020311 B1 020311 B1 (11) 020311

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
020311
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
(51) Int. Cl. C12N 15/79 (2006.01)
2014.10.30
(21)
Номер заявки
201170505
(22)
Дата подачи заявки
2009.11.18
(54)
ВЕКТОР НА ОСНОВЕ ИСКУССТВЕННОЙ ХРОМОСОМЫ
B1
020311
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения белка в эукариотических
клеточных линиях, включающий следующие этапы: a) обеспечение остова искусственной
хромосомы, b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой
кислоты, кодирующей указанный белок, и упомянутого остова, c) введение указанного
экспрессионного вектора в линию эукариотических клеток-хозяев для получения эукариотической
экспрессирующей клеточной линии, d) культивирование указанной экспрессирующей клеточной
линии для продуцирования указанного белка и e) выделение указанного белка. Кроме того,
настоящее изобретение относится к соответствующим векторам и трансгенным клеточным линиям.
Бауэр Антон, Казанова Хевиа Эмилио
Мануэль, Блаас Леандер (AT)
Нилова М.И. (RU)
B1
(56)
TSYRULNYK ANDRIY ET AL.: "A
detailed protocol for bacterial artificial chromosome
recombineering to study essential genes in stem
cells.", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
(CLIFTON, N.J.) 2008, vol. 430, 2008, pages 269-293,
XP002567157, ISSN: 1064-3745, the whole document
BLAAS LEANDER ET AL.: "PhiC31mediated cassette exchange into a bacterial artificial
chromosome.", BIOTECHNIQUES, vol. 43, no.
5, November 2007 (2007-11) - 9 March 2010
(2010-03-09), pages 659-664, XP002567158, ISSN:
0736-6205, cited in the application, the whole
document
WO-A2-02097059
WO-A1-02096923
WO-A2-2004056986
BLAAS LEANDER ET AL.: "Bacterial
artificial chromosomes improve recombinant
protein production in mammalian cells.", BMC
BIOTECHNOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD.,
LONDON, GB, vol. 9, no. 1, 14 January
2009 (2009-01-14), page 3, XP021049476, ISSN:
1472-6750, the whole document
020311
(31) A1859/2008
(32) 2008.11.28
(33) AT
(43) 2011.12.30
(86) PCT/EP2009/065410
(87) WO 2010/060844 2010.06.03
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
БАУЭР АНТОН; КАЗАНОВА ХЕВИА
ЭМИЛИО МАНУЭЛЬ (AT)
020311
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белков в культурах клеток млекопитающих.
Важным разделом биотехнологии является получение рекомбинантных белков в системах на основе
клеток млекопитающих. Критическим моментом при получении рекомбинантных белков является создание клеточных линий, экспрессирующих представляющий интерес белок на высоком уровне, и изоляция
из этих линий отдельных клеточных клонов со стабильной экспрессией на протяжении многих пассажей
и времени (Wurm, F.M. Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)). Существует необходимость в способах создания клеточных линий, позволяющих стабильно, безопасно, надежно и воспроизводимо получать высокий выход секретируемого белка в клеточной культуре в промышленных масштабах. Такая
необходимость быстро возрастает вместе с растущим числом биопрепаратов, разрабатываемых и производимых для лечения фармацевтической индустрией.
Обычно этого достигают посредством случайного встраивания вектора экспрессии, содержащего
промотор, представляющий интерес ген и селективный маркер, в хромосомную ДНК стабильной клеточной линии-продуцента.
Часто используемые клеточные линии-продуценты получают из клеток млекопитающих или насекомых. Клеточная линия представляет собой стабильную культуру клеток, которая при обеспечении
подходящей свежей среды и объема растет неопределенно долго. В клеточных линиях, в отличие от
штаммов клеток, не действует предел Хайфлика (Hayflick L. (1965), "The limited in vitro lifetime of human
diploid cell strains." Exp. Cell Res. 37 (3): 614-636), они являются иммортализованными. Примерами стабильных клеточных линий-продуцентов являются CHO, NSO, COS или Sf9 клетки или линии клеток человека, такие как PerC-6 и HEK 293.
Обычно для генетической инженерии как клеток, так и клеточных линий млекопитающих в качестве вектора используют плазмиды. Плазмида представляет собой нехромосомную молекулу ДНК, которая
существует отдельно от хромосомной ДНК и способна реплицироваться в бактерии независимо от хромосомной ДНК. В большинстве случаев плазмиды являются кольцевыми и двунитевыми. В пролиферирующих клетках млекопитающих плазмида может поддерживаться неопределенно долго после случайного встраивания в геном клетки-хозяина и посредством своего промотора может приводить к продукции представляющего интерес гена/продукта, обычно белка.
Хотя данный способ генетической инженерии является простым и прямолинейным, он не обладает
достаточной воспроизводимостью. Экспрессия белков с таких векторов в значительной степени зависит
от хроматина, окружающего сайт интеграции, который может выключать экспрессию с течением времени (Wurm, F.M., Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)). Поэтому отбор подходящих клонов становится трудоемкой и требующей много времени процедурой.
