ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 - Кемеровский технологический
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский технологический институт пищевой промышленности Кафедра «Технология жиров, биохимия и микробиология» МИКРОБИОЛОГИЯ МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов дневной формы обучения направления 655900 «Технология сырья и продуктов животного происхождения» специальности 271100 «Технология молока и молочных продуктов» Составила: доцент, канд. техн. наук И.А. Еремина «Утверждено» на заседании кафедры «____»__________2004 г. Протокол №____ Рекомендовано к печати методкомиссией ТФ «____»______________2004 г Протокол №____ Кемерово 2004 2 3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 ОРГАНИЗАЦИЯ И СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА ПРЕДПРИЯТИЯХ МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСУДЫ, ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Цель занятия: Ознакомление с задачами и целями осуществления микробиологического контроля, микробиологическими критериями безопасности молочных продуктов, схемой микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности. Приобретение навыков приготовления питательных сред, посуды для проведения микробиологического анализа. Приборы и реактивы: Автоклав, электрические плитки, питательные среды: МПА, среда Сабуро, среда Кесслера, молоко, панкреатин, СаСО3, NaCl, яичный желток. Посуда: Чашки Петри, колбы на 500 см3, пробирки, пипетки на 1 см3, ватно-марлевые пробки, вата, пергаментная бумага. 1.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Задачей микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности является определение различных микробиологических показателей. 1.1.1 Группы микробиологических критериев безопасности пищевых продуктов 1. Группа показателей санитарного состояния Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов (возбудителей пищевых инфекций) в пищевых продуктах невозможно изза низкого их содержания в продукте по сравнению с содержанием сапрофитной микрофлоры. Поэтому при санитарной оценке пищевых продуктов используют косвенные методы, позволяющие определить уровень загрязнения человека выделениями человека. Чем выше этот уровень, тем вероятнее попадание в объект патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций. 4 Санитарная оценка пищевых продуктов проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и наличию бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г или 1 см3 продукта. Высокая бактериальная обсемененность пищевых продуктов свидетельствует о недостаточной термической обработке сырья, недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования, неудовлетворительных условиях хранения и транспортировки продукции. Общую бактериальную обсемененность определяют в молочных продуктах, в которых отсутствует технически полезная микрофлора (микрофлора заквасок). Для определения этого показателя используют универсальные питательные среды: мясопептонный агар (МПА) или среду для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Наличие бактерий группы кишечной палочки (БГКП) наблюдается во всех молочных продуктах (за исключением стерилизованных). БГКП объединяют представителей нормальной микрофлоры кишечника человека и относятся к семейству Enterobacteriaceae родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. БГКП выполняют функцию индикатора фекального загрязнения и относятся к санитарно-показательным микроорганизмам. Выбор БГКП в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для оценки санитарного состояния пищевых продуктов не случаен. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим требованиям: Эти микроорганизмы должны являться представителями нормальной микрофлоры организма, в нем развиваться и размножаться; Они должны в больших количествах выделяться из организма; В окружающей среде они должны длительное время сохранять свою жизнеспособность, но не размножаться; Определение этих микроорганизмов должно осуществляться простыми методами. В нормативных документах (государственных, отраслевых стандартах (ГОСТ, ОСТ), технических условиях, требованиях СанПиНа) обычно указывается количество продукта, в котором БГКП не допус- 5 каются. При высоком уровне загрязнения продукта БГКП возрастает вероятность нахождения в нем патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры и др.). Для определения БГКП применяют накопительную среду Кесслера, а идентификацию этих бактерий проводят с использованием дифференциально-диагностической среды Эндо. 2. Группа условно-показательных микроорганизмов. К этой группе относятся микроорганизмы – возбудители пищевых отравлений, таких как Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum. В молочных продуктах, богатых белком (например, твороге, сыре) нормируется содержание коагулазоположительного золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) – возбудителя пищевой интоксикации. При определении золотистого стафилококка используют элективные питательные среды: молочно-солевой (МСА) или желточно-солевой (ЖСА) агар. 3. Группа патогенных микроорганизмов Из патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах определяют сальмонеллы. Проводят исследования на наличие сальмонелл органы Санэпиднадзора. Обычно, сальмонеллы не допускаются в 25 г (см3) продукта. Оля определения сальмонелл используют накопительные питательные среды (селенитовую, Кауфмана, Мюллера) и дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина). 4.Группа показателей микробиологической стабильности продукта. К этой группе относятся микроскопические грибы и дрожжи, которые, как известно, являются возбудителями порчи продукта. Этот показатель нормируется в молочных продуктах с растительными добавками. Динамику роста грибов и дрожжей определяют при установлении сроков годности и режимов хранения новых видов продуктов. Кроме вышеперечисленных микробиологических показателе для прогнозирования качества выпускаемой молочной продукции целесообразно определять отдельные группы микроорганизмов, которые относятся к представителям технически вредной микрофлоры (липо- 6 литические, протеолитические бактерии) и полезной микрофлоры (молочнокислые и др. бактерии) 1.1.2 Организация микробиологического контроля Микробиологический контроль осуществляется в лаборатории предприятия. При отсутствии микробиологической лаборатории на предприятии указанный контроль может осуществляться по хоздоговору с органами госсанэпиднадзора или лабораториями, аккредитованными для проведения микробиологических исследований. Для проведения микробиологических исследований в лаборатории должен быть оборудован бокс, состоящий из двух помещений – собственно бокса и предбоксника. В боксе должны быть установлены бактерицидные лампы, количество которых определяют из расчета 2,5 вт/м2. Корме того в лаборатории должно иметься следующее оборудование: термостаты (для культивирования микроорганизмов при определенной температуре), автоклав (для стерилизации питательных сред, посуды, инструментов), сушильный шкаф или печь Пастера (для стерилизации посуды), микроскопы (для определения качественного состава микрофлоры). Лаборатории молочных заводов должны быть аккредитованы государственной санитарноэпидемиологической службой на право проведения исследований, характеризующих гигиенические показатели безопасности выпускаемой продукции. При организации микробиологического контроля руководствуются «Инструкцией по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности, утвержденной 28.12.87 Госагропромом СССР, а также санитарными правилами и нормами СанПиНа 2.3.4. 551-96, государственными, отраслевыми стандартами и техническими условиями на различные группы молочных продуктов. Микробиологическому контролю подлежат: Сырье (например, сырое молоко), полуфабрикаты (например, закваски), готовая продукция. Такой контроль еще называют контролем технологического процесса. Он позволяет установить эффективность процесса пастеризации молока, выявить места инфицирования на различных этапах технологического процесса производства молочных продуктов. Оборудование, трубопроводы, вспомогательные материалы, вода, воздух производственных помещений, тара, упаковочные ма- 7 териалы и др. Микробиологический контроль этих объектов позволяет судить о санитарно-гигиеническом состоянии производства и соблюдении санитарных норм и правил личной гигиены работников производства. Так, готовая продукция (молоко, сливки, кисломолочные напитки) должны контролироваться микробиологической лабораторией предприятия не реже 1 раза в 5 дней, сметана и творог – не реже 1 раза в 3 дня, качество санитарной обработки оборудования должно оцениваться по каждой единице оборудования не реже 1 раза в 10 дней. Чистоту рук работников следует контролировать не реже 3 раз в месяц. В приложении 1 приведена схема организации микробиологического контроля на примере производства кисломолочных напитков. Характеристика питательных сред, используемых для микробиологического исследования молочных продуктов Для микробиологического исследования молочных продуктов и проведения санитарно-бактериологического контроля условий производства используют натуральные (приготовленные из продуктов животного и растительного происхождения) плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовятся из жидких путем внесения гелеобразующих веществ (агар-агара или желатина). Агар-агар – полисахарид, не используемый микроорганизмами для питания. Получают его из морских водорослей. Плавится агар при температуре около 1000С и затвердевает при температуре около 400С. Плотные питательные среды используют для количественного учета микроорганизмов (каждая клетка вырастает на плотной среде в виде изолированной колонии). Путем посева молочных продуктов и их разведений на плотные питательные среды определяют КМАФАнМ, содержание золотистого стафилококка, микроскопических грибов и дрожжей, количество молочнокислых, гнилостных бактерий, спор бактерий рода Bacillus и др. Содержание агар-агара в плотных питательных средах составляет около 2%. Желатин – белок, который выделяют из костей и хрящей животных при их вываривании. Многие микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, могут гидролизовать желатин, а продукты гидролиза использовать в качестве источника питания. Спо1.1.3 8 собность разжижать среды с желатином является диагностическим признаком при идентификации микроорганизмов. Питательные среды бывают универсальные (для культивирования микроорганизмов различных групп), накопительные, элективные (для накопления и выявления микроорганизмов определенных групп) и дифференциально-диагностические (для определения видовой принадлежности микроорганизмов). В качестве универсальных питательных сред используют жидкие (например, мясопептонный бульон - МПБ) и плотные (например, мясопептонный агав (МПА) и среда Сабур). Накопительные среды имеют жидкую консистенцию и используются для выявления микроорганизмов, содержание которых в продукте незначительное. Накопительные питательные среды используются для выявления наличия бактерий группы кишечной палочки БГКП (среда Кесслера) и сальмонелл (среда Кауфмана, селенитовая среда). При наличии роста бактерий на накопительных питательных средах в дальнейшем, как правило, делается пересев на плотные дифференциально-диагностические питательные среды, которые используются для идентификации выросших на накопительных средах бактерий. Так, в качестве дифференциально-диагностической среды для идентификации БГКП используется среда Эндо. Элективные (избирательные) питательные среды имеют плотную консистенцию. Примером элективной питательной среды может являться молочно-солевой агар, который используется для выявления в молочных продуктах золотистого стафилококка. В заводских лабораториях для приготовления питательных сред обычно используют промышленно изготовляемые сухие среды, которые представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Некоторые питательные среды готовят по прописям из отдельных компонентов (молока, пептона, дрожжевого экстракта, питательных солей и т.