А., научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ»; г. Владимир, е-mail: borisova@arriah.ru
Борисов В.В., старший научный сотрудник, доктор ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: borisov2@arriah.ru
Бородина О.В., ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Бровко Ф.А., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина
и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино, Московская область
Бурдейная Л.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: burdeynaya@arriah.ru
Бьядовская О.П., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических
наук,ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: bjadovskaya@arriah.ru
Герасимова Н.И., ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных
наук, ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Герасимов В.Н., главный научный сотрудник, доктор ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Глейзер С.В., аспирант, ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
258
Список авторов
Григорян Г.В., младший научный сотрудник, ветеринарный врач,
Научный центр животноводства и ветеринарии Республики Армения,
эксперт Европейской Комиссии по вопросам ветеринарного здравоохранения
в Закавказском регионе (Делегация Европейской Комиссии в Грузии);
е-mail: ecah_grigoryan@mail.ru
Диев В.И., старший научный сотрудник, доктор ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: diev@arriah.ru
Диев С.В., руководитель группы приема проб и оформления документации,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Долгов Д.Л., младший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: dolgov@arriah.ru
Дрыгин В.В., профессор, доктор биологических наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: drygin@arriah.ru
Дудников А.И., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Думова В.В., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Евсеев А.М., ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: evseev@arriah.ru
Еремеева Т.Б., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Зинковский Ю.В., ведущий программист, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: zinkovsky@arriah.ru
Иголкин А.С., младший научный сотрудник, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: igolkin_as@arriah.ru
Ирза В.Н., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: irza@arriah.ru
Камалова Н.Е., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: kamalova@arriah.ru
Каньшина А.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: kanshina@arriah.ru
Клюкина Н.Д., научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Князев В.П., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Козлов Д.Ю., аспирант, ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: kozlov@arriah.ru
Колосов С.Н., главный научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: kolosov@arriah.ru
Кононов А.В., младший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Список авторов
259
Коропова Н.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Костыркин Ю.А., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных
наук, ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Кременчугская С.Р., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: kremenchugskaya@arriah.ru
Кузнецова Е.Г., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Кузнецов В.Н., ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: kuznetsov_vn@arriah.ru
Кулаков В.Ю., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: kulakov@arriah.ru
Левченко С.В., младший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Лёзова Т.Н., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Луговская Н.Н., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: lugovskaya@arriah.ru
Майорова Т.К., аспирант, ведущий ветеринарный врач,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Манин Б.Л., кандидат биологических наук, г. Владимир;
е-mail: manin_bl@arriah.ru
Манин Т.Б., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: manin@arriah.ru