Чтобы избежать позиционных эффектов прилегающего хроматина, было предложено несколько
стратегий. Например, использовали "антирепрессорные" элементы, фланкирующие вектор, либо вектора
встраивали в конкретный локус хромосомы с открытой структурой хроматина (Kwaks, T.H. и др., Nature
Biotechnology 21, 553-558 (2003), Huang, Y. и др., Journal of Immunological Methods 322, 28-39 (2007)).
Для получения трансгенных хозяев, таких как животные или растения, в данной технологии использовали искусственные хромосомы.
Публикация WO2002/097059А2 описывает искусственные хромосомы, которые были сконструированы с включением сайтов, доступных для сайт-специфичного встраивания ДНК посредством рекомбинации, что в особенности полезно при создании трансгенных животных.
Публикация US2008/0060093A1 раскрывает способы создания растений, трансформированных автономными мини-хромосомами.
Moralli с соавторами (EMBO reports 2006 Vol. 7(9) 911-918) описывают применение вектора на основе искусственной хромосомы человека в качестве системы переноса генов для экспрессии и изучения
комплементации.
Разработка подходящего вектора для экспрессии белка составляет важную часть при получении рекомбинантного белка в эукариотических клеточных линиях. В целом, искомый вектор для получения
рекомбинантного белка в клеточной культуре должен иметь следующие свойства:
1) экспрессия не должна зависеть от места встраивания в геном,
2) экспрессия должна коррелировать с количеством встроенных копий трансгена,
3) экспрессия должна сохраняться со временем и
4) уровень экспрессии должен быть высоким.
Целью настоящего изобретения является создание способа и вектора, позволяющих получать стабильные клеточные клоны для улучшения продукции рекомбинантного белка в эукариотических клеточных линиях-продуцентах.
Объекты настоящего изобретения позволяют решить указанную задачу.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения белка в линии эукариотических клеток,
включающий следующие этапы:
a) обеспечение остова искусственной хромосомы,
b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой кислоты кодирующей
-1-
020311
указанный белок у указанного остова,
c) введение указанного вектора экспрессии в линию эукариотических клеток-хозяев для получения
экспрессирующей эукариотической клеточной линии,
d) культивирование указанной экспрессирующей клеточной линии для продуцирования указанного
белка и
e) выделение указанного белка.
Таким образом, используемая согласно настоящему изобретению экспрессирующая клеточная линия имеет интергрированный экспрессионный вектор на основе искусственной хромосомы.
Клеточная линия согласно настоящему изобретению понимается как постоянная клеточная культура, которая при обеспечении подходящих культуральной среды и объема будет неопределенно долго
делиться и, таким образом, является иммортализованной. Клеточную линия, используемую согласно настоящему изобретению, в дальнейшем будут также называть "линией клеток-хозяев" или "клеткойхозяином".
Способ согласно настоящему изобретению, в частности, основан на конструкциях искусственных
хромосом, содержащих чужеродные последовательности нуклеиновых кислот, и способах использования
этих конструкций для получения белков ex vivo, например секреторных белков.
Согласно настоящему изобретению искусственные хромосомы можно использовать для широкомасштабного получения рекомбинантного белка в клеточных линиях-продуцентах. Предпочтительно
указанные искусственные хромосомы получают из бактерий наподобие бактериальной искусственной
хромосомы, также называемой "BAC" и содержащей, например, элементы F-плазмиды, или наподобие
искусственной хромосомы с элементами из плазмиды P1, называемой "PAC". Как в случае космид, указанная искусственная хромосома может содержать элементы из бактериофага. Кроме того, искусственные хромосомы, преимущественно используемые в настоящем изобретении, получают из дрожжей, например искусственную хромосому дрожжей, называемую еще "YAC", и из млекопитающих, например
искусственную хромосому млекопитающего, также называемую "MAC", подобную получаемой из человека искусственной хромосоме человека, называемой "HAC".
Указанные искусственные хромосомы объединяет присутствие последовательностей "ориджинов"
репликации - последовательностей, необходимых для репликации и сохранения хромосомы в течение
клеточного деления соответствующей клетки, используемой для амплификации ДНК. Космиды, бактериальные искусственные хромосомы и искусственные хромосомы с элементами плазмиды P1 содержат
репликаторы бактерий, дрожжевые искусственные хромосомы - репликаторы дрожжей, искусственные
хромосомы млекопитающих - репликаторы из клеток млекопитающих, а искусственные хромосомы человека - репликаторы из человеческих клеток. В дополнение, искусственные хромосомы согласно настоящему изобретению могут иметь маркеры для селекции, обычно это устойчивость к антибиотикам,
что позволяет отбирать клетки, несущие указанную искусственную хромосому.
Такие искусственные хромосомы представляют собой векторы, включившие в себя хромосомные
элементы, которые отвечают за репликацию и сохранение в соответствующем организме и способны
стабильно нести в себе крупные фрагменты геномной ДНК. Размер таких больших геномных фрагментов
ДНК обычно варьирует в пределах 30-50 kb для космид, 50-350 kb для искусственных хромосом с элементами плазмиды P1 и бактериальных искусственных хромосом, 100-3000 kb для дрожжевых искусственных хромосом и >10000 kb для искусственных хромосом млекопитающих и искусственных хромосом
человека.