д.). После приготовления питательных сред их разливают в пробирки или колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Наиболее часто автоклавирование ведется при избыточном давлении 0,1 Мпа и, следовательно, температуре 121 0С в течение 15-30 мин. Некоторые питательные среды стерилизуют при более низком избыточном давлении или текучим паром (не создавая избыточного давления). 9 2. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ Студенты знакомятся со схемой микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности. Готовят посуду, питательные среды для проведения микробиологического анализа. 2.1 Приготовление посуды для микробиологического анализа Для проведения микробиологического анализа используют чашки Петри, которые герметично упаковываются в пергаментную бумагу и стерилизуются. Пипетки на 1 см3 закрывают ватными тампонами и также заворачивают в бумагу. Стерилизация посуды осуществляется в автоклаве при избыточном давлении 0,1 Мпа в течение 30-40 минут или сухим жаром в сушильном шкафу или печи Пастера при 165-1700С в течение 1-1,5 часа. Стерильную посуду следует хранить в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками в течение не более 30 суток. 2.2 Приготовление питательных сред из промышленно выпускаемых сухих сред Заключается в растворении определенного количества порошка в воде, доведении полученной смеси до кипения и кипячении в течение 5 минут. Далее (при необходимости) среда фильтруется через ватномарлевый фильтр и разливается в пробирки или колбы, которые закрываются ватно-марлевыми пробками. Далее среды стерилизуют в автоклаве. С использованием сухих сред готовят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среду Сабуро, среду Кесслера, среду для определения мезофильный аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. 2.3 Приготовление питательных сред из отдельных компонентов 2.3.1 Среды для культивирования молочнокислых бактерий Обезжиренное молоко. Молоко отделяют от сливок, разливают в пробирки или колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,05 Мпа. Среду используют для изучения физиологических свойств и для группового количественного учета молочнокислых бактерий. 10 Эту среду используют также для получения лабораторной закваски из сухих и жидких заквасок и бактериальных концентратов. Агар с гидролизованным молоком. Вначале готовят гидролизованное молоко путем гидролиза стерильного обезжиренного молока с помощью фермента панкреатина при 450С в течение 3-х суток в присутствии хлороформа. Полученный гидролизат разводят водопроводной водой (в соотношении 1:2). Затем вносят 1,5-2% агара и 2-3% мела в виде тонкого порошка. Среду стерилизуют. Агар с гидролизованным молоком используют для количественного учета молочнокислых бактерий в молочных продуктах. 2.3.2 Среда для количественного учета гнилостных бактерий Молочный агар готовят путем внесения 20% горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2% водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков). 2.3.3 Среды для выявления коагулазоположительных стафилококков Основа – солевой агар: к мясопептонному бульону с рН 7,2-7,4 добавляют 2%-ного агара и 6,5%-ного хлористого натрия, расплавляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватномарлевый фильтр, разливают мерным цилиндром по 100 см3 в колбы вместимостью 250 см3 и стерилизуют при 1210С в течение 30 минут. Получают солевой агар. Вместо МПБ можно использовать сухой питательный агар, добавив к нему 6,5% хлористого натрия. Желточно-солевой агар. К расплавленному и охлажденному до 0 45 С солевому агару (основе) добавляют 20 см3 эмульсии яичного желтка. После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20 см3 и хранят в холодильнике 57 дней. Для приготовления эмульсии яичного желтка на дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 см3. Желток добавляют в колбу с 4-мя объемами стерильно- 11 го физиологического раствора, затем содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы. Молочно-солевой агар. К 100 см3 расплавленного и охлажденного до 450С солевого агара вносят 10 см3 обезжиренного стерильного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Перечислить группы микробиологических критериев безопасности молочных продуктов. Какие микробиологические показатели определяют для оценки качества молочных продуктов? Что такое КМАФАнМ и в каких видах молочных продуктов определяется этот показатель? Почему бактерии группы кишечной палочки выбраны в качестве санитарно-показательных для молочных продуктов? Какие микроорганизмы из группы условно-патогенных микроорганизмов определяют в сыре, твороге? Какие патогенные микроорганизмы определяют в молоке и молочных продуктах? Какие микробиологические показатели определяют для оценки микробиологической стабильности продукта? Кто осуществляет микробиологический контроль на предприятиях молочной промышленности? Каким оборудованием и какой посудой должна быть оснащена микробиологическая лаборатория? Перечислить объекты микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности. С какой периодичностью осуществляется микробиологический контроль готовой продукции на предприятиях молочной промышленности? Каким образом готовят посуду для проведения микробиологического анализа? Для чего используются накопительные питательные среды? Какие питательные среды используются для определения молочнокислых бактерий в молоке и молочных продуктах? Как готовятся и для чего используются плотные питательные среды? Назовите питательные среды, которые используются для определения микробиологических показателей в молоке и молочных продуктах. Какие питательные среды используются для выявления и идентификации бактерий группы кишечной палочки. Какие питательные среды являются элективными для коагулазоположительных стафилококков? Как они готовятся? 12 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРОГО И ПАСТЕРИЗОВАННОГО МОЛОКА (выполняется на двух занятиях) Цель занятия: Знакомство с косвенными методами определения микроорганизмов и ингибирующих веществ в сыром молоке. Освоение методов количественного учета микроорганизмов в питьевом молоке. Анализ полученных данных и оценка качества питьевого молока в соответствии с требованиями СанПиНа. Изучение качественного состава микрофлоры пастеризованного молока. Оборудование, материалы: Проба пастеризованного молока, пробирки с 9 см3 стерильной воды, стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри, пробирки с питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро; средой Кесслера с поплавками; со стерильным молоком; колбы на 250 см3 с водным 2% агаром; набор красок по Граму; фильтровальная бумага; бактериологические петли; предметные стекла; микроскопы; спиртовки; термостаты. 2.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2.1.1 Отбор проб молока Молоко для микробиологического анализа тщательного перемешивают. Стерильным черпаком или пробоотборником отбирают около 50 см3 молока в стерильную колбу, которую затем закрывают ватно-марлевой пробкой. Если пробы предназначены для отправки в лабораторию, их необходимо охладить до 5…60С. Хранить пробы при этой температуре можно не более 4 часов. Перед отправкой образцы пломбируют или опечатывают, оформляют сопроводительный документ, в котором указывают дату, час отбора пробы, температуру продукта, должность и подпись бравшего пробу. 2.1.2 Методы исследования сырого молока Основными источниками попадания микроорганизмов в молоко являются вымя и кожный покров животных, руки доярок, оборудование, воздух и др. После доения молоко необходимо охладить до воз- 13 можно более низких температур во избежание чрезмерного развития микроорганизмов в молоке в процессе его хранения. Во время хранения молока изменяется количественный и качественный состав микрофлоры. Характер этих изменений зависит от температуры, продолжительности хранения, степени обсемененности и состава микрофлоры молока. Изменение вторичной микрофлоры проходит через определенные естественные фазы развития: бактерицидную фазу, фазу смешанной микрофлоры, фазу молочнокислых бактерий, фазу дрожжей и плесеней. Основными факторами, определяющими гигиеническое качество сырого молока являются: Содержание патогенных микроорганизмов (микобактерий туберкулеза, бруцелл, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, дизентерийных палочек (шигелл Зонне), коагулазоположительных стафилококков). При установлении эффективности пастеризации молока ориентируются на то, что допустимое максимальное количество этих микроорганизмов в сыром молоке должно быть не выше 10…100 клеток в 1 см3. Содержание сапрофитных микроорганизмов. В зависимости от количества микроорганизмов в молоке судят о пригодности его для переработки в различные молочные продукты. Например, при переработке сырого молока в питьевое количество микроорганизмов в сыром молоке допускается до 1х106 клеток в 1 см3. Повышенное содержание сапрофитных микроорганизмов приводит к различным порокам сырого молока (ослизнению и тягучести, преждевременному свертыванию, горькому, прогорклому, мыльному и щелочному вкусу, несвойственным молоку запахам, порокам цвета и т.д.). Содержание соматических клеток. При воспалительных заболеваниях молочной железы в молоке появляется большое количество соматических клеток (например, лейкоцитов). Чем больше соматических клеток в молоке, тем выше содержание в нем возбудителей маститов (патогенных стафилококков, гемолитических стрептококков и т.д.). Содержание ингибирующих веществ. Ингибирующие вещества, содержащиеся в молоке, делятся на естественные (собственно молочные ингибиторы, обусловливающие бактерицидные свойства молока) и попадающие в молоко извне (попадают в молоко при лечении, кормлении животных, с оборудования). К есте- 14 ственным ингибиторам относятся лизоцимы, а к ингибиторам второй группы – антибиотики, сульфаниламиды, пестициды, гербициды, остатки моюще-дезинфицирующих веществ. Поступающее на переработку сырое молоко и сливки исследуют по редуктазной пробе. Этот метод относится к косвенным методам определения количества бактерий в молоке. Метод основан на восстановлении метиленового голубого или резазурина при 380С окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. Чем дольше обесцвечиваются красители, тем выше класс молока (см. приложение 2). К косвенным методам относится также определение ингибирующих веществ в сыром молоке. В качестве контроля используют образец с индикаторами, как и в редуктазной пробе. Опытом служит вариант с внесением метиленового голубого или резазурина и термофильного стрептококка. Если в молоке имеются ингибирующие вещества, то термофильные стрептококки в нем не размножаются, индикаторы не обесцвечиваются и молоко остается окрашенным (голубая окраска при использовании метиленового голубого и синефиолетовая – при использовании резазурина). Редуктазную пробу и определение ингибирующих веществ, а сыром молоке проводят не резе 1 раза в 10 дней. Содержание микроорганизмов в молоке можно также определять прямыми методами: посевом разведений молока на МПА непосредственно (при определении КМАФАнМ) и после пастеризации при 80…850С в течение 15-20 минут (для определения спор бактерий). 