Метлин А.Е., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: metlin@arriah.ru
Михайлина Н.М., главный технолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Михалишин В.В., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mihalishin@arriah.ru
Михалишин Д.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных
наук, ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mihalishindv@arriah.ru
Мищенко А.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mischenko@arriah.ru
Мищенко В.А., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mishenko@arriah.ru
Молодкин А.В., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: molodkin_av@arriah.ru
Мороз Н.В., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: moroz@arriah.ru
Мудрак Н.С., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mudrak@arriah.ru
260
Список авторов
Назаров Н.А., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: nazarov_na@arriah.ru
Никешина Т.Б., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: nikeshina@arriah.ru
Никифоров В.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: nikiforov@arriah.ru
Обухова Л.М., ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Оганесян А.С., аспирант, ведущий ветеринарный врач,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: oganesyan@arriah.ru
Орлова Е.С., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: orlova@arriah.ru
Патрикеев В.Г., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: patrykeev@arriah.ru
Перепеча А.А., ведущий технолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Пичуева А.А., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Пономарев А.П., главный научный сотрудник, доктор биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: ponomarev@arriah.ru
Потехин А.В., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: potehin@arriah.ru
Пронин И.А., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Прохватилова Л.Б., кандидат биологических наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: prohvatilova@arriah.ru
Рахманов А.М., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Русалеев В.С., профессор, доктор ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: rusaleev@arriah.ru
Ручнова О.И., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: ruchnova@arriah.ru
Рыбаков С.С., профессор, доктор биологических наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: rybakov@arriah.ru
Сарбасов А.Б., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: sarbasov@arriah.ru
Саргсян Х.В., директор Научного центра животноводства и ветеринарии
Республики Армения, кандидат ветеринарных наук
Селиверстов А.В., аспирант, ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Сидина Е.И., студентка, филиал института биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино, Московская область
Список авторов
261
Стариков В.А., аспирант, ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Старов С.К., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: starov@arriah.ru
Сысолякина М.В., ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Тетерина Т.А., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Тимина А.М., старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: timina@arriah.ru
Фоменко В.Ю., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Фролов С.В., кандидат ветеринарных наук, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: frolov@arriah.ru
Харитонова Е.Н., аспирант, ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Хлебопашникова С.В., ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Чвала И.А., научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: chvala@arriah.ru
Челышева М.В., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: chelysheva@arriah.ru
Чернышов А.В., аспирант, ведущий ветеринарный врач, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: mail@arriah.ru
Чумбуридзе К., ветеринарный врач, эксперт Европейской Комиссии
по вопросам ветеринарного здравоохранения в Закавказском регионе
