Что происходит в генетической лаборатории?

16
Что происходит в
генетической лаборатории?
Данная брошюра составлена при участии Dr Ian M Frayling, Institute of
Medical Genetics, University Hospital of Wales, Cardiff, UK; Dr Domenico
Coviello, Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS, Milan, Italy and
The Genetic Interest Group.
Иллюстрации: Rebecca J Kent
www.rebeccajkent.com
rebecca@rebeccajkent.com
Информация для пациентов и
членов их семей
2
Что происходит в генетической лаборатории?
Данная брошюра содержит информацию о том, каким
образом проводится исследование образцов в генетической
лаборатории. Особенно важными для обсуждения являются
следующие вопросы:
•
какие лабораторные методики используются для
проведения генетических исследований;
•
почему одни анализы можно сделать быстро, а другие
– нет;
•
почему в некоторых случаях лаборатория не может
дать определенный ответ.
Более подробная информация о том, почему Вам может
понадобиться генетическое исследование, содержится в
брошюре «Что такое генетическое исследование?»
Что такое генетическое исследование?
Большинство генетических исследований представляет
собой изучение ДНК – химического соединения, которое
содержится в наших клетках и содержит «инструкции» для
роста, развития и функционирования организма. ДНК можно
представить в виде нити кодированной информации,
разделенной на отдельные «инструкции», называемые
генами. У человека известно более 30,000 различных генов,
которые входят в состав
хромосом. Мы наслед уем
хромосомы от наших родителей
– 23 от мамы и 23 от папы, всего
– 23 пары (или два набора по 23
хромосомы). Если представить
генетический набор человека
как «книгу жизни», то ДНК можно
сравнить с буквами, гены – со
словами, а хромосомы – с
главами.
15
14
использовались в этих целях, он должен сообщить об этом.
Как любые данные медицинского обследования, образцы
ДНК относятся к материалам истории болезни и хранятся в
соответствии с правилами конфиденциальности. Это
означает, что доступ к ним имеет только соответствующий
медицинский специалист.
Рисунок 1: Гены, хромосомы и ДНК
3
Некоторых людей беспокоит вероятность доступа к их
образцам ДНК лиц из правоохранительных органов. Такая
ситуация может возникнуть крайне редко. Однако если в
генетическую лабораторию поступает соответствующий
запрос о выдаче образцов ДНК (или любого другого
медицинского документа или биологического образца), то
это возможно только в случае судебного распоряжения.
Изменения в генах или хромосомах называются мутациями.
Продолжая аналогию с книгой, мутации можно представить
в виде неправильно написанных слов или замены слов в
предложении. Мутации встречаются очень часто, и у
каждого человека есть некоторое количество мутаций.
Мутация может иметь положительный или отрицательный
эффект, а может и вовсе его не иметь. Это зависит от
воздействий внешней среды, фактора случайного выбора
или мутаций в других генах. Мутации приводят к
заболеваниям, если они нарушают передачу необходимых
«инструкций» для нормального функционирования от
данного гена организму. Следовательно, целью
генетического исследования является поиск мутаций на
уровне гена или хромосомы. Как правило, для генетического
исследования используются образцы крови. Иногда
используются образцы других тканей (например, слюны),
однако образцы крови предпочтительнее, так как они
позволяют получить достаточное количество качественной
ДНК, необходимой для проведения исследования. Образец
крови или ткани пациента отправляется в лабораторию для
анализа генов или хромосом.
4
Как правило, медико-генетические центры или клиники
имеют свои генетические лаборатории. Однако генетических
заболеваний и соответствующих анализов очень много, и
выполнить все возможные исследования в одной
лаборатории невозможно. Кроме того, среди генетических
заболеваний много очень редких состояний, диагностика
которых может осуществляться всего в одной-двух
лабораториях во всем мире. Поэтому иногда исследуемый
образец может быть отправлен в специализированную
лабораторию, в которой осуществляется диагностика,
необходимая с точки зрения Вашего врача.
Также важно помнить, что, как правило, результаты
генетического исследования содержат информацию только о
том заболевании, для которого проводился данный анализ.
Пока не существует какого-либо «универсального»
генетического теста, который мог бы выявить все возможные
генетические заболевания. Целью медицинского
генетического исследования является предоставление
информации о здоровье данного человека или членов его
семьи. Как правило, в задачи исследования не входит
дополнительная генетическая информация (например,
установление отцовства), которая иногда может быть
выявлена в ходе исследования.
Генетические лаборатории
Существует два основных вида
генетических лабораторий. В
одном случае исследуются гены,
в другом – хромосомы.
1)
Цитогенетическое
исследование
Если
доктор
подозревает
у
13
разных этапах предусмотрены «контроли качества». Если
обнаруживается мутация, для подтверждения результата ее
обязательно проверяют повторно (в процессе исследования
есть много автоматических этапов, однако специалист все
равно должен все проверить лично). Нередко специалисты
проводят дополнительное независимое исследование,
чтобы проверить первоначальные результаты. Существуют
специальные методы контроля для исключения возможности
перепутывания образцов. Кроме этого, существует система
внешнего контроля и обмен данными между лабораториями
для выработки оптимальных схем и методик лабораторной
диагностики генетических заболеваний.