2.1.3 Микрофлора и методы количественного учета микроорганизмов в пастеризованном (питьевом) молоке Поступившее на предприятие молоко подвергается различным технологическим приемам, направленным на уменьшение в нем содержания микроорганизмов. Наиболее часто используют очистку молока, охлаждение. Пастеризацию Пастеризация – это тепловая обработка молока при температурах ниже температуры кипения. При производстве питьевого молока наиболее распространенным режимом является пастеризация при 760С с выдержкой 20 секунд. Целью пастеризации является уничтожение патогенных микроорганизмов, а также инактивация ферментов, снижающих стойкость молока и вызывающих в дальнейшем пороки молочных продуктов. Эффективность пастеризации молока за- 15 висит от температуры, продолжительности пастеризации, степени бактериальной обсемененности молока и качественного состава микрофлоры. Микрофлору, которая остается после пастеризации молока называется остаточной микрофлорой пастеризованного молока. Эффективность пастеризации является высокой, если количество оставшихся бактерий составляет 0.01% от исходного содержания бактерий в молоке и низкой – при 1,5-2%. Сразу после пастеризации БГКП не допускаются в 10 см3 молока. В остаточной микрофлоре молока сразу после пастеризации содержатся в основном споровые формы бактерий. После пастеризации молоко может дополнительно обсеменяться БГКП, психрофильными бактериями, мезофильными молочнокислыми стрептококками, термоустойчивыми палочками, дрожжами, уксуснокислыми бактериями (микрофлора вторичного обсеменения пастеризованного молока). В питьевом молоке выборочно от одной-двух партий не реже 1 раза в 5 дней определяют общую бактериальную обсемененность (КМАФАнМ) и наличие БГКП. По микробиологическим показателям питьевое молоко и сливки должны соответствовать требованиям ГОСТа, представленного в таблице приложения 3. 2.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ 1-е занятие На первом занятии студенты знакомятся с правилами отбора проб молока, с факторами, определяющими гигиеническое качество сырого молока, с косвенными методиками определения в сыром молоке количества микроорганизмов и ингибирующих веществ; готовят разведения питьевого молока и проводят посев этих разведений на плотные и жидкие питательные среды для определения микробиологических показателей. В питьевом молоке прямыми методами определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), наличие БГКП (эти показатели в питьевом молоке нормируются), а также содержание микроскопических грибов и дрожжей, гнилостных бактерий для прогнозирования изменения качества питьевого молока в процессе хранения. 16 2.2.1 Схема разведения молока и проведения микробиологического исследования Для приготовления разведений продукта используют пробирки с 9 см3 стерильной воды. Иногда для приготовления разведений используются стерильные растворы разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора хлорида натрия, пептонной воды или лимоннокислого натрия. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 1 см3 молока. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки (разведение 1:10). Затем этой же пипеткой из пробирки с разведением 1:10 отбирают 1 см3 жидкости и переносят во вторую пробирку с водой (разведение 1:100). Количество разведений рассчитывают таким образом, чтобы в чашках Петри выросло от 30 до 300 колоний. Так. При исследовании пастеризованного молока рекомендуется готовить I, II и III разведение продукта, так как нормируемое значение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в питьевом молоке не более 50…200 тыс. КОЕ/см3 (см. приложение 3). 1 см3 1 см3 Питьевое молоко 1 см3 1 см3 1 см3 9 см3 Н2О 9 см3 Н2О 1:10 1:100 1 см3 1 см3 среда Кесслера среда Сабуро 1:1000 1 см3 МПА 9 см3 Н2О МПА 1 см3 молочный агар Рис.1 Схема проведения микробиологического исследования питьевого молока 17 2.2.2 Чашечные методы количественного учета микроорганизмов Сущность чашечных методов количественного учета микроорганизмов заключается в посеве разведений продукта на стерильные плотные питательные среды в чашки Петри с последующим культивированием и подсчетом выросших в чашках колоний. При этом считается, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Учет результатов при использовании чашечных методов Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки делят на сектора, подсчитывают число колоний в 2-3 секторах, находят среднеарифметическое число колоний и умножают на разведение (10 – при первом разведении продукта, 100 – при втором разведении и т.д.). Если инкубированные чашки с первым разведением (1:10) не содержат колоний, то результат выражают так: меньше 1х10 КОЕ/см3 (КОЕ – колониеобразующие единицы); Если в чашках Петри с I разведением (1:10) содержится меньше, чем 15 колоний, то результат выражается так: количество микроорганизмов менее Мх10 КОЕ/г, где М – число выросших колоний; Если количество колоний более15, то подсчитывают количество колоний в чашках, умножают на разведение и полученный результат округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов»: - до числа, кратного 5, если количество колоний в чашке менее 100; - до числа, кратного 10, если количество колоний в чашке более 100. Пример: Посеяно I разведение продукта 1:10. В чашке Петри выросло 194 колонии. Полученный результат округляем до 200. Количество микроорганизмов в продукте: 200х10=2,0х103КОЕ/г. Чашечными методами определяют следующие микробиологические показатели: КМАФАнМ, количество спор грибов и дрожжей, содержание гнилостных бактерий, коагулазоположительных стафилококков. 2.2.2.1 Определение мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов Перед посевом чашки маркируют. 18 По 1 см3 разведений (III и II разведений молока) вносят в чашки Петри. Пипетку с посевным материалом держат под углом 450С, касаясь концом пипетки дна чашки. Затем в каждую чашку наливают по 12-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, расплавленной и охлажденной до 450С. Сразу после заливки агара содержимое тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. Если ожидают ползучий рост микроорганизмов посевы после застывания агара заливают вторым слоем питательной среды или 3…5 см3 водного раствора агара. После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при (301)0С на 72 часа (допускается предварительный учет через 48 часов с последующим окончательным учетом через 24 часа). 2.2.2.2 Определение количества грибов и дрожжей Ведут так же, как и определение КМАФАнМ, только в качестве питательной среды используют сусло-агар или среду Сабуро. Для посева берут II разведение молока. Инкубацию посевов ведут при температуре 240С в течение 5 суток с предварительным учетом через 3 суток. 2.2.2.3 Определение протеолитических (гнилостных) бактерий III разведение молока засевают на молочный агар инкубацию посевов проводят при 300С в течение 72 часов. Протеолитические бактерии на молочном агаре при своем росте образуют зоны просветления агара (зоны протеолиза). Пептонизирующие бактерии образуют узкие зоны пептинизации. 2.2.3 Методы, основанные на накоплении микроорганизмов с последующей их идентификацией Эти методы используются для выявления микроорганизмов, содержание которых незначительно в сравнении с общим количеством микроорганизмов. Сущность этих методов заключается в посеве продукта или его разведений на накопительные жидкие среды. Если после культивирования обнаруживают рост микроорганизмов (образование осадка, помутнение среды, накопление газа в поплавках), то в дальнейшем проводят пересев из пробирок, в которых замечен рост на дифференциально-диагностические среды для идентификации выросших на накопительной среде микроорганизмов. 19 К таким методам относятся определение наличия БГКП, сальмонелл. 2.2.3.1 Определение бактерий группы кишечной палочки Для посева используют то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (1 см3 молока или 1 см3 первого разведения молока). Посев проводят в пробирки со средой Кесслера с поплавками. Посевы помещают в термостат с температурой 37 0С на 24 часа. При отсутствии признаков роста (газообразования в поплавках, помутнения среды) дают заключение об отсутствии БГКП и соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП. При положительной бродильной пробе для окончательного заключения о наличии в продуктах БГКП из подозрительных пробирок производят посев на чашки со средой Эндо или Левина. Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Чашки помещают в термостат. Учет результатов. При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для БГКП (на среде Эндо – красных с металлическим блеском, на среде Левина – черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром) считают, что продукт соответствует нормативу. При наличии на среде Эндо или Левина типичных колоний их окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП в анализируемой пробе и несоответствии продукта по микробиологическому нормативу. 2-е занятие На втором занятии студенты исследуют посевы разведений молока, подсчитывают количество выросших колоний в чашках Петри на мясопептонном агаре или среде для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, среде Сабуро, молочном агаре. Учет результатов при использовании чашечных методов ведут согласно п. 2.2.2. Данные, полученные при посеве разведений молока на МПА или среде для определения КМАФАнМ, сравнивают с нормируемым значением, пользуясь приложением 3. Изучают посевы молока и его разведения (1:10) в пробирках со средой Кесслера и поплавками. Если в пробирках со средой Кесслера газообразования в поплавках не наблюдается, то делают заключение 20 об отсутствии БГКП во взятом на анализ объеме молока (1 или 0,1 см3). По результатам исследований студенты делают вывод о качестве исследованного молока. Качественный состав микрофлоры пастеризованного молока определяют, изучая культуральные и морфологические свойства выросших в чашках колоний бактерий. 2.2.4 Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний Чашки с посевами внимательно осматривают. Отмечают колонии микроорганизмов, отличающиеся по культуральным свойствам. Рассматривая выросшие колонии в проходящем свете невооруженным глазом (макроскопически) и с помощью лупы описывают следующее: 1. Форму колоний Форма колоний может быть круглой, неправильной, корневидной, эллипсовидной и т.д. 2. Размеры колоний Колонии, имеющие диаметр более 4 мм являются крупными, от 2 до 4 мм – средними, от 1 до 2 мм – мелкими, менее 1 мм - точечными или росинчатыми. 3. Цвет колоний Микроорганизмы, содержащие пигменты могут быть желтого, оранжевого, розового, кремового и др. цветов. Большинство микроорганизмов не содержат пигментов и растут на плотных средах в виде серовато-матовых колоний. Такие колонии называют бесцветными. 4. Рельеф колоний Рельеф или профиль колоний может быть плоским, выпуклым, куполообразным, смешанным (плоским с выпуклым центром, кратерообразным и др.). 5. Поверхность колоний Поверхность колоний может быть гладкой, блестящей, шероховатой, морщинистой, извилистой и т.