По всей видимости, АМП являются наиболее древними
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКОХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА» на правах рукописи ПОЛИНА НАДЕЖДА ФЕДОРОВНА Биологическая активность антимикробных пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на модели инфекции Chlamydia trachomatis 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., доцент, Лазарев В.Н. Москва 2015 2 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………... 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………………. 1.1. Антимикробные пептиды (АМП) …………………………………………………... 1.1.1. Классификация АМП………………………………………………………….... 1.1.2. Механизм действия АМП………………………………………………………. 1.1.3. Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП …….. 1.1.4. Терапевтическое применение АМП …………………………………………… 1.1.5. АМП из яда паука Lachesana tarabaevi………………………………………... 1.1.5.1. Латарцины…………………………………………………………………... 1.1.5.2. Цито-инсектотоксины…………………………………………………….... 1.2. Системы регуляции экспрессии генов……………………………………………… 1.2.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой системы регуляции экспрессии ……………………………………………………………………………... 1.2.2. Фармакология доксициклина…………………………………………………... 1.3. Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis…………………………... 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………. 2.1. Материалы……………………………………………………………………………. 2.1.1. Штаммы E. coli………………………………………………………………….. 2.1.2. Плазмидные векторы ………………………………………………………….... 2.1.3. Реактивы и антибактериальные препараты…………………………………..... 2.2. Методы………………………………………………………………………………... 2.2.1. Реакция рестрикции……………………………………………………………... 2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ………………………………………..... 2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля……………………………… 2.2.4. Реакция лигирования…………………………………………………………..... 2.2.5. Конструирование векторов……………………………………………………... 2.2.6. Культивирование клеток E. coli………………………………………………... 2.2.7. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК……………………………..... 2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом кипячения……………………………. 2.2.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса………………….... 2.2.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК……….. 2.2.11. Препаративное выделение плазмидной ДНК………………………………... 2.2.12. Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия……………………………………………………………….. 2.2.13. Тестирование антимикробной активности пептидов на E.coli……………… 2.2.14. Культивирование линий клеток млекопитающих………………………….... 2.2.15. Культивирование штамма C. trachomatis…………………………………….. 2.2.16. Определение антихламидийной активности пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi……………………………………………………………………. 2.2.17. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) доксициклина на C. trachomatis………………………………………………………. 2.2.18. Трансфекция клеток линии HEK293…………………………………………. 2.2.19. Заражение линии клеток HEK293 C. trachomatis……………………………. 2.2.20. Выявление включений C. trachomatis……………………………………….. 2.2.21. Конфокальная микроскопия…………………………………………………... 2.2.22. Определение титра C. trachomatis……………………………………………. 2.2.23. Анализ жизнеспособности клеток……………………………………………. 2.2.24. Выделение суммарной РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis……………………………………………………………………………… 4 8 8 8 15 18 20 23 24 27 30 30 34 35 39 39 39 39 39 39 39 40 40 40 40 42 42 43 43 43 43 44 44 44 45 45 45 46 46 46 46 47 47 47 3 2.2.25. Реакция обратной транскрипции……………………………………………... 2.2.26. Транскрипционный анализ……………………………………………………. 2.2.27. Протеомный анализ……………………………………………………………. 2.2.28. Дополнительное программное обеспечение…………………………………. 2.2.29. Статистика……………………………………………………………………… 3. РЕЗУЛЬТАТЫ……………………………………………………………………………. 3.1. Антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi……………………… 3.2. Антибактериальная активность пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на E. coli in vitro………………………………………………………………………………… 3.3. Антимикробный эффект латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a на C. trachomatis………………………………………………………………………………… 3.4. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих гены латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда паука Lachesana tarabaevi………………………... 3.5. Регуляция экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках млекопитающих………………………………………………………. 3.6. Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293……………. 3.7. Транскриптомный анализ клеток линии HEK293 при экспрессии гена цитоинсектотоксина cit1a……………………………………………………………………... 3.8. Протеомный анализ линии клеток HEK293 при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a……………………………………………………………….. 3.9. Влияние экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a на ингибирование инфекции C. trachomatis на разных фазах жизненного цикла…………………………. 4. ОБСУЖДЕНИЕ………………………………………………………………………….... ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………… ВЫВОДЫ …………………………………………………………………………………… Список сокращений ………………………………………………………………………… Список литературы …………………………………………………………………………. 48 48 48 50 50 51 51 51 52 53 57 59 60 63 67 72 86 88 89 90 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы и степень ее разработанности В настоящее время повсеместно наблюдается рост устойчивых к действию антибиотиков возбудителей инфекционных заболеваний. Возникновение таких микроорганизмов, наряду с широкоим и неправильным использованием антибиотиков, приводит к снижению эффективности лечения социально значимых инфекционных заболеваний. В этой связи актуальной задачей является поиск новых альтернативных подходов к лечению инфекционных заболеваний. В качестве нового поколения лекарственных средств против инфекционных заболеваний могут выступать антимикробные пептиды (АМП). АМП являются основными компонентами системы врожденного иммунитета и представляют собой крайне разнообразную группу соединений. За последние годы изучено большое количество АМП, охарактеризованы их свойства и функции. На данный момент описано более 2000 АМП (aps.unmc.edu/AP/main.php), обнаруженных у самых разнообразных организмов. Так, АМП были выделены из растений, грибов, животных, включая человека (Tossi et al., 2000). Они обладают широким спектром действия и проявляют свою активность по отношению как к грам-отрицательным, так и к грам-положительным микроорганизмам. Также в литературе были описаны противовирусная и противогрибковая активности АМП. По сравнению с антибиотиками АМП обладают рядом преимуществ, а именно: - действием в микромолярных концентрациях, - более широким спектром бактерицидной активности, - низкой вероятностью возникновения резистентности к ним со стороны возбудителей инфекции. Высокая антимикробная активность пептидов обусловлена механизмом их действия. При взаимодействии АМП с клеткой-мишенью происходит образование поры в мембране клетки, что, в конечном счете, приводит к нарушению ее целостности и последующему лизису клетки. Такая низкая специфичность действия делает возникновение резистентности к АМП маловероятным событием. Исходя из этого, АМП являются крайне перспективными агентами в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний. Известно, что АМП могут оказывать цитотоксическое действие на клетки высших эукариот, что ограничивает использование АМП в ветеринарной и медицинской практике. Одним из решений данной проблемы является исследование антибактериального действия пептидов при экспрессии кодирующих их генов в инфицированной клетке. Уменьшения цитотоксического эффекта, вероятно, можно достичь благодаря использованию системы регулирования экспрессии генов, кодирующих эти пептиды. 5 Среди всего многообразия АМП особое внимание привлекают пептиды из ядов членистоногих. В ходе длительной эволюции членистоногие выработали уникальные средства атаки и защиты, представляющие собой многокомпонентную смесь веществ, в состав которой входят цитолитические пептиды с антимикробной активностью. В нашей работе мы остановили свой выбор на новых уникальных классах пептидов из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi, а именно на латарцинах и цито-инсектотоксине CIT1a. Это линейные, катионные и амфифильные пептиды. В водном растворе они имеют неупорядоченную структуру, а в мембранном окружении склонны к образованию α-спиралей. В качестве мишени для применения АМП из яда паука Lachesana tarabaevi нами были выбраны бактерии из рода Chlamydia. Хламидии остаются одними из самых распространенных бактериальных агентов, передающихся половым путем, в том числе и в России. Хламидии вызывают такие заболевания человека как воспаления органов малого таза, непроходимость маточных труб, патологии беременности и родов, снижение фертильности у мужчин. Более того, для Chlamydia характерно развитие персистенции в организме человека. Цель и задачи работы Целью настоящей работы являлось изучение действия антимикробных пептидов из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi на развитие инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis. Были поставлены следующие задачи: 1. Определить антимикробную активность химически синтезированных латарцинов Ltc1, Ltc2, Ltc3a, Ltc4b, Ltc5 и цито-инсектотоксина CIT1a из яда паука L. tarabaevi в отношении C. trachomatis. 2. Исследовать эффективность подавления развития хламидийной инфекции при экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a в клетках линии HEK293. 3. Изучить ингибирующее действие цито-инсектотоксина CIT1a при экспрессии кодирующего его гена в клетках линии HEK293 на развитие C. trachomatis на разных фазах жизненного цикла патогена. Научная новизна В настоящей работе впервые исследована активность АМП из яда паука Lachesana tarabaevi в отношении инфекции Chlamydia trachomatis. Антихламидийная активность показана как для химически синтезированных АМП, так и при контролируемой экспрессии кодирующих их генов непосредственно в инфицированной клетке. Для этого получены плазмидные векторы, экспрессирующие гены, которые кодируют АМП из яда паука L. tarabaevi. Данные векторы 6 позволяют точно регулировать экспрессию исследуемых генов АМП, что явлется необходимым условием для снижения токсического эффекта продуктов экспрессии. Впервые при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a из яда паука L. tarabaevi, показано изменение в транскрипции и трансляции генов, продукты которых вовлечены в функционирование актинового цитоскелета и аппарата Гольджи в клетках, экспрессирующих ген цито-инсектотоксина, что приводит к нарушению развития C. trachomatis. Также впервые изучено влияние экпрессии гена, кодирующего цито- инсектотоксина CIT1a из яда паука L. tarabaevi на различных стадиях жизненного цикла хламидий. Теоретическая и практическая значимость Данная работа демонстрирует возможность использования латарцинов и цитоинсектотоксина в качестве новых антихламидийных агентов, а именно при экспрессии кодирующих их генов в инфицированной клетке. Разработанная система регулируемой экспрессии генов позволяет избежать токсического эффекта на клетки эукариот. Данные, полученные при анализе транскриптома и протеома клеток, экспрессирующих ген цитоинсектотоксина CIT1a, позволяют более полно объяснить механизмы антихламидийного действия этого пептида. Методология и методы исследования В диссертации использованы современные бактериологические методы (культивирование клеток E. coli штамм DH5α и их трансформация, культивирование и определение титра C. trachomatis, определение МИК), генно-инженерные методы (выделение аналитических и препаративных количеств плазмидной ДНК, методы рестрикционного анализа, отбор рекомбинантных клонов и другие методы молекулярного клонирования), методы работы с линиями клеток млекопитающих (культивирование, трансфекция, анализ жизнеспососбности клеток), методы протеомного и транскриптомного анализов и биоинформатические методы. Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Продемонстрирована антимикробная активность химически синтезированных латарцинов Ltc1, Ltc2, Ltc3a, Ltc4b, Ltc5 и цито-инсектотоксина CIT1a из яда паука Lachesana tarabaevi в отношении C. trachomatis. 2. Показано, что экспрессия генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках линии HEK293 вызывает подавление развития хламидийных включений. Эффективность подавления инфекции составляла 60-85 %. 3. Установлено, при индукции экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, наиболее эффективное подавление развития C. trachomatis в клетках линии HEK293 происходит на ранних стадиях инфекции, т.е. стадии образования незрелого включения. 7 Степень достоверности и апробация результатов Для решения поставленных задач в работе использовались современные инструментальные методы. Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных медицинской и биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации, обоснованы и подтверждены фактическим материалом. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (Москва, 16 июня 2015 г.), а также в ходе ряда конференций: "Клеточные взаимоотношения патоген-хозяин" (Амстердам, Нидерланды, 2010), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учѐных «Ломоносов-2012» (Москва, Россия, 2012), 1-ый Международный симпозиум по Ядам «ЯДЫ 2012» (Оксфорд, Великобритания, 2012), Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине III международная научно-практическая конференция (Казань Россия, 2012). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, из которых 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 публикации в трудах конференций. 8 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Антимикробные пептиды (АМП) Антимикробные пептиды являются наиболее древними компонентами защитных систем организма. Впервые АМП были получены Hultmark с соавт. из гемолимфы шелкопряда Hyalophora cecropia (Hultmark et al., 1980). Эти пептиды, названные цекропинами P9A и P9B, были активны по отношению к Escherichia coli и другим грам-отрицательным бактериям. Аминокислотные последовательности двух пептидов имели высокую степень гомологии между собой, различаясь в содержании остатков метионина и глутаминовой кислоты. Weiss с коллегами получили и исследовали антимикробные пептиды из полиморфонуклеарных лейкоцитов человека — бактерицидные пептиды, увеличивающие проницаемость мембраны (BPI). Пептиды были активны против Escherichia coli и Salmonella typhimurium(Weiss et al., 1978). В то же время были выделены из нейтрофилов и исследованы дефензины человека (HNP1,2,3) (Selsted et al., 1985). Zasloff описал семейство АМП, присутствующих в коже Xenopus laevis (Zasloff, 1987), им были подробно исследованы свойства магаинина и его антибактериальная активность. Структура и функции различных АМП активно изучаются последние десятилетия. На сегодняшний день описано более 2000 АМП (aps.unmc.edu/AP/main.php). Пептиды выделены из самых разнообразных источников: бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных (da Costa et al., 2015, Tossi et al., 2000). Они имеют широкий спектр действия, активны как против грам-положительных, так и против грам-отрицательных бактерий, также действуют на вирусы и грибы (Yount and Yeaman, 2013). Помимо этого АМП обладают и иммуностимулирующей функцией, они усиливают фагоцитоз, способствуют накоплению клеток иммунной системы в местах воспаления (Brown and Hancock, 2006, Choi et al., 2012, Suarez-Carmona et al., 2015). 1.1.1. Классификация АМП В основе различных классификаций АМП лежат физико-химические характеристики, такие как особенности структуры пептидов, механизм действия, источник происхождения и т.п. Остановимся подробнее на классификации, основанной на особенностях первичной и вторичной структуры пептидов. Первую группу представляют анионные антимикробные пептиды. Для проявления их активности необходимо присутствие ионов цинка (Zn2+), выступающих в роли кофактора. Это небольшие пептиды, их масса составляет 720-820 Да (Brogden et al., 1996). Структура анионных АМП имеет сходство со структурой пропептидов сериновых протеаз группы 1. Помимо 9 антимикробной активности, анионные АМП могут выполнять регуляторные функции в легочном метаболизме за счет регуляции по типу отрицательной обратной связи (Brogden et al., 1997). Механизм действия анионных АМП неизвестен. Предполагается, что образование комплекса с ионами Zn2+ (LaForce and Boose, 1984) помогает присоединиться к отрицательнозаряженной поверхности бактериальной клетки. Свою антимикробную активность данные пептиды проявляют как против грам-положительных, так и против грам-отрицательных бактерий. Так, анионные АМП, обнаруженные в легочном сурфактанте овец, были активны по отношению к Mannheimia haemolytica, Escherichia coli и Klebsiella pneumonia (Brogden, 1992). Представителями этой группы являются также максимин H5 из амфибий (Lai et al., 2002), дермцидин человека (Burian and Schittek, 2015, Schittek et al., 2001). Максимин содержит три остатка аспарагиновой кислоты и не содержит основных аминокислотных остатков (Lai et al., 2002). Дермцидин образуется в потовых железах человека, состоит из 47 аминокислотных остатков. Он так же, как и максимин, имеет отрицательный заряд при нейтральном значении pH (Burian and Schittek, 2015). Следующую обширную и разнообразную группу составляют катионные АМП. Среди них можно выделить линейные катионные пептиды, формирующие α-спираль. Это наиболее хорошо изученная группа АМП. Она включает в себя пептиды, состоящие из 20-40 аминокислотных остатков (рисунок 1), не содержащие остатков цистеина. В водной среде они имеют неупорядоченную структуру, но в присутствии таких соединений, как додецилсульфат натрия, трифторэтанол (ТФЭ), фосфолипидные везикулы и липосомы, пептиды принимают конформацию α-спирали (Gennaro and Zanetti, 2000). К этой группе относятся такие пептиды как цекропины, кателицидины, дермасептины, магаинины. Цекропины, выделенные из гемолимфы двукрылых насекомых, имеют основный Nконцевой участок, отделенный от более гидрофобного C-терминального участка эластичной гибкой петлей (Hultmark et al., 1980, Pinheiro da Silva and Machado, 2012, Steiner et al., 1981). Они активны, главным образом, против грам-отрицательных бактерий, но, в некоторых случаях, наблюдается и действие против грам-положительных бактерий. Мелиттин, полученный из пчелиного яда, состоит из 26 аминокислотных остатков. Его третичная структура представляет собой два спиральных участка, разделенных петлей, причем, в отличие от цекропина, N-концевой участок является более гидрофобным (Dempsey, 1990). У млекопитающих пептидами, образующими α-спираль, являются представители семейства кателицидинов. Так, у человека присутствует только один представитель этого семейства, hCAP18/LL37. LL37 (его предшественником является катионный антимикробный пептид человека-18 кДа или hCAP-18) состоит из 37 аминокислотных остатков, в числе которых два лейцина (рисунок 1). Он вырабатывается нейтрофилами, а также эпителиальными 10 клетками органов дыхательной, пищеварительной и репродуктивной систем (Pinheiro da Silva and Machado, 2012, Vandamme et al., 2012, Wassing et al., 2015, Zanetti, 2005). LL37 проявляет антимикробную и антимикотическую активности. Рисунок 1. Вторичные структуры основных представителей различных классов антимикробных пептидов. A – LL-37, б – магаинин, в – индолицидин, г - α-дефензин человека 1 (HNP-1), д - θ-дефензин, е – тритрптицин. Красным цветом окрашены гидрофильные а.о., синим – гидрофобные а.о., желтым выделены остатки цистеина. Следующая большая группа пептидов – это пептиды, образующие β-складчатую структуру, стабилизированную одной или несколькими дисульфидными связями. Как правило, это пептиды размером от 16 до 40 аминокислотных остатков, и среди них можно выделить несколько подгрупп. К ним относятся α-, β- и θ-дефензины (рисунок 1). Подобно кателецидинам, дефензины проявляют антибактериальную и антивирусную активности (SuarezCarmona et al., 2015). У человека α-дефензины присутствуют в нейтрофилах (human neutrophil peptide 1-4, human defensin 1-4), клетках Панета (в тонком кишечнике) и эпителиальных клетках урогенитального тракта женщин (human defensins 5,6) (Beisswenger and Bals, 2005, Kim, 2014, Pinheiro da Silva and Machado, 2012), в их составе 29-35 аминокислотных остатков. α-дефензины содержат 6 остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи между следующими остатками цистеина: C1→C6, C2→C4 и C3→C5 (рисунок 2). В структуре β-дефензинов также обнаружено три дисульфидных связи. Их положение в молекуле отличается от положения в αдефензинах, что и образует основное различие между этими подгруппами. Дисульфидные связи образуются между C1→C5, C2→C4 и C3→C6 (Beisswenger and Bals, 2005). Длина β-дефензинов составляет 34-47 аминокислотных остатков. β-дефензины 1-4 (HBD1-4) обнаружены в 11 нейтрофилах и эпителиальных клетках. Они способствуют переходу гистамина в свободное состояние, образованию простагландина и также действуют как антимикробные агенты. θдефензины обнаружены в лейкоцитах и костном мозге макаки-резус (Tang et al., 1999). У человека эти пептиды не вырабатываются из-за мутации в сигнальной последовательности, где образуется стоп-кодон (Kim, 2014, Nguyen et al., 2003). θ-дефензин – это циклический пептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков и имеющий три дисульфидные связи. Антимикробные свойства этого пептида проявляются при микромолярных концентрациях (Tang et al., 1999). Рисунок 2 Расположение дисульфидных связей в структуре дефензинов. А - α-дефензины, Б - β-дефензины. Другая группа пептидов – это пептиды, обогащенные определенными аминокислотами, такими как пролин, аргинин, триптофан. Они линейны и не содержат в своем составе остатков цистеина. К ним относятся индолицидин (рисунок 1), бактеницин, гистатин, тритрптицин (Nguyen et al., 2011). Индолицидин, выделенный из нейтрофилов быка, состоит из 13 аминокислотных остатков, 5 из которых - это триптофан и 3 – пролин. Его Сконец амидирован (Selsted et al., 1992). Тритрптицин впервые был обнаружен у свиней в нейтрофильных гранулах. Он также состоит из 13 аминокислотных остатков, 3 из которых триптофан (чем и обусловлено его название) и 4 - аргинин, обеспечивающие положительный заряд молекулы (Lawyer et al., 1996). Он активен против грам-положительных, грамотрицательных бактерий, а также против грибов. К числу триптофан-богатых пептидов относится также пуроиндолин, выделенный из эндосперма пшеницы (Blochet et al., 1993). Другим представителем этой группы является гистатин, гистидин-богатый пептид, секретируемый слюнными железами человека (da Costa et al., 2015, Tsai and Bobek, 1998). Из 25 аминокислотных остатков, 7 составляют остатки гистидина. Гистатин 5 наиболее активен против Candida ablicans. Большое содержание пролина (19 из 39 аминокислотных остатков) и аргинина (8 из 39) наблюдается в пептиде PR-39, выделенном из тонкого кишечника свиней. Этот пептид многофункционален: он является хемоаттрактантом нейтрофилов (Huang et al., 12 1997), ингибирует активность протеасом (Gaczynska et al., 2003), а также способен вызывать подавление апоптоза (Nguyen et al., 2011, Ramanathan et al., 2004). Бактенецины, полученные из нейтрофилов быка, овцы, содержат около 45% пролина и 23% аргинина (Frank et al., 1990). Основные характеристики антимикробных пептидов различных классов представлены в таблице 1. Таблица 1. Основные характеристики некоторых представителей АМП. Название АМП Аминокислотная последовательность Организм Активность Заряд Место образования -3 % гидрофобных аминокислотных остатков 55 Максимин (Maximin H5) ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL амфибии Bombina maxima грам+ Дермцидин (human Dermcidin) SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA VEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV человек грам+ грамгрибы грам+ грамгрибы вирусы опухолевые клетки клетки млекопитающих грам+ грамгрибы вирусы клетки млекопитающих грам+ грамгрибы опухолевые клетки грам+ грамгрибы вирусы опухолевые клетки грам+ грам- -2 38 потовые железы Мелиттин (Melittin) GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ медоносная пчела Apis mellifera 5 46 яд LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDF LRNLVPRTES человек 6 35 нейтрофилы Магаинин 2 (Magainin 2) GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS африканская шпорцевая лягушка, Xenopus laevis 3 43 кожа α-дефензин человека 1 (human alpha Defensin HNP-1 human neutrophil peptide-1, HNP1) -дефензин человека 4(Human beta defensin 4 HBD-4) -дефензин человека 1 (Human beta defensin 1 HBD-1) ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLW AFCC человек 3 53 нейтрофилы FELDRICGYGTARCRKKCRSQEYRIG RCPNTYACCLRKWDESLLNRTKP человек 7 32 грам+ грам- 4 36 нейтрофилы, эпителиальные клетки нейтрофилы, эпителиальные клетки DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTC YRGKAKCCK человек кожа θ-дефензин (Monkey RTD-1 rhesus theta-defensin1) GFCRCLCRRGVCRCICTR макак-резус грам+ грамвирусы грибы 5 55 лейкоциты Индолицидин (Indolicidin) ILPWKWPWWPWRR нейтрофилы быка Bos taurus 3 53 нейтрофилы Бактеницин (Bactenicin 5) RFRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPI RPPFRPPLGPFP нейтрофилы быка Bos taurus грам+ грамгрибы вирусы клетки млекопитающих грам- 9 27 нейтрофилы Гистатин (Histatin 5) DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY человек грам+ грамгрибы 5 8 слюна Тритрптицин (Tritrpticin) VRRFPWWWPFLRR синтетический, производный кателецидина свиньи 4 53 нейтрофилы RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPG FPPRFPPRFP свинья грам+ грамгрибы клетки млекопитающих грам+ грамопухолевые клетки 10 20 эпителий тонкого кишечника PR-39 15 1.1.2. Механизм действия АМП На сегодняшний день считается, что нет единого для всех АМП механизма, объясняющего их действие на про- или эукариотическую клетку. В настоящий момент существует несколько моделей, демонстрирующих возможные варианты взаимодействия пептидов с клетками. Контакт пептида с клеткой начинается с электростатического взаимодействия пептида и отрицательно заряженной мембраной клетки. В случае грам-отрицательных бактерий, молекуле пептида необходимо преодолеть дополнительную наружную мембрану, несущую отрицательный заряд, обусловленный наличием липополисахаридов в ее составе. А в случае грам-положительных бактерий, на пути к цитоплазматической мембране барьером служит клеточная стенка, состоящая из тейхоевых и липотейхоевых кислот, также имеющих