Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный
реклама
Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии» На правах рукописи КАРДАШОВА Карина Шамилевна «Специфический анионный транспортер церебральных эндотелиоцитов (получение моноклональных антител, исследование органной и клеточной локализации и нейрокогнитивных функций)» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность: 03.01.04 – Биохимия Научный руководитель: доктор медицинских наук О.И. Гурина. Москва – 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………...…………………………………… 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………… 11 ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ …………... 11 Транспорт через гематоэнцефалический и гематоликворный барьеры ……………... 12 Пассивная диффузия …………………………………………………………………………. 13 Транспор с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос) ……………… 14 Эндоцитоз …………………………………………………………………………………….. 15 Активный транспорт …………………………………………………………………………. 16 Функциональная экспрессия транспортеров на сайтах гематоэнцефалического барьера 16 Семейство АВС-транспортеров ………………………………………………………………. 16 Р-гликопротеин ………………………………………………………………………………. 20 Белок BCRP / Bcrp …………………………………………………………………………… 23 Белки множественной лекарственной устойчивости (MRPs / Mrps) ……………………... 26 Суперсемейство SLC транспортеров ……………………………………………………….. 31 Транспортеры органических анионов OATs / Oats …………………………………… 32 Транспортеры органических катионов OСTs / Oсts ………………………………… 33 Транспортеры органических анионных полипептидов OATPs / Oatps …………… 35 BSAT1 (blood-brain barrier-specific anion transporter 1) ……………………………. 42 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ……………………………………………………… 46 Характеристика исследуемого материала ………………………………………………… 46 Животные …………………………………………………………………………………… 46 Культуры клеток …………………………………………………………………………… 47 Культура клеток миеломы мышей линии Balb/C Sр2/0-Ag14 …………………………….. 48 Культура клеток глиомы С6 крысы ………………………………………………………… 49 Получение первичной культуры церебральных эндотелиоцитов крысы ………………… 49 Получение первичной культуры астроцитов неонатального мозга крысы ………………. 50 Получение первичной культуры эндотелиоцитов пуповины человека (HUVEC) ………. 52 Подготовка субстрата для культивирования эндотелиальных клеток …………………… 53 Совместное культивирование эндотелиоцитов с астроцитами …………………………… 54 Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к BSAT1, получение моноклональных антител и их характеристика ………………………………………….. 54 Получение препарата рекомбинантного антигена BSAT1 ……………………………… 57 Получение моноклональных антител к BSAT1 и их характеристика ………………… 65 Проведение иммунизации …………………………………………………………………… 65 Процедура слияния ………………………………………………………………………… 66 2 Подготовка клеток фидерного слоя ………………………………………………………… 68 Процедура клонирования гибридом ……………………………………………………… 68 Замораживание и хранение гибридом ……………………………………………………… 69 Получение асцитов и очистка моноклональных антител …………………………………. 69 Определение класса иммуноглобулинов моноклональных антител ……………………... 72 Методы иммунохимического анализа ……………………………………………………….. 74 Иммуноферментный анализ …………………………………………………………………. 74 Иммуноморфологический анализ ……………………………………………………………... 79 Иммунофлюоресцентный анализ …………………………………………………………… 79 Иммуноцитохимический анализ ……………………………………………………………. 80 Иммуногистохимический анализ …………………………………………………………… 83 Конъюгация антител с флуорофором …………………………………………………………... 85 Конъюгация антител I ………………………………………………………………………… 85 Методы количественного определения белка ………………………………………………. 87 Приготовление наногелей, конъюгированных с анти-BSAT1-антителами …………… 88 Исследование когнитивных функций у крыс ………………………………………………... 90 Тест распознавания нового объекта ………………………………………………………… 90 Тест спонтанного чередования ……………………………………………………………… 91 Тест пассивного избегания …………………………………………………………………... 92 Приподнятый крестообразный лабиринт ………………………………………………… 93 Тестирование в лабиринте Морриса ………………………………………………………... 94 Моделирование интракраниальной глиомы …………………………………………………. 97 Статистическая обработка полученных результатов …………………………………… 99 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ………………………………………... 100 125 ГЛАВА 3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов и изучение их иммунохимических свойств ……………………………………………….. 100 ГЛАВА 4. Иммуноморфологический анализ органной, тканевой и клеточной локализации BSAT ……………………………………………………………………………………………… 109 ГЛАВА 5. Изучение влияния анти-BSAT1-антител на когнитивные функции беременных крыс и их потомства …………………………………………………………………………….. 124 ГЛАВА 6. Исследование распределения меченных I125 и AlexaFluor® 660 анти-BSAT1антител in vivo и оценка перспектив применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем экспериментальную глиому 101/8 …………………….. 133 ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ………………………………. 152 ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………………………... 155 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………………….. 156 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ: BSAT1 – цереброспецифический анионный транспортер (brain specific anion transporter 1) C6 – линия крысиной глиомы C6 Cx-43 – коннексин 43 DAPI – флуоресцентный ядерный краситель 4',6-диамидино-2-фенилиндол Dil – флуоресцентный краситель 1,1‘-октадецил 3,3,3‘,3-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат FCS – fetal calf serum (фетальная сыворотка телѐнка) GFAP – глиофибриллярный кислый протеин GFP – green fluorescent protein (зеленый флюоресцентный белок) GLUT1 – переносчик глюкозы-1 HEK293 – линия человеческой эмбриональной почки 293 HUVEC – линия человеческих эндотелиоцитов из пупочной вены ICAM-1 - межклеточный белок клеточной адгезии (intercellular cell adhesion molecule) IgG – иммуноглобулины G IL – интерлейкин JAM – контактные адгезивные молекулы (junctional adhesive molecules) LAT1 – переносчик крупных аминокислот (large amino acid transporter) MCT – переносчик монокарбоксильных соединений MRP – белок мультилекарственной резистентности (multidrug resistance-associated protein) OATP - переносчик органических анионов OD – оптическая плотность PBS – фосфатно-солевой буфер PFS6 – выживаемость в течение 6 месяцев без прогрессии Pgp - Р-гликопротеин SDS – додецил-сульфатнатрия TMB – 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) TNF-α – фактор некроза опухоли-альфа VCAM-1 – сосудистый белок клеточной адгезии-1 VE-cadherin – васкулярно-эндотелиальный кадгерин VEGF– эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial cell adhesion molecule) а.о. – аминокислотные остатки АГ – антиген АС – антисыворотка АТ – антитела БСА – бычий сывороточный альбумин ГГФРТ – гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза 4 ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ДДС – додецилсульфат натрия ДМСО – диметилсульфоксид ИГХ – иммуногистохимический анализ ИФА – иммуноферментный анализ ИЦХ – иммуноцитохимический анализ кДа – килодальтон кДНК – комплементарная ДНК мРНК – матричная РНК МРТ – магнитно-резонансная томография п.о. – пары оснований ПААГ – полиакриламидный гель ПАФ – полный адьювант Фрейнда ПВДФ – поливинилиденфторидная мембрана ПК – плотные контакты (tight junction, TJ) ПСА – аммония персульфат ПЦР – полимеразная цепная реация ПЭГ – полиэтиленгликоль РИА – радиоиммунный анализ РЭС – ретикуло-эндотелиальная система СМЖ – спинномозговая жидкость ТГ – тиреоидные гормоны ФИТЦ – флуоресцеин изотиоцианат ЦНС – центральная нервная система ЧСА – человеческий сывороточный альбумин ЩК – щелевой контакт (gap-junction) ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭПР – эндоплазматический ретикулум ЭЦМ – эндотелиоциты церебральных микрососудов 5 ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Создание лекарственных препаратов направленного типа действия уже более 100 лет является актуальной задачей медицины [31, 310]. Особое значение создание адресных препаратов имеет в терапии глиальных опухолей. Избирательная проницаемость гематоэнцефалического барьера и высокая активность эффлюксных систем даже в слабо дифференцированном церебральном эндотелии существенно ограничивают возможности фармакотерапии [224, 295]. Один из перспективных подходов к созданию адресных лекарственных препаратов центрального действия заключается в применении высокоспецифических антител к белкам-мишеням в нервные ткани в качестве вектора, определяющего избирательность доставки лекарства [28, 48, 62, 102, 103, 312, 182, 311, 312]. Среди белков, специфичных для церебрального эндотелия особого внимания заслуживает цереброспецифический анионный транспортер (BSAT1 или OATP14) [19, 20, 22, 178, 279, 337]. BSAT1 является представителем широко распространенного семейства транспортеров органических анионов OATP, локализуется на люминальной и аблюминальной мембране эндотелиацитов, осуществляя АТФ-зависимый транспорт тироксина в головной мозг [158, 214]. Высокая специфичность BSAT1 по отношению к микрососудам нервной ткани делает его очень интересной мишенью для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в церебральные капилляры [280]. Транспортеры тиреоидных гормонов (ТГ) являются необходимым компонентом для проникновения гидрофильных ТГ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в клетки глии и нейроны [74, 205, 236, 279]. У людей мутация по гену транспортера монокарбоксильных соединений-8 (MCT8), одного из переносчиков ТГ, вызывает синдром Аллана-Херндона-Данли, характеризующийся выраженными ментальными и неврологическими нарушениями, снижением тонуса и спастичностью мышц, а также увеличенной концентрацией Т3 и сниженной Т4 в крови [74]. В мозге мышей с дефицитом MCT8 также наблюдаются изменения уровня ТГ, однако когнитивных нарушений выявлено не было [317]. Известно, что у этих животных снижено проникновение Т3 через ГЭБ, но не нарушен транспорт Т4 в мозг [296]. У грызунов нехватку MCT8 компенсирует нейроспецифический транспортер анионов BSAT1 (или Oatp1c1) 6 [225, 266]. Для крыс и мышей характерен высокий уровень его экспрессии в эндотелиоцитах мозга и структурах сосудистого сплетения, у людей же он слабо экспрессируется только в микрососудах мозга. В экспериментах на недавно созданной линии мышей, нокаутных по гену BSAT1, не было выявлено видимых отклонений в развитии, равно как и изменений концентрации в крови Т4 и Т3, а также экспрессии тиролиберина и тиреотропина; однако содержание Т4 и Т3 в ткани мозга, а также экспрессия Т3-регулируемых генов были снижены, что свидетельствует о локальном гипотиреоидизме в мозге при нормальной функции прочих транспортеров ТГ. Вместе с тем, эффекты ингибирования интенсивности биосинтеза BSAT1 на когнитивные функции изучены не были. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Получить моноклональные антитела к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов, изучить его клеточную и органную локализацию, нейрокогнитивные свойства, а также оценить перспективы применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем в экспериментальную глиому С6. В соответствии с целью были поставлены следующие ЗАДАЧИ: 1. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов. 2. Изучить иммунохимические свойства моноклональных анти-BSAT1 антител. 3. Изучить клеточную и органную локализацию BSAT1. 4. Изучить когнитивные функции у потомства самок крыс, которым в перинатальном периоде парентерально вводили анти-BSAT1 антитела. 5. Оценить перспективы применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем в экспериментальную глиому С6. НАУЧНАЯ НОВИЗНА 1. Впервые исследовали органную, клеточную и субклеточную локализацию цереброспецифического анионного транспортера BSAT1 крысы с помощью антител к его внеклеточному фрагменту. 7 2. Впервые продемонстрировано влияние антител к внеклеточному фрагменту BSAT1 на когнитивные функции экспериментальных животных. 3. Впервые разработана и изучена в экспериментах in vitro и in vivo векторная наноконтейнерная система на основе наногелей и анти-BSAT1-антител. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ: 1. Протоколы получения моноклональных анти-BSAT1-антител могут применяться для приготовления компонентов при иммунофементном и иммуноцитологическом скриннинге BSAT1 в биологических объектах, а также при подготовке векторов в системах направленного транспорта в клетки-мишени нервной ткани. 2. Полученные в работе данные могут использоваться для планирования дизайна доклинических исследований по направленному транспорту диагностических и лекарственных препаратов в мозг. АПРОБАЦИЯ, ВНЕДРЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИ Апробация работы. Основные положения работы представлены и обсуждены: на VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012), и на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им. Пирогова и сотрудников отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского» Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 - статьи в российских научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, одна статья в иностранном журнале, 2 - тезисы в материалах российских и международных конференций. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 181 машинописных страницах; состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных главах работы приведены данные обзора литературы, характеристика объекта, методов исследования, а также используемого материала, результаты собственных исследований и их обсуждение. Диссертация иллюстрирована 55 рисунками и 6 таблицами. 8 Автор выражает глубокую признательность академику РАН Владимиру Павловичу Чехонину за неоценимый вклад в данную работу и пристальное внимание, уделѐнное еѐ выполнению и завершению. Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского: Владимира Павловича Баклаушева, Гаухар Маратовну Юсубалиеву, Ольгу Ивановну Гурину, Надежду Филипповну Гриненко, Наталью Владимировну Нуколову, Сергея Александровича Шеина, Андрея Вячеславовича Макарова, Илью Васильевича Викторова, Ирину Петровну Лазаренко, Клавдию Павловну Ионову, сотрудников кафедры и Отдела Медицинских нанобиотехнологий РГМУ им. Н.И. Пирогова: Анну Владимировну Леопольд, Максима Артѐмовича Абакумова, Илью Леонидовича Губского, Филиппа Александровича Кошкина, Ирину Ивановну Шепелѐву, коллектив группы оптических исследований (руководитель Евгений Борисович Цитрин) Института биологии развития им. Н.Н. Кольцова РАН, ведущего научного сотрудника Института морфологии человека РАМН, к.б.н. Александра Сергеевича Халанского в соавторстве с которыми выполнены разделы этой работы. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ ГЕМАТО-ЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является высокоэффективной морфо-функциональной структурой, поддерживающей гомеостаз в нервной ткани. Гематоэнцефалический барьер состоит из клеточных компонентов (эндотелиальные клетки, астроциты, микроглия, перициты, нейроны) и внеклеточного матрикса [244]. Концепция ГЭБ подчеркивает, что для нормальной функции мозга требуется скоординированное взаимодействие различных компонентов, формирующих его структуру. В случае нарушения каких-либо компонентов в результате физиологического или фармакологического стресса может быть нарушена целостность ГЭБ и как следствие – повышена его проницаемость [237]. 1. Базолатеральные эффлюксные транспортеры 2. Жирорастворимые препараты 3. Эндотелиальные клетки с плотными контактами (TJ) 4. Перицит 5. Люминальные АТФ-зависимые транспортеры (P-gp, MRP, BCRP и др.) 6. Транспортер-опосредованный перенос (глюкоза, аминокислоты и др.) 7. Рецептор-опосредованный перенос 8. Абсорбционный эндоцитоз (альбумин, белки плазмы) 9. Астроцитарный отросток Рисунок 1.1. Схема транспортных механизмов гематоэнцефалического барьера Хорошо известно, что важнейшими регуляторами, определяющими гомеостаз ЦНС являются гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гемато-ликворный барьер (BCSF) [31, 75, 319]. Кроме того, ГЭБ и BCSF создают препятствие на пути эффективной доставки лекарственных препаратов в ЦНС. В связи с этим, для дифференцированного захвата и эффлюкса через барьеры существуют транспортеры, точно контролирующие проникновение циркулирующих растворенных веществ [7, 12, 14, 31, 10 55, 75, 90, 269, 319]. Изучение функций транспортеров позволило изменить подходы для доставки лекарственных и диагностических веществ в ткань мозга с «грубых» физических на химические, которые специфичны для конкретных транспортеров ГЭБ и / или BCSF (рисунок 1.1.). Cреди прочих функций, ГЭБ высокоселективно контролирует транспорт лекарственных веществ в мозг, тем самым ограничивая возможности для эффективной терапии заболеваний ЦНС. В течение последнего десятилетия, интенсивные исследовательские усилия были сосредоточены на оптимизации доставки лекарств непосредственно через ГЭБ. Вместо того чтобы физически обойти через ГЭБ с помощью механических методов, новые подходы, направленные на изучение и идентификацию транспортеров, позволяют развить новые химические подходы с использованием эндогенных барьерных компонентов для доставки лекарств в мозг [Ошибка! Источник ссылки не найден., 79, 90, 138, 244, 319]. Такой подход обеспечивает уникальную возможность для улучшения эффективности существующих методов лечения и способствует развитию новых. ТРАНСПОРТ ЧЕРЕЗ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ И ГЕМАТОЛИКВОРНЫЙ БАРЬЕРЫ. В связи невозможностью создания достаточных концентраций в головном мозге, фармакотерапия некоторых заболеваний ЦНС становится невозможной. Это связано, в частности, с активным эффлюксом, ограничивающим доступ и проникновение лекарсвенных препаратов из кровотока в мозг. Однако лекарственные вещества могут пересекать барьеры (ГЭБ и BCSF) и накапливаться в ткани мозга с помощью различных механизмов, способствующих поглощению – таких, как пассивная диффузия, эндоцитоз и перенос, опосредованный транспортером (рисунок 1.2.). 11 Рисунок 1.2. Схематическое изображение транспортных механизмов ГЭБ. Пассивная диффузия Пассивная диффузии заключается в перемещении растворенных веществ через биологические мембраны вдоль градиента их концентрации без затраты энергии или биологического участия белка-носителя. На способность вещества пассивно диффундировать влияют несколько факторов: растворимость, полярность, молекулярный размер, концентрации в крови и площадь поверхности для диффузии. Диффузия полярных и гидрофильных веществ через мембраны затруднена. Имеет место корреляция между растворимостью веществ и проницаемостью мембран: так, жирорастворимые вещества легко перемещаются через клеточные мембраны. Хотя размер молекул и влияет на проницаемость – более низкомолекулярные вещества проходят легче, но его влияние на проницаемость не так велика, как у растворимости. Размер соединения может быть преодолен путем растворения в липидах, в частности, соединений, которые высоко гидрофобные [115]. Кроме того, на способность веществ к пассивной диффузии через биологические мембраны влияет наличие водородной связи. Как правило, чем меньше количество водородных связей сформировано, тем больше способность соединения пассивно диффундировать через мембрану [318]. Несмотря на 12 ограничения, связанные с физико-химическими свойствами, небольшие, полярные или заряженные молекулы (т.е. ионы, вода) могут проникать через биологические мембраны с помощью водных каналов, проходящих через липидный слой [306]. Например, к лекарственным средствам, которые могут пассивно диффундировать через биологические мембраны, относятся опиоиды (т.е. морфин, героин), димедрол и стероиды [15, 63, 306]. Транспорт с помощью носителя (транспортер-опосредованный перенос) Перенос веществ, опосредованный транспортером (рисунок 1.3.), включает взаимодействие субстрата с белком-транспортером / носителем, обеспечивающим диффузию через мембрану по градиенту концентрации растворенного вещества. Рисунок 1.3. Транспортер-опосредованные механизмы переноса (локализация транспортеров эффлюкса и инффлюкса на компонентах ГЭБ). 13 Такие транспортные системы используются для прохождения необходимых питательных веществ (например, глюкозы) в мозг, а также для элиминации метаболических отходов. Классическим примером транспортер-опосредованного переноса является транспортер Glut-1, который локализуется с люминальной и аблюминальной поверхностей ГЭБ и является транспортером, зависящим от концентрации вещества [234, 299]. Лекарственные препараты в ЦНС также могут проникать путем транспортопосредованного переноса. Например, LAT-1 опосредует перенос L-DOPA, препарата, используемого в качестве «золотого стандарта» при терапии Болезни Паркинсона [9]. Эндоцитоз Везикулярный транспорт через ГЭБ происходит путем рецептор- опосредованного, адсорбционного или эндоцитоза с незавершенной фазой [1, 270, 318]. Рецептор-опосредованнй эндоцитоз предполагает взаимодействие субстрата с рецептором, экспрессированным на поверхности мембраны. Связывание субстрата вызывает интернализацию комплекса субстрат-рецептор во внутриклеточное пространство, где происходит диссоциация субстрата от рецептора [224]. Интернализация комплекса субстрат-рецептор включает инвагинацию люминальной мембраны, которая инкапсулирует комплекс в пузырьки. Затем пузырьки отделяются от мембраны и интернализуются; после поглощения, содержимое пузырьков освобождается в пределах внутриклеточного пространства, либо везикулы сливаются с аблюминальной мембраной, освобождая содержимое прямо в паренхиму мозга [225]. Например, путем рецептор-опосредованного эндоцитоза происходит транспорт трансферрина и инсулина [85, 147]. При адсорбционном эндоцитозе катионные белки связываются с люминальной мембраной капилляров эндотелиоцитов с помощью электростатического взаимодействия с анионными сайтами, расположенными на мембране. Эти анионные сайты экспрессированы кислыми гликопротеинами на люминальной мембране (т.