Согласно предпочтительному способу реализации настоящего изобретения используемую искусственную хромосому выбирают из группы "искусственных хромосом микроорганизмов", включающей
бактериальные искусственные хромосомы, дрожжевые искусственные хромосомы, искусственные хромосомы с элементами плазмиды P1 и космиды. Искусственные хромосомы микроорганизмов обычно
достигают размера 5000 kbp. Предпочитаемый размер искусственной хромосомы согласно настоящему
изобретению - 100-350 kbp, но может быть и больше 350 kbp.
Предпочитаемый к использованию в настоящем изобретении остов искусственной хромосомы происходит от бактерии, бактериофага или дрожжей. Указанные искусственные хромосомы микроорганизмов можно рассматривать вместе ввиду их схожих свойств, но они различны по допустимому размеру
встраиваемых локусов ДНК. Помимо искусственных хромосом на основе бактериальных искусственных
хромосом, космид, искусственных хромосом с элементами плазмиды P1, дрожжевых искусственных
хромосом, также можно использовать хромосомы, полученные из млекопитающих (искусственные хромосомы млекопитающих) или человека (искусственные хромосомы человека). Согласно настоящему
изобретению в качестве остова бактериальной искусственной хромосомы предпочтительно используют
конструкцию Rosa26BAC. Также можно использовать и другие локусы с открытым хроматином, такие
как b-actin, Gapdh, Hprt и рибосомальные белки.
Добавочными элементами искусственной хромосомы согласно настоящему изобретению представляют собой большие фрагменты ДНК, содержащие генетические локусы. Эти генетические локусы поддерживаются и функционируют после введения искусственных хромосом в соответствующую эукариотическую линию клеток-продуцентов. Для экспрессии нужного генетического продукта такие генетиче-2-
020311
ские локусы содержат элементы, регулирующие структуру хроматина и доступность для факторов транскрипции, а также элементы, определяющие уровень транскрипции, такие как последовательности энхансеров и промоторов.
Некоторые из уже упомянутых элементов искусственной хромосомы нужны лишь для правильной
амплификации ДНК. Например, в бактериях и дрожжах это репликатор и маркерный ген для селекции,
такой как устойчивость к антибиотикам. Таким образом, часть искусственной хромосомы, несущая такие
элементы, называется остовом.
Искусственные хромосомы представляют собой большие векторы на основе ДНК, которые широко
используются для создания ДНК-библиотек при комплексном картировании и анализе геномов. Бактериальные искусственные хромосомы использовали для определения последовательностей геномов организмов в крупномасштабных проектах по секвенированию, как, например, Проект Геном Человека. Небольшой фрагмент ДНК нужного организма амплифицируют как вставку в бактериальной искусственной
хромосоме, а затем секвенируют. Затем секвенированные фрагменты выстраивают в нужную последовательность генома всего организма с помощью компьютера.
Также бактериальные искусственные хромосомы использовали как большие векторы для создания
трансгенных мышей (Giraldo, P. и Montoliu, L., Transgenic research 10, 83-103 (2001)). В данном примере
эмбриональные клетки мышей экспрессировали представляющий интерес ген, регулируемый соответствующим локусом в бактериальной искусственной хромосоме.
Выяснилось, что искусственные хромосомы можно использовать для создания эукариотических
экспрессирующих клеточных линий с улучшенными свойствами. Неожиданным образом было обнаружено, что полученный с использованием бактериальной искусственной хромосомы вектор согласно настоящему изобретению можно применять для трансфекции эукариотических клеточных линий и для высокоэффективной экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток. Согласно предпочтительному
варианту реализации настоящего изобретения основанный на бактериальной искусственной хромосоме
вектор согласно настоящему изобретению использовали для получения фрагмента константной области
человеческого lgG1. Прямое сравнение масштабных культур клеток HEK 293, полученных с использованием обычного вектора и вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы, показало, что вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы неожиданным образом улучшил выход белка в
10 раз. Дальнейший анализ стабильных клеточных клонов, несущих вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы, показал прямую зависимость продукции белка от количества интегрированных
копий бактериальной искусственной хромосомы, а также стабильность продукции белка даже после 30
пассажей.
Таким образом, согласно настоящему изобретению возможно, в целом, улучшить экспрессию секреторных белков и полипептидов, и в частности, в целях промышленного производства рекомбинантного
белка, что обычно подразумевает крупномасштабное производство, например ферментационный объем
по меньшей мере 1 л, более предпочтительно 5 л, а еще более предпочтительно ферментацию проводят
по меньшей мере в 100 л ферментационной среды. Ферментацию проводят партиями или с использованием техники непрерывного ферментирования.