отрицательный заряд. Положительно заряженные пептиды имеют высокое сродство к липополисахаридам (ЛПС) внешней мембраны. Это сродство выше, чем к ионам магния (Mg2+) и кальция (Ca2+) (Hancock and Chapple, 1999), поэтому в результате взаимодействия АМП с мембраной из последней происходит вытеснение двухвалентных ионов, что ведет к нарушению целостности наружной мембраны. Далее, достигнув цитоплазматической мембраны, пептиды при невысоком молярном соотношении пептид/липид, за счет электростатических взаимодействий выравниваются параллельно поверхности мембраны (Yang et al., 2001). Как только это соотношение возрастает, они начинают ориентироваться перпендикулярно бислою мембраны. При ориентируются высоком молярном перпендикулярно и соотношении встраиваются пептид/липид, в мембрану. молекулы Причем пептида критическая концентрация, необходимая для проникновения, различна для разных пептидов, а также зависит от типа липидов, входящих в мембрану (Yount and Yeaman, 2005). Дальнейшее развитие событий может происходить несколькими путями. Существует три модели, объясняющих, каким образом происходит разрушение мембраны - это модель «ковра», модель тороидальных пор и модель «доска-бочка» (da Costa et al., 2015) (рисунок 3). Согласно модели «доска-бочка» (рисунок 3Б), α-спирали пептида формируют трансмембранную пору путем образования узелков с люменом так, что гидрофобная поверхность пептида взаимодействует с гидрофобными липидами бислоя, а гидрофильная – образует внутреннюю часть поры (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Yang et al., 2001). При этом пору можно сравнить с бочонком, а молекулы пептида с досками в бочонке. Такой механизм действия обнаружен у аламетицина, при действии которого на клетку пору 16 формируют от 3 до 11 молекул пептида (He et al., 1995, Spaar et al., 2004). Внутренний и внешний диаметры поры составляют ~1.8 нм и ~4.0 нм, соответственно. Рисунок 3. Различные механизмы действия АМП. А — модель тороидальных пор; Б — модель «доска-бочка»; В — модель «ковра». Гидрофильные участки выделены красным, гидрофобные — синим. Адаптировано из (Jenssen et al., 2006). В модели «ковра» (рисунок 3В) пептиды аккумулируются на поверхности бислоя (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Shai, 1999). Они располагаются параллельно бислою мембраны за поверхностью счет электростатических мембраны. Молекулы взаимодействий с отрицательно заряженной пептида выстилаются подобно ковру так, что гидрофильная составляющая пептида взаимодействует с гидрофильными участками липидов. Это, в свою очередь, при высокой концентрации пептида, вызывает изменение ориентации гидрофильной и гидрофобной частей липидного бислоя относительно друг друга. В конечном счете, происходит нарушение кривизны бислоя и разрушение мембраны. Таким образом действуют, например, овиспирин (Brogden, 2005), магаинин, дермасептин, цекропин. Согласно модели тороидальных пор (рисунок 3А), в образовании поры участвуют как молекулы пептида, так и липиды мембраны. Пептид, встраиваясь в мембрану, вызывает 17 искривление бислоя так, что полярная часть пептида и полярные части липидов, взаимодействуя, образуют пору (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Yamaguchi et al., 2002). В этой модели пептиды всегда связаны с липидами бислоя в отличие от модели «доска-бочка» (Yang et al., 2001). По механизму образования тороидальных пор действуют протегрин, мелиттин, магаинин (Matsuzaki et al., 1996, Yamaguchi et al., 2002, Yang et al., 2001). Размеры пор, образованных согласно этой модели, больше размеров пор, формирующихся по модели «доска-бочка». Внутренний диаметр поры, образованной магаинином, составляет от 3 до 5 нм, внешний - от 7 до 8 нм. В ее образовании участвуют от 4 до 7 молекул пептида и около 90 липидных молекул (Matsuzaki et al., 1998, Yang et al., 2001). Большинство пептидов действуют по описанным выше механизмам. Но известны случаи, когда пептиды проникают через мембрану, не вызывая ее лизиса. Их действие направлено на различные внутриклеточные мишени (рисунок 4), что приводит к ингибированию синтеза клеточной стенки бактерии, подавлению биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, либо ингибированию активности ферментов (Nguyen et al., 2011). Также мишенями для АМП могут служить аутолизин бактерий и фосфолипазы эукариот, которые активируются ими. В присутствии тейхоевых и липотейхоевых кислот аутолизин находится в неактивном состоянии. При этом у Staphylococcus simulans аутолизин реактивируется при добавлении пептида Pep5 (Bierbaum and Sahl, 1987). Секретируемая фосфолипаза А2 также активируется в присутствии магаинина 2, индолицидина (Zhao and Kinnunen, 2003). Другой АМП, буфорин, проникает через цитоплазматическую мембрану в клетку и аккумулируется в цитоплазме (Park et al., 2000). Затем происходит его связывание с нуклеиновыми кислотами, что приводит к гибели клетки (Park et al., 1998). Пролин-богатый пептид PR-39 вызывает филаментацию Salmonella enterica серовара Typhimurium (S. typhimurium), а индолицидин приводит к филаментации E. coli (Shi et al., 1996, Subbalakshmi and Sitaram, 1998). Это может происходить по нескольким причинам: либо из-за нарушения репликации ДНК, либо из-за подавления активности ферментов, участвующих в образовании оболочки клетки. PR-39 блокирует синтез белка, приводит к деградации белков, необходимых для репликации ДНК (Boman et al., 1993). Индолицидин подавляет синтез ДНК и РНК (Subbalakshmi and Sitaram, 1998). Гистатин проникает в клетки грибов и приводит к нелитической потере АТФ из активно дышащих клеток (Kavanagh and Dowd, 2004). Пирхорицин и дрозоцин связываются с шаперонами, специфически с DnaK и неспецифически с GroEL, препятствуя фолдингу белков (Otvos et al., 2000). 18 Рисунок 4. Альтернативные механизмы действия АМП на примере Escherichia coli. Адаптировано из (Brogden, 2005). Исследованы свойства некоторых пептидов, связанные с активацией иммунитета. Некоторые из таких АМП участвуют в хемотаксисе моноцитов, нейтрофилов, стимулируют заживление ран (Chertov et al., 1996, De et al., 2000, Kolls et al., 2008). 1.1.3. Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП Хотя возникновение устойчивости у микроорганизмов к АМП кажется маловероятным в силу особенностей механизма действия, существует несколько примеров, подтверждающих такую возможность. Неизвестно, как быстро возникает такая устойчивость. Кроме того, остается неясным, как возникновение такой адаптации может повлиять на эволюцию АМП. Рассмотрим несколько примеров возникновения резистентности микроорганизмов к АМП (рисунок 5). Одним из возможных механизмов возникновения такой устойчивости является изменение суммарного отрицательного заряда мембраны, приводящее к уменьшению сродства АМП к бактериальной мембране. Снижение величины суммарного отрицательного заряда происходит за счет модификации тейхоевых кислот, липида А, фосфолипидов и пептидогликана. Так, показано, что Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes способны уменьшать отрицательный заряд за счет перемещения D-аланина из цитоплазмы на наружную поверхность мембраны (Abachin et al., 19 2002, Peschel et al., 1999, Poyart et al., 2003). Этот перенос обеспечивается белками, кодируемыми опероном dltABCD. Другим примером данного феномена является модификация у S.aureus одного из важнейших фосфолипидов мембраны, лизилфосфатидилглицерола, Lлизином (Peschel et al., 2001), осуществляемая белком MprF. У грам-отрицательных бактерий также может происходить уменьшение отрицательного заряда за счет изменения структуры липида А (компонента липополисахаридов) при встраивании аминоарабинозы, например, как это происходит у Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa (Miller et al., 2005). S. enterica также способна добавлять жирные кислоты в структуры липида А, что уменьшает проницаемость внешней мембраны за счет увеличения гидрофобных взаимодействий (Guo et al., 1998). Тем не менее, антимикробная активность пептидов сохраняется при действии более высоких концентраций АМП. Это вызвано тем, что нейтрализация мембраны оказывается неполной. Помимо этого, некоторые микроорганизмы способны синтезировать пептидазы и протеазы, разрушающие АМП. Так, протеазы S. aureus V8 и ауреолизин, а также протеаза внешней мембраны PgtE Salmonella enterica серовара Typhimurium, инактивируют αспиральный АМП LL37 (Guina et al., 2000, Sieprawska-Lupa et al., 2004). Streptococcus pyogenes (Nyberg et al., 2004), Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Porphyromonas gingivalis и Prevotella spp. (Schmidtchen et al., 2002) также вырабатывают протеазы, разрушающие линейные АМП (рисунок 5). Пептиды, в составе которых есть дисульфидные связи, например, дефензины, оказываются более устойчивыми к действию протеаз (Campopiano et al., 2004, Maemoto et al., 2004). Для различных пептидов механизмы резистентности к ним строго специфичны. Так, S. aureus вырабатывает стафилокиназу, которая способна связывать и инактивировать α-дефензин из нейтрофилов человека (Jin et al., 2004). S. pyogenes секретирует ингибиторы комплемента, инактивирующие синтетический пептид LL37 (Frick et al., 2003). Помимо этого, некоторые АМП служат субстратами для белка множественной лекарственной устойчивости Neisseria meningitides и Neisseria gonorrhoeae MtrCDE (Shafer et al., 1998, Tzeng et al., 2005), в результате чего пептиды активно выводятся из бактериальных клеток. У большинства АМП за антимикробную активность отвечают лишь несколько аминокислотных остатков, входящих в состав пептида, остальные же могут быть заменены без потери функций АМП. Этот феномен получил название «биомолекулярное разнообразие» пептидов. Например, существует пять различных генов, кодирующих гепсидин-подобные АМП, в камбале (Douglas et al., 2003) против только одного у человека (Park et al., 2001), или 19 20 генов α-дефензинов в клетках Панета у мышей против двух у человека (Ouellette and Selsted, 1996). Рисунок 5. Некоторые механизмы устойчивости бактериальных организмов к АМП. Аадаптировано из (Peschel and Sahl, 2006). А. Часть линейных АМП, чувствительных к протеолизу, является мишенью для различных бактериальных протеаз. Б. Действие АМП блокируется либо секретируемыми белками, например, стафилокиназой, или же они активно выводятся путем экструзии, например, с участием MtrCDE . В. Некоторые бактерии способны уменьшать суммарный отрицательный заряд мембраны, что уменьшает их сродство к АМП. Другим примером биомолекулярного разнообразия является существование 23 различных криптдин-подобных АМП у мышей (Hornef et al., 2004). Они имеют различный спектр антимикробной активности, что подчеркивает значимость такого разнообразия АМП для реализации защитных функций. Одновременное присутствие различных вариантов АМП уменьшает вероятность возникновения устойчивости к ним у микроорганизмов. 1.1.4. Терапевтическое применение АМП Постоянно растет количество данных о возникновении резистентности у микроорганизмов к традиционным и вновь синтезированным антибиотикам (FDA: Antibiotic Resistance www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/anti_resist.html). Резистентность к АМП возникает гораздо реже, чем к антибиотикам. Широкий спектр антибактериального действия АМП связан, главным образом, с их механизмом действия: антимикробное действие заключается во взаимодействии с клеточными мембранами, а не со специфическими мишенями, как это происходит в случае антибиотиков. Но, несмотря на преимущества, клиническое использование АМП ограничено. Это связано с дорогостоящим производством и токсичностью многих пептидов по отношению к эукариотическим клеткам. 21 Но, в настоящее время, некоторые АМП находятся на разных фазах клинических исследований (таблица 2) (Fjell et al., 2012, Fox, 2013, Kang et al., 2014). Так, MBI 594AN (Microbiologix Biotech, http://www.migenix.com), являющийся аналогом индолицидина, был разработан для лечения акне. Он является аналогом индолицидина. Propionibacterium acnes, связанная с данным заболеванием, проявляет устойчивость к ряду антибиотиков (эритромицину, клиндамицину, и другим) (Tan, 2004). Доклинические исследования показали хорошую эффективность in vitro против штаммов P. acnes. Показано, что MBI 594AN не токсичен для животных. Фаза IIb клинических испытаний показала статистически значимое уменьшение воспалительных повреждений/очагов (p < 0.004) в течение 6 недель по сравнению с контролем (Gordon et al., 2005). Компания Periodonitix разработала синтетический аналог гистатина - катионный пептид P113, состоящий из 12 аминоксилотных остатков (http://www.demegen.com). Исследования P113 продемонстрировали высокую активность in vitro против Candida albicans, а также против грамположительных и грам-отрицательных микроорганизмов. P113 использовался в качестве жидкости для полоскания рта при лечении кандидоза у пациентов с ВИЧ (завершена I и II стадии испытаний). P113 безопасен для ежедневного применения как в форме геля, так и жидкости для полоскания рта, предотвращает гингивит и кровотечение десен без каких-либо побочных эффектов. Также этот пептид использовался при лечении легочных инфекций, вызванных Pseudomonas aeruginosa, у больных муковисцидозом (Gordon et al., 2005). Лицензия на P-113 была передана компании Demegen, под контролем которой была завершена фаза IIb клинических испытаний с определением оптимальной дозы P-113 для лечения кандидоза полости рта (Fjell et al., 2012, Kang et al., 2014). Другой пептид, (http://www.ardeabio.com, исеганан (Iseganan) IB-367, http://www.intrabiotics.com), продукт является компании аналогом Intrabiotics протегрина, выделенного из лейкоцитов свиней. Он использовался в форме жидкости для полоскания рта при воспалениях слизистой оболочки у пациентов, перенесших химиотерапию, и пациентов, страдающих муковисцидозом (Giles et al., 2004). Однако клинические испытания показали, что эффект от применения исеганана был сравним с эффектом плацебо. Дальнейшее исследование IB-367 временно приостановлено (Fjell et al., 2012, Kang et al., 2014). Неупрекс (Neuprex), также известный как rBPI или опебакан (Opebacan), является рекомбинантной формой бактерицидного пептида, увеличивающего проницаемость мембраны (BPI), вырабатываемого нейтрофилами человека. rBPI был разработан в виде инъекции компанией Xoma (http://www.xoma.com) для лечения бактериального менингита. Однако III 22 фаза клинических испытаний не показала статистически значимых различий в уменьшении уровня смертности по сравнению с контрольной группой (Kang et al., 2014, Levin et al., 2000). Таблица 2. Терапевтическое применение АМП. Название препарата Описание Заболевание Пексиганан Pexiganan Магаинин 2, 22 а.к. пептид из кожи лягушки Xenopus laevis Синтетический аналог индолицидин Диабетические язвы стопы Омиганан Omiganan MBI-226 Иcеганан Iseganan (IB-367) P113D OP-145 Novexatin Lytixar (LTX-109) Информация о клинических испытаниях NCT00563433 NCT00563394 Компания Dipexium Pharma (White Plains, New York)/MacroChem/Genaera Угри розовые (Rosacea) II/III NCT00608959 BioWest Therapeutics/Maruho (Vancouver) Предотвращения катетер-обусловненных инфекций кровяного русла III NCT00027248 Microbiologix Biotech (Vancouver, BC, Canada) Протегрин (лейкоциты свиньи). Пептид с двумя дисульфидным и связями Гистатин (человек), Нелинейный α - спиральный Стоматит, пневмония, для лечения хронических респираторных инфекций у пациентов с муковисцидозом III NCT00022373 Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. Mountainview, CA кандидоз у пациентов с ВИЧ-инфекцией IIb NCT00659971 Синтетический 24 а.к. аналог LL-37 Циклический катионный пептид Синтетический пептид, разрушающий мембраны Хронические бактериальные инфекции среднего уха Микозы пальцев ног II ISRCTN842200 89 Demegen, Pittsburgh, PA Dow Pharmaceutical Sciences, Patuloma, CA, http://www.demegen.com/index .htm OctoPlus (Leiden, The Netherlands) Инфекции MRSA (метициллинрезистентный Staphylococcus aureus) в носу Инфекции, вызываемые Clostridium difficile I/II NCT01223222 I ISRCTN400711 44 Острые бактериальные инфекции кожи, вызванные Staphylococcus spp Мукозит полости рта у больных раком шеи и головы при химиолучевой терапии II NCT01211470 NVB302 Лантибиотики класса B PMX-30063 Миметики дефензина Brilacidin (PMX-30063) Фаза клинических испытаний III Миметики дефензина Пексиганан (pexiganan) MSI-78, NCT00231153 I/II NCT02052388 II, планируется исследование (дата завершения декабрь 2016) NCT02324335 разработанный NovaBiotics (Aberdeen, UK) http://www.novabiotics.co.uk/pi peline/np213-novexatin Lytix Biopharma (Oslo) http://www.lytixbiopharma.com /home/ Novacta (Welwyn Garden City, UK) http://www.novactabio.com/ind ex.php PolyMedix, Inc., (Canada), Cellceutix Corporation, United States , http://cellceutix.com Cellceutix Corporation, United States, http://cellceutix.com/ корпорацией Genaera (http://www.genaera.com), длиной 22 а.о., представляет собой аналог антимикробного пептида 23 амфибий, магаинина 2, с измененной C-концевой частью. Предполагается его использование для лечения пациентов, страдающих диабетом, с инфицированными язвами нижних конечностей. Однако его применение в III фазе клинических испытаний показало, что заживление ран при действии пексиганана не отличалось от контрольной группы пациентов, в которой раны обрабатывали фторхинолоновым антибиотиком офлоксацином (Lamb and Wiseman, 1998). В 1999 году исследования прекратились, т.к. управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) США сочло, что действие пексиганана по эффективности не превосходит используемые антибиотики. В настоящее время компания Dipexium Pharmaceuticals разработала MSI-78 как крем для местного применения под названием Locilex (0.8% пексиганана). В 2014 Dipexium инициировала III фазу клинических испытаний Locilex для подтверждения его преимуществ и безопасности (Fjell et al., 2012, Fox, 2013, Kang et al., 2014). Также следует упомянуть об омиганане MBI-226, разработанным компанией Migenix (http://www.migenix.com). Этот препарат предназначался для борьбы с инфекцией, возникающей в месте введения постоянного центрального венозного катетера. Природным аналогом омиганана является упоминавшийся выше пептид индолицидин, выделенный из бычьих нейтрофилов. На III фазе испытаний не наблюдалось статистически значимых различий в подавлении инфекции при действии омиганана по сравнению с контролем - повидон-йодом (Gordon et al., 2005). Однако, несмотря на это, в том же исследовании было получены следующие статистически значимые результаты: 1) уменьшение колонизации микрофлорой в зоне катетера (p = 0.002) и 2) уменьшение локальных инфекций (p = 0.004). Компания BioWest Therapeutics проводит III фазу клинических испытаний омигарда, 1% геля омиганана, в качестве средства для борьбы с инфекцией, возникающей в месте введения постоянного центрального венозного катетера. Также другая компания Cutanea Life Sciences Inc.проводит II фазу клинических испытаний омиганана для лечения розацеи (Rosacea) (Fjell et al., 2012, Fox, 2013, Kang et al., 2014). Особое место среди антимикробных пептидов занимают пептиды, обнаруженные в яде пауков. Рассмотрим более подробно свойства пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi. 1.1.5. АМП из яда паука Lachesana tarabaevi Яды пауков представляют собой комплекс уникальных по составу и свойствам веществ, служащих одновременно средствами нападения и защиты (Mebs, 2002). Яды пауков являются многокомпонентными смесями и состоят из белков, пептидов и низкомолекулярных 24 компонентов, причем пептиды составляют основную часть яда (Vassilevski et al., 2009). Пептиды из яда пауков можно разделить на нейротоксины, содержащие дисульфидные связи, и линейные цитолитические пептиды (Corzo and Escoubas, 2003). Размер нейротоксинов варьирует в пределах 3-7 кДа, в то время как линейные пептиды короче – менее 3 кДа (Estrada et al., 2007). В настоящее время антимикробные пептиды из яда пауков рассматриваются в качестве новых антибактериальных и антивирусных средств. Рассмотрим более подробно классы пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi, а именно, латарцины и цито-инсектотоксины. 1.1.5.1. Латарцины Среднеазиатский паук Lachesana tarabaevi относится к семейству Zodariidae (паукимуравьеды). Были исследованы антимикробная и инсектицидная активности цельного яда Lachesana tarabaevi. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в отношении Escherichia coli 0,05 мг/мл, средняя летальная доза (ЛД50) 3 мкг/г для личинок серой мясной мухи Sarcophaga carnaria. При введении яда наблюдается некроз близлежащих тканей, обильное выделение жидкости (Kozlov et al., 2006). Латарцины (Ltc) – это пептиды, выделенные из яда паука Lachesana tarabaevi. Название образовано первыми буквами латинского названия паука Lachesana tarabaevi. Латарцины были выделены в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Последовательности пептидов приведены в таблице 3 (Kozlov et al., 2006). Таблица 3. Аминокислотные последовательности латарцинов (Kozlov et al., 2006). Пептид Аминокислотная последовательность Ltc 1 SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGE Ltc 2a GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc 2b GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKN Ltc 3a SWKSMAKKLKEYMEKLKQRA-NH2 Ltc 3b SWASMAKKLKEYMEKLKQRA-NH2 Ltc 4a GLKDKFKSMGEKLKQYIQTWKAKF-NH2 Ltc 4b SLKDKVKSMGEKLKQYIQTWKAKF-NH2 Ltc 5 GFFGKMKEYFKKFGASFKRRFANLKKRL-NH2 NH2 - C-концевое амидирование. Длина Масса, Да 25 26 26 20 20 24 24 28 3071,5 2901,0 2879,5 2481,7 2424,6 2900,9 2882,3 3428,1 25 Латарцины - это короткие, линейные, катионные (pI > 10), амфифильные пептиды с молекулярной массой 2–4 кДа. Они имеют заряд от +5 у Ltc 3b до +10 у Ltc 5 при нейтральных значениях pH. Также структуре латарцинов свойственно преобладание остатков лизина над остатками аргинина, амидирование C-концевого остатка. Часто первым аминокислотным остатком является остаток глицина. При изучении вторичной структуры методом кругового дихроизма было показано, что в водном растворе Ltc 1, 2a, 3a, 4a, 5 характеризуются неупорядоченностью структуры, а в растворе ТФЭ, суспензии мицелл детергентов или липосом пептиды склонные к образованию α-спиралей (Kozlov et al., 2006). Это совпало с предсказаниями вторичной структуры пептидов по аминокислотной последовательности согласно различным алгоритмам (таблица 4). Таблица 4. Вторичная структура латарцинов по данным спектроскопии кругового дихроизма. пептид Ltc 1 Ltc 2a Ltc 3a Ltc 3b Ltc 4a Ltc 4b Ltc 5 условия вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ вода 50% ТФЭ содержание элементов вторичной структуры, % α-спираль β-структура β-изгиб клубок 9 26 22 43 78 2 2 18 6 30 23 41 69 4 7 20 31 16 21 32 87 1 0 12 39 11 20 30 85 1 1 13 9 29 24 38 88 1 0 11 10 26 24 40 88 1 0 11 5 24 27 44 86 1 2 11 Были исследованы антимикробная (в отношении ряда грам-положительных и грамотрицательных организмов) и гемолитическая активности выделенных латарцинов (Kozlov et al., 2006). Соответствующие МИК представлены в таблице 5. Область активных концентраций пептидов лежит в пределах 0,5–16 мкМ. Антимикробная активность латарцинов сопоставима с активностью выделенного из яда медоносной пчелы мелиттина, и, в некоторых случаях, превосходит ее. Среди исследуемых бактерий наиболее устойчивыми к действию латарцинов оказались P. aeruginosa. Но, стоит отметить, что Ltc 1, Ltc 2a и Ltc 5 активны против P. aeruginosa. Также было показано, что в присутствии двухвалентных ионов (20 мM CaCl2) активность латарцинов уменьшается в несколько раз (4–20) (Kozlov et al., 2006). Это подтверждает гипотезу о механизме действия АМП, согласно которой пептиды 26 электростатически связываются с отрицательно-заряженной поверхностью мембраны. Наиболее выраженная гемолитическая активность (таблица 5) наблюдается у Ltc 1, 2a, 5. Таблица 5. Антимикробная и гемолитическая активность латарцинов (Kozlov et al., 2006). Ltc 1 Грамположительные бактерии A. globiformis 0.5 B. subtilis 1.0 Грамотрицательные бактерии E. coli DH5α 1.0 E. coli MH1 0.7 P. aeruginosa 4.1 Дрожжи P. pastoris 17 S. cerevisiae >33 Гемолитическая активность эритроциты кролика 80 (20 % лизис) МИК, мкМ Ltc 2a Ltc 3a Ltc 3b Ltc 4a Ltc 4b Ltc 5 0.7 0.4 0.3 1.2 0.7 2.9 0.3 1.1 0.3 1.1 1.1 0.6 0.5 0.7 6.7 2.5 6.0 >40 23 28 >45 4.5 3.2 >35 4.4 4.4 >35 0.6 0.6 18 6.7 54 20 20 23 23 36 18 >35 35 >37 >37 6.0 >120 >120 >120 >120 40 Ген, кодирующий Ltc 2а, был также экспрессирован в E.coli в виде гибридного пептида с тиоредоксином (Shlyapnikov et al., 2008). Активность очищенного Ltc 2a была сопоставима с активностью синтезированного пептида. Была исследована структура пептидов-предшественников латарцинов (таблица 6). Они являются секретируемыми пептидами, синтезируемыми на рибосомах в виде препропептидов. Пропоследовательности, как правило, несут большой отрицательный заряд, который компенсирует положительный заряд АМП, что препятствуют электростатическому связыванию пептидов с мембранами. Таблица 6. Аминокислотные последовательности предшественников латарцинов. Пептид Ltc 1 Ltc 2 Ltc 3 Ltc 4a Ltc4b Ltc 5 Аминокислотная последовательность препро-участка предшественника MKYFVVALALAVALVCIAESTAYDVNEELENELDDLSDAAWLAKAAEDLQALDDFEES EESR MKYFVIALALAVALVCIAESTAYEVNEELENELDDLDDAAWLAVAEELQGLEDFEESR MKTYAVLLALVVAFVCIAESTGYPVEDLEDDELTELEAEALLEDLLEDLELEDLDYNE EAR MKFSIIALALAVAFVCVAESRSEEEGYDVSEEIQAEELEEAER MKFSIIALALAVAFVCVAESRSEEEGYDVSEEIQAEELEEAAR MKYCVVILALLVALVCITESRSTETGYAVAETLEDNDLDELQAYLEEIAEASEMEDFS NIEEAR Сигнальные пептиды выделены курсивом. Мотивы PQM подчеркнуты. Длина, а.о. пре22 про40 22 22 36 39 22 22 22 21 21 42 27 Зрелый пептид соответствует С-терминальной части предшественника. Под действием протеаз зрелые цепи отделяются от пропоследовательностей. Сайты процессинга или мотивы созревания, определяющие протеолиз, получили название PQM и iPQM. Мотив PQM описывается формулой X1X2X3R, где любой Xn = E (Kozlov et al., 2006). Мотив iPQM является симметричной копией PQM. Предшественники латарцинов подразделяют на простые, двойные и сложные. Разделение основано на количестве мотивов ограниченного протеолиза и зрелых цепей. «Простые» предшественники латарцинов состоят из одного мотива PQM, имеют единственную зрелую цепь. «Двойные» предшественники - два мотива PQM и две зрелые цепи. «Сложные» предшественники содержат пять или шесть мотивов PQM и соответственно четыре или пять мотивов iPQM (Kozlov et al., 2006). Изучение посттрансляционных модификаций полипептидов из ядов пауков показало, что наиболее часто происходит C-концевое амидирование или отщепление положительно заряженных остатков. У латарцинов Ltc 3a, 3b, 4a, 4b и 5 было показано амидирование, а для Ltc 1 - удаление C-терминального остатка лизина (Kozlov et al., 2006). 