Особые методики - Global Fertility Academy

Предлагаем вашему вниманию главу 14.
Она называется “Особые методики: ИМСИ – инъекция морфологически
отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита”.
Автор – д-р Anick De Vos.
1
После изучения этой главы слушатель должен иметь представление о
различных аспектах морфологического анализа органелл подвижного
сперматозоида (MSOME). Кроме того, слушатель должен знать, что возможное
преимущество методики инъекции морфологически отобранного
сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИМСИ) для достижения беременности
было продемонстрировано только в сравнении с парной контрольной группой.
На данный момент доказательства, полученные в результате проспективных
рандомизированных исследований, весьма ограничены. Также слушатели
узнают, что четкие показания для ИМСИ требуют дальнейшего уточнения.
2
Стандартная инъекция сперматозоида в плазму ооцита (ИКСИ) включает
отбор спермы при оптическом увеличении приблизительно в 400 раз. Однако
сперматозоиды, которые при таком увеличении сперматозоида (MSOME).
Микроинъекция сперматозоидов, отобранных выглядят морфологически
нормальными, могут иметь различные структурные аномалии на субклеточном
уровне, которые останутся незамеченными эмбриологом.
Благодаря использованию более сильного оптического увеличения удалось
минимизировать этот недостаток, и таким образом был разработан новый
метод морфологического анализа органелл подвижного согласно строго
определенным критериям нормальной морфологии по MSOME, в плазму
ооцита называется ИМСИ.
3
Bartoov и соавт. впервые предложили МСОМЕ в 2001 году. Эта процедура
позволяет подробно анализировать морфологию ядерных структур
подвижного сперматозоида в режиме реального времени при помощи
инвертированного микроскопа, оснащенного мощной оптикой для
дифференциально-интерференционного контраста, которая позволяет
достигать увеличения в 1500 раз, с возможностью дальнейшего улучшения
качества изображения средствами цифровой визуализации.
.
4
Исследование при сильном увеличении позволяет идентифицировать
подвижный сперматозоид с нормальным ядром, который характеризуется
овальной формой с гладкими очертаниями и нормальным содержимым ядра,
т.е. вакуоли занимают не более четырех процентов его площади.
Успех метода ИКСИ напрямую и в значительной мере зависит от
морфологического строения ядра сперматозоида (Bartoov и соавт., 2001).
Незначительные морфологические аномалии ядра сперматозоида могут
оставаться незамеченными эмбриологом во время отбора сперматозоидов при
проведении традиционной ИКСИ (Bartoov и соавт., 2005).
5
Специфические морфологические аномалии субклеточных органелл
сперматозоидов, наблюдаемые при проведении МСОМЕ, могут встречаться в
акросоме, постакросомальной пластинке, ядре (включая его форму и
состояние хроматина), шейке, хвосте и митохондрионе (Bartoov и соавт., 2002).
В сперматозоиде может отсутствовать акросома и/или постакросомальная
пластинка. Возможно частичное присутствие акросомы или ее везикуляция.
Аномалии формы ядра включают: малый овал, большой овал, узкое, широкое,
короткое, с регионарным нарушением. Присутствие вакуолей, которые
занимают более четырех процентов области ядра, указывает на нарушение
целостности хроматина. Присутствие цитоплазматической капли в области
шейки может указывать на неполную зрелость сперматозоида. Кроме того,
сперматозоид считается аномальным, если у него отмечается отсутствие
хвоста, хвост закрученный или сломанный, множественные хвосты или
короткий хвост. Митохондрии могут отсутствовать, частично отсутствовать или
быть дезорганизованными.
6
Средняя встречаемость морфологически нормальных сперматозоидов на 100
исследованных проб спермы (100 выбранных случайным образом пар,
направленных на ИКСИ) составила 3,3 ± 0,5% (медиана 2,5%), при этом
диапазон встречаемости морфологически нормальных сперматозоидов
составил от 0 до 38%, а морфологически нормального ядра - от 0 до 68%.