е. гликокаликсом) [254, 289]. Для эндоцитоза с незавершенной фазой не требуется наличия рецепторов и предполагается захват веществ, растворенных в межклеточной жидкости. После прикрепления вещества с клатрином мембраны клетки создается инвагинация мембраны и формирование «ямки» с дном, покрытым клатрином, в 14 дальнейшем везикула закрывается, отсоединяется от мембраны. В дальнейшем происходит либо высвобождение содержимого везикулы в межклеточное пространство, либо везикула сохраняет свое содержимое со стороны аблюминальной мембраны [32]. Активный транспорт Активный транспорт субстратов через ГЭБ является энергозависимым и обычно связан с гидролизом АТФ [1]. В результате такого транспорта возможно проникновение веществ против градиента их концентрации. Существует множество энергозависимых транспортеров, экспрессированных на эндотелиоцитах ГЭБ, отвечающих за перенос необходимых питательных веществ, ионов и других эндогенных соединений в ЦНС. Кроме того, дополнительно существуют другие транспортеры активного переноса, отвечающие за ограничение / регулирование проникновение потенциально токсических веществ в мозг [1]. Многие лекарственные препараты доставляются в ЦНС путем активного транспорта, в том числе такие препараты, как опиоидные анальгетики, ингибиторы HMG Co-A редуктазы, ингибиторы HIV-1 протеаз, сердечные гликозиды, противоопухолевые препараты, блокаторы кальциевых каналов и антибиотики. Функциональная экспрессия транспортеров на сайтах гематоэнцефалического барьера Для множества терапевтических соединений проникновение в ткань мозга и экструзия из мозга опосредована транспортными белками. Идентифицированы различные варианты транспортных систем проникновения и эффлюкса через ГЭБ и BCSF, включая АТФ-зависимые (АВС) транспортеры, транспортеры органических анионов и органических катионов, белковых транспортеров, транспортеров нуклеотидов и транспортеров монокарбоксилатов [7, 117, 123, 127, 130, 164, 168, 179]. Семейство АВС-транспортеров Семейство АТФ-зависимых АВС-транспортеров является одним из крупнейших и наиболее повсеместно экспрессированных белковых семейств, известных на сегодняшний день (рисунок 1.7.) [97, 241, 242]. Суперсемейство АВС-транспортеров 15 состоит из 48 генов, которые подразделяются на 7 различных подсемейств (ABCA – ABCG) [65]. АВС-транспортеры участвуют в различных физиологических функциях, таких, как поддержание структуры липидного бислоя, транспорт пептидов и транспорт стерола, переносе широкого спектра лекарственных препаратов (таблица 1.1.). Таблица 1.1. Семейство АВС транспортеров и их субстраты P-gp (ABCB1) BCRP (ABCG2) MRP1 (ABCC1) MRP2 (ABCC2) MRP3 (ABCC3) MRP4 (ABCC4) MRP5 (ABCC5) MRP6 (ABCC6) Субстраты Ссылки морфин, дигоксина, верапамил, дексаметазон, саквинавир, нелфинавир, саквинавир, паклитаксел, лоперамид, актиномицин Д, питавастатин, правастатин 255, 258, 267, 268, 276 доксорубицин, топотекан, метотрексат, иматиниб, питавастатин, церивастатин, зидовастатин, митоксантрон, эстрон-3-сульфат, протопорфирин, митоксантрон 184, 235, 277 сульфаты, LTC4, винкристин, даунорубицин, доксорубицин, этопозид, MTX, глутатион, коньюгаты глюкуроновой кислоты билирубин, цисплатин, прастатин, сульфородамин101 кислота хлорид (Техасский красный), глутатион, коньюгаты глюкуроновой кислоты моноамины и коньюгаты желчных кислот, MTX, этопозид, тенипозид циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ), аналоги нуклеотидов (PMEA, PMEG), пуриновых аналогов простагландинов, MTX, уровни неконьюгированных желчных кислот, коньюгаты сульфатов, глутатион, коньюгаты глюкуроновой кислоты 32, 154, 209 циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ), аналоги нуклеотидов (PMEA), ставудин-монофосфат, глутатион Короткие пептиды, этопозид, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, коньюгаты глюкуроновой кислоты Одним из наиболее клинически значимых ролей АВС транспортеров является их прямой вклад в развитие фенотипа множественной лекарственной устойчивости (MDR) [65]. MDR фенотип определяется как одновременная устойчивость к несколь16 ким структурно несвязанным соединениям, и который не является результатом независимых генетических мутаций, придающим устойчивость к одному ксенобиотику [105]. АВС гены классифицируются либо как полный транспортер, либо как половина транспортера с полным транспортером, демонстрирующим прототип двух трансмембранных доменов и двух нуклеотид-связывающих домена. Половина транспортеров содержат только один трансмембранный домен и один нуклеотид-связывающий домен, которые, предположительно, гомо- или гетеродимеризуются для повышения функциональности [132]. Все ABC члены суперсемейства обладают тремя высококонсервативными мотивами, известными как мотивы Walke rA, Walker B и ABC signature C motif (т.е., ALSGGQ) [125, 335]. Точная роль последовательностей ABC signature C неизвеста, хотя высказано предположение, что этот домен может участвовать в распознавании субстрата или гидролиза АТФ [175]. Гидролиз АТФ для АВС транспортеров требуется в качестве источника биологической энергии для транспорта веществ в одном направлении через мембраны против градиента концентрации [65, 328]. Члены подсемейства ABCA играют роль в трафике фосфолипидов (т.е. холестерин) через плазматические мембраны. Потеря функций этими транспортерами может привести к развитию дислипидемии. Например, потеря функций в результате мутации в ABCA1, играющем ключевую роль в реверсивном транспорте холестерина, приводит к развитию болезни Танжера [64, 251]. Болезнь Танжера - аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся тяжелой недостаточностью липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А, а также накоплением сложных эфиров холестерина во всем теле [64, 227]. При некоторых офтальмологических заболеваниях, включая болезнь Штаргардта, рецессивный пигментный ретинит и рецессивная конусная дистрофия, обнаружены варианты мутаций гена ABCA4, который локализован в центральных фоторецепторах. ABCB подсемейство состоит из 11 членов, которые отвечают за транспорт различных растворенных веществ, таких как лекарственные препараты, пептиды, фосфатидилхолин и железо [64]. Одним из наиболее хорошо изученных членов ABCB подсемейства является Pgp, основной участник фенотипа MDR, который участвует в клеточном эффлюксе ле17 карственных препаратов. Другие члены ABCB подсемейства – белок-транспортер экспорта солей желчных кислот, более известный как BSEP транспортер (ABCB11) и транспортеры, ассоциированные с процессингом антигена 1 и антигена 2 (TAP1 и TAP2, также известные как ABCB2 и ABCB3, соответственно). Мутации в ABCB генах были обнаружены при различных заболеваниях, включая прогрессирующийсемейный внутрипеченочный холестаз, анкилозирующий спондилит, инсулин- зависимый сахарный диабет и целиакию [64]. Существуют 13 членов ABCC подсемейства, функции которых заключаются в ионном транспорте и сигнальной трансдукции [64]. Повреждение и / или потеря функций этих транспортеров происходит в результате различных патофизиологических состояний, включая гиперинсулинемическую гипокликемию (ABCC8) [88, 98] и синдром Дубина-Джонсона (ABCC2) [305]. Кроме того, муковисцидоз в результате нарушения функции хлорид-ионных каналов при мутации гена CFTR transporter (ABCC7) [57]. MRP/Mrp изоформы также являются членами ABCC подсемейства и связаны с развитием фенотипа MDR [64]. ABCC семейство также включает рецепторы сульфонилмочевины (СУР) 1 и 2 типов, а также урезанный белок, который не является медиатором транспортеров (ABCC13) [64]. ABCD подсемейство состоит из 4 генов (ABCD1-4), которые кодируют половину транспортеров, найдены исключительно в пероксисомах. Члены семейства ABCD, как считается, участвуют в перевозке коэнзима-А длиноцепочечных жирных кислот [307]. Мутация ABCD1 гена приводит к сцепленному с Х-хромосомой заболеванию – адренолейкодистрофии, которая характеризуется прогрессирующей демиелинизацией, нарастанием когнитивных нарушений, потерей зрения, слуха, двигательными нарушениями [43]. В отличие от других ABC подсемейств, ABCE и ABCF подсемейства содержат гены, содержащие нуклеотид-связывающие домены, но не кодируют трансмембранные домены. Белок OABP является единственным известным членом ABCE подсемейства, отвечающим за распознавание олигоаденилата, который продуцируется при вирусных инфекциях [292]. Функция ABCF1-3 не была в полной мере охарактеризована, однако, было установлено, что hABCF1 может являться частью рибосомального комплекса [64]. ABCG подсемейство человека состоит из шести транспортеров, которые включают в себя ABCG2, также известном как BCRP / Bcrp. BCRP / Bcrp играет важную роль в создании MDR фенотипа и является, как известно, транспортером некоторых лекарственных препаратов. Другие члены ABCG подсе18 мейства включают ABCG1, ABCG5, и ABCG8, участвующих в перевозке стеринов, таких как холестерин [289]. В ЦНС наиболее изученными членами суперсемейства АВС являются P-gp, изоформы MRP / Mrp и BCRP / Bcrp (рисунок 1.4.), поскольку известно, что они играют важную роль в ограничении поступления лекарственных препаратов в ткань мозга, тем самым снижая эффективность фармакотерапии при лечении неврологических заболеваний [238, 328]. Рисунок 1.4. Схематическое изображение локализации АВС транспортеров: ABCA1, ABCA2, P-gp, MRP1 и BCRP в ЦНС. (Hartz and Bauer, 2011) Р-гликопротеин P-gp представляет (рисунок 1.5.) собой 170 кДа эффлюксный транспортер, кодируемый геном MDR [76, 87, 87105, 185, 264]. Две изоформы MDR идентифицированы в тканях человека – MDR-1 и MDR-2 [51, 245]; однако, экспрессия P-gp в тканях грызунов кодируется тремя отдельными изоформами MDR – Mdr-1a, Mdr-1b и Mdr-2. В то время, как экспрессия MDR-1/mdr-1a/mdr1b формирует MDR фенотип [105, 298], 19 MDR-2/mdr-2 экспрессируются, прежде всего, в печени и участвуют в билиарном транспорте фосфатидилхолина [105, 273]. Рисунок 1.5. Структурная модель P-gp. У человека продукт гена MDR1 составляет 1280 аминокислот в длину и состоит из двух гомологичных половинок, каждая из которых содержит шесть трансмембранных доменов. В каждой гомологичной половинке также содержится один АТФсвязывающий сайт. На первой внеклеточной петле расположено от двух до четырех сайтов гликозилирования. Исследования по изучению P-gp с дефицитом гликозилирования продемонстрировало низкие уровни этого транспортера на клеточной поверхности, но и транспортная функция при этом оставалась незатронутой [108, 324]. Первоначально P-gp был идентифицирован в клетках яичников китайского хомячка, которые были устойчивы к действию колхицина [181], в дальнейшем была выявлена экспрессия P-gp во многих тканях, включая почки, печень, желудочнокишечный тракт, плаценту и семенники [263]. В ткани головного мозга, P-gp локализован как на люминальной, так и на аблюминальной мембранах [30] эндотелиоцитов ГЭБ, а также на апикальной плазматической мембране эпителиальных клеток сосудистого сплетения. Вероятнее всего, экспрессия P-gp развивалась для того, чтобы защи20 тить ЦНС от потенциально нейротоксических ксенобиотиков и поддержать гомеостаз, необходимый для нормального функционирования нейронов [263]. Одним из примеров доказательства важной роли P-gp в области защиты ЦНС послужили исследования с Mdr1a / Mdr1b нокаутными мышами. Было продемонстрировано 100-кратное увеличение поглощения инвермектина, нейротоксического пестицида, у Mdr1a / Mdr1b нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого типа [255]. Кроме того, клинически у Mdr1a / Mdr1b нокаутных мышей выявлялись симптомы интоксикации инвермектина – тремор, паралич, кома, смерть, – которые относились непосредственно к симптомам увеличения проникновения препарата в мозг [255]. Аналогичные наблюдения были зарегистрированы у собак колли, где повышенная чувствительность к ивермектина была напрямую связана с полным отсутствием гена Mdr1 [70]. Кроме того, экспрессия P-gp была обнаружена в клеточных компартментах паренхимы головного мозга, таких как астроциты, микроглия и нейроны [101, 168, 239, 256, 304]. Одна молекула P-gp способна распознавать и транспортировать многочисленные препараты с широким спектром химической структуры, начиная от веществ с молекулярной массой 250 г / моль (например, циметидин) и до 1202 г / моль (циклоспорин) [180]. Список известных категорий субстратов включает антибиотики, блокаторы кальциевых каналов, сердечные гликозиды, химиотерапевтические средствама, иммуносупрессанты, противоэпилептические средства, антидепрессанты и ингибиторы ВИЧ-1 протеаз [66, 100, 281]. Недавние исследования показали, что многие HMG CoA-редуктазы (например, питавастатин, правастатин) переносятся через биологические мембраны с помощью P-gp [267, 268]. Кроме того, было продемонстрировано, что опиоидные анальгетики, такие как морфин и опиоидный пептид DPDPE непосредственно элиминируют из ткани мозга с помощью P-gp [49, 50, 241, 260]. К эндогенным субстратам P-gp относятся цитокины, липиды, стероидные гормоны и пептиды [165, 173, 262]. P-gp может элиминировать из клеток широкий спектр структурно различных соединений. С этим АТФ-зависимым транспортером могут взаимодействовать сотни субстратов (обычно гидрофобных), в том числе, противоопухолевых препаратов, иммунодепрессантов, стероидных гормонов, блокаторов кальциевых каналов, сердечных гликозидов [243]. 21 В меньшей степени проницаемые препараты (слабые основания) также элиминируют в достаточной степени. В опухолевых клетках обнаружена гиперэкспрессия P-gp и в них он отвечает за эффлюкс лекарственных препаратов из клеток опухоли, тем самым предотвращая интернализацию химиопрепаратов и делая химиотерапию в большинстве случаев практически неэффективной. Таким образом, этот белок является одним из основных препятствий в лечении рака с помощью химиотерапии [25, 190]. В настоящее стратегически разрабатывается несколько направлений для преодоления трудностей, связанных с оптимальной доставкой лекарственных препаратов. К числу этих направлений относится не только ингибирование P-gp, по и поиск возможных путей обхода или игнорирования его [2, 135, 287]. Тем не менее, необходимо проявлять осторожность в отношении использования фармакологических ингибиторов P-gp для улучшения доставки в ткани. В частности, широкое распространение P-gp в различных органах и тканях организма при сочетании с большими дозами ингибиторов, необходимых для эффективного блокирования P-gp, часто приводит к значительной системной интоксикации [291]. Кроме субстратов P-gp, были найдены и описаны возможные конкурентные ингибиторы транспортера. К ним,например, относят блокаторы кальциевых каналов (т.е., верапамил), нейролептики (т.е. аминазин), иммунодепрессанты (т.е. циклоспорин А) и PSC 833 аналог циклоспорина А (т.е. вальсподар) [263]. Также были обнаружены ингибиторы HMG CoA-редуктазы, способные блокировать транспортную функцию P-gp. В совокупности, результаты этих исследований позволяют проводить поиск возможностей по преодолению лекарственной устойчивости, индуцированной P-gp, в клетках опухолей [99]. Белок BCRP / Bcrp Белок BCRP / Bcrp (рисунок 1.6.) первоначально был идентифицирован в линии клеток рака молочной железы MCF-7 / AdrVp и использовался в исследованиях, связанных с изучением методов преодоления фенотипа MDR [52]. Несмотря на отсутствие P-gp или MRP-1, эти клетки демонстрировали АТФ-зависимый эффлюксный транспорт адриамицин и родамина-123, что свидетельствовало о наличии нового транспортера белка [169, 210]. Этот транспортер впоследствии был клонирован из 22 клеточной линии MCF-7 / AdrVp и назван "белок сопротивления раку молочной железы" [71]. BCRP / Bcrp состоит из 655 аминокислот и имеет молекулярную массу приблизительно 72 кДа. BCRP / Bcrp обычно упоминается как "полу-транспортер", состоит из шести трансмембранных доменов (прототип 12 трансмембранным доменам ABC транспортера) с С- и N-концов, расположен на внутриклеточной стороне плазматической мембраны [71]. В добавление, 2-3 N-сайты гликозилирования расположены на внеклеточных петлях белка. Эти сайты гликозилирования, по-видимому, не имеют прямого влияния на функциональные возможности транспортера или на его клеточную локализацию [68, 201]. Считается, что BCRP / Bcrp образует функциональные гомо- или гетеродимеры, которые необходимы для активного эффлюкса [106, 107]. BCRP / Bcrp был идентефицирован в нескольких типах тканей, включая печень, желудочно-кишечный тракт, плацента и семенники [84]. В ЦНС BCRP / Bcrp экспрессирован на люминальной мембране эндотелиальных клетках капилляров ГЭБ, а также в астроцитах и в микроглии [77, 167, 333]. BCRP / Bcrp был также обнаружен в сосудистом сплетении мозга крыс, но только на уровне синтеза мРНК [92]. Рисунок 1.6. Модель BCRP. 23 Несмотря на имеющиеся исследования, демонстрирующие экспрессию BCRP / Bcrp в ЦНС, до сих пор до конца не выяснена его функциональная роль. При исследовании in vitro на культуре эндотелиальных клеток капилляров человека и грызунов была продемонстрирована активность BCRP / Bcrp-опосредованного транспорта [129, 333], но функциональная экспрессия может произойти в результате гиперэкспрессии BCRP / Bcrp в этой клеточной культуре. Таким образом, транспортная активность, о которой сообщалось, не может быть точным отражением BCRP / Bcrp функции в условиях in vivo [58, 332]. Кроме того, исследования in vivo также содержат противоречивые данные о функциональной экспрессии Bcrp. Так, при исследовании эффлюксного транспорта дегидроэпиандростерон-сульфата (DHEAS) и митоксантрона через ГЭБ мыши показано, что Bcrp играет лишь незначительную роль в активном эффлюксе этих субстратов [167, 171]. Этот вывод был сделан на основе результатов, полученных при перфузии in situ у P-gp нокаутных мышей и у мышей дикого типа. В обоих случаях было продемонстрировано увеличение поглощения меченных DHEAS и митоксантрона при предварительной обработке двойным ингибитором P-gp / Bcrp GF120918 (т.е. элакридар), что указывает на наличие P-gp-независимого эффлюксного транспортера [167, 171]. Однако при проведении исследования с ABCG2 (- / -) (то есть, Bcrp) нокаутными мышами показано, что поглощение тканью мозга меченных DHEAS и митоксантрона было сопоставимо с уровнем поглощения у мышей дикого типа [167, 171]. Добавление GF120918 имело аналогичный эффект на захват субстрата тканью мозга, как у Bcrp, так и мышей дикого типа [167, 171]. Ранее, в исследовании Breedveld et al. показали, что клиренс внутривенно введенного имантиниба, установленного субстрата для Bcrp, значительно снизился (~ 1.6 раза) у мышей с Bcrp сравнению с контрольной группой дикого типа. Кроме того, проникновение имантиниба в мозг, оцениваемое через два часа после введения, было значительно выше у мышей с Bcrp (2,5 раза), чем уровни, наблюдаемые у мышей дикого типа [37]. Кроме того, введение элакридара увеличивало проникновение имантиниба в мозг у мышей дикого типа, что предполагает, что эффлюксный транспорт этого противоопухолевого препарата опосредуется Bcrp [37]. Существует значительное совпадение между профилем субстратов для BCRP / Bcrp и P-gp (таблица 1.1.) [276, 277]. В дополнение к физиологическим субстратам, таких как стероидные гормоны, глутатион и фолиевая кислота [187, 277], 24 BCRP / Bcrp также транспортирует большое количество структурно различных терапевтических соединений. Среди субстратов, транспортируемых BCRP / Bcrp, имеются химиотерапевтические агенты (например, митоксантрон), антрациклины (например, этопозид, тенипозид), и производные камптотецина (то есть, топотекан, иринотекан) [8, 52, 143, 210, 228]. Белки множественной лекарственной устойчивости (MRPs / Mrps) Основная функция белков MRPs / Mrps состоит в экструзии ксенобиотиков из клеток, способствуя тем самым развитию фенотипа множественной лекарственной резистентности (MDR) [200, 303]. MRPs / Mrps отличаются от P-gp тем, что профиль их субстратов более ограниченный. В частности, MRPs / Mrps изоформы транспортируют, как правило, органические анионы и глюкуронидаты, сульфатированные и глутатион-конъюгированные метаболиты [334]. Специфические свойства и функциональное значение отдельных изоформ MRPs / Mrps сложно определить из-за существования 9 гомологов со значительным совпадением профилей субстратов, обозначенных как MRP 1-MRP 9. MRP 1 / Mrp 1 – MRP 6 / Mrp 6 были обнаружены как на ГЭБ, так и на BCSF, хотя до конца не выяснена их локализация и функциональная экспрессия [334]. MRP 1 / Mrp 1, MRP 2 / Mrp 2, MRP 3 / Mrp 3 и MRP 6 / Mrp 6 структурно похожи тем, что каждый из них имеет 3 трансмембранных домена (TMD), обозначенные TMD 0, TMD 1 и TMD 2, соответственно. TMD 0 содержит 5 α-спиралей, в то время как ТВД 1 и TMD 2 содержит 6 α-спиралей. MRP / Mrp TMDs, предположительно необходимы для сбора в плазмалемме поры, через которые можно транспортировать субстраты [33]. В противоположность этому, MRP 4 / Mrp 4 и MRP 5 / Mrp 5 более сходны по структуре с P-gp в том, что они не имеют TMD 0 и, следовательно, имеют более низкие молекулярные массы, чем другие гомологи MRP / Mrp [33, 172]. Цитоплазматический линкер (L 0) - часть белка, который сохраняется во всех гомологах MRP / Mrp и имеет важное значение для транспортной функции. L 0 находится между TMD 0 и TMD 0 на тех MRP гомологах с 3 трансмембранными доменами, в то время как в тех, что с 2 TMDs, L 0 является цитоплазматическим сегментом белка между TMD 1 и N-концом [59]. Нуклеотид-связывающие домены были идентифицированы в цитоплазматической области белка между TMD1 и TMD2, а также между TMD2 и С-концом [33]. MRP 1 / Mrp 1 – MRP 6 / Mrp 6 локализованы на люминальной 25 мембране эндотелия капилляров головного мозга [59, 334]. Наличие такой локализации может свидетельствовать о том, что члены семейства MRP/Mrp играют важную роль в захвате и эффлюксе лекарственных препаратов из мозга в кровь. В то время, как Mrp1 и Mrp3-Mrp5 обнаружены в плазматической мембране астроцитов и микроглии, экспрессия Mrp2 и Mrp6 в клетках глии минимальна [332]. В клетках микроглии и астроцитах крысы на мРНК, ни белки Mrp2 и Mrp6 найдены не были, хотя имели место споры по поводу обнаружения мРНК у эмбрионов крысы [59]. В астроцитах новорожденных крыс Wistar Hirrlinger et al. обнаружили мРНК Mrp1 и Mrp3-Mrp5, но не выявили мРНК Mrp2 [128]. При проведении исследования Ballerini et al. [24] сообщили об обнаружении мРНК Mrp1-Mrp6 в астроцитах плодов крыс. В совокупности, полученные различными группами ученых данные, свидетельствуют о том, что в интранатальном и неонатальном периодах уровни экспрессии Mrp различны. MRP1 / Mrp1 – протеин с молекулярной массой 190 кДа и состоит из 1531 аминокислотных остатков, экспрессируется различными органами и тканями организма и в высоких концентрациях идентифицирован в легких, яичниках, почках и мононуклеарных клетках периферической крови [33, 59, 172]. Субстраты, транспортируемые MRP1 / Mrp1, довольно разнообразны, в их число входят и органические анионы, и катионные соединения. Глюкуроновые конъюгаты, такие, как эстрадиола-17глюкуронид (E217βG) и сульфатные конъюгаты, такие, как эстрон 3-сульфат также являются предпочтительными субстратами [281]. Кроме того, химиотерапевтический препарат метотрексат является признанным субстратом [33]. Высокое сродство MRP1 имеет с цистенил-лейкотриеном LTC4, свидетельствует о том, что MRP1 может способствовать индукции иммунного ответа, хотя детали этого участия до сегодняшнего дня остаются неизвестными. MRP1 также имеет возможность транспортиртировать различные металлоиды в виде оксоанионов. Способность MRP1 к эффлюксу различных токсинов, канцерогенов и лекарственных препаратов свидетельствует об его роль в детоксикации ксенобиотиков [176]. MRP1 является транспортером окисленной формы глутатиона (GSSG), а также восстановленного глутатиона (GSH) и конъюгатов глутатиона, например, 2,4-динитрофенил-S-глутатиона (DNP-SG) [281]. Весьма вероятно, что эта физиологическая функция MRP1 / Mrp1 является ключевой для поддержания нормального окислительно-восстановительного баланса в ткани мозга именно из-за локализации на структурах ГЭБ и в паренхиме мозга (т.