удк 543.421 определение селена в волосах человека визначення

Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
УДК 543.421
В.М. Михеенко, к.х.н., доцент
Донбасская национальная академия строительства и архитектуры, г. Краматорск, Украина
nik@donnaba.edu.ua
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕЛЕНА В ВОЛОСАХ ЧЕЛОВЕКА
Предложена методика определения селена в волосах человека. Разработана программа закрытого микроволнового кислотного разложения проб волос человека. Оптимизирована температурно-временная программа
электротермического атомно-абсорбционного определения селена на атомно-абсорбционном спектрометре «SOLAAR M». Показана эффективность применения зеемановской коррекции фона неселективного поглощения для
анализа биопроб со сложной матрицей. Статистический анализ данных содержания селена в волосах по данной
методике позволил определить нижний предел обнаружения селена в волосах.
Ключевые слова: селен, электротермическая атомно-абсорбционная спектроскопия, зеемановская коррекция фона, модификатор, предел обнаружения.
В.М. Михєєнко, к.х.н., доцент
Донбаська національна академія будівництва і архітектури, м.
Краматорськ, Україна
nik@donnaba.edu.ua
ВИЗНАЧЕННЯ СЕЛЕНУ У ВОЛОСІ ЛЮДИНИ
Запропоновано методику щодо визначення селену у волосі людини. Розроблено програму закритого мікрохвильового кислотного розкладання проб волосся людини. Оптимізовано температурно - часову програму електрохімічного атомно-абсорбційного аналізу визначення селену на атомно-абсорбційному спектрометрі «SOLAAR
M». Показано ефективність застосування зеємановської корекції фону неселективного поглинання для аналізу
біопроб із складною матрицею. Статистичний аналіз даних вмісту селену у волосі за даною методикою дозволив
визначити нижню межу виявлення селену у волосі.
Ключові слова: селен, електрохімічна атомно-абсорбційна спектроскопія, зеєманівська корекція фону,
модифікатор,
V. Mikheenko, PhD.(Chemistry), Assoc. Professor
Donbas National Academy of Civil Engineering and Architecture,
Kramatorsk, Ukraine
nik@donnaba.edu.ua
SELENIUM IDENTIFICATION IN PEOPLE’S HAIR
The methodology for determination of selenium in the human hair is offered. The program of the closed microwave acid decomposition of tests in the human hair is developed. The temperature-temporal program of electro-thermal
atomic absorption determination of selenium is optimized on the atomic absorption spectrometer "SOLAAR M". The
efficiency of application of Zeeman correction of background of unselective absorption for the analysis of bioassays with
a difficult matrix is shown. The statistical analysis of data of maintenance of selenium in hair by means this methodology allowed to define the lower limit of finding of selenium in hair.
Key words: selenium, electrochemical atomic absorption spectroscopy, Zeeman correction of background, modifier.
Формулировка проблемы. Заболевания, синдромы и патологические состояния, вызванные избытком, дефицитом или дисбалансом микроэлементов, установленные клиническими методами, называются микроэлементозами. До недавнего времени селен считался токсичным элементом и его роль в организме человека была недостаточно изучена. На сегодняшний
день роль этого эсенциального элемента в организме человека очень велика. Поэтому актуальной является проблема количественного определения селена в различных биологических образцах человека (кровь, волосы, моча) для лечения и диагностики различных заболеваний
Анализ предшествующих исследований и публикаций. Анализ литературных данных
показал, что в литературе имеется большое количество работ, посвященных методам определения и роли микро- и макроэлементов в организме человека [1, 2]. Среди микроэлементов большую роль в организме человека играет селен, который принимает участие во многих процессах.
11
Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
Селен проявляет противораковые свойства, препятствует развитию мутаций генов, защищает от воздействия радиации, стимулирует антиоксидантные свойства, нормализует обмен
белков и нуклеиновых кислот, регулирует функцию поджелудочной и щитовидной желез [3],
улучшает репродуктивное здоровье, выводит из организма тяжелые металлы (ртуть, свинец,
кадмий, олово). Также селен, необходим для правильного и достаточного функционирования
клеток иммунной системы в развитии противовирусного иммунитета. Причем это касается
всех вирусов гриппа, герпеса, папиломовируса и т.д. Селен помогает удерживать вирус иммунодефицита человека в неактивном состоянии.
