№ 1 - 2011 г. 14.00.00 медицинские науки УДК 616-006.68:612.57-091.818]-092.9 ПРОГРАММИРУЕМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ ПРИ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕМИИ У КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ WALKER 256 А.В. Ефремов1, Е. В. Овсянко1, П.М. Ларионов2, Ю.В. Пахомова1, Я.У. Овсянко1 1 ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» (г. Новосибирск) 2 ГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Ростмедтехнологии» (г. Новосибирск) Проведено иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bax и Bad) в клетках карциносаркомы Walker 256, имплантированных в мышцу бедра в дозе 1 × 106 клеток крысам-самцам линии Wistar при воздействии общей гипертермией. Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из решающих моментов в запуске апоптоза клеток карциносаркомы Walker 256 является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2. При воздействии общей гипертермии наблюдалась выраженная индукция апоптоза. Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, апоптоз, Bcl-2, Bax, Bad, общая гипертермия Ефремов Анатолий Васильевич – доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАМН, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-39-78 Овсянко Елена Владимировна – кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии, гистологии и биологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: Vin_San92@mail.ru Ларионов Петр Михайлович – доктор медицинских наук, профессор ГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Ростмедтехнологии», e-mail: Vin_San92@mail.ru Пахомова Юлия Вячеславовна – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: (383) 225-39-78 Овсянко Ясит Умеровна – кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры анатомии человека ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-15-24 Введение. Одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации клеток и апоптозом. В повреждении регуляции апоптоза, приводящем к развитию опухолевых заболеваний, одно из центральных мест связано с экспрессией одного из основных звеньев в регуляции программированной гибели клетки – белков семейства Bcl-2. Эти белки играют важную роль в регуляции внутреннего (митохондриального) пути апоптоза. К ним относятся как индукторы, так и ингибиторы апоптоза. В настоящей работе изучена методом иммуногистохимии экспрессия генов белков семейства Bcl-2 в опухолевой ткани у крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 в динамике после воздействия общей гипертермией. Материал и методы исследования. В эксперименте использовали крыс-самцов линии Wistar массой 180–200 г. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 1 × 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl. Через 5 суток с момента перевивки опухоли животных разделяли на 2 группы: 1-я группа – контроль со «спонтанным» развитием опухоли (n = 7); 2-я группа – при воздействии общей гипертермией (ОГ) (n = 14). ОГ животных производилась в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [1]. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5 °С (стадия теплового удара). Опухолевую ткань для иммуногистохимического исследования брали в следующие сроки: 1-й группы – после 5-х суток с момента перевивки опухоли; 2-й – на 7е и 14-е сутки с момента прогревания животных. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 выполняли на парафиновых срезах опухолевой ткани толщиной до 5 мкм с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [3]. Использовали антитела Bax (поликлональный) к домену, играющему важную роль в образовании гомо- и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2, а также к Bcl-2 и Ваd (моноклональные). Морфометрическое исследование изучали на фотографических снимках, сделанных при помощи моторизованного микроскопа M200 (Zeiss) и камерой AxioCam HRc (Zeiss) с конечным увеличением ×630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision – Release 4.7.1. (Zeiss). Полученные в экспериментах цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t – критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 % (p < 0,05). Результаты исследования и их обсуждение Полученные результаты представлены в таблице. Величины показателей уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 у крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермией (M ± m) Группы 1 группа 2 группа, ОГ Сутки 5-е 7-е 14-е Bcl-2, % 19,86 ± 1,52 13,06 ± 1,48 * 8,91 ± 1,41* Bax, % 19,13 ± 2,05 71,52 ± 4,49 * 33,47 ± 1,59 * Bad, % 32,59 ± 1,81 68,06 ± 3,58 * 70,58 ± 1,95 * Примечание: 1-я группа – контроль со «спонтанным» развитием опухоли; 2-я группа – при воздействии общей гипертермией (ОГ); * – р < 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе со «спонтанным» развитием опухоли При сравнительной оценке экспрессии белков семейства Bcl-2 при «спонтанном» развитии опухоли не было выявлено достоверных различий между величинами показателей Bcl-2 и Bax. Уровень показателя экспрессии Bad был достоверно выше соответствующих величин показателей Bcl-2 и Bax в 1,64 и 1,7 раза соответственно. Один из механизмов апоптоза связан с изменением степени фосфорилирования/дефосфорилирования белка-индуктора Bad. Bad дефосфорилируется, образуются гетеродимеры Bcl-2/Bad, и запускается процесс апоптоза за счет высвобождения митохондриальных факторов, при этом в конечном