д. 6. Прозрачность колоний Колонии бывают прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные. 7. Характер края колоний 21 Край может быть ровным, волнистым, локонообразным, лопастным, бахромчатым, зазубренным, корневидным и т.д. 8. Структуру колоний Структура колоний бывает однородная (гомогенная) и неоднородная (гетерогенная). Неоднородные колонии могут быть мелкои крупнозернистыми, радиально или концентрически исчерченными, чешуйчатыми и др. 9. Консистенцию колоний Определяется при приготовлении препаратов для микроскопического анализа. 2.2.5 Изучение морфологических свойств микроорганизмов При изучении морфологии выросших в чашках колоний на предметных стеклах готовят фиксированные мазки (при исследовании колоний одноклеточных микроорганизмов: бактерий, дрожжей) или препараты типа «раздавленная капля» (при исследовании колоний микроскопических грибов). Фиксированные мазки окрашивают по Граму и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива (на х90). При микроскопровании препаратов обращают внимание на форму клеток; их взаимное расположение; наличие спор; отношение к окраске по Граму (грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый). Эти признаки позволяют отнести микроорганизмы к определенной группе. Техника окраски по Граму 1. На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу с генцианвиолетом и смачивают ее водой. Окраску мазка генцианвиолетом проводят в течение 2…3 минут; 2. Бумагу снимают с мазка и обрабатывают мазок раствором Люголя в течение 1…2 минут; 3. Раствор Люголя сливают и на мазок наносят несколько капель 96% спирта на 30…60 секунд; 4. Мазок промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой; 5. Мазок окрашивают раствором фуксина 2 – 3 минуты, промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. На сухой окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла. При микроскопии препаратов типа «раздавленная капля» используют сухие объективы на х8 и на х40. Обращают внимание на строе- 22 ние мицелия (септированный, несептированный), строение плодоносящих гифов (спорангиеносцев и конидиеносцев). Микроскопическую картину зарисовывают. Результаты исследований вносят в таблицу: Таблица 1. Культуральные и морфологические признаки выросших в чашках колоний Культуральные Свойства 1. Форма колоний 2. Размеры колоний 3. Цвет колоний . . . 9.Консистенция Питательные среды МПА Среда Сабуро Молочный агар 1 2… 1 2… 1 2… Микроскопическая картина После заполнения таблицы делается вывод о качественном составе микрофлоры питьевого молока. Контрольные вопросы 1. Перечислить факторы, определяющие гигиеническое качество сырого молока. 2. В чем сущность метода определения количества микроорганизмов по редуктазной пробе? 4. Как определяется эффективность пастеризации молока? 5. Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевого молока? 6. В чем сущность чашечных методов? Перечислить микробиологические показатели, которые определяются чашечными методами. 7. Как готовят разведения молока для проведения микробиологического анализа? 8. Как проводят определение КМАФАнМ, количества грибов и дрожжей? 9. В чем сущность метода определения БГКП? Какие питательные среды используются в этом методе? 10.Какие культуральные признаки определяют при изучении выросших в чашках колоний? 23 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКВАСОК И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Цель занятия: Ознакомиться с полезной микрофлорой заквасок и классификацией кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок. Ознакомиться с микробиологическими методами контроля качества заквасок и кисломолочных продуктов. Освоить метод микроскопического исследования заквасок и кисломолочных продуктов на наличие посторонней микрофлоры. Оборудование, реактивы и материалы исследования: Жидкие закваски на стерильном молоке, кисломолочные продукты; микроскопы, спиртовки, предметные стекла, бактериологические петли; иммерсионное масло, раствор краски Муромцева, фильтровальная бумага. 3.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Закваски – чистые культуры или смесь чистых культур молочнокислых бактерий, вносимые в молоко с целью получения высококачественных кисломолочных продуктов. На заводах и в лабораториях по производству бактериальных препаратов выпускают жидкие и сухие бактериальные концентраты, а также маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок. Эти бактериальные препараты высылают на молочные предприятия, где путем последовательного их пересева в возрастающие объемы молока, получают лабораторные закваски (при культивировании микрофлоры бактериальных препаратов на стерильном молоке) и, далее, производственные закваски (путем пересева лабораторной закваски на стерильное или пастеризованное молоко). Производственные закваски используют в производстве кисломолочных продуктов. Производственные закваски на молочных предприятиях получают в отделениях чистых культур или в специальном боксе при микробиологической лаборатории предприятия. В них необходимо поддерживать асептические условия. Не допускается одновременно проводить посевы по контролю готовой продукции, контролю условий производства и готовить закваски. Нельзя применять закваски и бак- 24 териальные концентраты с истекшим сроком хранения. Флаконы с заквасками вскрывают непосредственно перед употреблением и используют все содержимое флакона сразу. 3.1.1 Морфологические свойства некоторых бактерий, входящих в состав микрофлоры заквасок Молочнокислые стрептококки Представляют собой шаровидные или овальные клетки размером до 1-2 мкм в диаметре, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Молочнокислые стрептококки неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму окрашиваются положительно. Клетки ароматобразующих стрептококков (Streptococcus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus) мельче, чем клетки молочного и сливочного стрептококков (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris), а клетки термофильного стрептококка (Streptococcus thermophilus) самые крупные. К гомоферментативным относятся молочный и сливочный стрептококки, а к гетероферментативным – ароматические стрептококки. Промежуточное положение между гомоферментативными мгетероферментативными молочнокислыми стрептококками занимает термофильный стрептококк, поэтому его иногда называют среднегетерогенным видом. Молочнокислые палочки Лактобактерии представляют собой палочки, одиночные, соединенные попарно и цепочками размером (4…10х0,5…0,6) мкм. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. Молочнокислые палочки относятся к роду Lactobacillus, включающему три подрода: термобактерии, стрептобактерии и бетабактерии. Термо- и стрептобактерии являются гомоферментативными, а бета-бактерии - гетероферментативными молочнокислыми палочками. К термобактериям относятся 8 видов палочек, наиболее известными из которых являются Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus. Подрод стрептобактерий включает 7 видов, среди которых в молочной промышленности используются Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. В подрод бета-бактерий входят 11 видов палочек, наиболее изученными из которых являются Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum. 25 Клетки стрептобактерий мельче, чем клетки термобактерий, и часто располагаются в виде цепочек. Бета-бактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки. 3.1.2 Классификация кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок В зависимости от состава микрофлоры заквасок кисломолочные продукты делятся на 5 групп: Продукты, приготовляемые с использованием многокомпонентных заквасок К таким продуктам относятся кефир и кумыс, которые готовятся с использованием естественной симбиотической закваски – кефирного грибка. Кефирные грибки – прочное симбиотическое образование. Они имеют всегда определенную структуру и передают свои свойства и структуру последующим поколениям. Они имеют неправильную форму, сильноскладчатую или бугристую поверхность, консистенция их упругая, мягко-хрящеватая, размеры от1-2 мм до3-6 см и более. В состав кефирного грибка входят ряд молочнокислых бактерий: мезофильные молочнокислые стрептококки видов Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; ароматобразующие бактерии видов Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc dextranicum; молочнокислые палочки рода Lactobacillus; уксуснокислые бактерии; дрожжи. При микроскопировании срезов кефирного грибка обнаруживаются тесные переплетения палочковидных нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую остальные микроорганизмы. Мезофильные молочнокислые стрептококки обеспечивают активное кислотоообразование и формирование сгустка. Их количество в готовом продукте достигает 109 в 1 см3. Ароматобразующие бактерии развиваются медленнее молочного и сливочного стрептококков. Они образуют ароматические вещества и газ. Их количество в кефире составляет 107-108 в 1 см3. Количество молочнокислых палочек в кефире достигает 107-108 в 1 см3. При увеличении продолжительности процесса сквашивания и при повышенных температурах количество этих бактерий повышается до 109 в 1 см3, что приводит к перекисанию продукта. Дрожжи развиваются гораздо медленнее, чем молочнокислые бактерии, поэтому увеличение их количества отмечается во время созревания продукта и составляет 106 в 1 см3. излишнее развитие 26 дрожжей может происходить при повышенных температурах сквашивания и длительной выдержке продукта при этих температурах. Еще медленнее развиваются уксуснокислые бактерии и содержатся в кефире в количестве 104-105 в 1 см3. Излишнее развитие уксуснокислых бактерий в кефире может привести к появлению слизистой тягучей консистенции. Процесс сквашивания и созревания кефира ведут при температуре 20-220С в течение 10-12 часов. Продукты, приготовляемые с использованием мезофильных молочнокислых стрептококков К таким продуктам относятся творог, сметана. При приготовлении этих продуктов процесс сквашивания молока проводят при температуре 300С в течение 6-8 часов. В состав микрофлоры этих продуктов входят гомоферментативные стрептококки: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; гетероферментативные ароматобразующие стрептококки: Streptococcus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus и ароматобразующие лейконостоки вида Leuconostoc dextranicum. Их количество в готовом твороге составляет 108-109 клеток в 1 г, в сметане – 107 клеток в 1 г. Продукты, приготовляемые с использованием термофильных молочнокислых бактерий С использованием термофильных молочнокислых бактерий готовят йогурт, простоквашу Южную, ряженку и варенец. Процесс сквашивания ведут при температуре 40-450С в течение 3-5 часов. В состав микрофлоры йогурта и простокваши Южная входят термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) и болгарская палочка (Lactobacillus bulgaricus) в соотношении 4:1…5:1. Применяют также симбиотическую закваску этих микроорганизмов. Содержание термофильных стрептококков и болгарской палочки в 1 см3 продукта составляет 107-108. В производстве ряженки и варенца используют закваску термофильного молочнокислого стрептококка в количестве 3-5%. Иногда добавляют болгарскую палочку. Содержание термофильного стрептококка в 1 см3 продукта составляет 107-108 клеток. Продукты, приготовляемые с использованием мезофильных и термофильных молочнокислых стрептококков К этим продуктам относят сметану Любительскую, молочнобелковую пасту «Здоровье», творог, вырабатываемый ускоренным методом, а также напитки пониженной жирности