Ha правах рукописи Нурминский Вадим Николаевич ВЛИЯНИЕ

Ha правах рукописи
Нурминский
Вадим Николаевич
ВЛИЯНИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СОЕДИНЕНИИ
НА СТАБИЛЬНОСТЬ И ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА ВАКУОЛЯРНЫХ МЕМБРАН
03.00.12 - физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Иркутск - 2003
Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии
растений СО РАН, г. Иркутск
Научные руководители:
чл.-корр., доктор биологических наук,
профессор Р.К. Саляев;
кандидат биологических наук,
A.M. Корзун
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Ю.М. Константинов,
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО
РАН, г. Иркутск
кандидат биологических наук В.А. Полынов,
Иркутский Государственный Педагогический Университет
(ИГПУ), г. Иркутск
Ведущая организация:
Казанский институт биохимии и биофизики Каз.НЦ РАН, г.
Казань
Защита диссертации состоится "4 " ноября 2003 г. в 10 ч на заседании
диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии
и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова,
132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: cell@sifibr.irk.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института
физиологии и биохимии растений СО РАН.
Автореферат р а з о с л а н ' / / " £ ^ ^ ^ 2 0 0 3
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
-
/
Акимова
йАог- А
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
15^71Актуальность ОБЩАЯ
проблемы. Многие из естественных и синтетических
химических соединений способны при взаимодействии с биологическими
мембранами изменять их структурные и функциональные характеристики,
т.е. обладают мембранотропными свойствами. Изучение механизмов реакции
мембран на химические воздействия необходимо как для понимания
принципов функционирования мембранных систем, так и для осуществления
направленного поиска новых биологически активных соединений важных во
многих областях практической деятельности.
Интерес к вакуолярной мембране (тонопласту) высших растений как к
модельному объекту при исследованиях мембранотропных эффектов
обусловлен следующими причинами: 1) вакуолярная мембрана может быть
достаточно легко получена и доступна для таких исследований в виде
фракции изолированных вакуолей или высокоочищенного мембранного
препарата (Саляев и др., 1981); 2) мембрана изолированной вакуоли является
"чистой" биологической мембраной; на этом объекте отсутствуют другие
структурные элементы (клеточная стенка, гликокаликс), которые могут
влиять на мембранотропное действие веществ; 3) мембрана имеет
постоянную ориентацию - цитоплазматической стороной наружу; 4) эта
мембрана хорошо изучена в структурном и биохимическом отношении
(Саляев и др., 1982, Саляев и др., 1983, Kaiser et al., 1986), исследованы ее
основные транспортные системы: системы пассивного транспорта ионов,
активного транспорта протонов и метаболитов (Тихонова, 1998, Maeshima,
2001).
В настоящее время в мире синтезируется большое количество
химических соединений. Причем скорость появления новых соединений
значительно превышает возможность получения данных об их действии на
биологические мембраны. Существует настоятельная потребность в
разработке эффективных подходов и методов тестирования химических
веществ на биологическую активность. Для оценки мембранотропной
активности новых соединений особый интерес представляет изучение
барьерных свойств биологических мембран, поскольку многие из них могут
влиять на мембранную проницаемость и стабильность. Для этой цели нам
представляется
перспективным
использовать
компьютерную
видеорегистрацию процесса распада фракции изолированных вакуолей.
Очевидно, что изменение барьерной функции мембраны будет отражаться на
ионной
проницаемости.
Поэтому
при
выяснении
механизмов
мембранотропного действия веществ важно в первую очередь исследовать
реакцию основных компонентов системы пассивной ионной проницаемости
мембраны на их влияние. Наиболее информативными подходами к
исследованию ионной проницаемости являются электрофизиологические
методы.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось
исследование физиологической реакции функциональных систем мембран
изолированных вакуолей на воздействие веществ, поташшальнв-вбягшщощих
мембранотропной активностью, из классов рерлОСаЛ^^ЙЙ^^ШимеАных
3
I
TUjn
СПетервург
О» «0;
соединений и стимуляторов роста растений.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать метод изучения влияния мембранотропных соединений
путем регистрации динамики деструкции мембран изолированных вакуолей с
наиболее высокой степенью автоматизации эксперимента.
2.
Разработать
подходы
для
исследования
механизмов
мембранотропного
действия
веществ
методом
регистрации
электрофизиологических параметров мембран изолированных вакуолей.
3. Изучить изменение барьерной функции мембран изолированных
вакуолей в ответ на воздействие окислителей, восстановителей,
протекторных соединений, полимеров и некоторых новых биологически
активных соединений.
4. Исследовать реакцию системы пассивной проницаемости
вакуолярной мембраны на воздействие одного из широко известных
мембранотропных соединений - диметилсульфоксида.
Научная новизна. В ходе исследований разработан новый
автоматизированный метод тестирования мембранотропной активности
химических соединений на основе компьютерной цейтрафферной
видеосъемки фракции изолированных вакуолей и автоматизированной
обработки данных. Исследовано влияние химических соединений из классов
окислителей-восстановителей, полимеров и стимуляторов роста растений на
барьерные свойства мембраны и установлен ряд веществ, оказывающих
хорошо выраженное протекторное действие на мембраны. Изучены
электрофизиологические особенности взаимодействия с вакуолярной
мембраной широко используемого в экспериментах и практике
мембранотропного соединения - диметилсульфоксида.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
исследований могут быть полезными для понимания особенностей реакции
биологических мембран на химические воздействия. Разработанные
методические приемы открывают новые возможности для первичного
тестирования химических соединений на мембранотропную активность и
позволяют выявлять вещества, влияющие на барьерные свойства мембран.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации
были доложены на Международной конференции "Физиология растений наука III тысячелетия" (Москва, 1999), на Международной конференции по
экологической физиологии растений "Актуальные вопросы экологической
физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар, 2001), на второй сессии
электронной конференции "Информационно-вычислительные технологии в
решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии,
биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2003), на молодежном
академическом форуме '"Молодежь и наука Сибири" (Чита, 2003), а также на
научных сессиях (2000. 2002 г.) Сибирского института физиологии и
биохимии растений СО РАН. По материалам диссертации опубликовано семь
работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их
обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143
страницах машинописного текста, включая 31 рисунок и 1 таблицу. Список
литературы содержит 200 источников (из них 142 - зарубежных авторов).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследований. Объектом исследований были изолированные
вакуоли из клеток корнеплода столовой свеклы Beta vulgaris L. Растения
выращивали на опытном участке института. Корнеплоды отбирали на фазе
первого года вегетации и во время покоя (корнеплоды хранили при +4-+5°С).