(Делегация Европейской Комиссии в Грузии)
Чупин С.А., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: chupin@arriah.ru
Шадрова Н.Б., ведущий биолог, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: shadrova@arriah.ru
Шепеляковская А.О., старший научный сотрудник, кандидат
биологических наук, филиал института биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино,
Московская область
Щербаков А.В., ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: ascherbakov@arriah.ru
Яковлева А.С., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук,
ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир; е-mail: yakovleva_as@arriah.ru
Яснева Е.А., младший научный сотрудник, ФГУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир; е-mail: jasneva@arriah.ru
262
Содержание
СОДЕРЖАНИЕ
ЯЩУР И ДРУГИЕ БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА И СВИНЕЙ
РЕЗУЛЬТАТЫ МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ПО ЯЩУРУ В РОССИИ В 2008 ГОДУ
В.В. Борисов, А.М. Рахманов, Е.В. Белик, С.Р. Кременчугская,
Н.Е. Камалова, А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Никифоров,
М.В. Сысолякина, В.Н. Герасимов, Д.Н. Афонина,
Т.К. Майорова, А.В. Щербаков………………………………………………3
ЭЛЮЦИЯ СОРБИРОВАННОГО ВИРУСА ЯЩУРА
СОПОЛИМЕРАМИ ПОЛИАКРИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
Т.Н. Лезова, Н.Д. Клюкина, Д.В. Михалишин, А.В. Борисов……………14
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА ЯЩУРА МЕТОДОМ
«СОРБЦИИ-ЭЛЮЦИИ» ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН
Н.Д. Клюкина, Т.Н. Лезова, Д.В. Михалишин,
А.В. Борисов, В.А. Стариков………………………………………………20
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН ТИПА АЗИЯ-1
В.А. Стариков, В.В. Михалишин, Т.Н. Лезова,
А.В. Борисов, Д.В. Михалишин…………...……………………………….29
ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОИЗВОДСТВУ И КАЧЕСТВУ
ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН
А.И. Дудников, В.В. Михалишин…………………………………………..35
ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫХ
А.В. Молодкин, Н.А. Назаров, Н.М. Михайлина,
А.О. Шепеляковская, Ф.А. Бровко, Х.М. Бозиев,
Е.И. Сидина, С.С. Рыбаков, А.Е. Метлин………………………………….43
АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ
КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРС С РАЗНЫМИ
АДЪЮВАНТАМИ
А.В. Кононов, В.А. Мищенко, В.В. Думова,
С.В. Левченко, С.В. Хлебопашникова……………………………………..50
Содержание
263
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА,
ВЫЗВАВШЕГО ВСПЫШКУ АТИПИЧНОГО РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ В ИРКУТСКОЙ
ОБЛАСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
А.В. Щербаков, А.М. Тимина, М.В. Челышева, А.В. Каньшина………55
РЕСПИРАТОРНЫЕ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ
В.С. Русалеев, А.В. Потехин, О.В. Бородина……………………………64
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К РОТАВИРУСУ СВИНЕЙ
МЕТОДОМ ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ
А.С. Оганесян, О.П. Бьядовская,
О.Г. Андреева, Л.Б. Прохватилова…………………………………………70
РАЗРАБОТКА НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ
К БАКТЕРИЯМ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
В СЫВОРОТКАХ КРОВИ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ОДНОГО
РАЗВЕДЕНИЯ
Н.Б. Шадрова, М.А. Балашова……………………………………………82
ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ApxIV
В СЕРОДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
А.В. Каньшина, А.С. Яковлева, А.В. Щербаков………………………......91
ОЦЕНКА И ПРИМЕНЕНИЕ НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СЕРОМОНИТОРИНГА ВЕЗИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ
Н.Н. Луговская, Е.Н. Харитонова,
С.Р. Кременчугская, В.В. Борисов …………………....…………………..101
АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА РОТАВИРУСОВ: ОБЗОР
С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова, В.А. Мищенко…………………………114
РЕЗУЛЬТАТЫ МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИИ,
ОБУСЛОВЛЕННОЙ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE,