Даже небольшое снижение содержания селена приводит к существенному снижению антистрессорной, противоинфекционной и противоопухлевой сопротивляемости организма. Дефицит селена вызывает снижение иммунитета, развитие атеросклероза, ишемической болезни
сердца; существенно повышается риск развития инфаркта миокарда; появляются кожные проявления – дерматиты, экземы, выпадение волос, ломкость ногтей. Кроме того, при дефиците
селена наблюдается замедление роста у детей, часто встречается внезапная смерть детей до года. При недостатке этого элемента чаще развивается рак желудка, предстательной железы, толстой кишки, молочной железы, легких. Дефицит селена может вызвать бесплодие (в основном
мужское).
Напротив, избыток селена приводит к поражению кожи (хронические дерматиты, шелушение), выпадению волос, расслаиванию ногтей, повреждению эмали зубов, появлению чесночного запаха изо рта, тошноты, рвоты, нарушению функции печени. При вдыхании паров селена появляеся насморк, поражение бронхов и легочной ткани вплоть до отека легких.
На схеме 1 представлено влияние селена на организм человека.
Схема 1 - Влияние селена на неспецифическую резистентность организма
Добавление Se повышает:
Фагоцитарную активность Мф
Недостаток Se повышает:
- вирулентность вирусов
- агрегацию тромбоцитов
Добавление Se повышает:
- миграцию нейтрофилов
- продукцию О2· нейтрофилами
макрофаги
NK клетки
нейтрофилы
Se
Добавление Se повышает:
- активность натуральных киллеров
- активность лимфокин-активированных NK-
Недостаток Se снижает:
- хемотаксис нейтрофилов
- антимикробную активность Нф
- антигрибковую активность Нф
УФ-индуцированный кожный канцерогенез,
УФ-идуцированную эритему, -УФ-идуцированный апоптоз, - продукцию провоспалительных цитокинов
(IL-6, IL-8, TNF) в клетках кожи при УФ облучении,
повреждение ДНК и перекисное окисление липидов в УФ
облученных клетках кожи
Добавление Se повышает:
ультрафиолет
Для определения микроколичеств селена в биоматериалах используют различные методы: спектрофлуориметрию, нейтроноактивационный анализ, атомно-абсорбционную спектроскопию (ААС), эмиссионную спектроскопию с индуктивно связанной плазмой, газовую и жидкостную хроматографию, рентгено-флуоресцентный анализ и другие. Наиболее часто исполь12
Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
зуют ААС в сочетании с гидридной техникой, а также ААС с электротермической атомизацией.
При этом коррекция Зеемана вносит свои приемущества в ААС анализ [4-10].
Цели. Разработка методики количественного атомно-абсорбционного определения селена в волосах человека.
Основной материал. В качестве объекта исследования были взяты образцы волос человека. Методом анализа был выбран атомно-абсорбционная спектроскопия с использованием
электротермического атомизатора, так как селен является микроэлементом и его содержание в
волосах человека низкое.
Количественный атомно-абсорбционный анализ основан на основном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера, который связывает абсорбционность (оптическую плотность)
атомного пара А с концентрацией определяемого элемента с (формула 1)
А= -lgT = -lg
(1)
= klc,
где Т – пропускание; Io и I – интенсивность падающего и прошедшего через атомизатор света; l
– толщина поглощающего слоя; k – атомный коэффициент поглощения, пропорциональный вероятности оптического перехода.
Почти для всех элементов k находится в пределах 107 – 109. Сравнение с фотометрическим методом, где максимальное значение молярного коэффициента светопоглощения ε ≈ 105,
показывает, что чувствительность атомно-абсорбционного метода выше
Волосы для анализа желательно брать неокрашенные, отбор проб проводить от корня 2-3
см (состояние организма за последние 2-3 месяца). Если человек пользуется шампунем или пастой «Сульсена», которые содержат селен, то данные анализа будут значительно завышены. Для
анализа волос брали навеску массой 0,3000 г. Перед анализом волосы моют, обезжиривают этанолом и сушат. Разложение проб волос проводили в закрытых тефлоновых автоклавах в микроволновой печи «MARS» путем добавления концентрированной азотной кислоты. Всегда ставили холостую пробу, которая проходила через те же стадии пробоподготовки, что и пробы волос.