Выделение вакуолей и растворы. Выделение вакуолей из тканей
корнеплодов проводили микрообъемным механическим методом (Саляев и
др., 1981). Изолированные вакуоли переносили в камеры установки
оригинальной конструкции для цейтрафферной компьютерной видеосъемки с
инкубационным раствором, или в камеру пэтч-кламп установки,
заполненную контрольным раствором. Раствор выделения содержал - для
экспериментов по изучению влияния веществ на барьерные свойства
мембраны (в мМ): 100 КС1, 5 ЭДТА, 15 HEPES/KOH, рН 8,3, аланин (до
осмотической концентрации 1000 мОсм • кг"'); для пэтч-кламп эксперимента:
100 КС1, 2 MgCb, 5 ЭДТА, 50 трис/MES, рН 7,5-8,0. Осмотическую
концентрацию (1150 мОсм • кг"') регулировали аланином и измеряли на
осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия).
Инкубационный раствор содержал (в мМ): 100 КС1, 15 HEPES/KOH,
рН 7,3, аланин (до осмотической концентрации 1 0см • кг"'). В качестве
мембранотропных
агентов
использовали
соединения,
названия,
концентрация, краткая характеристика и источник получения которых
представлены в таблице. Поскольку цитотоксическое действие Н2О2
обусловлено тем, что он может быть источником гидроксильных радикалов, в
растворы с перекисью добавляли 50 мкМ FeS04 • 7Н2О и 150 мкМ
аскорбиновой кислоты для запуска реакции Фентона, как описано в работе
(Иванов и др., 2000).
Контрольный
раствор,
использовавшийся
для
заполнения
экспериментальной камеры пэтч-кламп установки и проведения контрольных
измерений в начале каждого эксперимента, содержал (в мМ): 100 КС1, 2
MgClj, 0,1 СаСЬ, 1 ЭГТА, 5 трис, рН 7,3-7,5 - MES, апанин (1150 мОсм-кг"').
Для заполнения микропипеток использовался раствор, содержащий (в мМ):
100 КС1, 2 MgClj, 5 трис, рН 5,5-6,0 - MES, апанин (1050 мОсм • кг"').
Компьютерная
цейтрафферная
видеосъемка
микроскопических
образцов. В целях автоматизации эксперимента по изучению стабильности
вакуолярных мембран в условиях действия мембранотропных соединений
нами была разработана и создана экспериментальная установка для
цейтрафферной компьютерной регистрации видеоизображений серии
микроскопических образцов, а также программное обеспечение (создано
ведущим
инженером-программистом
СИФИБР
СВ.
Резиновым),
позволяющее управлять экспериментом и обрабатывать полученные
видеоданные.
На рис. 1 представлен общий вид и основные компоненты установки
5
Таблица 1. Список соединений, использованных в экспериментах*
Концен­
XL'
Вещество
Свойсгва
Источник
трация
1 Пероксид
Прооксидан г, окисляет метио- Реахим.
водорол.1 ЮмМ
20мМ
ниновые и цистеиновые остатки, Россия
(Н2О2)
50мМ
разлагается
с
образованием
гидроксильного радикала
2 Аскорбиновая кислога ЮмМ
Антиоксидант, взаимодействует с Реахим.
20мМ
активными формами кислорода и Россия
радикалом токоферола
3 L-Глутатион
20мМ
Прооксидант, инактивирует белки Sigma,
окисленный
через окисление Sll-связей
США
4 L-Глутатион
20мМ
Трипептид (Glu-Cys-Gly), анти­ Sigma,
восстановленный
оксидант,
предохраняет
от СШ
окисления SH-связей в белках
5 Дитиотреитол (ДТТ)
Антиоксидант,
восстанавливает Serva,
1мМ
ЮмМ
Германия
S-S-связи
20мМ
6 Диметилсульфоксид
Апротонный органический раство­ Реахим.
1мМ,
Россия
(ДМСО)
ЮмМ,
ритель, антиоксидант
ЮОмМ
7 Дигидрокверцетин
0,1 мг/мл Флавоноид, антиоксидант, ингиби- ИХ
СО
рует процессы ПОЛ
(ДГК)
1м г/мл
РАН
Юмг/мл
8 Поливинилпирролидон 0,1 мг/мл Полимеры
1 -этенилпирроли- Merck,
растворимый (ПВО)
0,5мг/мл динона-2, адсорбент фенола и Германия
1 мг/мл
хинона
9 Арабиногалактан (А Г) 1 мг/мл, Полисахарид, обладает гепато- ИХ
СО
Юмг/мл протекторным, мембранотропным РАН
и
иммуностимулирующим
свойствами
10 Сывороточный
1 мг/мл
Белок, электростатически взаи­ Reanal,
альбумин бычий (БСА)
модействует
с
мембранами, Венгрия
адсорбирует фенолы и хиноны,
связывает жирные кислоты
11 Сывороточный
1 мг/мл
Reanal,
-IIальбумин человеческий
Венгрия
(ЧСА)
12 Амбиол (дигидрохло- 0,1 мг/мл Стимулятор
роста
растений, ИХФ
сильный РАН
рид 1-метил-4-диметил- 0,5мг/мл предположительно
антиоксидант
аминометил-51м г/мл
гидроксибензимидазола)
13 Фонк (фосфат окси- 1 мг/мл
Стимулятор
роста
растений,
-IIслабый
никотиновой кислоты) 1 Омг/мл предположительно
антиоксидант
14 Бихол
1 мг/мл
-II-II♦Выражаем искреннюю благодарность проф. В.А. Бабкину (ИХ СО РАН, Иркутск) и
проф. Е.Б. Бурлаковой (ИХФ РАН, Москва) за предоставление испытуемых
препаратов.
