АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. И. БАХА l№9 На правах рукописи Е. В. ПАКШИНА ИЗУЧЕНИЕ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В СВЯЗИ СО СТРУКТУРОЙ И ФОТОХИМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ ПИГМЕНТОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени ' кандидата биологических наук Научный руководитель — член-корреспондент Академии наук СССР, профессор А. А. Красновский Мосва — 1965 АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. Н. БАХА На правах рукописи Е. В. ПАКШИНЛ ИЗУЧЕНИЕ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В СВЯЗИ СО СТРУКТУРОЙ И ФОТОХИМИЧЕСКИМИ.СВОЙСТВАМИ ПИГМЕНТОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени: кандидата биологических наук Научный руководитель — член-коррешондент Академии наук СССР, профессор А. А. Краеновский JSacKOEcercR «рд. А'еанааСеяызз.! Мосва — 1965 Защита диссертации состоится в Институте биохимии им. А. Н. Баха ЛН СССР M*J<Jjc<6 -А&А^Т^ . 1965 г. Автореферат разослан . uuUf'JiOU. . 1965 г. Просьба Ваши отзьшы и замечания присылать по адресу: г. Москва, Лешшскии проспект 33, Институт, биохимии им. А. Н. Баха АН СССР, Ученому секретарю. ВВЕДЕНИЕ Превращение хлорофилла в феофитин представляет со­ бой замещение центрального атома магния в молекуле пиг­ мента на два атома (водорода: ХЛОРОФИЛЛ + 2Н *-* ФЕОФИТИН + Mg + + Еще Вилыитеттер и Штоль (1919) нашли, что хлорофилл «а» быстрее превращается в феофитин, чем хлорофилл «в». Ис­ следование этой реакции в растворе," проведенное в работах Маккинея и Джослина (1938, 1940, 1941), а также Лам орт а (1956) показали, что эта реакция следует первому порядку, и что хлорофилл «а» реагирует в 8—9 раз быстрее, чем хло­ рофилл «в». По вопросу о действии света на реакцию феофитпнизации в литературе имеются разноречивые указания. Иоргенсен и Кид (1916) отмечали, что при экспонировании на свету кол­ лоидных растворов хлорофилла в присутствии двуокиси угле­ рода о них образовывалось больше феофитнна, чем в неосвещавшихся растворах. Рабинович в своей монографии (1.951) указал «а неопубликованные опыты, в которых наблюдалось. ускоряющее действие света на феофитинизацию хлорофилла в растворе при рН более 3. По данным Ламорта (1956), свет не ускорял феофитинизацию IB водно-'бутаноловьгх растворах хлорофилла. По данным Аронова и Мамашей (1943), фотоокисление не стимулирует феофитинизацию. Известно, что реакция обратимого фотовосстановления хлорофилла в водном пиридине аскорбиновой кислотой (Красновский 1948) сопровождается потерей магния частью молекул пигмента. Исследование кинетики этого процесса (Баншгстер 1959—fl961) показало, что феофитин образуется из восстановленной формы хлорофилла через стадию восста­ новленного феофитина..Хлорофилл, восстановленный в толуо­ ловом растворе фенилгидразином, при обратной реакции так­ же подвергается феофитинизации (Евстигнеев и Гаврилова 1953). 3 Действие света на феофитинизацию заслуживает особого рассмотрения в плане связи этого шроцеоса с обратимыми окислителыю-восстаноюительньгми превращениями пигмен­ тов, изучение которых является одним из путей, ведущих к выяснению природы первичных реакций фотосинтеза. Феофитин постоянно сопровождает хлорофилл и его ана­ логи при извлечении пигментов из фотосинтезирующих орга­ низмов. В заметных количествах он накапливается в них лишь в особых условиях. Давно известно, что в листьях растений феофитин образуется при старении, когда происходит наруше­ ние упорядоченной структуры хлорапластсш и связанное с этим образование из хлорофилла различных продуктов де­ струкции. В последнее время при изучении: бактериального фотосин­ теза появляются факты, говорящие о том, что феофитин мо­ жет присутствовать в молодых фотосинтезирующих организ­ мах и даже в особых случаях выполнять в них вместо бакте­ риохлорофилла роль поглощающего свет пигмента, передавая энергию той небольшой части бактериохлорофилла, которая непосредственно участвует в фотореакциях фотосинтеза. Так, "по данным Клейтона (1963), при продолжительном экспони­ ровании на сильном свету в анаэробных условиях зелено-го­ лубых мутантов Rhodopseudomonas spheroides" основная мас­ са бактериохлорофилла последних превращалась в бактериофеофитин, причем световые реакции о выделенных из этих «феофитинизированных» клеток хроматофорах сохраняли тот же характер, что и в исходных бактериях. Кпхара и Френ­ кель (1963) изолировали из 'молодой культуры пурпурных фотосинтезирующих бактерий частицы, содержащие бактериофеофитин и не содержащие бактериохлорофилла. Можно думать, что и в хлоропластах постоянно присутствует неболь­ шое количество феофитина либо как продукт деструкции хлорофилла в непрерывной цепи его обновления, а возможно и как 'побочный продукт окислительно-восстановительных превращений пигментов. -' Главные задачи работы сводились к следующему: '1. Сравнительное исследование скорости феофитинизацин хлорофилла «а», хлорофилла «в», их хлорофнллпдов, протохлорофилла, бактериохлорофилла и бактериовиридина в раз­ личных органических растворителях с целью установления 'связи этой реакции со структурой пигмента а также получе"ния данных, необходимых для последующего исследования 'действия света на этот процесс. : 4 2. Исследование действия света на феофитинизацшо хло­ рофилла и его аналогов в органических растворителях, в твердых пленках и адсорбатах. Изучение связи реакции феофитинизации с обратимыми окислнтельно-восстанов;ителыш: ми превращениями и необратимым фотоокислительным раз­ рушением пигментов фотосинтезнругощих организмов. 3. Сравнение по скорости феофитиннзация хлорофилла «а» и «в» в листьях и гомогенатах. Изучение действия света на феофитинизащию в лиетьяьх, •гомогенатах и в суспензиях фотосинтезирующих бактерий. Л\ЕТОДИКА Выделение пигментов. Хлорофилл «а» и хлорофилл .