Секреторные белки представляют собой белки или полипептиды, продуцируемые и выделяемые из
эукариотической клетки-хозяина во внеклеточное окружение. Обычно эти процессы обеспечиваются
сигнальными пептидами, которые представляют собой короткие пептидные последовательности, длиной
в 2-100 аминокислот, управляющие посттрансляционным транспортом белка. В основном, сигнальные
пептиды используют при получении белков, секретируемых клетками-продуцентами. Обычно при формировании зрелого секреторного белка сигнальные пептиды отщепляются. Примером сигнального пептида, найденного для легкой к (каппа) цепи человека и приводящего к секреции белка, является
"MELGLSWIFLLAILKGVQC" (Felgenhauer, M., Kohl, J. и Ruker, F.; Nucleotide sequences of the cDNAs
encoding the V-regions of H- and L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV-1-gp41; Nucleic
Acids Res. 18 (16), 4927 (1990)). Сигнальные пептиды также могут называться нацеливающими сигналами, сигнальными последовательностями, транзитными пептидами или сигналами локализации.
Аминокислотная последовательность сигнальных пептидов направляет синтезируемые в цитоплазме белки в ряд органелл: ядро, матрикс митохондрий, эндоплазмотический ретикулум, хлоропласт, апопласт и пероксисому. Сигнальные пептиды, используемые в экспрессионных векторах, обычно после
доставки белка отщепляются от белка сигнальной пептидазой.
Таким образом, вектор согласно настоящему изобретению основан на искусственной хромосоме,
включающей ген, который может кодировать секреторный белок, предпочтительно с использованием
сигнальной последовательности, например, в связке с секретируемым белком. Сигнальный пептид предпочтительно отщепляется от секретируемого белка после экспрессии и транспорта в надосадочную жидкость клеточной культуры.
Способ согласно настоящему изобретению, в основном, используют для обеспечения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей сывороточные белки, включающие в себя иммуноглобулины, фрагменты и производные иммуноглобулинов, альбумин, факторы крови, полипептидные гормоны, цитокины, хемокины, ферменты, и ростовые факторы, и их производные.
-3-
020311
К производным относится любой фрагмент, конъюгат, результат слияния, нуклеиновая кислота или
гомолог полипептида, который происходит от или является подобием секретируемого белка.
Для получения белка в рамках настоящего изобретения культивируют линию экспрессирующих
клеток, продуцирующую указанный белок, после чего белок выделяют. Таким образом, можно использовать способы выделения или сепарации, известные в данной области техники, такие как способы хроматографического разделения, необходимые для количественного выделения продукта.
В качестве эукариотической клетки-хозяина используют любую клетку-хозяин, способную при необходимости осуществлять эукариотическое гликозилирование белка. Предпочтительно применяют одиночные клетки млекопитающих или насекомых или клеточные линии клеток человека, приматов, мыши,
хомяка. Распространенным примером являются эмбриональные клетки почки человека, такие как HEK
293, CHO, COS, NS0 клетки, лимфобласты мыши, PerC6 или Sf9 клетки.
Для рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутые рекомбинантные белки, с геном остова искусственной хромосомы предпочтительно используют такие технологии рекомбинации,
как гомологичная рекомбинация или кассетный обмен, как, например, управляемый интегразой ϕС31
кассетный обмен.
Вектор согласно настоящему изобретению стабильно интегрирован в хромосому клетки-хозяина,
предпочтительно в хромосому млекопитающего или насекомого, еще предпочтительнее в хромосому,
полученную от человека, мыши или хомяка с целью обеспечения трансгенного хозяина.
Трансгенная клеточная линия согласно настоящему изобретению предусматривает одиночные
клетки, стабильные клоны одиночных клеток, клеточные линии и т.п. Тем не менее, настоящее изобретение явно исключает трансгенных людей. Трансгенная клетка-хозяин предпочтительно содержит вектор в
генетической карте своей хромосомы, обычно конъюгированный или непосредственно встроенный в
локус интенсивно экспрессируемого гена или белка, также называемого мажорным белком.
Здесь и далее под мажорным белком понимается белок с высокой степенью экспрессии на уровне
мРНК и полипептида в клетке-хозяине, например рибосомальные белки, белки цитоскелета, белки, необходимые для синтеза ДНК, такие как ДНК-полимераза. Такой мажорный белок обычно является хорошо
экспрессируемым собственным белком клетки-хозяина. Использование локуса мажорного белка обычно
способствует стабильной экспрессии секреторного белка, закодированного в искусственной хромосоме,
на высоком уровне. Также предпочтительно происхождение указанного локуса из млекопитающего или
насекомого.
Выбранный локус предпочтительно содержит регуляторные элементы для образования открытого
хроматина или экспрессии белка в целом. В частности, желательно присутствие энхансеров, препятствующих конденсации хроматина, в качестве как элементов, содержащихся в локусе в роли собственных
энхансеров, так и экзогенных, гетерологичных или синтетических регуляторных элементов, обеспечивающих необходимую для экспрессии структуру хроматина. Таким образом, данный локус доступен для
факторов транскрипции.