е., на мембранах астро26 цитов и микроглии). Например, ингибирование Mrp1 приводит к снижению эффлюкса GSSG из первичной культуры, который образуется в качестве побочного продукта окислительного стресса [157]. Транспорт GSH Mrp1 увеличивается в присутствии верапамила, известного как ингибитор P-gp [174]. Сам верапамил не транспортируется Mrp1, подразумевается, что он аллостерически повышает Mrp1 транспорт GSH путем увеличения его сродства к этому эндогенному антиоксиданту [174]. В связи с этим, эндогенные соединения, которые оказывают аналогичный верапамилу эффект на Mrp1 (например, биофлавоноид апигенин) свидетельствует о том, что MRP1 может способствовать индукции иммунного ответа, хотя детали этого участия до сегодняшнего дня остаются неизвестными. MRP1 также имеет возможность транспортиртировать различные металлоиды в виде оксоанионов. Способность MRP1 к эффлюксу различных токсинов, канцерогенов и лекарственных препаратов свидетельствует об его роль в детоксикации ксенобиотиков [176]. MRP1 является транспортером окисленной формы глутатиона (GSSG), а также восстановленного потребуются для внутриклеточного накопления в целях повышения Mrp1-опосредованного транспорта GSH. При иммуногистохимическом анализе и изучении транспорта лекарственных препаратов была установлена экспрессия Mrp1 в клетках первичной клеточной культуры из сосудистого сплетения новорожденных крыс, где Mrp1 был локализован на эпителиальных клетках сосудистого сплетения с базолатеральной стороны [230]. В исследованиях Choudhuri S. et al. с помощью измерения уровня экспрессии мРНК была подтверждена локализация Mrp1 на эпителиальных клетках сосудистого сплетения крыс [54]. Базолатеральная локализация Mrp1 делает возможным эффлюкс субстратов из СМЖ в кровоток [59]. Однако, после введения E217βG и DNP-GS, установленных для MRP/Mrp субстратов, в желудочки мозга Mrp1-нокаутным мышам, было показано отсутствие достоверных отличий в концентрации E217βG и DNP-GS в СМЖ, по сравнению с мышами дикого типа [172]. Полученные результаты косвенным образом указывают на присутствие другого транспортера органических анионов, аналогичного членам семейства ОАТ / Oat, который активно экструдирует вещества из СМЖ через BCSF барьер. Кодируемый геном ABCC2, MRP2 состоит из 1545 остатков аминокислот и имеет молекулярную массу 174 кДа [33]. В ЦНС MRP2/Mrp2, в первую очередь, экспрессирован на люминальной мембране эндотелиоцитов капилляров головного мозга 27 [59]. Субстратный профиль для MRP2/Mrp2 очень похож на MRP1/Mrp1, однако многие из этих общих субстратов обладают более низкой аффинностью к MRP2 / Mrp2, чем к MRP1 / Mrp1. Так, например, показан транспорт противоракового химиотерапевтического препарата цисплатина MRP1, в то время как MRP2 не является его переносчиком [212]. В связи с тем, что изначально MRP2 / Mrp2 был обнаружен со стороны канальцевой (апикальной) стороне мембран гепатоцитов, его часто называют канальцевый мультиспецифический транспортер органических анионов (cMOAT). MRP2/Mrp2 оказался крупным транспортером из клеток печени в желчь билирубина, органических анионов и глюкуронида [33]. Эта локализация MRP2/Mrp2 указывает на то, что данный транспортер играет решающее значение для выделения различных метаболитов. Отсутствие полноценной MRP2 в гепатоцитах приводит к развитию синдрома Дубина-Джонсона, при котором происходит накопление конъюгатов билирубина в крови. Во многих отношениях MRP3 / Mrp3 тесно связан с MRP2 / Mrp2. Состоящий из остатков 1527 аминокислот и имеющий молекулярную массу 169 кДа, MRP3 / MRP3 похож по размеру и субстратному профилю на MRP1/Mrp1 и MRP2/Mrp2 [33, 172]. MRP3 / Mrp3 локализуется на люминальной мембране эндотелиоцитов капилляров головного мозга и также экспрессирован на плазматических мембранах астроцитов и микроглии [26]. Известно, что MRP3 / Mrp3 транспортирует противоопухолевые препараты, такие как метотрексат и тенипозид, но не является транспортером цисплатина, винкристина и доксорубицина [33, 59]. MRP3 / Mrp3 является единственным MRP, транспортирующим соли одновалентных желчных кислот, таких как гликохолат [59]. Одним из ключевых различий между MRP3 / Mrp3 и MRP1 / Mrp1 и/или MRP2 / Mrp2 является то, что MRP3 / Mrp3 имеет повышенное сродство для глюкуронида по сравнению с конъюгатом глутатиона. В самом деле, нет данных о транспорте конъюгата глутатиона MRP3 / Mrp3 [330]. Известно, что при транспорте этопозида MRP3 не требуется GSH в качестве совместного субстрата [107], в то время как транспорт этопозида MRP1 / Mrp1 и MRP2 / Mrp2 зависит от GSH [59]. MRP4 / Mrp4 транспортер различных соединений и является уникальным по сравнению с другими MRP / Mrp. MRP4 имеет молекулярную массу 150 кДа, состоит из остатков 1325 аминокислот и содержит два трансмембранных домена [33]. Как 28 MRP1 / Mrp1 и MRP2 / Mrp2, MRP4 / Mrp4 способен транспортировать E217βG и метатрексат. Однако MRP4 / Mrp4 не обладает способностью транспортировать другие субстраты, общие для MRP1 / Mrp1-MRP3/Mrp3, такие как этопозид, DNP-SG, и LTC4. Необходимо отметить, что в последнее время субстратный профиль MRP4 более расширен, по сравнению с изначальными прогнозами [59]. Mrp4 придает резистентности клетками при терапии ВИЧ-1 такими препаратами, как azidothymidinemonophosphate (AZT-MP) и 9-(2-phosphonylmethoxyethyladenine) (PMEA). Как было показано, присутствие GSH способствует Mrp4-опосредованному транспорту желчных кислот, холина, холил-глицина и холил-таурина в гепатоцитах [232]. Полученные данные позволяют предположить, что GSH необходим в качестве совместного транспортного субстрата для конкретных MRP4 / Mrp4 субстратов. Высокий уровень экспрессии MRP4 / Mrp4 в ЦНС выявлен у ГЭБ и BCSF барьера, в астроцитах и в клетках микроглии [281]. Локализация MRP4 / Mrp4 на люминальной поверхности клеток эндотелия капилляров головного мозга и базолатеральной стороне эпителиальных клеток сосудистого сплетения позволяет ограничить поступление широкого круга соединений в паренхиму головного мозга и СМЖ [211]. MRP5 / Mrp5 имеет молекулярную массу 161 кДа и состоит из 1437 аминокислотных остатков [33]. MRP5 / Mrp5 повсеместно с высоким уровнем экспрессирован в мозге, сердце и склетных мышцах. У Mrp5 нокаутных мышей не выявлено какихлибо дисфункций [313]. Аналогично MRP4 / Mrp4, был MRP5 / Mrp5 идентифицирован в плазматической мембране астроцитов и клеток микроглии, в ГЭБ и BCSF барьере [281]. Mrp5 способен транспортировать PMEA, 6-тиоинозин монофосфат, а также цАМФ и цГМФ [33]. В тоже время, MRP5 / Mrp5 не способен связывать и транспортировать общие с MRP1 / Mrp1 субстраты, такие как этопозид, LTC4 и винкристин. Одним из уникальных для MRP5 / Mrp5 субстратов является препарат для терапии ВИЧ-1 ставудин монофосфат. Никаких других эндогенных для ЦНС субстратов MRP5 / Mrp5 не обнаружено [157]. Еще одной уникальной характеристикой MRP5 / Mrp5 является внутриклеточная экспрессия белка. Неполяризованные клетки HEK293, трансфицированные MRP5, продемонстрировали более высокую концентрацию MRP внутри клетки, чем на плазматической мембране по сравнению с поляризованными MDCKII клетками, у которых максимальная экспрессия MRP5 обнаружена на базолатеральной мембране [59, 313]. По сравнению с MRP4 / Mrp4, 29 MRP5 / Mrp5 имеет более узкий субстратный профиль, хотя для уточнения специфичности субстратов и локализации требуются дополнительные исследования. MRP6 / Mrp6 состоит из остатков 1503 аминокислот и имеет молекулярную массу 165 кДа и экспрессируется в низких концентрациях во многих тканях организма, но в основном экспрессирован в почках и печени, где он локализован на базолатеральной мембране проксимальных канальцев и гепатоцитов [129, 332]. Локализация MRP6 / Mrp6 структуре ГЭБ подтверждена в настоящее время на люминальной стороне эндотелиоцитов капилляров головного мозга, экспрессия в астроцитах и микроглии незначительна. В структуре BCSF барьера MRP6 / Mrp6 обнаружен не был [281]. При проведении исследований показан транспорт MRP6 / Mrp6 этопозида, цисплатина и доксорубицина, в тоже время MRP6 / Mrp6 не является транспортером метотрексата, винкристина и E217βG [59]. Несмотря на то, что MRP6 / Mrp6 и белки MRP1 / Mrp1-MRP3 / Mrp3 структурно похожи, MRP6 / Mrp6 не способен транспортировать конъюгат глюкуронида. Также MRP6 / Mrp6 не является транспортером циклических нуклеотидов и метотрексата, субстратов MRP4/Mrp4. Суперсемейство SLC транспортеров. Члены суперсемейства SLC являются медиаторами транспорта через биологические мембраны анионных и катионных низкомолекулярных веществ, а также пептидов и нуклеотидов. Из 43 известных подсемейств SLC транспортеров (SLC1SLC43), белки от SLC15A1, SLC21A, SLC22, SLC28, и SLC29 экспрессированы на ГЭБ и/или BCSF барьере [53, 130, 145, 154, 164]. Члены SLC21 и SLC22 подсемейств включают OAT / Oat, OCTs / Octs и OATPs / Oatps [117, 119, 124, 192, 246, 248]. Члены SLC15A1 семейства включают транспортеры пептидов, в то время как ингибиторы транспорта являются членами SLC28 и SLC29 семейств [154]. Хотя многие из этих транспортеров способны на двунаправленный транспорт, как правило, SLC выступают за усвоение лекарств клетками [164]. В отличие от ABC транспортеров, большинство SLC не требуют ATP для перемещения субстратов через биологические мембраны. Вместо этого, транспорт основан на электрохимическом градиенте (т.е., Na+ или H+ градиент) или градиенте концентраций транспортируемых веществ. Таким образом, эти транспортеры классифи- 30 цируются в качестве помощников перевозчиков или вторичных активных перевозчиков [275, 328]. Транспортеры органических анионов OATs / Oats OATs / Oats являются членами суперсемейства 22 SLC (SLC22A) [164]. В настоящее время к членам семейства OATs / Oats относятсятся OATs / Oats 1-6 и ренальный специфический транспортер (RST) [4, 7, 11, 14, 18, 34, 44, 163, 184, 202, 215, 271]. OAT классифицируются в соответствии от потребности в энергии: Na+зависимые, Na+-независимые и АТФ-зависимые [168, 261]. Эти транспортеры опосредуют прохождение органических анионов через биологические мембраны. Субстратами OATs / Oats являются различные эндогенные и экзогенные молекулы, такие как простагландины, гормоны, анионные метаболиты нейромедиаторов, а также лекарственные препараты и связанные с ними метаболиты [41, 78, 159, 217, 238]. Субстраты OATs / Oats, как правило, обладают отрицательным зарядом при физиологических рН и в связи с этим требуют специальной транспортной системы длч пересечения биологических мембран. Прототипом OATs / Oats субстрата является p- aminohippurate (РАН), органический анион с низкой молекулярной массой. OATs / Oats имеет широкий субстратный профиль и способен транспортировать небольшие амфифильные органические анионные соединения различной химической структуры, незаряженные молекулы и некоторые органические катионы [78, 238]. Мембранная топология OATs / Oats включает в себя 12 трансмембранных αспиралей и несколько гликизилированных и PKC участков, которые расположены на внеклеточных петлях, соединяющих 6 и 7 спирали [78, 261]. OATs / Oats экспрессирован, прежде всего в эпителиальных тканях (почки, печень), но также представлен в мозге в сосудистом сплетении и в микроциркуляторном русле головного мозга [34, 44, 163, 203, 271, 329]. OAT1 / Oat1 слабо экспрессирован в ткани мозга [38, 91, 170, 219, 240]. Белок OAT2 синтезируется в печени и мозге; однако, мРНК Oat2 была обнаружена только в сосудистом сплетении крыс [39, 54, 163, 262]. В отличие от этого, OAT3 / Oat3 является наиболее представленной в ткани мозга изоформой OAT / Oat. Oat3 является транспортером РАН, сульфата эстрона, таурохолата, охратоксина, бензилпенициллина, циметидина, ранитидина [164, 209, 284]. Исследования показали, что Oat3 играет 31 важнейшую роль в транспорте анионных нейромедиаторных метаболитов адреналина, норадреналина, дофамина, серотонина [163]. Oat3 локализуется на апикальной мембране эпителиальных клеток сосудистого сплетения, где он выступает посредником проникновения субстратов в сосудистое сплетение и из СМЖ [284]. Oat3, как известно, локализован в базолатеральной мембране и может присутствовать на апикальной мембране эндотелиальных клеток капилляров головного мозга крыс [145]. Экспрессия Oat3 на апикальной и базолатеральной мембранах делает возможной транспорт лекарственных веществ Oat3 субстратов как из крови в мозг, так и из мозга в кровь. Таким образом, эта семейство транспортеров может быть потенциальной мишенью для увеличения доставки лекарственных препаратов в ЦНС. Известно, что белок OAT4 / Oat4 может экспрессироваться в ГЭБ и BCSF барьере, но точная локализации до настоящего момента не была подтверждена. мРНК Oat4 обнаружен в эпителиальных клетках сосудистого сплетения [325]. Экспрессия OAT4 также была выявлена в клетках эндотелия микрососудов мозга человека, но только на уровне мРНК [161]. Oat4-обусловленный транспорт характеризуется как двунаправленный и натрий-независимый. Исследования показали, что Oat4 участвует в транспорте простагландинов [146]. Другие субстраты относятся к сульфату эстрона и охратоксина А [17, 44]. В настоящее время нет никаких свидетельств того, что существует экспрессия OAT5 / Oat5 и / или OAT6 / Oat6 в ткани мозга [202, 329]. Транспортеры органических катионов OСTs / Oсts Органические катионы имеют временный или постоянный положительный заряд и, следовательно, не способны в какой-либо заметной степени проникать через биологические мембраны. Такие вещества требуют определенные транспортные механизмы, позволяющие им проходить через биологические мембраны и накапливается внутри клетки [152, 202, 261]. Выявленные транспортеры органических катионов (OCTs) являются членами суперсемейства SLC22A [141] и подразделяются на две группы в соответствии с их возможностями к транспортировке. Олигоспецифические транспортеры органических катионов облегчают транспорт одного основного субстрата и / или его аналога. Эта категория OCTs включает Na+ кo-транспортеры нейромедиаторов, высокоаффинных транспортеров тиамина (витамина В1) и транспортеров холин (предшественника ацетилхолина) [331]. Полиспецифические OCTs 32 транспортируют органические катионы с различной химической структурой [73, 151, 152]. Системы OCTs дополнительно характеризуются либо как потенциалчувствительные органические катионные транспортеры (OCTs), либо как H+ градиент-зависимые оригинальные органические транспортеры (OCTNs). OCTs включают в себя транспортные системы OCT / Oct1-3, а OCTN / Octn транспортные системы включают в себя OCTN1-3 человека и Octn1-3 грызунов [104, 110, 111]. Таким образом, OCTs / Octs участвуют в притоке в клетки катионных субстратов [110, 300], а OCTNs / Octns являются посредниками клеточного эффлюкса различных катионных веществ [56, 300]. Члены семейства OCT / Oct в своей структуре имеют 12 α-спиральных трансмембранных домена с внутриклеточными N и C-терминалями. Кроме того, предположительно мембраны включает в себя большую внеклеточную петлю между TM1 и TM2, который содержит несколько N-гликозилированных участков и небольшую межклеточную петлю, соединяющею TM6 и ТМ7. C-конец содержит несколько последовательных участков киназо-зависимого фосфорилирования [56, 151, 222]. OCT / Oct1-3, в основном, локализуются на базолатеральной мембране поляризованных клеток, в том числе на клетках эндотелия микрососудов и эпителиальных клетках сосудистого сплетения. мРНК OCT1 и белок экспрессируются в эндотелиальных клетках мозга человека (cmec/D3), где OCT1 выступает посредником транспорта ламотриджина, противоэпилептического препарата [67]. В отличие от OCT1/Oct1, OCT2/Oct2 представлен в ЦНС на различных структура, таких как нейроны, сосудистое сплетение и корковые астроциты. В нейронах OCT2 опосредствует транспорт нейромедиаторов, таких как серотонин, дофамин и норадреналин [40, 113, 272]. OCT3/Oct3 экспрессируется в различных тканях организма, включая мозг [112, 142, 321]. В ЦНС, экспрессия мРНК Oct3 выше, чем Oct1 и Oct2 [323]. Oct3 был обнаружен у грызунов в нейронах и сосудистом сплетении [142, 156, 257], где он выступает посредником транспорта тетраэтиламминия (ТЕА), дофамина, серотонина и амфетаминов [323]. В дополнение к транспорту эндогенных органических катионов, OCTs/Octs могут играть определенную роль в распределении препаратов в ЦНС. Например, в исследованиях in vitro с применением иммортализованных эндотелиальных клеток капилляров головного мозга (TR-BBB13) выявлена роль транспортера органических катионов в поглощении оксикодона клетками [220]. 33 На сегодняшний день у грызунов были выявлены только три изоформы Octns, OCTN 1-3. Напротив, две OCTN изоформы, обозначенные OCTN1 и OCTN2, были выявлены у человека [150]. Все OCTNs способны транспортировать органические катионы и карнитин, аминокислоту, необходимую для транспортировки жирных кислот через внутреннюю митохондриальную мембрану для синтеза АТФ [152, 308, 312]. В то время как OCTN1 не выявлен в ЦНС человека [290], он был обнаружен в спинном мозге грызунов, в сосудистом сплетении, гиппокампе, коре и мозжечке [54, 272, 320]. В дополнение к карнитину, субстратами OCTN1 / Octn1 являются ТЕА, хинидин, холин, никотин, циметидин, и клофелин [326]. OCTN2 экспрессируется в ряде тканей, включая ткань мозга [288]. OCTN2 мРНК был обнаружен в нейронах гиппокампа, мозжечка и коры головного мозга [156, 272, 288, 322] и экспрессия белка OCTN2 / Octn2 обнаружена в первичной культуре эндотелиоцитов капилляров головного мозга коровы, свиньи, крысы и человека [238]. Функциональные исследования с участием транспорта ацетил-L-карнитина указывают, что OCTN2 локализуется на люминальной мембране ГЭБ [144, 133]. Octn3 экспрессируется на высоком уровне в печени и яичках, но нет никаких оснований полагать, что этот транспортер локализуется в ЦНС [166]. Транспортеры органических анионных полипептидов OATPs/Oatps OATPs / Oatps относятся к большому суперсемейству SLC [116]. В 2004 г. для уточнения номенклатуры и для предотвращения возможной путаницы система наименования OATPs / Oatps была пересмотрена. OATPs / Oatps отнесли к OATP/SLCO суперсемейству и подразделили на семейства, подсемейства и индивидуальные гена или продукты генов на основе филогенетических отношений [116, 246]. Члены семейства и подсемейства разделяют соответственно 40% и 60% идентичности аминокислот. Изоформы OATP человека идентифицируются символом ―OATP‖ – для написания белков и ―SLCO‖ – обозначения гена, за которым следует семейный номер, подсемейство и индивидуальный номер белка/гена. У грызунов ортолог отличается от человеческих белков и генов, строчным написанием символов (Oatp, Slco). OATPs / Oatps учавствуют в трансцеллюлярном транспорте молекул через клеточные мембраны. Эта группа транспортеров обладает широкой субстратной 34 специфичностью и участвует во всасывании, распределении и экскреции ксенобиотиков (таблица 1.2.). Таблица 1.2. Локализация членов семейства ОАТР в ЦНС и их субстраты Изоформы ОАТР Грызуны Oatplal (slcolal) Oatp1a4 (slco1a4) Oatp1a5 (slco1a5) Oatplcl (slcolcl) Oatp2a1 Локализация в ЦНС Субстраты Сосудистое сплетение BQ123, BSP-DNP-SG, холаты, кортизол, CRC220, делторфин II, DPDPE, эналаприл, эстрадиола-17 βглюкуронида, эстрон-3-сульфат, фексофенадин, гадоксетат, глутатион, глюкохолат, урсодеоксихолевая кислота, охратоксин а, уабаин, правастатин, S-динитрофенил, сульфат тауролитохолевой кислоты, тауродезоксихолевая кислота(TCDCA), тауроксенодинхолат натрия(TUDCA), таурохолевая кислота, темокаприлат ГЭБ сосудистое сплетение BQ123, холаты, дегидроэпиандростерон-сульфат (DHEAS), дигоксин, DPDPE, эстрадиола-17 βглюкуронид, эстрон-3-сульфат, фексофенадин, гликохолат, уабаин, правастатин, таурохолат, T3, T4, TCDCA, TUDCA Сосудистое сплетение Бромсульфофталин, BQ123, холаты, кортизол, дексаметазон, DHEAS, эстрадиола-17 β-глюкуронида, эстрон-3сульфат, гликохенодезоксихолиевая кислота, гликохолат, гликодезоксихолат, GW4064, олеиновая кислоты, простогландин E2, T3, T4, тауродезоксихолат, таурохолат, TCDCA, TUDCA, урсодезоксихолевая кислота ГЭБ сосудистое сплетение Эстрадиола-17 и б-глюкоронид, церивастатин, обратный T3, T4, сульфат троглитазона ГЭБ Простагландин Е2 (sclo2a1) Человек OATP1A2 (SLCO1A2) ГЭБ DPDPE, эстрон-3-сульфат, фексофенадин, гатифлоксацин, гликохолат, гидроксимочевина, иматиниб, лабеталол, левофлоксацин, ломефлоксацин, лопинавир, мезилат, микроциклин- LR, N -метилхинин, N, метилхинидин, норфлоксацин, уабаин, питаваститин, простогландин E2, соталол, рокурониум, розувастатин, обратный 35 T3, саквинавир, T4, T3, талинолол, таурохолат, тауроксенодинхолат натрия TCDCA, TUDCA, метаболиты унопростона, тауродезоксихолиевая кислота OATP3A_v1 Сосудистое сплетение Бензилпенициллин, БК-123, делторфин II, эстрон-3сульфат, простагландин E1, простагландин E2, T4, вазопрессин Сосудистое сплетение Арахидоновая кислота, БК-123, простагландин E1, простагландин E2, T4, вазопрессин (SLCO3A1_v1) OATP3A_v2 (SLCO3A_v2) OATP1C1 (SLCO1C1) OATP2B1 (SCLO2Bl) Детектированы в головном Бромсульфофталеин, эстрадиола-17 β-глюкуронид, эстмозге в мозге, рон-3-сульфат, гормоны щитовидной железы, тироксин но локализация сульфат не определена Аторвастатин, бозентан, фексофенадин, флувастатин, Детектированы монтелукаст, правастатин, питавастатин, розувастатин, в головном талинолол, бензилпенициллин, алискирен, эзетимид мозге в мозге, глюкуронид, бромосульфофталеин, дегидроэпиандроно локализация стерон-3-сульфат, эстрон-3-сульфат, глибенкламид, не определена месалазин, прегненолон сульфат, таурохолаты, , метаболиты унопростана Направленность транспорта зависит от трансмембранного градиента концентрации OATP / Oatp субстрата. Транспортный механизм OATP / Oatp натрийнезависимый и не требует затрат АТФ, чтобы транспортировать субстраты через мембраны. Аналогично другим SLC транспортерам, считается, что OATP / Oatp транспорт опосредованно регулируется электрохимическими градиентами, которые используют неорганические или органические растворенные вещества в качестве движущего фактора. Несмотря на то, что внутриклеточный бикарбонат, конъюгаты глутатиона и глутатион рассматриваются как возможные совместные транспортные субстраты, точного подтверждения этого факта получено не было [312]. Кроме того, продемонстрировано влияние на функциональную активность некоторых членов семейства OATP / Oatp внеклеточного pH. Например, было показано, что транспортная функция OATP2B1 значительно увеличивается при пониженной кислотности [249, 301]. Сродство для некоторых субстратов OATP/Oatp может быть увеличено при кислых значениях рН при протонировании остатков внеклеточного гистидина [177]. рН36 зависимость OATP2B1 транспорта является клинически значимой; OATP2B1 экспрессирован в тонком кишечнике, биодоступность OATP2B1 субстратов может быть увеличена при низких значениях pH. OATP2B1 экспрессируется также в ткани головного мозга, pH чувствительность этого транспортера может сопровождаться изменением поступления в ЦНС OATP / Oatp субстратов в ответ на изменения рН крови (т.