«в» получали из листьев крапивы, следуя модифицированному в нашей лаборатории методу Цшейле и Комар с конечной хроматографической очисткой на сахорозе. Протохлорофилл из­ влекали ацетоном из внутренних оболочек тыквенных семян, предварительно очищенных от внешних оболочек и смочен­ ных водой, пигмент далее переводили в серный эфир и хроматохрафировали на сахарной колонке из смеси петролейного и серного ефиров (7 : 3). Бактериохлорофнлл выделяли из культуры Rhodopseudomonas palustris, экстрагировали пиг­ менты метиловым спиртом, переводя их далее в эфир и хроматографируя на сахорозе из смеси петролейного и серного эфнров (7 : 3). Бактериовиридин выделяли из культуры зеленьих бактерий Chloropseudomonas ethylieum, извлекая аце­ тоном, переводя пипмент далее в серный эфир с конечной хро­ матографией на сахарозе из омеси серного и петролейного эфиров (1 : !1). Хлорофиллиды «а» и «в» получали из соот­: ветствующих хлорофиллов, для чего раствор пигмента в 65% ацетоне встряхивали в течение 6 часов с ацетоновым препа­ ратом хлорофнллазы из листьев сахарной свеклы, получен­ ном в условиях, близких к описанным Холден (1961). Измерение скорости феофитвдшзации осуществляли путем измерения спектров (поглощения на спектрофотометре СФ-5 и на регистрирующем спектрофотометре СФ-10. Запись спект­ ров обнаруживала четкое постоянство изобестичеокнх точек, что позволяло судить об отсутствии в данном случае какихлибо побочных, отличных от феофитини'зации процессов. Ко­ личество образовавшегося феофнтина вычисляли либо на ос­ новании измерения падения оптической .плотности в характер­ ных максимумах поглощения походных пигментов либо по 5 росту оптической плотности в максимумах поглощения обра­ зующихся феофнтннов. Требуемая кислотность а водно-слиртозЫх, водно-аЦетоновЫх и водно-тирйднновых 'растворах пигментов создавалась добавлением щавелевой или соляной кислот. Значения рН растворов измерялись на потенциомет­ ре «ЛН-58» со стеклянным элеиародам. Пигменты обычно брали в концентрации 1 X Ю~5 — 3 X 10~5 м/л. Изменение концентрации пигмента а этО'М пределе не влияло на скорость феофнтинизацни, которая зависила лишь от концентрации кислоты. |Пр,и выяснении влияния света «а реакцию феофнтиниза­ цни опыты проводили в трубках Туиберга, с тем, чтобы избежать шобочного фотоокисления. Освещение '.производи­ ли |в термостатированной установке кинолампой 500 вт с конденсором через красный светофильтр КС-Ш, или без светофильтра. -Потенциометрические "измерения проводила о пиридино­ вых растворах против каломельного элезсгрода с помощью потенцио;метра ЛП-5, согласно cxeate,. принятой в нашей ла­ боратории (Евстигнеев, Гаврилова, 1953). I. СРАВНЕНИЕ КИНЕТИКИ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ Исследовались хлорофилл «а», хлорофилл «в», •соответст­ вующие 'им безфитольные производные— хлорофиллиды, непосредственный предшественник хлорофилла в бношнтеги'чеакон цепи •—протохлорофилл и пигменты фотосинтезаругащих бактерий бактериохлорофилл а бактериовириднн. Мы надеялись связать наблюдаамые различия в скорости феофитинизацин с известными! отличиями в строении моле­ кул названных пигментов: с наличном различных заместите­ лей в пиррольных ядрах, с различным уровнем восстановленности «полуизолированных» двойных связей у протохлорофилла, хлорофилла, бактериохлорофилла, с изменениями в цижло'пентанавам кольце .молекулы, с присутствием в моле­ куле бактериоопридина фарнезола в отличат от фитола хло­ рофилла. Скорости феофитинизации измеряли в .различных органи­ ческих растворителях: водном ацетоне, водном этиловом спирте, водном пиридине, серном эфире, толуоле и петролейпом 1эфире. G В водно-спиртовых и водно-ацетоновых растворах изме­ рения скорости реакций проводили в диапазоне рН от 2 до 5 через интервалы 0,3- Кривые, выражающие кинетику превра­ щения хлорофилла и его аналогов в соответствующие феофитины при различных значениях рН приведены в диссерта­ ции. Они следуют первому порядку. На основании получен­ ных кривых нами были вычислены константы скорости реак­ ции для различных значений рН, также приводимые в дис­ сертации. Это позволило сравнить исследуемые пигменты по скорости феофптинизации количественно, располагая их при этом в определенной последовательности. Так, например, з водно-ацетоновых растворах . пигментов в присутствии 10"-3ад/л НС1 при 22° значения .констант скорости (к -1мин -1 ) были следующие: для-2 бактериовиридина —"2,8- Ю , хло­ рофилла «а» — 3 - Ю —3, протохлорофилла —7,6- Ю - 3 и хло­ рофилла «в» — 3 - 10 . В водно-спиртовых растворах пит» ментов при прочих равных условиях величины-1констант ско­ рости/были: - для бактериовиридина — 2,3- 2• Ю , хлорофилла 2 «а» — 3 - Ю , протохлорофилла — 1 - 1 0 , хлорофилла «в» — '1,6-'Ю -3 . Сравнение показало, что наиболее быстро феофнтинизировался бактериовиридин, далее 'следовал хлоро­ филл «а», потом протохлорофилл; бактериохлорофилл по скорости феофптинизации был близок к протохлорофнллу, и медленнее всего магний замещался водородом в молекуле хлорофилла «в». Константы скорости наиболее быстро феофитинизирующегося бактериовиридина и самого устойчиво­ го хлорофилла «в» отличаются на два порядка. Соотноше­ ния между константами скоростей реакций, исследованных 'пигментов при различных рН меняются, но установленная последовательность пигментов по скорости феофитинизации сохраняется. • Сравнение исследуемых пигментов по скорости феофнти'нвдации2 в серном эфире под действием щавелевой кислоты (2Х|Ю- м/л) показало, что для прохождения реакции напо­ ловину в случае бактериовиридина требуется 15 минут, хло­ рофилла «а» 23 час, протохлорофилла и хлорофилла «в» более 8 суток. В водном пиридине в присутствии 2Х|10 -2 м/л щавелевой кислоты установлена та же последовательность пигментов по убыванию скорости феофитинизации. Так, время половинно­ го превращения бактериовиридина было 0,4 часа,- хлорофил­ ла «а» — 3 часа, протохлорофилла около 10 часов, хлоро­ филла «в» около 24 часов. 7 Хлорофиллиды «а» и «в», полученные нами из хлорофил­ лов i«a» и «.в», заметно не отличались от соответствующих хлорофиллов по скорости феофитинизации в водном ацетоне. По данным Шандерля (1962), специально сравнивавшего ки­ нетику феофитинизации хлорофиллов «а» и «в» с соответст­ вующими хлорофиллпдамл, константы последних превыша­ ют первые самое большее, в полтора раза. Эта величина зна­ чительно меньше тех, которыми отличаются друг от друга члены установленного нами ряда пигментов. Феофитинизация в неполярных растворителях — толуоле и петролейном эфире — в присутствии пальмитиновой кислоты •Сам, установленный нами, факт феофитинизации пигмен­ тов в данных условиях представляет самостоятельный инте­ рес. В безводной среде (петролейный эфир) и в присутствии пальмитиновой кислоты трудно представить существование ионов водорода в концентрации, достаточной для осу­ ществления феофитинизации. Согласно Годневу (1947), ки• слоты типа пальмитиновой, могут своим карбоксилом всту­ пать в непосредственное взаимодействие с азотами пирроль ных ядер молекулы хлорофилла. Можно думать, что наблю­ даемая нами феофитинизация в системе петролейный эфир — пигмент — пальмитиновая кислота