Из шести исследованных субклеточных органелл сперматозоидов (акросома,
постакросомальная пластинка, ядро, шейка, хвост, митохондрии),
морфологически нормальное ядро сперматозоида (форма и состояние
хроматина) оказалось наиболее важным параметром, влияющим на исход
ИКСИ (Bartoov и соавт., 2002 и Berkovitz и соавт., 2005).
7
На данный момент возможное преимущество ИМСИ для достижения
беременности было продемонстрировано в основном путем сравнения с
контрольной парной группой, проведенного единственной исследовательской
группой. Следовательно, существует насущная необходимость проведения
рандомизированных контролируемых клинических исследований для
подтверждения или опровержения полученных результатов.
Bartoov et al., N Engl J Med (Журнал медицины Новой Англии) 2001
Bartoov et al., Fertil Steril (Фертильность и бесплодие) 2003
Berkovitz et al., Hum Reprod (Репродукция человека) 2006
Berkovitz et al., RBM Online (Репродуктивная биомедицина онлайн) 2006
8
В первом предварительном исследовании изучалась частота наступления
беременности у 24 пар, которые проходили один цикл ИМСИ. Проводилась
инъекция сперматозоидов с нормальным ядром, отобранных методом
МСОМЕ, в цитоплазму ооцитов (Bartoov и соавт., 2001). У пар было
диагностировано мужское бесплодие и множественные неудачные циклы
ИКСИ в анамнезе. Средняя частота наступления беременности в ходе
исследования составила 58%.
Авторы пришли к заключению, что морфологическое строение ядра
сперматозоида является важным фактором выживаемости эмбриона после
процедуры ИКСИ.
9
Шестьдесят две пары, у которых было не менее 2 неудач циклов ИКСИ в
анамнезе, проходили один цикл ИМСИ, которому предшествовал
морфологический отбор сперматозоидов с нормальным ядром.
Из них пятьдесят пар сравнивали с парами, которые проходили традиционную
процедуру ИКСИ в том же центре ЭКО и имели такое же количество
предыдущих неудачных циклов ИКСИ. Парное исследование выявило более
высокую частоту наступления беременности при ИМСИ (66%) по сравнению с
традиционной процедурой ИКСИ (30%), на основании чего авторы пришли к
выводу, что микроинъекция в цитоплазму ооцитов сперматозоидов,
отобранных по строго определенным критериям морфологически нормального
ядра, значимо повышает частоту наступления беременности у пар с
предыдущими неудачами ИКСИ (Bartoov и соавт., 2003).
10
В 2006 году Berkovitz и соавт. опубликовали сравнительное исследование в
издании Human Reproduction. Экспериментальная группа состояла из 28
циклов. В этой группе производился перенос эмбрионов, полученных путем
микроинъекции сперматозоидов с ядром нормальной формы, но содержащим
большие вакуоли. Контрольная парная группа включала 28 циклов, где
производился перенос только тех эмбрионов, которые были получены путем
микроинъекции сперматозоидов, отобранных по строго определенным
критериям с морфологически нормальным ядром и его содержимым.
В экспериментальной группе частота наступления беременности на цикл была
значимо ниже, а частота самопроизвольного аборта на беременность была
значимо выше по сравнению с контрольной группой (18% по сравнению с 50%
и 80% по сравнению с 7% соответственно). Был сделан вывод, что
микроинъекция вакуолизированных сперматозоидов снижает частоту
наступления беременности и сопровождается ранним самопроизвольным
абортом.