с плодово- 27 ягодными наполнителями. Сквашивание молока ведут при температурах 35-380С в течение 6-7 часов. Микроорганизмами, ведущими молочнокислые процессы, являются мезофильные и термофильные стрептококки. Мезофильные стрептококки осуществляют активное течение молочнокислого процесса и участвуют в обеспечении влагоудерживающей способности сгустка. Их количество в 1 см3 продукта составляет 106-108 клеток. Основной функцией термофильных стрептококков является обеспечение необходимой вязкости сгустка, способности его к удерживанию сыворотки и восстановление структуры после перемешивания. Содержание их в продукте 106-108 клеток в 1 см3. Продукты, приготовляемые с использованием ацидофильных палочек и бифидобактерий Это продукты лечебно-профилактического назначения. К ним относятся: ацидофильное молоко, ацидофилин, ацидофильно-дрожжевое молоко, ацидофильная паста, детские ацидофильные смеси, кисломолочные продукты с использованием бифидобактерий. Использование бактерий рода Lactobacillus acidophilus в производстве продуктов детского и диетического питания обусловлено наличием у этих бактерий способности выделять в процессе жизнедеятельности специфические антибиотические вещества, подавляющие рост бактерий группы кишечной палочки, дизентерийной палочки, сальмонелл, коагулазоположительных стафилококков и др. Бактерицидные свойства ацидофильной палочки усиливаются в присутствии молочной кислоты. Ацидофильное молоко готовят, сквашивая пастеризованное молоко чистыми культурами ацидофильных палочек. Ацидофильную пасту вырабатывают из ацидофильного молока определенной кислотности (80-900Т), отпрессовывая часть сыворотки. Ацидофилин вырабатывают из пастеризованного молока, сквашивая его закваской, состоящей из ацидофильных палочек, молочнокислых стрептококков и кефирной закваски в равных соотношениях. При приготовлении ацидофильно-дрожжевого молока в состав закваски помимо ацидофильных палочек входят дрожжи вида Saccharomyces lactis. Основным пороком кисломолочных продуктов с использованием ацидофильных палочек является перекисание продукта. Это происходит в том случае, когда не проводят быстрого охлаждения продукта. Продукты, обогащенные бифидобактериями, характеризуются высокими диетическими свойствами, так как содержат ряд биологи- 28 чески активных соединений: свободные аминокислоты, летучие жирные кислоты, ферменты, антибиотические вещества, микро- и макроэлементы. В настоящее время выпускают широкий ассортимент молочных продуктов с бифидобактериями. Все эти продукты условно можно разделить на три группы. В первую группу входят продукты, в которые вносят жизнеспособные клетки бифидобактерий, выращенные на специальных средах. Размножение этих микроорганизмов в продукте не предусматривается. Ко второй группе относятся продукты, сквашенные чистыми или смешанными культурами бифидобактерий, в производстве которых активизация роста бифидобактерий достигается обогащением молока бифидогенными факторами различной природы. Кроме того, можно использовать мутантные штаммы бифидобактерий, адаптированные к молоку и способные расти в аэробных условиях. Третья группа включает продукты смешанного брожения, чаще всего сквашенные совместными культурами бифидобактерий и молочнокислых бактерий. 3.1.2 Контроль качества заквасок и микробиологический контроль производства кисломолочных продуктов Контроль качества заквасок. Качество лабораторной и производственной заквасок на стерилизованном молоке контролируют по активность (предельной кислотности и продолжительности свертывания молока). В случае ее снижения проверяют чистоту закваски путем просмотра окрашенного микроскопического препарата не менее чем в 10 полях зрения микроскопа. Качество производственной закваски на пастеризованном молоке контролируют по активности, микроскопическому препарату, кислотности, наличию БГКП и органолептическим свойствам сгустка. БГКП не допускаются в 10 см3 закваски. Контроль кефирных грибковой и культуральной заквасок проводят по кислотности, наличию БГКП и микроскопическому препарату. В кефирных культуральных заквасках БГКП не допускаются в 3 см3. Наличие посторонних микроорганизмов в заквасках можно определить и посевом жидких заквасок на питательные среды. Так, споровые формы бактерии определяют посевом заквасок, выдержанных при 850С в течение 10 минут, в стерильное молоко с добавлением парафина для выращивания в анаэробных условиях и без парафина – для культивирования споровых форм бактерий в аэробных условиях. 29 Если после культивирования при 300С в течение 2-х суток в пробирках с парафином парафиновая пробка поднимается, а молоко пептонизируется, то это указывает на наличие в заквасках анаэробных споровых палочек рода Clostridium. Наличие грибов и дрожжей определяют путем посева разведений закваски в чашки Петри с сусломагаром или средой Сабуро с последующим культивированием при 24…260С в течение 3-5 суток. Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем засева соответствующих разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования посевов при температуре 300С в течение 3-5 суток. Учет результатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернувшегося молока. Микробиологический контроль производства кисломолочных продуктов заключается в проведении контроля технологического процесса, санитарно-гигиенического контроля условий производства и готовой продукции. При контроле технологии проверяют эффективность пастеризации молока не реже 1 раза в 10 дней. Особое внимание уделяют контролю качества заквасок на наличие бактерий группы кишечной палочки, отбирая пробы из трубопровода при подаче закваски в ванну. Исследуют также смесь после заквашивания и сквашивания. В последнем случае пробы отбирают из ванны, резервуара или бутылки при термостатном способе производства. Определяют наличие БГКП, которые не должны содержаться в 1 см3. Контроль технологических процессов производства кисломолочных продуктов проводят один раз в месяц. Готовую продукцию контролируют на наличие БГКП, а при необходимости – по микроскопическому препарату не реже одного раза в 5 дней. БГКП не допускаются в 0,1 см3 кефира, простокваши, йогурта, ацидофильно-дрожжевого молока и других кисломолочных напитков. В сметане 20%-ой и 25%-ой жирности БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3, в твороге – в 0,001 г. В твороге нормируется также содержание золотистого стафилококка (не допускаются в 0,01 г). Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы не допускаются в 25 см3 (г) всех видов кисломолочных продуктов. При ухудшении микробиологических показателей готового продукта проводят дополнительный контроль технологических процессов для установления причин, влияющих на качество продукта. 30 3.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ Студенты готовят фиксированные мазки из молочнокислых заквасок и кисломолочных продуктов (кефира, сметаны, творога, йогурта, варенца, ряженки и др.), окрашивают их краской Муромцева и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива (х90) в 10 полях зрения. Основываясь на знаниях, полученных в разделе 3.1.2, отмечают наличие посторонних микроорганизмов и обращают внимание на качественный состав полезной микрофлоры. Микроскопическую картину зарисовывают и под каждым рисунком делают вывод о качестве исследованного образца. 3.2.1 Техника окраски фиксированных мазков по Муромцеву 1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок из молочнокислого сгустка. 2. На мазок помещают фильтровальную бумажку и через нее наносят раствор краски Муромцева. 3. Краской Муромцева окрашивают мазок в течение 3…5 минут. 4. Мазок промывают водой, подсушивают его фильтровальной бумагой, наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют препарат с объективом на х90. Контрольные вопросы 1. Какими морфологическими признаками характеризуются молочнокислые стрептококки? 2. Что такое закваски? Из чего готовятся производственные закваски на молочных предприятиях? 3. Какими морфологическими признаками характеризуются молочнокислые палочки? 4. Перечислите группы кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок. 5. Охарактеризуйте микрофлору продуктов, приготовляемых с использованием многокомпанентных заквасок. Какие это продукты? 6. Какие кисломолочные продукты получают с использованием мезофильных молочнокислых стрептококков? При какой температуре проводят сквашивание таких продуктов? 7. Какие продукты готовят с использованием ацидофильных палочек и бифидобактерий? В чем ценность этих продуктов? 8. Какие микроорганизмы входят в состав микрофлоры йогурта, ряженки, варенца? 9. Как осуществляют контроль наличия в заквасках и кисломолочных продуктах посторонних микроорганизмов путем микроскопии. 10. Какие микробиологические показатели определяют при контроле качества заквасок и кисломолочных продуктов? 31 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4 САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ ПРОИЗВОДСТВА (выполняется на двух занятиях) Цель работы: Ознакомиться с организацией санитарно-гигиенического контроля на предприятиях молочной промышленности. Освоить микробиологические методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, воздуха производственных помещений, оборудования, тары, упаковочных и вспомогательных материалов, рук и спецодежды работников. Оборудование, материалы: термостаты, микроскопы, спиртовки, плитки, пробирки с тампонами для приготовления смывов, пробирки со средой Кесслера, средой Кода, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3, стерильные колбы на 500 см3, питательные среды: мясопептонный агар, сусло-агар или среда Сабуро, бактериологические петли, предметные стекла, набор красок по Граму, фильтровальная бумага. 4.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 4.1.1 Организация санитарно-гигиенического контроля на предприятиях молочной промышленности Санитарно-гигиенический контроль условий производства на предприятиях молочной промышленности осуществляется общегосударственной и ведомственными службами. Государственный санитарный надзор осуществляется санитарно-зпидемиологической службой (СЭС) в форме предупредительного (при проектировании и строительстве) и текущего надзора за выполнением установленных для предприятий молочной промышленности санитарно-гигиенических требований. Текущий контроль может быть плановый и внеплановый. Органы и учреждения государственного санитарного надзора наделены широкими полномочиями. Распоряжения и указания представителей санитарной службы являются обязательными для администрации предприятия. Их невыполнение несет за собой администра- 32 тивную ответственность руководителей предприятий, цехов и отделов, отдельных работников. Принудительные административные меры применяются и при выявлении нарушений, представляющих непосредственную угрозу для здоровья людей. В таких случаях может быть установлен запрет на дальнейшую эксплуатацию предприятия (например, запрет на выпуск продукции). При особо серьезных нарушениях, повлекших или могущих повлечь за собой возникновение пищевых заболеваний или другие вредные последствия, органы санитарного надзора могут привлекать виновных к уголовной ответственности. Внутриведомственный санитарный контроль осуществляют ведомственная санитарная служба и заводская лаборатория. Они контролируют выполнение требований СанПиНа для предприятий молочной промышленности, регулярно следят за санитарным состоянием производства, за профилактическими обследованиями работников цехов и соблюдением ими правил личной гигиены. Результаты проведения санитарно-гигиенического контроля фиксируются в специальном журнале. При отборе проб для микробиологических исследований представителями санитарно-эпидемиологической службы, микробиологи предприятия также проводят отбор проб и их исследование. В случаях систематических расхождений результатов, получаемых службой СЭС и ведомственными лабораториями, проводят по согласованию совместные исследования для уточнения методов анализа и интерпретации их результатов. 