осуществляется при обязательном контакте азота хлорофилла и карбоксила пальмитиновой кислоты. Изучая действие на исследуемую реакцию, лолярных до­ бавок, которые могли бы нарушить непосредственное взаи­ модействие пальмитиновой кислоты и хлорофилла, мы уста­ новили, что этиловый спирт и диоксан в концентрации 5 • 10—3,м/л заметно ннгнбироюали феофитинизацшо, а ингибирующее влияние пиридина проявлялось при концентрации 5« 10~*м/л. Следует отметить, что ни в спирте, ни в пириди­ не, ни в диоксане пальмитиновая кислота вообще не вызы­ вала феофитинизации хлорофилла. Сравнение исследуемых пигментов по скорости феофити­ низации в неполярных безводных растворителях (петролей­ ный эфир, толуол) представляет, по нашему мнению, инте­ рес в 'связи с тем, что здесь исключается фактор сольвата­ ции пипмента молекулами растворителя, что позволяет свя­ зать различия в скорости феофитинизации пигментов только с различиями в строении молекул пигментов. В описывае8 мых здесь системах мы наблюдали тот же, что и в случае водных растворителей, ряд пигментов. Так, в толуоловых растворах в присутствии 3-10 _ 2 м/л пальмитиновой кислоты время полупревращения пигментов в соответствующие фео•фитины было: для бактериовиридина — 4 мин., хлорофилла «а» — 27 мин., протохлорофилла — 540 мин., бактериохлорофилла — 690 мин. и хлорофилла «в» — 1440 мин. Обсуждение данных по кинетике феофитинизации хлорофилла и его аналогов в связи с известными структурными различиями исследованных пигментов Современные представления о химическом строении ис­ следованных пигментов приведены в литературном обзоре диссертации. Строение молекулы наиболее быстро феофитннизирующегося бактериовиридина нельзя .считать оконча­ тельно установленным. После серии работ Холта (1960— 1963) можно считать, что молекула бактериовиридина отли­ чается от молекулы хлорофилла «а» следующими особенно­ стями: 1) роль фитола, этерифицирующего молекулу хлоро­ филла выполняет здесь фарнезол, 2) вместо винильной груп­ пы во 2-ом положении первого пиррольного ядра имеется гидроксиэтильная группа, 3) карбометокеильная группа, имеющаяся при Сю в молекуле хлорофилла^ заменена в мо­ лекуле бактериовиридина на водород. Учитывая наши данные rib сравнению скоростей феофи­ тинизации хлорофиллов и соответствующих хлорофиллидов. а также данные, более детального (Шандерль и др., 1962) ис­ следования по влиянию замены фитола различными радика­ лами на скорость феофитинизации, можно.полагать, что на­ личие фарнезола в молекуле бактериовиридина не сказы­ вается существенно на скорости феофитинизации. Группа, аналогичная заместителю при втором углеродном атоме у бактериовиридина имеется и у бактериохлорофнлла, а последний обменивает магний„на водород со значительно меньшей скоростью. Логично предположить, что легкая атакуемость магния нонадш водорода в молекуле бактериови­ ридина определяется отсутствием карбометогасильной груп­ пы при десятом углеродном атоме. Анализируя далее ряд исследуемых пигментов по убы­ вающей скорости феофитинизации (бактериовиридин, хлоро­ филл «а», протохлорофилл и бактериохлорофилл, хлоро­ филл |«в»), следует отметить отсутствие зависимости скоро9 сти 'феофнтннизации от. степени восстановленности «пол у изо­ лированных» двойных связей в молекуле 'пигмента. Возмож­ но, что симметричность а состоянии полуизолировапных свя­ зей (обе гидрированы—бактериохлорофилл или сбе [присутст­ вуют — протохлорофнлл) стабилизирует атом магния в этих пипментах по сравнению с хлорофиллом «а». Очевидно, да­ лее, что наличие электроотрицательных заместителей в пиррольных ядрах (альдегидная группа во втором ппрролыюм ядре- у хлорофилла «в» и ацетильная группа в первом ппр­ ролыюм ядре ба.ктерпохлорофилла) затрудняет реакцию об­ мена магния на ионы водорода. Наличие же подобного за­ местителя в первом пиррольном ядре бактериовлрнднна, оче­ видно перекрывается противоположным действием отсутст­ вия Сю карбометоксильпой группы щухлапентанонавого коль­ ца. Возможно влияние этих групп ипдукционно передается по 1коныошро;ванной системе сопряжения, увеличивая проч­ ность связи магний-азот. 'Проведенное нами сравнение кинетики феофитинизации всех исследованных пигментов, давшее определенное - пред­ ставление о влиянии различий в строении молекул пипментоо на прочность связи магний-азот, позволило нам получить также результаты, необходимые для последующего исследо­ вания действия света на эту реакцию. II. РЕАКЦИЯ ФОТОФЕОФИТИНИЗАЦИИ II ОБРАТ1ШЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПИГЛ\ЕНТОВ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ Описанию 'непосредственных результатов по действиюсвета на реакцию феофитинизации мы предпосылаем данные, несколько расширяющие и дополняющие наши сведения от­ носительно обратимых окислительно-восстановительных пре­ вращений пигментов, условий стабилизации ф'отовосстановленных продуктов и способов обнаружения лабильных, про­ межуточных продуктов фотовосстановления. Исследование обратимого фотовосстановления бактериоллорофилла и бактериовнридина мы предприняли в связи с тем, 1что данные по фотохимическим свойствам этих пигмен­ тов являлись далеко не полными, по сравнению с детально исследованными в лаборатории фотооиохи'мни нашего инсти­ тута окислительно-восстановительными превращениями хло10 рофялла. Бактериовиридин до нашей работы (1959) в таком плане вообще не исследовался. •Мы показали, что при фотовосстанавлении в пиридино­ вом растворе с использованием в качестве донора водорода аскорбиновой кислоты бактериовиридин дает продукт вос­ становления, очень схожий с «красной» восстановленной формой хлорофилла «а». Аналогичный продукт фотовосстановления, бактериовиридин давал и при использовании .