Участок "открытого хроматина", или "активного хроматина", или "эухроматина" может быть объектом структурных изменений, которые приводят к образованию менее конденсированных и активно
транскрибируемых структур. Считается, что механизм образования эухроматина лежит в основе регуляции
генов на уровне хроматина, поддерживая гены в активном состоянии, что является предпочтительным
для получения вектора на основе искусственной хромосомы, предназначенного для экспрессии белка.
В области генетики и эволюционных вычислений локус понимают как фиксированное положение
на хромосоме, в котором может содержаться один и более генов. Локус белка понимают как положение
гена, участвующего в экспрессии по меньшей мере части указанного белка. Вариант последовательности
ДНК в конкретном локусе называют трансгенной хромосомой. Упорядоченный список локусов, известных для отдельного генома, называют генетической картой.
Согласно настоящему изобретению предпочтительно используют локус, полученный из последовательностей ДНК линии клеток-продуцентов. Например, для млекопитающего хозяина используют локус
белка млекопитающего, также называемый локусом млекопитающего. Для клеток насекомого предпочитают использовать локус белка насекомого, также называемый локусом насекомого. В настоящем изобретении предпочтительно применяют человеческие и мышиные локусы. Примерами локусов являются
Rosa 26 или локусы интенсивно экспрессируемых и необходимых генов, таких как бета-актин и другие
белки цитоскелета, также гены рибосомальных белков.
Еще более предпочтительно использовать аллогенные локусы - локусы от того же вида, что и клетка-хозяин. Например, локус млекопитающего внедряют в вектор для создания клеток-хозяев млекопитающего, например человеческий локус внедряют в вектор согласно настоящему изобретению и вводят в
линию клеток человека. Такую аллогенную систему предпочтительно используют для получения белков
человека. Более того, предпочтительно используют вектор с мышиным локусом для интегрирования в
линию мышиных клеток-хозяев, вектор с локусом хомяка предпочтительно используют для интегрирования в линию клеток-хозяев хомяка, а вектор с локусом насекомого предпочтительно используют для
интегрирования в линию клеток насекомого.
Регуляторные элементы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтитель-4-
020311
но включают в себя промотор, или собственный, содержащийся в нативном локусе, или гетерологический элемент, такой как эукариотический и/или прокариотический промотор, или даже двойной промотор. Примерами промоторов служат неспецифичные промоторы, например промотор цитомегаловируса
(CMV), промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером цитомегаловируса (Caggs),
тимидинкиназы (Tk), убиквитина-С или второго фактора элонгации (EF2), которые обычно используют
для трансфекции. Кроме искусственных промоторов, используют и природные промоторы, такие как
промоторы бета-актина или рибосомальных белков. Предпочтительно выбирают сильные промоторы.
Было доказано, что для увеличения выхода продукта будет лучше внедрить в клетку-хозяина более
1 копии искусственной хромосомы, лучше 3 копии, еще лучше 5 или 10 копий, предпочтительно в клетку-хозяина интегрируют до 50 копий. Еще большее количество использованных искусственных хромосом, тем не менее, также может быть выгодным, в частности, когда в экспрессию белка вовлечен более
чем один локус, их число может достигать 500 копий. Увеличенное количество встроенных в геном копий искусственной хромосомы напрямую коррелирует с увеличением экспрессии представляющего интерес гена и, таким образом, влияет на увеличение выхода соответствующего закодированного белка.
Это явное преимущество в сравнении с использованием "knock-in" стратегий, в которых представляющий интерес ген интегрируют в одну или две копии хромосомного локуса линии клеток-хозяев, без использования искусственных хромосом.
Таким образом, использование искусственных хромосом, предложенное в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает высокий уровень экспрессии белка. Способ получения, предложенный
в соответствии с настоящим изобретением, дает выход на уровне 1 пг/клетка/день, предпочтительно выход достигает 3, 5, 10, 30, 50 и до 100 пг/клетка/день. Выход может улучшиться после увеличения плотности указанных клеток-хозяев при соответствующем культивировании.
Выяснилось, что клон, полученный в соответствии с настоящим изобретением, стабильно продуцирует белок даже после множества пересевов. Неожиданно было отмечено, что даже после 10, 20 или 30
пассажа продуктивность уменьшалась незначительно, т.е. не больше чем на 30%, что, таким образом,
демонстрировало стабильность системы экспрессии.
Вектор согласно настоящему изобретению может обеспечить средства для экспрессии, которые
обеспечивают более простое получение рекомбинантного белка в дополнение к обычным способам экспрессии или, что более предпочтительно, в качестве полноценной и независимой единицы экспрессии.
Таким образом, вектор, полученный в рамках настоящего изобретения, предпочтительно содержит регуляторные элементы гена, позволяющие случайную интеграцию искусственной хромосомы в стабильные
клеточные линии, при отсутствии влияния хроматинового окружения.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения вектор обеспечивают как полноценную
единицу экспрессии, содержащую все регуляторные элементы, обеспечивающие стабильную экспрессию
белка. Таким образом, вектор, полученный в рамках настоящего изобретения, можно вводить в клеткухозяина без необходимости интеграции в хромосому.