11
В 2006 году Berkovitz и соавт. снова опубликовали отчет о сопоставительном
контролируемом исследовании в издании RBM Online. Целью исследования
было подтверждение предыдущих выводов на новых группах с большей
численности. Сравнение 80 пар, у которых проводилась исследуемая
процедура ИМСИ, с парами сравнения, у которых проводиллось традиционная
процедура ИКСИ, подтвердило, что частота наступления беременности после
ИМСИ значимо выше, а частота самопроизвольного аборта - значимо ниже,
чем при выполнении традиционной процедуры ИКСИ (60% по сравнению с
25% и 14% по сравнению с 40% соответственно).
В 10 циклах ИМСИ эмбрионы были получены путем микроинъекции
сперматозоидов с минимальными морфологическими отклонениями,
поскольку сперматозоиды лучшего качества отсутствовали. При
микроинъекции сперматозоидов "второго сорта" частота наступления
беременности и частота родов были значимо ниже, а частота
самопроизвольного аборта - значимо выше, чем при микроинъекции
"наилучших" сперматозоидов с морфологически нормальным ядром.
По мнению авторов, данные результаты служат подтверждением предыдущих
выводов.
12
С целью изучения преимуществ процедуры ИКСИ при сильном увеличении у
пар с многократными неудачами ИКСИ по причине низкого качества отцовских
клеток проводилась дополнительная попытка традиционной процедуры ИКСИ,
с последующей попыткой процедуры ИКСИ при сильном увеличении.
Проводилось сравнение двух последовательных попыток (Hazout и соавт.,
2006).
Проведение ИКСИ при сильном увеличении приводило к улучшению
клинических исходов (повышению частоты наступления беременности,
имплантации, родов и родов живым плодом) без влияния на биологические
исходы (частота оплодотворения и дробления, морфология эмбриона).
Улучшение клинических исходов наблюдалось как у пациентов с повышенной
степенью фрагментации ДНК спермы, так и у пациентов с нормальным
статусом ДНК.
13
Наиболее достоверным прогностическим фактором качества спермы является
наличие вакуолей в головке сперматозоида. Предполагается, что
микроинъекция вакуолизированных сперматозоидов снижает частоту
наступления беременности и ассоциируется с ранним самопроизвольным
абортом (Berkovitz и соавт., 2005).
Две публикации, вышедшие в последнее время, поддерживают идею
взаимосвязи между дефектами хроматина и наличием вакуолей в головке
сперматозоида (Franco и соавт., 2008 и Garolla и соавт., 2008). Наличие
больших ядерных вакуолей ассоциируется с повреждением ДНК.
Морфологические особенности, определяемые при сильном увеличении,
также ассоциировались с митохондриальной функцией, хроматиновым
статусом и увеличением количества анеуплоидий.
Эти результаты могут служить аргументами в пользу применения
морфологического отбора при сильном увеличении.
14
На данный момент эффективность ИМСИ еще не доказана, и требуется
определить показания, по которым эта процедура должна использоваться.
С этой целью необходимо провести рандомизированные контролируемые
клинические исследования с участием четко определенных групп пациентов.
На данный момент было проведено только одно рандомизированное
контролируемое клиническое исследование (Antinori и соавт., 2008), в ходе
которого проводилось сравнение двух методик – ИКСИ и ИМСИ – по
следующим показателям: частота наступления беременности, частота
невынашиваемости беременности и частота имплантации.
Результаты исследования показали, что ИМСИ повышает частоту
наступления клинической беременности (39,2% по сравнению с 26,5%). Также
был сделан вывод, что процедура ИМСИ наиболее эффективна у пациентов с
двумя и более неудачными попытками в анамнезе
15
Одно из ограничений единственного проведенного рандомизированного
контролируемого клинического исследования состояло в том, что в
соответствии с законодательством Италии на каждого пациента допускается
использовать для инъекции не более трех ооцитов. Предстоит установить,
насколько полученные результаты репрезентативны по отношению к циклам, в
которых нет такого ограничения количества используемых ооцитов.
Кроме того, было выявлено несколько практических сложностей. На поиск
нормальных сперматозоидов требовалось минимум 60 минут, а в некоторых
случаях – до 210 минут, в зависимости от качества спермы в каждой пробе.