в качестве восстановителя сернистого натрия. Было показано также, что бактериовиридин, подобно хлорофиллу, способен сенсибилизировать реакции фотохимического переноса водорода. • *. • В 1951 г. Краоновеким и Войновокой была обнаружена возможность обратимого фотохнмичеакого восстановления и окисления бактериохлорофилла и бактериофеофитина. Мы обнаружили, что при освещении пиридинового раствора бак­ териохлорофилла в вакууме в присутствии сернистого нат­ рия образуется активный продукт фотовосстановления бактери'ахлорсфилла, имеющий максимум поглощения при 660 ммк, моментально регенерирующий в исходный пигмент при впуске кислорода воздуха, и отличающийся от более стабильных продуктов фотовосстановления бактериохлоро­ филла, не имеющих характерных максимумов поглощения в видимой области спектра. Исследуя потенциал платинового электрода пиридиновых растворов хлорофилла «а», бактериохлорофилла и бактерновиридина в присутствии сернистого натрия, мы обнаружили, что во всех случаях при освещении он изменяется в отрица­ тельную сторону приблизительно на 0,1 вольта. В темноте за 1—2 минуты происходило обратное изменение потенциала.: Вероятно, в данных условиях все пигменты образуют електродно-активные фотовосстановленные продукты одного типа. Сернистый натрий является очень сильным восстановителем, и отсутствие различий между пигментами в силе восприятия электрона в данных условиях не исключает возможность та­ ких различий в других условиях, о чем будет говориться ни­ же в связи с изучением действия света на феофитииизацию бактериохлорофилла. Согласно представления1М, развиваемым в лаборатории фотобиохимии нашего института, восстановленные фор/мы хлорофилла и его аналогов могут быть ион-раднкалом -Х~ л «•протоннзироваиными» формами типа -ХН (один протон) и -ХН + 2 (два протона). Сравнительная устойчивость «крас11 ' нон» формы хлорофилла и аналогичных ей форм других пиг­ ментов определяется образованием ассоциатов молекулы лигмента, юоспринявшей электрон, at молекул среды — ос­ нования (пиридин), сочлененных 'посредством 'протона: -Х-... H+...N<. Изучение влияния условий кислотно-основного равновесия на устойчивость восстановленных форм, показало, что добав­ ление сильных оснований к стабильным " восстановленным формам приводит к мгновенной регенерации исходного пиг­ мента, что было объяснено надш, как результат разрушения ассоциата согласно гипотетической схеме: •X-...H+...N^+N,<-*-X-4-H^N,<+iM< где N < символизирует собой основание — пиридин, в ко­ тором происходит восстановление, a N ' < более сильные, до­ бавляемые к реакционной смеси основания (пиперидин и аммиак). На примере гематолорфирнна нами было доказано, что п разных условиях кислотности могут стабилизироваться раз­ ные взаи'молерекодящие друг в друга (восстановленные фор­ мы: одна, менее устойчивая, с максимумом поглощения при 650.ММК («основная») и другая, более устойчивая с макси­ мумом поглощения при» 740 мм к («кислая»). Не улавливаемые спектрально лабильные фотовосстановленные формы, предшествующие образованию стабильных продуктов или образующиеся в системах, где нет условий. для стабилизации устойчивых продуктов фотовосстанавле1ГИЯ, исследуются различными другими способами, основан­ ными и а том, что они (эти формы), будучи радикалами, мо­ гут инициировать полимеризацию мономера, сенспбнлизнрованно восстанавливать добавляемые акцепторы электронов, будучи электродно-активнымн, изменять 'потенциал 'Инертно­ го (платинового) электрода, помещенного в реагирующую систему пигмент-донор электрона. Основываясь ,на том известном факте (Красновский, Ев­ стигнеев, Баннистер), что «красная» восстановленная форма хлорофилла теряет магний гораздо легче, чем 'исходный пиг­ мент, образуя при этом феофитин, нам казалось интересным исследовать, не могут ли и лабильные, воспринявшие элект­ рон, восстановленные формы пигментов феофитинизироваться легче, чем исходные пигменты. Тогда накопление феофитина.могло бы быть, как бы индикатором быстрых обратимых окислительно-восстановительных превращений пигментов, не . П обнаруживаемых спектрально. В связи с этим мы предпри­ няли исследование феофитинизации стабильных фотовосстановленных форм пигментов и действия света па феофитшгазацшо пигментов, где ранее спектрально не удавалось обна­ ружить образование'фотовосстановленных форм пигмента. Образование феофитина в пиридине, спирте и ацетоне в присутствии аскорбиновой кислоты Мы изучали влияние различного количества воды в пири­ дине на образование феофитина из красной восстановленной формы хлорофилла «а» при одинаковом содержании аскор­ биновой кислоты (10- 2, м/л). При содержании в пиридине меньше 1% воды из красной формы хлорофилла «а», регене­ рирует исходный плгмеагг и совсем не образуется феофитина. При содержании 1—5%' воды в пиридине, хлорофилл регене­ рирует неполностью, при обратной реакции'образуется фео­ фитин с большей HCIII 'меньшей степени, в зависимости от ко­ личества воды. При 10% содержании воды в пиридине, крас­ ная восстановленная форма хлорофилла практически пол­ ностью превращается в феофитин. Можно думать, что стиму­ лирующее действие >воды на образование феофитина связано с увеличением кислотности среды за счет возрастающей сте­ пени диссоциации аскорбиновой кислоты в водно-пиридино­ вом растворе. Эти данные согласуются с данными Баннистера (1959). Мы обнаружили, что хлорофилл «в», восстановленный в тех же условиях (пиридин-аскорбиновая кислота) при об­ ратной реакции также подвергается феофитинизации, причем из восстановленной формы хлорофилла «в» регенерирует исключительно феофитин даже при содержании воды менее 1%-. Мы наблюдали далее образование феофитина в системе хлорофилл-спирт-аскорбиновая кислота, после ее освеще­ ния в анаэробных условиях и последующего выдерживания в темноте о присутствии воздуха. Фотопродукты, образую­ щиеся в данных условиях под действием света, не имеют .каких-либо.[характерных максимумов поглощения в видимой области спектра. Можно думать, что здесь мы имеем дело с фотохимическим образованием восстановленной лейкоформы хлорофилла «а», которая при обратной реакции дает фео­ фитин. 13 В ацетоновом растворе хлорофилла «а» в аналогичных ус­ ловиях так же, как и в спирте, происходит образование феоф игл на из бесцветных продуктов фотовоосгановлепия пиг­ мента. Таким образом, нам удалось установить, что в спиртовых и ацетоновых растворах хлорофилла, содержащих аскорби­ новую кислоту, input освещении « анаэробных условиях про­ исходит .образование восстановленных лейкоформ пигмента. регенерирующих в феофитнн в обратной реакции. О характе­ ре указанных продуктов можно сказать, что они, также, как и «красная» восстановленная форма хлорофилла «а», обра­ зующаяся в шгриди'не, являются относительно устойчивыми. по всей вероятности «протопизированными» восстановленны­ ми формами пигмента. В связи с тем, что стабильные .