1.1.5.2. Цито-инсектотоксины Цито-инсектотоксины – это новый уникальный класс пептидов, обнаруженных в яде паука Lachesana tarabaevi. Это линейные катионные пептиды, необычной длины (69-75 а.о.), проявляющие высокую антибактериальную и инсектицидную активности. В составе яда Lachesana tarabaevi было обнаружено 8 цито-инсектотоксинов CIT1a-h (таблица 7). Они имеют незначительное сходство с другими известными пептидами. В их последовательности не обнаружено остатков цистеина, в то время как лизин составляет около 30 % а.к. состава. Суммарный заряд при pH 7 составляет +14. В составе цито-инсектотоксинов >40% гидрофобных а.о. Такое распределение а.о. в составе пептида формирует амфипатичную структуру с выраженными заряженными и гидрофобными участками. Также были обнаружены близкие гомологи новых пептидов: CIT 1-6, 1-9, 1-10, 1-12 – 116. CIT1a является наиболее представленным цито-инсектотоксином в составе яда L. tarabaevi, поэтому его свойства были подробно изучены. По данным спектроскопии кругового дихроизма в водном растворе CIT1a имеет неупорядоченную структуру, а в растворе 50% трифторэтанола и мицелл детергентов склонен к образованию α-спирали (таблица 8). 28 Таблица 7. Аминокислотные последовательности цито-инсектотоксинов (Vassilevski et al., 2008). Масса, Да Пептид Аминокислотная последовательность CIT 1a CIT 1b CIT 1c CIT 1d CIT 1e CIT 1-6 CIT 1f CIT 1g CIT 1-9 CIT 1-10 CIT 1h CIT 1-12 CIT 1-13 CIT 1-14 GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKLMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYVLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGITKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKSDKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGIFKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKHYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYVLKHYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKTDKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKHYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYVLKHYGKKALQKVSEKL GFFGNAWKKIKGKAEKFFRKKAAKIIAKKEGITKEEAEAKVDTMSKKQIKVYLLKHYGKKALQKASEKL GFFGNAWKKIKGKAEKFFRKKAAKIIAKKEGITKEEAEAKVDPMSKKQIKVYLLKHYGKKALQKASEKL GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKHYGKKLFKKRPKNCDQ GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKLFKKRPKNCDQ GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKLMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYLLKYYGKKSSSKSVRKIVI SKSF GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIMVKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYVLKHYGKKSSSKSFRKIVI SKSF CIT 1-15 CIT 1-16 7905,6 7905,6 7891,6 7919,7 7921,6 7965,7 7879,6 7865,6 7909,6 7893,6 7885,5 7881,5 8269,1* 8295,1* 8571,4 8579,4 Пептиды, обнаруженные в яде, выделены жирным, наиболее представленные пептиды в яде подчеркнуты. Аминокислотные остатки, отличающиеся от последовательности CIT1a, выделены серым. *- свободная тиольная группа. Таблица 8. Вторичная структура CIT1a (Vassilevski et al., 2008). Раствор вода 50% ТФЭ 25 мМ SDS ДОФХ Содержание элементов вторичной структуры, % α-спираль β-структура β-изгиб клубок 13 14 24 49 69 3 7 21 66 3 8 23 55 5 14 26 ДОФХ – диолеоилфосфатидилхолин Биологическая активность исследовалась для химически синтезированного CIT1a. Он проявляет антибактериальную активность в микромолярных концентрациях (таблица 9). CIT1a обладает цитолитической активностью в отношении эритроцитов человека (ЭК 50 =6 мкM), лейкоцитов человека (ЭК50 =3 мкM), клеточной линии насекомых Sf9 (ЭК50 =1 мкM). Летальные дозы ЛД50 составляют для личинок мухи - 20 мкг/г, взрослой мухи - 5 мкг/г, для таракана ЛД50 = 500 мкг/г. Активность CIT1a была сопоставима с активностью химически синтезированного CIT1a в отношении B. subtilis, E. coli и личинок мухи (для других организмов нет данных). Цитоинсектотоксины также являются секретируемыми пептидами, синтезируемыми на рибосомах в виде препропептидов. Была определена предполагаемая структура 29 предшественников цито-инсектотоксинов. N-концевая часть предшественника соответствует сигнальному пептиду, С-концевая — зрелому пептиду. Препропептиды не содержат дополнительных остатков глицина. Они относятся к типу «простых» предшественников (один мотив PQM, одна зрелая цепь). Таблица 9. Антимикробная активность синтезированного CIT1a (Vassilevski et al., 2008). Микроорганизм МИК (мкМ) Грам-положительные Arthrobacter globiformis 0.5 Bacillus subtilis 0.9 Micrococcus luteus >30 Staphylococcus aureus >30 Грам-отрицательные Escherichia coli C600 0.5 Escherichia coli DH5α 0.9 Escherichia coli MH1 0.5 Pseudomonas aeruginosa 1.9 Pseudomonas fluorescens 3.8 Serratia marcescens >30 Необычная структура цито-инсектотоксинов может быть объяснена тем, что они, вероятно, образованы путем комбинации двух коротких линейных пептидов. Фрагменты, соответствующие 1–34 и 39–69 а.о., обладают характеристиками, свойственными коротким α-спиральным АМП. Их заряд составляет + 9 и + 7 при pH 7.0, также они образуют кластеры гидрофобных и заряженных а.о. Эти 2 фрагмента разделены между собой последовательностью EEAQ или EEAE (соответствует 35–38 а.о.). Данная последовательность напоминает сайт расщепления пропептида – мотив PQM - EEAR. Вероятно, произошла мутация в последовательности линкера, в результате чего два коротких пептида не разделяются, а находятся в составе одной пептидной цепи. Такая мутация могла закрепиться в ходе эволюции из-за наличия высокой биологической активности цитоинсектотоксинов. Принимая во внимание все достоинства АМП по сравнению с антибиотиками, остается проблема их цитотоксического действия на клетки эукариот. Решением для данной проблемы может являться использование системы регулирования экспрессии генов, кодирующих АМП. 30 1.2. Системы регуляции экспрессии генов Использование таких регуляторных генетических систем, которые можно «включать» и «выключать», помогает решить задачи, связанные с поддержанием определенного уровня экспрессии гена, а также избежать некоторых побочных эффектов, например, токсичности продукта. Для работы такой системы необходимо соблюдение определенных критериев: 1. уровень транскрипции в стадии активации должен превосходить ее базальный уровень; 2. индуктор должен быть биодоступным; 3. система не должна воздействовать на метаболические пути организма; 4. транскрипция должна быть быстро и полностью обратимой; 5. система должна четко реагировать на присутствие или отсутствие индуктора соответствующим включением или выключением экспрессии; 6. должна быть строгая взаимосвязь между дозой индуктора и уровнем экспрессии целевого гена; 7. активатор транскрипции должен вызывать минимальный иммунный ответ. Разработано несколько систем регуляции экспрессии гена in vivo, удовлетворяющих вышеописанным критериям. Это тетрациклиновая (Gossen and Bujard, 1992, Gossen et al., 1995), рапамициновая (Rivera et al., 1996) системы, а также системы, основанные на рецепторах стероидов млекопитающих (мифепристоновая и тамоксифеновая) (Roscilli et al., 2002, Vegeto et al., 1992) и насекомых (экдистероидная) (Karns et al., 2001, Palli et al., 2003). Все эти системы регуляции генной экспрессии были проверены in vitro и in vivo (Auricchio et al., 2002, Latta-Mahieu et al., 2002, Lebherz et al., 2005, Rivera et al., 2005, Stieger et al., 2007, Toniatti et al., 2004). 1.2.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой системы регуляции экспрессии Основной частью тетрациклин-зависимой системы регуляции является оперон устойчивости к тетрациклину Tn10 E. coli, содержащий последовательность, кодирующую тетрациклин-зависимый репрессор (TetR), и последовательность Tet оператора (TetO) (Wissmann et al., 1986). В отсутствие тетрациклина белок TetR присоединяется к последовательности TetO, при наличии индуктора TetR, изменяя свою конформацию, отсоединяется от ДНК (Orth et al., 1998). 31 На сегодняшний день разработано пять различных тетрациклин-чувствительных систем регуляции экспрессии, где основные элементы клонированы в составе двух экспрессирующих кассет (рисунок 6А). В первых двух системах транслируется TetR, слитый с белком– трансактиватором VP16 вируса простого герпеса (HSV). Система называется Tet-Off, если экспрессия происходит в отсутствие тетрациклина (рисунок 6Б), и Tet-On, если экспрессия гена происходит только в присутствии индуктора - тетрациклина (рисунок 6В). В третьей системе транслируемый TetR слит с белком-трансингибитором, Крупель-связывающим белком (KRAB, Krüppel-associated box) (Deuschle et al., 1995). Эта система сконструирована таким образом, что экспрессия гена идет только в присутствии тетрациклина (рисунок 6Г). Оставшиеся две системы были разработаны, чтобы уменьшить базальный уровень экспрессии. Это система, представляющая собой сочетание систем rTetR-VP16 и TetR-KRAB (рисунок 6Д), и система, включающая авторегуляторную петлю, в которой под контролем индуцибельного промотора экспрессируется трансактиватор (рисунок 6Е). Tet-Off (tTA, TetR-VP16) Химерный белок, состоящий из ДНК-связывающего домена TetR и трансактиваторного домена VP16, называется tTA (Tet-controlled transcriptional activator, тетрациклин-зависимый активатор транскрипции). TRE (Tet-responsive elements) - тетрациклин-чувствительные элементы, образованные путем слияния семи повторов последовательности TetO. Они слиты с последовательностью минимального промотора цитомегаловируса человека (PminCMV), формируя составной промотор PCMV-1. В отсутствие тетрациклина tTA связывается с TRE, активируя тем самым PCMV-1, что приводит, в конечном счете, к экспрессии гена (рисунок 6Б). В присутствии тетрациклина tTA изменяет свою конформацию, отсоединяется от последовательности TRE, в результате чего экспрессия гена прекращается. Для предотвращения возможного взаимодействия трансактиватора VP16 с другими клеточными промоторами, его последовательность была изменена до трех повторов 12 аминокислотных остатков каждый. Применение этой системы удобно в случае, когда ген должен экспрессироваться в течение продолжительного времени. Это связано с тем, что «выключение» транскрипции связано с добавлением тетрациклина, и последующее «включение» системы будет зависеть от кинетики выведения тетрациклина. 32 Рисунок 6. Схематическое изображение пяти различных тетрациклин-зависимых систем регуляции экспрессии генов. Адаптировано из (Stieger et al., 2009). А – две экспрессионные кассеты, лежащие в основе тетрациклин-зависимой системы регуляции экспрессии генов, Б – система Tet-Off (tTA, TetR-VP16), В – система Tet-On (rtTA, rTetR-VP16), Г – система KRAB Tet-On (tTS, TetR-KRAB), Д – комбинированная система Tet-On (rtTA и tTS), Е - авторегуляторная петля Tet-On–TetOff. Tet-On (rtTA, rTetR-VP16) Как было показано, при внесении четырех мутаций в TetR домен трансактиватора tTA изменяется характер взаимодействия белка с последовательностью TRE в зависимости от наличия тетрациклина (Gossen et al., 1995). В этом случае мутантный белок репрессор rTetR (reverse Tet repressor) связывается с последовательностью TRE в присутствии тетрациклина. Белок-трансактиватор rtTA состоит из доменов rTetR и VP16, система в этом случае является Tet-On системой. Это означает, что экспрессия гена происходит только в случае присутствия индуктора, тетрациклина (рисунок 6В). Следует отметить, что «включение» данной системы происходит гораздо быстрее, чем в описанной выше системе Tet-Off. Но здесь возникает ряд проблем, связанных с необходимой для индукции экспрессии концентрацией тетрациклина. Она может оказаться достаточно высокой. Для разрешения этого вопроса Urlinger с соавт. провели ряд экспериментов по проведению случайного мутагенеза и оптимизации кодонов, разработали серию различных трансактиваторов rtTA (Urlinger et al., 2000). Эта система была успешно отработана на 33 различных моделях, в том числе и на приматах (Favre et al., 2001, Latta-Mahieu et al., 2002, Stieger et al., 2007). KRAB Tet-On (tTS, TetR-KRAB) Чтобы уменьшить иммуногенность белка-трансактиватора, была разработана система KRAB Tet-On. В этой системе белок-репрессор TetR соединен с трансрепрессивным доменом KRAB человеческого белка с «цинковыми пальцами» Kox1, образуя трансингибитор TetRKRAB (или tTS) (Bellefroid et al., 1991, Margolin et al., 1994). Белки с «цинковыми пальцами» являются регуляторными белками, а их KRAB домен ингибирует РНК-полимеразы II и III в районе 3000 оснований от их места связывания с ДНК. Составной промотор в системе TetRKRAB (PTetO-CMVlg) содержит последовательности TRE и промотор CMV, активация которого не требуется. Если тетрациклин отсутствует, то TetR-KRAB присоединяется к последовательности TRE, ингибируя активность промотора CMV. Если же тетрациклин присутствует, TetR-KRAB, отсоединяясь от TRE, запускает транскрипцию (рисунок 6Г). На сегодняшний день до конца неизвестен механизм, с помощью которого KRAB ингибирует генную экспрессию. Причинами могут служить локальное изменение структуры хроматина, локальное деацетилирование гистонов (Matsuda et al., 2001, Schultz et al., 2001, Sripathy et al., 2006). Скорее всего, данной системой ингибируются только интегрированные промоторы. Это предположение было успешно проверено in vitro на клеточных культурах и in vivo на мышах, используя лентивирусные векторы (Rossi et al., 1999, Wiznerowicz and Trono, 2003). Комбинированная система Tet-On (rtTA и tTS) Эта система была разработана, чтобы уменьшить базальный уровень транскрипции. Ген tTS клонировали вместе с трансактиватором, разделенным сайтом IRES (внутренний сайт посадки рибосомы, internal ribosomal entry site). Если тетрациклин отсутствует, rtTA отсоединен от последовательности TRE, а tTS закрепляется на ней и ингибирует фоновую экспрессию гена. В присутствии тетрациклина оба химерных белка изменяют свою конформацию, что в итоге приводит к экспрессии гена (рисунок 6Д). Эта система была использована в исследованиях in vivo, при этом наблюдался низкий уровень фоновой экспрессии, но максимальный уровень экспрессии гена в присутствии тетрациклина в комбинированной системе был неотличим от системы Tet-On. При применении данной системы возникает ряд вопросов, в частности, каким образом отразится на клетке синтез трех чужеродных белков, которые вовлечены в регуляцию экспрессии в данной системе. Также, клонирование элементов системы в составе одного вирусного вектора может оказаться невозможным из-за ограниченной емкости вектора. 34 Авторегуляторная петля Tet-On–TetOff Другой стратегией уменьшения фоновой экспрессии служит расположение трансгенов, трансактиватора и интересующего гена, под контролем составного Tet-индуцибельного промотора PCMV-1 (рисунок 6Е) (Haberman et al., 1998). В отсутствие индуктора rtTA не экспрессируется, как происходит в системе Tet-On. Индуцибельный промотор PCMV-1 не может взаимодействовать с rtTA, который экспрессируется конститутивно в независимости от наличия индуктора. Так как в данной системе первым экспрессируется rtTA, экспрессия трансгена будет идти дольше по времени. Авторегуляторная петля может также использоваться как Tet-Off система, если tTA расположен под контролем минимального промотора CMV (Fitzsimons et al., 2001). Данная система используется как в плазмидных, так и в вирусных векторах (Gould et al., 2000, Markusic et al., 2005). 1.2.2. Фармакология доксициклина Доксициклин (Dox) является полусинтетическим аналогом тетрациклина. Он более эффективен по сравнению с тетрациклином, поэтому может использоваться в качестве индуктора во всех вышеописанных системах. Основные способы применения доксициклина - пероральный или парэнтеральный. Время полужизни Dox в сыворотке крови составляет от 14 до 22 часов. Доксициклин обладает хорошей проникающей способностью для различные тканей, в том числе, для мозга. Показано, что максимальные концентрации Dox зафиксированы в печени, почках и пищеварительном тракте. Выведение препарата происходит преимущественно с калом и мочой (Agwuh and MacGowan, 2006). Доксициклин подавляет синтез бактериальных белков, при этом нарушается связь транспортных аминоацил-РНК с 30S субъединицей рибосомальной мембраны. Dox используется для лечения таких заболеваний как болезнь Лайма (Ljostad et al., 2008), малярия (Nosten et al., 2006), инфекции, вызванные Staphylococcus aureus (Powell and Wenzel, 2008). Побочные эффекты, вызванные длительным применением Dox, включают нефротоксичность и дозо-зависимую фоточувствительность. Dox может накапливаться в костях, приводя к замедлению их роста, и также в зубах. Если доза Dox составляет 40 мг/день, то такое применение не приводит к возникновению Dox-резистентных штаммов (Berman et al., 2007). Для предотвращения возникновения резистентных штаммов возможно использование 4-эпидоксициклина, метаболита Dox. Он не 35 обладает антимикробной активностью, но способен эффективно работать в качестве индуктора в вышеописанных системах регуляции экспрессии генов (Eger et al., 2004). 1.3. Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis Хламидии – большая группа грам-отрицательных микроорганизмов, отличающихся уникальным облигатным паразитизмом в эукариотических клетках. Семейство Chlamydiaceae состоит из 2 родов Chlamydia и Chlamydophila (Everett et al., 1999). Хламидии существуют в двух формах: метаболически неактивная - элементарные тельца (ЭТ), и репродуцирующаеся - ретикулярные тельца (РТ). Жизненный цикл проходит внутри особого включения, окруженного мембраной. Взаимодействие ЭТ с клеткой происходит в 2 этапа (Abdelrahman and Belland, 2005). На первом этапе имеет место обратимое электростатическое взаимодействие, затем следует необратимое взаимодействие с поверхностью клетки, образование включения (рисунок 7). Далее происходит дифференцировка ЭТ в метаболически активное неинфекционное РТ. Затем следует этап размножения РТ путем деления. Включение увеличивается в размере, занимая почти весь объем клетки. На поздних этапах развития инфекции происходит вторичная дифференцировка РТ в инфекционные ЭТ. Далее после лизиса клетки ЭТ оказывается во внешнем пространстве. Продолжительность жизненного цикла у различных представителей семейства Chlamydiaceae варьирует от 48 до 72 часов. Многие хламидийные инфекции характеризуются длительным или хроническим течением. При этом часто хламидии образуют атипичные включения, они представляет собой увеличенное в размере РТ, которое не делится и не проходит обратную дифференцировку в ЭТ, но в котором происходит репликация хромосомы. Для лечения хламидийной инфекции используют различные антибиотики. Но на сегодняшний день описано несколько случаев возникновения устойчивости C. trachomatis к антибиотикам. Mourad с соавт. продемонстрировал устойчивость хламидий к эритромицину (Mourad et al., 1980). Позднее были обнаружены изоляты C. trachomatis резистентные к тетрациклину, эти изоляты были устойчивы также к доксициклину, эритромицину, сульфонамиду и клиндамицину (Jones et al., 1990). Somani и соавт. описали три изолята C. trachomatis, проявляющих множественную лекарственную устойчивость, в том числе к доксициклину, азитромицину и офлоксацину (Somani et al., 2000). В связи с эти возникает необходимость в поиске новых альтернативных классов лекарственных препаратов в борьбе с хламидийной инфекцией. В качестве таковых могут выступать антимикробные пептиды. 36 Рисунок 7. Жизненный цикл хламидий (Abdelrahman and Belland, 2005). ЭТ – элементарные тельца, РТ – ретикулярные тельца. Цитоплазматическая мембрана клетки обозначена красным цветом. Рассмотрим более побробно действие АМП по отношению к микроорганизмам, вызывающим инфекции передающиеся половым путем. Протегрины проявляют антибактериальное действие и по отношению к Chlamydia trachomatis. В работе Yasin и соавторов было проведено сравнение влияния дефензина HNP-2 и протегрина PG-1 на элементарные тельца C. trachomatis серовар L2 (Yasin et al., 1996). PG-1 оказался более активным в сравнении с HNP-2, он проявлял свои свойства также к сероварам D и H C. trachomatis. В присутствии сыворотки активность протегрина не уменьшалась, как происходило в случае с дефензином. В другой работе Yasin и соавторы изучили влияние 48 различных АМП на Chlamydia trachomatis (Yasin et al., 2004). Пептиды, длиной 16-20 а.о., имели большую активность по сравнению с пептидами большего размера. Пептиды, имеющие оказывали такое же действие как и пептиды с -складчатую структуру, -спиральной структурой. Кольцевые мини- дефензины среднего размера проявляли меньшую активность против C. trachomatis. А энантиомеры пептидов имели антибактериальные свойства сопоставимые с нативными пептидами. В работе Chong-Cerrillo и соавторов было показано действие протегрина-1, RTD-1, криптдина-4 и индолицидина на C. trachomatis различных сероваров. Наибольшую активность 37 проявлял протегрин-1. Также авторы показали, что серовары L2 и Е более чувствительны по сравнению с сероваром MoPn к действию АМП (Chong-Cerrillo et al., 2003). Тот факт, что большую часть жизненного цикла хламидии находятся внутри включения (Abdelrahman and Belland, 2005), возможно, объясняет малое количество работ по изучению активности АМП в отношении данного патогена. Кроме того, показана активность АМП в отношении других микроорганизмов, вызывающих инфекции, передающиеся половым путем. Так, из 5 исследованных кателицидинподобных пептидов (Sambri et al., 2002) активностью против Treponema pallidum обладали только PG-1 и SMAP-29. Пептиды CRAMP, LL-37, BMAP-28 не проявляли антимикробного действия. Также была показано влияние протегринов (PG-1, -2, -3, -5) на Neisseria gonorrhoeae. Более того, PG-1 проявлял активность к антибиотикоустойчивым штаммам. Морфологические исследования подтвердили разрушение мембраны гонококков, обработанных протегринами (Qu et al., 1996). В работе Beven и Wroblewski показана активность десяти АМП в отношении представителей класса Mollicutes (Acholeplasma, Mycoplasma, Spiroplasma) (Beven and Wroblewski, 1997). Исследуемые пептиды приводили к изменению мембранного потенциала клеток, для спироплазм показано изменение подвижности и формы клеток при действии исследованных АМП. Также при исследовании различных АМП, богатых остатками лизина и лейцина, наиболее активны в отношении Mollicutes были пептиды длиной 15 аминокислотных остатков, имеющие заряд +5 (Beven et al., 2003). Также было исследовано влияние дефензинов человека hBD-1, -2 и -3 на Mycoplasma pneumoniae. Показано увеличение экспрессии hBD-2 в клетках плоского эпителия легких EBC1, индуцированных интерлейкином 1β, при инфицировании M.pneumoniae. (Kuwano et al., 2006). Для hBD-1 и hBD-3 такого эффекта не обнаружено. Таким образом, из обзора работ, посвященных изучению антихламидийной активности АМП, следует, что АМП могут стать весьма перспективными инструментами в борьбе с этим патогеном. Таким образом, в литературном обзоре приведена классификация АМП, описаны механизмы действия, применение АМП в медицине. Подробно описаны пептиды, которые обнаруженные в яде паука Lachesana tarabaevi, представляющем собой смесь уникальных по составу и функциям веществ. Изучение механизмов действия АМП на модели пептидов из яда 38 паука представляют собой большой научный и практический интерес. Особенно актуальным представляется возможность исследовать действие этих пептидов при их регулируемой экспрессии в инфицированной клетке. 39 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы 2.1.1. Штаммы E. coli DH5 (Invitrogen, США), генотип F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1, TOP10 (Invitrogen, США), генотип F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λJM110 (Stratagene, США), генотип rpsL (Strr) thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44 Δ(lac-proAB) [F´ traD36 proAB lacIqZΔM15] 2.1.2. Плазмидные векторы В процедурах клонирования и экспрессии использовали плазмидные векторы pGEMTeasy (Promega, США), pRc/CMV (Invitrogen, США), pTet-On (Clontech, США), pBI-EGFP (Clontech, США), pEGFP-N1 (Clontech, США), pEGFP-C1 (Clontech, США). 2.1.3. Реактивы и антибактериальные препараты В работе использовали реактивы фирм «Реахим» (Россия), «Merck» (США), «Sigma» (США), наборы для рестрикции, лигирования и ПЦР фирм «Fermentas» (Литва) и «Promega» (США), набор для термоциклического секвенирования Big DyeTM Terminator v.3.1 Cycle Sequencing «Applied Biosystem» (США), препарат для трансфекции эукариотических клеток SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Германия), Lipofectamine Transfection Reagent (Invitrogen, США), антибактериальные препараты канамицин, ампициллин, гентамицин (Россия), дрожжевой экстракт, бакто-триптон и бактоагар фирмы «Difco» (США), питательная среда ДМЕМ «Sigma» (США), сыворотка эмбрионов коров «HyClone» (США). Олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды были синтезированы в ООО НПФ ―Литех‖ фосфоамидитным методом на синтезаторе олигонуклеотидов ASM-800. 2.2. Методы 2.2.1. Реакция рестрикции Реакцию рестрикции плазмидной ДНК проводили в соотношении: 3 мкг плазмидной ДНК - 3 ед. эндонуклеаз рестрикции (Fermentas, Литва). Реакция проходила при 37 оС 2 часа в 40 буфере, рекомендованном производителем. Разделение продуктов реакции рестрикции осуществлялось при помощи горизонтального электрофореза в 1-1.5% агарозном геле. 2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Для постановки ПЦР использовали раствор дНТФ, буфер для ПЦР, деионизованную воду, Taq полимеразу (НПФ «Литех», Россия), 5 пмоль каждого праймера. Реакцию проводили согласно инструкции проихводителя. Детекцию продуктов ПЦР анализировали при помощи горизонтального электрофореза в 1-2% агарозном геле с последующим окрашиванием геля бромистым этидием (1.25 мкМ). 2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля Фрагменты ДНК в агарозном геле вырезали при длинноволновом ультрафиолетовом облучении с последующим выделением набором GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Фрагменты ДНК, длина которых свыше 3000 пн, центрифугировали 6000 g в течение 5 мин с использованием микроколонок со стеклянным фильтром. 2.2.4. Реакция лигирования Лигирование фрагментов ДНК проводили в соотношении: 0,5-1,5 мкг плазмидной ДНК 1 ед. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). Реакция лигирования проходила при 4оС в течение ночи в буфере, рекомендованном производителем. Для лигирования комплементарных олигонуклеотидов с целью получения непрерывного гена олигонуклеотиды, подвергшиеся отжигу, на первом этапе кинировали с импользованием 1 ед. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). Количество каждого олигонуклеотида при этом составляло 10 пмоль. 2.2.5. Конструирование векторов Конструирование рекомбинантной плазмиды pEGFP-C1-X Олигонуклеотиды были синтезированы в ООО НПФ «Литех» фосфоамидитным способом на автоматическом синтезаторе ASM-700 (BIOSSET, Россия). Последовательности, кодирующие гены пептидов, приведены в таблице 10. При конструировании олигонуклеотидов на 5’-концы были добавлены последовательности для узнавания эндонуклеазы рестрикции Bam HI. Олигонуклеотиды (100 нг) смешивали с 10 ед. Т4 полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва), инкубировали при 37 0С в течении 1 часа в буфере, рекомендованном производителем, 41 к смеси добавляли 1 мM ATP. Далее олигонуклеотиды смешивали, нагревали до 95 0С и медленно охлаждали до комнатной температуры. Таблица 10. Последовательности олигонуклеотидов, использованных для клонирования генов АМП. Название АМП CIT1a Ltc1 Ltc2 Ltc3a Ltc4b Ltc5 Последовательность праймера 5`→ 3` CIT1a1 gatcatgggtttcttcgggaatacgtggaagaaaattaagggcaaagctgataagattatg CIT1a2 ttaaagaaagcagtaaagattatggtaaagaaagaaggaatttccaaagaagaggcgcagg CIT1a3 caaaagtagatgcaatgtcaaagaaacaaattcgcctctatttactcaagt CIT1a4 attatggaaaaaaagctcttcaaaaagcgtccgaaaaattgtga CIT1a1-rev tgctttctttaacataatcttatcagctttgcccttaattttcttccacgtattcccgaagaaacccat CIT1a2-rev cattgcatctacttttgcctgcgcctcttctttggaaattccttctttctttaccataatctttac CIT1a3-rev gctttttttccataatacttgagtaaatagaggcgaatttgtttctttga CIT1a4-rev gatctcacaatttttcggacgctttttgaaga La91a gatcatgtccatgtggtccggcatgtggagaagaaagctgaagaagctgcgaaa La91b cgctttgaagaagaagctgaagggcgagtga La91c agctttcttctccacatgccggaccacatggacat La91d gatctcactcgcccttcagcttcttcttcaaagcgtttcgcagcttcttc La93a gatcatgggcctgttcggcaagctgatcaagaagtttggaagaaaggctatctcctac La93b gccgtgaagaaggctagaggaaagcactga La93c gatctcagtgctttcctctagccttcttcacggcgtaggagatagccttt La93d cttccaaacttcttgatcagcttgccgaacaggcccat Ltc3a1 gatcatgagctggaagagcatggccaagaagctgaaggagtacatggagaagctgaagcagcgggcctga Ltc3a2 gatctcaggcccgctgcttcagcttctccatgtactccttcagcttcttggccatgctcttccagctcat Ltc4b1 gatcatgagcctgaaggacaaggtgaagagcatgggcgagaagctgaag Ltc4b2 cagtacatccagacctggaaggccaagttctga Ltc4b3 atgctcttcaccttgtccttcaggctcat Ltc4b4 gatctcagaacttggccttccaggtctggatgtactgcttcagcttctcgccc Ltc51 gatcatgggcttcttcggcaagatgaaggagtacttcaagaagttcggcgccagcttc Ltc52 aagcggcggttcgccaacctgaagaagcggctgtga Ltc53 ttcttgaagtactccttcatcttgccgaagaagcccat Ltc54 gatctcacagccgcttcttcaggttggcgaaccgccgcttgaagctggcgccgaac Далее кинированные олигонуклеотиды клонировали в плазмидный вектор pEGFP–C1 по сайту рестрикции BamHI. Полученный таким образом вектор получил название pEGFP-C1-X, где X соответствует клонируемому гену АМП. Соответствие последовательностей целевым подтверждали при помощи определения их нуклеотидной последовательности. Конструирование рекомбинантной плазмиды pBI-EGFP-rtTA Фрагмент, содержащий ген, кодирующий трансактиваторный белок rtTA, нарабатовали с использованием праймеров rtTA1 5`-GCATCAGAGCAGATCTTACTGAGAG и rtTA2 5`- TTCCTTAGATCTTGAAAATCTCGCC, в состав которых введены сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции BglII, матрицей служил плазмидный вектор pTet-On, После 42 разделения продуктов ПЦР, полученный фрагмент выделяли из геля, затем обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII. Плазмидный вектор pBI-EGFP обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII. Вектор и фрагмент лигировали. Компетентные клекти E.coli трансформировали лишазной смесью. Конструирование рекомбинантной плазмиды pBI-rtTA-∆GFP Для удаления гена gfp вектор pBI-EGFP-rtTA обрабатывали эндонуклеазами рестрикции SalI и NotI. Далее, после препаративного разделения продуктов рестрикции в агарозном геле, к фрагменту вектора, не содержащего ген gfp, добавляли Т4 ДНК-полимеразу и фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli, смесь дНТФ и соответствующий буфер. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем добавляли Т4 ДНК-лигазу (Fermentas, Литва). Полученная рекомбинантная плазмида получила название pBI-rtTA-∆GFP. Конструирование рекомбинантных плазмид pBI-EGFP-rtTA-Х и pBI-rtTA-∆GFP-Х Вектор pEGFP-C1-X обрабатывали эндонуклеазами рестрикции SmaI и MluI. Полученный фрагмент содержал ген Х, кодирующий соответствующий АМП, и сигнал полиаденилирования из вируса SV40. Плазмидные векторы pBI-EGFP-rtTA и pBI-rtTA-∆GFP обрабатывали эндонуклеазами рестрикции PvuII и MluI. Вектор и фрагмент лигировали. Компетентные клекти E.coli трансформировали лишазной смесью. Векторы получили название pBI-EGFP-rtTA-Х и pBI-rtTA-∆GFP-Х, где Х - ген, кодирующий соответствующий АМП. 2.2.6. Культивирование клеток E. coli Клетки E. coli культивировали в жидких средах Luria-Bertani (LB) (1% NaCl, 1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта), SOB (2% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мM NaCl, 2,5 мM KCl), и на твердом LB-агаре (1% NaCl, 1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1,5% бакто-агара) с добавлением соответствующего антибиотика (100 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл канамицина). 2.2.7. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК Получение компетентных клеток E. coli штамма DH5α и трансформацию плазмидной ДНК проводили по методу Hanahan (Hanahan, 1983). Трансформацию клеток лигазной смесью проводили также, предварительно прогревая ее при 65ºС 10 мин. 43 2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом кипячения Ночную культуру E. coli лизировали в буфере, содержащем 8% сахарозу, 0,5% тритон X-100, 10 мМ Tris-HCl, 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8.0. К пробам добавляли лизоцим (0,8 мг/мл), перемешивали и инкубировали в кипящей водяной бане 40 сек. Далее клеточный осадок осаждали центрифугированием 14000 g в течение 15 мин. Супернатант инкубировали с 2 ед. РНКазы А при 37оС в течение 40 мин. Плазмидную ДНК осаждали 1/2 объема 30% ПЭГ-6000 в 1,5М NaCl, центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин. Затем осадок промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в воде. Концентрацию полученной плазмидной ДНК определяли с помощью гель- электрофореза в 1% агарозе с последующим окрашиванием бромистым этидием. 2.2.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса Ночную культуру E. coli, выращенную на среде LB (2 мл) с соответствующим антибиотиком, осаждали центрифугированием 60 сек. при 14000 g. Осадок тщательно суспендировали в 150 мкл буфера, содержащем 25 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА pH 8.0. Далее добавляли к клеткам 300 мкл свежеприготовленного лизирующего буфера (0,2 Н NaOH, 1% SDS), перемешивали переворачиванием. Затем добавляли 300 мкл нейтрализирующего раствора (3 М ацетат Na, 2 M уксусная кислота), перемешивали, после чего выдерживали на льду 5-7 мин. и центрифугировали 14000 g в течение 10 мин. Плазмидную ДНК осаждали 0,7 объема изопропанолом, центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин. Осадок промывали 70% этанолом с повторным центрифугированием, высушивали и растворяли в воде. Далее к раствору инкубировали с 2 ед. РНКазы А при 37оС в течение 40 мин. Концентрацию полученной плазмидной ДНК определяли с помощью гель- электрофореза в 1% агарозе с последующим окрашиванием бромистым этидием. 2.2.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК Нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК определяли при помощи набора для термоциклического секвенирования Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, США) на генетическом анализаторе ABI Prism 3730 xl DNA Analyser (Applied Biosystems, США). 2.2.11. Препаративное выделение плазмидной ДНК Плазмидную ДНК выделяли при помощи набора JetStar Plasmid Purification Maxi Kit (Genomed, Германия) согласно инструкции производителя. 44 2.2.12. Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФспектрофотометрия Химический синтез изучаемых пептидов был выполнен в лабораториях химии пептидов и рецепции нейропептидов в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Пептиды получали твердофазным синтезом путем наращивания цепи с С-концевого остатка, для временной защиты α-NH2-групп использовали флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc) (Chan and White, 2000). Пептиды были получены на синтезаторе пептидов Syro I(MultiSynTech GmbH, Германия). Спектр поглощения пептидов измеряли на спектрофотометре Shimadzu RF-5301PC (Kyoto, Япония). 2.2.13. Тестирование антимикробной активности пептидов на E.coli Антимикробной активности синтетических пептидов из яда паука L. tarabaevi определялив отношении E. coli штамм DH5α. Пептиды были предоставлены лабораторией нейрорецепторов и нейрорегуляторов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. МИК определяли методом серийных разведений, модифицируя методику (Wiegand et al., 2008). Клетки E. сoli культивировали в жидкой среде LB при 37°C и перемешивании со скоростью 220 об/мин в течение 18 ч. Полученные культуры разбавляли в 200 раз и выращивали до достижения экспоненциальной фазы роста (OD620 ~0,3–0,5). Полученную культуру разводили до концентрации клеток 105 колониеобразующих единиц в 1 мл. Затем 90 мкл клеток E. сoli переносили в лунку 96-луночного планшета, смешивали с 10 мкл раствора тестируемых пептидов (использовали серийные разведения пептидов). Контролем служила чистая среда LB, еще одним контролем - клетки с добавлением 10 мкл чистой воды. Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем оценивали изменение оптическую плотность при 620 нм. Каждый опыт проводили в трех независимых повторах. МИК - наименьшая концентрация вещества, которая вызывает подавление роста микроорганизмов. Для подсчета титра в КОЕ, аликвоты клеток высевали на твердый LB-агар. 2.2.14. Культивирование линий клеток млекопитающих Клетки линии McCoy (ATCC® CRL-1696™) выращивали в среде MEM (Invitrogen, США) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США), 1 г/л глюкозы, 2 мМ Lглутамина в атмосфере 5% CO2 при 37 0С. 45 Клетки HEK293 (ATCC® CRL-1573™) культивировали в среде ДМЕМ (Invitrogen, США) с 10% cыворотки эмбрионов коров (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 4,5 г/л глюкозы при 37 о С в атмосфере 5% CO2. 2.2.15. Культивирование штамма C. trachomatis В работе использовали штамм C. trachomatis D/UW-3/Cx (ATCC VR-885), значение МИК доксициклина для данного штамма составляет 0.08 мг/л. C. trachomatis культивировали в линии клеток McCoy в среде МЕМс добавлением 0.5% глюкозы, 10% сыворотки эмбрионов коровы, 25 мкг/мл ванкомицина, 25 мкг/мл гентамицина, 2.5 мкг/мл амфотерицина В, 1 мкг/мл циклогексимида. Заражение клеток McCoy проводили инокулятом, для которого через 48 часов после заражения образуется 20-50 включений в поле зрения (400-кратное увеличение). Заражение проводили центрифугированием при 900 g в течение часа, затем клетки McCoy инкубировали при 370С в течение 2 часов. Далее промывали клетки средой МЕМ, добавляли среду для роста и оставляли клетки при 370С на 48 часов. Элементарные тельца C. trachomatis очищали с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности урографина, согласно (Schachter and Wyrick, 1994). 2.2.16. Определение антихламидийной активности пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi Элементарные тельца C. trachomatis инкубировали с пептидами (концентрация пептида составляла 20, 100 и 200 мкМ) в течение 20 мин при 4°С. Затем данной смесью инфицировали линию клеток HEK293. Контролем инфицирования служили элементарные тельца, нкубированные в фосфатном буфере. 2.2.17. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) доксициклина на C. trachomatis Клетки McCoy высевали в 24-луночные планшеты (105 клеток/лунку), культивировали 24 часа при 370С в среде МЕМ (Invitrogen, США) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США) и 2 мМ L-глутамина. После заражения клеток добавляли культуральную среду, в состав которой входили двукратные разведения доксициклина (0,01–2 мкг/мл). Затем клетки культивировали еще 48 часов при 370С. Значение МИК - наименьшая концентрация доксициклина, при добавлении которой в клетках не идентифицировалось ни одного типичного хдамидийного включения. 46 2.2.18. Трансфекция клеток линии HEK293 Клетки линии HEK293 трансфицировали плазмидной ДНК, выделенной набором EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Германия), при помощи Lipofectamine Transfection Reagent (Invitrogen, США), SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Германия), согласно рекомендациям производителя. 2.2.19. Заражение линии клеток HEK293 C. trachomatis Клетки инокулировали элементарными тельцами C. trachomatis, центрифугировали при 900 g в течение 1 часа, и далее инкубировали при 37 °С в 5% CO2 в течение 1,5 часов. Затем надосадочную жидкость отбирали, заменяя свежей ростовой средой, содержащей 5% сыворотки эмбрионов коровы. Инфицированные клетки инкубировали при 37 °С в 5% CO2 в течение 48 часов. 2.2.20. Выявление включений C. trachomatis Идентификация C. trachomatis основана на выявлении включений, которые образуются в зараженных клетках. иммуннофлуоресценции. Хламидийные включения выявляли с помощью реакции прямой Для постановки реакции линию клеток фиксировали 4% параформальдегидом и обрабатывали антителами, специфичными к липоолигосахаридам (ЛОС) хламидий (ChlaMonoScreen-2; Nearmedic Plus, Москва, Россия), меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоционатом) или Alexa488 (Invitrogen, США). Клетки докрашивали флуоресцентным красителем Эвансом голубым. Готовые препараты линии клеток анализировали в эпифлуоресцентном микроскопе. Хламидийные включения видны как характерные включения ярко-зеленого цвета в цитоплазме клеток красного цвета. 2.2.21. Конфокальная микроскопия Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию проводили с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Eclipse E800 (Nikon, Япония) с аргоновым лазером (длина волны 488 нм) и гелий-неоновым лазером (длина волны 594 нм). Все полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop v 6.0 (Adobe Systems), ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/, http://www.imagej.ru/). Анализ экспрессии репортерных генов осуществляли через 24 часа после трансфекции с помощью конфокальной микроскопии. Клетки промывали раствором Хэнкса и фиксировали 4% параформальдегидом 10 минут. 47 2.2.22. Определение титра C. trachomatis Через 72 часа после заражения инфицированный монослой клеток разрушали с использованием стеклянных шариков, тщательно перемешивали и центрифугировали 1300 g 5 минут. Далее делали серию последовательных разведений супернатанта, которыми заражали новый монослой линии клеток. Через 24 часа оценивали образование хламидийных включений. Единицу, образующую включения, рассчитывали исходя из количества включений в одном поле зрения по следующей формуле: Единица, образующая включения (количество/мл) = Х * N * фактор разведения / V, где Х- количество включений в одном поле зрения, N - количество полей зрения, V – объем исследуемого образца, мл. Количество полей зрения рассчитывалось исходя из площади одного поля зрения и площади поверхности исследуемого образца. 2.2.23. Анализ жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста LIVE/DEAD (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В основе теста лежит флуоресценция кальцеина (calcein AM) и гомодимера этидия (EthD-1). Полианионный краситель кальцеин, флуоресцируя зеленым светом (длина волны возбуждения/излучения ~495 нм/~515 нм), является индикатором активности внутриклеточной эстеразы. EthD-1 проникает через поврежденную мембрану и связывается с нуклеиновыми кислотами, флуоресцируя красным светом (длина волны возбуждения/излучения ~495 нм/ ~635 нм). 2.2.24. Выделение суммарной РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis Выделение РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis, осуществляли с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) следууя рекомендациям производителя. Полученный образец РНК освобождали от примеси ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы I (Fermentas, Литва). Реакция проходила при 37˚С в течение 30 мин в буфере, рекомендованном производителем, с добавлением 20 единиц ингибитора рибонуклеаз. 48 2.2.25. Реакция обратной транскрипции Денатурацию РНК и отжиг праймеров проводилив соотношении 1мкг РНК и 20 пмоль специфического праймера Un 5`-AGAACAATCAAGGGTCCCCAAACTC при 70˚С в течение 10 мин. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Далее пробирки охлаждали во льду.. Пробу смещивали с 200 ед. M-MLV обратной траскриптазы (Promega, США), 20 ед. ингибитора рибонуклеаз, 1 мM dATP, dCTP, dTTP и dGTP. Реакцию проводили в буфере, рекомендованном производителем, при 42˚С в течение часа. Затем смесь прогревали при 5 мин 95˚С. 2.2.26. Транскрипционный анализ Транскрипционный анализ был выполнен ЗАО «Геноаналитика» (г. Москва, Россия). Суммарную РНК из клеток выделяли с помощью TRIZOL (Invitrogen, США), согласно рекомендациям производителя. Выход и чистоту полученной тотальной РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Целостность РНК в препарате определяли при помощи индекса целостности РНК (RIN) с использованием анализатора Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США). 200 нг суммарной РНК амплифицировали с помощью Illumina® TotalPrep™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Гибридизацию контрольных и опытных образцов проводили на чипах WG-6 версии 2 (Illumina, США), согласно рекомендациям производителя. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения BeadStudio (Illumina, США). Анализ онтологии генов был выполнен при помощи программного обеспечения WebGestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) (Zhang et al., 2005). 2.2.27. Протеомный анализ Подготовка проб Трансфицированные клетки промывали раствором Хенкса (Биолот, Россия), затем снимали 0,05% раствором трипсина (Sigma, США). Клетки осаждали центрифугированием при 130g в течение 10 мин, затем снова промывали раствором Хенкса (трижды). Осадок (около 10мкл) суспендировали в 100 мкл буфера следующего состава: 8 М мочевина (GE Healthcare, США), 2 М тиомочевина (GE Healthcare, США), 10 мМ Tris-HCl (GE Healthcare, США), 167 мкл раствора 30 % СHAPS (GE Healthcare, США) и 10 % NP 40, рН 8.0, вода для хроматографии (Merck, Германия). Далее образцы центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин. Концентрацию белков в образце определяли с использованием набора Quick start Bradford (Bio- 49 Rad, США), следуя инструкции производителя. Все образцы доводили до концентрации белка 2 мг/мл. После чего пробы окрашивали флюоресцентными метками CyDye-DIGE Cy3 (GE Healthcare, США) и CyDye-DIGE Cy5 (GE Healthcare, США), согласно инструкции производителя, в соотнощении 400 пМ метки для 50 мкг общего белка. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 40С в темноте, реакцию останавливали 10 мМ раствора лизина. Далее проводили одномерный электрофорез в 12% ПААГ для проверки эффективности окрашивания. Перед изоэлектрофокусировкой образцы смешивали в эквимолярном соотношении, к пробам добавляли DTT (GE Healthcare, США) (до 80 мМ) и амфолины 3-10 (GE Healthcare, США) (до 0,2%). Двумерный электрофорез Изоэлектрофокусировку проводили в стеклянных 18-сантиметровых трубочках в 4% ПААГ: 8 М мочевина, 4 % акриламид/метиленбисакриламид, 2 % амфолины рН 3 - 10, 4 % амфолины рН 5 - 8, 6 % р-ра, содержащего 30 % CHAPS и 10 % NP 40, 0.1 % ТЕМЕД, 0,02 % персульфат аммония, при условиях: 100 В – 200 В – 300 В – 400 В – 500 В – 600 В в течение 45 мин, 700 В – в течение 10 часов, 900 В – 1 часа. Далее трубочки в течение 30 мин уравновешивали в буфере следующего состава: 6 М мочевина, 30 % глицерин, 62.5 мМ TrisHCl, pH 6.8, 2 % додецилсульфат натрия, 20 мМ ДТТ, бромфеноловый синий. Далее трубочки переносили на поверхность градиентного полиакриламидного геля (9-16%) длиной 20 см, закрепляя при помощи 0,9 % агарозы с бромфеноловым синим. Электрофорез проводили в трис-глициновом буфере при охлаждении в условиях из расчета 20 мА на стекло в течение 20 мин, 40 мА на стекло - 2 часа, 35 мА на стекло - 2,5 часа при охлаждении камеры до 100С. Сканирование полученных гелей проводили на приборе Typhoon Trio Imager (GE Healthcare, США) при разрешении 200 dpi. Для последующей идентификации белков гели окрашивали серебром. Изображения анализировали при помощи программного обеспечения PDQuest (Bio-Rad, США). Масс-спектрометрический анализ Интересующие полосы из геля вырезали и измельчали до фрагментов размером 1 1 мм. В пробирки помещали по 1-2 фрагмента, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 150 мкл раствора, в состав которого входили 40% метанол, 5% уксусная кислота. К осадку добавляли 150 мкл Н2О и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости к осадку добавляли 150 мкл раствора 50% ацетонитрил, 50 мM NH4HCO3. Пробы инкубировали 20 мин при 56 С; при необходимости данную процедуру повторяли. К осадку инкубировали со 150 мкл ацетонитрила 10 мин при комнатной 50 температуре, затем высушивали в течение 30 минут в вакуумном эксикаторе. Сухие фрагментым геля смешивали с трипсином (10 нг/мкл) в растворе, состав которого: 20 мM NH4HCO3, 50 мкМ ДТТ, в соотношении 1-1,5 мкл на фрагмент геля. Пробы инкубировали 10 мин при 5 С, затем добавляли Н2О в соотношении 1-1,5 мкл на фрагмент геля, далее выдерживали 15 часов при 37 С. Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку, высушивали при 56 С в течение 30 мин, ресуспендировали в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Смешивали на мишени 0,5 мкл полученного образца с равным объемом раствора 2,5-дигидроксибензоевой кислоты (20 мг/мл, 20% ацетонитрил, 0,1% трифторуксусная кислота), высушивали на воздухе. Массспектрометрию проводили на приборе MALDI-TOF Reflex IV (Bruker Daltonies, Германия), УФ лазер – 336 нм, в режиме положительных ионов, c использованием отражателя. Идентификация белков производилась методом пептидного фингерпринта с использованием программного пакета Mascot 2.1.0 (Matrix Science, Великобритания). Работа была выполнена в лаборатории протеомного анализа ФГБУН НИИ физикохимической медицины ФМБА России. 2.2.28. Дополнительное программное обеспечение Для работы с нуклеотидными последовательностями использовали программу Vector NTI (InforMax Inc, США). Также в работе использовали материалы базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 2.2.29. Статистика Анализ данных проводили на основе стандартных методов статистической обработки данных с оценкой достоверности различий по критерию Стьюдента для единичных сравнений, для множественных сравнений – дисперсионный анализ (ANOVA- ―Analysis of variance‖). Различия между значениями считали достоверно значимыми при p<0.05 51 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi Как известно, яды пауков представляют собой смесь цитолитических пептидов, ферментов, аминов, дисульфид-содержащих нейротоксинов. Эти вещества являются уникальными средствами защиты и нападения, выработанными в ходе эволюции. Объектом нашего исследования явились антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi. Выбранные пептиды и их физико-химические характеристики представлены в таблице 11. Таблица 11. Антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi. Название пептида Номер в Uniprot Аминокислотная последовательность Ltc3a Ltc4b Q1ELU3 GFFGNTWKKIKGKADKIMLKKAVKIM VKKEGISKEEAQAKVDAMSKKQIRLYL LKYYGKKALQKASEKL SWKSMAKKLKEYMEKLKQRA Q1ELU4 SLKDKVKSMGEKLKQYIQTWKAKF Ltc5 Q1ELU9 Ltc1 Ltc2 Q1ELT9 Q1ELU1 CIT1a P85253 GFFGKMKEYFKKFGASFKRRFANLKK RL SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGE GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Длина Масса (Да) Заряд 69 7905 14 21 2482 5 25 2881 5 29 3431 9 25 26 2903 3074 9 9 Латарцины (Lachesana tarabaevi) — это короткие (до 30 а.о.), линейные, катионные (pI>10), амфифильные пептиды, склонные к формированию α-спирали. Их заряд при нейтральном pH колеблется от +5 до +9. CIT1a относится к уникальному классу пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi цито-инсектотоксинам. Это линейный катионный пептид необычной длины – 69 а.о.. В его последовательности не обнаружено остатков цистеина, в то время как лизин составляет около 30 % а.к. состава. Суммарный заряд при pH 7 составляет +14. 3.2. Антибактериальная активность пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на E. coli in vitro На первом этапе нами была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi для E. сoli (штамм DH5α). Результаты представлены в таблице 12. 52 Таблица 12. МИК АМП из яда паука Lachesana tarabaevi для E. сoli (штамм DH5α). Название пептида МИК (мкМ) CIT1a 1 Ltc1 1 Ltc2 0,5 Ltc3a 2,5 Ltc4b 4,5 Ltc5 0,5 Как видно из полученных данных, антимикробная активность пептидов по отношению к E. сoli различна. Наиболее активными оказались пептиды Ltc2 и Ltc5, для них МИК составляет 0,5 мкМ. Наименьшей активностью среди выбранных пептидов обладал Ltc4b (МИК 4,5 мкМ). 3.3. Антимикробный эффект латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a на C. trachomatis Далее нами было изучено влияние синтетических АМП из яда паука L. tarabaevi на C. trachomatis. Для этого элементарные тельца C. trachomatis инкубировали с пептидом 20 мин при 4 0С с последующим инфецированием линии клеток HEK293. Пептиды добавляли в концентрации 20, 100 и 200 мкМ. Затем подсчитывали количество образовавшихся включений C. trachomatis (таблица 13). Таблица 13. Антимикробное действие пептидов из яда паука L. tarabaevi на C. trachomatis. Концентрация Количество включений в поле зрения пептида (увеличение х400) CIT1a Ltc1 Ltc2 Ltc3a 20 мкМ 32.5±1.6 31.8±1.6 33.1±0.9 30.2±0.9 100 мкМ 18.5±1.4* 24.2±1.1* 35.5±1.3 30.8±1.1 200 мкМ 21.1±0.5* 25.0±0.9* 29.8±0.9 30.4±1.2 * - достоверность отличий по сравнению с контролем, Р<0,05 Ltc5 27.8±0.6 27.5±0.5* 26.7±0.9* Контроль 34.2±2,3 При инкубации пептидов с элементарными тельцами C. trachomatis ингибирующий эффект был различен. Значительное подавление инфекции наблюдалось при концентрации пептида 100 мкМ. При увеличении концентрации до 200 мкМ изменения уровня ингибирования инфекции не происходило. Среди исследуемых пептидов наибольшей антихламидийной активностью обладал цито-инсектотоксин CIT1a (количество включений уменьшалось в 1,8 раз по сравнению с 53 контролем), наименьшей – пептид Ltc2, для которого значения практически не отличались от контрольных. 