Что произойдет с моим образцом крови (ткани) после
выполнения анализа?
Как правило, в лаборатории хранятся ДНК и препараты
хромосом, если пациент не выразил желание, чтобы их
уничтожили после проведения анализа. Лаборатория может
выдать образцы ДНК или уничтожить их в любое время по
просьбе пациента. Использование ДНК пациента для поиска
каких-либо других изменений не проводится без согласия
пациента.
Если появляются новые диагностические возможности,
лаборатории могут проводить исследования на сохраненных
образцах (например, если предыдущий анализ был
безрезультатным) при наличии согласия пациента. В этом
случае и врачи, и пациенты будут уверены, что на данном
этапе сделано все возможное для диагностики данного
заболевания. Лаборатории могут использовать анонимные
образцы ДНК для разработки новых методов, или
использовать их в программах обмена образцами между
лабораториями при внешнем контроле качества работы
лаборатории и выработки оптимальных схем диагностики.
Если пациент не хочет, чтобы его образцы ДНК
12
работы и времени. В этом случае поиск не ограничен
определенным участком гена, и может понадобиться анализ
полной последовательности одного или нескольких генов.
Это длительный процесс, который может занять несколько
месяцев. На продолжительность анализа влияют такие
факторы как размер гена и технические возможности
лаборатории.
Например, в случае мышечной дистрофии Дюшенна
заболевание обусловлено мутациями в гене дистрофина,
одном из самых длинных из известных генов. Известны
тысячи различных мутаций в данном гене, и поэтому поиск
одной из них в конкретной семье может быть длительным и
сложным. С другой стороны, при болезни Гентингтона
мутации всегда возникают в одном и том же небольшом
участке гена гентингтина, и для специалистов в
лаборатории проведение такого анализа намного быстрее и
проще.
Еще одним важным фактором является качество ДНК.
Иногда при проведении анализа необходимо исследование
ДНК умерших родственников, и если качество такой ДНК
плохое, то время, необходимое для окончательного
результата, может увеличиваться в два-три раза. В
некоторых случаях проведение или завершение анализа
невозможно из-за недостаточного количества ДНК.
Могут ли результаты быть ошибочными?
Так как результаты генетических исследований имеют
крайне важные последствия для пациента и его
родственников, они должны быть очень тщательно
продуманы и правильно сформулированы. Для
достоверности полученных данных в ходе исследования на
5
пациента генетическое заболевание, связанное с
изменениями одной из хромосом, то он назначит
исследование в цитогенетической лаборатории.
Исследуемым материалом может быть кровь, кожа,
амниотическая жидкость или ворсины хориона. Вначале
клетки биологического материала необходимо нарастить,
затем их помещают на специальные стекла и анализируют с
помощью микроскопа.
При этом хромосомы окрашены
специальным красителем, чтобы их было лучше видно.
Рисунок 2: Как выглядят хромосомы под микроскопом
В первую очередь цитогенетик оценивает количество
хромосом. Некоторые заболевания связаны с наличием
дополнительных хромосом или, наоборот, отсутствием
определенных хромосом. Примером такого заболевания
является синдром Дауна, при котором у пациентов
присутствует одна дополнительная хромосома. Цитогенетик
также оценивает структуру хромосом. Изменения
структуры хромосом могут быть связаны с разрывом,
изменением формы или размера хромосомы. Это может
происходить вследствие утраты части хромосомы или
появления в ней дополнительных фрагментов. Иногда эти
6
изменения очень небольшие по размерам, и их трудно
выявить. В таких случаях используется специальная
методика – флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).
Она позволяет выявлять изменения, которые слишком малы
по размерам для обычного микроскопического
исследования, а также используется для проверки и
подтверждения данных микроскопического анализа при
небольших размерах изменений хромосом.
Рисунок 3: Хромосомы, расположенные в порядке
нумерации: кариотип
лаборатории, может быть не выявлена.
•
•
11
На сегодняшний день ученым известны далеко не все
гены, мутации в которых приводят к определенным
генетическим заболеваниям.
У пациента может быть не то генетическое
заболевание, которое предполагает врач, и,
соответственно, поиск ведется не в тех генах или
хромосомах, которые ответственны за развитие
заболевания.
Важно отметить, что методы генетических исследований
постоянно совершенствуются, и наши знания о причинах
наследственных заболеваний очень быстро расширяются.
Поэтому, если мутация не была выявлена в настоящее
время, возможно, в ближайшем будущем это будет
возможно.
Почему некоторые генетические анализы проводятся
быстро, а другие – медленно?
Цитогенетическое исследование может быть относительно
длительным. Необходимое наращивание клеток занимает не
менее недели, затем еще около недели может понадобиться
для подготовки образцов и микроскопического анализа.
2) Молекулярно-генетическое исследование
Если
доктор
подозревает
у
пациента
генетическое
Если в семье есть другие ранее обследованные больные, в
лаборатории знают, какую именно мутацию необходимо
искать, и это намного ускоряет сроки выполнения анализа.