е., при метаболическом/респираторном ацидозе и алкалозе). Тем не менее, вопрос зависимости от рН для всех OATP / Oatp членов семьи остается спорным. Хотя некоторые исследования показали, OATP1B1 и OATP1B3 являются электрогенными транспортерами с высокой чувствительностью к внеклеточным изменениям рН [189], модификации транспорта хорошо известного OATP / Oatp субстрата эстрон-3сульфата в ответ на внеклеточное подкисление не наблюдалось [186]. OATPs / Oatps широко экспрессируется в различных тканях, включая печень, почки, сетчатку глаз, легкие, семенники, щитовидную железу, селезенку, плаценту, сердце, лейкоцитах периферической крови [238, 293]. В ткани мозга, экспрессия OATP / Oatp была выявлена на эндотелиальных клетках ГЭБ и эпителиальных клетках сосудистого сплетения [238]. Из 36 OATP/Oatp изоформ, которые были выявлены, на ЦНС барьерах локализуются Oatp1a1, Oatp1a4, Oatp1a5, Oatp1c1, и Oatp2a1 грызунов и OATP1A2, OATP1C1 и OATP2B1 человека. В составе ГЭБ и BCSF барьера, OATPs / Oatps несут ответственность за проникновение в ЦНС множества амфипатических и органических соединений [155]. Члены семейств OATP / Oatp были обнаружены в клеточных компартментах паренхимы мозга, например, астроцитах и нейронах [32, 163]. Экспрессия ОАТРs человека на ГЭБ и / или BCSF барьере. В то время как экспрессия Oatps на ГЭБ грызунов была хорошо известна, идентификация OATPs на ГЭБ человека была спорной. Например, при иммунофлюоресцентном окрашивании лобной коры головного мозга человека была продемонстрирована экспрессия OATP1A2 структурах ГЭБ [170]. В противоположность этим данным, при недавнем исследовании с применением протеомического анализа получены противоречивые результаты [170, 297]. В этом протеомном исследовании было показано, что все члены семейства OATP, включая OATP1A2 в пределах чувствительности метода в образцах ткани мозга не обнаружены. Однако следует признать, что образцы 37 ткани мозга были получены от субъектов, умерших от заболеваний периферической нервной системы, и, как было показано ранее, модулирующих экспрессию транспортных белков ГЭБ [297]. Как было показано в исследованиях различных групп ученых [121, 196, 241, 260], наличие патологического стрессорного фактора может иметь драматические последствия для экспресии транспортеров ГЭБ, а, следовательно, и для доставки лекарственных препаратов в ЦНС. Таким образом, необходимо полное изучение механизмов регуляции ОАТР в состоянии здоровья и при болезни, чтобы полностью понять локализацию и функциональную экспрессию ОАТР в ГЭБ человека, а также рассматривать как возможных транспортеров для оптимизации доставки лекарственных препаратов в ЦНС. Кроме того, в работах Uchida et al. подчеркнута необходимость исследований в условиях in vivo для оценки участия изоформ ОАТР для доставки лекарств через ГЭБ в ЦНС [297]. OATP1A2 впервые выявленый OATP человека и единственная человеческая изоформа OATP/Oatp, экспрессия которого широко представлена в ГЭБ. OATP1A2 состоит из 670 аминокислотных остатков и имеет 67% идентичности с аминокислотами крысиного Oatp1a1. OATP1A2 локализован как люминальной, так и аблюминальной мембранах эндотелиальных клеток человеческого ГЭБ [170]. В число известных субстратов OATP1A2 входят антибиотики, антигистаминные препараты, противоопухолевые препараты, бета-блокаторы, сердечные гликозиды, антагонисты эндотелин-А рецепторов, препараты для терапии ВИЧ-1, ингибиторы HMG СоА-редуктазы, блокаторы нервно-мышечной проводимости, опиоидные анальгетики [246]. К эндогенным субстратам OATP1A2 относятся билирубин, бромосульфофталеин, холаты, эстрадиола-17-глюкуронид, deltorphin II, эстрон-3-сульфат, гликохолат, гидроксимочевина, PGE2, свободный T3, таурохолат, T4, T3, и метаболит унопростон [246]. У человека обнаружены два варианта сплайсинга OATP3A1 с различной локализацией в BCSF барьере [131]. В то время как OATP3A1_v1 локализуется на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток сосудистого сплетения, OATP3A1_v2 выявлен на апикальной мембране [131]. Оба варианта (OATP3A1_v1 и OATP3A1_v2) способны транспортировать лекарственные препараты (например, BQ123), а также физиологические субстратов (как, например, PGE1, PGE2, T4, вазопрессин) [246]. Эти варианты сплайсинга, тем не менее, имеют некоторые различия в субстратном профиле [131]. Показано, что deltorphin II является субстратом для конкрет38 ных OATP3A1_v1, а арахидоновая кислота является субстратом для конкретных OATP3A1_v2 [95]. В исследованиях Huber R. et al. было показано, что deltorphin II является субстратом OATP3A1_v1, в то время как арахидоновая кислота является субстратом только для OATP3A1_v2 [131]. Другие изоформы OATP, такие как OATP1C1 [225] и OATP2B1 [158] были обнаружены в ткани мозга человека, однако точная локализация и функциональная характеристика этих изоформ в ЦНС до сих пор не определены. Однако, есть свидетельства того, что эти изоформы ОАТР экспрессированы в клетках глии [38, 219], что свидетельствует о потенциальной роли OATPs в качестве детерминант при транспортировке лекарственных препаратов в ЦНС. OATP1C1 имеет более ограниченный субстратный профиль по сравнению с другими членами семейства OATP1. Хотя OATP1C1 может быть прототипом переносчиков OATP субстратов (например, бромосульфофталеина, эстрадиол-17- глюкуронида, эстрон-3-сульфата), но, прежде всего, его функция в крови и/или в ткани является транспорт гормонов щитовидной железы [126, 191, 282]. В отличие от OATP1C1, OATP2B1 участвует в транспорте многих лекарственных препаратов, в том числе аторвастатина, бозентана, фексофенадина, флувастина, монтелукаста, правастатина, питавастина, розувастатина и талинолола [240]. Другими известными субстратами для OATP2B1 являются бензилпенициллин, бромосульфофталеин, дегидроэпиандростерон-3-сульфат, эстрон-3-сульфат, эзетимиб-глюкуронид, глибенкламид, месалазин, прегненолон-сульфат, таурохолат, тебипенем пивоксил и метаболит унопростон [240]. Учитывая способность OATPs транспортировать структурно и терапевтически разнообразные препараты, OATP-опосредованная адресная доставка лекарственных препаратов представляет собой отличную возможность для эффективного транспорта лекарственных веществ в мозг. Экспрессия Оatps грызунов на ГЭБ и / или BCSF барьере. Oatp1a1 белок, состоящий из 670 аминокислотных остатков, экспрессируется в различных органах и тканях организма грызунов, включая ткань мозга [312]. Первоначально клонирован из печени крыс и с применением Real Time-PCR и была продемонстрирована экспрессия мРНК белка в сосудистом сплетении [8]. Экспрессию Oatp1a1 в сосудистом сплетении до настоящего момента подтвердить не удалось из-за 39 наличия перекрестных реакций достопуных в настоящее время антител к Oatp1a1 с другими анти-Oatps-антителами, такими например, как Oatp1a5. Профиль субстратов Oatp1a1 включает в себя соли желчных кислот, органические анионы, органические катионы и лекарственные препараты (например, правастатин, DPDPE, фексофенадин) [312]. До настоящего времени функциональная значимость Oatp1a1 в сосудистом сплетении остается неизвестной. Oatp1a4 – белок, состоящий из 661 аминокислотных остатков, экспрессирован на люминальной и аблюминальной мембранах эндотелия ГЭБ и в сосудистом сплетении грызунов [312]. Субстратами Oatp1a4 являются лекарственные препараты (опиоидные анальгетики, ингибиторы HMG CoA-редуктазы), соли желчных кислот, гормоны, пептиды и эндогенные органические катионы [118]. Вместе с Oatp1a5 на BCSF барьере и Oatp1c1 на ГЭБ, Oatp1a4 отвечает за транспорт гормонов щитовидной железы и их захват в ЦНС [118]. Hagenbuch B. et al. предположили, что Oatp1a4 является основной изоформой Oatp, экспрессированной на ГЭБ крысы, транспортирующей лекарственные препараты [116]. Например, Oatp1a4 является медиатором транспорта из крови в мозг DPDPE [241] и правастатина [294]. В исследованиях Ronaldson P.T. et al. было продемонстрировано повышение экспрессии Oatp1a4 после патологического стресса, PIP [241]. После устранения P-gp-опосредованного эффлюкса путем фармакологической ингибиции показано увеличение захвата DPDPE с помощью Oatp1a4 с 56 % в группе контрольных крыс с физиологическим раствором до 71 % у крыс, подвергнутых PIP [241]. Полученные результаты имеют важное значение постольку, поскольку они демонстрируют возможность изоформ OATP/Oatp быть реальными целями для доставки в мозг лекарственных препаратов. Oatp1a5 состоит из 670 аминокислотных остатков и из семейства Oatp наиболее широко экспрессирован на BCSF барьере грызунов [164, 219, 312]. В частности, Oatp1a5 локализован на апикальной поверхности эпительальных клеток сосудистого сплетения. В число субстратов Oatp1a5 входят соли желчных кислот, конъюгатов стероидов и гормонов щитовидной железы [118]. Присутствие Oatp1a5 с противоположной стороны мембраны от Oatp1a4 и Oatp1c1 могло бы облегчить транспорт общих субстратов в СМЖ или из СМЖ [312]. Oatp1c1 белок состоит из остатков 716 аминокислот и экспрессирован на ГЭБ и BCSF барьере. На ГЭБ Oatp1c1 локализован на люминальной и аблюминальной мем40 бранах эндотелиальных клеток ГЭБ грызунов [312]. В сосудистом сплетении Oatp1c1, в первую очередь, локализован на базальной мембране эпителиальных клеток [312]. Oatp1c1 имеет более ограниченный субстратный профиль, чем большинство других OATPs / Oatps и его основной функцией является высокоафинный транспорт тироксина [280].В дополнение к транспорту тироксина, Oatp1c1 транспортирует измененный Т3 (3,3',2,5'-трийодтиронин), церивастатин и эстрадиол E217βG [312]. Oatp2a1 у грызунов экспрессирован во многих тканях организма и транспортирует исключительно PGE2 [199]. В ГЭБ Oatp2a1 локализуется от люминальной мембраны с преимущественной экспрессией цитоплазме; предполагается, что этот транспортер играет определенную роль в физиологии лихорадки [149]. Oatp2b1 был обнаружен в ткани мозга грызунов, но до настоящего времени его точная локализация в структуре ГЭБ не выяснена [312]. BSAT1 (blood-brain barrier-specific anion transporter 1) Oatp14 (Оatp1c1; Slc21a14) –является новым членом семейства транспортеров органических анионных полипептидов (OATP / Oatp). Методом Norten blot было продемонстрировано преобладание экспрессии Oatp14 в ткани мозга. В тоже время, мРНК Oatp14 не было обнаружено в других тканях, в том числе, в сердце, селезенке, легких, печени, скелетных мышцах, почках и яичках. При Western blot была показана экспрессия данного белка в капиллярах головного мозга и сосудистого сплетения. Методом иммуногистохимического анализа, проведенного с применением антиOatp14-антител, получены данные об экспрессии Oatp14 в культуре клеток почки эмбриона человека HEK293. Основной функцией Oatp14 является транспорт тироксина (Т4, протиреоидного гормона) (Km = 0,18 μM), а также амфипатических органических анионов, таких, как 17β эстрадиол-D-17β-глюкуронида (Km = 10 μM), церивастатина (Km = 1,3 μM) и троглитозона сульфата (Km = 0,76 μM). Поглощение трийодтиронина (Т3), активная форма, происходящая из Т4, была занчительно выше у клеток с экспрессией Oatp14, чем в вектор-трансфекцированных клетках, но транспорт Т3 был примерно в 6 раз ниже, чем транспорт Т4. Эффлюкс Т4, предварительно поступившего в клетки, из Oatp14экспрессировавнных клеток был также более быстрым, чем из клеток, трасфекцированных вектором (0,032 против 0,006 мин-1). В связи с этим, можно заключить, что 41 Oatp14 может выступать в качестве посредника двунаправленного переноса Т4. Сульфобромофталеин, таурохолат и эстрона сульфат являются сильными ингибиторами для Oatp14, в то время как дигоксин, p-aminohippurate, лейкотриен C4 или органические катионы, такие как тетраэтиламмоний или циметидин не имеют никакого эффекта воздействия. Уровни экспрессии мРНК Oatp14 и белка могут повышаться или снижаться регуляцией в условиях гипо- и гипертиреоза. Таким образом, можно предположить, что Oatp14 играет важную роль в поддержании концентрации Т4 и, в конечном счете, Т3 в ткани мозга путем транспортировки Т4 из кровотока в ткань мозга. Li et al. [178] в своих исследованиях с использованием методов генной инженерии сравнили ГЭБ-специфический анионнный транспортер 1 (BSAT1) экспрессии генов из капилляров головного мозга с выделенными из печени и почек. кДНК BSAT1 состоит из 2148 пар оснований, которая кодирует белок, состоящий из 716 аминокислотных остатков с 12 трансмембранными доменами. BSAT1 широко экспрессируется в капиллярах мозга по сравнению с гомогенатом мозга, печени и почек. Сравнение кДНК последовательностей BSAT1 показало, что он является 14-м членом Oatp / OATP семьи (Oatp14). Тиреоидные гормоны играют важную роль в правильном развитии центральной нервной системы и периферических тканей млекопитающих. Недостаток тиреоидных гормонов отражается на развитии практически всех органов и систем, развивается синдром называемый кретинизмом [221, 265]. В частности, гипотиреоидизм в неонатальном периоде является причиной серьезных повреждений нервных клеток и приводит к отставанию в развитии [86]. Хотя тироксин является основным секретируемым гормоном, действие тиреоидных гормонов в основном обусловлено дейодированием Т4 в биологическую активную форму 3,3 5-трийодо-L-тиронин, с последующим связывание Т3 со специфическим ядерным рецептором. Перед тем, как гормон достигает своей внутриклеточной цели, он обязан проникнуть сквозь плазматическую мембрану. Учитывая липофильную структуру тиреоидных гормонов, считалось, что они транспортируются через плазматическую мембрану посредством простой диффузии. В последнее десятилетие выдвинута теория о наличии систем, транспортирующих тиреоидные гормоны, в разнообразных тканях [302]. Таким образом, процесс поглощения мозгом T4 из циркулирующей крови является первым шагом во всех последующих реакциях гормонов щитовидной железы в 42 головном мозге. Вопрос о том, что существуют ли конкретные транспортные механизмы для проникновения Т4 в клетки эндотелия капилляров головного мозга до остается спорным. Трансфекция кДНК Oatp14 в клетки HEK293 приводит к значительному увеличению захвата T4, а также измененного Т3 и неактивных метаболитов Т4. Поглощение T3 у Oatp14-экспрессированных клеток было значительно выше, чем у трансфицированных вектором клеток. Окончательно не известно, объяснять ли поглощение Т3 трансфицированными вектором в клетках конкретной транспортной системой или пассивной диффузией. Вовлечение Oatp14 в поддержании гомеостаза Т4 в ткани мозга также является результатом изменения уровней экспрессии Oatp14 в капиллярах мозга в условиях гипо- и гипертиреоза. Экспрессия Oatp14 в мозговых капиллярах изменяется таки образом, как будто Oatp14 отвечает за поддержание концентрации Т4 в центральной нервной системе: регулируется «вверх» и «вниз» в соответствии с гипотиреозом и гипертиреозом [86]. Таким образом, Oatp14 участвует в поглощении T4 через капилляры мозга. С помощью Western blot анализа Oatp14 был обнаружен в сосудистом сплетении боковых, третьего и четвертого желудочках. Распределение в мозге Т3 и Т4 после интрацеребровентрикулярного введения ограничивается эпендимными клеткам, то таким образом, транспортировка по сосудистому сплетению может распределиться в мозге вблизи желудочков [72]. В дополнение к транспорту гормонов щитовидной железы, Oatp14 принимает участие в переносе определенных типов амфипатических органических анионов, таких как E217βG, церивастатина и троглитозона сульфата, хотя их транспортная деятельность была заметно ниже, чем для Т4, за исключением троглитозона сульфата. Поскольку Oatp14 может опосредовать двунаправленный транспорт, вполне возможно, что Oatp14 участвует в эффлюксе из мозга органических анионов, таких как E217βG при проведении микроинъекций в кору головного мозга и, возможно, в эффлюксе из ткани мозга избыточного количества Т4 и измененного T3. Белок OATP-F, изоформа, высоко гомологичная Oatp14 (84% по уровню аминокислот), также имеет аналогичный Oatp14 субстратный профиль [225]. Northern blot анализ продемонстрировал богатую экспрессию OATP-F в ткани мозга и яичках и, в меньшей степени, в ткани сердца, однако локализация в OATP-F в ткани головного мозга до сих пор остается неясной. С точки зрения субстратной специфичности и гомологии, OATP-F должен быть человеком ортолог Oatp14, и можно предположить, 43 что OATP-F также участвует в захвате T4 из циркулирующей крови в ЦНС. Ввиду важности функции T4 в головном мозге во время развития, вполне возможно, что функциональная потеря гена OATP-F может быть связана с дефицитом гормонов щитовидной железы, а также связанной с этим расстройством устойчивостью к гормональной терапии щитовидной железы. 44 ГЛАВА 2. Материалы и методы Для выполнения поставленной цели и задачи использовали совокупность иммунохимических, биохимических и культуральныхметодов. Для получения гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к BSAT1 пользовались общепризнанной схемой слияния по G. Köler и C. Milstein [153] в нашей модификации [339, 341]. Моноклональные антитела из асцитической жидкости выделяли с помощью иммунноаффинной хроматографии на CN-бромированной сефарозе с иммобилизованными гомогенными препаратами соответствующих антигенов по известной методике, предложенной Weir D. («Handbook of experimental immunology», 1978 г.). Анализ антител к исследуемому белку проводили с помощью иммуноэлектрофореза в различных модификациях; иммуноблотта, иммунодиффузионного анализа, иммуноферментного анализа, а также аналитического диск-электрофореза с додецилсульфатом натрия. Характеристика исследуемого материала Животные Лабораторных животных (крыс и мышей) получали из Питомника «Государственное учреждение Научный центр биомедицинских технологий РАМН», филиал Андреевка, адрес Московская область, Солнечногорский район, пос. Андреевка, директор Афонин К. В., тел. главного технолога +7 (917) 551-00-81. До проведения экспериментов животные находились в Клинике лабораторных животных ФГБУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского», руководитель – Ионова К.П. Крысы и мыши содержались в отдельных боксах, по 10 особей в каждой клетке, при нормальном световом режиме; доступ к воде и питанию свободный. В ежедневный рацион животных входили овощи, хлеб, каша, мясо, сухой корм с необходимым содержанием витаминов и микроэлементов. Санитарный контроль осуществляет Станция по борьбе с болезнями животных Центрального округа, адрес ул. Красносельская, д. 14, директор Селиверстов В.В., главный врач Старостина Светлана Александровна, тел. +7(495)264-88-81. Для получения гибридом использовали половозрелых самок мышей линии Balb/C, в возрасте 6-7 недель, весом 25-30 г. Сертификат выдан 01.12.10 № 25786 ве45 теринарное свидетельство от 1.12.10 250 № 0263832. Экспериментальное моделирование глиом [46] проводили на 4-х месячных половозрелых самках беспородных белых крыс весом 250 г. Сертификат выдан 02.11.10 №25765, ветеринарное свидетельство от 2.11.10 250 № 0219995. Условия содержания мышей и крыс, и все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (Приказ № 755 от 12.08.1977), «Правилами лабораторной практики в Российской федерации», утвержденным МЗ РФ (Приказ № 267 от 19.06.2003), Правилами биоэтики, утвержденными Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Директива 86/309 Европейского сообщества от 24 декабря 1986 г., Страсбург). Культуры клеток Культивирование всех клеточных линий, применявшиеся в научной работе проводили в стандартной среде RPMI-1640, F-12 или DMEM («Invitrogen») с добавлением 1% 200 мМ L-глутамина («Invitrogen», США), 1% Antibiotic-antimycotic solution (пенициллин 10000 ед/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл и амфотерицин B 25 мкг/мл, «Invitrogen», США), 1% 100 мМ пирувата натрия («Invitrogen», США) и 10% сыворотки новорожденных телят (FCS) («Invitrogen», Южная Америка). Клетки культивировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO2 в пластиковых флаконах или 96- и 24-луночных плашках («Corning», США). Количество клеток в объеме среды подсчитывали в камере Горяева по формуле: х = (a b) / c где х – искомое количество клеток в 1 мм3; а – сумма клеток, сосчитанных в определенном объеме камеры; b – разведение среды с клетками; с – количество подсчитанных малых квадратов. Определение жизнеспособностиклеток проводили путем окрашивания 0,4 % раствора трипанового синего. 46 Культура клеток миеломы мышей линии Balb/C Sр2/0-Ag14 Линия Sр2/0-Ag14 (ATCC № CRL1581) – это клетки миелома мыши (Musmusculus, B лимфоциты), гибрид P3X63Ag8 (Nature 1978. 276: 269; J. Immunol. 1981. 126: 317-321). Рисунок 2.1. Культура клеток линии Sр2/0-Ag14 (ATCC № CRL1581). Морфологически – лимфобластоподобные клетки, растут в суспензионной культуре. Они являются дефектными по ферменту ГГФРТ (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе), что обусловливает их чувствительность к среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин (НАТ) и устойчивость к антиметаболиту 8-азагуанину. Однако иногда миеломные клетки Sр2/0-Ag14 теряют устойчивость к 8азагуанину и приобретают способность расти и размножаться в среде НАТ. Вследствие этого, при использовании клеток-ревертантов для гибридизации, они будут расти в селективной среде, тормозить рост и маскировать наличие образовавшихся гибридом. И хотя у линии Sp2/0 очень низкий процент реверсий по сравнению с другими миеломами мышей, перед слиянием клетки культивировали в среде с добавлением 13,2 мМ 8-азагуанина («Sigma», США) для селекционного удаления ревертантных клеток с «диким» фенотипом, т.е. с активным ГГФРТ. Наращивание клеток Sp2/0-Ag14 проводили в среде RPMI-1640 («Invitrogen», 47 США) с добавлением 1 % 100 мМ пирувата натрия («Invitrogen», США), 1 % 200 мМ L-глутамина («Invitrogen», США), 1 % Antibiotic-antimycotic solution («Invitrogen», США) и 10 % FCS («Invitrogen», Южная Америка) при плотности клеток в культуре от 5 104 до 5 105. Смену ростовой среды проводили каждые 2-4 дня. Культура клеток глиомы С6 крысы Линия С6 глиомы (ATCC №CCL107), крысиная глиома (Rattus norvegicus, глиальные клетки), индуцированная in vivo N-нитрозометилмочевиной, моноклональная клеточная линия (Science 1968. 161: 370; Fed.Proc. 1968. 27: 720). Морфологически – фибробластоподобные клетки, рост адгезивный. Для наращивания замороженные клетки линии С6 быстро размораживали, отмывали центрифугированием от диметилсульфоксида, затем ресуспендировали в 6,0 – 8,0 мл среды F-12с добавлением 1 % 200 мМ L-глутамина («Invitrogen», США),1 % 100 мМ пирувата натрия («Invitrogen», США), 1 % Antibiotic-antimycotic solution («Invitrogen», США) и 10 % FCS («Invitrogen», Южная Америка), и высаживали в культуральные матрасы объемом 72 см2. Культивировали до образования монослоя со сменой среды 2-3 раза в неделю, после чего проводили ферментативную диссоциацию (0,05 % трипсин-ЭДТА, «Invitrogen», США). Клетки отмывали центрифугированием (1000 g, 10 минут), затем ресуспендировали в ростовой среде F-12 («Invitrogen», США) и рассаживали в 96-луночные плашки для проведения дальнейшего иммуноцитохимического анализа. Первичная культура церебральных эндотелиоцитов крысы Получение первичной культуры церебральных эндотелиальных клеток из мозга крысы проводили согласно описанным в литературе протоколам [207, 247, 285] в нашей модификации. Кору головного мозга 1,5-3-х месячных крыс освобождали от мозговых оболочек под контролем бинокулярной стереоскопической лупы («Leica», Германия). Скальпелем измельчали ткань серого вещества в холодной среде DMEM («Invitrogen»). Измельченную ткань пастеровской пипеткой осторожно переносили в центрифужную пробирку и осаждали при 1500 об/мин 5 мин. К полученному осадку добавляли раствор коллагеназы 2 типа (1 мг/мл) («Worthington Biochemical Corp.», США) и инкубировали 1,5 часа при 37ºС на шейкере. Процесс ферментативной дис48 социации останавливали добавлением холодной среды DMEM-F12 («Invitrogen»), содержащей 10 % FCS («Invitrogen»), и центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин. Для отделения ткани от миелина полученный гомогенат суспендировали в 25 % растворе БСА, центрифугировали при 2400 об/мин в течение 20 минут, после чего очищенную фракцию микрососудов подвергали одночасовой ферментативной инкубации в растворе коллагеназы (1мг/мл). Заключительный этап очистки проводили на 33 % градиенте перколла («GE Healthcare», США). Фракцию, содержащую микрососуды и эндотелиальные клетки, дважды промывали в среде DMEM и высевали на культуральный пластик, предварительно покрытый раствором фибронектина и коллагена (0,1 мг/мл) («Sigma-Aldrich»). Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10 % FCS, 1,5 нг/мл bFGF, 100 мкг/мл гепарина, 50 мкг/мл добавки для роста эндотелиальных клеток (ECGS) («Sigma-Aldrich»), 5 мкг/мл добавки инсулин-трансферрин, 50 нг/мл гидрокортизона и 2мМ L-глютамина. Чтобы исключить возможность пролиферации неэндотелиальных клеток, в течение первых двух дней клетки культивировали в селективной среде – ростовой среде, содержащей пуромицин (4 мкг/мл). Контроль роста клеток осуществляли с помощью фазовоконтрастной микроскопии (DMI 6000 «Leica», Германия). Получение первичной культуры астроцитов неонатального мозга крысы Работа выполнялась на абортивном материале, все операции вплоть до ферментативной диссоциации проводились на холоду в стерильных условиях с использованием среды и буфера, содержащих антибиотик. Применяли адаптированную нами методику, описанную D. Weinstein [309]. Осторожным скольжением закрытых ножниц вдоль черепа производили скальпирование, освобождались от кожных покровов. При максимальном угловом наклоне лезвий ножниц разрезали череп по обеим сторонам от его основания до венечного шва, достигнув положения которого, производили поперечный разрез, избавляясь тем самым от переднего отдела мозга. Далее отделяли мозжечок от прилежащих затылочных долей полушарий головного мозга и переносили его в чистую чашку Петри с небольшим количеством буфера PBS с добавлением глюкозы. Удаление мозговых оболочек производили под контролем стереомикроскопа Leica, эта процедура снижает вероятность контаминации фибробластами, поэтому 49 важно было избавиться от несущих капилляры мембран. Дважды промывали мозжечок буфером PBS с глюкозой в новой чашке Петри и далее добавляли раствор трипсина с ДНКазой в объѐме необходимом, чтобы покрыть весь мозжечок (6 мл) и переносили стерильно запечатанную чашку в термокамеру на 3 мин с температурой 37ºС. После инкубации с ферментами отмывали двукратно буфером, вновь добавляли раствор ДНКазы и осторожно суспендировали ткань. По мере того, как суспензия становилась более гомогенной, отделяли супернатант от осадка. Для этого производили 10 циклов суспендирования – неполного осаждения, надосадок переносили в 50 мл флакон («Corning») и ещѐ раз повторяли процедуру. Собранный таким образом гомогенат проводили через фильтр 20 мкм («Fisher») и собирали клеточную суспензию в 15 мл флакон («Corning»), после чего осуществляли фракционирование в течение 1 мин на 150g с соблюдением теплового режима 4ºС. Для разделения на градиенте плотности Перкола ресуспендировали полученный осадок в растворе ДНКазы с PBS, обогащенном добавлением глюкозы и MgSO4 (соотношение 1:1) и осторожно наносили на сформированный градиент, центрифугировали 10 мин на 150 g и 4ºС. Обогащенная астроцитами фракция мигрирует в 30% градиент Перколла и оказывается верхним слоем во флаконе. Прогретым на огне концом пастеровской пипетки отбирали фракцию астроцитов, клетки которой вследствие адгезии друг к другу представляли единую взвесь и отделялись от прилежащего слоя нейрональных клеток. Перенесенную в свежий флакон 15 мл суспензию астроцитов доводили до верхнего объема PBS c глюкозой и центрифугировали при 150 g в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в среде DMEM/F12 («Invitrogen») с добавлением 2 % FBS («Invitrogen»), производили подсчет клеток в камере Горяева с применением трипанового синего и высаживали клетки на покрытый поли-L-лизином культуральный флакон 25 см2 в количестве 5·104 клеток/мл. Помещали в инкубатор в условия влажной атмосферой воздуха и температуры 37°С. Для избавления культуры астроцитов от нейронов проводили дополнительный этап очистки. Через 3 часа после процедуры выделения герметично закрытый культуральный флакон помещали на платформу с возратно-поступательным движением 200 rpm. Открепившиеся клетки наблюдали с помощью фазово-контрастной микроскопии и затем отмывали средой DMEM/F12, после чего во флакон добавляли свежую культуральную среду. Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с 10% FBS, пеницилли50 ном (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Через каждые пять пассажей проверяли экспрессию глиофибриллярного кислого белка (GFAP) и нестина. Реактивы, применяемые при получении первичной культуре астроцитов неонатального мозга крысы приведены в таблице 2.1. Таблица 2.1. Список реактивов, применяемых при получении первичной культуре астроцитов неонатального мозга крысы Реагент Состав реактивов Режим хранения Раствор ДНКазы 7,5 мг ДНКазы (Worthington) в DMEM/F12 -20ºС Раствор трипсина – ДНКазы 50 мг трипсина (TRL, trypsin, Worthington), 5 мг ДНКазы -20ºС (DP, DNase, Worthington) в 15 мл PBS/глюкозы, с содержанием 5 мг/мл MgSO4 и добавлением 90 мкл NaOH. Буфер PBS с до900 мл 1xPBS без Ca2+ Mg2+, 2 г глюкозы, pH до 7,4 1М +4ºС бавлением глюко- НCl и добавляли дистиллированную деонизированную возы ду до 1 л. Изоперколл 90 мл Перколла (Pharma Biotech), 10 мл 10х PBS +4ºС Перколл 30 % 30 мл изоперколла, 60 мл PBS с глюкозой +4ºС Перколл 60 % 60 мл изоперколла, 30 мл PBS с глюкозой +4ºС Получение первичной культуры эндотелиоцитов пуповины человека (HUVEC) Для получения первичных культур эндотелиоцитов из вены пуповины человека использовали модификацию методики, описанной Jaffe E.A. et al. [207]. Биологический материал получали из акушерской клиники в соответствии с этическими нормами, с согласия рожениц. Полость вены промывали DPBS («Invitrogen») до полного удаления крови, заполняли 0,2 % раствором коллагеназы в DPBS и подвергали ферментативной диссоциации. Пуповину переносили в стакан с DPBS, содержащим 0,9 mM CaCl2, 0,493 mM MgCl2, 5,56 mM глюкозу, 0,327 mM пируват натрия и инкубировали при 37С 20 минут. После инкубации раствор коллагеназы, содержащий клетки, собирали в пробирку 50 мл; оставшуюся коллагеназу собирали перфузией вены 20 мл среды 199 («Invitrogen»). К собранному элюату добавляли среду 199 с 10% эмбриональной cыворотки теленка (FBS) и центрифугировали 51 10 минут при 250 g. Супернатант удаляли, осадок клеток суспендировали в DMEM/F12 («Invitrogen»), содержащей 10% эмбриональной бычьей cыворотки (FBS), 2mM L-глютамина, 20 ng/мл bFGF («Sigma»), 120 мкг/мл гепарина, ростовую добавку для роста эндотелиальных клеток больших сосудов - LSGS («Invitrogen»), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали в культуральных пластиковых флаконах, 25 см2 («Corning-Costar») при 37С во влажной атмосфере с 5% СО2. Культуры пассировали с использованием раствора трипсин (0,02%) – ЭДТА (0,01%). Чистоту культур оценивали по типичной для эндотелиальных клеток морфологии (cobblestone) с помощью фазово-контрастной микроскопии, а также по экспрессии антигена вон Виллебрандта (VFW) и захвату липопротеина Dil-Ac-LDL. Подготовка субстрата для культивирования эндотелиальных клеток Весь используемый пластик и стекла для культивирования эндотелиальных клеток покрывали субстратом, который представлял смесь фибронектина, полученного из плазмы быка (Sigma-Aldrich) и IV типа коллагена, выделенного из плаценты человека (Sigma-Aldrich). Поскольку оба вещества представляют собой лиофилизованный порошок, перевод их в жидкое состояние осуществляли по инструкции производителя. Коллаген растворяли в 0,5 М уксусной кислоте до концентрации 1 мг/мл, аликвоты хранили при -20С. Фибронектин растворяли в дистиллированной стерильной воде до концентрации 1 мг/мл, и на 30 минут переносили пробирку с гликопротеином в термокамеру с температурой 37С. Растворенный фибронектин, избегая пипетирования, разносили по аликвотам объемом 0,4 мл в ампулы, не допуская повторного размораживания и оттаивания препарата. Для получения субстрата, на котором росли клетки, отдельно разводили в PBS коллаген до концентрации 5 мкг/мл и фибронектин до 1 мкг/мл, осторожно соединяли оба раствора в одной пробирке и затем покрывали минимальным объемом всю поверхность культурального пластика. Оставляли сушиться при комнатной температуре в течение 45 минут в условиях стерильного ламинара. На подготовленный таким образом пластик, стекла для иммуноцитохимии или культуральные вставки Transwell высаживали клетки или же хранили при +4С в стерильных емкостях до использования (не более 4 недель). 52 Совместное культивирование эндотелиоцитов с астроцитами Все опыты по оценке влияния факторов, модулирующих структурные свойства эндотелиальных клеток, проводились на вставках Transwell (Corning-Costar), cнабженных полупроницаемыми поликарбонатными мембранами с размером пор 0,4 мкм, позволяющими разделить астроциты и эндотелиоциты, не ограничивая при этом их коммуникацию посредством обмена ростовыми факторами, цитокинами и другими активными соединениями. В наших опытах был выбран следующий вариант кокультивирования эндотелиальных клеток и астроцитов: - эндотелиальные клетки, растущие на внутренней стороне полупроницаемой мембраны, астроциты – на внешней поверхности той же мембраны; Приведенная на рисунке 2.2. схема отражает последовательность действий при кокультивировании. Transwell астроциты Ростовая среда эндотелиоциты поликарбонатная мембрана 1 2 Рисунок 2.2. Схема создания ко-культуры эндотелиоциты-астроциты. 1 – Астроциты в небольшом объѐме среды высаживали на внутреннюю сторону культуральной вставки Transwell. Культивирование астроцитов проводили в течение 2 суток. 2 – Эндотелиальные клетки высеивали в лунки 48-луночных планшетов на покровные стекла. Этот день считают первым днем совместного культивирования с астроцитами. Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к BSAT1, получение моноклональных антител и их характеристика Техника продукции моноклональных антител была разработана Georges Köler и Cesar Milstein как часть их совместного исследования понимания механизмов разнообразия антител [153]. Это прекрасный пример того, как фундаментальные академические исследования могут привести к решению широкого ряда прикладных аспектов науки, техники и клинической медицины. В признание важности, 53 значимости этих исследований Köler G.и Milstein C. были награждены Нобелевской премией по медицине в 1984 г. Суть этой техники сводится к слиянию В-лимфоцита, обладающего свойством специфической продукции антител, но который не может жить более нескольких дней в культуре с миеломной клеткой, потерявшей способность продуцировать антитела, но которая имеет свойства бессмертия. Продуктом слияния таких клеток является «гибридомная клетка» или «гибридома», которая может жить вечно (посредством идентичных митотического клеток) и клеточного которые могут деления давать секретировать клоны абсолютно антитела заданной специфичности. Синтезируемые гибридомами моноклональные антитела быстро нашли соответствующее применение в самых различных вариантах иммунохимического анализа. Преимущества применения моноклональных антител перед поликлональными обусловлены, в первую очередь, тем, что моноклональные антитела полностью идентичны между собой и обладают способностью связывать только один эпитоп молекулы антигена. Благодаря тщательному скринингу и отбору гибридных клонов, участие в перекрестных реакциях моноклональных антител практически исключено, что объясняет высокую специфичность диагностических тест-систем на их основе, а также возможность их полноценной стандартизации. Техника получения моноклональных антител является довольно сложной, так как в действительности реальным источником иммунных В-клеток (лимфоузлы или селезенка грызунов) является смесь большого количества клеточных линий. В связи с этим, необходимо провести гибридные клетки через серию селекционных процедур для элиминации гибридом, которые не продуцируют антител, или, что важно, продуцируют антитела другой специфичности, или же низкой аффинности. Выделение индивидуальных клонов гарантированной моноклональности гибридомных клеток и антител, которые секретируются ими, является также важной, ключевой процедурой. В соответствии с целью и задачами работы мы получали моноклональные антитела к препарату рекомбинантного экстраклеточного фрагмента специфического для эндотелиоцитов церебральных микрососудов транспортера органических анионов BSAT1. 54 Для получения гибридных клеток, синтезирующих моноклональные антиBSAT1-АТ мы использовали методику Köhler G., Milstein C. в незначительной нашей модификации [48, 153, 337, 339, 341]. Схема получения моноклональных антител к BSAT1 приведена на рисунке 2.3. 1 3 4 2 5 6 7 8 9 Рис. 2.3. Принципиальная схема получения моноклональных анти-BSAT1-антител 1 – иммунизация мышей BSAT1 антигеном; 2 – выделение суспензии клеток селезенки; 3 – культура клеток миеломы (линия Sp2/0-Ag14); 4 – суспензия миеломных клеток; 5 – неслившиеся клетки селезенки; 6– неслившиесямиеломные клетки; 7 – слившиеся гибридные клетки; 8 – гибридома; 9 – продукция моноклональных анти- BSAT1-антител. 55 Процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка клеток миеломной линии Sр2/0 к слиянию; проведение процедуры слияния клеток миеломной линии Sр2/0 и Влимфоцитов селезенки иммунизированной мыши; проведение процедуры селекции на среде НАТ; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и реклонирование; массовая наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител. Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 6-8 месяцев. Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела в качестве антигена применяли препарат рекомбинантного BSAT1. Получение рекомбинантного экстраклеточного домена цереброспецифического анионного транспортера BSAT1 Цереброспецифический анионный транспортер BSAT1 был выбран нами вследствие своей избирательной локализации на люминальной мембране дифференцированных ЭЦМС, образующих гематоэнцефалический барьер. Идентичность BSAT1 крысы и человека (ген S1C1_HUMAN) составляет 84 %. Идентичность BSAT1 с другими представителями семейства OATP, экспрессированными в печени, селезѐнке, почках и лѐгких (ОАТР1-6) не превышает 50 %, что делает возможным получения антител, специфически распознающих BSAT1 и не взаимодействующих с другими органическими анионами [178, 279, 280]. Анализ первичной структуры, физико-химических свойств и мембранной топологии BSAT1 показал, что у этого белка минимум 10 трансмембранных доменов (по данным других исследователей — 12) (рисунок 2.4.). Аминокислотная последовательность этого домена: EKYSYEKYERYSPSSNLTPNISPCYLESSSPSPRSIVGKSQNKINDECEVDTSSSMW 56 MDTSSKENAHLFHKNSAQPAGGPSFKAGYPSTEEARPCCGKLKVFLGALSFVYFAKALTEGYLKSTITQIERRFDIPSSL VGIIDGSFEIGNLLVITFVSYFGAKLHRPKIIGAGCLVMGFGTMLIAVPQFFMEKYSYEKYERYSPSSNLTPNISPCYLE SSSPSPRSIVGKSQNKINDECEVDTSSSMWVYVFLGNLLRGLGETPIQPLGIAYLDDFASEDNAAFYIGCVQTVAIIGPI FGFLLGSLCAKLYVDIGFVNLDHITITPKDPQWVGAWWLGYLIAGFLSLLAAVPFWCLPKTLPRSQSREDSGSSSEKSKF ITDDPVNYQMAPREESMKIMEMARDFLPSLKSLFRNPVYILYLCASTVQFNSLFGMVTYKPKYIEQQYGQSSSKANFVIG LINIPAVALGIFSGGIVMKKFRLGICEATKLYLGSSVFGYLLFLSLFALGCENSSVAGLTVSYQGTKPVSYHERALFSDC NSRCKCSDSKWEPMCGDNGITYASACLAGCQSSSRSGKNIIFSNCTCVGFAAPKSGNWSGMMGRCQKDNGCSQMFLYFLV ISVITSYTLSLGGIPGYILLLRCIQPQLKSFALGIYTLAVRVLAGIPAPVYFGVLIDTSCLKWGFKKCGSRGSCRLYDSH AFRHIYLGLTTLLGTVSVFLSTAVLLVLKKKYVSKRSSFITAREKIVMSSSVKKETCAARDHGLQPKYWPGKETRL Рисунок 2.4. Первичная структура белка BSAT1 крысы (716 а.о., pI 8,8; 10 трансмембранных сегментов) и топология, выявленная с помощью программ HMMTOP, TMHMM, TMPred. Черным цветом указаны внутриклеточные регионы; Зеленым и подчеркнуты – трансмембранные участки; Синим – внеклеточные петли; Для дальнейших исследований был выбран один из наиболее крупных экстраклеточных фрагментов, соответствующий 134 — 190 а.о. в аминокислотной последовательности, обозначенный BSAT1134-190 (57 а.о., 6,5 кДа, pI 4,8). Этот фрагмент характеризовался наименьшей гомологией с другими органическими анионами семейства OATP, локализованными в различных органах и тканях. Структура соответствующей кДНК (2151 нт): atggacacttcatccaaagaaaatgcccatttgttccacaaaaattcagcgcaacctgccggagggccatcttttaaagc gggatatccgtccacagaggaagcgcggccatgctgtggaaaactcaaggtgttcttaggtgccctgtcttttgtttact ttgccaaagcattgacagaaggctacctgaagagcactattactcagatagagagaaggtttgatatcccttcctctctg gtgggaataattgatggtagtttcgaaattgggaatctcctggtcataacattcgttagctactttggtgccaaacttca caggccaaaaataattggagcaggatgcctggtcatgggctttggaactatgctcatcgcagttccccagttcttcatgg 57 agaagtacagctatgagaaatatgagaggtattctccctcctccaacctcactcccaacatctctccgtgctacctagag tccagcagtccatcaccacgctcaatcgtggggaaatcacaaaacaagataaacgatgagtgtgaagtggataccagttc ctccatgtgggtttatgtcttcctgggaaaccttctccgaggattaggggaaactcctatccaacccctgggcatcgcct acctggatgatttcgccagtgaagacaatgctgccttctacatcgggtgtgtgcagacagtggcaattatagggcccatt ttcggcttcctcttgggttcattatgtgccaaactctatgttgatattggctttgtgaatctagaccacataactatcac cccaaaggatccccagtgggtcggggcctggtggcttggttacctaatagcagggttcctaagtcttcttgcagccgtgc ctttctggtgcttacccaagactctaccaagatcccaaagtagagaggactccggctcctcctctgagaaatccaagttc attacagatgaccctgttaactaccaaatggcccccagagaagaaagcatgaaaatcatggaaatggcgagggattttct tccatcactgaagagtctttttagaaatccagtatacatcttatacttgtgtgcaagcactgttcagttcaattctctat tcggcatggtcacatataaaccaaagtacattgagcagcagtatgggcagtcttcctccaaagccaactttgtcattggt ctcatcaatattcctgcagtggcccttggaatattctctgggggaatagttatgaaaaaattcaggctgggtatttgtga agctacaaaactctacttgggatcatctgtctttggctacctcctcttcctctctctgtttgcactgggatgtgaaaatt ccagtgtggccggactaactgtctcctaccaaggaaccaaacctgtctcttatcatgaacgagctctcttttcagattgc aactcaagatgcaaatgttcagactcaaaatgggagcccatgtgtggggacaatgggattacctatgcgtcggcttgtct tgctggctgtcaatcctccagccggagtggaaagaacattatattttctaactgcacttgtgtgggatttgctgccccta aatcaggaaactggtcaggcatgatgggcaggtgtcagaaagataatggatgttcccaaatgtttctgtatttccttgtg atttcagtcatcacatcatatacattatctctaggtggcatacctggatatatattactcttgaggtgcattcaaccaca acttaagtcttttgctctgggcatctacaccttagcagtaagagttcttgcaggaatcccagcccccgtgtactttggtg ttttaatcgacacttcgtgcctcaagtggggatttaagaaatgtggaagcagaggctcctgcagactgtacgactctcat gctttcagacatatatacctgggactaaccacgctcttgggcacggtgtctgtcttcctaagcacggctgtgcttttggt tttaaagaaaaaatacgtctcaaaacgcagcagcttcataaccgcaagagaaaaaatagtgatgtcctcaagcgtcaaaa aggagacgtgtgccgcaagggatcatgggttgcagcccaagtactggccaggcaaggagacccgactttaa 58 Таблица 2.2. Результат анализа мембранной топологии BSAT1 c помощью программы HMMTOP № Ак-остатков Топология 1 — 39(43) I (Intracellular) 44 — 63 H (Hydrophobic) 64 — 79 O (Outside) 80 — 99 H (Hydrophobic) 100 — 111 I (Intracellular) 112 — 133 H (Hydrophobic) 134 — 190 O (Outside) 191 — 213 H (Hydrophobic) 214 — 225 I (Intracellular) 226 — 245 H (Hydrophobic) 246 — 275 O (Outside) 276 — 295 H (Hydrophobic) 296 — 357 I (Intracellular) 358 — 378 H (Hydrophobic) 379 — 396 O (Outside) 397 — 418 H (Hydrophobic) 419 — 430 I (Intracellular) 431 — 450 H (Hydrophobic) 451 — 557 O (Outside) Сиквенс KSTITQI ERRFDIPSS (O) EKYSYEK YERYSPSSNL TPNISPCYLE SSSPSPRSIV GKSQNKINDE CEVDTSSSMW (o) GSLCA KLYVDIGFVN LDHITITPKD PQWVG YK PKYIEQQYGQ SSSKAN CENSSVAGLT YHERALFSDC WEPMCGDNGI QSSSRSGKNI AAPKSGNWSG VSYQGTKPVS NSRCKCSDSK TYASACLAGC IFSNCTCVGF MMGRCQKDNG 59 CSQMFLY 558 — 581 H (Hydrophobic) 582 — 593 I (Intracellular) 594 — 616 H (Hydrophobic) 617 — 646 O (Outside) 647-668 H (Hydrophobic) 669 — 716 I (Intracellular) DTSC LKWGFKKCGS RGSCRLYDSH AFRHIY Примечания: Outside – внеклеточные фрагменты, Intracellular - внутриклеточные, Hydrophobic — гидрофобные трансмембранные домены. Дизайн рекомбинантных белков Поскольку продукция рекомбинантных белков в бактериях, как правило, оказывается успешной в случае (а) достаточно крупных полипептидов, имеющих массу начиная от 5-10 кДа и (б) белки не должны содержать участков с ярко выраженной гидрофобностью (например, трансмембранных участков) [69], то было решено создать два типа рекомбинантных белков: внеклеточный фрагмент BSAT1134-190 с Nконцевой гексагистидиновой последовательностью (BSAT134Q) и этот же фрагмент с более крупным гибридным белком, имеющим высокий уровень продукции в клетках бактерий – кальмодулин-связывающим доменом Са-АТФазы плазматической мембраны человека PMCA4b (CBD) массой 17 кДа [69, 337]. Этот химерный белок, обозначенный как BSAT134-CBD, вследствие большей молекулярной массы, должен был обладать и большей иммуногенностью, что является важным условием для проведения успешной иммунизации и получения моноклональных антител. Схема проведения эксперимента и экспериментальные процедуры Работа состояла из следующих этапов: дизайн олигонуклеотидных праймеров, необходимых для амплификации соответствующих фрагментов кДНК и клонирования их в плазмидные векторы pQE30 (Qiagen) или CBDQ [2, 69]. Выделение тотальной РНК из мозга крысы (кора и мозжечок) и получение пер60 вых цепей кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. ПЦР-амплификация фрагментов кДНК, кодирующих фрагмент 134-190 а.о. Клонирование полученных продуктов ПЦР в плазмидный вектор pGEM-T (Promega) и проверка правильности ориентации и нуклеотидной последовательности вставки с помощью секвенирования ДНК. Отбор клонов, не содержащих ошибки. Клонирование выбранных вставок в векторы для экспрессии – pQE30 и CBDQ Продукция соответствующих белков в бактериях, выделение, очистка и анализ с помощью электрофореза в ПААГ Экспериментальные процедуры: Олигонуклеотидные праймеры Для амплификации фрагмента, кодирующего фрагмент 134-190 а.о., были использованы праймеры BSAT134F (gatcAGATCTgagaagtacagctatgaga) и BSAT134B (gatcAAGCTTaccacatggaggaactggtat), содержащие сайты узнавания рестриктаз BglII и HindIII соотвественно. Олигонуклеотиды были синтезированы и очищены с помощью ВЭЖХ фирмой «СибЭнзим» (Новосибирск). Для дизайна и работы с нуклеотидными и белковыми последовательностями использовали пакет программ ―DNAStar‖ (Lasergene). Структура фрагмента кДНК, кодирующего фрагмент белка 134-190 а.о.: gagaagtacagctatgagaaatatgagaggtattctccctcctccaacctcactcccaacatctctccgtgc tacctagagtccagcagtccatcaccacgctcaatcgtggggaaatcacaaaacaagataaacgatgagtgt gaagtggataccagttcctccatgtgg Выделение тотальной РНК и получение первых цепей кДНК Осуществляли с помощью набора «SV Total RNA Isolation System» (Promega), согласно рекомендациям производителя. К 2 мкг полученной РНК добавляли 500 нг праймера олиго (дТ)18, инкубировали при +70С 3 мин. Смесь помещали в лед, добавляли 40 ед. акт/ ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека ―iRNAsin‖ (Promega), буфер для обратной транскриптазы M-MLV (Promega), dNTP до концентрации каждого 0.4 мМ, 200 ед. акт.