3.4. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих гены латарцинов и цитоинсектотоксина CIT1a из яда паука Lachesana tarabaevi Большинство работ по изучению биологической активности антимикробных пептидов выполняются на основе химически синтезированных и очищенных препаратов пептидов. Однако их производство является дорогостоящим процессом. Кроме того, ограниченное использование АМП в медицине вызвано их цитотоксическим действием. Поэтому актуальной представляется задача исследовать возможность экспрессии генов, кодирующих антимикробные пептиды, непосредственно в инфицированной клетке. На первом этапе, на основе двух экспрессирующих векторов pBI-EGFP (Clontech) и pTetOn (Clontech) был получен вектор pBI-EGFP-rtTA (рисунок 8). Фрагмент, содержащий ген, кодирующий трансактиваторный белок rtTA, получали при помощи ПЦР, матрицей служил плазмидный вектор pTet-On. Далее фрагмент клонировали в плазмидный вектор pBI-EGFP по сайту рестрикции BglII. Полученная конструкция позволяет регулировать экспрессию двух генов – gfp и целевого гена, за счет работы разнонаправленных промоторов, имеющих общий регуляторный элемент. Тетрациклин-чувствительный элемент TRE (Tet-responsive elements) расположен между двумя минимальными промоторами цитомегаловируса человека (PminCMV) и состоит из семи повторов Tet оператора (TetO). Белок-трансактиватор rtTA, состоящий из ДНК-связывающего домена rTetR и трансактиваторного домена VP16, в присутствии доксициклина связывается с тетрациклин-чувствительным элементом TRE, активируя PminCMV, что приводит к экспрессии целевого гена и гена gfp. Гены, кодирующие АМП из яда пауков, были клонированы в экспрессирующий вектор по следующей схеме. На первом этапе синтетические олигонуклеотиды, последовательности которых соответствовали последовательностям генов АМП, были клонированы в плазмидный вектор pEGFP–C1 (рисунок 9). Вектор получил название pEGFP-C1-X, где X соответствует клонируемому гену латарцина или цито-инсектотоксина CIT1a. Для исследования активности АМП при их экспрессии в клетках, инфицированных C. trachomatis, были получены конструкции с делетированным геном gfp. Необходимость этого была обусловлена тем, что идентификация хламидийных включений проводится при помощи метода прямой иммунофлуоресценции антителами, специфичными к ЛОС (липоолигосахариды) хламидий, меченых FITC, спектр флуоресценции которого совпадает со спектром GFP. 54 Рисунок 8. Схема получения вектора pBI-EGFP-rtTA. PCMV – ранний промотор цитомегаловируса человека, CMV min promoter – минимальный ранний промотор цитомегаловируса человека, egfp – green fluorescent protein (ген зеленого флуоресцирующего белка), TRE – тетрациклин-зависимый элемент, AmpR - ген устойчивости к ампициллину, SV40 poly(A) – сигнал полиаденилирования из вируса SV40, (r)TetR – последовательность из тетрациклинового оперона транспозона Tn10 E.coli, VP16AD – активаторный домен белка VP16 вируса простого герпеса, rtTA – ген, кодирующий белок-трансактиватор rtTA, ColEI ori – точка начала репликации в E.coli. Для этого сначала был получен вектор pBI-rtTA-∆GFP, где ген gfp удалялся из pBIEGFP-rtTA путем обработки эндонуклеазами рестрикции SalI и NotI (рисунок 10). На следующем этапе фрагмент вектора pEGFP-C1-X, который содержит ген Х, кодирующий исследуемый АМП, и сигнал полиаденилирования SV40 polyA, клонировали в экспрессирующие векторы pBI-EGFP-rtTA и pBI-rtTA-∆GFP (рисунок 11). 55 Рисунок 9. Схема получения вектора pEGFP-C1-X, где X – ген, кодирующий латарцины или цито-инсектотоксин CIT1a из яда паука, Kan/NeoR - ген устойчивости к канамицину/неомицину. Обозначения регуляторных элементов соответствуют рисунку 8. Рисунок 10. Схема получения вектора pBI-rtTA-∆GFP. Вектор pBI-rtTA-∆GFP не содержит гена gfp. Обозначения регуляторных элементов см. рисунок 8. 56 Рисунок 11. Схема получения векторов pBI-EGFP-rtTA-Х и pBI-rtTA-∆GFP-Х. Вектор pBI-EGFP-rtTA-Х содержит ген, кодирующий исследуемый АМП из яда паука, и ген gfp, вектор pBI-rtTA-∆GFP-Х – только ген, кодирующий соответствующий АМП из яда паука. Обозначения регуляторных элементов см. рисунок 8, 9. В результате были получены векторы для точной регуляции экспрессии генов, кодирующих выбранные пептиды. Ген, кодирующий латарцин или цито-инсектотоксин CIT1a, и ген gfp экспрессируются в системе векторов pBI-EGFP-rtTA-Х, вектор pBI-rtTA-∆GFP-Х содержит ген, кодирующий соответствующий АМП из яда паука, и не содержит ген gfp. 57 3.5. Регуляция экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках млекопитающих На следующем этапе, для проверки работоспособности полученных плазмидных векторов проводили трансфекцию клеток линии HEK293 полученными конструкциями, pBIEGFP-rtTA-Х. Контролем служили нетрансфицированные клетки. Через 5 часов после трансфекции проводили индукцию экспрессии генов, кодирующих латарцины и цитоинсектотоксин CIT1a, доксициклином (0,002-2 мкг/мл). В случае эффективной работы системы регулируемой экспрессии генов, при ее индукции доксициклином должна происходить транскрипция как gfp, так и исследуемого гена. На рисунке 12 показана флуоресценция GFP в клетках линии HEK293 через 24 часа после трансфекции вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a. Контролем служили нетрансфицированные клетки HEK293. Рисунок 12. Экспрессия генов gfp и cit1a в клетках линии HEK293, трансфицированных вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a. Концентрация индуктора - 0,02 мкг/мл. Далее из трансфицированных клеток HEK293 была выделена суммарная РНК. Затем проведена реакция обратной транскрипции с использованием специфичных праймеров для последовательности, кодирующей исследуемый ген АМП. Полученная кДНК использовалась в качестве матрицы при постановке ПЦР. На рисунке 13 показана электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР клеток линии HEK293 при экспрессии в них гена cit1a. Аналогичные результаты были получены при экспрессии всех исследуемых генов АМП. Для оценки цитотоксичности АМП при экспрессии кодирующих их генов в линии клеток HEK293 использовали различные концентрации индуктора - доксициклина (0,02, 0,2 и 2 мкг/мл). Через 24 часа после трансфекции оценивали жизнеспособность клеток с использованием набора LIVE/DEAD (Invitrogen, США) методом флуоресцентной микроскопии. Даже в случае концентрации доксициклина 2 мкг/мл не наблюдалось токсического воздействия на клетки по сравнению с контролем. Количество жизнеспособных клеток при этом составляло 58 >95%. Контролем служили нетрансфицированные клетки HEK293. Результаты для CIT1a представлены на рисунке 14. Количество живых клеток при экспрессии генов, кодирующих латарцины, составляло 95-99% по сравнению с контролем. Рисунок 13. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР клеток линии HEK293 при экспрессии в них гена cit1a. 1 – отрицательный контроль ПЦР (матрица — кДНК нетрансфицированных клеток HEK293); 2 – отрицательный контроль ПЦР (без обратной транскриптазы); 3 – ОТ-ПЦР анализ РНК, выделенной из трансфицированной вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a линии клеток HEK293; 4 – положительный контроль ПЦР (матрица - плазмидная ДНК pBI-EGFP-rtTA-CIT1a, содержащая ген cit1a; М – маркер молекулярной массы (DNA Ladder Mix; Thermo Scientific). Рисунок 14. Анализ цитотоксического эффекта CIT1a при его экспрессии в клетках линии HEK293 через 24 час после трансфекции. Для оценки жизнеспособности клеток использовали набор LIVE/DEAD (Invitrogen, США). Концентраций доксициклина - 0,02, 0,2 и 2 мкг/мл, контроль - нетрансфицированные клетки HEK293 Поскольку МИК доксициклина для C. trachomatis D/UW-3/Cx составляет 0,08 мкг/мл, для дальнейших экспериментов по изучению влияния экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, на развитие хламидийной инфекции мы использовали концентрацию индуктора 0,002 мкг/мл. 59 3.6. Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293 На следующем этапе работы была изучена антихламидийная активность АМП из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293, инфицированных C. trachomatis. Клетки линии HEK293 трансфицировали плазмидными векторами, содержащими гены, кодирующие исследуемые АМП из яда паука, и не содержащими ген gfp — pBI-rtTA-∆GFP-Х, где х — ген исслудемого АМП. В качестве контроля клетки трансфицировали тем же вектором, индуктор в среду не добавляли. Через 24 часа после трансфекции клетки HEK293 инфицировали элементарными тельцами C. trachomatis серовара D. Спустя 24 часа после заражения проводили оценку влияния экспрессии гена, кодирующего антимикробный пептид, на рост C. trachomatis в линии клеток HEK293 по образованию характерных включений. Идентификация включений проводилась с использованием прямой реакции иммуннофлуоресцентного окрашивания антителами, специфичными к ЛОС хламидий. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания трансфицированных линий клеток представлены на рисунке 15. Рисунок 15. Экспрессия генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках линии HEK293 подавляет инфекцию C. trachomatis. А. Микрофотографии иммунофлуоресцентного анализа клеток линии HEK293 при экспрессии в них генов АМП из яда паука, зараженных C. trachomatis. Включения C. trachomatis окрашены антителами, специфичными к ЛОС хламидий, мечеными FITC (зеленая флуоресценция), 60 цитоплазма клеток - красным. Контроль – клетки, трансфицированные тем же вектором, доксициклин в среду не добавляли. Б. Процент ингибирования образования хламидийных включений в клетках HEK293 при экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a относительно контроля. Из полученных данных видно, что при экспрессии генов, кодирующих АМП из яда паука, в линии клеток HEK293 наблюдается значительное подавление развития хламидийной инфекции, по сравнению с контролем. Наибольший антихламидийный эффект наблюдался при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, ингибирование развития инфекции по сравнению с контролем превышало 85%. В случае с другими пептидами, за исключением латарцина Ltc5, эффективность подавления инфекции колебалась в диапазоне 60-70 %. 3.7. Транскриптомный анализ клеток линии HEK293 при экспрессии гена цитоинсектотоксина cit1a Механизм действия АМП при их экспрессии внутри клетки остается неизвестным. Для того чтобы выяснить, каким именно образом клетка реагирует на экспрессию гена cit1a на уровне транскрипции, на следующем этапе работы был проведен транскриптомный анализ трансфицированных вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a клеток линии HEK293. Индукцию экспрессии гена cit1a проводили добавлением доскициклина до конечной концентрации 0,002 мкг/мл. Контролем служили клетки, трансфицированные исходным вектором pBI-EGFP-rtTA. При анализе транскриптомного профиля было обнаружено 44 дифференциально экспрессирующихся гена. Экспрессия 33 из них понижалась, 11 – повышалась по сравнению с контролем (таблица 14). Таблица 14 . Дифференциально экспрессирующиеся гены клеток HEK293, трансфицированной вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a. Ген ACCESSION определение Уровень экспрессии понижается Homo sapiens actin, alpha 1, skeletal ACTA1 NM_001100.3 muscle (ACTA1), mRNA. Homo sapiens activating transcription factor ATF3 NM_001040619.1 3 (ATF3), transcript variant 4, mRNA. Homo sapiens ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit E (ATP5I), nuclear gene encoding ATP5I NM_007100.2 mitochondrial protein, mRNA. Homo sapiens bolA homolog 2 (E. coli) BOLA2 NM_001031827.1 (BOLA2), mRNA. отношение опыт/ контроль 0,09 0,29 0,33 0,39 61 C7ORF40 NR_003697.1 COX7B NM_001866.2 DDIT3 NM_004083.4 EGR1 NM_001964.2 HIST1H2BD NM_138720.1 HIST1H2BD NM_138720.1 HIST1H4H NM_003543.3 HIST2H4A NM_003548.2 HSD17B10 IL8 NM_004493.2 NM_000584.2 LOC1001300 70 LOC1001302 91 XM_001723889.1 XR_038455.1 LOC391019 XR_019605.1 LOC401317 XM_379479.3 LOC644928 NM_001093732.1 LOC647302 XR_019555.1 MYH3 NM_002470.2 PPP1R15A NM_014330.2 RN5S9 NR_023371.1 RNU1-3 NR_004408.1 RNU1-5 NR_004400.1 RNU1A3 NR_004430.1 RNU1G2 NR_004426.1 RNY4 NR_004393.1 RPL14 NM_001034996.1 Homo sapiens chromosome 7 open reading frame 40 (C7orf40), non-coding RNA. Homo sapiens cytochrome c oxidase subunit VIIb (COX7B), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA. Homo sapiens DNA-damage-inducible transcript 3 (DDIT3), mRNA. Homo sapiens early growth response 1 (EGR1), mRNA. Homo sapiens histone cluster 1, H2bd (HIST1H2BD), transcript variant 2, mRNA. Homo sapiens histone cluster 1, H2bd (HIST1H2BD), transcript variant 2, mRNA. Homo sapiens histone cluster 1, H4h (HIST1H4H), mRNA. Homo sapiens histone cluster 2, H4a (HIST2H4A), mRNA. Homo sapiens hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 (HSD17B10), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA. Homo sapiens interleukin 8 (IL8), mRNA. PREDICTED: Homo sapiens similar to metallopanstimulin (LOC100130070), mRNA. PREDICTED: Homo sapiens misc_RNA (LOC100130291), miscRNA. PREDICTED: Homo sapiens misc_RNA (LOC391019), miscRNA. PREDICTED: Homo sapiens hypothetical LOC401317 (LOC401317), mRNA. Homo sapiens hCG2033311 (LOC644928), mRNA. PREDICTED: Homo sapiens misc_RNA (LOC647302), miscRNA. Homo sapiens myosin, heavy chain 3, skeletal muscle, embryonic (MYH3), mRNA. Homo sapiens protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15A (PPP1R15A), mRNA. Homo sapiens RNA, 5S ribosomal 9 (RN5S9), ribosomal RNA. Homo sapiens RNA, U1 small nuclear 3 (RNU1-3), small nuclear RNA. Homo sapiens RNA, U1 small nuclear 5 (RNU1-5), small nuclear RNA. Homo sapiens RNA, U1A3 small nuclear (RNU1A3), small nuclear RNA. Homo sapiens RNA, U1G2 small nuclear (RNU1G2), small nuclear RNA. Homo sapiens RNA, Ro-associated Y4 (RNY4), small cytoplasmic RNA. Homo sapiens ribosomal protein L14 (RPL14), transcript variant 1, mRNA. 0,40 0,44 0,29 0,18 0,14 0,19 0,15 0,17 0,40 0,12 0,35 0,23 0,28 0,26 0,38 0,35 0,16 0,21 0,11 0,22 0,19 0,25 0,19 0,13 0,27 62 Homo sapiens small nucleolar RNA host gene 9 (non-protein coding) (SNHG9), nonSNHG9 NR_003142.2 coding RNA. Homo sapiens small nucleolar RNA, H/ACA SNORA63 NR_002586.1 box 63 (SNORA63), small nucleolar RNA. Homo sapiens small nuclear ribonucleoprotein polypeptide F (SNRPF), SNRPF NM_003095.2 mRNA. Homo sapiens zinc finger, CCHC domain ZCCHC12 NM_173798.2 containing 12 (ZCCHC12), mRNA. Уровень экспрессии повышается Homo sapiens actin, gamma 1 (ACTG1), ACTG1 NM_001614.2 mRNA. Homo sapiens CDK5 regulatory subunit associated protein 3 (CDK5RAP3), CDK5RAP3 NM_176095.1 transcript variant 1, mRNA. Homo sapiens FK506 binding protein 14, 22 FKBP14 NM_017946.2 kDa (FKBP14), mRNA. LOC1001338 PREDICTED: Homo sapiens similar to 40 XM_001714384.1 hCG1994151 (LOC100133840), mRNA. PREDICTED: Homo sapiens hypothetical LOC1001342 protein LOC100134241 (LOC100134241), 41 XM_001717424.1 mRNA. PREDICTED: Homo sapiens similar to LOC1001346 hCG2024106, transcript variant 2 48 XM_001724681.1 (LOC100134648), mRNA. PREDICTED: Homo sapiens similar to Eukaryotic translation initiation factor 4H (eIF-4H) (Williams-Beuren syndrome chromosome region 1 protein homolog), LOC653994 XM_944429.1 transcript variant 2 (LOC653994), mRNA. Homo sapiens minichromosome maintenance complex component 7 MCM7 NM_005916.3 (MCM7), transcript variant 1, mRNA. Homo sapiens microspherule protein 1 MCRS1 NM_006337.3 (MCRS1), transcript variant 1, mRNA. Homo sapiens stromal cell derived factor 4 SDF4 NM_016176.2 (SDF4), mRNA. Homo sapiens splicing factor 3a, subunit 2, SF3A2 NM_007165.4 66kDa (SF3A2), mRNA. Анализ онтологии генов был выполнен при помощи 0,30 0,08 0,41 0,26 3,74 3,85 2,85 3,55 6,21 3,00 7,93 6,01 5,14 4,87 3,14 WebGestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/). Среди 44 дифференциально экспрессирующихся генов 18 были классифицированы согласно онтологии генов (рисунок 16). 63 Рисунок 16. Распределение дифференциально экспрессирующихся генов линии клеток HEK293, трансфицированной вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a, в сравнении с контролем по функциональным категориям онтологии генов. A – гистограмма «молекулярный механизм/функция», Б – гистограмма «биологический процесс», В – гистограмма «клеточный компонент». Затем данные 18 генов были объединены по 3 главным категориям – биологический процесс, клеточный компонент, молекулярный механизм – согласно стандартам онтологии генов и в 35 субкатегорий. 3.8. Протеомный анализ линии клеток HEK293 при экспрессии гена, кодирующего цитоинсектотоксин CIT1a На следующем этапе работы был выполнен протеомный анализ линии клеток HEK293, трансфицированной плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a. Индукцию экспрессии гена cit1a проводили добавлением доскициклина, концентрация 0,002 мкг/мл. В качестве контроля 64 клетки трансфицировали вектором pBI-EGFP-rtTA. Полученные данные дифференциально экспрессирующихся белков представлены на рисунке 17, в таблице 15. В клетках линии HEK293, трансфицированных плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTACIT1a, обнаружено 49 дифференциально нарабатывающихся белков. Рисунок 17. 2D-электрофореграмма дифференциально нарабатывающихся белков в линии клеток HEK293 при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a. Экстрагированные белки из контрольных клеток были окрашены флуоресцентным красителем Cy5 (красная флуоресценция). Белки, выделенные из трансфицированной pBI-EGFP-rtTA-CIT1a линии клеток, окрашены флуоресцентным красителем Cy3 (зеленая флуоресценция). Таблица 15. Протеомное профилирование линии клеток HEK293, трансфицированных вектором pBI-EGFPrtTA-CIT1a (опыт) по сравнению с контрольным образцом клеток (контроль). Название белка Myosin light polypeptide 6 OS=Homo sapiens GN=MYL6 PE=1 SV=2 Lactoylglutathione lyase OS=Homo sapiens GN=GLO1 PE=1 SV=4 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 OS=Homo sapiens GN=HNRNPH3 PE=1 SV=2 Heterogeneous nuclear Контроль (красный) CIT1а (зеленый) Отношение опыт/ контроль 525560,9 655948,94 1,24 1150349,6 1430413,63 1,24 803495,38 1053866.63 775555,86 1145403,50 1,31 1,47 65 ribonucleoprotein A/B OS=Homo sapiens GN=HNRNPAB PE=1 SV=2 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H OS=Homo sapiens GN=HNRNPH1 PE=1 SV=4 Tubulin alpha-1A chain OS=Homo sapiens GN=TUBA1A PE=1 SV=1 Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal OS=Homo sapiens GN=KRT2 PE=1 SV=2 Cytoskeleton-associated protein 4 OS=Homo sapiens GN=CKAP4 PE=1 SV=2 Unhealthy ribosome biogenesis protein 2 homolog OS=Homo sapiens GN=URB2 PE=1 SV=2 Methionyl-tRNA formyltransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=MTFMT PE=2 SV=2 Pancreatic lipase-related protein 3 OS=Homo sapiens GN=PNLIPRP3 PE=2 SV=2 Uncharacterized protein C9orf66 OS=Homo sapiens GN=C9orf66 PE=2 SV=1 Mixture 1 Glutathione S-transferase P OS=Homo sapiens GN=GSTP1 PE=1 SV=2 ADP-ribosylation factor-like protein 15 OS=Homo sapiens GN=ARL15 PE=1 SV=1 Chordin OS=Homo sapiens GN=CHRD PE=1 SV=2 14-3-3 protein epsilon OS=Homo sapiens GN=YWHAE PE=1 SV=1 191637,14 263428,53 1,38 841762,00 1610087,60 1,91 886967,63 1046923,56 1,2 977040,25 1,77 550702,50 279491,72 478690,00 321659,75 447458,75 1,4 1073783,75 1376649,25 1,28 414289,90 642091,81 1,55 1349899,00 1,20 1116758,88 1,59 3644585,00 3,09 561893,50 3,24 629291,88 1,14 2517399,25 1,3 1055876,50 1,86 1019583,88 1,55 1145146,25 702102,19 1176856,55 Neurofilament medium polypeptide 173058,70 OS=Homo sapiens GN=NEFM PE=1 SV=3 Brain-specific angiogenesis inhibitor 1associated protein 2-like protein 1 554420,00 OS=Homo sapiens GN=BAIAP2L1 PE=1 SV=2 GTP-binding protein Rhes OS=Homo 1933852,75 sapiens GN=RASD2 PE=1 SV=1 Golgi SNAP receptor complex member 566544,71 1 OS=Homo sapiens GN=GOSR1 PE=1 SV=1 Transitional endoplasmic reticulum 659691,19 ATPase OS=Homo sapiens GN=VCP 1,71 66 PE=1 SV=4 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABAT PE=1 SV=3 Laminin subunit alpha-2 OS=Homo sapiens GN=LAMA2 PE=1 SV=4 Kinesin-like protein KIF17 OS=Homo sapiens GN=KIF17 PE=1 SV=3 Peroxiredoxin-2 OS=Homo sapiens GN=PRDX2 PE=1 SV=5 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-2 OS=Homo sapiens GN=CHRNA2 PE=1 SV=2 NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFV2 PE=1 SV=2 Annexin A5 OS=Homo sapiens GN=ANXA5 PE=1 SV=2 Cyclin-G1 OS=Homo sapiens GN=CCNG1 PE=1 SV=2 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase OS=Homo sapiens GN=FUT6 PE=1 SV=1 Mixture 1 Putative ankyrin repeat domaincontaining protein 30B-like OS=Homo sapiens GN=ANKRD30BL PE=2 SV=3 Serine--pyruvate aminotransferase OS=Homo sapiens GN=AGXT PE=1 SV=1 Centromere protein F OS=Homo sapiens GN=CENPF PE=1 SV=2 Migration and invasion-inhibitory protein OS=Homo sapiens GN=MIIP PE=1 SV=3 Cat eye syndrome critical region protein 5 OS=Homo sapiens GN=CECR5 PE=1 SV=1 Heat shock 70 kDa protein 1A/1B OS=Homo sapiens GN=HSPA1A PE=1 SV=5 Zinc finger protein 57 homolog OS=Homo sapiens GN=ZFP57 PE=1 SV=2 Hypoxia up-regulated protein 1 OS=Homo sapiens GN=HYOU1 PE=1 SV=1 Parvalbumin alpha OS=Homo sapiens 175314,72 318637,13 1,82 248564,03 1,19 1133975,38 1,55 1159913,05 1,63 1349899,00 1,20 1116758,88 1,59 302120,78 696512,63 2,3 724510,75 829722,00 1,35 1310959,88 1,54 211233,92 729707,75 711603,10 1145146,25 702102,19 850532,31 803495,38 554420,00 775555,86 566544,71 279491,72 668107,75 729707,75 5902019,00 1053866.63 1,31 629291,88 1,14 1145403,50 1,47 1055876,50 1,86 478690,00 1,71 847742,81 1,27 1133975,38 1,55 16349006,00 2,77 67 GN=PVALB PE=1 SV=2 Alpha-soluble NSF attachment protein OS=Homo sapiens GN=NAPA PE=1 SV=3 Adenylate kinase isoenzyme 5 OS=Homo sapiens GN=AK5 PE=1 SV=2 Chloride intracellular channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=CLIC1 PE=1 SV=4 Ornithine aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OAT PE=1 SV=1 Protein disulfide-isomerase A3 OS=Homo sapiens GN=PDIA3 PE=1 SV=4 Immunity-related GTPase family Q protein OS=Homo sapiens GN=IRGQ PE=1 SV=1 NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFS1 Vimentin OS=Homo sapiens GN=VIM PE=1 SV=4 405305,93 238415,25 0,59 1151955,63 1,22 561893,50 3,24 539036,50 1188160,25 2,2 598056,75 812234,44 1,36 175560,69 201177,64 1,15 2308345,75 2923986,75 1,27 16349006,00 2,77 947098,38 173058,70 5902019,00 3.9. Влияние экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a на ингибирование инфекции C. trachomatis на разных фазах жизненного цикла Мы показали, что экспрессия генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в линии клеток HEK293 ингибирует развитие инфекции C. trachomatis. Однако остается неясным, на какой именно стадии жизненного цикла хламидии происходит подавление ее роста. В эксперименте по изучению влияния экспрессии гена cit1a в клетках линии HEK293 на развитие хламидийной инфекции мы проводили трансфекцию клеток плазмидой, через 5 часов в культуральную среду добавляли индуктор. Далее через 24 часа проводили заражение клеток C. trachomatis. Таким образом, заражение хламидиями происходило на фоне перманентной экспрессии гена cit1a. Для изучения влияния экспрессии гена cit1a на раннюю стадию развития C. trachomatis также проводили трансфекцию клеток, затем через 5 часов заражали клетки ЭТ. Индуктор экспрессии гена cit1a добавляли через 1 час после инфицирования клеток хламидиями. Для данной схемы было использовано 2 контроля: 1) нетрансфицированная линия клеток, в которую спустя 1 час после заражения добавлялся доксициклин до конечной концентрации 0,002 мкг/мл; 2) линия клеток HEK293, которую трансфицировали тем же 68 вектором, что и в опытном образце, но без добавления доксициклина после заражения. Далее, через 48 часов после инфицирования проводили оценку ингибирования развития C. trachomatis с помощью прямой реакции иммунофлуоресцентного окрашивания. Через 72 часа после инфицирования определяли титр дочерних ЭТ C. trachomatis. Для этого клетки HEK293 заражали материалом, полученным через 72 часа после первичного заражения линии клеток. Схема эксперимента представлена на рисунке 18. Рисунок 18. Схема экспериментов по изучению влияния экспрессии гена, кодирующего CIT1a, в линии клеток HEK293 на развитие хламидийной инфекции на разных фазах жизненного цикла C. trachomatis. Из полученных нами данных видно, что включения, образовавшиеся после индукции экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, через 1 час после заражения, имеют атипичную форму и размер (рисунок 19). Подсчет хламидийных включений показал, что при индукции экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 через 1 час после заражения клеток элементарными тельцами наблюдается подавление развития инфекции C. trachomatis в трансфицированных клетках. Как видно из графика, представленного на рисунке 20, концентрация доксициклина не влияет на развитие хламидийной инфекции. Для изучения влияния экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 на среднюю стадию развития хламидийной инфекции индукция экспрессии генов осуществлялась через 16 часов после заражения. В остальном схема эксперимента не отличалась от схемы по изучению влияния экспрессии cit1a на раннюю стадию инфекции (рисунок 18, 3). 69 Рисунок 19. Микрофотография линии клеток HEK293 при индукции экспрессии в них гена, кодирующего цито-инсектотоксина CIT1a, через 1 час после заражения ЭТ C. trachomatis. Заражение ЭТ клеток HEK293 проведено через 5 часов после трансфекции вектором pBI-rtTA∆GFP- CIT1a. Клетки HEK293 окрашены антителами, специфичными к ЛОС хламидий, мечеными FITC. Цитоплазма клеток окрашена красным цветом, включения — зеленым. Стрелками показаны аберрантные (CIT1a+/Dox+) и нормально развивающиеся хламидийные включения (увеличение х600). Результаты определения титра дочерних ЭТ при индукции экспрессии гена cit1a через 16 часов после заражения представлены на рисунке 21. В этом случае мы наблюдали некоторое снижение титра дочерних ЭТ, но отличия являлись статистически недостоверными в сравнении с контролем. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что 70 индукция экспрессии гена cit1a во время средней фазы жизненного цикла C. trachomatis не приводит к ингибированию ее дальнейшего развития. Рисунок 20. Эффект экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 на раннюю стадию развития хламидийной инфекции. Определение титра дочерних ЭТ. CIT1a (-), Dox 0,002 мкг/мл — контроль — нетрансфицированные клетки HEK293, через 1 час после заражения добавляли индуктор в концентрации 0,002 мкг/мл, CIT1a, Dox (-) - клетки, трансфицированные вектором pBI-rtTA-∆GFP-CIT1a, индуктор не добавлялся, CIT1a, Dox 0,002 мкг/мл — клетки, трансфицированные вектором pBI-rtTA-∆GFP-CIT1a, концентрация индуктора 0,002 мкг/мл. Рисунок 21. Эффект экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 на среднюю стадию развития хламидийной инфекции. Определение титра дочерних ЭТ.. CIT1a (-), Dox 0,002 мкг/мл — контроль — нетрансфицированные клетки, через 16 часов после заражения добавляли индуктор в концентрации 0,002 мкг/мл, CIT1a, Dox (-) - клетки, трансфицированные вектором pBI-rtTA-∆GFP-CIT1a индуктор не добавлялся, CIT1a, Dox 0,002 мкг/мл - трансфицированные вектором pBI-rtTA-∆GFP-CIT1a, концентрация индуктора 0,002 мкг/мл. 71 Таким образом, при анализе влияния экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a из яда паука L. tarabaevi, в линии клеток HEK293 на разные фазы жизненного цикла C. trachomatis мы показали, что наиболее эффективное подавление развития патогена происходит на ранней стадии инфекции, т.е. стадии образования незрелого включения. 72 4. ОБСУЖДЕНИЕ Использование антибиотиков приводит к росту резистентных штаммов патогенных микроорганизмов. В настоящее время проблема антибиотико-резистентности представляет угрозу национальной безопасности в развитых странах. Антимикробные пептиды могут стать новыми противомикробными агентами при лечении различных инфекционных заболеваний. Антимикробные пептиды являются частью древнейших защитных систем живых организмов. За последние годы изучено большое количество АМП, охарактеризованы их свойства и функции. На данный момент описано более 2000 АМП (aps.unmc.edu/AP/main.php), обнаруженных у самых разнообразных организмов. Так, пептиды выделены из растений, грибов, беспозвоночных, позвоночных животных, включая человека (Tossi et al., 2000). Среди всего многообразия данного класса соединений особое внимание привлекают АМП из ядов членистоногих, служащие одновременно средствами защиты и нападения (Mebs, 2002). Состав яда членистоногих представлен цитолитическими пептидами, ферментами, дисульфидсодержащими нейротоксинами, а также низкомолекулярными соединениями. В нашей работе мы остановили свой выбор на пептидах из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi (таблица 11). В составе яда среднеазиатского паука обнаруживается широкое разнообразие компонентов, отобранных в ходе эволюции. В яде присутствуют одновременно большое количество как гомологичных, так и различающихся по структуре АМП и нейротоксинов. При этом биосинтез этих компонентов яда происходит сходным образом. Препроучастки в молекулах предшественников консервативны, а зрелые пептиды отличаются значительной вариабельностью (Vassilevski et al., 2009). В яде Lachesana tarabaevi представлены уникальные по составу АМП, в число которых входит группа латарцинов. Латарцины — это короткие (до 30 а.о.), линейные, катионные (pI>10) и амфифильные пептиды. В водном растворе они имеют неупорядоченную структуру, а в мембранном окружении склонны к образованию α-спирали (Kozlov et al., 2006). Их заряд при нейтральном pH колеблется от +5 до +9. Также среди пептидов из яда Lachesana tarabaevi следует отметить особый уникальный класс пептидов - цито-инсектотоксины. К ним относятся линейные катионные пептиды необычной длины – 69 а.о. (Vassilevski et al., 2008), в последовательности которых не обнаружено остатков цистеина, в то время как лизин составляет около 30% аминокислотного состава. Суммарный заряд при pH 7 составляет +14. Этот необычный класс АМП появился, по всей видимости, благодаря мутации, приведшей к невозможности разделения двух коротких линейных пептидов из молекулы предшественника. 73 До сих пор не описано универсального механизма взаимодействия АМП с про- и эукариотическими клетками. В настоящее время существует несколько моделей воздействия пептида на клетку: модель тороидальных пор, модель «ковра» и модель «доска-бочка» (Jenssen et al., 2006). Для всех моделей предполагается, что на первом этапе имеет место электростатическое взаимодействие положительно заряженного пептида и отрицательно заряженной мембраны клетки. Амфипатичная природа АМП предполагает эффективное взаимодействие их с молекулами липидов в составе мембраны. При достижении определенного молярного соотношения пептид/липид, пептиды ориентируются перпендикулярно поверхности мембраны. После этого происходит образование поры в мембране согласно одной из моделей действия АМП на клетку. В независимости от реализуемого механизма образования поры, это приводит к нарушению целостности плазматической мембраны и, как следствие, дальнейшей гибели клетки. Ранее была продемонстрирована высокая антимикробная и цитолитическая активность исследуемых нами пептидов на различных организмах, таких как грамположительные (Arthrobacter globiformis, Bacillus subtilis) и грамотрицательные бактерии (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), дрожжи; гемолитическая активность — на эритроцитах кролика и человека (Kozlov et al., 2006). Диапазон активных концентраций для пептидов колебался в пределах 0,5–16 мкМ для разных микроорганизмов. Значения МИК наиболее активных пептидов для E. coli (таблица 12) составляет 0,5 мкМ (латарцины Ltc2 и Ltc5). Наименьшая активность среди латарцинов наблюдается у пептида Ltc4b, его МИК - 4,5 мкМ. Данные по антимикробной активности пептидов из яда Lachesana tarabaevi согласуются с общепринятым механизмом действия АМП, а именно с нарушением целостности мембраны клетки посредством образования поры и последующим лизисом клетки. Наибольшей гемолитической активностью обладали пептиды Ltc2, Ltc 5 и CIT1a. Важно отметить, что значения концентраций, вызывающих 50% лизис эритроцитов, для пептидов из яда паука выше, чем для мелиттина. При анализе инсектицидной активности пептидов из яда паука было показано, что цито-инсектотоксин CIT1a в 20 раз активнее по отношению к линии клеток насекомых Sf9 в сравнении с латарцином Ltc 2a (Vassilevski et al., 2008). При анализе токсического действия пептидов на лабораторных мышах активность CIT1a и Ltc 2a была сопоставима, а при действии пептидов на насекомых цито-инсектотоксин CIT1a проявлял значительно большую активность по сравнению с латарцинами. Высокая активность цитоинсектотоксинов в отношении насекомых и обусловила название данного класса пептидов из яда Lachesana tarabaevi. 74 Известно, что некоторые АМП, в частности, мелиттин, способны вызывать аллергические реакции у человека. В то же время не было найдено каких-либо совпадений при сравнении аминокислотной последовательности CIT1a с последовательностями в базе данных аллергенов (http://www.allergome.org). низкой токсичностью Высокая антибактериальная активность совместно с цито-инсектотоксина CIT1a для клеток эукариот делает его привлекательным агентом в борьбе с внутриклеточными инфекциями. Внутриклеточный патоген C. trachomatis вызывает такие серьезные заболевания, передающиеся половым путем, как уретриты, цервициты, сальпингиты, также может приводить к бесплодию. Общепринятым средством борьбы с развитием хламидийной инфекции являются антибиотики. Однако уже описан ряд случаев возникновения устойчивости к различным антибиотикам у C. trachomatis (Jones et al., 1990, Mourad et al., 1980, Somani et al., 2000). Альтернативой антибиотикам в лечении инфекции, вызванной C. trachomatis, могут служить АМП. Ранее была продемонстрирована антихламидийная активность мелиттина из яда пчелы Apis mellifera (Lazarev et al., 2002, Lazarev et al., 2005). Однако мелиттин обладает сильной гемолитической активностью, а также может являться аллергеном, что делает возможность его использования в качестве лекарственного препарата не очевидной. Принимая во внимание вышесказанное, а также высокую антибактериальную активность исследуемых АМП из яда Lachesana tarabaevi, мы протестировали антихламидийное действие химически синтезированных пептидов. Для этого после инкубации элементарных телец (ЭТ) хламидий с выбранными пептидами проводили заражение линии клеток HEK293 и затем оценивали антихламидийную активность по числу образовавшихся включений. Концентрации пептида составляли 20, 100 и 200 мкМ, контроль — ЭТ в фосфатном буфере. Ингибирующий эффект пептидов на развитие C. trachomatis наблюдался при концентрации 100 мкМ. При этом наибольшей антихламидийной активностью обладал цито-инсектотоксин CIT1a (таблица 13), наименьшей – латарцин Ltc2, количество включений, образовавшихся после взаимодействия ЭТ с этим пептидом, практически не отличалось от контроля. Важно отметить, что при увеличении концентрации пептида до 200 мкМ антихламидийная активность исследуемых АМП не усиливалась. Полученные нами данные по противохламидийной активности исследуемых АМП сопоставимы с ранними результатами, полученными Yasin с соавторами в 1996 г. В этой работе авторы показали ингибирование C. trachomatis при взаимодействии патогена с протегрином и дефензином (Yasin et al., 1996). При этом протегрин был в 20 раз более активным по отношению к C. trachomatis по сравнению с дефензином человека, но значения МИК пептидов для хламидий значительно превосходили МИК для других грамотрицательных организмов. Высокие значения МИК для хламидий, возможно, обусловлены 75 особенностями строения мембраны микроорганизма. Метаболически неактивное, но инфекционное ЭТ хламидии окружено наружной мембраной, состоящей из множества сшитых дисульфидными связями белковых компонентов, главную часть которых составляют цистеинбогатые белки - MOMP, OmpA, OmcB, и OmcA (Abdelrahman and Belland, 2005, Hatch et al., 1984, Newhall and Jones, 1983, Newhall, 1987). Подобное строение мембраны определяет структурную жесткость элементарного тельца, что препятствует взаимодействию пептида с хламидиями, образуя дополнительный барьер для образования пор в мембране патогена. С учетом особенностей строения и жизненного цикла C. trachomatis, мы предположили, что перспективным для терапии этой инфекции с помощью АМП может быть использование не химически синтезированных пептидов, а регулируемая экспрессия генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, непосредственно в инфицированных клетках. Для проверки этого предположения нами были получены плазмидные векторы для регулируемой экспрессии генов, кодирующих АМП из яда паука L. tarabaevi в эукариотических клетках. Известно, что АМП обладают цитолитическим действием по отношению к эукариотическим клеткам, что может вызвать ограничение использования АМП в практике. Одним из решений для данной проблемы - уменьшения цитотоксического эффекта, является использование системы регулируемой экспрессии генов. В своей работе мы использовали тетрациклин-зависимую систему регуляции экспрессии генов (Stieger et al., 2009). В данной системе белок-трансактиватор rtTA связывается с последовательностью тетрациклин-зависимого элемента (TRE) в присутствии индуктора доксициклина, что приводит к активации транскрипции целевого гена. Белок-трансактиватор rtTA состоит из двух доменов: ДНК-связывающего домена (r)TetR – мутантного белкарепрессора и VP16AD – активаторного домена белка VP16 вируса простого герпеса. TRE находится между двумя идентичными минимальными промоторами цитомегаловируса человека PminCMV. На основе двух экспрессирующих векторов pBI-EGFP и pTet-On был получен вектор pBI-EGFP-rtTA (рисунок 8), несущий перечисленные регуляторные элементы, а также последовательность гена белка-трансактиватора rtTA. Под контролем минимальных промоторов цитомегаловируса человека находятся ген, кодирующий исследуемый нами пептид из яда паука, и репортерный ген gfp. При добавлении в среду культивирования доксициклина происходит активация транскрипции исследуемого гена и гена gfp. В результате были получены плазмидные векторы для всех исследуемых нами АМП из яда паука L. tarabaevi. Полученные векторы получили название pBI-EGFP-rtTA-Х, где Х— ген, кодирующий соответствующий АМП. 76 Далее, для проверки эффективности работы полученной системы регулируемой экспрессии генов проводили трансфекцию клеток линии HEK293. Линию клеток трансфицировали плазмидными векторами pBI-EGFP-rtTA-Х, через 5 часов после этого в культуральную среду добавляли индуктор - доксициклин до концентраций 0,002-2 мкг/мл. Контролем служили нетрансфицированные клетки. Если полученная система регулируемой экспрессии генов функциональна, то при добавлении в среду доксициклина должна активироваться транскрипция генов gfp и исследуемого АМП из яда паука. Таким образом, через 24 часа после трансфекции по флуоресценции GFP анализировали работу полученной системы регулируемой экспрессии генов (рисунок 12). Эффективность трансфекции составляла 85 ± 5%, даже при концентрации индуктора 0,002 мкг/мл наблюдалась флуоресценция GFP. Для подтверждения экспрессии генов, кодирующих пептиды из яда паука, в клетках линии HEK293 был проведен ОТ-ПЦР анализ трансфицированных клеток (рисунок 13), с использованием специфичных праймеров для последовательностей, кодирующих исследуемые гены АМП из яда паука L. tarabaevi. В результате анализа была продемонстрирована эффективная работа тетрациклинзависимой системы регуляции экспрессии генов. Также показано, что в трансфицированных линиях клеток HEK293 экспрессируются гены, кодирующие все исследуемые антимикробные пептиды (таблица 11). Известно, что АМП в силу особенностей механизма действия обладают токсическим эффектом и по отношению к эукариотическим клеткам (Kozlov et al., 2006). Для оценки цитотоксичности, наблюдаемой при экспрессии генов, кодирующих АМП из яда паука в линии клеток, проводили анализ жизнеспособности с использованием различных концентраций доксициклина: 0,02, 0,2 и 2 мкг/мл. Через 24 часа после трансфекции оценивали результат. Контролем служили нетрансфицированные клетки HEK293. Такой контроль позволяет оценить токсическое влияние продуктов экспрессии генов, а также воздействие трансфицирующих агентов на клетки. Количество жизнеспособных клеток не отличалось от контроля, составляло >95% (рисунок 14). Цитотоксический эффект не наблюдался даже при концентрации доксициклина 2 мкг/мл. На следующем этапе работы мы изучили влияние экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в линии клеток HEK293 на развитие хламидийной инфекции. Для этого были получены плазмидные векторы, аналогичные описанным выше, но с делетированным геном gfp Необходимость этого была обусловлена тем, что идентификация хламидийных включений проводится при помощи метода прямой иммунофлуоресценции антителами, специфичными к ЛОС хламидий, меченых FITC, спектр флуоресценции которого 77 совпадает со спектром GFP. Полученный вектор получил название pBI-rtTA-∆GFP-Х, где Х – ген, кодирующий соответствующий АМП из яда паука. Линию клеток HEK293 трансфицировали данными плазмидными векторами, спустя 5 часов добавляли индуктор, а через 24 часа после трансфекции клетки заражали ЭТ C. trachomatis. Подавление развития хламидийной инфекции в линии клеток анализировали через 24 часа после заражения клеток при помощи прямой реакции иммунофлуоресцентного окрашивания с антителами специфичными к ЛОС хламидий. Контролем были клетки, трансфицированные тем же вектором, доксициклин в среду не добавляли. Концентрация доксициклина в эксперименте составляла 0,02 мкг/мл, это обусловлено тем, что МИК доксициклина для C. trachomatis составляет 0,08 мкг/мл. Нами было установлено, что при экспрессии генов, кодирующих АМП из яда паука, в линии клеток HEK293 наблюдается значительное подавление развития хламидийной инфекции, по сравнению с контролем (рисунок 15). Ингибирующий эффект определялся как отношение количества включений, образовавшихся в клетках при экспрессии гена, кодирующего АМП, к количеству включений в контроле. Наибольший антихламидийный эффект наблюдался при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, ингибирование развития инфекции по сравнению с контролем превышало 85%. В случае с другими пептидами, за исключением латарцина Ltc5, эффективность подавления инфекции колебалась в диапазоне 60-70 %. Следует отметить, что при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, ингибирующий эффект был выше, чем при экспрессии гена, кодирующего мелиттина (~60%) (Lazarev et al., 2002). Таким образом, мы показали подавление развития хламидийной инфекции в линии клеток HEK293 при экспрессии исследуемых генов АМП и отсутствие, при этом, токсического эффекта экспрессии генов на клетки. Таким образом, мы продемонстрировали эффективность системы регулируемой экспрессии генов, кодирующих АМП из яда паука L. tarabaevi, на модели хламидийной инфекции в линии клеток HEK293, при этом не наблюдалось токсического эффекта экспрессии генов на клетки. Принимая во внимание высокую антихламидийную активность пептидов из яда паука при экспрессии кодирующих их генов в клетке, но при этом достаточно высокое значение МИК в экспериментах in vitro, на следующем этапе мы решили более полно изучить возможные механизмы подавления развития C. trachomatis. Дальнейшие эксперименты мы проводили с использованием пептида с наиболее выраженными антибактериальными свойствами – цитоинсектотоксина CIT1a. 78 Далее мы исследовали действие CIT1a при экспрессии кодирующего его гена в клетках линии HEK293 на разных стадиях развития C. trachomatis. C. trachomatis – это облигатный внутриклеточный микроорганизм с уникальным двухфазным жизненным циклом (Abdelrahman and Belland, 2005). Можно выделить несколько основных стадий развития хламидийной инфекции: - прикрепление и проникновение в эукариотическую клетку элементарного тельца хламидии и образование незрелого включения, перемещение включения в перинуклеарное пространство, 0-2 ч; - дифференциация инфекционных элементарных телец в метаболически активные ретикулярные тельца, их репликация, 2-30 ч; - обратная (вторичная) дифференциация ретикулярных телец в элементарные, их выход из клетки, 48-72 ч. В эксперименте по изучению влияния экспрессии гена cit1a в клетках линии HEK293 на развитие хламидийной инфекции мы проводили трансфекцию клеток плазмидой, через 5 часов в культуральную среду добавляли индуктор. Далее через 24 часа проводили заражение клеток C. trachomatis. Таким образом, заражение хламидиями происходило на фоне перманентной экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a. Для изучения влияния экспрессии гена cit1a на раннюю стадию развития C. trachomatis также проводили трансфекцию клеток HEK293 плазмидным вектором pBI-rtTA-∆GFP-CIT1a. Затем через 5 часов заражали клетки ЭТ. Индуктор экспрессии гена cit1a добавляли через 1 час после инфицирования клеток хламидиями. Для данной схемы было использовано 2 контроля: 1) нетрансфицированная линия клеток, в которую спустя 1 час после заражения добавлялся доксициклин до конечной концентрации 0,002 мкг/мл; 2) линия клеток HEK293, которую трансфицировали тем же вектором, что и в опытном образце, но без добавления доксициклина после заражения. Далее, через 48 часов после инфицирования проводили оценку ингибирования развития C. trachomatis с помощью прямой реакции иммунофлуоресцентного окрашивания. Через 72 часа после инфицирования определяли титр дочерних ЭТ C. trachomatis. Для этого клетки HEK293 заражали материалом, полученным через 72 часа после первичного заражения линии клеток. Схема эксперимента представлена на рисунке 18. В результате нам удалось продемонстрировать, что при индукции экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 через 1 час после заражения C. trachomatis происходит значительное подавление хламидийной инфекции (рисунок 20). Морфологический анализ подтвердил этот результат при помощи прямой реакции иммунофлуоресцентного окрашивания через 48 часов после заражения линии клеток HEK293. Хламидийные включения при этом имели атипичную 79 форму и размер (рисунок 19). Следовательно, ингибирование хламидийной инфекции при экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 происходит на этапе прикрепления ЭТ хламидий к поверхности клеток и сразу после проникновения патогена внутрь клетки. Чтобы проанализировать влияние экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, на среднюю фазу развития инфекции C. trachomatis, провели эксперимент согласно схеме 3 (рисунок 18). Так же как и в предыдущем варианте, через 5 часов после трансфекции линии клеток индуктор в культуральную среду не добавляли, а проводили заражение линии клеток ЭТ C. trachomatis. Доксициклин добавляли в культуральную среду только через 16 часов после заражения клеток. В данном случае использовали контроли подобно предыдущему варианту: 1) нетрансфицированная линия клеток, спустя 16 часов после заражения добавлялся доксициклин до концентрации 0,002 мкг/мл; 2) линию клеток HEK293 трансфицировали тем же вектором, что и в опытном образце, но доксициклин не добавлялся после заражения. Визуализацию включений, также как и в схеме 2 (рисунок 19), проводили через 48 часов после заражения, а спустя 24 часа (через 72 часа после заражения) определяли титр дочерних ЭТ хламидий. В данном случае также происходило снижение титра дочерних ЭТ, но данное снижение, по сравнению с контролем, оказалось статистически недостоверным (рисунок 21). Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что индукция экспрессии гена cit1a во время средней фазы жизненного цикла C. trachomatis не оказывает влияния не ее дальнейшее развитие. Таким образом, при анализе влияния экспрессии гена, кодирубщего цито-инсектотоксин CIT1a из яда паука L. tarabaevi, в линии клеток HEK293 на разные фазы жизненного цикла C. trachomatis мы показали, что наиболее эффективное подавление развития патогена происходит на ранней стадии инфекции, т.е. стадии образования незрелого включения. Остается до конца неясным, каким именно образом происходит ингибирование развития хламидийной инфекции в клетках HEK293 при экспрессии в них генов АМП. На следующем этапе мы провели сравнительные транскриптомный и протеомный анализы клеток HEK293, экспрессирующих ген cit1a. Для выполнения транскрипционного профилирования линию клеток трансфицировали плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a, индуктор, доксициклин, добавляли до концентрации 0,02 мкг/мл. Контрольным образцом были клетки, трансфицированные исходным вектором pBI-EGFP-rtTA. Анализ транскриптомного профиля клеток при экспрессии гена cit1a показал наличие 44 дифференциалльно экспрессирующихся генов. При этом экспрессия 33 из них понижалась, 11 – повышалась по сравнению с контролем (таблица 14). Среди 44 дифференциально экспрессирующихся генов 18 были классифицированы согласно онтологии генов (рисунок 16). Далее они были объединены по 3 80 главным категориям – биологический процесс, клеточный компонент, молекулярный механизм/функция – согласно стандартам онтологии генов и в 35 субкатегорий. Из полученного списка генов, уровень транскрипции которых изменяется, можно выделить следующие: acta1, actg1 (кодируют актин), myh3 (миозин), atp5I (кодирует субъединицу Е ATФ-синтазы), cox7b (субъединицу VIIb цитохром с-оксидазы), hsd17b10 (гидроксистероиддегидрогеназу), hist1h2bd, hist1h4h, hist2h4a (гистоны), поскольку продукты этих генов вовлечены в метаболические пути, обеспечивающие проникновение и образование включения при хламидийной инфекции. Для анализа дифференциально нарабатывающихся белков при экспрессии гена cit1a линию клеток HEK293 трансфицировали плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1а. Индукцию экспрессии проводили добавлением доскициклина до концентрации 0,02 мкг/мл. Контроль - клетки, трансфицированные исходным вектором pBI-EGFP-rtTA, не содержащем в своем составе последовательности гена, кодирующего CIT1a. Двумерный электрофорез с последующей идентификацией белков при помощи масс-спектрометрии показал наличие 49 дифференциально нарабатывающихся белков (рисунок 17, таблица 15). При анализе протеомного и транскриптомного профиля клеток при экспрессии в них гена cit1a практически не было обнаружено пересечения результатов, за исключением уровня транскрипции гена myh3 и, соответственно, белка миозина. Более того, нет данных, демонстрирующих прямое воздействие пептида на развитие хламидийной инфекции. Из чего мы сделали предположение, что некоторые дифференциально экспрессирующиеся гены опосредованно влияют на развитие патогена. Одним из ключевых этапов развития хламидий является прикрепление и проникновение в эукариотическую клетку. Davis с соавторами продемонстрировали, что дисульфидизомераза (PDI) участвует в прикреплении ЭТ C. trachomatis серовара Е (Davis et al., 2002) к поверхности клетки. PDI является многофункциональным ферментом: катализирует восстановление, окисление и изомеризацию дисульфидных связей, его значительное количество приходится на эндоплазматический ретикулум, также этот белок содержится в цитоплазме, ядре, и на поверхности клетки. PDI участвует как в прикреплении, так и в проникновении хламидий в клетку (Abromaitis and Stephens, 2009). При этом в процессе прикрепления ЭТ к клетке C. trachomatis взаимодействует не напрямую с PDI, а с белками, которые в свою очередь связаны с этим ферментом. А для проникновения хламидий в клетку необходима ферментативная активность PDI, в результате которой происходит восстановление дисульфидных связей. Как известно, поверхность ЭТ представлена цистеин-богатыми белками, которые образуют сшитую сеть белковых компонентов. Возможно, восстановление дисульфидных связей мембранных 81 белков C. trachomatis при действии PDI инициирует процесс проникновения ЭТ в эукариотическую клетку. Поэтому изменение количества PDI, наблюдаемое при экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293 (таблица 15), может существенным образом сказаться на инфекционной способности хламидий. Известно, что хламидии активно используют цитоскелет клетки-хозяина. Взаимодействие с актином, микротрубочками и промежуточными филаментами играет важную роль для патогена на всех этапах его жизненного цикла, особенно на стадиях проникновения в клетку и образования включения (Scidmore, 2011). Для проникновения в клетку хламидии используют Rac1-зависимый механизм реорганизации актина. В этом процессе ключевую роль играет хламидийный белок-эффектор TARP (translocated actin-recruiting phosphoprotein). Регуляция реорганизации актина посредством TARP возможна как за счет изменения активности Rho GTPаз, так и непосредственного участия в полимеризации при взаимодействии с актином. TARP взаимодействует с Sos2, Vav2 и факторами обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs), которые в свою очередь активируют Rac1. Хламидии также секретируют белки, вызывающие деполимеризацию актина, а именно CT166, гликозилирующий Rac1, и CT694, который взаимодействует с актин-связывающим белком AHNAK (Bastidas et al., 2013). Во время ранней фазы инфекции образующееся включение перемещается в перинуклеарную область клетки-хозяина и остается тесно связанным с аппаратом Гольджи, где включение начинает сливаться с везикулами, содержащими сфингомиелин. Для своего перемещения хламидии активно используют микротрубочки, включение двигается к минусконцу микротрубочек и остается в тесной связи с центром образования микротрубочек (Grieshaber et al., 2006). Транспорт различных компонентов в клетке вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков: кинезинов и динеинов. Движение хламидий вдоль микротрубочек происходит динеин-зависимым способом. Для перемещения C. trachomatis, подобно везикулярному транспорту в клетке, белки мембраны включения взаимодействуют с динеином и некоторыми компонентами комплекса динактина (Grieshaber et al., 2003). Зрелое включение стабилизируется в клетке за счет образования вокруг него «каркаса», состоящего из F-актина и промежуточных филаментов (Kumar and Valdivia, 2008). Более того, протеаза хламидий CPAF, секретируемая в цитоплазму, взаимодействует с виментином, изменяя структурные свойства промежуточных филаментов на поверхности включения. За счет этого «каркас» становится динамичным, т.