4.1.2 Оценка санитарного состояния воздуха производственных помещений Воздух производственных помещений может стать источником микробного загрязнения молочных продуктов. Санитарно-гигиеническая оценка воздуха производственных помещений проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и содержанию санитарно-показательных микроорганизмов – гемолитических стрептококков и стафилококков. Воздух производственных помещений считается чистым, если КМАФАнМ не превышает 1500 КОЕ/м3, а гемолитических стрептококков и стафилококков не более 16 в 1 м 3. В ка- 33 честве питательных сред используют мясопептонный агар (для определения КМАФАнМ) и кровяной агар (для определения гемолитических стрептококков и стафилококков). Для определения микроорганизмов в воздухе используют седиментационный и аспирационный методы. Седиментационный метод основан на самопроизвольном оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды в открытых чашках Петри. Аспирационный метод заключается в принудительном оседании микроорганизмов из воздуха на поверхности плотных питательных сред. Осуществляется аспирационный метод с помощью специальных приборов (например, прибора Кротова), снабженных вентиляторами, которые засасывают воздух в прибор через клиновидную щель. В приборе воздух ударяется о поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри. Помимо нормируемых микробиологических показателей в воздухе производственных цехов и холодильниках на предприятиях молочной промышленности определяют наличие спор микроскопических грибов и дрожжей, произвольно оседающих на поверхности сусло-агара или среды Сабуро за 5 минут. Посевы культивируют при комнатной температуре в течение 5-и суток. Санитарно-гигиеническая оценка проводится по 3-х бальной шкале. Состояние воздуха отличное, если в посевах споры грибов и дрожжей не обнаружены; хорошее, если на поверхности среды оседает до 2 спор грибов, а споры дрожжей не выявлены; удовлетворительное, если в чашках Петри после культивирования вырастает не более 5-и колоний грибов и 2-х колоний дрожжей. Для снижения бактериальной обсемененности воздуха на предприятиях молочной промышленности проводят проветривание и влажную уборку помещений. Снизить содержание микроорганизмов в воздухе можно также путем его фильтрации через воздушные фильтры, применяя физические и химические методы обеззараживания воздуха: обработку ультрафиолетовыми лучами, хлорсодержащими препаратами в виде испарений и аэрозолей. Эффективным способом является озонирование воздуха. 4.1.3 Оценка санитарного состояния воды Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям ГОСТа на питьевую воду. 34 Один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде для оценки ее санитарного состояния определяют общую бактериальную обсемененность (КМАФАнМ), содержание кишечных палочек и наличие патогенных микроорганизмов. Последний анализ выполняется службой СЭС. Согласно требованиям ГОСТа общая бактериальная обсемененность воды не должна превышать значения 100 КОЕ/см3, коли-титр допускается не менее 300 см3, а коли-индекс – не более 3. Коли-титр – наименьший объем воды, в котором допускается наличие одной кишечной палочки. Коли-индекс – количество кишечных палочек в 1 дм3 воды. Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами. 4.1.4 Контроль оборудования, трубопроводов, посуды, инвентаря, вспомогательных и упаковочных материалов, рук работников Контроль аппаратов и оборудования. Контроль проводят непосредственно после мойки, дезинфекции и пропаривания перед началом работы. Для проведения исследования готовят ватные или марлевые тампоны, которые закрепляют на деревянном или металлическом стержне и помещают в пробирки с 10 см3 воды. Пробирки с тампонами стерилизуют в автоклаве при 0,1 Мпа в течение 20-30 минут. Смывы с крупного оборудования и аппаратов берут с помощью нержавеющих металлических трафаретов с вырезанной серединой (площадь выреза 10, 25 или 100 см3). Перед взятием пробы трафарет смачивают спиртом, обжигают и накладывают на исследуемую поверхность. Ограниченную поверхность промывают смоченным тампоном, затем тампон погружают в пробирку с водой и содержимое хорошо перемешивают. В смывной воде определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки (путем посева на МПА и среду Кесслера). В смывах с хорошо вымытого оборудования общее количество микроорганизмов в смывной воде не должно превышать их содержания в чистой воде, поступающей на мойку. Кишечные палочки должны в смыве отсутствовать. Наличие кишечной палочки можно определить, используя среду Кода. В этом случае тампоном, смоченным в среде Кода, промывают исследуемую поверхность. Далее тампон погружают в среду, а про- 35 бирку помещают в термостат с температурой 42 0С на 24 часа. О наличии кишечной палочки судят по изменению цвета среды с зеленого до желтого. Контроль трубопроводов, рукавов, шлангов. Внутренняя поверхность трубопроводов, рукавов, шлангов недоступна для взятия проб с помощью тампонов. В этом случае общую бактериальную обсемененность и коли-индекс определяют в последней промывной воде. Эти показатели не должны отличаться от показателей воды, применяемой в производстве. Контроль посуды и инвентаря. Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см3 воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах. Контроль вспомогательных и упаковочных материалов. Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки молока и молочных продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв стерильным ватным тампоном (со 100 см3 поверхности). Определяют наличие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно превышать 5 в 1 см3 смыва. Поваренную соль контролируют на общую бактериальную обсемененность. Для разведения берут 5 г соли и растворяют ее в 95 см3 воды. Содержание микроорганизмов в соли не должно превышать 100 КОЕ/г. Сахар исследуют на наличие дрожжей и плесеней, растворяя 10 г сахара в 90 см3 воды. Дрожжи и микроскопические грибы должны отсутствовать. Контроль чистоты рук и спецодежды работников. Анализ чистоты рук работников производят (без предварительного предупреждения) пред началом производственного процесса только у рабочих, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией. 36 Перед анализом тампон смачивают стерильной водой или физиологическим раствором и обтирают им обе руки и пальцы каждого работника. Тампон ополаскивают в воде и всю смывную воду высевают в 5 см3 среды Кесслера или Кода. Наличие в смыве кишечной палочки недопустимо. Периодически проводят контроль обработки рук хлорной известью, для чего отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором (смесь растворов - 6% раствора йодистого калия и 4% раствора растворимого крахмала в равных соотношениях). Если тампон и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном окрашиваются в сине-бурый цвет, то это свидетельствует о присутствии ионов хлора. Чистоту рук можно проверить также с помощью индикаторных бумажек для определения бактерий группы кишечной палочки. Для этого индикаторную бумажку смачивают в стерильной воде и накладывают на руку. Затем бумажку помещают в пакет, запаивают и термостатируют в течение 12 часов при 370С. Появление розовых пятен свидетельствует о присутствии БГКП. Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на присутствие кишечных палочек посевом 1 см3 смывной воды в среду Кесслера. Кишечные палочки на спецодежде должны отсутствовать. 4.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ 1-е занятие На первом занятии студенты знакомятся с методиками определения микроорганизмов в воздухе, воде и осуществляют посевы этих объектов на питательные среды. Готовят смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода. 4.2.1 Микробиологическое исследование воздуха Проводят седиментационным методом. Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей. Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помеще- 37 ние и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью. Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро – в течение 2-3 суток при 250С. Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки в 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха: Х = а1005100 / ST, где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух); S – площадь чашки Петри, см2; Т – время экспозиции, мин; 100 – пересчет площади чашки на 100 см2; 5 – время экспозиции по Омелянскому; 100 – пересчет на 1 м3 воздуха. 4.2.2 Микробиологическое исследование воды Отбор проб. Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем. 4.2.2.1 Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) проводят по методике, описанной в разделе 2.2.2.1. Для посева отбирают 1 см3 воды. 4.2.2.2 Определение содержания колиформных бактерий методом бродильных проб Метод бродильных проб (или титрационный метод) основан на накоплении бактерий установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциальнодиагностическую среду для идентификации выросших колоний. 38 Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см3, 3 объемов по 10 см3 и 3 объемов по 1 см3 в лактозопептонную среду. Посев 100 и 10 см3 в 10 и 1 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации. Для определения можно также использовать среду Кесслера. Посевы инкубируют при температуре 370С в течение 24-48 часов. Если во всех колбах и пробирках роста кишечных палочек не обнаружено, то это значит, что коли-титр более 333 см3. На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 370С в течение 18-20 часов. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды. 4.2.2.3 Определение колиформных бактерий методом мембранных фильтров Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальнодиагностической среде и последующей идентификации выросших колоний. Для анализа точно отмеряют 300 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 370С в течение 24 часов. Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью. При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа. Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 370С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты 39 с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы. 4.2.3 Исследование чистоты рук Закрепленный на деревянном или металлическом стержне стерильный тампон смачивают стерильной водой (или физиологическим раствором) и протирают ими ладони, тыльную поверхность рук, под ногтями и между пальцами обеих рук. Тампон погружают в пробирку с водой, в которой проводилось смачивание, содержимое пробирки хорошо взбалтывают, отбирают 1 см3 и готовят разведения (1:10 и 1:100). Для определения КМАФАнМ проводят посев разведений в чашки Петри на мясопептонный агар с последующим термостатированием при 370С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслера и проводят культивирование при 430С в течение 24 часов. Учет результатов исследований. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 см3 смыва при отсутствии газообразования в пробирке со средой Кесслера с поплавком (при отсутствии кишечной палочки). Состояние рук считается: отличным, если в 1 см3 смыва содержится до 1000 клеток микроорганизмов; хорошим, если содержание микроорганизмов составляет от 1000 до 5000 в 1 см 3 смыва; удовлетворительным – при количестве микроорганизмов в 1 см3 смыва от 5000 до 10000. Если количество микроорганизмов в 1 см3 смыва превышает 10000 клеток, то санитарное состояние рук плохое (руки грязные). 2-е занятие На втором занятии студенты исследуют: - посевы воздуха на мясопептонном агаре и на среде Сабуро. Подсчитывают количество выросших колоний и по формуле Омелянского (раздел 4.2.1.) определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, содержание грибов и дрожжей в 1 м3 воздуха. Определение качественного состава микрофлоры воздуха проводят по методикам, описанным в разделах 2.2.4 и 2.2.5. На основании результатов исследований делаются выводы о санитарном состоянии и качественном составе микрофлоры воздуха. - Посевы водопроводной воды на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Подсчитывают количество выросших колоний на мясопептонном агаре. Если в чашках выросло более 100 колоний, то 40 санитарное состояние воды неудовлетворительное. Внимательно рассматривают посевы воды на жидкой накопительной среде (лактозо-пептонной среде или среде Кесслера). Если на среде есть рост, то лаборанты к занятию делают пересев на среду Эндо. Студенты рассматривают посевы в чашках Петри на среде Эндо и при наличии типичных колоний готовят фиксированные мазки, окрашивают их по Граму. Если в мазках при микроскопии с объективом на х90 обнаруживаются грамотрицательные мелкие палочки, располагающиеся по одиночке, без спор, то считают, что в исследуемой пробе воды присутствуют кишечные палочки и делают вывод о том, что коли-титр воды меньше объема, допустимого нормативом на питьевую воду. - Посевы с рук на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Делают вывод о чистоте рук согласно описанию, изложенному в разделе 4.2.3. Контрольные вопросы 1. Какая служба осуществляет государственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности? Какие формы государственного санитарного надзора Вы знаете? 2. Кто осуществляет внутриведомственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности? 3. По каким микробиологическим показателям проводят оценку санитарногигиенического состояния воздуха? 4. В чем сущность седиментационного метода определения микроорганизмов в воздухе? 5. Каким образом можно снизить бактериальную обсемененность воздуха? 6. Какие микробиологические показатели определяются согласно ГОСТу в питьевой воде для оценки ее санитарного состояния? 7. Каким образом готовятся смывы с оборудования для оценки его санитарного состояния? 8. Как проводят контроль чистоты трубопроводов, шлангов, рукавов? 9. Какие микробиологические показатели определяют в смывах с оборудования, трубопроводов, посуды? 10.Каким образом проводят микробиологический контроль вспомогательных и упаковочных материалов? 11.Как проводят микробиологический контроль чистоты рук работников? 12.Как проводят контроль обработки рук работников хлорной известью? 13.Как определить содержание микроорганизмов в 1 м3 воздуха? 14.Что такое коли-титр, коли-индекс воды? Какими методами определяется содержание кишечных палочек в питьевой воде? 15. Какие способы обеззараживания воды Вам известны? 41 5. УЧЕБНАЯ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ (УНИРС) (выполняется на 3-х занятиях) Цель занятия: Ознакомиться с порядком выполнения и правилами оформления научно-исследовательской работы, ее основными разделами. Составить обзор литературы по теме, схему проведения эксперимента, подобрать методики определения нормируемых микробиологических показателей, провести исследование качественного и количественного состава микрофлоры анализируемого молочного продукта и приобрести навыки интерпретации результатов проводимых исследований для оценки качества молочных продуктов по микробиологическим показателям. Оборудование, материалы: Пробы анализируемых молочных продуктов; пробирки с 9 см3 стерильной воды; стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри; пробирки с питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ, со средой Сабуро, средой Кесслера с поплавками, колбы на 250 со 100 см3 солевого агара, эмульсия яичного желтка; набор красок по Граму; фильтровальная бумага; бактериологические петли; предметные стекла; микроскопы; спиртовки; термостаты. 5.1 СТРУКТУРА ОТЧЕТА И ТРЕБОВАНИЯ К ОФОРМЛЕНИЮ РАБОТЫ 5.1.1 Структура отчета по учебной научно-исследовательской работе Введение Введение отражает необходимость проведения микробиологического контроля при производстве указанного в теме молочного продукта. 1. Обзор литературы В обзоре литературы приводятся литературные данные по микробиологии исследуемого молочного продукта: об источниках микрофлоры, о роли технически важной микрофлоры в формировании качества, об условиях развития микроорганизмов, о пороках и видах порчи продукта и т.д. Указывается, как проводится микробиологический контроль технологического процесса, санитарно-гигиенический 42 контроль условий производства и по каким микробиологическим показателям оценивается качество готового продукта в соответствии с требованиями нормативной документации. 2. Схема проведения эксперимента и методы исследований 2.1 Схема проведения эксперимента. В приложении 4 приведены нормируемые микробиологические показатели исследуемых молочных продуктов. Ознакомившись с требованиями СанПиНа, необходимо составить схему проведения эксперимента по аналогии со схемой исследования пастеризованного молока (см. рис. 1 на стр. 16). 2.2 Методы исследований. Здесь приводятся методики определения нормируемых микробиологических показателей, описание культуральных свойств выросших в чашках колоний, методики приготовления фиксированных мазков (для исследования одноклеточных микроорганизмов) и препаратов типа «раздавленная капля» (для исследования микроскопических грибов), методика окрашивания препаратов бактерий по Граму. При составлении этого подраздела используют знания, полученные при выполнении лабораторных работ №1 и №2. 3. Результаты исследований и их обсуждение В этом разделе приводятся результаты собственных исследований микробиологических показателей анализируемого продукта. Результаты чашечных методов исследований округляются в соответствии с п. 2.2.2 (см. стр. 17). Учет результатов исследований наличия БГКП в исследуемой массе (объеме) продукта проводят по методике, описанной в методике п. 2.2.3.1 (см. стр. 19). Полученные данные сравниваются с нормируемыми значениями микробиологических показателей. При определении качественного состава микрофлоры изучают культуральные и морфологические свойства отличающихся друг от друга колоний, выросших в чашках Петри на различных питательных средах колоний. Результаты исследований заносятся в таблицу, составленную аналогично таблице 1 (см. стр. 22). На основании полученных данных указываются группы микроорганизмов, обнаруженных в анализируемом продукте. Выводы Обобщая результаты микробиологического анализа молочного продукта, делается вывод о его качестве. Если микробиологические показатели не соответствуют требованиям нормативной документации, то указываются возможные причины повышенной бактериальной обсемененности продукта. 43 Список литературы Приводится список используемой литературы в алфавитном порядке, составленный в соответствии с требованиями ГОСТ 7.1-84. Библиографическое описание документа. 5.1.2 Требования к оформлению работы Работа оформляется на белой бумаге формата А4 (210х197) мм, на одной стороне листа. Страницы проставляются арабскими цифрами вверху страницы от центра. Нумерация должна быть сквозной по всему документу. Титульный лист. Вверху титульного листа указывается министерство, которому подчиняется учебное заведение (Министерство образования Российской федерации). Ниже указывается название учебного заведения – Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. Еще ниже справа – название кафедры («Технология жиров, биохимия и микробиология»). В центре титульного листа – Отчет об учебной научно-исследовательской работе по теме «…». Под этим заголовком справа указываются фамилия, и. о. студента или группы студентов, представивших отчет, индекс группы. Еще ниже – фамилия, и. о., должность преподавателя, который принимает отчет. Внизу титульного листа в центре указывается город и год написания отчета (например: Кемерово – 2003). Содержание. В нем перечисляются главы (разделы) работы с указанием страниц. Далее следуют введение, обзор литературы по теме и другие разделы работы. Заголовки «Содержание», «Введение», «Выводы», «Список литературы» не нумеруются. Основные разделы должны иметь порядковую нумерацию в пределах всего документа и обозначаются арабскими цифрами. Заголовок раздела записывается прописными буквами, в конце заголовка точка не ставится. Каждый раздел начинается с нового листа. Разделы могут делиться на подразделы, которые нумеруются арабскими цифрами в пределах каждого раздела (например: 2.3 – третий подраздел второго раздела). Заголовок подраздела записывается строчными буквами кроме первой прописной. Переносы слов в заголовках не допускаются. В тексте работы должны быть ссылки на научный источник (номер ссылки должен соответствовать номеру источника в списке лите- 44 ратуры). Нумерация рисунков и таблиц производится арабскими цифрами и является сквозной по всему документу. Общими требованиями к отчету являются: четкость и логическая последовательность изложения материала; убедительность аргументации; краткость и точность формулировок; конкретность изложения результатов работы; обоснованность рекомендаций и предложений. Список литературы должен быть составлен в соответствии с ГОСТом 7.1-84. Примеры библиографического описания: 1. Книга одного, двух авторов: Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. –271с. 2. Книга трех авторов: Мудрецова-Висс К.А и др. Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов. – Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 1997. –312с. Или: Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов./К.А. Мудрецова-Висс, А.А. Кудряшова, В.П. Дедюхина. – Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 1997. –312с. 3. Книга более трех авторов: Микробиологические основы молочного производства: Справочник/Л.А. Банникова, Н.С. Королева и др.; под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1987. –400с. 4. Статьи в журнале: Кравченко Э.Ф. Пути повышения эффективности использования вторичного молочного сырья//Молочная промышленность, 1993.№3.С. 3-5. Обогащение творожной и подсырной сыворотки микробным белком/Н.И. Дерканосов, Н.А. Чувашева, Е.Л. Гарманова и др.//Молочная промышленность, 1986. -№9. – С. 12-13. 5. Обзорная информация: Переработка молочной сыворотки с применением мембранных методов разделения/Н.Я Дыкало, Э.Ф. Кравченко и др.//Молочная промышленность. Обз. инф. – М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1984. – 39 с. 6.Стандарты: ГОСТ 7.1-84. Библиографическое описание документа. Общие требования и правила оформления. – Взамен ГОСТ 7.1-76. Введ. 45 01.01.84. – М.: Изд-во стандартов, 1984. –72с. УДК 016:006.354. Группа Т62. 7. Методические указания: Шмаков В.