обратной транскриптазы M-MLV (Promega). После инкубации в 61 течение 2 ч при 37 С нуклеиновые кислоты последовательно очищали от белков с помощью экстракций смесью фенол-хлороформ (1 : 1), хлороформом и осаждали этанолом. Полученный осадок ресуспендировали в 50 мкл воды. ПЦР-амплификация фрагментов кДНК В тонкостенной пробирке 0,5 мл готовили реакционную смесь следующего состава: • 1 мкл 2,5 мМ раствора dNTP • 2 мкл 10х-буфера для ПЦР (15 мМ MgCl2, 100 мМ Трис-НСl, 500 мМ KCl, рН 8,3 при комнатной температуре, 0,1% желатин) • 10 p каждого праймера (прямого и обратного) • 0,1 мкл Taq-полимеразы (около 0,5 ед) • 2 мкл кДНК • вода (Milli-Q) до 20 мкл Типичные параметры ПЦР в амплификаторе с подогреваемой крышкой Biometra ―Trio-termoblock‖: 2 мин 30 сек 95, денатурация 95 30 сек – отжиг 55 30 сек – элонгация 72 1 мин (30 циклов), 72 5 мин. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, используя окрашивание бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Клонирование и секвенирование Продукты ПЦР очищали с помощью экстракции смесью фенол-хлороформ, хлороформом, переосаждали спиртом и лигировали в плазмидный вектор pGEM-T (Promega), используя ДНК-лигазу фага Т4 (Promega) согласно рекомендациям производителя. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli JS-5 (Bio-Rad), высевали на чашки, с LB-агаром, содержащие 50 мкг/мл карбенициллин, X-Gal и ИПТГ (белоголубая селекция). Полученные белые колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР на предмет наличия вставки. Положительные клоны наращивали в жидкой культуре и использовали для выделения плазмидной ДНК с помощью набора «Wizard Plus Minipreps DNA Purification System» (Promega). Очищенную плазмидную ДНК использовали для секвенирования. 62 Клонирование в векторы для экспрессии Очищенные плазмидные ДНК, содержащие вставки без ошибок, обрабатывали соответствующими рестриктазами, подвергали разделению в геле с помощью электрофореза, вырезанные фрагменты экстрагировали из геля с помощью набора «SVGel&PCRClean-UpSystem» (Promega). Очищенные таким образом фрагменты кДНК лигировали с расщепленными по тем же сайтам плазмидными ДНК pQE30 (BamHI + HindIII) pCBDQ (BglII + HindIII), лигазной смесью трансформировали клетки E.coliSG13009 (Qiagen) и высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл канамицина. Полученные колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР на предмет присутствия вставки в правильной ориентации и положительные клоны использовали для дальнейшей работы. Продукция BSAT134Q и BSAT134CBD в бактериях, выделение, очистка и анализ с помощью электрофореза в ПААГ Положительные клоны культивировали при перемешивании в жидкой среде LB при +37 С, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл канамицина до достижения оптической плотности (600 нм) 0,7-0,9; затем добавляли ИПТГ до концентрации 1 мМ и инкубировали в тех же условиях еще 4 часа. Затем клетки осаждали при 3000g 20 мин, замораживали и хранили при -70 С. Выделение белков осуществляли в денатурирующих условиях на Ni-NTAагарозе, согласно протоколу, рекомендованному фирмой Qiagen. Клетки, выращенные в объеме 50-200 мл культуры, размораживали при комнатной температуре 10 мин, ресуспендировали в 5 мл раствора «В» (8М мочевина, 0,1 М Na-фосфат, 0,01 М Трис-HCl, рН 8,0) на 1 г сырого веса и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Лизат центрифугировали (15000 об/мин, 15 мин при 5°, ротор JA-20), собирали супернатант, к которому добавляли 2 мл 50% Ni-NТА-агарозы, инкубировали 45-60 мин, периодически встряхивая. Затем суспензию переносили в колонку, промывали 15 мл раствора В, 20-30 мл раствора С (раствор В, рН 6,3), после чего элюировали 2-3 мл элюирующего раствора (В, содержащий 250 мМ имидазола). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд и, в зависимости от его выхода, проводили повторную элюцию. Полученные препараты белков анализировали электрофорезом в ПААГ. 63 Получение гибридных клеток, продуцирующих моноклональные анти-BSAT1антитела. Для проведения цикла иммунизации для последующего слияния и получения гибридом, а также для получения асцитической жидкости отбирали самок мышей линии Balb/C в возрасте 6-7 недель с весом 25-30 г. Иммунизацию самок мышей линии Balb/С полученным препаратом рекомбинантного BSAT1 проводили по следующей схеме: I. Первичная иммунизация (включает 4 цикла) Высокоочищенный препарат рекомбинантного BSAT1 в количестве20 мкг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (в соотношении 1:1) вводили подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки. Иммунизацию повторяли на 9 и 18 сутки тем же препаратом антигена в том же количестве, подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки. На 27 сутки вводили 10 мкг высокоочищенного препарата антигена в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) в область лимфатических узлов брюшной цепочки, околошейных лимфатических узлов, подушечки лап. II.Реиммунизация Высокоочищенный препарат антигена в количестве 20 мкг в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (в соотношении 1:1) вводили подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки. Повторное введение высокоочищенного препарата антигена в количестве 10 мкг повторяли на 9 сутки в том же количестве, подкожно в область околошейных лимфатических узлов, подушечки лап, а также лимфатических узлов брюшной цепочки. Через 4 дня после проведения последней инъекции проводили забор крови из хвостовой вены и определяли уровень анти-BSAT1-АТ с помощью иммуноферментного анализа. 64 При обнаружении адекватного титра антител за 3 - 4 дня до извлечения селезенки последнее введение препарата BSAT1 в количестве 25 мкг осуществляли внутривенно (в 0,01 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,3). Плазмоцитомные клетки. Перед слиянием миеломные клетки линии Sp2/0Ag14 культивируют в среде с добавлением 8-азагуанина для удаления ревертантных клеток, содержащих «нормальный» уровень ГГФРТ и, которые, подобно гибридным, способны расти в среде НАТ. После проведения селекционного удаления ревертантных клеток с применением 8-азагуанина, проводили трехкратную отмывку клеток Sp2/0-Ag14 центрифугированием (1000 g, 4 минуты) в среде RPMI-1640. Процедура слияния. Проведение процедуры слияния осуществляли в стерильных условиях. Иммунизированную мышь забивали путем декапитации, и выделяли селезенку, которую затем помещали в чашку Петри, с охлажденной культуральной средой RPMI-1640. Селезенку измельчали скальпелем на кусочки размером 2-3 мм, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со средой RPMI-1640. Образовавшийся гомогенат центрифугировали (1000 g, 4 минуты), осажденные клетки ресуспендировали в 5 мл холодной среды RPMI-1640. После этого клетки осаждали центрифугированием (1000 g, 10 минут; 5804 R «Eppendorf», Германия), определяли их количество и оценивали жизнеспособность. Подготовленные плазмоцитомные клетки смешивали с клетками селезенки (соотношение клетки линии Sp2/0-Ag14 : клетки селезенки составляло 2 : 1, соответственно). Полученную смесь однократно отмывали в ростовой среде RPMI1640 и осуществляли процедуру слияния. К смеси клеток при постоянном перемешивании в течение 60 секунд по каплям добавляли 1,0 мл раствора «PEG/DMSO Hybri-Max», («Sigma», USA, № Р 7306). После чего клетки инкубировали в течение 90 секунд. К полученной суспензии в течение 5 минут по каплям добавляли 10 мл среды DMEM без сыворотки, затем в течение 2 минут – 10 мл этой же среды, затем по каплям доводили общий объем до 50,0 мл этой же средой. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 30 мл ростовой среды DMEM с добавлением 20 % FCS. 65 Суспендированные таким образом клетки высевали в лунки культуральных планшетов («CellStar», USA, № 655180), по 50 мкл в каждую лунку и помещали в CO2-инкубатор. Через 12 часов в каждую лунку добавляли по 50 мклгибридомной среды ГАТ («Gibco», USA, № 21060), приготовленной на основе коммерческой ростовой среды DMEM с добавлением тимидина (16 мМ), гипоксантина (0,1 мМ), аминоптерина (0,8 мкМ), а также содержащей 20 % FCS. Такая среда является селективной по отношению к гибридным клеткам. Находясь в ней, образовавшиеся гибридомы сохраняют жизнеспособность в силу особенностей метаболизма, обусловленных родительскими предшественниками. Неслившиеся клетки такими свойствами не обладают, в результате чего происходит их массовая гибель. Клетки выдерживали в селективной среде в течение 14 дней, постепенно заменяя селективную среду НАТ на ростовую среду с добавлением НТ(«Gibco», USA, № 0949) и в дальнейшем – на ростовую среду DMEM с добавлением 20 % FCS. Первую смену селективной среды проводили на 4 сутки. Далее замену осуществляли по мере ее кондиционирования и закисления, ориентируясь на изменение цвета среды с красного на желтый (кислотно-основный индикатор феноловый красный). В случае активно пролиферирующих гибридомных клеток ростовую среду меняли раз в два дня. Видимые глазом клоны появлялись в течение 10-14 дней. Выявление клонов, секретирующих специфические анти-BSAT1-АТ, осуществляли несколькими методами минимум трехкратно: твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), иммуноцитохимическим анализом (ИЦХ), иммуногистохимическим анализом (ИГХ) и методом иммуноблотта. Клоны, проявившие в динамике максимальную секретирующую способность, отбирали для последующего реклонирования. Скрининг секретирующей способности реклонированных гибридом выявлял наиболее стабильно секретирующие клоны, которые в дальнейшем наращивали. Для клонирования и последующего наращивания клетки высевали в 96-луночные плашки в ростовую среду с предварительно подготовленным фидерным слоем. 66 Подготовка клеток фидерного слоя В качестве клеток фидерного слоя применяли перитонеальные макрофаги, которые адаптируют ростовую среду, продуцируя ростовые факторы и, с другой стороны, поглощают дебрис и элиминируют токсичные вещества, тем самым способствуя пролиферации гибридных клеток. Для выделения перитонеальных макрофагов, мышь забивали путем дислокации позвонков шейного отдела, для проведения асептики помещали в 96° спирт на 5 минут. Продольным разрезом вскрывали кожу на животе и отделяли ее от брюшных мышц, затем продольным разрезом вскрывали брюшную полость. Брюшную полость 2-3 раза промывали в ростовой среде RPMI-1640, после чего клетки переносили в лунки 96-луночного планшета в объеме 100 мкл на лунку и культивировали в течение 3 суток. Гибридные клетки для клонирования и наращивания добавляли в лунки на 4 сутки. Для проведения процедуры клонирования гибридные клетки суспендировали в лунках и проводили расчет концентрации клеток в камере Горяева. Гибридомы высаживали в лунки 96-луночного планшета с предварительно подготовленным фидерным слоем из расчета 1 клетка на лунку. При достижении концентрации клеток 200-300 в лунки, проводили скрининг супернатантов с помощью ELISA, ИЦХ, ИГХ и иммуноблотт-анализа. Для получения адекватных результатов клонирования, проводили минимум три процедуры реклонирования. После проведения клонирования и реклонирования, гибридные клетки отобранных клонов наращивали и частично замораживали в среде для заморозки «Recovery Cell Culture Freezing Medium» («Gibco», USA, № 12648-010) при температуре – 70 С по 5 106 клеток на ампулу и хранили в жидком азоте. Процедура клонирования гибридом Отобранные гибридомы ресуспендировали и рассчитывали концентрацию клеток в суспензии с помощью камеры Горяева. После чего по 100 клеток переносили в 10 мл ростовой среды RPMI-1640 (1% 100мМ пирувата натрия («Invitrogen», США), 1% 200 мМ L-глутамина («Invitrogen», США), 1% раствор антибиотик-антимикотик (пенициллин 10000 ед/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл и амфотерицин B 25 мкг/мл, «Invitrogen», США) и 20 % сыворотки новорожденных телят («Invitrogen», Южная 67 Америка) и рассаживали в 96-ти луночные планшеты с подготовленым фидерным слоем. В течение 14 дней за растущими клонами наблюдали, когда клеток становилось достаточно (от 500 на лунку), проводили тестирование супернатантов с помощью ELISA, ИЦХ и иммуноблоттинга. Клонирование каждой гибридомы проводили последовательно 3 раза. Замораживание и хранение гибридом Для криоконсервирования гибридной линии предварительно наращивали 5-10 млн клеток в полной ростовой среде RPMI-1640 (1 % 100мМ пирувата натрия («Invitrogen», США), 1 % 200 мМ L-глутамина («Invitrogen», США), 1% антибиотикаантимикотика (пенициллин 10000 ед/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл и амфотерицин B 25 мкг/мл, «Invitrogen», США) и 10% сыворотки новорожденных телят («Invitrogen», Южная Америка). Клетки ресуспендировали и отмывали от ростовой среды при помощи центрифугирования (1000 g, 4 минуты). Супернатант сливали и к клеточному осадку добавляли 1-3 мл среды для заморозки (90% сыворотки новорожденных телят («Invitrogen», Южная Америка) и 10% диметилсульфоксид (ДМСО, «Helicon», Россия). Клетки ресуспендировали и переносили к криопробирки («Corning», США), после чего быстро замораживали в жидком азоте (−195°C) или низкотемпературном холодильнике (−80°С; «Sanyo», Япония). При размораживании клеток пробирки быстро нагревали на водяной бане (37°С) и отмывали от ДМСО методом центрифугирования. Затем рассаживали на 96-луночные планшеты в полной ростовой среде RPMI-1640 сохраняя высокую плотность клеток в лунках. В ином случае размороженные гибридомы подсаживали интраперитонеально самкам мышей линии Balb/C. Получение асцитов и очистка моноклональных антител Для получения асцитической жидкости, содержащей моноклональные антиBSAT1-АТ, вводили интраперитонеально самкам мышей линии Balb/C в количестве 1-5 106. Гибридные клетки вводили мышам через 5-7 дней после интраперитонеальной инъекции 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан) («Sigma», USA). Непосредственно перед введением в брюшную полость, клетки отмывали от ростовой среды методом центрифугирования (1000 g, 5 минут), после чего клеточный осадок 68 ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI-1640 («Invitrogen», США) или PBS. Асцитическую жидкость в виде серозного или серозно-геморрагического выпота получали спустя 10-14 дней после инъекции гибридных клеток. Полученную асцитическую жидкость центрифугировали (1500 g, 10 минут), супернатант, содержащий антиBSAT1-АТ отбирали для тестирования и частично замораживали для длительного хранения при −80 С, а клеточный осадок криоконсервировали в среде для заморозки или вводили интраперитонеально мышам для дальнейшей наработки асцитов. Очистка моноклональных антител методом аффинной хроматографии В основе этого вида хроматографии лежит обратимая биоспецифическая адсорбция, осуществляемая за счет взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, и комплементарными к ним белками, подлежащими разделению. Основы этого метода хроматографии подробно были изложены Турковой Я. («Аффинная хроматография», 1978 г.). Фракционируемая смесь наносится в условиях, максимально благоприятствующих специфическому связыванию выделяемого белка с молекулами, фиксированными на матрице. Несвязавшиеся белки отмываются, после чего нужный белок отделяют от сорбента, специальным образом изменяя состав раствора. Одним из вариантов этого метода разделения белков является иммуноаффинная хроматография, которую мы применяли в своей работе. В своей работе мы применяли 2 варианта иммуноаффинной хроматографии: иммуноаффинная хроматография на адсорбентах с иммобилизованным рекомбинантным протеином А. иммуноаффинная хроматография на иммуноадсорбентах с иммобилизованным BSAT1. С целью очистки моноклональных анти-BSAT1-АТ применяли аффинную хроматографию, основанную на селективном взаимодействии белков в подвижной фазе, подлежащих фракционированию, с белками неподвижной фазы, иммобилизованными на носителе. Молекулы, обладающие высоким сродством к неподвижной фазе, удерживаются на колонке и впоследствии элюируются. Для проведения специфического связывания иммуноглобулинов класса G мыши был использован рекомбинантный протеин A, конъюгированный с агарозой («Invitrogen», USA, № 15918-014). Работу проводили на хроматографической системе BioLogic LP System («Biorad», USA) при 69 4С. Асцит центрифугировали при 5000g в течение 10 мин и фильтровали (0,22 мкм). Далее асцит наносили на колонку (объем колонки – 12 мл) с протеин А-агарозой (объем носителя – 4 мл) и оставляли на рециркуляцию в течение 1 часа со скоростью 10-20 мл/ч. После чего колонку последовательно промывали фосфатным (pH 7,4) и ТРИС буфером (pH) по 30-40 мин со скоростью 30 мл/ч. Элюирование связавшихся с носителем антител, проводили глициновым буфером (0,2 М глицин-HCl, рН 3) со скоростью 40 мл/ч. Элюцию проводили по-фракционно и нейтрализовали кислый pH раствора добавлением 1M ТРИСа (200 мкл на 1 мл). Очищенные моноклональные антитела 4-х кратно диализовали против 500 мл охлажденного PBS по 40 мин с использованием полупроницаемой мембраны. Препараты антител концентрировали методом ультрафильтрации на центрифужных мембранах (100 кДа, «Millipor», USA). Очищенные анти-BSAT1-АТ криоконсервировали в 50% глицерине с добавлением 0,1% азида натрия и хранили при −20С либо лиофилизировали и сухой препарат моноклональных антител хранили при +4 С. Второй вариант иммуноаффинной хроматографии, применяемой в нашей работе для очистки анти-BSAT1-АТ - иммуноаффинная хроматография на иммуноадсорбентах с иммобилизованным препаратом BSAT1. Иммуноадсорбенты для получения очищенного препарата анти-BSAT1-АТ готовили по модифицированной нами прописи Weir D. («Handbook of experimental immunology», 1978 г.): 1 г CNBr-сефарозы 4В замачивали в 50 мл 1 мМ раствора HCI в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем отмывали на стеклянном фильтре в 200 мл того же раствора. К активированному таким образом гелю прибавляли препарат рекомбинантного BSAT1, предварительно отдиализованный против 0,1 М Na-карбонатного буфера (рН 8,3), содержащего 0,5 М хлорида натрия, из расчета 5 мг белка на 1 мл геля, учитывая, что 1 г порошка CNBr-сефарозы при набухании дает 3,5 мл геля. Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре на роторной мешалке. Образовавшийся иммуноадсорбент отмывали от избытка белка 1 л 0,1 М Na-карбонатного буфера, содержащего 0,5 М хлорида натрия. Оставшиеся имидокарбонатные группы CNBr-сефарозы блокировали 1 М раствора глицина при 2часовой инкубации геля. Избыток блокирующего агента отмывали попеременно 0,1 70 М Na-карбонатным буфером, рН 8,3, содержащим 0,5 М хлорида натрия, и 0,1 М натрий-ацетатным буфером рН 4,0, также содержащим 0,5 М NaCl. Иммуноаффинную хроматографию проводили в миниколонке (1 × 5 см), высота носителя составляла 2 - 3 см. Извлечение анти-BSAT1-АТ из асцита осуществляется при многократном пропускании обрабатываемого раствора через эту колонку в режиме медленной рециркуляции (около 10 мл/ч). Затем колонку отмывали от несвязавшегося белка рабочим буфером (Na-карбонатный буфер, рН 8,3), и нужный компонент элюировали 0,2 М глициновым буфером с рН 2,2. Элюцию проводили со скоростью 30 мл/ч и элюат собирали по фракциям. Существенной деталью этой процедуры является необходимость быстрой нейтрализации кислого элюата (обычно 1 М раствором ТРИС) для предотвращения денатурирующего действия экстремально кислой среды. Отбор фракций, содержащих анти-BSAT1-АТ, проводили с помощью иммуноферментного анализа. Полученные анти-BSAT1-АТ диализовали против PBS, криоконсервировали в 50 % глицерине с добавлением 0,1 % азида натрия и хранили при −20С либо лиофилизировали и сухой препарат моноклональных антител хранили при +4С. Определение класса иммуноглобулинов моноклональных антител Определение классов и подклассов мышиных моноклональных анти-BSAT1АТ проводили методом неконкурентного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа с использованием набора антител к различным классам иммуноглобулинов мыши (ISO2-1KT, ―Sigma‖, США). Анти-G1-, анти-G2a-, анти-G2b-, анти-G2-, анти-A- и анти-M-АТ иммобилизовали на полистироловых 96-ти луночных планшетах с высокой степенью адгезии («Sarstedt», Германия) в концентрации 10 мкг/мл в натрий карбонатном буфере (0,05 M, pH 9,6) 12 часов при 4°С. После инкубации три раза промывали рабочим фосфатным буфером (PBS pH 7,4, c 0,2 % Твин 20 и 0,2 % Тритон X100) на автоматическом вошере (PW40 «Biorad», США). Для предотвращения неспецифической адгезии антител фазу забивали 1 % раствором БСА («Amresco», США) в течение 30 мин на шейкере и трехкратно отмывали рабочим буфером. Затем вносили исследуемые супернатанты по 200 мкл и титровали методом двухкратных разведений. В качестве отрицательного контроля использовали ростовую среду, кондиционированную клетками культуры Sp2/0-Ag14, и вторичные антитела. Инкубировали 171 2 часа на шейкере и трехкратно отмывали рабочим буфером. В качестве вторичных использовали козьи антитела к F(ab)2-фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, предабсорбированные сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США) в разведении 1:20000. Для исключения перекрестного взаимодействия вторичных антимышиных антител с первичными иммуноглобулинами, иммобилизованными на пластике, вторичные антитела предабсорбировали сывороткой. Инкубировали 1 час на шейкере и четырехкратно отмывали рабочим буфером. Реакцию проявляли раствором тетраметилбензидина "ready-to-use" («Amresco», США) по 100 мкл на лунку, останавливали – 0,5 М раствором соляной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическую плотность регистрировали с помощью мультифункционального планшетного анализатора (VictorX3 «PerkinElmer», США) на длине волны 450 нм. Определение константы аффинности антител Константу аффинности антител при связывании с рекомбинантным BSAT1 определяли по методу Beatty J.D. et al. методом ИФА. Константа аффинности рассчитывалась по следующей формуле: Kaff = (n-1) / (2(n[Ab‘]-[Ab])), n = [Ag] / [Ag‘], где: [Ag] – большая посадочная концентрация антигена; [Ag‘] – меньшая посадочная концентрация антигена; [Ab] – равновесная концентрация антител при OD-50 с концентрацией антигена [Ag]; [Ab‘] – равновесная концентрация антител при OD-50 концентрацией антигена [Ag‘]. Концентрации антител переводили в моль/л и подставляли в формулу. Константа диссоциации (Kd) обратно пропорциональна константе аффинности: Kd = 1/Kaff 72 Методы иммунохимического анализа Твердофазный иммуноферментный анализ. Для количественного определения анти-BSAT1-АТ в сыворотке крови иммунизированных мышей, в супернатантах гибридных клеток, асцитах и очищенных препаратах антител мы применяли хорошо известный метод иммуноферментного анализа – твердофазный вариант иммуноферментного анализа с пределом чувствительности 800 пг/мл предложенный в 1971 г. Engvall E. et al. (Immunochemistry, V. 8(9), p. 871874) и Van Weeman B.K. et al. (FEBS Lett., V. 15, № 3, p. 232-236). Принцип метода состоит в одновременном взаимодействии антигена, иммобилизованного на твердой матрице с антителами и с конъюгатом специфических антител с ферментом (вторичные антитела). Количество связанного конъюгата выявляется с помощью хромогенного субстрата, вступающего в реакцию с ферментом. При этом интенсивность приобретенного окрашивания пропорциональна количеству антигена в образце. Для проведения анализа использовали препарат рекомбинантного BSAT1, полученный в лаборатории иммунохимии Отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии. Процедура постановки твердофазного иммуноферментного анализа BSAT1. В качестве твердой матрицы мы применяли 96-луночные полистирольные планшеты («Sarstedt», Германия). Схема постановки иммуноферментного анализа анти-BSAT1-АТ приведена на рисунке 2.5. Проведение иммуноферментного анализа анти-BSAT1-АТ проводили по следующему протоколу: 1. Для активации планшета вносили образцы препарата рекомбинантного BSAT1 в покрывающем буфере. Покрывающий буфер рН 9,6 Nа2СО - 1,59 г NаНСО3 - 2,93 г Н2О - до 1000 мл. 73 1 2 3 4 Рис. 2.5. Схема постановки иммуноферментного определения антител к BSAT 1. 