итоге происходит активация каспазы-9. Возможно, апоптоз является фактором, сдерживающий рост опухоли на ранних стадиях развития. По наблюдениям I. D. Bowen, S. M. Bowen [4] в молодых опухолях на начальных стадиях развития происходит активация апоптоза, но с увеличением массы опухоли апоптоз резко падает и сохраняется на относительно стабильном уровне. При воздействии ОГ на протяжении всего эксперимента резко возрастал уровень экспрессии промоторов апоптоза Bax и Bad, инициирующих программируемую клеточную смерть в присутствии ингибиторов каспаз. Выявлено, что показатель уровня экспрессии Bad как на 7-е, так и на 14-е сутки эксперимента был выше уровня величины того же показателя группы контрольных животных со «спонтанным» развитием опухоли в 2,08 и 2,16 раза соответственно. Экспрессия уровня проапоптогенного белка Bax была также выше соответствующего показателя уровня контроля в большей степени на 7-е сутки в 3,74 и 1,74 раза соответственно. Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax. Отношение Bcl-2 и Bax находится в состоянии постоянного динамического равновесия, образуя гомо- и гетеродимеры, что завершается апоптозом клетки [5]. Ранее нами было обнаружено при воздействии ОГ на крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 повышенное на 14-е сутки содержание ТБК-активных продуктов, уровня диеновых конъюгатов, а также увеличение активности лизосомных ферментов (арилсульфатазы А- и N-ацетил-ß,D-глюкозаминидазы) в сыворотке крови, свидетельствующие о стимуляции окислительного стресса, индуцирующие гибель клеток Walker 256 путем апоптоза [2]. Важно отметить, что уровень экспрессии протоонкогена Bcl-2 при воздействии ОГ на протяжение всего эксперимента достоверно ниже соответствующего показателя контроля у животных со «спонтанным» развитием опухоли в большей степени на 14-е сутки эксперимента в 1,52 и 2,23 раза соответственно. Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что члены семейства белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами. Показано, что решающим моментом в запуске апоптоза карциносаркомы выраженная индукция апоптоза наблюдалась при воздействии общей гипертермии. Список литературы 1. Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А. и др. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / опубл. 2001. Бюл. № 10. 2. Пупышев А. Б., Федина Р. Г., Мичурина С. В., Овсянко Е. В. [и др.] // Вопр. онкологии. – 2009. – Т. 55, № 2. – С. 221–223. 3. Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия : методич. рекомендации / В. Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, Н. А. Максимова. – Спб., 2002. – 36 с. 4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen. – London : Champman and hall, 1990. 5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway – Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271. – P. 4573–4576. PROGRAMMED CELL DECAY IN GENERAL HYPERTHERMIC RATS WITH CARCINO - SARCOMA WALKER 256 A.V. Efremov1, E.V. Ovsyanko1, P.M. Larionov2, Y.V. Pakhomova1, Y.U. Ovsyanko1 1 SEI HPE «Novosibirsk State Medical University» SI «Novosibirsk SRI of Blood Circulation Pathology named after academician E.N. Meshalkin Rosmedtechnology» (c. Novosibirsk) 2 The Bcl-2 ( Bcl-2, Bax and Bad) proteins‘ expression level immunehistochemical research is carried out in carcino-sarcoma cells Walker 256, implanted into Wistar mail-rats muscular thigh cells in the dosage of 1 x 10`6, under general hyperthermia. The given data observe the Bcl-2 proteins heterodimerization being one of the decisive moments in Walker 256 carcino- sarcoma cells start of apopthosis. The marked apopthosis induction was observed under general hyperthermia. Keywords: carcino-sarcoma Walker 256, apopthosis, Bcl-2 Bcl-2, Bax, Bad, general hyperthermia About authors: Efremov Anatoliy Vasilyevich – doctor of medical sciences, professor, correspondent member RAMS, head of pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78 Ovsyanko Elena Vladimirovna – medical sciences candidate, assistant professor at anatomy, histology and biology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», e-mail: Vin_San92@mail.ru Larionov Petr Mikhailovich – doctor of medical sciences, professor SI «Novosibirsk SRI of Blood Circulation Pathology named after E.N. Meshalkin Rosmedtechnology», e-mail: Vin_San92@mail.ru Pakhomova Yulia Viacheslavovna – doctor of medical sciences, professor at pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78 Ovsyanko Yasit Umerovna – medical sciences candidate, senior teacher at human anatomy department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone: 8(383) 225-1524 List of the Literature: 1. Efremov A.V., Pakhomova Y.V., Pakhomov E.A. [et. al]. Licence 2165105 of Russian Federation. Experimental modeling way of general hyperthermia in little laboratory animals / published in 2001. Bulletin № 10. 2. Pupyshev A.B., Fedina R.G., Michurina S.V., Ovsyanko E.V. [et.al] // Oncology Questions. - 2009. - V. 55, № 2. P. 221-223. 3. Ellinidy V.N. Practical immunehistochemistry: methodical recommendations / V.N. Ellinidy, N.V. Anikieva, N.A. Maksimova. - Spb., 2002. - 36p. 4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen. – London : Champman and hall, 1990. 5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway – Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271. – P. 4573–4576.