Для определения селена нельзя использовать открытое мокрое разложение, так как могут быть
потери этого элемента. Программа для разложения проб в СВЧ печи «MARS» была подобрана
экспериментально и представлена в таблице 1
Таблица 1.
Программа для закрытого кислотного разложения проб волос в микроволновой печи «MARS»
Давление, Р
Мощность
W, Вт
%
Время τ,
мин
psi
атм
1200
1200
30
60
4
15
100
200
7,14
14,28
Время
Температура
удержания,
Т, °С
мин
85
4
180
10
В контрольном автоклаве находился датчик температуры и давления, что позволило в
режиме online контролировать процесс разложения проб. На этапе подбора оптимальной программы разложения образца это черезвычайно упрощает задачу исследователя.
Исследования проводились на атомно-абсорбционном спектрометре «SOLAAR-M» компании ThermoElectron (рис. 1).
13
Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
Рис.1. Атомно-абсорбционный спектрометр c электротермическим атомизатором «ThermoElectron SOLAAR M»
В качестве источника излучения использовали кодированную лампу с полым катодом
(ЛСП) на селен (ток ЛСП 80 %), юстировка лампы проводилась в автоматическом режиме. При
проведении анализа использовали длину волны 196,0 нм, тип графитовой кюветы ELC, ширину
щели монохроматора 0,5 нм. В качестве модификатора использовали нитрат никеля с концентрацией 4 г/л. Применение модификатора препятствовало потере селена на стадии пиролиза в
виде легколетучих соединений. Наиболее удачным оказалось мокрое введение модификатора.
Объём вводимой в графитовую кювету пробы составлял 20 мкл, модификатора 5 мкл, смачивателя 5 мкл. Проба и модификатор вводились в кювету с помощью автосамплера (FS 95/97), носик которого промывался каждый раз раствором промывной жидкости. Применение автосамплера позволяет точно дозировать пробу аналита, автоматически вводить добавки определяемого элемента а также модификатора, разбавлять растворы при необходимости а самое главное
увеличивает производительность анализа. Калибровочный график строили по методу добавок
(рис. 2), так как мы имели дело со сложной матрицей. К пробе волос вводили добавки стандартного раствора нитрата селена (ГСО) с концентрацией селена 8, 16, 32 мкг/л.
Рис.2. Градуировочный график по методу добавок
Отрезок 0-Сх соответствует концентрации определяемого элемента в растворе пробы, Аоптическая плотность (абсорбционность) с учетом холостой пробы.
14
Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
Температурно-временная программа, подобранная экспериментальным путем представлена в табл. 2. Температура атомизации селена выбрана 2300 °С на основании максимального
сигнала абсорбции селена в пробе при данной температуре.
Таблица 2.
Температурно-временная программа определения селена в волосах методом ЭТААС.
t,
Скорость подъема
Скорость подаT, °C
Стадия
сек
температуры, °C/ сек
чи Ar, л/мин
0
0,2
0
0,1
сушка
10
0,2
100
20,0
7
0,2
150
10
пиролиз
20
0,2
300
20
50
0,2
1150
15
атомизация
0
Выкл.
2300
3
очистка кюве0
0,3
2500
3
ты
На стадии сушки удаляется растворитель из образца, затем следует стадия пиролиза (состоит из 3-х этапов). На стадии пиролиза удаляются основные компоненты матрицы, а аналит
переводится в предатомизационное состояние. На стадии атомизации образуются свободные
атомы определяемого элемента (Se).
Мы использовали графитовую кювету с пиропокрытием типа ELC, так как пироуглеродное покрытие позволяет исключить диффузию паров при атомизации пробы и увеличить срок
службы самой кюветы. На рис. 3 представлен температурный профиль продольно расположенной графитовой кюветы.