Так, например, оказалось, что вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы, предложенный в соответствии с настоящим изобретением, дает явное преимущество по сравнению с обычным
вектором. Он обеспечивает как минимум в 10 раз более высокий уровень экспрессии и менее подвержен
нежелательным влияниям хроматина, упрощая тем самым выделение отдельных клеточных клонов, продуцирующих представляющий интерес белок на высоком уровне. Более того, векторы на основе искусственных хромосом могут использовать собственные регуляторные элементы клетки и посредством этого
избегать гашения экспрессии в долго живущих культурах.
Использование векторов, основанных на искусственных хромосомах, в рамках настоящего исследования, в частности малых искусственных хромосом, таких как искусственные хромосомы микроорганизмов,
например бактериальной искусственной хромосомы, дает все преимущества "knock-in" стратегий. В дополнение, такие вектора могут быть интегрированы в геном хозяина в большом количестве копий, в то время
как интеграция "knock-in" вектора происходит в одном или самое большее двух экземплярах. Уровень экспрессии с векторов прямо пропорционален числу интегрированных копий, таким образом, вектор, созданный на основе искусственной хромосомы, дает более высокие уровни экспрессии по сравнению с "knockin" стратегией. Кроме того, создание стабильных клеточных линий согласно настоящему изобретению, в
частности, с использованием векторов на основе бактериальной искусственной хромосомы представляет
собой более простой процесс, требующий меньше времени, чем "knock-in" способы. Как уже отмечалось
выше, экспрессия представляющего интерес гена с использованием обычных векторов в высокой степени
подвержена нежелательному влиянию хроматина. Для преодоления этой проблемы обычные векторы
фланкируют короткими последовательностями ДНК, называемыми хроматиновыми изоляторами. Существует обширный список элементов ДНК, которые считают хроматиновыми изоляторами: участки контроля
локусов, элементы прикрепления к матриксу, антирепрессорные элементы, повторяющиеся хроматиновые
элементы, граничные элементы и т.д. (Wurm, F.M., Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)). С переменным успехом все эти элементы использовали в обычных векторах. Такие хроматиновые изоляторы представляют собой короткие последовательности ДНК, используемые в отрыве от их реального геномного
окружения, тем самым они не способны создать истинное хроматиновое окружение.
-5-
020311
С другой стороны, векторы на основе искусственных хромосом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением и содержащие определенный локус (например, Rosa 26), уже по своему определению являются элементами хроматина. Они содержат большинство, если не все регуляторные элементы
заданного локуса в настоящем эндогенном геномном контексте. Таким образом, векторы, предложенные
в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивают лучшую регуляцию хроматина или окружение,
чем обычные векторы, фланкированные только хроматиновыми изоляторами. С использованием предпочтительного варианта реализации способа в рамках настоящего изобретения необходимость в использовании хроматиновых изоляторов отпадает.
На фиг. 1А показаны конструкции, использованные для получения белка. CAGGS Fc - обычный
экспрессионный вектор, содержащий промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером
цитомегаловируса (CAGGS), сигнальный пептид, за которым идут Fc регион гена lgG1, репортерный элемент, состоящий из внутреннего сайта посадки рибосомы (IRES) и улучшенного желтого флуоресцирующего белка (eYFP), полиаденилатная сигнальная последовательность вакуолизирующего обезьяньего вируса (SV40 polyA) и фосфоглицераткиназная (PGK) неомициновая кассета. Конструкция Rosa26BAC CAGGS Fc
получена рекомбинацией вектора CAGGS Fc в бактериальную искусственную хромосому, содержащую
локус Rosa26. Вектор CAGGS Fc был помещен во второй экзон антисмысловой последовательности локуса Rosa26 вместе с последовательностями по 100 kb слева и справа.
На фиг. 1В показано сравнение эффективности продукции белка обычным вектором и вектором на
основе бактериальной искусственной хромосомы. Выход Fc анализировался в клеточных пулах клеток
HEK 293, полученных с использованием векторов CAGGS Fc и Rosa26BAC CAGGS Fc. Вектор CAGGS Fc
давал выход на уровне 0,5 пг/клетка/день, в то время как вектор на основе бактериальной искусственной
хромосомы давал выход на уровне 5,7 пг/клетка/день. Измерения повторяли трижды. Усы на столбцах
гистограммы показывают стандартное отклонение.
Фиг. 1С показывает зависимость между продукцией белка и количеством интергированных копий
трансгенной бактериальной искусственной хромосомы. Анализ 12 отдельных клонов показал разброс числа
копий от 1 до 55 для вектора Rosa26BAC CAGGS Fc с выходом белка от 5,5 до 30 пг/клетка/день. Продукция
белка была в прямой зависимости от количества трансгенных бактериальных искусственных хромосом.
Фиг. 1D показывает сохранение продукции белка на стабильном уровне в процессе пересевов культуры. Выход белка Fc измеряли на 1 и 30 пассажах у 6 разных клонов, изолированных из культур
Rosa26BAC CAGGS Fc. Никаких явных отличий найдено не было. Усы на столбцах гистограммы показывают
стандартное отклонение.