е. способен расширяться вместе с увеличивающимся в размерах включением на поздних стадиях развития хламидий. 82 Анализ транскриптомного профиля клеток при экспрессии гена cit1a показал изменение уровня транскрипции генов acta1, actg1, myh3, кодирующих актин и миозин соответственно. Кроме того, протеомный анализ трансфицированной плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTACIT1a линии клеток HEK293 показал отличия в уровнях миозина, белка 4, ассоциированного с цитоскелетом, кератина, тубулина, виментина (таблица 15), главных компонентов цитоскелета эукариотической клетки. Также следует отметить изменение уровня кинезин-подобного белка KIF17, который, как и динеин, является моторным белком, участвуя в транспорте различных компонентов вдоль микротрубочек. Принимая во внимание прочную взаимосвязь жизненного цикла хламидии с цитоскелетом клетки-хозяина, изменение уровня экспрессии генов и белков, вовлеченных в организацию актина, промежуточных филаментов и микротрубочек, может значительным образом сказываться на развитии хламидийной инфекции. Как упоминалось выше, хламидии, находясь в клетке, тесно связаны с аппаратом Гольджи. C. trachomatis получает холестерин эукариотических клеток, синтезированный de novo или из липопротеинов низкой плотности. Хламидийное включение сливается с везикулами, содержащими сфингомиелин, перехватывая их на пути транспорта от аппарата Гольджи к плазматической мембране (Carabeo et al., 2003). Было показано, что во время инфекции C. trachomatis в эукариотической клетке происходит фрагментация аппарата Гольджи с образованием миницистерн, окружающих бактериальное включение (Heuer et al., 2009). Образование миницистерн инициируется протеолитическим распадом формирующего матрикс аппарата Гольджи белка гольджина-84. Фрагментация аппарата Гольджи является критическим моментом для внутриклеточного роста C. trachomatis. Таким образом, изменения в функционировании аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума (ЭПР) могут существенным образом повлиять на эффективный рост хламидий внутри эукариотической клетки. При протеомном профилировании линии клеток, экспрессирующей ген cit1a, нами было показано изменение количества белка 1 комплекса рецептора SNAP аппарата Гольджи (Golgi SNAP receptor complex member 1 GOSR1), а также АТФазы гладкого ЭПР (валозинсодержащего белка) VCP (таблица 15). Комплекс белков рецептора SNAP аппарата Гольджи относится к семейству белков SNARE, вовлечен в транспорт компонентов от ЭПР к аппарату Гольджи. Более того, обнаружено, что синтаксин 6, также относящийся к семейству белков SNARE взаимодействует с мембраной хламидийного включения (Moore et al., 2011). C. trachomatis активно модифицируют мембрану включения с помощью собственных белков сразу после ее проникновения в клетку. Белки мембраны включения хламидий являются посредниками во взаимодействии патогенного микроорганизма с эукариотической клеткой. 83 Одним из примеров такого взаимодействия является взаимосвязь белков 14-3-3β клеткихозяина и хламидийного белка IncG. Данный процесс видоспецифичен, поскольку в случае инфекции C. psittaci и C. pneumoniae подобного взаимодействия не происходило (Scidmore and Hackstadt, 2001). Белки 14-3-3 принадлежат к семейству высококонсервативных фосфосеринсвязывающих белков. Изоформа 14-3-3β является первым описанным эукариотическим белком, для которого показано взаимодействие с хламидийным включением посредством IncG. Белок 14-3-3 взаимодействует с различными сигнальными молекулами, что указывает на его роль в таких важных процессах как регуляция клеточного цикла и дифференцировка клеток. При инфицировании клетки C. trachomatis большая часть белка 14-3-3 обнаруживается в связанной с хламидийным включением форме. Таким образом, нарушается взаимодействие данного белка с другими клеточными компонентами, что может приводить к изменению путей трансдукции сигнала (Scidmore and Hackstadt, 2001). Помимо этого, адаптерный белок 14-3-3β может принимать участие в регуляции процесса активации апоптоза. При инфицировании клетки C. trachomatis BAD, взаимодействуя с 14-3-3β, оказывается связанным с хламидийным включением. Это приводит к тому, что фосфолирированный BAD не взаимодействует с митохондриями, где он может индуцировать апоптоз за счет выхода цитохрома С. Таким образом, в клетке, инфицированной C. trachomatis, не запускается процесс апоптоза, что является следствием взаимодействия белка мембраны включения IncG с фосфосеринсвязывающим белком, который, в свою очередь, связывает BAD (Verbeke et al., 2006). Взаимосвязь белка 14-3-3 с хламидийным включением показана только для изоформы 14-3-3β, остается неясным происходит ли подобное в случае других изоформ данного белка. Возможно, обнаруженное изменение количества белка 14-3-3ε в 3,09 раза при экспрессии гена cit1a в линии клеток (таблица 15) может сказываться на развитии хламидийной инфекции. Известно, что хламидии обладают уникальным антиапоптотическим механизмом. Было показано, что в клетках, инфицированных хламидиями, под воздействием проапоптогенных факторов происходит ингибирование выхода митохондриального цитохрома С в цитоплазму, и, как следствие, не происходит дальнейшей активации каспазы (Fan et al., 1998, Miyairi and Byrne, 2006). Также C. trachomatis может вносить изменения в каскад событий, предшествующий выходу цитохрома С в цитоплазму. Таким образом, гены, кодирующие митохондриальные белки, могут опосредованно влиять на развитие хламидийной инфекции. Транскриптомный анализ клеток при экспрессии в них гена цито-инсектотоксина cit1a показал дифференциальную экспрессию некоторых митохондриальных генов: atp5I (кодирует субъединицу Е ATФ-синтазы), cox7b (субъединицу VIIb цитохром с-оксидазы), hsd17b10 (гидроксистероид-дегидрогеназу) (таблица 14). 84 Транскриптомный анализ клеток экспрессирующих ген cit1a показал различие в уровнях экспрессии кодирующих гистоны генов hist1h2bd, hist1h4h, hist2h4a. При этом гистоны не обнаружены среди дифференциально нарабатывающихся белков, что, возможно, объясняется их существенным положительным зарядом, значения их изоэлектрических точек - 12-13. Патогенный микроорганизм секретирует различные белки в эукариотическую клетку, тем или иным образом нарушая реализацию клеточных процессов. Так у C. trachomatis был идентифицирован ядерный эффекторный белок NUE, содержащий SET домен, вовлеченный в процесс укладки хроматина. NUE секретируется из хламидийного включения, используя систему секреции III типа, и проникает в ядро клетки, где проявляет активность гистонметилтрансферазы, модифицируя клеточные гистоны, при этом он не проявляет активности по отношению к гистоно-подобным белкам бактерий. Было показано, что субстратами для данной метилтрансферазы являются гистоны H2B, H3 и H4 (Pennini et al., 2010). Способность хламидий к модификации гистонов может привести к подавлению системы защитных механизмов клетки. Интересным фактом является то, что сами гистоны могут иметь антимикробную активность (Kawasaki and Iwamuro, 2008, Patat et al., 2004, Tsao et al., 2009). Например, в себоцитах человека гистоны H4 являются основным антимикробным компонентом (Lee et al., 2009), проявляя активность по отношению к Staphylococcus aureus и Propionibacterium acnes. Проведенное нами транскриптомное профилирование показало увеличение экспрессии гена, кодирующего субъединицу 2 фактора сплайсинга 3а с молекулярной массой 66 кДа (SF3A2). SF3a состоит из 3субъединиц: SF3a60, SF3a66 и SF3a120 массами 60, 66 и 120 кДа соответственно, и является компонентом малого ядерного рибонуклеопротеина U2, взаимодействующего с пре-мРНК при образовании сплайсосомы (Lin and Xu, 2012). Также было показано, что субъединица SF3а66, помимо основной функции образования сплайсосомы и сплайсинга, способна связываться с β-тубулином и микротрубочками. Остается до конца невыясненным, как именно происходит взаимодействие, поскольку SF3A2 локализуется в ядре, а микротрубочки – в цитоплазме. Возможно, некоторое количество SF3A2 (SF3a66) все же содержится в цитоплазме клетки и функционирует как белок, связывающий микротрубочки. Альтернативным предположением является то, что функция связывания микротрубочек может реализовываться во время клеточного деления, когда часть SF3A2 попадает в цитоплазму при разрушении ядерной мембраны. Помимо этого было обнаружено, что β-II-тубулин локализуется в ядре и не связан с сетью микротрубочек, его функцией может являться поддержании формы ядра клетки. В таком случае, третье объяснение – фактор сплайсинга 3а взаимодействует именно с β-II-тубулином в ядре (Takenaka et al., 2004). 85 Суммируя результаты работы, мы создали возможную модель ингибирования развития C. trachomatis в клетках, экспрессирующих ген cit1a представлена на рисунке 22. Рисунок 22. Модель действия АМП при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293 на развитие хдамидийной инфекции. 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование антибиотиков приводит к возникновению резистентных штаммов микроорганизмов. Одним из перспективных решений проблемы устойчивости патогенов может стать использование антимикробных пептидов. Антимикробные пептиды - природные средства защиты организма, обнаруженные у растений, беспозвоночных, позвоночных животных, включая человека. Данные пептиды относятся к системе врожденного иммунитета. Свою активность АМП проявляют в отношении бактерий, грибов, вирусов. Такой широкий спектр антимикробной активности обусловлен механизмом действия АМП: связываясь с мембраной клетки, АМП образуют канал, или пору, что приводит к выходу содержимого клетки наружу и последующей ее гибели. В сравнении с антибиотиками применение АМП имеет ряд преимуществ: более широкий спектр антибактериального действия; формирование резистентности практически невозможно из-за особенностей механизма действия АМП; действие при более низких концентрациях. Исходя из этого, АМП активно изучались последние десятилетия, что привело к разработке многочисленных аналогов пептидов с измененными биологическими свойствами. Но применение химически синтезированных АМП ограничено из-за токсичности продукта по отношению к эукариотическим организмам, а также дороговизны их производства. В настоящей работе описывается подход, позволяющий решить этот недостаток терапевтического использования АМП. Проблема токсичности устранена путем регуляции экспрессии кодирующих АМП генов в эукариотической клетке. Мы использовали тетрациклин-зависимую систему регуляции экспрессии генов. Нами была сконструирована серия плазмидных векторов, где экспрессия генов находится под контролем двух идентичных минимальных промоторов цитомегаловируса человека, между которыми расположен тетрациклин-зависимый элемент (TRE). В качестве объекта исследования нами были выбраны АМП из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. Это уникальные по своему составу и свойствам АМП. Среди пептидов из яда L. tarabaevi особенно выделяется цито-инсектотоксин CIT1a, его размер 69 а.о., заряд составляет +14. Были сконструированы плазмидные векторы, экспрессирующие гены латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда Lachesana tarabaevi под контролем тетрациклин-зависимого промотора цитомегаловируса человека. Мы показали, что использование полученных конструкций при трансфекции линии клеток HEK293 не вызывает токсического эффекта. 87 Нами было показано, что при экспрессии генов, кодирующих латарцины и цитоинсектотоксин CIT1a из яда паука, наблюдалось подавление C. trachomatis. Наибольшая антихламидийная активность выявлена при экспрессии гена cit1a. До настоящего времени было не до конца известно, как именно происходит ингибирование развития хламидийной инфекции в клетке при экспрессии в ней генов, кодирующих АМП. Для выяснения этого вопроса был выполнен транскриптомный и протеомный анализы линии клеток, экспрессирующей ген цито-инсектотоксина CIT1a. Нам удалось выявить изменение уровней транскрипции и трансляции ряда генов и белков, продукты которых вовлечены в функционирование актинового цитоскелета и аппарата Гольджи. Это может существенным образом сказываться на внутриклеточном перемещении хламидий, а также потреблении ими сфингомиелина, что, возможно, приводит к снижению способности хламидий проникать в клетку, остановке ее развития внутри эукариотической клетки и развитию абберантных включений. Ранее не было известно, на какой именно стадии развития патогена реализуется антихламидийное действие пептидов. Нами было исследовано влияние экспрессии гена cit1a на развитие C. trachomatis на стадии заражения, раннюю и среднюю фазу инфекции. В результате нами было показано, что при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, на ранней стадии инфекционного процесса происходит наиболее эффективное подавление C. trachomatis. Таким образом, в настоящей работе мы впервые продемонстрировали антихламидийную активность пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi, изучив возможные механизмы подавления развития инфекции C. trachomatis при экспрессии гена cit1a в линии клеток HEK293, а также показали, что наиболее эффективное подавление развития хламидий происходит на ранней стадии жизненного цикла патогена. 88 ВЫВОДЫ 1. Химически синтезированные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi латарцины Ltc1, Ltc5 и цито-инсектотоксин CIT1a обладают антимикробной активностью в отношении элементарных телец C. trachomatis, тогда как латарцины Ltc2, Ltc3a - нет. 2. Экспрессия генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках линии HEK293 вызывает подавление развития хламидийных включений с эффективностью подавления инфекции 60-85 %. 3. При индукции экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a, наиболее эффективное подавление развития C. trachomatis в клетках линии HEK293 происходит на стадии образования незрелого включения. 89 Список сокращений АМП – антимикробные пептиды BPI - бактерицидные белки, увеличивающие проницаемость ЛПС - липополисахариды ТФЭ — трифторэтанол ДОФХ – диолеоилфосфатидилхолин п.о. – пар оснований МИК – минимальная ингибирующая концентрация КОЕ – колониеобразующая единица ЛД50 - средняя летальная доза ЭК50 - концентрация, вызывающая 50% лизис эритроцитов ЭПР – эндоплазматический ретикулум ЭТ - элементарное тельце РТ – ретикулярное тельце а.о. – аминокислотный остаток ПААГ – полиакриламидный гель ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ДТТ – 1,4-дитиотреитол, ОТ-ПЦР – обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция FITC - изотиоцианат флуоресцеина Dox – доксициклин 90 Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Abachin, E., Poyart, C., Pellegrini, E., Milohanic, E., Fiedler, F., Berche, P., and Trieu-Cuot, P. Formation of d-alanyl-lipoteichoic acid is required for adhesion and virulence of Listeria monocytogenes // Mol Microbiol. 2002. Vol. 43. № 1. P. 1-14. Abdelrahman, Y. M. and Belland, R. J. The chlamydial developmental cycle // FEMS Microbiol Rev. 2005. Vol. 29. № 5. P. 949-959. Abromaitis, S. and Stephens, R. S. Attachment and entry of Chlamydia have distinct requirements for host protein disulfide isomerase // PLoS Pathog. 2009. Vol. 5. № 4. e1000357. Agwuh, K. N. and MacGowan, A. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the tetracyclines including glycylcyclines // J Antimicrob Chemother. 2006. Vol. 58. № 2. P. 256-265. Auricchio, A., Rivera, V. M., Clackson, T., O'Connor, E. E., Maguire, A. M., Tolentino, M. J., Bennett, J., and Wilson, J. M. Pharmacological regulation of protein expression from adenoassociated viral vectors in the eye // Mol Ther. 2002. Vol. 6. № 2. P. 238-242. Bastidas, R. J., Elwell, C. A., Engel, J. N., and Valdivia, R. H. Chlamydial intracellular survival strategies // Cold Spring Harb Perspect Med. 2013. Vol. 3. № 5. P. a010256. Beisswenger, C. and Bals, R. Functions of antimicrobial peptides in host defense and immunity // Curr Protein Pept Sci. 2005. Vol. 6. № 3. P. 255-264. Bellefroid, E. J., Poncelet, D. A., Lecocq, P. J., Revelant, O., and Martial, J. A. The evolutionarily conserved kruppel-associated box domain defines a subfamily of eukaryotic multifingered proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. Vol. 88. № 9. P. 3608-3612. Berman, B., Perez, O. A., and Zell, D. Update on rosacea and anti-inflammatory-dose doxycycline // Drugs Today (Barc). 2007. Vol. 43. № 1. P. 27-34. Beven, L., Castano, S., Dufourcq, J., Wieslander, A., and Wroblewski, H. The antibiotic activity of cationic linear amphipathic peptides: Lessons from the action of leucine/lysine copolymers on bacteria of the class Mollicutes // Eur J Biochem. 2003. Vol. 270. № 10. P. 2207-2217. Beven, L. and Wroblewski, H. Effect of natural amphipathic peptides on viability, membrane potential, cell shape and motility of mollicutes // Res Microbiol. 1997. Vol. 148. № 2. P. 163-175. Bierbaum, G. and Sahl, H. G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: Influence of cationic peptides on activity of n-acetylmuramoyl-l-alanine amidase // J Bacteriol. 1987. Vol. 169. № 12. P. 5452-5458. Blochet, J. E., Chevalier, C., Forest, E., Pebay-Peyroula, E., Gautier, M. F., Joudrier, P., Pezolet, M., and Marion, D. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic and cystine-rich protein with a unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by triton x-114 phase partitioning // FEBS Lett. 1993. Vol. 329. № 3. P. 336-340. Boman, H. G., Agerberth, B., and Boman, A. Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine // Infect Immun. 1993. Vol. 61. № 7. P. 2978-2984. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? // Nat Rev Microbiol. 2005. Vol. 3. № 3. P. 238-250. Brogden, K. A. Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum // Infect Immun. 1992. Vol. 60. № 12. P. 5182-5189. Brogden, K. A., Ackermann, M., and Huttner, K. M. Small, anionic, and charge-neutralizing propeptide fragments of zymogens are antimicrobial // Antimicrob Agents Chemother. 1997. Vol. 41. № 7. P. 1615-1617. Brogden, K. A., De Lucca, A. J., Bland, J., and Elliott, S. Isolation of an ovine pulmonary surfactant-associated anionic peptide bactericidal for Pasteurella haemolytica // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. Vol. 93. № 1. P. 412-416. 91 19. Brown, K. L. and Hancock, R. E. Cationic host defense (antimicrobial) peptides // Curr Opin Immunol. 2006. Vol. 18. № 1. P. 24-30. 20. Burian, M. and Schittek, B. The secrets of dermcidin action // Int J Med Microbiol. 2015. Vol. 305. № 2. P. 283-286. 21. Campopiano, D. J., Clarke, D. J., Polfer, N. C., Barran, P. E., Langley, R. J., Govan, J. R., Maxwell, A., and Dorin, J. R. Structure-activity relationships in defensin dimers: A novel link between beta-defensin tertiary structure and antimicrobial activity // J Biol Chem. 2004. Vol. 279. № 47. P. 48671-48679. 22. Carabeo, R. A., Mead, D. J., and Hackstadt, T. Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003. Vol. 100. № 11. P. 67716776. 23. Chan, W. C. and White, P. D. Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach // The practical approach series New York: Oxford University Press, 2000, xxiv, 346 p. 24. Chertov, O., Michiel, D. F., Xu, L., Wang, J. M., Tani, K., Murphy, W. J., Longo, D. L., Taub, D. D., and Oppenheim, J. J. Identification of defensin-1, defensin-2, and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8-stimulated neutrophils // J Biol Chem. 1996. Vol. 271. № 6. P. 2935-2940. 25. Choi, K. Y., Chow, L. N., and Mookherjee, N. Cationic host defence peptides: Multifaceted role in immune modulation and inflammation // J Innate Immun. 2012. Vol. 4. № 4. P. 361-370. 26. Chong-Cerrillo, C., Selsted, M. E., Peterson, E. M., and de la Maza, L. M. Susceptibility of human and murine Chlamydia trachomatis serovars to granulocyte- and epithelium-derived antimicrobial peptides // J Pept Res. 2003. Vol. 61. № 5. P. 237-242. 27. Corzo, G. and Escoubas, P. Pharmacologically active spider peptide toxins // Cell Mol Life Sci. 2003. Vol. 60. № 11. P. 2409-2426. 28. da Costa, J. P., Cova, M., Ferreira, R., and Vitorino, R. Antimicrobial peptides: An alternative for innovative medicines? // Appl Microbiol Biotechnol. 2015. Vol. 99. № 5 P. 2023-2040. 29. Davis, C. H., Raulston, J. E., and Wyrick, P. B. Protein disulfide isomerase, a component of the estrogen receptor complex, is associated with Chlamydia trachomatis serovar E attached to human endometrial epithelial cells // Infect Immun. 2002. Vol. 70. № 7. P. 3413-3418. 30. De, Y., Chen, Q., Schmidt, A. P., Anderson, G. M., Wang, J. M., Wooters, J., Oppenheim, J. J., and Chertov, O. LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (Fprl1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells // J Exp Med. 2000. Vol. 192. № 7. P. 1069-1074. 31. Dempsey, C. E. The actions of melittin on membranes // Biochim Biophys Acta. 1990. Vol. 1031. № 2. P. 143-161. 32. Deuschle, U., Meyer, W. K., and Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters // Mol Cell Biol. 1995. Vol. 15. № 4. P. 1907-1914. 33. Douglas, S. E., Gallant, J. W., Liebscher, R. S., Dacanay, A., and Tsoi, S. C. Identification and expression analysis of hepcidin-like antimicrobial peptides in bony fish // Dev Comp Immunol. 2003. Vol. 27. № 6-7. P. 589-601. 34. Eger, K., Hermes, M., Uhlemann, K., Rodewald, S., Ortwein, J., Brulport, M., Bauer, A. W., Schormann, W., Lupatsch, F., Schiffer, I. B., Heimerdinger, C. K., Gebhard, S., Spangenberg, C., Prawitt, D., Trost, T., Zabel, B., Sauer, C., Tanner, B., Kolbl, H., Krugel, U., Franke, H., Illes, P., Madaj-Sterba, P., Bockamp, E. O., Beckers, T., and Hengstler, J. G. 4-epidoxycycline: An alternative to doxycycline to control gene expression in conditional mouse models // Biochem Biophys Res Commun. 2004. Vol. 323. № 3. P. 979-986. 35. Estrada, G., Villegas, E., and Corzo, G. Spider venoms: A rich source of acylpolyamines and peptides as new leads for CNS drugs // Nat Prod Rep. 2007. Vol. 24. № 1. P. 145-161. 36. Everett, K. D., Bush, R. M., and Andersen, A. A. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one 92 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms // Int J Syst Bacteriol. 1999. Vol. 49 Pt 2. P. 415-440. Fan, T., Lu, H., Hu, H., Shi, L., McClarty, G. A., Nance, D. M., Greenberg, A. H., and Zhong, G. Inhibition of apoptosis in chlamydia-infected cells: Blockade of mitochondrial cytochrome c release and caspase activation // J Exp Med. 1998. Vol. 187. № 4. P. 487-496. Favre, D., Provost, N., Blouin, V., Blancho, G., Cherel, Y., Salvetti, A., and Moullier, P. Immediate and long-term safety of recombinant adeno-associated virus injection into the nonhuman primate muscle // Mol Ther. 2001. Vol. 4. № 6. P. 559-566. Fitzsimons, H. L., McKenzie, J. M., and During, M. J. Insulators coupled to a minimal bidirectional tet cassette for tight regulation of rAAV-mediated gene transfer in the mammalian brain // Gene Ther. 2001. Vol. 8. № 22. P. 1675-1681. Fjell, C. D., Hiss, J. A., Hancock, R. E., and Schneider, G. Designing antimicrobial peptides: Form follows function // Nat Rev Drug Discov. 2012. Vol. 11. № 1. P. 37-51. Fox, J. L. Antimicrobial peptides stage a comeback // Nat Biotechnol. 2013. Vol. 31. № 5. P. 379382. Frank, R. W., Gennaro, R., Schneider, K., Przybylski, M., and Romeo, D. Amino acid sequences of two proline-rich bactenecins. Antimicrobial peptides of bovine neutrophils // J Biol Chem. 1990. Vol. 265. № 31. P. 18871-18874. Frick, I. M., Akesson, P., Rasmussen, M., Schmidtchen, A., and Bjorck, L. SIC, a secreted protein of Streptococcus pyogenes that inactivates antibacterial peptides // J Biol Chem. 2003. Vol. 278. № 19. P. 16561-16566. Gaczynska, M., Osmulski, P. A., Gao, Y., Post, M. J., and Simons, M. Proline- and arginine-rich peptides constitute a novel class of allosteric inhibitors of proteasome activity // Biochemistry. 2003. Vol. 42. № 29. P. 8663-8670. Gennaro, R. and Zanetti, M. Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides // Biopolymers. 2000. Vol. 55. № 1. P. 31-49. Giles, F. J., Rodriguez, R., Weisdorf, D., Wingard, J. R., Martin, P. J., Fleming, T. R., Goldberg, S. L., Anaissie, E. J., Bolwell, B. J., Chao, N. J., Shea, T. C., Brunvand, M. M., Vaughan, W., Petersen, F., Schubert, M., Lazarus, H. M., Maziarz, R. T., Silverman, M., Beveridge, R. A., Redman, R., Pulliam, J. G., Devitt-Risse, P., Fuchs, H. J., and Hurd, D. D. A phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled, study of iseganan for the reduction of stomatitis in patients receiving stomatotoxic chemotherapy // Leuk Res. 2004. Vol. 28. № 6. P. 559-565. Gordon, Y. J., Romanowski, E. G., and McDermott, A. M. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs // Curr Eye Res. 2005. Vol. 30. № 7. P. 505-515. Gossen, M. and Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracyclineresponsive promoters // Proc Natl Acad Sci U S A. 1992. Vol. 89. № 12. P. 5547-5551. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W., and Bujard, H. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells // Science. 1995. Vol. 268. № 5218. P. 1766-1769. Gould, D. J., Berenstein, M., Dreja, H., Ledda, F., Podhajcer, O. L., and Chernajovsky, Y. A novel doxycycline inducible autoregulatory plasmid which displays "on"/"off" regulation suited to gene therapy applications // Gene Ther. 2000. Vol. 7. № 24. P. 2061-2070. Grieshaber, S. S., Grieshaber, N. A., and Hackstadt, T. Chlamydia trachomatis uses host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitin-independent process // J Cell Sci. 2003. Vol. 116. № Pt 18. P. 3793-3802. Grieshaber, S. S., Grieshaber, N. A., Miller, N., and Hackstadt, T. Chlamydia trachomatis causes centrosomal defects resulting in chromosomal segregation abnormalities // Traffic. 2006. Vol. 7. № 8. P. 940-949. 93 53. Guina, T., Yi, E. C., Wang, H., Hackett, M., and Miller, S. I. A PhoP-regulated outer membrane protease of Salmonella enterica serovar typhimurium promotes resistance to alpha-helical antimicrobial peptides // J Bacteriol. 2000. Vol. 182. № 14. P. 4077-4086. 54. Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides // Cell. 1998. Vol. 95. № 2. P. 189-198. 55. Haberman, R. P., McCown, T. J., and Samulski, R. J. Inducible long-term gene expression in brain with adeno-associated virus gene transfer // Gene Ther. 1998. Vol. 5. № 12. P. 1604-1611. 56. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J Mol Biol. 1983. Vol. 166. № 4. P. 557-580. 57. Hancock, R. E. and Chapple, D. S. Peptide antibiotics // Antimicrob Agents Chemother. 1999. Vol. 43. № 6. P. 1317-1323. 58. Hatch, T. P., Allan, I., and Pearce, J. H. Structural and polypeptide differences between envelopes of infective and reproductive life cycle forms of Chlamydia spp // J Bacteriol. 1984. Vol. 157. № 1. P. 13-20. 59. He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W., and Worcester, D. L. Antimicrobial peptide pores in membranes detected by neutron in-plane scattering // Biochemistry. 1995. Vol. 34. № 48. P. 15614-15618. 60. Heuer, D., Rejman Lipinski, A., Machuy, N., Karlas, A., Wehrens, A., Siedler, F., Brinkmann, V., and Meyer, T. F. Chlamydia causes fragmentation of the Golgi compartment to ensure reproduction // Nature. 2009. Vol. 457. № 7230. P. 731-735. 61. Hornef, M. W., Putsep, K., Karlsson, J., Refai, E., and Andersson, M. Increased diversity of intestinal antimicrobial peptides by covalent dimer formation // Nat Immunol. 2004. Vol. 5. № 8. P. 836-843. 62. Huang, H. J., Ross, C. R., and Blecha, F. Chemoattractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide // J Leukoc Biol. 1997. Vol. 61. № 5. P. 624-629. 63. Hultmark, D., Steiner, H., Rasmuson, T., and Boman, H. G. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia // Eur J Biochem. 1980. Vol. 106. № 1. P. 7-16. 64. Jenssen, H., Hamill, P., and Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents // Clin Microbiol Rev. 2006. Vol. 19. № 3. P. 491-511. 65. Jin, T., Bokarewa, M., Foster, T., Mitchell, J., Higgins, J., and Tarkowski, A. Staphylococcus aureus resists human defensins by production of staphylokinase, a novel bacterial evasion mechanism // J Immunol. 2004. Vol. 172. № 2. P. 1169-1176. 66. Jones, R. B., Van der Pol, B., Martin, D. H., and Shepard, M. K. Partial characterization of Chlamydia trachomatis isolates resistant to multiple antibiotics // J Infect Dis. 1990. Vol. 162. № 6. P. 1309-1315. 67. Kang, S. J., Park, S. J., Mishig-Ochir, T., and Lee, B. J. Antimicrobial peptides: Therapeutic potentials // Expert Rev Anti Infect Ther. 2014. Vol. 12. № 12. P. 1477-1486. 68. Karns, L. R., Kisielewski, A., Gulding, K. M., Seraj, J. M., and Theodorescu, D. Manipulation of gene expression by an ecdysone-inducible gene switch in tumor xenografts // BMC Biotechnol. 2001. Vol. 1. P. 11. 69. Kavanagh, K. and Dowd, S. Histatins: Antimicrobial peptides with therapeutic potential // J Pharm Pharmacol. 2004. Vol. 56. № 3. P. 285-289. 70. Kawasaki, H. and Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents // Infect Disord Drug Targets. 2008. Vol. 8. № 3. P. 195-205. 71. Kim, J. M. Antimicrobial proteins in intestine and inflammatory bowel diseases // Intest Res. 2014. Vol. 12. № 1. P. 20-33. 72. Kolls, J. K., McCray, P. B., Jr., and Chan, Y. R. Cytokine-mediated regulation of antimicrobial proteins // Nat Rev Immunol. 2008. Vol. 8. № 11. P. 829-835. 94 73. Kozlov, S. A., Vassilevski, A. A., Feofanov, A. V., Surovoy, A. Y., Karpunin, D. V., and Grishin, E. V. Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity // J Biol Chem. 2006. Vol. 281. № 30. P. 20983-20992. 74. Kumar, Y. and Valdivia, R. H. Actin and intermediate filaments stabilize the Chlamydia trachomatis vacuole by forming dynamic structural scaffolds // Cell Host Microbe. 2008. Vol. 4. № 2. P. 159-169. 75. Kuwano, K., Tanaka, N., Shimizu, T., and Kida, Y. Antimicrobial activity of inducible human beta defensin-2 against Mycoplasma pneumoniae // Curr Microbiol. 2006. Vol. 52. № 6. P. 435438. 76. LaForce, F. M. and Boose, D. S. Effect of zinc and phosphate on an antibacterial peptide isolated from lung lavage // Infect Immun. 1984. Vol. 45. № 3. P. 692-696. 77. Lai, R., Liu, H., Hui Lee, W., and Zhang, Y. An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima // Biochem Biophys Res Commun. 2002. Vol. 295. № 4. P. 796-799. 78. Lamb, H. M. and Wiseman, L. R. Pexiganan acetate // Drugs. 1998. Vol. 56. № 6. P. 1047-1052; discussion 1053-1044. 79. Latta-Mahieu, M., Rolland, M., Caillet, C., Wang, M., Kennel, P., Mahfouz, I., Loquet, I., Dedieu, J. F., Mahfoudi, A., Trannoy, E., and Thuillier, V. Gene transfer of a chimeric trans-activator is immunogenic and results in short-lived transgene expression // Hum Gene Ther. 2002. Vol. 13. № 13. P. 1611-1620. 80. Lawyer, C., Pai, S., Watabe, M., Borgia, P., Mashimo, T., Eagleton, L., and Watabe, K. Antimicrobial activity of a 13 amino acid tryptophan-rich peptide derived from a putative porcine precursor protein of a novel family of antibacterial peptides // FEBS Lett. 1996. Vol. 390. № 1. P. 95-98. 81. Lazarev, V. N., Parfenova, T. M., Gularyan, S. K., Misyurina, O. Y., Akopian, T. A., and Govorun, V. M. Induced expression of melittin, an antimicrobial peptide, inhibits infection by Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis in a HeLa cell line // Int J Antimicrob Agents. 2002. Vol. 19. № 2. P. 133-137. 82. Lazarev, V. N., Shkarupeta, M. M., Titova, G. A., Kostrjukova, E. S., Akopian, T. A., and Govorun, V. M. Effect of induced expression of an antimicrobial peptide melittin on Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis infections in vivo // Biochem Biophys Res Commun. 2005. Vol. 338. № 2. P. 946-950. 83. Lebherz, C., Auricchio, A., Maguire, A. M., Rivera, V. M., Tang, W., Grant, R. L., Clackson, T., Bennett, J., and Wilson, J. M. Long-term inducible gene expression in the eye via adenoassociated virus gene transfer in nonhuman primates // Hum Gene Ther. 2005. Vol. 16. № 2. P. 178-186. 84. Lee, D. Y., Huang, C. M., Nakatsuji, T., Thiboutot, D., Kang, S. A., Monestier, M., and Gallo, R. L. Histone H4 is a major component of the antimicrobial action of human sebocytes // J Invest Dermatol. 2009. Vol. 129. № 10. P. 2489-2496. 85. Levin, M., Quint, P. A., Goldstein, B., Barton, P., Bradley, J. S., Shemie, S. D., Yeh, T., Kim, S. S., Cafaro, D. P., Scannon, P. J., and Giroir, B. P. Recombinant bactericidal/permeabilityincreasing protein (rBPI21) as adjunctive treatment for children with severe meningococcal sepsis: a randomised trial. rBPI21 meningococcal sepsis study group // Lancet. 2000. Vol. 356. № 9234. P. 961-967. 86. Lin, P. C. and Xu, R. M. Structure and assembly of the SF3a splicing factor complex of U2 snRNP // EMBO J. 2012. Vol. 31. № 6. P. 1579-1590. 87. Ljostad, U., Skogvoll, E., Eikeland, R., Midgard, R., Skarpaas, T., Berg, A., and Mygland, A. Oral doxycycline versus intravenous ceftriaxone for European Lyme neuroborreliosis: A multicentre, non-inferiority, double-blind, randomised trial // Lancet Neurol. 2008. Vol. 7. № 8. P. 690-695. 95 88. Maemoto, A., Qu, X., Rosengren, K. J., Tanabe, H., Henschen-Edman, A., Craik, D. J., and Ouellette, A. J. Functional analysis of the alpha-defensin disulfide array in mouse cryptdin-4 // J Biol Chem. 2004. Vol. 279. № 42. P. 44188-44196. 89. Margolin, J. F., Friedman, J. R., Meyer, W. K., Vissing, H., Thiesen, H. J., and Rauscher, F. J., 3rd Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains // Proc Natl Acad Sci U S A. 1994. Vol. 91. № 10. P. 4509-4513. 90. Markusic, D., Oude-Elferink, R., Das, A. T., Berkhout, B., and Seppen, J. Comparison of single regulated lentiviral vectors with rtTA expression driven by an autoregulatory loop or a constitutive promoter // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33. № 6. P. e63. 91. Matsuda, E., Agata, Y., Sugai, M., Katakai, T., Gonda, H., and Shimizu, A. Targeting of kruppelassociated box-containing zinc finger proteins to centromeric heterochromatin. Implication for the gene silencing mechanisms // J Biol Chem. 2001. Vol. 276. № 17. P. 14222-14229. 92. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., and Miyajima, K. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation // Biochemistry. 1996. Vol. 35. № 35. P. 11361-11368. 93. Matsuzaki, K., Sugishita, K., Ishibe, N., Ueha, M., Nakata, S., Miyajima, K., and Epand, R. M. Relationship of membrane curvature to the formation of pores by magainin 2 // Biochemistry. 1998. Vol. 37. № 34. P. 11856-11863. 94. Mebs, D. Venomous and poisonous animals : A handbook for biologists, and toxicologists and toxinologists, physicians and pharmacists // Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2002, ix, 339 p. 95. Miller, S. I., Ernst, R. K., and Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity // Nat Rev Microbiol. 2005. Vol. 3. № 1. P. 36-46. 96. Miyairi, I. and Byrne, G. I. Chlamydia and programmed cell death // Curr Opin Microbiol. 2006. Vol. 9. № 1. P. 102-108. 97. Moore, E. R., Mead, D. J., Dooley, C. A., Sager, J., and Hackstadt, T. The trans-Golgi SNARE syntaxin 6 is recruited to the chlamydial inclusion membrane // Microbiology. 2011. Vol. 157. № Pt 3. P. 830-838. 98. Mourad, A., Sweet, R. L., Sugg, N., and Schachter, J. Relative resistance to erythromycin in Chlamydia trachomatis // Antimicrob Agents Chemother. 1980. Vol. 18. № 5. P. 696-698. 99. Newhall, W. J. and Jones, R. B. Disulfide-linked oligomers of the major outer membrane protein of Chlamydiae // J Bacteriol. 1983. Vol. 154. № 2. P. 998-1001. 100. Newhall, W. J. t. Biosynthesis and disulfide cross-linking of outer membrane components during the growth cycle of Chlamydia trachomatis // Infect Immun. 1987. Vol. 55. № 1. P. 162-168. 101. Nguyen, L. T., Haney, E. F., and Vogel, H. J. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action // Trends Biotechnol. 2011. Vol. 29. № 9. P. 464-472. 102. Nguyen, T. X., Cole, A. M., and Lehrer, R. I. Evolution of primate theta-defensins: A serpentine path to a sweet tooth // Peptides. 2003. Vol. 24. № 11. P. 1647-1654. 103. Nosten, F., McGready, R., d'Alessandro, U., Bonell, A., Verhoeff, F., Menendez, C., Mutabingwa, T., and Brabin, B. Antimalarial drugs in pregnancy: A review // Curr Drug Saf. 2006. Vol. 1. № 1. P. 1-15. 104. Nyberg, P., Rasmussen, M., and Bjorck, L. Alpha2-macroglobulin-proteinase complexes protect Streptococcus pyogenes from killing by the antimicrobial peptide LL-37 // J Biol Chem. 2004. Vol. 279. № 51. P. 52820-52823. 105. Orth, P., Cordes, F., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W., and Hinrichs, W. Conformational changes of the Tet repressor induced by tetracycline trapping // J Mol Biol. 1998. Vol. 279. № 2. P. 439-447. 106. Otvos, L., Jr., O, I., Rogers, M. E., Consolvo, P. J., Condie, B. A., Lovas, S., Bulet, P., and Blaszczyk-Thurin, M. Interaction between heat shock proteins and antimicrobial peptides // Biochemistry. 2000. Vol. 39. № 46. P. 14150-14159. 96 107. Ouellette, A. J. and Selsted, M. E. Paneth cell defensins: Endogenous peptide components of intestinal host defense // FASEB J. 1996. Vol. 10. № 11. P. 1280-1289. 108. Palli, S. R., Kapitskaya, M. Z., Kumar, M. B., and Cress, D. E. Improved ecdysone receptorbased inducible gene regulation system // Eur J Biochem. 2003. Vol. 270. № 6. P. 1308-1315. 109. Park, C. B., Kim, H. S., and Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions // Biochem Biophys Res Commun. 1998. Vol. 244. № 1. P. 253-257. 110. Park, C. B., Yi, K. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., and Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. Vol. 97. № 15. P. 82458250. 111. Park, C. H., Valore, E. V., Waring, A. J., and Ganz, T. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver // J Biol Chem. 2001. Vol. 276. № 11. P. 7806-7810. 112. Patat, S. A., Carnegie, R. B., Kingsbury, C., Gross, P. S., Chapman, R., and Schey, K. L. Antimicrobial activity of histones from hemocytes of the pacific white shrimp // Eur J Biochem. 2004. Vol. 271. № 23-24. P. 4825-4833. 113. Pennini, M. E., Perrinet, S., Dautry-Varsat, A., and Subtil, A. Histone methylation by NUE, a novel nuclear effector of the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis // PLoS Pathog. 2010. Vol. 6. № 7. P. e1000995. 114. Peschel, A., Jack, R. W., Otto, M., Collins, L. V., Staubitz, P., Nicholson, G., Kalbacher, H., Nieuwenhuizen, W. F., Jung, G., Tarkowski, A., van Kessel, K. P., and van Strijp, J. A. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor Mprf is based on modification of membrane lipids with L-lysine // J Exp Med. 2001. Vol. 193. № 9. P. 1067-1076. 115. Peschel, A., Otto, M., Jack, R. W., Kalbacher, H., Jung, G., and Gotz, F. Inactivation of the dlt operon in Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. № 13. P. 8405-8410. 116. Peschel, A. and Sahl, H. G. The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance // Nat Rev Microbiol. 2006. Vol. 4. № 7. P. 529-536. 117. Pinheiro da Silva, F. and Machado, M. C. Antimicrobial peptides: Clinical relevance and therapeutic implications // Peptides. 2012. Vol. 36. № 2. P. 308-314. 118. Powell, J. P. and Wenzel, R. P. Antibiotic options for treating community-acquired MRSA // Expert Rev Anti Infect Ther. 2008. Vol. 6. № 3. P. 299-307. 119. Poyart, C., Pellegrini, E., Marceau, M., Baptista, M., Jaubert, F., Lamy, M. C., and Trieu-Cuot, P. Attenuated virulence of Streptococcus agalactiae deficient in D-alanyl-lipoteichoic acid is due to an increased susceptibility to defensins and phagocytic cells // Mol Microbiol. 2003. Vol. 49. № 6. P. 1615-1625. 120. Qu, X. D., Harwig, S. S., Oren, A. M., Shafer, W. M., and Lehrer, R. I. Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to protegrins // Infect Immun. 1996. Vol. 64. № 4. P. 1240-1245. 121. Ramanathan, B., Wu, H., Ross, C. R., and Blecha, F. PR-39, a porcine antimicrobial peptide, inhibits apoptosis: Involvement of caspase-3 // Dev Comp Immunol. 2004. Vol. 28. № 2. P. 163169. 122. Rivera, V. M., Clackson, T., Natesan, S., Pollock, R., Amara, J. F., Keenan, T., Magari, S. R., Phillips, T., Courage, N. L., Cerasoli, F., Jr., Holt, D. A., and Gilman, M. A humanized system for pharmacologic control of gene expression // Nat Med. 1996. Vol. 2. № 9. P. 1028-1032. 123. Rivera, V. M., Gao, G. P., Grant, R. L., Schnell, M. A., Zoltick, P. W., Rozamus, L. W., Clackson, T., and Wilson, J. M. Long-term pharmacologically regulated expression of erythropoietin in primates following AAV-mediated gene transfer // Blood. 2005. Vol. 105. № 4. P. 1424-1430. 97 124. Roscilli, G., Rinaudo, C. D., Cimino, M., Sporeno, E., Lamartina, S., Ciliberto, G., and Toniatti, C. Long-term and tight control of gene expression in mouse skeletal muscle by a new hybrid human transcription factor // Mol Ther. 2002. Vol. 6. № 5. P. 653-663. 125. Rossi, C., Gibellini, D., Barbanti-Brodano, G., Betti, M., Boarini, C., Pengue, G., Lania, L., and Caputo, A. Transiently transfected and stably integrated HIV-1 LTR responds differentially to the silencing activity of the Kruppel-associated box (KRAB) transcriptional repressor domain // J Med Virol. 1999. Vol. 58. № 3. P. 264-272. 126. Sambri, V., Marangoni, A., Giacani, L., Gennaro, R., Murgia, R., Cevenini, R., and Cinco, M. Comparative in vitro activity of five cathelicidin-derived synthetic peptides against Leptospira, Borrelia and Treponema pallidum // J Antimicrob Chemother. 2002. Vol. 50. № 6. P. 895-902. 127. Schachter, J. and Wyrick, P. B. Culture and isolation of Chlamydia trachomatis // Methods Enzymol. 1994. Vol. 236. P. 377-390. 128. Schittek, B., Hipfel, R., Sauer, B., Bauer, J., Kalbacher, H., Stevanovic, S., Schirle, M., Schroeder, K., Blin, N., Meier, F., Rassner, G., and Garbe, C. Dermcidin: A novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands // Nat Immunol. 2001. Vol. 2. № 12. P. 1133-1137. 129. Schmidtchen, A., Frick, I. M., Andersson, E., Tapper, H., and Bjorck, L. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37 // Mol Microbiol. 2002. Vol. 46. № 1. P. 157-168. 130. Schultz, D. C., Friedman, J. R., and Rauscher, F. J., 3rd Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2alpha subunit of NuRD // Genes Dev. 2001. Vol. 15. № 4. P. 428-443. 131. Scidmore, M. A. Recent advances in Chlamydia subversion of host cytoskeletal and membrane trafficking pathways // Microbes Infect. 2011. Vol. 13. № 6. P. 527-535. 132. Scidmore, M. A. and Hackstadt, T. Mammalian 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG // Mol Microbiol. 2001. Vol. 39. № 6. P. 1638-1650. 133. Selsted, M. E., Harwig, S. S., Ganz, T., Schilling, J. W., and Lehrer, R. I. Primary structures of three human neutrophil defensins // J Clin Invest. 1985. Vol. 76. № 4. P. 1436-1439. 134. Selsted, M. E., Novotny, M. J., Morris, W. L., Tang, Y. Q., Smith, W., and Cullor, J. S. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils // J Biol Chem. 1992. Vol. 267. № 7. P. 4292-4295. 135. Shafer, W. M., Qu, X., Waring, A. J., and Lehrer, R. I. Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. Vol. 95. № 4. P. 1829-1833. 136. Shai, Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides // Biochim Biophys Acta. 1999. Vol. 1462. № 1-2. P. 55-70. 137. Shi, J., Ross, C. R., Chengappa, M. M., Sylte, M. J., McVey, D. S., and Blecha, F. Antibacterial activity of a synthetic peptide (PR-26) derived from PR-39, a proline-arginine-rich neutrophil antimicrobial peptide // Antimicrob Agents Chemother. 1996. Vol. 40. № 1. P. 115-121. 138. Shlyapnikov, Y. M., Andreev, Y. A., Kozlov, S. A., Vassilevski, A. A., and Grishin, E. V. Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom // Protein Expr Purif. 2008. Vol. 60. № 1. P. 89-95. 139. Sieprawska-Lupa, M., Mydel, P., Krawczyk, K., Wojcik, K., Puklo, M., Lupa, B., Suder, P., Silberring, J., Reed, M., Pohl, J., Shafer, W., McAleese, F., Foster, T., Travis, J., and Potempa, J. Degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus-derived proteinases // Antimicrob Agents Chemother. 2004. Vol. 48. № 12. P. 4673-4679. 98 140. Somani, J., Bhullar, V. B., Workowski, K. A., Farshy, C. E., and Black, C. M. Multiple drugresistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure // J Infect Dis. 2000. Vol. 181. № 4. P. 1421-1427. 141. Spaar, A., Munster, C., and Salditt, T. Conformation of peptides in lipid membranes studied by xray grazing incidence scattering // Biophys J. 2004. Vol. 87. № 1. P. 396-407. 142. Sripathy, S. P., Stevens, J., and Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression // Mol Cell Biol. 2006. Vol. 26. № 22. P. 8623-8638. 143. Steiner, H., Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H., and Boman, H. G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. 1981. Vol. 292. № 5820. P. 246-248. 144. Stieger, K., Belbellaa, B., Le Guiner, C., Moullier, P., and Rolling, F. In vivo gene regulation using tetracycline-regulatable systems // Adv Drug Deliv Rev. 2009. Vol. 61. № 7-8. P. 527-541. 145. Stieger, K., Mendes-Madeira, A., Meur, G. L., Weber, M., Deschamps, J. Y., Nivard, D., Provost, N., Moullier, P., and Rolling, F. Oral administration of doxycycline allows tight control of transgene expression: A key step towards gene therapy of retinal diseases // Gene Ther. 2007. Vol. 14. № 23. P. 1668-1673. 146. Suarez-Carmona, M., Hubert, P., Delvenne, P., and Herfs, M. Defensins: "Simple" antimicrobial peptides or broad-spectrum molecules? // Cytokine Growth Factor Rev. 2015. Vol. 26. № 3. P. 361-370 147. Subbalakshmi, C. and Sitaram, N. Mechanism of antimicrobial action of indolicidin // FEMS Microbiol Lett. 1998. Vol. 160. № 1. P. 91-96. 148. Takenaka, K., Nakagawa, H., Miyamoto, S., and Miki, H. The pre-mRNA-splicing factor SF3a66 functions as a microtubule-binding and -bundling protein // Biochem J. 2004. Vol. 382. № Pt 1. P. 223-230. 149. Tan, H. H. Topical antibacterial treatments for acne vulgaris: Comparative review and guide to selection // Am J Clin Dermatol. 2004. Vol. 5. № 2. P. 79-84. 150. Tang, Y. Q., Yuan, J., Osapay, G., Osapay, K., Tran, D., Miller, C. J., Ouellette, A. J., and Selsted, M. E. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins // Science. 1999. Vol. 286. № 5439. P. 498-502. 151. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., and Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: Transcription regulatory systems // Gene Ther. 2004. Vol. 11. № 8. P. 649-657. 152. Tossi, A., Sandri, L., and Giangaspero, A. Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides // Biopolymers. 2000. Vol. 55. № 1. P. 4-30. 153. Tsai, H. and Bobek, L. A. Human salivary histatins: Promising anti-fungal therapeutic agents // Crit Rev Oral Biol Med. 1998. Vol. 9. № 4. P. 480-497. 154. Tsao, H. S., Spinella, S. A., Lee, A. T., and Elmore, D. E. Design of novel histone-derived antimicrobial peptides // Peptides. 2009. Vol. 30. № 12. P. 2168-2173. 155. Tzeng, Y. L., Ambrose, K. D., Zughaier, S., Zhou, X., Miller, Y. K., Shafer, W. M., and Stephens, D. S. Cationic antimicrobial peptide resistance in Neisseria meningitidis // J Bacteriol. 2005. Vol. 187. № 15. P. 5387-5396. 156. Urlinger, S., Baron, U., Thellmann, M., Hasan, M. T., Bujard, H., and Hillen, W. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: Novel mutations yield expanded range and sensitivity // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. Vol. 97. № 14. P. 7963-7968. 157. Vandamme, D., Landuyt, B., Luyten, W., and Schoofs, L. A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide // Cell Immunol. 2012. Vol. 280. № 1. P. 22-35. 158. Vassilevski, A. A., Kozlov, S. A., and Grishin, E. V. Molecular diversity of spider venom // Biochemistry (Mosc). 2009. Vol. 74. № 13. P. 1505-1534. 99 159. Vassilevski, A. A., Kozlov, S. A., Samsonova, O. V., Egorova, N. S., Karpunin, D. V., Pluzhnikov, K. A., Feofanov, A. V., and Grishin, E. V. Cyto-insectotoxins, a novel class of cytolytic and insecticidal peptides from spider venom // Biochem J. 2008. Vol. 411. № 3. P. 687696. 160. Vegeto, E., Allan, G. F., Schrader, W. T., Tsai, M. J., McDonnell, D. P., and O'Malley, B. W. The mechanism of RU486 antagonism is dependent on the conformation of the carboxy-terminal tail of the human progesterone receptor // Cell. 1992. Vol. 69. № 4. P. 703-713. 161. Verbeke, P., Welter-Stahl, L., Ying, S., Hansen, J., Hacker, G., Darville, T., and Ojcius, D. M. Recruitment of BAD by the Chlamydia trachomatis vacuole correlates with host-cell survival // PLoS Pathog. 2006. Vol. 2. № 5. P. e45. 162. Wassing, G. M., Bergman, P., Lindbom, L., and van der Does, A. M. Complexity of antimicrobial peptide regulation during pathogen-host interactions // Int J Antimicrob Agents. 2015. Vol. 45. № 5. P. 447-454. 163. Weiss, J., Elsbach, P., Olsson, I., and Odeberg, H. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes // J Biol Chem. 1978. Vol. 253. № 8. P. 2664-2672. 164. Wiegand, I., Hilpert, K., and Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances // Nat Protoc. 2008. Vol. 3. № 2. P. 163-175. 165. Wissmann, A., Meier, I., Wray, L. V., Jr., Geissendorfer, M., and Hillen, W. Tn10 tet operator mutations affecting Tet repressor recognition // Nucleic Acids Res. 1986. Vol. 14. № 10. P. 42534266. 166. Wiznerowicz, M. and Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vectormediated drug-inducible RNA interference // J Virol. 2003. Vol. 77. № 16. P. 8957-8961. 167. Yamaguchi, S., Hong, T., Waring, A., Lehrer, R. I., and Hong, M. Solid-state NMR investigations of peptide-lipid interaction and orientation of a beta-sheet antimicrobial peptide, protegrin // Biochemistry. 2002. Vol. 41. № 31. P. 9852-9862. 168. Yang, L., Harroun, T. A., Weiss, T. M., Ding, L., and Huang, H. W. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys J. 2001. Vol. 81. № 3. P. 1475-1485. 169. Yasin, B., Harwig, S. S., Lehrer, R. I., and Wagar, E. A. Susceptibility of Chlamydia trachomatis to protegrins and defensins // Infect Immun. 1996. Vol. 64. № 3. P. 709-713. 170. Yasin, B., Pang, M., and Wagar, E. A. A cumulative experience examining the effect of natural and synthetic antimicrobial peptides vs. Chlamydia trachomatis // J Pept Res. 2004. Vol. 64. № 2. P. 65-71. 171. Yount, N. Y. and Yeaman, M. R. Immunocontinuum: Perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance // Protein Pept Lett. 2005. Vol. 12. № 1. P. 49-67. 172. Yount, N. Y. and Yeaman, M. R. Peptide antimicrobials: Cell wall as a bacterial target // Ann N Y Acad Sci. 2013. Vol. 1277. P. 127-138. 173. Zanetti, M. The role of cathelicidins in the innate host defenses of mammals // Curr Issues Mol Biol. 2005. Vol. 7. № 2. P. 179-196. 174. Zasloff, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: Isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc Natl Acad Sci U S A. 1987. Vol. 84. № 15. P. 5449-5453. 175. Zhang, B., Kirov, S., and Snoddy, J. Webgestalt: An integrated system for exploring gene sets in various biological contexts // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33. № Web Server issue. P. W741748. 176. Zhao, H. and Kinnunen, P. K. Modulation of the activity of secretory phospholipase A2 by antimicrobial peptides // Antimicrob Agents Chemother. 2003. Vol. 47. № 3. P. 965-971.