Согласно требованиями данной методики анализ одной пробы выполнялся
одновременно двумя эмбриологами, чтобы ограничить субъективность оценки
спермы. Для проведения процедуры ИМСИ требуется специальное
оборудование (для достижения необходимого увеличения), практические
критерии (для правильного отбора сперматозоидов) и опытные,
высококвалифицированные эмбриологи или лаборанты. Длительное время,
требующееся для отбора спермы, является основным существенным
ограничением более широкого применения этой методики.
16
Одно исследование оценивало влияние наличия вакуолей в ядрах
сперматозоидов на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты
(Vanderzwalmen и соавт., 2008).
Сперматозоиды классифицировались при сильном увеличении на четыре
различных класса в зависимости от количества и размера имеющихся
вакуолей. В исследуемой популяции 7% сперматозоидов были I класса,
59,7% - II класса, 20,4% - III класса и 12,9% - IV класса.
17
В ходе развития эмбрионов в группе из 25 пациентов после инъекции ооцитов
от одной женщины сперматозоидами четырех различных классов до 3-го дня
не наблюдалось значимых различий по качеству эмбрионов.
Однако частота формирования бластоцист для сперматозоидов I и II классов
составила 56,3% и 61,4% соответственно, в противоположность
сперматозоидам III класса, для которых этот показатель оказался равным
5,1%, и сперматозоидам IV класса, для которых этот показатель составил 0%
(Vanderzwalmen и соавт., 2008).
18
В дополнение к системе классификации Vanderzwalmen и соавт., которая
основывается на количестве и размере вакуолей, недавно была предложена
новая система классификации (Cassuto и соавт., 2009). Согласно этой системе
во внимание принимаются три основных параметра нормальной морфологии:
головка, вакуоли и шейка; в то время как три второстепенных параметра
(акросома, аксиальность и цитоплазматическая капля) не включались в
окончательную количественную оценку. Количественная оценка трех основных
параметров осуществлялась по такой шкале: норма = 1 и аномалия = 0. При
использовании формулы расчета количественной оценки, предложенной
авторами, возможные значения оценки лежат в диапазоне от 0 до 6. Были
предложены три класса качества спермы:
• 1 класс: высокое качество сперматозоидов (от 4 до 6 баллов)
• 2 класс: среднее качество сперматозоидов (от 1 до 3 баллов)
• 3 класс: низкое качество сперматозоидов (0 баллов)
Авторы выявили значимые различия по частоте оплодотворения при
использовании спермы трех различных классов и обнаружили корреляцию с
частотой развития бластоцист при применении предложенной
классификацией спермы.
19
В завершение этой главы следует принять во внимание, что детальное
морфологическое исследование сперматозоидов (в особенности головки
сперматозоида) при сильном увеличении в режиме реального времени
позволяет отобрать наилучшие сперматозоиды до их инъекции в цитоплазму
ооцита (ИМСИ).
В некоторых случаях при использовании этого метода отбора спермы
отмечалось повышение частоты имплантации и наступления
прогрессирующей беременности. Однако имеющиеся данные получены в
основном в результате сравнительных парных контролируемых исследований;
было проведено только одно рандомизированное контролируемое
клиническое исследование, что свидетельствует о насущной необходимости
проведения дальнейших контролируемых клинических исследований.
Наиболее достоверным прогностическим фактором качества сперматозоижа
является наличие вакуолей в его головке, что предположительно связано с
повреждением ДНК и влияет на развитие эмбриона.
20
Широкое использование данной методики пока еще не рекомендовано и
требует:
• проведения большего количества рандомизированных контролируемых
клинических исследований для валидации результатов;
• разработки более точных показаний для ИМСИ, определения целевых групп
пациентов, для которых данная методика будет эффективной;
• адекватной стандартизации систем классификации сперматозоидов
методом МСОМЕ.
21
22