Дальнейшее описание настоящего изобретения производится посредством примеров.
Пример 1. Экспрессия человеческого Fc.
С целью протестировать эффективность бактериальных искусственных хромосом были созданы два
вектора экспрессии: вектор CAGGS Fc, содержащий промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером цитомегаловируса (CAGGS) (Niwa, H., Yamamura, K. & Miyazaki, J., Gene 108, 193-199
(1991)), сигнальный пептид, за которым идет Fc фрагмент (т.е. шарнир, CH2 и CH3) человеческого lgG1
как представляющий интерес ген (Fc), репортер, состоящий из внутреннего сайта посадки рибосомы и
улучшенного желтого флуоресцирующего белка (IRES/eYFP), и фосфоглицераткиназная (PGK) неомициновая кассета. Второй вектор, Rosa26BAC CAGGS Fc, состоит из вектора CAGGS Fc, который был помещен в остов бактериальной искусственной хромосомы, содержащей локус Rosa26 (фиг. 1А).
Клетки HEK 293 трансфицировали векторами CAGGS Fc и Rosa26BAC CAGGS Fc. После 14 дней селекции
на G418 устоялись два массива клеточных культур (клеточных пула) для CAGGS Fc и Rosa26BAC CAGGS Fc.
Анализ количества Fc-фрагмента в надосадочной жидкости показал выход в 0,5 и 5,7 пг/клетка/день в клеточных пулах с CAGGS Fc и Rosa26BAC CAGGS Fc, соответственно (фиг. 1В), демонстрируя, что использование вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы значительно улучшило продукцию белка.
Затем анализировали зависимость между количеством копий трансгена и выходом белка Fc. Из
культуры с Rosa26BAC CAGGS Fc было выведено 12 клонов с содержанием копий трансгена от 1 до 55. Выход белка, судя по надосадочным жидкостям данных культур, был взаимосвязан с числом копий трансгена и варьировал от 5,5 до 30 пг/клетка/день (фиг. 1С). Коэффициент корреляции R2 между числом копий вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы и продукцией белка был равен 0,88. Это
указывает на то, что при использовании экспрессионного вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы продукция белка пропорциональна числу интегрированных копий трансгена.
Наконец, изучили долгосрочную продукцию белка на протяжении времени и при увеличении числа
пассажей. 6 клонов из культуры с Rosa26BAC CAGGS Fc пересевали 30 раз и анализировали продукцию белка. Выход белка Fc от 1 до 30 пассажа значительно не уменьшался, указывая, что векторы на основе бактериальной искусственной хромосомы обеспечивают стабильную продукцию рекомбинантного белка с
течением времени.
В этой работе использовали локус Rosa26 в составе бактериальной искусственной хромосомы, чтобы оградить экспрессирующий участок (CAGGS Fc). С таким подходом было показано, что вектор на
основе бактериальной искусственной хромосомы дает лучшие результаты в сравнении с обычными век-6-
020311
торами для продукции рекомбинантного белка. Дальнейшие улучшения основанных на бактериальной
искусственной хромосоме векторов для продукции рекомбинантного белка могут включать использование
эндогенных/естественных промоторов с высокой активностью в клетке продуценте. Например, анализ
транскрипции клеток HEK 293 выявил высокие уровни экспрессии гена Rpl23a, кодирующего рибосомальный белок. По этой причине использование бактериальной искусственной хромосомы, содержащей
локус Rpl23a, в клетках HEK 293 может дополнительно улучшить продукцию рекомбинантного белка.
Материалы и методы
Плазмиды и культуры клеток.
Вектор экспрессии CAGGS Fc собирали классическими способами клонирования, с торцов помещены два сайта attB (места, распознаваемые интегразой phiC31). Вектор Rosa26BAC CAGGS Fc ВАС был создан по ранее описанному способу (Blaas, L, Musteanu, M., Zenz, R., Eferl, R. и Casanova, E., BioTechniques
43, 659-660, 662, 664 (2007)). Коротко, вектор CAGGS Fc интегрировали в бактериальную искусственную
хромосому, содержащую локус Rosa26, используя управляемый интегразой phiC31 кассетный обмен со
вторым экзоном антисмыслового транскрипта локуса Rosa26.
Для создания культур клеток 24 мкг векторов CAGGS Fc и Rosa26BAC CAGGS Fc ВАС были линеаризованы с помощью рестриктазы Notl, после чего, с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen), производилась трансфекция клеток HEK 293. Через 2 дня после трансфекции в среду (DMEM - модифицированная Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки,
дополненная глутамином, пируватом и неосновными аминокислотами) добавляли антибиотик G418
(800 мкг/мл). Селекцию производили 14 дней. После чего культуры росли в отсутствие G418, а измерение продукции белка Fc в массиве культур производили 1 неделей позже.
Белок Fc можно выделять, используя способы хроматографии.
Определение белка Fc.