Рис. 1. Общий вид установки для цейтрафферной компьютерной
видеосъемки (А) и коллектор микроскопических объектов (Б). 1 инвертированный микроскоп, 2 - коллектор микроскопических образцов, 3 —
видеокамера, 4 — микрофотонасадка, 5 - фиксатор видеокадра, 6 —
персональный компьютер, 7 — верхний диск, 8 — нижний диск, 9 электродвигатель, 10 — диск привода коллектора, 11 - корпус крепления
двигателя, 12 — камера для микроскопических образцов, 13 — винт крепления
и регулировки вертикального полож:ения камер, 14 — узел подшипника
скольжения, 15 — потенциометр.
для
цейтрафферной
компьютерной
видеосъемки
и
коллектора
микроскопических образцов. Установка состоит из инвертированного
микроскопа "Биолам П-1" (Россия) (1), закрепленного на столике микроскопа
коллектора микроскопических образцов на 12 камер (собственного
изготовления) (2), видеокамеры КТП-67 (Россия) (3), установленной на
микроскопе через микрофотонасадку МФН-11 (Россия) (4), фиксатора
видеокадра на базе приборного интерфейса КАМАК (5), персонального
компьютера (процессор Celeron - 600 МГц, RAM - 128 Мб, HDD - 30 Гб) (6).
По команде компьютера электродвигатель осуществляет вращение
коллектора, помещая в поле зрения микроскопа следующий образец. Через
заданные промежутки времени в соответствии с заранее составленным
планом эксперимента ведется запись видеокадров микроскопических
образцов на жесткий диск компьютера.
Программное обеспечение экспериментальной установки состоит из
двух компонент - профаммы сбора данных и программы обработки.
Программа сбора данных осуществляет управление аппаратной частью
установки, отслеживание интервалов времени, прием видеоизображения с
фиксатора телевизионного кадра, запись растровых файлов на жесткий диск
персонального компьютера. Сбор данных может производиться без
вмещательства оператора в течение суток и более. Программа обработки
предоставляет оператору интерфейс для просмотра кадров, выделения
круговых областей с целью отметки интересующих
оператора
микроскопических объектов, подсчета количества выделенных областей и
позволяет отслеживать изменение количества объектов в каждом образце в
ходе эксперимента. Полученные данные являются основой для построения
экспериментальных зависимостей количества объектов в разных образцах от
времени инкубации.
Таким
образом,
экспериментальная
установка
позволяет
регистрировать на протяжении длительного промежутка времени
видеоизображения 12-ти микроскопических образцов, а программа обработки
данных позволяет наблюдать динамику состояния образцов по ходу
эксперимента.
В экспериментах с пероксидом водорода, редокс-парой глутатиона,
диметилсульфоксидом, поливинилпирролидоном, арабиногалактаном и
альбуминами были следующие варианты: без мембранотропного вещества
(контроль) и с исследуемым веществом в разных концентрациях. Для
проверки протекторных свойств аскорбиновой кислоты, дитиотреитола,
дигидрокверцетина, амбиола, фонка и бихола при перекисном окислении
липидов исследовали совместное действие каждого их этих веществ с
пероксидом водорода. В этом случае эксперименты проводили по схеме с
такими вариантами: 1) без мембранотропного вещества (контроль); 2) с
пероксидом водорода (Н2О2) в концентрации 20 мМ; 3) с исследуемым
веществом; 4) вместе с Н2О2 и исследуемым веществом.
Пэтч-кламп измерения проводили по стандартной методике, в режиме
фиксации мембранного потенциала, используя пэтч-конфигурации "whole
vacuole" (аналогично "whole cell") и "cytosolic side-out" (аналогично "outside8
out"). Измерения электрофизиологических характеристик изолированной
вакуоли проводили на автоматизированной установке, изготовленной в
лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР. Программное
обеспечение эксперимента создано ведущим инженером-программистом
СИФИБР С В . Розиновым. Ток через мембрану измеряли при помощи
преобразователя ток-напряжение на операционном усилителе Б1404УД1А-1
(Корзун и др., 1997). Интегральные токи и токи через одиночные каналы
фильтровали в полосе частот 1 кГц и 10 кГц, соответственно, и записывали на
жесткий диск компьютера. Направление токов и потенциалов принималось
согласно Бертлу (Bertl et а!., 1992). Мембранный потенциал равен потенциалу
цитоплазмы по отношению к вакуоли, а положительный (выходящий) ток
определяется потоком катионов из цитоплазмы в вакуоль.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние
мембоанотропных
соединений
на
стабильность
изолированных вакуолей. Рассмотрим ход эксперимента на примере с
дигидрокверцетином (ДГК) (рис. 2). Из графика на рис. 2 видно, что в
контрольном растворе наблюдается постепенный и достаточно быстрый
распад вакуолей в суспензии. Очевидно, что при этом происходит изменение
барьерной функции мембраны с последующей деструкцией тонопласта.
Исходя из того, что стабильность липидного бислоя и клеточной мембраны в
целом определяется наличием липидных пор (структурных дефектов в
липидном бислое) (Антонов и др., 1999), разрыв тонопласта, прежде всего,
является следствием изменений в липидном матриксе мембраны. Причины
нарущения целостности липидного бислоя могут быть различны, например,
перекисное окисление липидов, гиперактивация катаболических ферментов,
изменения в липид-белковых взаимодействиях и др. Эти процессы приводят
к образованию стрессовых пор, их последующему расширению и разрыву
мембраны.