восстановленные формы феофитиннзируются легче, чем исходный пит/мент, можно считать, что изменения в молекуле хлорофилла, связанные с фотовоесстановлением и конечным образованием названных форм, 'приводят к ослаблению связи центрального атома маг­ ния с азотом шфрольных колеи. Феофлтипизация пигментов в пиридиновых и спиртовых растворах в присутствии соляной и щавелевой кислот Отчетливое действие света на образование фсофптнна было показано нами в системах питмеит-пиридин-ооляиая кислота, пигмент-ииридш-щавелевая кислота, т. е. в систе­ мах, где ранее не удавалось обнаружить образование устой­ чивых ^продуктов фотовосстановления. Хлорофилл «а», хло­ рофилл «в» ,ц протохлорофилл при освещении в вакууме их «одно-пиридиновых (10% воды) растворов в присутствии 2- 10-2'М/л щавелевой кислоты менее чем за 10 мин. наполо­ вину превращались в соответствующие феофитины, время их темповой феофнтлнизашш измерялось часами. Столь же от­ четливое ускоряющее действие света наблюдалось и при ис­ следовании феофптиннзации пиридинового раствора бактериовиридина в 'присутствии 6«10 - 3 м/л щавелевой кислоты. Обращает на себя внимание тот факт, что различия в скорости темповой феофигшшзацнн, о которых говорилось в первом разделе, нивелируются при фотофеофитнннзации. Есть основания полагать, что механизм фотофеофитнннза­ ции пигментов в водно-пиридиновом растворе отличается от механизма темповой фсофишннзацш. В пиридине . в силу 14 большого сродства молекул растворителя к протону, очевид­ но, существует конкуренция за него между молекулами лиг?4 меата и молекулами растворителя, вследствие чего'феофитн лизацп'я в темноте идет крайне медленно. Мы предположили, что фотсфеофитшшзацня проходит через стадию образования лабильных фотовосстановленных форм хлорофилла, при этом роль донора электрона может играть пиридин. Можно представить, что возбужденная мо­ лекула пигмента, приняв электрон, приобретает несравненно большее сродство к протону. Если донором водорода в систе­ ме служит •аскорбиновая кислота, то телец ва «принятием электрона происходит образование протошюировапных вос­ становленных форм, стабилизирующихся в комплексе аскор­ биновая кислота — пиридин-пигмент. Если донором служит пиридин, то такой стабилизации, видимо, не 'происходит, хло­ рофилл принимает прежний уровень восстановленностн, от­ давая принятый иш электрон, а вошедшие в молекулу хлоро­ филла протоны, вначале, очевидно, связанные с пиррольными атомами азота, обладающими «вакантными*» парами электронов, после перераспределения связей замещают атом магния в' кольце. . Спирт по сравнению с пиридином является более благо­ приятной средой для темповой феофнтшшзацт». Поэтому за­ ранее трудно было ожидать резкого различия в скорости об­ разования феофптпнов на свету н в темноте; ускоряющее действие света в спирте надо было исследовать на фоне темпозой феофитннизации, что требовало более точных коли­ чественных измерений. Нам удалось найти условия, когда в спирте наблюдалась не менее отчетливое, чем в пиридине, ускоряющее действие света >на'процесс образования феофитина шз хлорофилла «а». В таблице Л приведены данные, иллюстрирующие стимули­ рующее действие света на исследуемую реакцию при различ­ ных концентрациях щавелевой кислоты и различном содер­ жавши воды. Последовательно увеличивая кислотность среды, мы об­ наружили, (Что при достижении определенной концентрации водородных ионов свет перестает действовать ускоряюще на образование феофитина. Так, при концентрации соляной ки­ слоты в спирте 4 • Ю - 4 м/л реакция феофнтшшзации хлоро­ филла «а» значительно ускоряется под действием света, в случае же 2>1(Нм/л соляной кислоты процесс 'протекает с одинаковой скоростью на свету и в темноте. Аналогичная ва15 виоимость фотофеофитигогзации от концентрации «онею водо­ рода была обнаружена нами у хлорофилла «с» и у бактерновиридина. Таблица 1. Превращение хлорофилла «а» в феофитин (в'/сза 15 мин) в спиртовом растворе в присутствии щавелевой кислоты ка свету и в темноте зло-* З.Ю-з Количество к-ты м/л 0 10 0 Ю Спет 60 90 14 -13 Темнота 15 10 0 15 Количество РОЛЫ % Можно думать, что в спирте (как и в пиридине) в опре­ деленных условиях кислотности (рН> 3) имеет место образо­ вание феофитина из лабильных, короткоживущих, не обна­ руживаемых спектрально фотопродуктов, в дополнение к тем­ повой феофитинизации, протекающей независимо от действия света. В условиях большой концентрации водородных июнов ( р Н < 3 ) , скорость процесса образования феофитина по обычному «темповому» механизму превышает скорость фотофесфитннизации, поэтому и ускоряющее действие овета не проявляется. В таблице 2 приведено время полупревращения пигмен­ тов 'В соответствующие феоф'нтины и темноте и ма шету в ус­ ловиях благоприятных для 'проявления фотофеофитшпгзации. Таблица 2. Время полупревращения пигментов в феофитин при освещении и в.темноте. Время в минутах Раство­ Щавелевая ритель к-та м/л =о 6.10-3 бактерновнрщпн gx: 2.10-2 хлорофилл а . - хлорофилл в С2 ч»5 си Н (О С 16 Пигмент протохлорофилл свет темнота >60 13 180 12 600 10 1440 9 7.10—« бактерновириднн >60 ало-з хлорофилл а >6'.' - 18 13 Явление фотофеофитинизации пигментов в спирте также как и в пиридине, мы склонны сюязывать с 'реакцией обрати­ мого фотохимического (восстановления пигмента, в которой гтлекулы полярного растворителя могли играть роль до­ норов электронов для возбужденной молекулы пигмента, что согласуется с данными Арван н Глебовского (1961), пока­ завшие, ято пиридин может восстанавливать при юсвещенин в вакууме тиазнновые красители. Предположение о возмож­ ной элсктронодонорной роли спирта согласуется с данными по обнаружению 'методом З П Р свободных радикалов- спир­ та (Рихирева и др. 1964), возникающих при освещений! за­ мороженных растворов пигментов. Исследование действия овета на феофитлнизацию бактериохлорофилла в спиртовых и пиридиновых растворах пока­ зало, что феофагтнн чсз этого (пигмента в темноте и ?прн осве­ щении образуется с одинаковой 'скоростью. Отсутствие фотофеофитинизации у бактер.иохлорофилла позволяет предполо­ жить, нто ни спирт, ни пиридин не являются для него подхо­ дящими донорами электронов; можно думать поэтому, что сродство к электрону у (возбужденной молекулы бактериохлорофилла меньше, чем у хлорофилла. Это согласуется С ' данными о различии фотосенснбнлизации хлорофиллом и бактериохлорофиллом окислительно-'восстановительных ре­ акций (Кр ас н опеки й, (Войновская 1952) и о фотосенсибилизированных превращениях нипмептных пар (Евстигнеев, Ганрилова 1961), показавших ;более низкий восстановитель­ ный потенциал (восстановленной фор,мы бактериохлорофилла по сравнению с хлорофиллом. Действие ингибиторов на фотофеофитинизацню Если при фотофеофитинизации феофитин образуется из лабильных (продуктов фотовоестановлешгя, то следовало ожи­ дать :шгг.