Анализ проводится быстрее также в ситуации, когда поиск
сужен до определенного участка гена. В этих случаях анализ
занимает в среднем 1-2 недели.
Однако если в семье раньше не было выявлено мутаций,
или известно несколько генов, связанных с заболеванием, то
для выполнения анализа может понадобиться больше
10
проанализировать. Если в данном гене у пациента
выявляется мутация, которая уже была ранее описана у
других больных как причина муковисцидоза, то диагноз
считается подтвержденным.
В некоторых случаях у ребенка присутствует заболевание,
однако ни у одного из родителей мутаций не обнаружено. В
этих случаях вероятнее всего мутация произошла при
оплодотворении, и такую мутацию называют «новой», или
«вновь возникшей» (от латинского «de novo»).
В некоторых случаях лабораторное исследование не может
дать однозначный ответ – является ли найденная мутация
причиной заболевания или нет. Такие мутации относят к
«неклассифицированным
вариантам».
Подобное
заключение может разочаровать и врача, и пациента.
Однако очень важно отметить, что если бы в сомнительном
случае заключение было в пользу мутации как причины
заболевания (а на самом деле эта мутация не имела бы
отношения к развитию болезни), это привело бы к
постановке неправильного диагноза со всеми вытекающими
последствиями.
Всегда ли
мутации?
лабораторное
исследование
выявляет
В некоторых случаях при проведении поиска причины
заболевания мутации не выявляются.
Существует несколько причин для подобной ситуации:
•
Иногда при генетическом исследовании проводится
поиск только некоторых, наиболее частых, мутаций,
известных для данного заболевания. Поэтому редкая
мутация, не входящая в число анализируемых в данной
7
заболевание, связанное с изменением (мутацией) в гене, то
он назначит исследование в молекулярно-генетической
лаборатории для анализа ДНК определенного гена. Код
ДНК, в котором зашифрованы «инструкции» для организма,
состоит из четырех «букв», обозначающих азотистые
основания в составе ДНК: А (аденин), Ц (цитозин), Г (гуанин)
и Т (тимин). При молекулярно-генетическом исследовании
определяется точная последовательность «букв» в
анализируемом гене, что позволяет выявить какие-либо
отклонения от нормальной последовательности (назовем их
«ошибки написания»). Один ген может кодироваться 10000
и более «буквами», и специалисты лаборатории обладают
необходимыми знаниями и владеют методиками,
позволяющими расшифровать и проанализировать всю
протяженность гена. Выявленные изменения (мутации) гена
могут являться причиной заболевания.
В отличие от хромосом, ДНК нельзя увидеть с помощью
микроскопа. Молекулярные генетики выделяют ДНК из
клеток и с помощью специальных химических реакций и
приборов расшифровывают анализируемый ген. Для
выявления мутаций используется много разных методов.
Одним из наиболее часто используемых является
секвенирование.
8
Рисунок 4: секвенирование ДНК: обратите внимание на
разницу!
9
Откуда в лаборатории знают, является ли эта мутация
причиной заболевания?
Это очень важный вопрос. В генетических лабораториях
знают, что «любой может найти мутацию, но далеко не
каждый может объяснить ее значение». Мутации могут
иметь разную степень значимости, и ответ на вопрос о
последствиях выявленных изменений требует специальных
знаний о заболевании и его связи с данным геном или
хромосомой, а также очень внимательного анализа всех
клинических и генетических данных.
Нормальная
последовательность
ДНК
Последовательность ДНК
пациента
На рисунке показан фрагмент последовательности гена.
Если Вы видите цветное изображение рисунка, то заметите,
что каждая «буква» кода ДНК обозначена своим цветом. На
одном
изображении
представлена
нормальная
последовательность ДНК данного фрагмента, а на другом –
последовательность ДНК пациента.
В нормальной
последовательности каждой «букве» соответствует один
пик, в то время как у пациента в месте, обозначенном
стрелкой, присутствуют два пика в одном и том же
положении – Г (черный цвет) и Ц (синий цвет). Это означает,
что в данном месте на одной из хромосом соответствующей
пары присутствует мутация.
Так как направление поиска лабораторного генетического
исследования определяется направляющим диагнозом, то
крайне важны данные клинического обследования,
проведенные врачом-генетиком (или врачом другого
профиля, направившим пациента на генетический анализ).
Врач должен осмотреть пациента, его родственников,
собрать семейный анамнез, а также учесть результаты
других обследований, проведенных ранее. На основании
этой информации врач решает, какое лабораторное
генетическое исследование необходимо провести в данном
случае цитогенетическое или
молекулярно-генетическое, и какую
хромосому или какой ген необходимо
исследовать. Например, если врач на
основании симптомов заболевания и
семейного анамнеза предполагает,
что у пациента – муковисцидоз, то у
пациента возьмут кровь и отправят
образец в лабораторию. В
сопроводительных документах будет
указана соответствующая
информация о заболевании и
предположительный диагноз, а также
ген, который необходимо