N<™,%100
iiliiii
О
8
16
24
32
40
48
56
64 t, ч
Рис. 2. Зависимость относительного количества вакуолей (Nom,J от
времени
инкубации (t) при действии
пероксида водорода и
дигидрокверцетина.
9
Стрессирование и разрыв мембраны могут быть также вызваны нарушением
водно-осмотического равновесия вакуоли, вследствие лизиса крупных
молекул внутри вакуоли и повышения осмотической концентрации
внутривакуолярного содержимого, что должно привести к поступлению воды
в вакуоль, увеличению ее объема и фатальному растяжению мембраны.
На графике также отчетливо видно, что естественный ход разрушения
вакуолей существенно изменяется в присутствии Н2О2 и ДГК. В растворе с
Н2О2 распад вакуолей происходил быстрее, а с ДГК - значительно медленнее,
чем в контроле. Пероксид водорода сильно нарушал структуру мембраны,
вероятно, способствуя формированию и расширению пор в мембране, и она
разрушалась за короткое время. Дигидрокверцетин (ДГК), напротив, резко
стабилизировал мембраны, сохраняя их барьерную функцию.
Известно, что характерной чертой липидных пор, принципиально
отличающей их от известных белковых и пептидных пор, является
способность к самозалечиванию (Антонов и др., 1999). По всей видимости,
ДГК приводил к залечиванию (затеканию) стрессовых пор или напрямую,
связываясь с липидным бислоем мембраны, или опосредованно, при
замедлении процессов ПОЛ, действуя как антиоксидант (Теселкин и др.,
1996). Будучи добавлен к суспензии мембран вместе с Н2О2, он оказывал
заметное протекторное действие. Как видно из графика, процесс разрушения
изолированных вакуолей при добавлении ДГК можно условно разделить на 2
фазы. В первые 14-16 часов инкубации разрушается незначительное
количество вакуолей. В этой фазе скорость распада вакуолей в растворах
ДГК с Н2О2 и одного ДГК практически совпадает. Во второй фазе
наблюдается более интенсивный распад вакуолей в суспензии, причем
динамика распада в этой фазе подобна динамике распада в растворе с Н2О2.
При добавлении одного дигидрокверцетина характер кривой распада
радикально меняется. Как видно из рис. 2 она становится весьма пологой и
даже через 64 часа, когда во всех предыдущих вариантах все вакуоли
разрушились, в варианте с ДГК остаются целыми почти 80% вакуолей. По
результатам экспериментов получены значения периода полураспада
изолированных вакуолей Ti/2 (времени, в течение которого в регистрируемом
образце разрушаются 50% вакуолей).
Метод тестирования мембранотропной активности химических
соединений с помощью цейтрафферной компьютерной видеосъемки
позволил разделить исследованные вещества по характеру действия (и в
зависимости от концентрации) на три группы (рис. 3): стабилизирующие
(столбцы 14-17), дестабилизирующие (столбцы 2-7) и не оказывающие
заметного влияния на стабильность вакуолярных мембран (столбцы 8-13).
В наших экспериментах разрушению мембраны способствовали Н2О2,
глютатион окисленный, ДМСО в высоких концентрациях. Механизм
действия указанных веществ, как мы предполагаем, основан на стрессовой
дестабилизации липидного матрикса мембраны и связан с процессами
перекисного окисления липидов (ПОЛ) или ослаблением молекулярных
взаимодействий в матриксе при встраивании в него молекул неполярного
органического растворителя (как, например, в случае с ДМСО). Несмотря на
10
то, что амбиол и фонк могут обладать антиоксидантной активностью
(Воронина и др., 2001), в условиях нашего эксперимента они сами оказывали
повреждающее действие на тонопласт, а вместе с Н2О2 лишь ускоряли
разрушение вакуолей. Вероятно, эти вещества в данных условиях, кроме
замедления процессов ПОЛ, способствовали образованию пор в мембране,
что в конечном итоге приводило к снижению ее барьерных свойств.
f
о
а
2 3 4 5 6
7 8 9 10 И 12
13 14 15 16 17
Рис. 3. Влияние мембранотропных соединений на период полураспада
изолированных вакуолей относительно контроля: 1 - контроль, 2 глутатион окисленный 20мМ, 3 -ДМСО 100мМ, 4 - Н2О2 20мМ, 5 - амбиол
1 мг/мл, б - фонк 1 мг/мл, 7 - ДТГ 1 мМ, 8 - ПВП 0,5 мг/мл, 9 - глутатион
восстановленный 20 мМ, 10 - аскорбиновая кислота 20 мМ, 11 - БСА 1 мг/мл,
12 - ЧСА 1 мг/мл, 13 - ДТТ 10 мМ, 14 - арабиногалактан 1 мг/мл, 15 дигидрокверцетин 1 мг/мл (3,3мМ), 16-бихол 1 мг/мл, 17-ДМСО 10 мМ.
1
Протекторное действие на стабильность вакуолярных мембран, как
видим, оказывали вещества, относящиеся к классу антиоксидантов (ДМСО в
низких концентрациях, дитиотреитол, глютатион восстановленный и
особенно дигидрокверцетин). Антиоксиданты различной природы могут
замедлять и прерывать процессы ПОЛ и тем самым повышать стабильность
изолированных вакуолей. Такой механизм отчетливо проявлялся в
экспериментах с совместным использованием в опытах Н2О2 (вещества,
приводящего к ускорению перекисного окисления липидов) и
антиоксидантов, ингибирующих этот процесс. Наиболее сильное
протекторное действие на тонопласт оказывал дигидрокверцетин. Период
полураспада фракции изолированных вакуолей при его действии в
концентрации 3,3 мМ (1 мг/мл) увеличивался в 7,5 раза. Дня нового
биологически активного соединения бихол также было выявлено
протекторное действие на изолированные вакуоли. Это соединение
значительно стабилизировало тонопласт. Период полураспада вакуолей при
его влиянии в концентрации 1 мг/мл увеличивался почти в 4 раза. Однако
бихол не предотвращал дестабилизирующего действия Н2О2. Не выявлены
существенные изменения стабильности вакуолярной фракции при
11
добавлении в раствор белков, электростатически взаимодействующих с
мембраной (БСА, ЧСА), которые используют в качестве адсорбента фенола
(сильного окислителя) и хинона.
Таким образом, влияние испытанных веществ на барьерную функщпо
мембраны изолированной вакуоли может приводить или к стрессовой
дестабилизации тонопласта и разрушению вакуолей (например, при действии
прооксидантов, органических растворителей), или стабилизации барьерных
свойств мембраны (ДГК, арабиногалактан, бихол).
В исследовании действия мембранотропных веществ на барьерные
характеристики мембраны изолированной вакуоли особый интерес вызывает
диметилсульфоксид. Это вещество представляет собой распространенный и
широко применяемый в биотехнологии и медицине органический
растворитель, который способствует снижению барьерной функции
биологических мембран (Anchordoguy et al., 1992, Yu and Quinn, 1994). В
наших экспериментах ДМСО проявил себя следующим образом: в
концентрации 10 мМ заметно стабилизировал мембрану, а при увеличении
концентрации в 10 раз приводил к очень быстрому разрушению вакуолей.
Применение пэтч-кламп метода позволило исследовать механизм действия
ДМСО на основные компоненты системы пассивной проницаемости
тонопласта, в частности, на ионную проницаемость (электропроводность)
мембраны.
Действие диметилсульфоксида на электропроводность мембраны
изолированной вакуоли. Основными компонентами системы пассивной
ионной проницаемости (электропроводности) тонопласта являются ионные
каналы, из которых наиболее изучен канал с медленной кинетикой активации
(медленный вакуолярный (MB) канал) (Тихонова, 1998). В интегральную
электропроводность тонопласта входит также неспецифическая компонента,
за которую ответственны так называемые каналы утечки (Ward, 1997).
С целью изучить действие ДМСО на функционирование медленных
вакуолярных
каналов
и
неспецифическую
электропроводность,
обусловленную
каналами
утечки,
осуществляли
регистрацию
электропроводности тонопласта пэтч-кламп методом в режиме фиксации
потенциала в конфигурации "whole-vacuole" на вакуолях стандартного
диаметра (60±5 мкм). Для более детального изучения механизмов
мембранотропного действия ДМСО мы провели исследования его влияния на
уровне одиночных каналов в конфигурации "outside-out patch".
В результате 50 экспериментов получили кривые, отражающие
динамику активности МВ-каналов и каналов утечки в условиях ступенчатой
подачи командного сигнала в контроле и при воздействии ДМСО (рис. 4). В
соответствии с работой (Hedrich and Neher, 1987) активность МВ-каналов
проявлялась в условиях, когда в окружающем растворе присутствовали ионы
Са^^(>10 мкМ). Как видно из рисунка, кривая имела сигмовидный характер.
Среднее время активации тока было порядка 1 сек. Вольтамперная
характеристика при этом была нелинейной и демонстрировала выходящее
выпрямление (Тихонова, 1998). Особенность тока утечки состояла в том, что
каналы утечки находились преимущественно в самой мембране, а не в месте
12
ее контакта со стеклом микропипетки. Это подтверждалось существенно
более низким сопротивлением мембраны целой вакуоли (менее 1 ГОм) в
сравнении
с
сопротивлением,
полученным
при
перезамыкании
микроплощадки этой же мембраны на отверстии микропипетки (более 10
ГОм), которое характеризовало утечку в месте контакта.
^- " ^
1
Q
"1
.=^..^
-/^i^"^**'
Х^ "^
_=___„
Рис. 4. Типичная
зависимость трансмем­
бранного тока (Ij^^ от
времени при подаче на
мембрану изолированной
вакуоли
серии
командных напряжений
(^м)
^
условиях
воздействия 100 мМ
дмсо.
0
1
2
3
Прежде всего, было исследовано влияние ДМСО на проводимость
тонопласта в тех концентрациях, при которых он оказывал воздействие на
стабильность фракции изолированных вакуолей. По результатам 9
экспериментов были построены зависимости относительной проводимости
МВ-каналов и каналов утечки от напряжения (рис. 5).
а)
-80 -60 -40 -20
О 20 40 60 80 -80 -60 -40 -20 О 20 40 60 80
V„, мВ
V„. мВ
Рис. 5. Действие ДМСО на: а) относительную проводимость (G^^^^J
медленных вакуолярных каналов, б) относительную проводимость канатов
утечки, в зависимости от напряжения на мембране изолированной вакуоли
(V^ мВ). где G^^^=GJG^^_„^ G^ - проводимость мембраны, G^^^ проводимость мембраны в контроле при V =40 мВ. 1 — контроль, 2 —ДМСО
1мМ, 3-ДМСО ЮмМ.
13
Из полученных данных можно сделать вывод, что ДМСО в концентрации 110 мМ не влияет ни на специфическую проводимость МВ-каналов (рис. 5а),
ни на проводимость каналов утечки (рис. 56). Подтверждение этим данным
было получено в экспериментах на изолированных пэтчах (данные не
показаны).
Стабилизирующий эффект ДМСО в концентрации 1-10 мМ на
мембраны изолированных вакуолей проявлялся через несколько часов, а
электрофизиологические опыты проводили в течение 20-30 мин по причине
ограничения метода (одной из особенностей пэтч-кламп метода является
малая длительность эксперимента). Возможно, из-за этого действие ДМСО в
низких концентрациях на проницаемость тонопласта не было обнаружено. С
другой стороны, было интересно выяснить, как скажутся на
электрофизиологических свойствах тонопласта более высокие концентрации
ДМСО, приводящие к быстрому разрушению вакуолей.