И'бнравание исследуемой реакции в присутствии тор­ мозящих фотовосстановление соединений, к числу которых относятся: полнены (каротин), поли'цикличекжпе •соединения (тетрацен) и реагирующие с фотовосстановленными форма­ ми 'пигмента акцепторы электронов, .которыми являются, например, метиловый 'красный, сафранин, рибофлавин. Было исследовано действие названных соединений в концентрации от 5Х'Ш- 5 до Ю - 3 м/л на фотофеофитиннзацию хлорофилла «а», хлорофилла «в» и протохлорофллла в пиридиновых рас­ творах. -Каротин практически полностью мнгнбирует фото- i "Ш : феофнтинизацию в концентрации К)- 5 м/л, несколько менее эффективно действовал иафтацен, «который полностью угне­ тал фото'феофитшшзгцшо и концентрации Л0~* м/л. Метилозый красный, сафранин и рибофлавин- 4заметно замедляли фотофеофптинизацию о 'концентрации Ю :м/л и .(полностью угнетали реакцию в концентрации Ю - 3 м/л. Было высказано предположение, что обратимо .воспринимающий электрон ингибитор приводит систему в исходное положение и стацио­ нарная концентрация восстановленной формы пигмента, (котооая склонна не замещению магния на-.водород), падает до предела, определяемого скоростями слегающих цикл реак­ ций, и естественно, концентрацией ингибитора-акцептора электрона. Предполагая тождественность элементарных механизмов фотофеофитпнизатпи IB спирте :и пиридина, мы игеследовали действие (.метилового красного «на фотофеофитинизацию хло­ рофилла ««a» IB спирте и также обнаружили ннгибнрующее •действие метилового красного на исследуемый процесс. Ско­ рость феофитинизации '.на свету ,в присутствии Ю - 3 м/л мети­ лового 'красного практически .была равна скорости темповой феофитинизации 'без •метилового красного. В специальных •опытах мы показали, что метиловый .красный не влияет на скорость тем новой феофитинизации хлорофилла «а» о спирте. Феофитинизация хлорофилла в пиридине в присутствии янтарной, фумаровой и яблочной кислот. Влияние аниона кислоты на скорость процесса. Исследуя феофнтинизацию в системе 'пипмент-лиридин• органическая кислота, мы установили, 'что ни янтарная, ни фумаровая, ни яблонная кислоты не могут заменить щаве­ левую кислоту, ,в присутствии которой '.наблюдались такие от­ четливые эффекты фотофеофитшгизац'ии. Эти кислоты даже к сравнительно большой концентрации (8- Ш~2 м/л) не вы­ зывали феофитинизации «и в темноте, «ни при освещении. Более того, добавляемые в спетому итагмент-лнриаин-соляная 'кислота, они «нгибировали фотофеофнтииизацию, тогда как процесс темповой феофитинизации IB названные системах в присутствии этик кислот шел .скорее. Возможно, что в системе 'пигмент-лиридин-кислота осу­ ществляется (взаимодействия «между молекулами составных компонентов системы с образованием комплекса, в пределах которого и 'происходит передача заряда при фотофеофитинн18 заци-и. И ;при этом очень юажнымл являются не только электршшдонорные свои сто а ком-нонетов системы и степень дис­ социации 'кислот, но также етер-ическое 'соответствие их друг другу.Взаимодействие 'между компонентами системы пигмент-пиридин-кислота может иметь влияние и на скорость темно­ той феофитннпзащш. Из -наших, а также из литературных •данных известно, что анион кислоты ле влияет на скорость фесфптинизации хлорофилла в ацетоновом и спиртовом ра­ створе, где скорость процесса зааисит лишь от концентрации водородных ионов. Иную картину мы наблюдали в пиридине.. Так при исследовании темповой феофгяинизации бактериовпридина в .пиридиновом растворе было обнаружено, >что быст­ рее всего процесс шел в присутствии щавелевой кислоты, медленнее — -соляной и еще медленнее — серной. Феофитинизация и фотохимическое окисление пигментов кислородом воздуха Как уже указывалось выше, опыты по выяснению дейст­ вия света па фсофптшшзацшо мы .проводили в отсутствии воздуха, чтобы избежать "окислительного разрушения пигмен­ тов. Вместе с тем представляет интерес вопрос, действует ли необратимое окислительное разрушение пигментов на проч­ ность-связи магния с азотом в молекуле пигмента и не являет­ ся ли феофнпш непосредственным продуктом такого разру­ шения. . • ... • Мы исследовали этот вопрос на двух пигментах: хлоро­ филле «в» — наиболее устойчивом к окислению из всех ис­ следуемых пигментов и бактериовк'риднне — самом неустой­ чивом. Водно-ацетоновые растворы хлорофилла «в» освещались в присутствии воздуха, по мере фотоокнеления снимали спект­ ры поглощения, далее пигмент переводили! в серный эфир и хроматографнровали на бумаге из смеси Годиева. В спектре продукта окисления >в ацетоновом растворе обнаруживается подъем поглощения и области 500—560 ммк, по без характер­ ных для феофитлпа максимумов при 505 и» 535 ммк. Выцвета­ ют основные максимумы поглощения («красный» и «синий»), «плечо» при 440 ммк по мере окисления становится более яр­ ко выраженным. Если реакция фетсокнелеик'я проходила полностью, то на хроматограмме обнаруживалась одна зона • фиолетового оттенка в месте нанесения пигмента, если не пол19 костью, то две стопы: названная и расположенная свыше зона непрореагировавшего хлорофилла «в». Феофитпиа при этом не было обнаружено. Аналогичная картина наблюдалась и при фотоокислении водно-ацетонового раствора хлорофилла «в» в присутствии 2.10 - 3 IM/Л щавелавой 'кислоты. В темнота©*! контроле за время опыта не происходит никаких спектраль­ ных изменений. При освещении происходят спектральные из­ менения такие же, к а к и три освещении щ огаутствии щавеле­ вой кислоты. При длительном стоянииm темноте ( > 1 2 часов) н тот хлорофилл, который не освещался и тот, который остал­ ся «после фотоо.ки'сления, 'полностью феофитинизиравались. Так что взятое количество щавелевой кислоты было достаточ­ ным для полной феофитинизации хлорофилла «в» и фотоокисление не ускорило этого процесса. Мы не обнаружили феофитина и в продуктах фотоокисле­ ния бактериовиридина при освещении его в водно-ацетоновом растворе с последующей хроматографией на бумаге в смеси Годнева. Было отмечено, что продукт фотоокисления бакте­ риовиридина в серном эфире имел отчетливый максимум по­ глощения щш 855 ммк. Таким образом, «и при фотоокислении хлорофилла «в», ли при фотоокислении бактериовиридина м ы ле обнаружили об­ разования феофитина. Это согласуется с данными Маккинея и Аронова (1943), по мнению которых феофитпшизация зависила лишь от кислотности и не зависила от освещения и при­ сутствия воздуха. III. ФЕОФИТИНИЗАЦИЯ ПИГМЕНТОВ В ПЛЕНКАХ, АДСОРБАТАХ, В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЯХ, В ЛИСТЬЯХ И ГОМОГЕНАТАХ Сравнение по скорости феофитинизации хлорофилла «в» в листьях и гомогенатах «а» и Сравнивая по скорости феофитинизации" пигменты в орга­ нических растворителях, мы шмели дело с непосредственным влиянием особенностей 'структуры молекул пигмента, наличия в лих тех или иных группировок на исследуемую реакцию. Представляло интерес выяснить, сохраняется ли различие по скорости феофитинизации зелорофиллов «а» и «в», установлен­ ное в растворе, и в естественном 'состоянии связи, где молеку­ лы пигмента находятся во взаимодействии друг с другом, а также с белками и липоидам». . . . 