В СВИНОВОДЧЕСКИХ ХОЗЯЙСТВАХ
И ДИКОЙ ФАУНЕ РОССИИ
М.В. Челышева, А.М. Тимина, Е.С. Орлова, А.В. Щербаков…………..121
264
Содержание
ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ
БОЛЕЗНИ АУЕСКИ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ СВИНЕЙ
ПРИ ТЕСТИРОВАНИИ ИХ В ОДНОМ РАЗВЕДЕНИИ
Е.А. Яснева, Г.А. Блотова, В.И. Диев……………………………………130
ВСПЫШКА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
В ГРУЗИИ: РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ
ПРИЧИН ЗАНОСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
НА ТЕРРИТОРИЮ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ
Х.В. Саргсян, Г.В. Григорян, К. Чумбуридзе……………………………140
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ
И ДРУГИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ
А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов……………………………………………149
ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ОПЫТНЫХ
ОБРАЗЦОВ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ
ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ
БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ
А.В. Селиверстов..…………………………………………………………157
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ
АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ СИНДРОМА
ГИДРОПЕРИКАРДИТА КУР И НЬЮКАСЛСКОЙ
БОЛЕЗНИ В СОСТАВЕ
АССОЦИИРОВАННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ
ЭМУЛЬСИОННОЙ ВАКЦИНЫ
А.А. Перепеча, С.В. Фролов, В.В. Борисов,
Д.Л. Долгов, А.В. Борисов,
А.Б. Сарбасов, В.Ю. Кулаков …………………………….........................164
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПРОДУКЦИИ ШТАММА
«PVO3-B» МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ В ПЕРВИЧНОЙ
КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КУРИНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
Н.И. Герасимова, С.К. Старов, Т.Б. Манин,
И.А. Борисова, А.Б. Сарбасов ……………………………………………171
Содержание
265
НАКОПЛЕНИЕ МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ В
ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КУРИНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Н.И. Герасимова, А.А. Антонычев, Л.М. Обухова, С.К. Старов,
Т.Б. Манин, Д.Ю. Козлов………………………………………………….178
ВЛИЯНИЕ ПОЛИОНОВ НА РЕПРОДУКЦИЮ
МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO
Н.И. Герасимова, Л.В. Бурдейная, А.М. Евсеев, С.К. Старов,
Т.Б. Манин, Д.Ю. Козлов………………………………………………….185
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ
РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ФИБЕРА ВИРУСА
ССЯ-76 В СОСТАВЕ ВАКЦИНЫ
Е.А. Авситидийский, С.В. Фролов, А.В. Щербаков, В.В. Борисов ……190
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В КУРИНЫХ
ЭМБРИОНАХ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА Н5N2
А.С. Иголкин, И.А. Чвала, Т.Б. Манин, С.К. Старов…………………….196
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММА
ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE «З-1»,
ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ РФ
А.В. Чернышов, О.И. Ручнова…………………………………………….202
МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ВИРУСНОГО
ГЕПАТИТА УТЯТ В УТИНЫХ ЭМБРИОНАХ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ
В.Ю. Фоменко, С.В. Глейзер, В.Н. Ирза,
А.В. Борисов, В.П. Князев, Т.А. Тетерина……………………………….209
РАЗРАБОТКА ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ
ОБРАБОТКИ, УЧЁТА И ХРАНЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИФА
ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАЗНЫХ ВИДОВ
ЖИВОТНЫХ
Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин ………….215
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ
КРОВИ И ОРГАНОВ КРОЛИКОВ, ИНОКУЛИРОВАННЫХ
СУСПЕНЗИЯМИ НАНОБАКТЕРИЙ
А.П. Пономарев, А.А. Пичуева, Т.Б. Никешина, Е.В. Белик,
И.А. Пронин, Ю.А. Костыркин …………………………………………..220
266
Содержание
ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ
ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
Л.Ю. Апасова, Н.В. Мороз,