В каждую лунку 6-луночного планшета высевали 5×105 клеток в 2 мл среды. Через 72 ч после высевания с помощью твердофазного иммуноферментного анализа измерялась концентрация белка Fc в надосадочной жидкости. Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа F(ab')2 фрагменты IgG
козла против антигенов человека (специфичные к Fc фрагменту) (Sigma I-3391) в концентрации 1 мкг/мл
адсорбировали в лунках планшета Maxisorp в течение ночи при 4°C с последующим блокированием неспецифичных валентностей 5% бычьим сывороточным альбумином на фосфатно-солевом буфере в течение 1 ч при 25°C. После отмывки планшета образцы и калибратор вносились в лунки с заблокированными неспецифичными валентностями в соответствующих сериях разведений и инкубировались 1 ч при
25°C. Планшет отмывали и связавшийся Fc фрагмент выявляли белком А с пероксидазой хрена (SIGMA
P-8651), разведенным на фосфатно-солевом буфере с добавлением бычьего сывороточного альбумина в
соотношении 1:70000, после чего производилось окрашивание раствором субстрата - тетраметилбензидина (Sigma T0446). Оптическая плотность измерялась при 450 нм с длинной контрольной волны 630 нм.
Анализ числа копий Rosa26BAC CAGGS Fc.
Стабильные клоны из культуры Rosa26BAC CAGGS Fc получали способом сортировки клеток по
возбужденной флуоресценции улучшенного желтого флуоресцирующего белка. Число копий трансгена
в одиночных клеточных клонах вычисляли способом ПЦР в реальном времени с геномной ДНК
в качестве матрицы. Бактериальная искусственная хромосома с Rosa26 амплифицировалась с помощью
праймеров RosaF 5' TCTTGTCCTTTTACCTCCCTTGTA (последовательность № 1) и RosaR 5'
GAACATATTCAAAACACCAGGATTT (последовательность № 2). Эти праймеры распознают бактериальную искусственную хромосому и эндогенный локус ROSA26. В качестве внутреннего контроля амплифицировали локус бета-актина, при этом использовали праймеры actinF 5' TCATGTTTGAGACCTTCAACACC
(последовательность № 3) и actinR 5' GATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAGGT (последовательность № 4).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов, включающий следующие
стадии:
a) обеспечение остова искусственной хромосомы,
b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей
указанный белок, и указанного остова,
c) введение указанного экспрессионного вектора в линию эукариотических клеток-хозяев для получения эукариотической экспрессирующей клеточной линии, в которой по меньшей мере 5 копий указанной искусственной хромосомы успешно интегрированы в хромосому клетки-хозяина,
d) культивирование указанной экспрессирующей клеточной линии для продуцирования указанного
белка и
e) выделение указанного белка.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную рекомбинацию осуществляют с применением
техники рекомбинации, выбранной из гомологичной рекомбинации или кассетного обмена, управляемого интегразой.
-7-
020311
3. Способ согласно п.1 или 2, отличающийся тем, что в указанную линию клеток-хозяев происходит
интеграция указанного вектора в количестве по меньшей мере от 10 до 500 копий.
4. Способ согласно любому из пп.1-3, отличающийся тем, что получают секретируемый белок.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный секретируемый белок содержит сигнальный
пептид.
6. Способ по любому из пп.4, 5, отличающийся тем, что указанный секретируемый белок выбирают
из группы, состоящей из белков сыворотки, включая иммуноглобулины, производные или фрагменты
иммуноглобулинов, альбумин, факторы крови, полипептидные гормоны, цитокины, хемокины, ферменты, ростовые факторы и их производные.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанную искусственную хромосому получают из бактерии, бактериофага, дрожжей или млекопитающего.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанную искусственную хромосому выбирают из группы, состоящей из бактериальных искусственных хромосом (BAC), искусственных хромосом на основе плазмиды Р1 (PAC), дрожжевых искусственных хромосом (YAC) и космид.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанный вектор содержит регуляторные
элементы для образования открытого хроматина.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит либо нативный, либо гетерологичный промотор.
11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит локус мажорного белка.
12. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит локус, происходящий из насекомого или млекопитающего.
13. Применение экспрессионного вектора, основанного на искусственной хромосоме, которая содержит ген, кодирующий секреторный белок, при этом указанный вектор получен посредством
обеспечения остова искусственной хромосомы;
осуществления рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и указанного
остова с получением экспрессионного вектора,
в способе получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов согласно любому из пп.1-12.
14. Хромосома клетки-хозяина, содержащая стабильно интегрированный экспрессионный вектор,
основанный на искусственной хромосоме, которая содержит ген, кодирующий секреторный белок, при
этом указанный вектор получен посредством
обеспечения остова искусственной хромосомы;
осуществления рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и указанного
остова с получением указанного экспрессионного вектора.
15. Применение трансгенной линии клеток-продуцентов, которая содержит вектор, включающий
аллогенный локус, в способе получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов согласно
любому из пп.1-12.
Фиг. 1А
Фиг. 1В
-8-
020311
Фиг. 1С
Фиг. 1D
-9-
020311
Перечень последовательностей
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 10 -