20 Исследовались гомогонаты листьев фасоли, приготовлен­ ные на водопроводной воде. Гомогенаты подкисляли соляной кислотой II после экспозиции нейтрализовали раствором едко­ го натра. Так как непосредственно по спектрам поглощения гомогенатов было трудно судить о количестве образовавшихся феофитннов, пигменты по истечении экспозиции экстрагиро­ вали. Для этого гомогенаты центрифугировали, добавляя к ишм хлористый кальций для полноты осаждения, осадок раст­ воряли в ацетоне, и определенную часть ацетонового экстрак­ та разделял» методом (бумажной хроматографии из смеси — петролейный эфир: этиловый спирт (20 : 1). После разделе­ ния та бумаге элюировали ацетоном зоны: а) хлорофилл «в»-)-феофитин «в», 2) хлорофилл «а»-{-феофитин «а». Из­ мерение спектров поглощения элюатов после различных экс­ позиций показало, что не только в органических растворите­ лях, .по и в гомогонатах хлорофилл «в» феофитииизируется значительно медленнее, чем хлорофилл «а». Так о присутст­ вии 0,1% НС1 при 10-минутной экспозиции! гомогената хлоро­ филл «а» почти полностью превращался в феофитин, а хлоро­ филл «в» при 2-х часовой экспозиции превращался в феофит ш менее чем на 50%. Столь же резкое различие в скорости феофитшшзации между хлорофиллами «а» и «в» мы наблюдали в листях фа­ соли и элодеи инфильтрируемых соляной кислотой с после­ дующей экстракцией и хроматографическим разделением пиг­ ментов. Действие света на феофитинизацию хлорофилла и его аналогов в пленках, в адсорбатах, в листьях и гомогенатах В системах: пленка пигмента — кислота; адсорбированный на бумаге питмент -*- кислота трудно было предвидеть обра­ зование лабильных фотопродуктов пигмента, что, как мы по­ лагаем, имело место аз спиртовых и пиридиновых растворах, как результат взаимодействия возбужденных молекул пигмен­ та с молекулами растворителя. В связи с этим ;в данных мо­ делях можно было исследовать непосредственное действие света на реакцию замещения магния иа водород, когда эта реакция не связана с другими, отличными от феофитинизации, превращениями пигментов. Исследовавшиеся пигменты адсорбировали на кругах фильтровальной бумаги, погружая их оз концентрированные растворы пигмента в эфире. Равномерно окрашенные круги 21 разрезал» на равные секторы. Последние опускали в трубку Тунберга с кислотой. В одних опытах реакция феофитшшзацни 'проводилась в темноте, в других — при освещении крас­ ным светом. По истечении времени экспозиции сектор фильт­ ровальной бумаги с адсорбированным на нем пигментом вы­ нимали, промывали водой, пигмент элюировали определенным объемом ацетона и и измеряли спектр поглощения на спектро­ фотометре СФ-10. Данная серия опытов 'показала, что свет не ускоряет феофитишгзацню адсорбированных на бумаге пигментов (хлорофилл а, хлорофилл в, бактериовириднн). В случае протохлорофилла свет не только не ускорял феофитинизацшо, но было отмечено, что после освещения в элюате фесфитина было даже меньше, чем в томновом контроле, что как показали специальные эксперименты, объяснялось фоторазрушеписм образующегося етротофеофитипа. Подобного эффекта не было обнаружеаю с другими пигментами. Это яв* пение представляет самостоятельный интерес в плане сравни­ тельного исследования фотохимических свойств хлорофилла и его аналогов в различных состояниях. Мы не обнаружили ускоряющего действия света на феофитшшзацию и в пленках бактериовнридина, погруженных в водный раствор кислоты. При длительном освещении приготовленных на дистилли­ рованной воде гомогенатов листьев фасоли, как в присутствии кислорода, так м в вакууме, нам тоже не удалось обнаружить в ши образование .измеримого количества феофитина. Мы исследовали действие света на феофит.ннизацию ннфильтрироваишых кислотой листьев элодеи и фасоли, варьи­ руя продолжительность освещения, проводя опыты в присут­ ствии кислорода :и в вакууме при строгом термостатировании. По прошествии времени экспонирования листа с кислотой в темноте и на свету, мы экстрагировали из него пигменты, до­ бавляя три этой процедуре мел для нейтрализации инфильт­ рированной в лист кислоты. Экстракт хроматографировали и измеряли спектры поглощения элюатов зон: 1) хлорофилл «а» -|-феофитин «а», 2) хлорофилл «в» -f- феофитин «в». Мы установили, что продолжительное интенсивное освещение ин­ фильтрированных кислотой листьев сильным светом не приво­ дило к обнаружению в элюате из листа 'заметного количества феофитина, отличтого от контроля, которым служил элюат из неосвещенного листа. Такое отсутствие эффекта ускоряющего действия света' на феофитиннзацию в томогенате листа и в листе инфильтрнроватаюм кислотой, можно предположительно объяснить тем, 22 что in vivo не реализуется установленная нами в спиртовых и пиридиновых растворах хлорофилла возможность молекул пигмента давать активные фотопродукты, феофитивдизирующиеся с большей скоростью, чем исходный пигмент. Вместе с тем возможно, 'что 'инфильтрируемая в лист кислота в силу препятствий структурного характера не тступает в -контакт с той частью молекул хлорофилла, которая непосредственно участвует в фотопроцессах. Кроме того, если даже в листе имеет место факт образования феофитина из лабильных про­ межуточных продуктов пигментов в цепи их окислителыновосстановнтельных превращений, что мы предполагали для спиртозых п -пиридиновых растворов хлорофилла при .