С.С. Рыбаков, Т.Б. Еремеева………………................................................234
ВОПРОСЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИКИ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРВИЧНО ТРИПСИНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ТЕЛЕНКА
Н.И. Герасимова, Б.Л. Манин, С.К. Старов …………………………….239
СИСТЕМА МЕНЕДЖМЕНТА И ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА
А.И. Дудников, В.Г. Патрикеев, С.В. Диев……………………………….245
ВЕРТИКАЛЬНОЕ ДВИЖЕНИЕ ДНК-КОНТАМИНАЦИИ
(ХЛАМИДИЙ) В СУБКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ
ЭМБРИОНА ГУСЯ
Б.Л. Манин, Е.Г. Кузнецова, Н.В. Коропова ……………………………..251
Список авторов…………………………………………………….………257
Содержание…………………………………………………………………262
267
Содержание
CONTENTS
FOOT-AND-MOUTH DISEASE AND OTHER BOVINE
AND PORCINE DISEASES
RESULTS OF FMD MONITORING IN RUSSIA IN 2008
V.V. Borisov, A.M. Rakhmanov, Ye.V. Belik, S.R. Kremenchugskaya,
N.Ye. Kamalova, A.V. Kanshina, A.V. Scherbakov,
A.V. Mischenko, V.A. Mischenko, M.V. Sysolyakina,
V.N. Gerasimov, D.N. Afonina, T.K. Mayorova ……………………………...3
ELUTION OF ADSORBED FMD VIRUS USING
POLYACRILIC ACID COPOLYMERS
T.N. Lyozova, N.D. Klyukina, D.V. Mikhalishin, A.V. Borisov……………14
FMD VIRUS CONCENTRATION USING «ADSORPTION-ELUTION»
METHOD FOR FMD VACCINE PRODUCTION
N.D. Klyukina, T.N. Lyozova, D.V. Mikhalishin,
A.V. Borisov, V.A. Starikov…………………..………………………………20
STUDY OF IMMUNOGENIC ACTIVITY OF ASIA-1 FMD VACCINES
V.A. Starikov, V.V. Mikhalishin, T.N. Lyozova,
A.V. Borisov, D.V. Mikhalishin………………………………………………29
General Requirements for Quality
and Productionof FMD Vaccines
A.I. Dudnikov, V.V. Mikhalishin……………………………………………..35
Future Use of Monoclonal Antibodies
in Diagnosis of Rabies in Animals
A.V. Molodkin, N.A. Nazarov, N.M.Mikhaylina,
A.O. Shepelyakovskaya, F.A. Brovko, Kh.M. Boziev,
Ye.I. Sidina, S.S. Rybakov, A.Ye. Metlin……………………….……………43
ANTIGENICITY OF BOVINE CORONAVIRUS INFECTION
VACCINE WITH DIFFERENT ADJUVANTS
A.V. Kononov, V.A. Mischenko, V.V. Dumova,
S.V. Levchenko, S.V. Khlebopashnikova……………………………………50
Phylogenetic characterization of the virus
responsible for atypical REPRODUCTIVE AND
RESPIRATORY SYNDROME SWINE outbreak in the
Irkutskaya Oblast of the Russian Federation
A.V. Scherbakov, A.M. Timina, M.V. Chelysheva, A.V. Kanshina…………55
268
Содержание
PORCINE RESPIRATORY INFECTIONS OF BACTERIAL ETIOLOGY
V.S. Rusaleyev, A.V. Potekhin, O.V. Borodina………………………………64
DEVELOPMENT of ELISA test-system for detection
of antibodies to porcine retrovirus using
a single dilution method
A.S. Oganesyan, O.P. Byadovskaya,
O.G. Andreyeva, L.B. Prokhvatilova…...........................................................70
DEVELOPMENT of Indirect ELISA for detection
of antibodies to Actinobacillus
Pleuropneumoniae bacteria in porcine sera
with a single dilution method
N.B. Shadrova, M.A. Balashova …………………………………………….82
USE OF RECOMBINANT ApxIV PROTEIN
FOR SERODIAGNOSTICS OF INFECTION CAUSED BY
ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
A.V. Kanshina, A.S. Yakovleva, A.V. Scherbakov……………………………91
ASSESSMENT AND USE OF INDIRECT ELISA FOR
SEROMONITORING OF SWINE VESICULAR DISEASE
N.N. Lugovskaya, Ye.N. Kharitonova,
S.R. Kremenchugskaya, V.V. Borisov………………………………………101
ANTIGENICITY OF ROTAVIRUSES: OVERVIEW
S.A. Chupin, L.B. Prokhvatilova, V.A. Mischenko…………………………114
Results of MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE infection
monitoring on pig farms and in wild fauna of Russia
M.V. Chelysheva, A.M. Timina, Ye.S. Orlova, A.V. Sherbakov……………121
TEST SYSTEM ON THE BASIS OF enzyme-linked
immunoSORBENT assay FOR DETECTION
OF ANTIBODY TO Aujeszky’s disease VIRUS
IN SWINE SERA when testing THEM IN ONE DILUTION
Ye.A. Yasneva, G.A. Blotova, V.I. Diev……………………………….……130
AFRICAN SWINE FEVER OUTBREAK IN GEORGIA:
RETROSPECTIVE ANALYSIS OF COURSES OF AFRICAN
SWINE FEVER INTRODUCTION IN THE TERRITORY
OF THE REPUBLIC OF ARMENIA
H.V. Sargsyan, G.V. Grigoryan, K. Chumburidze…………………………..140
Содержание
269
CURRENT ASPECTS OF AVIAN AND OTHER ANIMAL DISEASES
Comparative evaluation of immunobiological
properties of various strains of infectious
bursal disease virus
A.V. Borisov, V.N. Kuznetsov………………………………………………149
Antigenic Properties of Experimental
Samples of Inactivated Emulsion Vaccine
against infectious bursal disease
A.V. Seliverstov……………………………………………………………157
DETERMINATION OF OPTIMAL CONCENTRATIONS
OF ANTIGENS OF CHICKEN HYDROPERICARDITIS
SYNDROME ND NEWCASTLE DISEASE VIRUSES
IN ASSOCIATED INACTIVATED EMULSION VACCINE
A.A. Perepecha, S.V. Frolov, V.V. Borisov,
D.L.Dolgov, A.V. Borisov,
A.B. Sarbasov, V.Yu. Kulakov ……………………….….…........................164
Peculiarities of Reproduction of Avian
Metapneumovirus Strain «PV03-B» in Primary
Chicken Fibroblast Cell Culture
N.I. Gerasimova, S.K. Starov, T.B. Manin,
I.A. Borisova, A.B. Sarbasov……………………….….….….….….….…..171
REPLICATION OF AVIAN METAPNEUMOVIRUS
IN CHICKEN FIBROBLAST PRIMARY CELL CULTURE
AT DIFFERENT TYPES OF CULTIVATION
N.I.Gerasimova, A.A. Antonychev, L.M. Obukhova,
S.K. Starov, T.B. Manin, D.Yu. Kozlov………………………….….….…..178
Effect of Polyons on Reproduction
of Avian Metapneumovirus
in Vero Cell Culture
N.I. Gerasimova, L.V. Burdeynaya, A.M. Yevseyev
S.K. Starov, T.B. Manin, D.Yu. Kozlov………………………………….…185
Determination of Optimal Concentration
of EDS-76 Virus Fiber Recombinant
Protein in a Vaccine Formulation
Ye.A. Avsitidiysky, S.V. Frolov, A.V. Scherbakov, V.V. Borisov…………190
270
Содержание
OPTIMIZATION OF H5N2 AVIAN INFLUENZA VIRUS
CULTIVATION IN CHICKEN EMBRYOS
A.S. Igolkin, I.A. Chvala, T.B. Manin, S.K. Starov……………….….….…196
STUDY OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF
ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE «Z-1»
STRAIN ISOLATED IN THE TERRITORY OF THE RF
A.V. Chernyshov, O.I. Ruchnova……………………….….….….….….….202
Method of duck hepatitis virus
cultivation in duck embryos
for vaccine production
V.Yu. Fomenko, S.V. Gleyzer, V.N. Irza, A.V. Borisov,
V.P. Knyazev, T.A. Teterina…………….….….….….….….….….….….….209
DEVELOPMENT OF SOFTWARE
FOR PROCESSING, RECORDING
AND STORING ELISA RESULTS
FOR DIAGNOSIS OF DIFFERENT
ANIMAL SPECIES DISEASES
Yu.V. Zinkovsky, S.N. Kolosov, N.S. Mudrak, V.V. Drygin ……………….215
Electron-Microscopic Analysis
of Blood and Organ Samples
OF RABBITS Inoculated
with Nanobacteria Suspensions
A.P. Ponomaryov, A.A. Pichuyeva, T.B. Nikeshina,
Ye.V. Belik, I.A. Pronin, Yu.A. Kostyrkin ………………………….….…..220
Purification and Concentration of salmon
infectious hematopoietic necrosis virus
L.Yu. Apasova, N.V. Moroz, S.S. Rybakov, T.B. Yeremeyeva …………….234
BIOTECHNOLOGY ISSUES
improvement OF Methods FOR Cultivation OF
Primarily trYpsinized Calf kidney cells
N.I. Gerasimova, B.L. Manin, S.K. Starov…………………………………239
Quality management system
A.I. Dudnikov, V.G. Patrikeyev, S.V. Diev………………………………….245
Содержание
271
Vertical Movement of DNA Contamination
(Chlamydia) in Subcultivated
Goose Embryo Cells
B.L. Manin, Ye.G. Kuznetsova, N.V. Koropova……………………………251
List of authors………………………………………………………………257
Contents…………………………………………………………….………262
Редактор: Борисова О.А. – кандидат ветеринарных наук
Ответственный секретарь: Жбанова Т.В. – кандидат биологических наук
Технический редактор и корректура:
Ануфриева Т.А. – кандидат биологических наук,
Борисова И.А. – кандидат биологических наук
Библиографическое оформление:
Марова Н.А.,
Капаркалес Г.В.,
Давыдова В.М.,
Гусева Е.Ю.,
Матвеева Н.В.
Перевод текста на английский язык: Цикина Н.А.
_____________________________________
ТРУДЫ ФЕДЕРАЛЬНОГО ЦЕНТРА ОХРАНЫ
ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ
Том VII
Компьютерная верстка: И. Гришанова
Сдано в набор 01.07.2009 г. Подписано в печать 06.08.2009 г.
Формат 60х84/16. Бумага офсетная. Печатных листов 17
Тираж 500 экз. Заказ № 1479
Отпечатано в типографии ООО «Транзит-ИКС»
г. Владимир, ул .Электрозаводская, 2.
Тел./факс (4922) 23-12-74
E-mail: tranzit@vtsnet.ru
Переплетные работы выполнены
во Владимирской книжной типографии
600025, г. Владимир, Октябрьский просп., 7