Рис. 3. Температурный профиль продольно расположенной графитовой печи
Учет неселективного поглощения проводили с помощью зеемановской коррекции фона
(магнитное поле до 0,8 тесла), так как на длине волны 196,0 нм дейтериевая коррекция фона не
эффективна. Уникальная система телевидения ЭТА (GFTV-наблюдение), обеспечивает высококачественное изображение процессов в графитовой кювете в режиме реального времени (online)
и значительно облегчает оптимизацию температурно-временной программы. Норма содержания селена в волосах человека составляет 0,5-1,5 мкг/г. Предел обнаружения по 3 критерию
составил 0,15 мкг/г.
15
Збірник наукових праць ДонНАБА
Випуск №1 – 2015 (1)
В ЭТААС для характеристики чувствительности метода используют характеристическую массу, которая рассчитывается по формуле 2:
mхар. =
∙ ∙ ,
,
(2)
где Qa – интегральное значение абсорбционности, V- объем вводимой пробы, мл; С- концентрация элемента г/мл.
Характеристическая масса это масса элемента в растворе, соответствующая 1% поглощения или 99% пропускания (A= -lg0,99 = 0,0044). Характеристическая масса для Se по данной
методике составила 58 пг или 58·10-12 г (для водных растворов 10,2 пг).
Следует отметить, что графитовая кювета с пиропокрытием, прошедшая более 600 циклов
уже не может использоваться для точного количественного определения селена, так как пиропокрытие разрушается из-за высокой кислотности проб.
Для проверки правильности данной методики мы использовали стандартный образец волос, а также метод добавок.
Выводы. Предложена методика определения селена в волосах человека методом ЭТААС. Благодаря закрытому микроволновому разложению пробы на стадии пробоподготовки весь
селен остается в пробе на момент анализа. Применение зеемановской коррекции фона позволило значительно уменьшить неселективное поглощение фона, свойственное биологическим матрицам. Предложено использование в качестве модификатора нитрат никеля.
ЛИТЕРАТУРА
1. Демидов В.А. Элементный состав волос и заболеваемость взрослого населения / В.А.
Демидов, Е.В. Лакарова, М.Г. Скальная и др. // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2011. – №15(134). – С. 45-48.
2. Луговая Е.А. Региональные особенности содержания химических элементов в организме
лиц старших возрастных групп города Магадана / Е.А. Луговая, А.Л. Максимов, Е.М.
Степанова // Экология человека. – 2015. - №2. С.10-15.
3. Караченцев Ю.И. Обеспеченность селеном отдельных регионов Cумской области и особенности частоты патологии щитовидной железы // Ю.И. Караченцев, О.А. Гончарова,
Е.И. Подорога // Международный эндокринологический журнал. – 2013. – №5(53). –
С.17–20.
4. Ермаков В.В. Особенности количественного определения селена в биоматериалах / Ермаков В.В., Тютиков С.В., Хушвахтова С.Д. и др. // Вестник Тюменского государственного университета. – 2010. - №3. С. 206-214.
5. Ермаков В.В. Флуориметрическое определение селена в продуктах животноводства, органах (тканях) животных и объектах окружающей среды // Методические указания по
определению пестицидов в биологических объектах. М.: ВАСХНИЛ, 1985. С. 28-35.
6. Ермаков В.В., Тютиков С.Ф. Геохимическая экология животных. М.: Наука, 2008. 310 с.
7. Lobinski, R., Edmonds, J.S., Suzuki, K.T., Uden, P.C. Species-selective determination of selenium compounds in biological materials // Pure Applied Chemistry. - 2000. – Vol.72. No.3. –
P. 447-481.
8. Ralston, N.V.C., Unrine J., Wallschager D/ Biogeochemistry and analysis of selenium and its
species. Waschington, 2009. 55 ps.
9. Watkinson, J.H. Fluorimetric determination of selenium in biological material with 2,3diaminonaphtalene // Analytical Chemistry. - 1966. – Vol. 38. No. 1. – P. 92-87.
10. Whetter, P.A. and Ullrey, D.E. Improved Fluorometric Method for Determining Selenium // J.
Assoc. Off. Anal. Chem. – 1978. – Vol. 61. No. 4. – P. 927.
Стаття надійшла до редакції 13 жовтня 2015 р.
16