их ос­ вещении ,в присутствии ^соляной и щавелевой кислот, то этот эффект может быть малым и не обнаруживаться используе­ мыми методами, связанными с необходимостью экстрагиро­ вать и разделять пигменты хроматографически. Феофитинизация бактериовиридина в суспензиях зеленых фотосинтезирующих бактерий Известно, 'что бактерновиридин и ба'ктериохл'орофнлл•лиименты, «выполняющие в фотосинтезирующих бактериях роль хлорофилла — находятся с бактериям и агрегированном, упорядоченном состоянии. Бактерповиридин в растворе име: ет красный 'максимум поглощения при 670 ммк, тогда как о зеленых бактериях красный максимум поглощения находится при 750 <MMiK. Этот сдвиг почти IB .100 ммк наблюдался нами "при испарении эфирного раствора этого пигмента в вакууме. Образующаяся при этом пленка пигмента имела главный красный максимум при 730 ммк. :В предварительной работе нами было показано, что при длительном стоянии водно-глицериновой суспензии бактерий при. комнатной температуре пли при нагревании: в течение более короткого времени образуется («мономерная» форма с максимумом поглощения при 670 ммк, являющаяся крайне несветопрочной: при сильном освещении красным светом в течение двух минут образовавшийся (при 670 ммк максимум полностью выцветает. Действие кислоты на суспензию зеленых бактерий вызы­ вало разрушение упорядоченной структуры бактериовириди­ на, сопровождающееся потерей магния молекулами пигмен­ та. При этом поглощение в красном максимуме при 750 ммк уменьшалось -и соответственно увеличивалось поглощение «мономерной» формы при 670 ммк. Gneicrp образующегося 23 феофитина соответствовал по положению основных максиму­ мов поглощения спектру пленки безмагниевого производного бактериовнридина, получетной путем испарения эфирного раствора 'пигмента на стекле. В отличии от «мономерной» форшы водногляцеринооой суспензии, образовавшийся из б акт ерновиридииа феофнтан был устойчив к выцветанию. Интересно, что процесс образования феофитина шел с сохра­ нением нзобестических точек в семействе кривых, отражаю­ щих спектры поглощения по мере феофитинизацпи. Мы .последовали действие света на скорость феофитинизации i6 актер но вир иди на при добавлении кислоты в водно-гли­ цериновые суспензии 'бактерий и в суспензии па культуральной среде. Освещение не приводило к ускорению процесса. Выводы 1. Сравнительное изучение феофитшшзацин хлорофилла л ого аналогов в растворах показало, что по скорости иссле­ дуемой реакции пигменты следуют убывающему ряду: бактериовиридин, хлорофилл «а», иротохлорофилл и бактериюхлорофилл. хлорофилл «в». Рассмотрение «вязи скорости феофитинизации со структурой пигментов мы резюмируем следующим образом: а) Наличие электроотрицательных за­ местителей в пиррольных ядрах и симметричность в степени восстановленности полуизолированных связей С3—С4 и С?—Са стабилизирует атом магния в молекуле пигмента. б) Крайне быстро идущая феофитишизация 'бажтериовдаридина, И молекуле которого, по имеющимся данным, отсутствует карбо'метакснль'ная труппа о положении Сю, говорит об осо­ бом стабилизирующем влиянии>последней на связь магний-. азот IB 1молекуле пигмента, в) Наличие или отсутствие фитола в (молекуле пигмента не влияет существенно «а скоростьфеофи-пнннзадеи. 2. В гомогенате из листьев фасоли и в листьях фасоли и элодеи, инфильтрированных кислотой, хлорофилл «а» феофитишгаируется значительно скорее, чем (хлорофилл «в». Таким образом, химическое различие в строении молекул хлорофил­ ла ,«а» и «в», обусловливающее более легкую атаку ем ость магния молекулы хлорофилла кга» ионами водорода в органи­ ческих растворителях, сохраняется и при' феофитинизации этих пигментов в естественном состоянии, когда молекулы пигмента взаимодействуют друг с другом, а также с белками и липоидами. 21 3. Исследование различных стабильных спектрально об­ наруживаемых продуктов фотово остановлен и я хлорофилла показало, что они обменивают магнии на водород вначительно легче, чем исходный пигмент. 4. Обнаружено ускоряющее действие света на феофитиншацию хлорофилла «а», хлорофилла «.в», протохлорофилла и бактериовпридина -в спиртовых и пиридиновых растворах в присутствии соляной и щавелевой кислот m условиях, когда не наблюдается .накопления устойчивых фотовосстановленных продуктов. •5. Различия по скорости «темповой» феофитинизациш у * хлорофилла «а», 'хлорофилла к<в» и (протохлорофилла ниве­ лируются при «фотофеофитинизацни». Высказано предполо­ жение, что «фотофеофитинизация», наблюдаемая нами в пи­ ридине HI спирте, идет по механизму, отличному от «темпо­ вой» феофитянизации и определяется образованием феофнтина из лабильных промежуточных продуктов обратимых фотовосстанавнтёльных превращений пигментов, где донора­ ми электронов могли быть молекулы растворителей — спирт и пиридин. Соединения, ингибирующие фотовосстановление хлорофилла (каротин, нафтацен, метиловый красный, сафра­ нин, рибофлавин), инпгбируют и фотофеофитинизацию. 6. Ускоряющее действие света на феофитинизацшо не наблюдается в условиях, когда этот процесс не связан с предшествующими фотохимическими превращениями пигмен­ тов, что было показано при исследовании феофнтинизации в пленках ш адсорбатах пигмента. При длительном освеще­ нии листьев, гомогенатов и суспензий фотосинтезирующих бактерий в них не удалось обнаружить накопление феэфнтина. 7. Фотоокисление пигмента кислородом не связано с на­ коплением феофитина. 8. Феофитшшзация в зеленых фотосинтезирующих бакте­ риях при действии на них кислоты (ведет к изменению струк­ туры агрегированных форм и к спектральным сдвигам, со­ ответствующим образованию мономерной формы; свет не влияет на скорость этого процесса. 9. Можно предполагать, что фотофеофитинизация в рас­ творах может быть 'индикатором не обнаруживаемых спект­ рально обратимых окислительно-восетановителыных превра­ щений пигментов, что необходимо учитывать при исследова­ нии окислительно-восстановительных превращений хлоро­ филла и его аналогов в различных модельных системах. 25 Материалы диссертации» опубликованы в следующих пе­ чатных работах: 1. Свойства фотовосстановленных 'форм хлорофилла, про­ тохлорофилла и гематопорфирина в связи с условиями кис­ лотно-основного равновесия. ДАН СССР 120, 581 (1958). 2. Фотохимические и спектральные свойства бактериови­ ридпна зеленых серных бактерий ДАН СССР 127, 913 (1959). 3. Обратимое фотовосстановление >бактериохлорофнлла и его участие в процессах фотохимического переноса электрона. ДАН СССР 135, 1258 (1960). 4. Сравнительное изучение образования феофнпшов из хлорофилла и его аналогов в темноте и при освещении. ДАН СССР 148, 935 (1963). 5. Исследование феофитипизации хлорофилла, бактериохлорофшла, бактериовиридпна, протохлорофилла и действие света на эту реакцию. Биохимия 29, 1132 (1964). 6. Сравнительное изучение образования феофитинов из хлорофилла л его аналогов. Тезисы докладов на Первом Все­ союзном биохимическом съезде. Январь 1964. 7. Действие света иг феофигинизацито хлорофилла w его аналогов. Биохимия (в печати). T - U 1 0 8 от 6/VIII-65 г. Об'ем 1,75 п. л. Тир, 150. Типография «На боевом посту». Павлопская, 8. Зак. 512Э: