Возможности атомно-силовой микроскопии в исследовании

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ – 2011 – Т. ХVIII, № 2 – С. 223
гия / Николаев А.И., Цепов Л.М..– С-Пб, 2001.– 309 с.
3. Шулимович, Б.Р. Клинико-микробиологические изменения дентина кариозных полостей на этапах лечения кариеса и
некоторых его осложнений: Автореф. дис… канд. мед. Наук / Б.Р.
Шумилович.– Воронеж, 1996.– 22 с.
THE REVELATION OF CANDIDA TYPE FUNGI INSIDE MICROBE
ASSOCIATIONS IN DENTAL ROOT CANAL DENTINE AT CHRONIC
PERIODONTITIS
A.V.SHISHKIN
Voronezh State Medical Academy after N.N.Burdenko,
Chair of Preventive Dentistry
The article concerns pathological effect of Candida type fungi
inside microbe associations in dental root canal dentine at chronic
periodontitis. Mycological estimation of dentine root canals at chronic
periodontitis was carried out as well.
Key words: periodontitis, mushrooms of Candida, dentine of
root canals.
УДК 616-093:611.018.73.345(084)
ВОЗМОЖНОСТИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
В ИССЛЕДОВАНИИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
ОСОБЕННОСТЕЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ СФИНКТЕРНЫХ ЗОН
ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА
В.Ф. АЗАРОВ, А.В. ГЛОТОВ, Н.А. ДАВЛЕТКИЛЬДЕЕВ,
А.В. КОЗИНСКАЯ, И.Н. ПУТАЛОВА*
Разработаны способы подготовки биопсийного материала слизистой
оболочки сфинктерных зон толстой кишки человека для атомносиловой микроскопии. Проведена идентификация типа клеток и их
субклеточных элементов с помощью атомно-силовой микроскопии.
Показаны возможности определения ультраструктуры клеток слизистой оболочки методом атомно-силовой микроскопии.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, слизистая оболочка, сфинктерные зоны толстой кишки
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – новый перспективный метод визуализации внутренней структуры тканей, клеток и
субклеточных структур в медико-биологических исследованиях.
Механизм АСМ основан на использовании силовых связей между атомами вещества. АСМ работает за счет взаимодействия
между острием зонда, сканирующего плоскость образца, и поверхностью образца.
Преимуществами АСМ перед оптической и просвечивающей электронной микроскопией являются облегченная процедура
приготовления образцов без применения красителей и контрастирующих веществ на основе солей тяжелых металлов и относительная простота получения изображений. Главное достоинство
АСМ состоит в получении истинного трехмерного рельефа исследуемой поверхности. Измерения при АСМ осуществляются не
только в вакууме, но и на воздухе, в атмосфере любого газа или в
капле жидкости. Адаптация методики подготовки срезов к требованиям метода АСМ позволяет изучать структурнофункциональные особенности тканей человека. Указанные преимущества и возможности АСМ дополняют традиционные способы визуализации тканей и являются перспективными для диагностики различных заболеваний.
В настоящее время в доступной литературе имеются лишь
отдельные работы, где обсуждаются оптимальные условия получения образцов тканей для АСМ. На сегодняшний день не определена процедура подготовки материала для исследования методом атомно-силовой микроскопии, не отработана методика получения АСМ-изображений эпителия слизистой оболочки толстой
кишки человека, не проведена идентификация клеток и субклеточных компонентов на АСМ-изображениях.
Цель исследования – адаптировать способы подготовки
биоптатов слизистой оболочки толстой кишки человека для АСМ
и показать возможности этого метода для исследования её ультраструктурного строения.
*
ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России, кафедра анатомии человека, 644043, г. Омск, ул. Партизанская, 20, тел.: 8 (3812) 27-53-71; кафедра медицины труда и профессиональных болезней, 644053, г. Омск, Тварковского, 8, МУЗ Медико-санитарная
часть №7, к. 325, тел.: 8 (3812) 67-32-91; кафедра прикладной и медицинской
физики; 644077, г. Омск, пр. Мира, 55а, тел.: 8 (3812) 22-49-72.
Материалы и методы исследования. В качестве объекта
исследования использовали биоптаты слизистой оболочки толстой
кишки в области сфинктеров О’Берна-Мутье-Пирогова и Балли,
полученные при эндоскопическом исследовании толстой кишки.
Материал для атомно-силового исследования обрабатывали
по следующей методике. Первично зафиксированные в глутаральдегиде ткани дополнительно обезвоживали ацетоном, содержащим 2% оксид осмия при температуре -90°С в течение 8 часов,
при температуре -60°С в течение 8 часов, при -30°С в течение 8
часов и при 0°С в течение 1 часа. После нагрева образцов до комнатной температуры, их помещали в смольную смесь (42,7 г эпон
812; 5,6 г дуркупан АСМ; 57,6 г дудоцинил сукциновый ангидрид). Пропитка осуществлялась пошагово (33% раствор смолы –
4 часа, 66% раствор смолы – 4 часа и на ночь (12 часов) в 100%
смоле в эксикаторе). Образцы полимеризовались при температуре 60°С в течение 72 часов. Ультратонкие (70-100 нм) срезы изготавливали на ультрамикротомах УМТП-4 и «Ultracut-E» (фирма
Reichert-Jung) через сутки после завершения полимеризации.
Изготовленные срезы размещали на предметное стекло и
изучали под оптическим микроскопом МИКМЕД 2 (ЛОМО, Россия) при увеличении 400 крат для выбора участка, содержащего
продольные срезы крипт. Изображения выбранных участков фиксировались с помощью цифровой камеры при увеличениях 2002000 крат.
Для исследования поверхности среза слизистой оболочки
толстой кишки использовали сканирующий зондовый микроскоп
Solver Pro (NT-MDT, Россия). Сканирование поверхности проводили методом полуконтактной АСМ на воздухе. В работе использовали кремниевые зонды серии NSG01 (NT-MDT) с жесткостью кантилевера 10 Н/м, радиусом закругления кончика
10 нм. Обработку и анализ АСМ-изображений осуществляли с
использованием программного модуля обработки изображений
Image Analysis (NT-MDT).
Результаты и их обсуждение. На АСМ-изображениях
эпителия слизистой оболочки толстой кишки в области сфинктера О’Берна-Мутье-Пирогова, предварительно представленных на
изображениях оптического микроскопа, чётко определяются
границы крипты и структура бокаловидных клеток: ядра, ядрышки и некоторые гранулы, содержащие муцин (рис. 1).
АСМ-изображения бокаловидных клеток также позволяют
четко различить мембрану клетки, ядро, ядрышко, окружающее
ядро эндоплазматическую сеть и гранулы, содержащие муцин
(рис. 2).
АСМ-изображение ядер бокаловидных клеток позволяет
изучать их структуру: рельефность профиля ядра клетки указывает на сложность его структуры, малые выступы по краям соответствуют двойной мембране ядра, а большой выступ – ядрышку
(рис. 3).
Рис.1. АСМ-изображение среза крипты слизистой оболочки толстой кишки
(увеличение × 1200)
ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ – 2011 – Т. ХVIII, № 2 – С. 224
А
Б
В
3. Метод АСМ позволяет визуализировать клеточные
структуры эпителиальной ткани с возможностью идентификации
типа клеток и их субклеточных элементов. На основе сравнения
АСМ-изображений с изображениями оптической микроскопии и
сопоставления морфологических параметров субклеточных
структур на АСМ-изображениях, идентифицированы крипты и
бокаловидные клетки, а также плазматическая и ядерная мембраны, ядро, ядрышко, эндоплазматическая сеть, гранулы с муцином
Г бокаловидных клеток эпителия.
Метод сканирующей зондовой микроскопии должен занять
Дважное место в ряду существующих исследовательских подходов
к изучению биологических объектов.
Литература
Рис.2. АСМ-изображение бокаловидной клетки толстой кишки
А – гранулы с муцином, Б – эндоплазматическая сеть, В – ядро,
Г – ядрышко, Д – границы мембраны ядра
(увеличение × 3000)
1. Роскошная, А.С. Применение АСМ для визуализации
срезов тканей / А.С. Роскошная, Д.В. Багров, Г.Е. Онищенко, К.В.
Шайтан. Современные достижения бионаноскопии.– Сборник
тезисов.– М.: Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова,
2009.– С. 47.
2. David Т. Moran Visual Histology / Т. Moran David, J. Carter
Rowley.– Lippincott Williams& Wilkins LTD, 1988.– 259 p.
3. Mаtsko, N.B. АFM of biological material embedded in epоxу
resin / N. B. Mаtsko, M. Martin. Jornal of Structural Biology.– 2004.–
146.– Р. 334–343.
4. Mаtsko, N.B. Epоxу resin as fixative during freezesubstitution / N. B. Mаtsko, M. Martin.- Jornal of Structural Biology,
2005.– 152.– Р. 92–103.
5. Matsko, N. В. Correlative AFM and ТЕМ of Soft Material /
N. В. Matsko, W. Grogger, B. Stadlober.– Imaging & Microscopy,
2008.– 10.– Р. 33–35.
6. Efimov, A.E. Atomic force microscope (AFM) combined with
the ultramicrotome: a novel device for the serial section tomography
and AFM/TEM compiementary analisis of biological and polymer
samples / A.E. Efimov, N.B. Mаtsko.– Jornal of Structural Biology,
2007.– N3.– Р. 207–217.
7. Maganov, S.N. Surface analysis with STM and AFM: experimental and theoretical aspects of image analysis / S.N. Maganov,
M.H.Whangbo.Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokio:
VCH, 1996.– Р. 323.
POSSIBILITIES OF ATOMIC FORCE MICROSCOPY IN RESEARCH
OF STRUCTURALLY FUNCTIONAL FEATURES MUCOUS MEMBRANE
OF THE SPHINCTERS ZONES OF A THICK GUT OF THE PERSON
Рис. 3. АСМ-изображение среза ядра бокаловидной клетки толстой кишки
(увеличение × 12000)
V. F. AZAROV, A.V. GLOTOV, N.A. DAVLETKILDEEV,
A.V. KOZINSKAYA, I.N. PUTALOVA
Идентификация субклеточных структур по АСМ изображениям осуществляется по их морфологическим параметрам, таким
как размер, форма и местоположение в клетке. Учитывая данные
ряда авторов [1,2,5] и сопоставляя АСМ-изображения с изображениями оптического микроскопа, в эпителиальной ткани слизистой оболочки толстой кишки идентифицированы бокаловидные
клетки и их клеточные элементы – плазматическая и ядерная
мембраны, ядро, ядрышко, эндоплазматическая сеть, гранулы с
муцином.
Некоторые авторы [1,3,4,5,6,7] указывают на сопоставимость результатов, полученных с помощью просвечивающей
электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. При
этом метод АСМ является более перспективным для визуализации клеточных структур в биологических исследованиях за счёт
облегчённой процедуры приготовления образцов, относительной
простоты получения изображений, возможности получать трехмерный рельеф исследуемой поверхности и отсутствия необходимости поддержания вакуума.
Выводы:
1. Адаптированы способы подготовки материала и отработана методика получения АСМ-изображений эпителиальной
ткани слизистой оболочки толстой кишки.
2. Возможность визуализации биологических структур, заключенных в эпоксидную смолу, определяется, главным образом,
методикой подготовки материала для АСМ-исследований. Визуализация структурно-функциональных особенностей и идентификация различных ультраструктур возможны благодаря крайне
малой шероховатости поверхности чистой эпоксидной смолы,
различиям в шероховатости срезов отдельных клеточных элементов и наличию перепада рельефа на их мембранах.
Omsk State Medical Academy, Chair of Anthroponomy,
Chair of Labour and Professional Diseases
Medical Unit #7, Omsk
Omsk State University after F.M. Dostoyevsky,
Chair of Applied and Medical Physics
Methods of preparing bioptic material of sphincteric zones of
human large intestine mucous tunic for have been developed for mucous membrane sphincters zones for atomic-power microscopy (АPM)
have been worked out. Identifying the type of cells and their subcellular elements by means of АPМ is performed. The possibilities of
defining cell ultra-structure of mucous tunic by means of АPМ are
shown.
Key words: atomic-power microscopy, a mucous tunic, large
intestine sphincteric zones.
УДК 616.24-022.6-07-018.2-007.17
ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ
ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ
С ФЕНОТИПИЧЕСКИМИ ПРИЗНАКАМИ
НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ДИСПЛАЗИИ
СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
В.В. АНОХИНА, Д.Ю. БУГРИМОВ, М.Н. МУРАВИЦКАЯ*
В статье представлены результаты сравнительного исследования
особенностей острых респираторных заболеваний у детей с признаками недифференцированной дисплазии соединительной ткани и
детей без этих признаков. Получены данные о преобладании орто*
ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздравсоцразвития России
г. Воронеж, ул. Студенческая, 10, e-mail: veraanohina@mail.ru