Г. Оформление текстовых документов: методические указания для преподавателей и студентов всех специальностей. – 4 изд., перераб. – Кемерово: КемТИПП, 1988. –48с. 5.1.3 Рекомендуемая тематика учебной научно-исследовательской работы 1. Микробиологическое исследование сухих молочных продуктов 2. Микробиологическое исследование сгущенных молочных консервов с сахаром 3. Микробиологическое исследование масла 4. Микробиологическое исследование сычужных твердых и мягких сыров 5. Микробиологическое исследование плавленого сыра 6. Микробиологическое исследование мороженого 2. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ 1-е занятие На первом занятии группа студентов (2-3 человека) получает задание на выполнение работы, после чего студенты знакомятся с микробиологическими показателями качества исследуемого продукта, пользуясь приложением №4, и самостоятельно разрабатывают схему проведения микробиологического анализа. После согласования схемы с преподавателем, студенты подбирают методики определения микробиологических показателей, делают заявку для лаборантов, в которой указывают необходимое для проведения анализа количество пробирок с водой и питательными средами, готовят посуду (чашки Петри, пипетки на 1 см3) для стерилизации. Приготовление питательных сред, стерилизация посуды и сред осуществляется лаборантами. 2-е занятие Ко второму занятию студенты должны подготовить литературный обзор по изучаемой теме. На занятии студенты проводят посев продукта на питательные среды, знакомятся с требованиями к оформлению работы (п. 5.1.2), занимаются оформлением работы: 46 написанием введения, схемы проведения эксперимента и методик определения микробиологических показателей, культуральных и морфологических свойств микроорганизмов. 3-е занятие На этом занятии студенты изучают посевы предыдущего занятия: подсчитывают количество выросших колоний в чашках, рассматривают посевы в пробирках на среде Кесслера на наличие роста БГКП, выбирают отличающиеся друг от друга колонии и описывают их культуральные свойства, готовят микроскопические препараты и осматривают их под микроскопом. Результаты исследований оформляются в соответствующем разделе в соответствии с требованиями, описанными в п. 5.1.1 и п. 5.1.2. Далее делаются выводы по работе и работа представляется к защите. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Пищевая промышленность, 1980. – 255 с. 2. Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 168 с. 3. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. – М.: Изд-во стандартов, 1996. 4. Микробиологические основы молочного производства: Справочник/ Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; Под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с. 5. Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов / К.А. Мудрецова-Висс, А.А Кудряшова, В.П. Дедюхина. - Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 1997. – 321 с. 6. Микробиология продуктов животного происхождения / Г.-Д. Мюнх, Х. Заупе, М. Шрайтер и др. Пер. с нем. –М.: Агропромиздат, 1985. –592 с. 7. Моисеева Е.Л. Микробиология мясных и молочных продуктов при холодильном хранении. – М.: Агропромиздат, 1988. – 223 с. 8. Санитарная микробиология /Н.В Билетова, Р.П Корнелаева и др. Под ред. С.Я. Любашенко. – М.: Пищевая промышленность, 1980. – 352 с. 9. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. –271с. 47 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов». 2. ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа». 3. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к испытаниям». 4. ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов». 5. ГОСТ 25102-90 «Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий». 6. Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 168 с. 7. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. – М.: Изд-во стандартов, 1996. 8. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК 4.2.577-96. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. –94 с. 9. Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды: Методические указания МУК 4.2.671-97. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1997. –36 с. 10. Микробиологические основы молочного производства: Справочник/ Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; Под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с. 11. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.: Агропромиздат, 1990. – 223 с. 12. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 – 208 с. 13. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. –271с. Приложение № 1 СХЕМА организации микробиологического контроля производства кисломолочных напитков № Исследуемые объекты Название анализа Откуда берут пробы Периодичность контроля 1 раз в декаду Разведение - 1. Молоко сырое Редуктазная проба Ингибирующие вещества Средняя проба молока от каждого поставщика 2. Молоко до пастеризации КМАФАнМ БГКП Из балансировочного бачка Не реже 1 раза в месяц IV, V, VI 3. Молоко после пастеризации КМАФАнМ БГКП Из крана на выходе секции охлаждения Не реже 1 раза в месяц I, II, III 4. Молоко пастеризованное для закваски БГКП Из ВДП, заквасочников, ушатов 1 раз в декаду 10 см3 5. Закваска Ежедневно 10 см3 БГКП Из всех емкостей с заМикроскопический пре- кваской парат Время свертывания, органолептическая оценка, кислотность 49 № Исследуемые объекты Название анализа 6. Молоко до и после внесения закваски БГКП Из ванн и танков 7. Молоко сквашенное до и после розлива (при резервуарном способе) Молоко сквашенное после розлива (при термостатном способе) Готовая продукция БГКП 8. 9. Откуда берут пробы Периодичность контроля Не реже 1 раза в месяц Разведение 10 см3 Из танков, бутылок Не реже 1 раза в месяц 0,1 см3 БГКП Из бутылок в цехе розлива Не реже 1 раза в месяц 0,1 см3 БГКП Микроскопический препарат - 1 раз в 5 дней 0,1 см3 - Не реже 1 раза в месяц - 10. Трубы, резервуары для закваски, бутылки КМАФАнМ БГКП 11. Воздух КМАФАнМ Плесени и дрожжи Из заквасочной Не реже 1 раза в месяц - 12. Вода КМАФАнМ Кишечная палочка - 13. Руки рабочих Кишечная палочка Йодкрахмальная проба Из крана в цехах, из во- 1 раз в квартал доисточника (центральное водоснабжение) С рук рабочих 1 раз в декаду 1 раз в неделю - Приложение №2 Результаты пробы на редуктазу Проба с резазурином Класс молока Продолжительность обесцвечивания метиленового голубого, ч Продолжительность обесцвечивания Окраска молока Высший Более 3,5 1,5 От серо-сиреневой до сиреневой I 3,5 1,0 То же II 2,5 1,0 Сиреневая с розоватым оттенком или ярко-розовая III 40 мин 1,0 Бледно-розовая или белая Ориентировочное количество бактерий в 1 см3 до 300 тыс. от 300 до 500 тыс. От 500 тыс. до 4 млн. От 4 млн. до 20 млн. Приложение №3 Микробиологические показатели питьевых молока и сливок КМАФАнМ, КОЕ/см3 Объем (в см3), в котором БГКП не допускаются Объем (в см3), в котором S. aureus не допускаются Пастеризованное молоко: в бутылках и пакетах: группа А группа Б во флягах и цистернах 5х104 1х105 2х105 1,0 0,1 0,1 1,0 0,1 - Пастеризованные сливки: в бутылках и пакетах: группа А группа Б во флягах 1х105 2х105 3х105 1,0 0,1 0.1 1,0 0,1 - Продукт *Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы не допускаются в 25 см3 продукта. Приложение №4 Микробиологические показатели некоторых молочных продуктов (выписка из СанПиНа 2.3.2.560-96) Масса продукта (г, см3), в КМАФАнМ, которой не допускаются КОЕ/г (см3), БГКП (ко- Патогенные, в т.ч. сальне более ли-формы) Индекс Вид продукта 6.2.1.4. Молоко топленое 2,5х10 1,0 25 6.2.1.6 Кисломолочные напитки - 0,01 25 6.2.1.7. Ряженка - 1,0 25 6.2.1.8 Сметана всех видов - 0,001 25 6.2.1.9 Сметана с термической обработкой Творог, сыр домашний и др. творожные изделия, вырабатываемые без термообработки Творожные изделия, вырабатываемые с термообработкой - 0,01 25 - 0,1 25 - 0,1 25 Примечания монеллы 6.2.2.1 6.2.2.2 3 S. aureus в 1 см3 не допускаются S. aureus в 1 см3 не допускаются S. aureus в 1 см3 не допускаются S. aureus в 1 см3 не допускаются S. aureus в 0,1 см3 не допускаются S. aureus в 0,1 см3 не допускаются 53 Индекс Вид продукта Масса продукта (г, см3), в КМАФАнМ, которой не допускаются КОЕ/г (см3), БГКП (ко- Патогенные, в т.ч. сальне более ли-формы) Примечания монеллы 6.2.2.3 Десерты сливочные - 0,1 25 6.2.3.2. Молоко сгущенное с сахаром (цельное и нежирное) в потребительской таре Какао, кофе натуральный со сгущенным молоком и сахаром, сливки сгущенные с сахаром Молоко коровье сухое цельное: - высший сорт - первый сорт Молоко сухое обезжиренное - для непосредственного употребления - для промышленной переработки Напитки сухие молочные 2,5х104* 0,1 25 3,5х104* 0,1 25 5х104 7х104 0,1 0,1 25 25 5х104 0,1 25 1х105 1х105 0,1 0,1 25 25 6.2.3.3. 6.2.4.1. 6.2.4.2. 6.2.4.3 S. aureus в 0,1 см3 не допускаются * в свежеприготовленном продукте * в свежеприготовленном продукте Плесени – не более 50 КОЕ/г, S. aureus в 1 см3 не допускаются 54 Индекс Вид продукта Масса продукта (г, см3), в КМАФАнМ, которой не допускаются КОЕ/г (см3), БГКП (ко- Патогенные, в т.ч. сальне более ли-формы) Примечания монеллы 6.2.4.4. Сливки сухие и сливки сухие с сахаром: - высший сорт - первый сорт 6.2.4.5. Сухие смеси для мягкого мороженого 6.2.6.1. Сыры сычужные твердые и мягкие 6.2.6.2. Сыр Российский 6.2.6.3. 6.2.7.1. 6.2.7.2. 6.2.7.3. 6.7.6.1 Сыры плавленые - без наполнителей - с наполнителями (овощи, грибы и др.) Мороженое на молочной основе закаленное Мороженое мягкое из сухих и жидких смесей Масло вологодское 5х104 1х105 5х104 0,1 0,1 0,1 25 25 25 - 0,001 25 - 0,001 25 5х103 0,1 25 1х104 0,1 25 1х105 0,01 25 1х105 1х104 0,1 0,1 25 25 S. aureus в 1 г не допускаются S. aureus не более 1000 КОЕ/г S. aureus не более 500 КОЕ/г Плесени 50 КОЕ/г. дрожжи 50 КОЕ/г Плесени 100 КОЕ/г. дрожжи 100 КОЕ/г S. aureus в 1 см3 не допускаются S. aureus в 1 см3 не допускаются 55 Индекс Вид продукта Масса продукта (г, см3), в КМАФАнМ, которой не допускаются КОЕ/г (см3), БГКП (ко- Патогенные, в т.ч. сальне более ли-формы) Примечания монеллы 1х105 0,01 25 - 0,01 25 1х105 0,01 25 Масло сливочное бутербродное Масло коровье топленое 5х105 0,001 25 1х103 1,0 25 6.2.9.1. Закваски для кефира (жидкие) - 3,0 100 6.2.9.2. Закваски для других кисломолочных продуктов, изготавливаемых из чистых культур - 10,0 100 6.7.6.2. Масло сладко-сливочное и соленое любительское и крестьянское 6.7.6.3. Масло кисло-сливочное любительское и крестьянское 6.7.6.4. Масло шоколадное 6.7.6.5. 6.7.6.6. Плесени 200 КОЕ/г, не более S. aureus в 10 см3 не допускаются Плесени 10 КОЕ/г S. aureus в 10 см3 не допускаются Плесени и дрожжи не более 10 КОЕ/г ОГЛАВЛЕНИЕ № лабораторной работы 1. Название работы Стр. ОРГАНИЗАЦИЯ И СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА ПРЕДПРИЯТИЯХ МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСУДЫ, ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 3-11 2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРОГО И ПАСТЕРИЗОВАННОГО МОЛОКА 12-22 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКВАСОК И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ 13-30 4. САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ ПРОИЗВОДСТВА 31-40 5. УЧЕБНАЯ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ (УНИРС) 41-46 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 47 ПРИЛОЖЕНИЯ 48-54 Подписано в печать __________г. Формат 60х84/16 Уч.- изд. л. 3,5. Тираж______экз. Заказ №______ Отпечатано на ризографе. Цена____руб. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 650056 г. Кемерово,56, б-р Строителей, 47. Отпечатано в лаборатории множительной техники КемТИППа, 650010, г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52