Алешин В. ДНК-анализ Кыштымского карлика

Алешин В. ДНК-анализ Кыштымского карлика
Алешин В. ДНК-анализ Кыштымского карлика
Алешин В. ДНК-анализ "Кыштымского карлика"
Материал для исследований передал: В.Чернобров, "Космопоиск"
ОТЧЕТ
о проведении исследований образцов, полученных от В.А. Черноброва
Материал. В октябре 2002 г. В.А. Чернобров предоставил мне фрагмент ткани, внешне напоминающей шерстяную, размером
примерно 50 см на 30 см, достаточно толстую (около 1 мм толщиной), белого цвета. Ткань была извлечена им из
полиэтиленового пакета, в который она была тщательно упакована. На ткани было заметно два пятна. Одно - бурого цвета,
с очень четкими краями, напоминающее засохшую кровь, пропитавшую ткань, диаметром примерно 2-3 см, достаточно
правильной округлой формы. В месте описываемого пятна ткань была уплотнена, как это бывает в случаях образования и
высыхания кровяного сгустка. В площади пятна ближе к одному краю имелось единственное округлое отверстие
правильной диаметром около 2-3 мм. Второе пятно было расположено на некотором удалении от первого -может быть, в 5
см, или, может быть, в 20 см, светло-желтого цвета, неправильной формы, с не вполне четкими границами. Оно также было
небольшим, наверное, около 3 см. Ткань в области второго пятна не отличалась от других участков, за исключением
пигментации.
Из полотнища стерильными ножницами было вырезано четыре фрагмента: фрагмент 1 представлял сектор, захватывающий
пятно бурого цвета и близлежащую неокрашенную ткань, его длина по наибольшему измерению составляла около 2-3 см,
однако точно не была измерена, фрагмент 1 захватил описанное выше округлое отверстие; фрагмент 2 отличался тем, что
не захватывал каких-либо особенных элементов в области бурого пятна; фрагмент 3 захватывал часть пятна желтого цвета;
позднее из этого же полотнища был вырезан фрагмент 4, расположенный вдалеке от заметных пятен.
Впоследствии остатки всех вырезанных фрагментов были возвращены В.А.Черноброву.
Выделение предполагаемой ДНК. Для выделения предполагаемой ДНК был использован только материал фрагмента 2. От
него стерильными инструментами было отделено несколько небольших фрагментов (не более 5 мм в длину и не более 1-2
мм в ширину, или же небольшие пучки волокон ткани) двух типов: бурого цвета, из области пятна, и белого цвета, на
расстоянии около 1-1,5 см от границы пятна. Последние расценивались как контрольные. Кроме того, в качестве одной из
проб использовали небольшое количество бурого порошка, счищенного скальпелем с ткани. Для выделения ДНК
использовали три методики. По одной из них пробу обрабатывали протеиназой К и SDS (0,5%) по общепринятой методике,
лизат депротеинизировали фенолом и, после добавления одновалентных катионов до нужной концентрации, ДНК осаждали
этанолом. Второй способ состоял в очистке ДНК с помощью диатомового сорбента (Биоком, Москва) по инструкции
изготовителя. Третий способ представляет собой щелочной лизис (Molecular Ecology, 11: 839-850, 2002). При использовании
любой из методик после некоторого времени инкубации бурый порошок растворялся и пигмент переходил в раствор.
Полимерзная цепная реакция. Было проведено две небольших серии опытов, в которых полученные препараты добавляли в
качестве в полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с олигонуклеотидными затравками (праймерами) к консервативным
участкам генов малой рибосомной РНК. Соответствующие гены есть у всех живых существ на Земле, и традиционно
используются для идентификации природных образцов неизвестного таксономического положения. В первой серии опытов
были проведены реакции с праймерами А и В (по Medlin et al., 1988. Gene 71: 491-499), которые специфичны для генов малой
рРНК (18S рРНК, другое название SSU rRNA) эвкариотов и достаточно универсальны (позволяют амплифицировать
соответствующие гены из большинства видов эвкариотов). Ожидаемая длина продукта с этими праймерами составляет
1,7-1,8 т.п.н. В первой серии опытов не было получено высокомолекулярных продуктов ни в одной из проб.
Во второй серии опытов ПЦР были использованы олигонуклеотидные затравки к эволюционно консервативным внутренним
участкам гена малой рРНК. В нескольких комбинациях были получены полимерные продукты амплификации ожидаемого
размера (от 0,5 до 1,0 т.п.н.). Продукты с идентичной электрофоретической подвижностью были получены как из проб,
содержащих материал бурого пятна, так и из прилежащих участков ткани, не окрашенных бурым субстанцией бурого цвета
("контрольных").
Какие -либо дополнительные исследования полученных продуктов (например, их клонирование и определение
нуклеотидных последовательностей) проведены не были.
Пробы материи, удаленные от бурого пятна на большое расстояние, исследованы не были.
Обсуждение и выводы. Как из проб, содержащих бурую субстанцию, так и из "контрольных" проб, взятых из участков
материи на расстоянии около 1-1,5, самое большее 2 см от границы бурого пятна, выделилась ДНК, пригодная в качестве
матрицы для ПЦР. По-видимому, эта ДНК сильно фрагментирована, поскольку попытка получить продукты размером около
1,7-1,8 т.п.н. с весьма консервативными специфическими для эвкариотов праймерами не была успешной. ПЦР с некоторыми
другими праймерами (не обязательно специфическими для эукариотов) привела к синтезу продуктов около не более 1 т.п.н.
Таким образом, материя по крайней мере вблизи бурого пятна ипрегнирована ДНК. Ее происхождение не было установлено,
также как наличие ДНК в участках ткани, удаленных от пятна. Нельзя исключить, что полученные продукты в "контрольных"
пробах связаны с тем, что "контрольные" пробы были взяты неадекватено - чересчур близко от бурого пятна, из которого
какие-то содержащие ДНК жидкости могли диффундировать на некоторое расстояние.
Очевидно, что имеющийся в распоряжении В.А. Черноброва материал пригоден для генетического анализа, который может
включать следующие элементы:
1) повторную амплификацию с помощью ПЦР небольших (менее 1 т.п.н.) фрагментов ДНК из очень небольших по объему
проб бурой субстанции с последующим их секвенированием, при необходимости с предшествующим клонированием;
2) повторную попытку амплификации ДНК с теми же праймерами из участков полотнища, значительно удаленных от бурого
пятна с последующим секверированнем продуктов (если такие будут получены) и обнаружения различий или идентичности
с продуктами, получающимися из бурого пятна.
Ведущий научный сотрудник
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
кандидат биологических наук
В.В. Алешин