После воздействия ДМСО в концентрации 100 мМ и подачи
командного напряжения (VK) более +80 мВ мембрана изолированной вакуоли
в большинстве случаев разрушалась. В других случаях перед разрушением
наблюдалась повышенная флуктуирующая проводимость (см. вариант при VK
=+80 мВ на рис. 4).
По результатам 6 экспериментов, в которых мембрана после
воздействия ДМСО оставалась целой, были построены зависимости
относительной проводимости МВ-каналов и каналов утечки от напряжения
(рис. 6). Как видно из этих кривых, ДМСО не влияет на специфическую
проводимость МВ-каналов (рис. 6а). Проводимость же каналов утечки
значительно возрастает (рис. 66), причем этот процесс обратим, так как после
удаления ДМСО из омывающего мембрану раствора величина проводимости
каналов утечки восстанавливается,
а)
G„,„ 3 т
т г
-80-60-40-20 О 20 40 60 80 -80-60-40-20 О 20 40 60 80
VM,MB
VM,MB
Рис. 6. Влияние ДМСО на: а) относительную проводимость (G^^J
медленных вакуолярных каналов, б) относительную проводимость каналов
утечки, в зависимости от напряжения на мембране изолированной вакуоли
(V, мВ), где G
=G/G
проводимость мембраны, G^
проводимость мембраны в контроле при V =40 мВ. 1 — контроль в начале
эксперимента, 2 -ДМСО ЮОмМ, 3-контроль в конце эксперимента.
14
в результате экспериментов по влиянию ДМСО на одиночные МВканалы было обнаружено, что небольшие участки мембраны (пэтчи) в
отличие от целой вакуоли выдерживают более высокие концентрации ДМСО
(100-700 мМ). Типичная регистрация токов одиночных МВ-каналов при
смене контрольного раствора на раствор, содержащий ДМСО в концентрации
700 мМ ( V „ = 4 0 M B ) представлена на рис. 7а. В диапазоне концентраций 350700 мМ ДМСО заметно снижал проводимость МВ-канала (при 700 мМ
проводимость канала снижалась в 4 раза по сравнению с контролем). При
этой концентрации ДМСО значительно влияет и на активность МВ-канала
(рис. 76 и в). При 700 мМ ДМСО вероятность нахождения канала в открытом
состоянии уменьшилась в 3 раза, а частота флуктуации между открытым и
закрытым состояниями уменьшилась в 10 раз относительно контроля.
Влияние ДМСО на одиночный МВ-канал было необратимым. Часто после
повторного запивания контрольного раствора в экспериментальную камеру
каналы вообще не фиксировались.
20
60
40
1,пА
35 -1
30
80 Т, сек
в)
N''"'*'VVЛv^\^,*ч«wЛ^^л»^^
25
20
4,5
5 Т,сек
79
79,5
80 Т, сек
Рис. 7. Типичная регистрация токов одиночных MB каналов при смене
контрольного раствора на раствор, содержащий ДМСО в концентрации 700
мМ (V„=40MB): а) вся трасса регистрации, б) и в) участки трассы до и
после внесения ДМСО соответственно.
В ряде экспериментов выявлено влияние ДМСО на неспецифическую
проводимость тонопласта (проводимость утечки), которую оценивали по
базовой линии регистрации тока при подачи командного напряжения
(толстая линия на рис. 7). При концентрации ДМСО 350 мМ
15
неспецифическая проводимость пэтча увеличивалась в 2-3 раза
относительноконтроля. Влияние ДМСО на проводимость утечки было
обратимым. При изъятии ДМСО из экспериментального раствора
проводимость принимала первоначальное значение.
Из
литературных
данных
известно,
что
ДМСО
может
взаимодействовать как с белковыми макромолекулами, так и с липидным
матриксом биологических мембран (Johannesson et al., 1997, Yu and Quinn,
1998). Как видно из экспериментов, ДМСО в концентрации 100 мМ не
изменяет структурно-функциональную организацию МВ-канала. В то же
время,
наблюдалось
существенное
увеличение
неспецифической
проводимости через каналы утечки. То есть, ДМСО в своем действии не
затрагивает функционирование специфичных каналов, но значительно влияет
на проводимость каналов утечки. Скорее всего, это может происходить за
счет расширения размеров пор этих каналов. Косвенным подтверждением
этого может быть кривая на рис. 4, полученная при напряжении +80 мВ. Она
представляет собой типичную картину, характерную для стрессовой
проводимости мембраны (Чизмаджев и др., 1982). Особенности такого
состояния для тонопласта описаны в работе (Ботоев и др., 1987) и
объясняются флуктуацией размера поры под воздействием стрессирующих
факторов. Можно полагать, что эти эффекты обусловлены изменениями в
липидном матриксе мембраны, поскольку известно, что молекулы ДМСО
способны модифицировать структуру липидных бислоев (Smondyrev and
Berkowitz, 1999). Наиболее вероятно, что в нашем случае этот процесс
способствовал новому образованию или расширению существующих в
мембране неспецифических каналов в виде водных пор и их флуктуации под
воздействием как напряжения, так и ДМСО, вплоть до разрыва мембраны. С
результатами по влиянию ДМСО на интегральную проводимость
вакуолярной мембраны согласуются данные экспериментов на пэтчах. ДМСО
обратимо увеличивал проводимость утечки. По-видимому, после промывания
раствора от ДМСО мембрана залечивалась, при этом размеры пор каналов
утечки уменьшались. Однако в высокой концентрации (более 100 мМ) ДМСО
влияет на характеристики МВ-канала. В этой связи, индуцируемое ДМСО
явление увеличения проницаемости мембран для различных соединений
(снижение барьерных свойств), при сохранении функциональной активности
специфических ионных каналов, может быть объяснено образованием или
расширением существующих в мембране неспецифических водных пор.
Наиболее вероятно, что изменения ионной проницаемости мембраны
изолированной вакуоли при действии ДМСО в концентрации более 100 мМ
связано не только с влиянием на мембрану в области липидного бислоя или в
области контакта интегральных белков с липидами, но и в области
специфических водных пор (ионных каналов), образуемых интегральными
белками.
Таким образом, действие ДМСО в концентрации 100 мМ на мембрану
изолированной вакуоли заключается в увеличении проводимости через
неспецифические мембранные каналы. В концентрации более 100 мМ ДМСО,
кроме того, понижает проводимость МВ-канала.
16
Возможные механизмы действия мембранотропных веществ.
Процессы, происходящие в наших экспериментах с мембранами, скорее
всего, имели разнообразную природу. В пользу того, что при разрушении
вакуолей происходит ПОЛ, может указывать протекторное действие
антиоксидантов. Однако, аскорбиновая кислота, эффективный ингибитор
ПОЛ, оказывала слабое стабилизирующее действие на мембрану.
Стимуляторы роста растений амбиол и фонк, обладающие антиоксидантными
свойствами (Воронина и др., 2001), в наших условиях, наоборот,
способствовали разрушению вакуолей. Из антиокислителей стабильность
мембраны сильно повышали только дигидрокверцетин и ДМСО в
концентрации 1-10 мМ.
Флавоноид дигидрокверцетин является исключительно активным
антиоксидантом, который ингибирует процессы ПОЛ, реагируя, как
предполагают, с липидными радикалами (Теселкин и др., 1996). ДГК весьма
эффективно стабилизировал мембраны, сохраняя их барьерную функцию.
При добавлении к суспензии мембран вместе с Н2О2, ДГК оказывал заметное
протекторное действие.
Известно, что взаимодействие флавоноидов со свободными
радикалами на мембране происходит в полярной области липидного бислоя
(Ratty et al., 1988). Вероятно, ДГК приводил к "залечиванию" стрессовых пор
в тонопласте или напрямую, связываясь с липидным бислоем мембраны, или
опосредованно, при замедлении процессов ПОЛ. Антиоксидантный эффект
флавоноидов может усиливаться в присутствии таких соединений как
аскорбиновая кислота, фосфолипиды и др. Синергизм флавоноидов с
аскорбиновой кислотой широко обсужден в литературе (Ratty and Das, 1988,
Cholbi et al., 1991). Предполагают что, механизм взаимного усиления
действия
основан
на
способности
синергистов
регенерировать
антиоксиданты. Мы исследовали совместное действие ДГК и аскорбиновой
кислоты на барьерной функции мембраны изолированной вакуоли, однако
отчетливого синергизма этих веществ в отношении протектирования
тонопласта не обнаружили.
Из всех антиоксидантов, использованных в наших экспериментах,
только ДГК обладает липофильными свойствами. При этом он наиболее
сильно воздействовал на период полураспада вакуолей. Вероятно, в процессе
стабилизации мембраны для антиоксиданта очень существенна способность
встраиваться в липидный бислой.
Эффект ДМСО при стабилизации вакуолярной мембраны, вероятно,
объясняется его антиоксидантными свойствами (Yu and Quinn, 1994) или
протектирования белков тонопласта при гидрофобном взаимодействии с их
неполярными группами (Arakawa et al., 1990). Однако увеличение
концентрации ДМСО напротив вызывало разрушение вакуолей. Пэтч-кламп
методом показано, что в этом случае ДМСО значительно влиял на каналы
утечки. Можно полагать, что мембранотропный эффект обусловлен
изменениями в липидном матриксе мембраны, поскольку известно, что это
вещество способно модифицировать структуру липидных бислоев
(Smondyrev and Berkowitz, 1999). При взаимодействии с мембраной молекула
17
ДМСО образует дефект на ее поверхности, позволяя проникнуть внутрь
бислоя молекулам воды (Рас! and Marchi, 1994). Наиболее вероятно, что в
нашем случае этот процесс способствовал возникновению или расширению
существующих в мембране пор и их флуктуации под воздействием как
напряжения, так и ДМСО, вплоть до разрыва мембраны.
Одним из следствий ПОЛ является окисление тиоловых групп
мембранных белков (Владимиров и др., 1991). Этот процесс, вероятно,
приводит к дестабилизации мембраны, поскольку по нашим данным
окислители SH-rpynn (глютатион окисленный, пероксид водорода)
значительно ускоряли, а восстановители (глютатион восстановленный,
дитиотреитол (ДТТ)) несколько замедляли распад вакуолей.
Действие фосфолипаз и механическое растяжение мембраны
вызывают нарушение ее барьерных свойств. Мембраносвязанные
фосфолипазы обнаружены во многих растительных объектах, в том числе в
вакуолярной мембране (Tavemier and Pugin, 1995), но не известно,
присутствуют ли они в тонопласте Beta vulgaris. К тому же большинство этих
ферментов, например фосфолипазы Аг и D, Са^^-зависимы, а наши растворы
Са * не содержали. Механическое растяжение мембраны при разрушении
изолированных вакуолей представляется маловероятным, так как все
растворы были выровнены по осмотической концентрации, и вряд ли она
изменялась во время эксперимента.
Адсорбция на поверхности липидного бислоя поликатионов или
полианионов также приводит к нарушению барьерных свойств мембраны.
Мы исследовали влияние альбуминов, поливинилпирролидона
и
арабиногалактана на стабильность мембран. БСА и ЧСА представляют собой
кислые
белки
животного
происхождения,
которые
являются
преобладающими в плазме крови, т.е. белками, определяющими свойства
микроокружения пофаничных мембран. Эти белки не оказывали заметного
влияния на процесс распада вакуолей.
Протекторное соединение поливинилпирролидон (ПВП), которое
используют в качестве адсорбента фенолов или хинонов (токсических
эндогенных компонентов тканей, окисляющих SH-группы белков)
несущественно влияло на стабильность вакуолей. Тонопласт непроницаем
для ПВП, поэтому если даже находящиеся внутри вакуоли токсические
агенты способствовали нарушению барьерных свойств мембраны, ПВП,
оставаясь снаружи, не мог повлиять на этот процесс.
Полисахарид арабиногалактан повышал стабильность изолированных
вакуолей. Скорее всего этот эффект обусловлен его взаимодействием с
тонопластом и формированием на поверхности вакуоли примембранного
углеводного слоя (или пространственной сетки), способствующих
сохранению барьерных свойств мембраны.
Завершая обсуждение экспериментальных данных, можно заключить,
что метод цейтрафферной
компьютерной
видеосъемки
фракции
изолированных вакуолей позволил изучить мембранотропное действие
различных химических соединений. Обнаружено, что наиболее выраженное
стабилизирующее действие на мембраны изолированной вакуоли оказывает
18
дигидрокверцетин. На примере диметилсульфоксида показано, что
нарушение барьерной функции вакуоли происходит за счет увеличения
неспецифической проводимости тонопласта.
ВЫВОДЫ
1. Для изучения мембранотропного действия веществ на барьерную
функцию
мембраны
изолированной
вакуоли
разработан
метод
автоматизированного слежения за динамикой разрушения изолированных
вакуолей с помощью компьютерной цейтрафферной видеосъемки
микроскопических
объектов
и
компьютерной
обработки
серии
телевизионных изображений.
2. Для изучения механизмов действия влияния мембранотропных
соединений на уровне транспортных белков (ионные каналы) и липидного
матрикса мембраны реализован подход на основе регистрации интефальной
электропроводности мембраны и активности одиночных ионных каналов
пэтч-кламп методом.
3. Впервые удалось изучить реакцию барьерной функции мембран
изолированных вакуолей на воздействие ряда соединений из фупп редоксагентов, полимерных соединений и стимуляторов роста растений и
установить вещества, оказывающие дестабилизирующее и выраженное
протекторное действие на мембраны. Прооксиданты - пероксид водорода (20
мМ), глутатион окисленный (20 мМ) - и органический растворитель
диметилсульфоксид в высокой концентрации (100 мМ) дестабилизируют
мембрану изолированной вакуоли, что приводит к снижению ее барьерной
функции, а антиоксиданты - дигидрокверцетин (3,3 мМ), диметилсульфоксид
в низкой концентрации (1-10 мМ) и дитиотреитол (10 мМ), а также
соединения арабиногалактан (1 мг/мл) и бихол (1 мг/мл) повышают
стабильность мембраны.
4. Наибольший эффект для стабилизации барьерной функции
мембраны проявил дигидрокверцетин (3,3 мМ), флавоноид, антиоксидант,
обладающий липофильными свойствами (период полураспада фракции
изолированных вакуолей превышал контроль в 7,5 раз). В то же время такие
антиоксиданты как аскорбиновая кислота (20 мМ) и глутатион
восстановленный (20 мМ), не оказывали влияние на барьерные свойства
тонопласта, как и полимерные соединения, адсорбирующие фенолы и
хиноны - поливинилпирролидон (1 мг/мл) и альбумины (1 мг/мл).
5. В концентрации 100 мМ диметилсульфоксид обратимо увеличивает
неспецифическую компоненту интегральной проводимости тонопласта, не
изменяя специфической проницаемости через медленный вакуолярный канал.
Дестабилизация барьерной функции мембраны осуществляется за счет
стрессовой модификации липидного матрикса - образования и расширения
неспецифических водных пор. Влияние диметилсульфоксида на МВ-канал
(необратимое затухание активности) зафиксировано только при очень
высоких концентрациях (700 мМ).
6. Наиболее вероятно, что стабилизация барьерной функции
тонопласта мембранотропными соединениями обусловлена, прежде всего,
способностью веществ взаимодействовать с липидным матриксом мембраны
19
(дигидрокверцетин - липофильное вещество,
ныи
растворитель) и предотвращать перекисное окисление липидов (процесс,
ведущий к образованию дефектов в лип идиом матриксе мембраны, .
увеличению проницаемости и снижению стабильности мембраны). Ц ^ о З ~(\
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Действие ДМСО на ионную проницаемость вакуолярной мембраны //
Международная конференция "Физиология растений - наука III
тысячелетия". Москва. 1999. Тезисы докладов. С. 165.
2. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Исследование влияния диметилсульфоксида на медленные вакуолярные
каналы и каналы утечки мембраны изолированной вакуоли // Международная
конференция по экологической физиологии растений "Актуальные вопросы
экологической физиологии растений в 21 веке". Сыктывкар. 2001. Тезисы
докладов. С. 54.
3. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Компьютерная обработка телевизионного изображения процесса распада
фракции изолированных вакуолей как метод мониторинга действия
мембранотропных веществ // Международная конференция по экологической
физиологии растений "Актуальные вопросы экологической физиологии
растений в 21 веке". Сыктывкар. 2001. Тезисы докладов. С. 58.
4. Корзун A.M., Нурминский В.Н., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Действие диметилсульфоксида (ДМСО) на электропроводность мембраны
изолированной вакуоли//ДАН. 2001. Т. 381, № 5. С. 691-693.
5. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов СВ., Саляев Р.К. Влияние
мембранотропных соединений на барьерную функцию мембраны
изолированной вакуоли // ДАН. 2003. Т. 389, № 2. С. 283-285.
6. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Компьютерная цейтрафферная видеосъемка фракции изолированных
вакуолей // Вторая национальная конференция "Информационновычислительные технологии в рещении фундаментальных научных проблем
и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины". Москва.
2003. Тезисы докладов.
7. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов СВ., Саляев Р.К. Влияние
окислителей, восстановителей, полимеров и регуляторов роста растений на
стабильность мембран изолированных вакуолей // V съезд общества
физиологов растений России. Пенза. 2003. Тезисы докладов.
8. Нурминский В.Н., Корзун A.M., Розинов СВ., Саляев Р.К.
Цейтрафферная компьютерная видеосъемка микроскопических образцов //
Молодежный академический форум "Молодежь и наука Сибири". Чита. 2003.
Тезисы докладов.
0/^^^=^
20