1 – адсорбция антигена на твердой фазе: внесение стандартных препаратов BSAT1, антитела к которым будут анализироваться; 2 – внесение образцов биологических жидкостей; комплементарное связывание соответствующих BSAT1 с антителами; 3 – внесение конъюгата антител с ферментом; комплементарное связывание соответствующих идиотипов АТ конъюгата с эпитопами BSAT1; 4 – внесение субстратнойсмеси ( ) дляэнзимаконъюгата, изменение цвета субстратной смеси ( ), регистрируемое фотометром. После проведения инкубации антигена (12 ч при + 4 С), во время которой происходит адсорбция антигена на поверхности полистирольной твердой фазы дна и стенок ячеек – так называемая активация твердой фазы – посадочный раствор сливали и ячейки промывали отмывающим буфером. Отмывающий буфер рН 7,0 Трис – 6,05г СаСI2 – 1,11 г NaСI - 0,2 г Тритон Х-100 – 1,0 мл Н2О - до 1000 мл Для предотвращения неспецифической адгезии антител фазу забивали 1% раствором бычего сывороточного альбумина БСА («Amresco», США) в течение 30 мин на шейкере и трехкратно отмывали рабочим буфером. 2. Внесение в ячейки планшета исследуемых образцов – сыворотка крови иммунизированных мышей, супернатанты гибридом, асциты, растворы антител. После промывки в ячейки вносили по 100 мкл исследуемой биологической жидкости или другого раствора определяемых антител. С целью полуколичественного анализа, исследуемые образцы вносили методом кратных разведений, начиная титровку с 1 : 100. В качестве положительного контроля 74 применяли сыворотку крови мышей, предварительно иммунизированных препаратом рекомбинантного BSAT1. В качестве отрицательного контроля применяли: сыворотку крови неиммунных мышей, препараты очищенных IgG неимунных мышей в эквивалентных концентрациях, образцы ростовой среды RPMI-1640 и внесение вторичных конъюгированных антител без предварительного внесения первых антител. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 2 ч. За это время происходит связывание антигена с адсорбированными антителами. Несвязавшиеся белки отмывали рабочим буфером. 3. Внесение в ячейки планшета коммерческого конъюгата вторичных АТ с пероксидазой хрена. В качестве вторичных использовали козьи антитела к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, предабсорбированные сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США) в разведении 1:20000. Инкубацию с конъюгатом проводили в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, после чего несвязавшийся конъюгат трижды отмывали рабочим буфером. Проявление ферментативной активности пероксидазы в связанном конъюгате проводили с использованием субстратного буфера Субстратный буфер рН 4,5 Кислота лимонная - 7,3 г NaHPO4x2H2O – 11,86 г H2O – до 1000 мл В субстратную смесь непосредственно перед внесением в лунки, добавляли 10 мкл 30 % перекиси водорода. Субстратную смесь вносили в лунку в количестве 100 мкл и инкубировали в течение 10-20 минут при комнатной температуре. В качестве хромогена в субстратной смеси применяли раствор тетраметилбензидина (ТМБ) («Amresco», США) по 100 мкл на лунку. По истечении времени инкубации ферментативную реакцию останавливали внесением в лунки планшетов 100 мкл стоп-реагента (0,5 М раствором соляной кислоты). Считывание результатов проводили с помощью многоканального спектрофотометра (Model 680 «Biorad», США) на длине волны 450 нм. 75 Диск-электрофорез белков в SDS-ПААГ Электрофоретическое разделение белков в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с 0,1 % додецилсульфата натрия (SDS) проводили по общепринятой методике Laemmli в камере для электрофореза (Mini protein tetra cell «Biorad», США). Гели заливали на столиках для заливки («Biorad», США): 12 % разделяющий гель (30% акриламид, вода, 100 мкл PSA, 100 мкл SDS, 8 мкл ТЕМЕД), 5 % концентрирующий гель (30% акриламид, вода, 50 мкл PSA, 100 мкл SDS, 5 мкл ТЕМЕД). К анализируемым образцам добавляли загрузочный буфер («Fermentas», Литва) содержащий 2% ДДС, 5% β–меркаптоэтанол и бромфеноловый синий, после чего кипятили 5 мин при 95°С. Препарат рекомбинантного BSAT1, клеточные лизаты клеток C6 глиомы и нормальных астроцитов крысы, предокрашенный маркер молекулярной массы («Fermentas», Литва) вносили в лунки геля. Электрофоретическое разделение белков проводили при постоянной силе тока 35 мА с помощью источника питания (PowerPac Basic power supply «Biorad», США) в ТРИС-глициновом буферев течение 40-60 мин и останавливали при достижении красителя нижней границы разделяющего геля. После разделения гель фиксировали и отмывали от SDS в растворе 10 % уксусной кислоты в течение 15 мин. Окрашивали раствором Кумасси R-250 (Coomassie Brilliant Blue R250 0,4 г; уксусная к-та 10 %; этиловый спирт 40 %) в течение 30-60 мин на шейкере, после чего отмывали (10 % метанол, 10 % уксусная кислота) 3-12 часов на шейкере. Иммуноблотт анализ Иммунноблотт анализ сочетает в себе иммуноферментный анализ с предварительным переносом белков после проведения электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, впервые был предложен в 1979 г. Towbin H. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 76, р. 4350-4354) и в дальнейшем модифицирован Aebersolds R. et al. (J. Biol. Chem., 1986, V. 261, № 9, p. 4229-4238), предложивших перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану с помощью электрического поля. Иммуноблотт-анализ включает в себя несколько стадий. В нашем исследовании мы применяли перенос белков с ПААГ на поливинилиденфторидную мембрану (ПВДФ) по методике Renart и Burnette с использованием модуля для «мокрого» переноса («Biorad», США). ПВДФ мембрану предварительно смачивали в 98% метаноле и промывали в 76 трис-глициновом буфере. Затем ПВДФ мембрану накладывали на полиакриламидный гель и собирали кассету, которую помещали в модуль для переноса. Перенос белков на мембрану проводили при постоянной силе тока 350 мА с помощью источника питания (Power Pac Basic power supply «Biorad», США) в охлажденном Трисглициновом буфере в течение 60 мин. Мембрану извлекали и промывали PBS. При необходимости мембрану окрашивали раствором Кумасси G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250 0,4 г; уксусная к-та 10 %; этиловый спирт 40 %) в течение 1 ч на шейкере, после чего отмывали (10 % метанол, 10 % уксусная кислота, 80 % дистиллированная вода) 3-12 часов на шейкере. После переноса, для предотвращения неспецифических белковых взаимодействий, мембрану забивали раствором 5 % сухого обезжиренного молока в PBS с 0,2 % Твина-20 в течение 12 часов при 4°С. Мембрану инкубировали в рабочем буфере PBS (0,2% Твина-20, pH 7.4) с тестируемыми супернатантами, очищенными моноклональными анти-BSAT1-АТ (разведение 1:3000-5000, концентрация 200-1000 нг/мл общего белка очищенного препарата антител) или асциты (разведение 1:3000-5000). В качестве положительного контроля использовали коммерческие анти-BSAT1-АТ (разведение 1:1000-5000, «Abcam», США). В качестве отрицательного контроля использовали кондиционированную среду культуры Sp2/0-Ag14, неспецифические мышиные IgG в эквивалентной концентрации и вторичные антимышиные антитела конъюгированные с пероксидазой хрена. Инкубировали с первичными антителами на шейкере 2 часа при комнатной температуре, после чего 4-5 раз отмывали рабочим буфером по 5 мин на шейкере. В качестве вторичных использовали козьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, предабсорбированные сывороткой крысы (А 3682, «Sigma», США) в разведении 1:200000, инкубировали в течение часа на шейкере и отмывали пятикратно рабочим буфером PBS (0,2% Твина-20, pH 7,4) на шейкере по 5 минут. Проявление проводили методом хемилюминисценции с помощью набора «ECL Advance Western Blotting Detection Kit» («GE Healthcare», Великобритания) по методике фирмы производителя. Детекцию осуществляли синечувствительной рентгеновской пленкой Ретина XBM («Kodak», США). 77 Иммуноморфологический анализ Иммунофлюоресцентный анализ + 1 2 + 3 4 5 Рисунок 2.6. Схема "непрямого" иммунофлюоресцентного анализа. 1 – клетка с презентированным BSAT1; 2 – анти-BSAT1-антитела; 3 – комплекс BSAT – анти-BSAT1-АТ, находящийся на поверхности клеток; 4 – конъюгат антител к Ig G мыши с флюорофором; 5 – комплексBSAT1 – анти-BSAT1-АТ – конъюгат антител к Ig G мыши с флюорофором; 78 Преимущество иммунофлюоресцентного анализа заключается в рациональном сочетании специфичности иммунохимической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. Метод позволяет надежно локализовать тот или иной антиген в структуре ткани (на срезах) или в клетках (в культуре или мазке). В свой работе мы использовали непрямой вариант иммунофлюоресцентного анализа, предложенный Weller T.H. и Coons A.H. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, V. 86, р. 787-794). Схема его постановки представлена на рисунке 2.6. Иммунофлюоресцентный анализ применяли с целью проверки специфичности полученных моноклональных антител к BSAT1. Постановку анализа осуществляли в культуре клеток глиомы С6, нативных астроцитах и эндотелиоцитах (иммуноцитохимический анализ) и на серийных срезах ткани мозга крыс с глиомой С6, сердца, печени, почки и селезенки (иммуногистохимический анализ). Иммуноциохимический анализ 1. Иммуноцитохимический анализ на клетках глиомы С6. Клетки глиомы С6, выращенные на высокоадгезивном полистироле или на покровных стеклах до 50-100 % конфлюентности монослоя, фиксировали раствором 4% параформальдегида в PBS (pH 7.4) 30 мин при комнатной температуре, после чего трехкратно отмывали. В качестве рабочего буфера использовали натрий-фосфатный буфер (PBS pH 7,4) с добавлением до 0,2 % Твина-20 и 0,2 % Тритона X-100. Для подавления неспецифического связывания, перед внесением тестируемых образцов, в культуру клеток вносилисреду с 2% нормальной крысы. В дальнейшем в лунки вносили тестируемые супернатанты (200 мкл), очищенные моноклональные анти-BSAT1АТ (рабочую концентрацию подбирали в каждой партии антител индивидуально, в среднем 2-10 мкг/мл тотального белка очищенного препарата антител) или асциты (разведение 1:500-1000), которые разводили образцы в рабочем буфере. В качестве положительного контроля использовали коммерческие анти-BSAT1-АТ (10 мкг/мл, «Abcam», США). В качестве отрицательного контроля использовали ростовую среду, кондиционированную среду культуры Sp2/0-Ag14, неспецифические мышиные IgG в эквивалентной концентрации и вторичные меченые антитела без первичных антител. Инкубацию с первичными антителами проводили при комнатной температуре на шейкере в течение 2-3 часов. После чего клетки трехкратно отмывали рабочим бу79 фером по 5 мин на шейкере. В качестве вторичных использовали козьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, предабсорбированные сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США) в разведении 1:1000, которые проявляли раствором диаминобензидина с перикисью водорода («Vector Labs», США). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с козьими антимышиными антителами конъюгированными с Alexa Fluor® 488 или Alexa Fluor® 633 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Вторичные антитела отмывали рабочим буфером четыре раза по 5 мин на шейкере. Для проведения тестирования на живых клетках, анти-BSAT1-АТ разводили в бессывороточной теплой среде RPMI-1640 («Invitrogen», США) в концентрации 2-10 мкг/мл и вносили в лунки, предварительно отобрав ростовую среду. Инкубировали 12 часа в CO2 инкубаторе при 37°С и аккуратно отмывали теплым PBS без детергентов. После чего фиксировали раствором 4 % параформальдегида в PBS (pH 7.4) 30 мин при комнатной температуре и трехкратно отмывали. Проявляли антителами к иммуноглобулинам мыши конъюгированными с AlexaFluor®488 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Вторичные антитела отмывали рабочим буфером (PBS pH 7,4 с 0,2 % Твина-20 и 0,2 % Тритона X100) четыре раза по 5 мин на шейкере. Анализ клеточных препаратов проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия) при соответствующих длинах возбуждения. Документация результатов проводилась путем автоматического компьютерного сканирования изображений. Результаты иммунофлюоресцентного анализа представлены в главе 4. 2. Иммуноцитохимический анализ в культуре астроцитов. Для проведения иммуноцитохимического анализа астроциты отмывали от ростовой среды трехкратно PBS и фиксировали 4 % забуференным раствором параформальдегида (рН 7,4) в течение 30 минут при +4С, после чего трехкратно отмывали PBS. На клетки, фиксированные на покровном стекле, для проведения иммуноцитохимического анализа наносили моноклональные анти-BSAT1-АТ в концентрации 210 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали поликлональные антитела к BSAT1 («Antibodies-online Inc», USA) и поликлональные анти-GFAP-АТ. В ка80 честве отрицательного контроля применяли IgG мыши в эквивалентной концентрации. Инкубирование проводили в течение 12 часов, отмывали и проявляли с помощью антивидовых антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488 и Alexa 594 в разведении 1:500 (Goat antimouse AlexaFluor®488 и Goat antirabbit AlexaFluor®594, «Invitrogen»). Ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Все разведения и отмывки проводили PBS (pH 7,4) с добавлением 0,2 % Tween-20, 0,2 % Triton X-100 и 1 % нормальной сыворотки козы. Покровные стекла для иммуноцитохимического анализа монтировали на предметные при помощи 80 % глицерина, хранили при -20ºС. Анализ связывания антител проводили на конфокальном микроскопе «Nikon» (Japan). 3. Иммуноцитохимический анализ в культуре эндотелиоцитов. Протокол проведения иммуноцитохимического анализа был одинаков для церебральных эндотелиоцитов крысы (RBEC) и для эндотелиоцитов, выделенных их пуповины человека (HUVEC). Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки трижды отмывали от ростовой среды PBS и фиксировали 4 % забуференным раствором параформальдегида (рН 7,4) в течение 30 минут при +4С, после чего трехкратно отмывали PBS. На фиксированные на покровном стекле эндотелиоциты для проведения иммуноцитохимического анализа наносили коктейль, содержащий 2-10 мкг/мл моноклональных антител к BSAT1 и 1-5 мкг/мл поликлональных антител к кадгерину («Abcam», Великобритания) или к ZO1 («Abcam», Великобритания) и инкубировали в течение 12 часов. После трехкратной отмывки проявляли с помощью антивидовых антител, конъюгированных с AlexaFluor®488 и AlexaFluor®594 в разведении 1:500 (Goat antimouse AlexaFluor®488 и Goat antirabbit AlexaFluor®594, «Invitrogen»). Ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Все разведения и отмывки проводили PBS (pH 7,4) с добавлением 0,2 % Tween-20, 0,2 % Triton X-100 и 1 % нормальной сыворотки козы. В качестве положительного контроля использовали поликлональные антитела к BSAT1 («Antibodies-online Inc», USA). В качестве отрицательного контроля применяли IgG мыши в эквивалентной концентрации. 81 Покровные стекла для иммуноцитохимического анализа монтировали на предметные при помощи 80% глицерина, хранили при -20ºС. Анализ связывания антител проводили на конфокальном микроскопе «Nikon» (Japan). Иммуногистохимический анализ Серийные срезы мозга крыс с глиомой С6, сердца, печени, почки и селезенки готовили на замораживающем микротоме (MNT «Slee», Германия) толщиной 30 мкм. Для подавления неспецифической сорбции, срезы предварительно инкубировали в 10% сыворотке нормальной лошади. В качестве рабочего буфера использовали натрий фосфатный буфер (PBS pH 7,4) с 0,2 % Твина-20 и 0,2 % Тритона X-100. Моноклональные анти-BSAT1-АТ вносили в концентрации 10-20 мкг/мл и инкубировали 12 часов при 4°С. В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные IgG в эквивалентной концентрации и вторичные меченные антитела без первичных антител. Отмывали трехкратно рабочим буфером по 5 мин на шейкере. Для исключения перекрестных и неспецифических взаимодействий с крысиной тканью, вторичные антитела абсорбировали 5 % сывороткой нормальной крысы. Проявление проводили козьими антимышиными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США) в разведении 1:500, ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Отмывку срезов проводили трижды рабочим буфером по 5 мин на шейкере, после этого срезы натягивали на стекла. Иммунофлуоресцентный анализ срезов проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия). Для окрашивания антителами разной специфичности, т.е. визуализации двух антигенов, использовали коктейль антител: мышиные моноклональные и анти-GFAP кроличьи поликлональные (разведение 1:400). Проявляли антивидовыми антителами: антимышиными (абсорбированные сывороткой нормального кролика) конъюгированными с AlexaFluor®488 («Invitrogen», США) в разведении 1:500 и антикроличьими (абсорбированные сывороткой нормальной мыши) конъюгированными с Alexa Fluor 633 («Invitrogen», США) в разведении 1:500. В таком подходе важно исключить перекрестное взаимодействие вторичных антимышиных антител с иммуноглобулинами кролика и вторичных антикроличьих антител с иммуноглобулинами мыши. 82 Иммунопероксидазный анализ Иммунопероксидазный анализ проводили с использованием высокочувствительной иммунопероксидазной системы «АВС-Vectastain» (VectorLab., USA). При окрашивании применяли модифицированный протокол фирмы-изготовителя. Тестирование проводили на срезах головного мозга, печени, почки, легкого и сердца крысы. Для приготовления срезов проводили перфузию сосудистого русла крыс 4 % забуференным раствором параформальдегида. Образцы органов инкубировали в том же фиксаторе в течение суток, после чего приготавливали замороженные или парафиновые срезы. Замороженные срезы хранили при -20С в антизамораживающем реактиве, состоящем из 30 % этиленгликоля и 30 % глицерина на 0,5 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4). Для проведения иммунопероксидазного анализа проводили семикратную отмывку замороженного среза от антизамораживающего реактива деионизированной воде после этого однократную отмывку в рабочем буфере (0,05 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,4). Для блокирования эндогенной пероксидазной активности выдерживали срезы в 3 % растворе Н2О2 на рабочем буфере в течение 5 мин. Затем инкубировали в 10 % растворе нормальной сыворотке лошади на рабочем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на роторной мешалке. После трехкратной отмывки рабочим буфером от нормальной сыворотки лошади, срезы инкубировали с первичными моноклональными антителами при температуре +4 С в течение 12 часов. Растворы моноклональных антител (рабочее разведение 1 : 1000) приготавливали на рабочем буфере с добавлением до 1 % нормальной сыворотки лошади. После этого проводили трехкратную отмывку срезов в рабочем буфере и вносили биотинилированные анти-мышиными IgG лошади, предварительно адсорбированные 2 % раствором нормальной сывороткой крови крысы (в рабочем буфере с добавлением 1 % нормальной сыворотки лошади) («VectorLabs.», USA). Инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре на роторной мешалке. После трехкратной отмывки от биотинилированных антител, проводили инкубацию с препаратом комплекса авидин-биотин-пероксидаза («АВС-kit Vectstain», США) в течение 30 минут при комнатной температуре на роторной мешалке. Отмывку от несвязавшегося конъюгата проводили трехкратно в рабочем буфере. Для проявления иммунопероксидазной активности срезы вносили в субстратный буфер, который гото83 вили непосредственно перед проявлением (0,01 М Na-цитратный буфер, рН 4,5 с добавлением 0,025 % DAB и Н2О2 до 0,01 %). Окрашенные срезы монтировали на стекла и заключали в бальзам. Микроскопирование полученных срезов проводили с помощью микроскопа «DMLВ» («Leica», Germany). Документация результатов проводилась путем автоматического компьютерного сканирования изображений. Результаты иммуногистохимического анализа приведены в главе 4. Конъюгация антител с флуорофором Для получения меченных AlexaFluor 488 (экстинкция 494 нм, эмиссия 519 нм) моноклональных анти-BSAT1-АТ и неспецифических IgG использовали набор AlexaFluor 488 Protein Labeling Kit («Invitrogen», США). Перед проведением процедуры конъюгации, препараты моноклональных анти-BSAT1-АТ диализовали от низкомолекулярных примесей. Тетрафторфениловый (ТФФ) эфир карбоновой кислоты AlexaFluor®488 растворяли в ДМСО («Helicon», Россия) до концентрации 10 мг/мл по протоколу фирмыпроизводителя. Затем к 0,5 мл антител (концентрация не менее 2 мг/мл) в PBS добавляли 50 мкл 1 M гидрокарбоната натрия, после чего вносили 20 мкл реактива ТФФ эфир AlexaFluor®488 (из расчета 100 мкг реагента на 1 мг антител) и перемешивали. Инкубацию проводили в течение часа при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1,5M гидроксиламина. Разделение меченых антител от несвязавшегося флуорофора проводили методом гель-фильтрационной хроматографии на колонке (19×0,8 см, V 9,5 мл) с 8 мл геля (Sephadex G-25 или BioGel P30), уравновешенной PBS. После элюции антитела концентрировали, измеряли их концентрацию и проверяли иммунохимическую активность методом ИЦХ анализа. Конъюгация антител I125 Для проведения экспериментов по исследованию биораспределения моноклональных анти-BSAT1-АТ, проводили их конъюгацию с I125. Все работы с радиоактивными метками проводили на базе радиоизотопного блока Института биоорганической химии им. Н.Н. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (руководитель блока, д.х.н. Ю.С. Скоблов). 84 В качестве реактива выбора при йодировании антител предлагается йодоген, поскольку по сравнению с другими применяемыми для этих целей окислителей (например – с хлорамином-Т) йодоген в наименьшей степени вызвает денатурацию антител. Кроме того, йодоген водонерастворим, и таким образом, в отличие от других окислителей, не попадает в образец и не требует дополнительных стадий очистки. Принцип метода заключается в том, что йодоген окисляет I до I +, который встраивается в OH-группу в ортоположении тирозина. Йодирование проводили по следующему протоколу. 1. Сухой йодоген («Sigma-Aldrich», США) разводили в дихлорметане в концентрации 1 мг/мл, аликвотили по 50 и 100 g в полипропиленовых пробирках объѐмом 2 мл и высушивали под током аргона. Полученные аликвоты хранили при 80С. 2. Нейтрализатию проводили 40 мкл (37 мБк) NaI125 («Изотоп», СПб) до- бавлением 10 мкл 50мМ фосфатного буфера. 3. В пробирку с йодогеном добавляли NaI125 из расчета 37 мБк (1 mCi)/100 – 200 µg белка и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. 4. По окончании реакции йодирования аккуратно отбирали жидкую фазу (йодоген, нерастворимый в воде остается на стенках пробирки) и проводили обессоливание меченного белка. Удаление несвязавшегося йода проводили двумя способами: гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 и центрифугированием на микроколонках с сефадексом G-15. Последний способ позволяет быстро и одномоментно обессоливать несколько различных препаратов без сопутствующего классической гель-фильтрации разведения белка. Обессоливание проводили по следующему протоколу: 1. Замачивали сефадекс G-15 в фосфатном буфере на несколько часов, за- тем декантировали получившийся сорбент; 2. Проводили инкубацию в течении 1 часа в 1 %-ном BSA; 3. Формировали микроколонку из 2-мл шприца, которую промывали три- жды фосфатным буфером; 4. Проводили центрифугирование при 1000 об/мин в бакет-роторе для удаления из колонок лишнего буфера ("столбики" сорбента должны слегка отслаиваться от стенок). 85 4. На подготовленные микроколонки наносили радиоактивный препарат, подлежащий обессоливанию, из расчета 20-30 % от объема колонки и центрифугировали при 1000 об/мин 2 мин. Для контроля обессоливания в одну из микроколонок можно нанести смесь Blue Dextran и K3Fe[Fe(CN)6] (красная кровяная соль). 5. Отбирали элюат (обессоленный белок). Для повторного использования микроколонки промывали 20 объемами фосфатного буфера. Радиохимическую чистоту меченных I125 антител определяли методами тонкослойной хроматографии и диск-электрофореза в полиакриламидном геле с SDS с последующим анализом радиоактивности фракций в сцинтилляционной камере Imager (HP). Удельная радиоактивность полученных меченных препаратов обычно находилась в пределах 0,1 - 0,3 mCi/100 µg и, таким образом, эффективность мечения с помощью йодогена колебалась от 10 до 30 %. Радиохимическая чистота полученных препаратов составляла не менее 98 %. Методы количественного определения белка Для определения общего белка в исследуемых образцах мы применяли методы O.H. Lowry (J. Biol. Chem., 1951, V. 193, p. 265-275) (с фенольным реагентом Фолина) и M.M. Bradford (Anal. Biochem., 1976, V. 72, р. 248-254) (окрашивание Кумасси G-250). Для проведения процедуры определения общего белка по методу Бредфор готовили реактив: 100 мг Кумасси G-250 растворяли в 50 мл этанола и добавляли 100 мл ортофосфорной кислоты. Полученный раствор доводили до 1 л дистиллированной водой и профильтровывали через бумажный фильтр. Перед проведением анализа готовили калибровочные разведения БСА в концентрации от 20 мг/мл до 50 мкг/мл в том же буфере, что и исследуемый образец. В 100 мкл реактива вносили от 1 до 20 мкл раствора белка, в зависимости от необходимой чувствительности и ожидаемой концентрации. Перемешивали ресуспендированием и через 10-15 мин измеряли оптическую плотность на планшетном фотометре (Model 680 «Biorad», США) на длине волны 595 нм. После чего строили калибровочную кривую в программе «Microsoft Excel 2010» и рассчитывали концентрацию общего белка в исследуемом образце. Для определения концентрации рекомбинантного BSAT1 в препарате с примесями бактериальных антигенов, проводили электрофоретическое разделение белков в 86 SDS-ПААГ. Предварительно готовили калибровочные концентрации БСА от 2 мг/мл до 50 мкг/мл и разгоняли на одном геле вместе с исследуемыми образцами по вышеописанной методике. Затем проводили сканирование геля и подсчет белковых бэндов в программе «ImageJ». После чего на основе разведений БСА строили калибровочную кривую и рассчитывали концентрацию исследуемого белка в препарате. Приготовление наногелей, конъюгированных с анти-BSAT-антителами Синтез биодеградируемых наногелей (рисунок 2.7.) проводили на основе диблок-сополимера полиэтиленгликоль-b-полиметакриловой кислоты PEG-b-PMA. Полиметакриловая кислота, содержащая большое количество отрицательно заряженных групп COO-, в присутствии Ca2+ образует блок-иономерные комплексы. С целью синтеза комплексов PEG-b-PMA/Ca2+, PEG-b-PMA смешивали с водным раствором CaCl2 в молярном соотношении [Ca2+] : [COO-] = 1 : 3. В получившихся блок-иономерных комплексах цепи блок-сополимеров в «ядре» наногеля связывали с поперечносшивающим агентом при инкубировании в течение ночи. В качестве поперечно-сшивающего агента применяли 1,2-этилендиамин и EDC (N-(3-диметил-аминопропил)-N-этилкарбодиимид гидрохлорид); (степень поперечных сшивок: 20%, [EDC]/[1,2-ethylenediamine] = 2; [COOH]/[EDC] = 5). Количество поперечных сшивок определяет жесткость структуры наногеля, возможность его дальнейшего набухания, и объем загружаемого внутрь вещества и, таким образом, является одним из определяющих физико-химических параметров наногелей. После проведения поперечного сшивания, полученные наногели диализовали (MWCO 3.5 kDa) последовательно против 0.5 % водного раствора аммиака с 2мМ EDTA и затем - дистиллированной воды в течение 48 часов. В дальнейшем, для придания наногелям векторных свойств их конъюгировали с полученными моноклональными антителами к BSAT1. Перед проведением процедуры конъюгации, анти-BSAT1-АТ тиолировали в 10-кратном молярном избытке реагента Траута в боратном буфере с 2-5mM EDTA (0.1 M, pH 8) в течение часа при комнатной температуре и отделяли от избытка тиолирующего агента на гель-фильтрационных микроколонках. 87 PEO - - - PMA - - - Образование комплекса PEG-b-PMA/Ca2+ в присутствии Са2+ «Загрузка» наногелей цисплатином Тиолирование моноклональных антиBSAT1-антител ПЭГилирование анти-BSAT1-антител «Сшивка» ПЭГилированных анти-BSAT1-антител с «загруженными» цисплатином наногелями Рисунок 2.7. Схематическое изображение синтеза наногелей с цисплатином с моноклональными анти-BSAT1-антителами в качестве вектора. К очищенным тиолированным антителам добавляли 10-кратный молярный избыток MAL-PEG-NH2 и инкубировали в течение ночи при 4°C в фосфатном буфере pH 7.4. Полученные ПЭГилированные антитела очищали трехкратной ультрафильтрацией в центриконах (MWCO 30,000 Da, Microcon YM-30) в 10 mM фосфатном буфере (pH 7,4). На следующем этапе наногели (предварительно активированные 10 кратным молярным избытком EDC по отношению к карбоксильным группам в течение 5 мин при комнатной температуре) смешивали с ПЭГилированными антителами и проводи88 ли инкубирование в течение ночи при 4°C. От несвязавшихся антител препарат наногелей отделяли гель-хроматографией на колонке с Сефарозой CL-6B, PBS в фосфатном буфере pH 7,4 со скоростью протока 0,5 мл/мин. Для определения концентрации общего белка использовали реакцию с бицинхониновой кислотой. Для проверки специфической активности анти-BSAT1-АТ в полученных препаратах векторных наногелей применяли метод твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве антигена был использован иммобилизованный на плашке препарат рекомбинантного BSAT1. Для дальнейшей работы отбирали препараты векторных наногелей, положительно реагирующих с BSAT1 в разведении не менее 1:1000. Исследование когнитивных функций у крыс Термин «когнитивные», или «познавательные» процессы употребляется для обозначения тех видов поведения животных и человека, которые основаны, не на ассоциативных процессах, а на оперировании внутренними (мысленными) представлениями. К ним относится некоторые виды памяти (образная память), ряд форм обучения, прежде всего пространственное, а также рассудочная деятельность. Тест распознавания нового объекта Тест проводился в камере размером 45 х 45 х 40 см, условно разделѐнной на 9 квадратов, из серого пластика при комнатном освещении (рисунок 2.8.). объект 2 объект 1 День обучения объект 2 объект 1 объект 2 День тестирования Рисунок 2.8. Камера для проведения теста распознавания нового объекта. Поведенческую активность животных регистрировали с помощью цифровой видеокамеры, расположенной над камерой, и полученные данные анализировали, ис89 пользуя компьютерную программу Any-maze. Тест включал три экспериментальных сессии длительностью 5 мин, разделенные интервалом в 24 ч. Первую сессию проводили при отсутствии объектов для адаптации животного к установке, при этом регистрировали пройдѐнное расстояние, траекторию, время в центре, число и время замираний. Через 24 ч в ходе второй сессии проводили ознакомление животных с объектами. Для этого в установку помещали два одинаковых прямоугольных параллелепипеда размером 6 х 6 х 10 см. Предметы располагали так, чтобы их центры находились на диагонали арены, а расстояние от их граней до стен установки составляло 10 см. Животное помещали в угол, равноудалѐнный от обоих предметов, и в течение 5 мин регистрировалось время, проведѐнное у каждого объекта. Через 24 часа после второй сессии один из параллелепипедов заменяли на усечѐнный конус такой же высоты и проводили третью сессию, во время которой регистрировали время исследования животным каждого из объектов. Считалось, что животное исследует объект, если его голова находилась в пределах 2 см от границ объекта. Индекс дискриминации вычисляли по формуле: I = (Тк – Тп / Тк + Тп)*100% где Тк – время «нового» объекта (конуса), а Тп – время исследования «знакомого» объекта (параллелепипеда) во время третьей сессии. После каждого эксперимента установка и исследуемые объекты тщательно протирались. Тест спонтанного чередования Тест проводили вY-лабиринте - конструкции, изготовленной из металла, с тремя рукавами, расположенными под одинаковыми углами. Размеры рукавов: 30х18х19 см. Пол установки изготовлен из стальных прутьев, расстоянием между прутьями 6 мм (рисунок 2.9.). Во время эксперимента крышки рукавов и центра были открыты и освещались при обычном комнатном освещении. Животное помещали в центр лабиринта и в течение 10 мин отмечали последовательность посещенных рукавов и общее число заходов. 90 Рисунок 2.9. Y-лабиринт для проведения теста спонтанного чередования Индекс спонтанного чередования рассчитывали по формуле: I = (Nт/Ns)*100% где Nт – число последовательно посещѐнных трѐх разных рукавов, Ns – общее число посещѐнных рукавов. Тест пассивного избегания Тест проводили в варианте step-through в установке фирмы Neurobotics (Москва, Россия). Установка изготовлена из серого пластика, передняя стенка – из тѐмного полупрозрачного пластика. Внутренние размеры установки: 40 х 30 х 36 см. В данном эксперименте она была разделена на два равных отсека перегородкой с отверстием посередине на уровне сетки размером 8х8 см. Первый отсек освещался, второй был тѐмным. Устройство электрокожного раздражения представляло собой покрывающую пол сетку с чередованием прутьев различной полярности по Я. Бурешу (переключение полярности по прутьям – 100 Гц) (рисунок 2.10.). Во время сеанса обучения крыс помещали в светлый отсек. Когда животное всеми четырьмя лапами заходило в тѐмный отсек, на сетку подавали ток длительностью 3 с силой 3 мА (минимальная сила тока для данной установки, при которой крыса пытается убежать в другой отсек), после чего тест прекращали, и крысу возвращали в клетку. Фиксировали время перехода в тѐмный отсек. 91 Рисунок 2.10. Камера для проведения теста пассивного избегания Время теста ограничивали пятью минутами. Тестирование сформированного пассивно-оборонительного навыка проводили через 48 часов и 7 дней после обучения. В ходе сеансов тестирования крысу также помещали в светлый отсек, и фиксировали время перехода (время от посадки до момента, когда передние лапы животного оказывались в темной половине), после чего тест прекращали. Если крысы в течение 5 минут не заходили в тѐмный отсек, тест также прекращали и животное возвращали в домашнюю клетку. Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) Данный тест является одним из наиболее общепринятых тестов для оценки тревожного состояния особей и позволяет оценить: Тревожность и параметры оценки риска; Исследовательскую активность; Эмоциональное состояние; Двигательную активность. ПКЛ представляет собой установку из двух закрытых (с высотой стенок 29 см) и открытых (высота бортиков 0,5 см) рукавов, пересекающихся под прямым углом с центральной площадкой размером 14х14 см. Размеры рукавов: 52х14 см. Установка размещалась на высоте 100 см от пола. Открытые рукава освещались лампочками на 80 Вт так, чтобы свет не проникал в закрытые рукава. Крыс помещали в центр установки мордочкой к закрытому рукаву и в течение 5 мин регистрировали: время в закрытых/открытых рукавах, число переходов между рукавами, а также количество «свешиваний» из открытых рукавов. 92 Тестирование в лабиринте Морриса. В начале 80-х годов шотландский исследователь Р. Моррис предложил для изучения способности животных к формированию пространственных представлений использовать «водный лабиринт». Метод приобрел большую популярность, и егостали называть «водным лабиринтом Морриса». Принцип метода заключается в следующем. Животное (мышь или крысу) выпускают в бассейн с водой. Из бассейна нет выхода, но имеется невидимая (вода замутнена) подводная платформа, которая может послужить убежищем: отыскав ее, животное может выбраться из воды (рисунок 2.11.). Рисунок 2.11. Камера для тестирования в водном лабиринте Морриса. Мышь вынимают из бассейна, а через некоторое время снова выпускают плавать, однако уже из другой точки периметра. Постепенно время, которое проходит от пуска животного до отысканияплатформы, укорачивается, а путь упрощается. Это свидетельствует о формировании у него представления о пространственном расположении платформы на основе внешних, по отношению, к бассейну ориентиров. Подобная мысленная карта может быть более или менее точной, а определить, в какой степени животное помнит положение платформы, можно, переместив его в новое по93 ложение. В этом случае, время, которое животное проведет, плавая над старым местоположением платформы, будет показателем прочности следа памяти. Создание специальных технических средств автоматизации эксперимента с водным лабиринтом и программного обеспечения для анализа результатов позволило использовать такие данные для точных количественных сравнений поведения животных в тесте. При этом можно оценивать: динамику формирования пространственного навыка; стратегии поведения животного в ходе опыта; обнаруживать слабые отличия в поведении. Такие возможности делают водный тест Морриса важным инструментом не только для изучения когнитивных функций, но и для решения ряда вопросов современной нейрогенетики. Исследование роли отдельных структур мозга в формировании навыка поиска пищи в радиальном и водном лабиринтах показало, что ключевую роль в этом процессе играет гиппокамп. Фармакологические воздействия, относительно избирательно повреждающие эту структуру, нарушают поведение крыс и мышей в радиальном и водном лабиринте. Тест характеризует способность животных к пространственной ориентации. Оценивали способность животного находить скрытую под водой платформу, основываясь на внешних ориентирах. Использовали бассейн с жесткими пластиковыми стенками диаметром 145 см и глубиной 50 см, который располагался на поддоне на высоте 50 см от пола в центре помещения. Ориентиры для животных (прямоугольники синего и зеленого цвета) были размещены на стенах в случайном порядке и постоянно находились на своих местах на протяжении всего периода обучения всех групп животных. Помещение освещалось рассеянно 2 лампами по 250 Вт. Бассейн заполнялся водой (t – 24 ± 1С) до высоты 25 см. Круглая платформа диаметром 8 см из пластика под цвет установки помещалась в центре одного из квадрантов бассейна на 2 см ниже уровня воды. До проведения тестирования животные проходили обучение. В течение 6 дней каждое животное помещали в бассейн с 8 разных точек и фиксировали время поиска платформы. Если животное за 120 с не обнаруживало платформу, то экспери94 ментатор сам помещал туда крысу, которая должна была оставаться на платформе 30 с. Животное должно научиться использовать пространственные сигналы, расположенные в комнате для тестирования, использовать для того, чтобы найти платформу. На протяжении всего эксперимента расположение обстановочных стимулов и платформы было постоянным. Увеличение времени поиска платформы указывают на ухудшение памяти. Наблюдение траектории плавания производили с помощью видеоустановки. Тестирование опытных животных в водном лабиринте начинали через 2 и 5 недель после СМАо и проводили в течение 6 дней. Лабиринт Морриса представлял собой бассейн со стенками серого цвета диаметром 150 см, на 40 см заполненный водой при температуре 23 С и расположенный в комнате с большим количеством обстановочных пространственных ориентиров. В ходе сеанса обучения крысу помещали в воду и фиксировали время достижения платформы. Животное оставляли на платформе на 15 с, затем помещали в отдельную клетку на 60 с. Крыс, не нашедших платформу за 60 с, мягко направляли к ней. Через 48 ч проводили оценку долговременной памяти в однократной пробе. Моделирование интракраниальной глиомы Эксперименты выполняли на половозрелых самках крыс в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства высшего и среднего образования СССР от 13.11.1984 г. № 742). В течение операции соблюдались стерильные условия. Моделирование интракраниальной опухоли проводили на крысах с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации клеток глиомы С6 по описанной ранее методике [21, 47, 109, 250, 340]. Все манипуляции, причиняющие животным болевую или иную травму, выполняли при наркотизации путем интраперитонеального введения Кетамина (50 мг/кг) и Седуксена (5 мг/кг), при последующем введении через 2-3 минуты вводят 0,1 мл атропина подкожно. Перед закреплением животного на операционном столе глубина наркоза определяется выраженностью моргательного и вибрисс рефлексов. Производили срединный надрез вдоль черепа, кости отделяли от соединительной ткани. За точку отсчета принималась Bregma, образованная пересечением сагитального (sagittal suture) и венечного (coronal suture) швов. Трепанацию черепа про95 изводили с помощью краниотома по следующим координатам: Ар -1,0; L 3,0; V 4,5, TBS - 5 мм (Swanson L.W. «Brain Maps»). Далее клетки глиомы C6 ресуспендировали в 15 мкл бессывороточной среды и отбирали в микрошприц. Имплантировали 4105 клеток с помощью стереотаксического аппарата («Narishige», Япония) через гамильтоновский микрошприц, соединенный с инфузоматом, в правый стриатум со скоростью 5 мкл/мин в объеме 15 мкл. По окончанию введения иглу оставляли в том же положении на 5 минут, после чего медленно извлекали со скоростью 2,5 мм/мин. Рану зашивали и обрабатывали антисептическим раствором. Ежедневно проводили наблюдение за общим состоянием животных, отмечая изменения в весе, характере двигательной активности, состоянии кожного покрова и шерсти, послеоперационные изменения неврологического статуса: появление позных, мышечных и двигательных нарушений, симметричность использования конечностей при движении. Результаты стереотаксической имплантации оценивают по данным МРТ сканирования мозга на томографе Clinscan 7Т («Bruker», Германия) в Т2 режиме. На финальной стадии эксперимента производят фиксацию головного мозга и остальных органов раствором 4% параформальдегида в забуференном физиологическом растворе (PBS рН 7,4) методом трансаортальной перфузии, по общепринятой методике (Бредбери М. «Концепция гематоэнцефалического барьера», 1983). Предварительно животному интраперитонеально вводили летальную дозу Кетамина (50,0 мг/кг) и Седуксена (5,0 мг/кг). Срединным надрезом вскрывали брюшную полость, грудину рассекают с двух сторон поперек ребер. На нисходящий отдел аорты накладывали зажим. Вскрывали полость правого предсердия и далее в области апекса сердца делали надрез, через который в полость левого желудочка до аортального синуса вводили канюлю, присоединенную к шприцу Жане. Перфузию мозга проводили 300 мл 4% раствором параформальдегида, после чего снимали зажим с нисходящей аорты и перфузировали внутренние органы. Затем животное декапитировали и извлекали мозг, печень, селезенку, почки, сердце. Органы выдерживали в фиксирующем растворе в течение 24 часов при 4С. Серийные срезы толщиной 20-40 мкм готовили на замораживающем микротоме (MNT «Slee», Германия). 96 Процедура в/в введения препаратов Препараты антител, липосом и наночастиц вводили животным в/в через бедренную вену. Предварительно животных наркотизировали интраперитонеальным введением Кетамина (50 мг/кг) и Седуксена (5 мг/кг), и через 2-3 минуты вводили 0,1 мл атропина подкожно. Перед закреплением животного на операционном столе глубина наркоза определяется выраженностью моргательного и вибрисс рефлексов. Проводили небольшой разрез в паховой области, тупым методом отслаивали мышцы и фасции, выделяли бедренную вену. Препараты вводили инсулиновым шприцом в объеме 0,2 - 1,0 мл. Транскардиальная перфузия и приготовление срезов органов Транскардиальную перфузию проводили по общеизвестной методике [337] в нашей модификации. Крыс глубоко наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентала натрия и иммобилизировали на препаровальном столике. Срединным разрезом вскрывали брюшную и грудную полости. Вскрывали полость правого предсердия и выпускали кровь. В области верхушки сердца делали надрез, через который в полость левого желудочка до аортального синуса вводилась канюля, присоединенная к системе, фиксатор подавался во все отделы аорты. Система состояла из емкости, содержащей забуференный физиологический раствор (рН 7,4), 3-х канального клапана и соединительных трубочек. Перфузию заканчивали после введения 500-600 мл физраствора, вскрывали брюшину, аккуратно вынимали плодов из матки, не вскрывая плацентарной оболочки, и помещали в 4 %-ный раствор параформальдегида. Через 24 часа постфиксации осторожным скольжением закрытых ножниц вдоль черепа производили скальпирование, освобождались от кожных покровов. При максимальном угловом наклоне лезвий ножниц разрезали череп плода крысы по обеим сторонам от его, извлекали мозг и сразу приклеивали на платформу для образцов для приготовления срезов толщиной 30 µm на вибротоме Microm HM650V. Иммуногистохимический анализ проводили методом двойного иммунофлюоресцентного окрашивания с применением моноклональных антител к BSAT1 и поликлональных антител к GFAP. Анализ срезов проводили на конфокальном микроскопе «Nikon» (Japan). 97 Статистическая обработка полученных результатов Статистическую обработку результатов проводили при помощи программ «Prophet 5.0» и «Excel» из пакета приложений Microsoft Office XP (Microsoft, США). Статистический анализ был проведен с помощью t-критерия Стьюдента, коэффициента корреляции Пирсона и U-критерия с использованием функции Фишера. 98 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному домену специфического транспортера органических анионов церебральных эндотелиоцитов и изучение их иммунохимических свойств. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные анти-BSAT1-АТ, проводили по методу, предложенному Köhler G. и Milstein C. [153] в частичной нашей модификации [339, 341]. В цикле иммунизации самок мышей линии Balb/C (схема иммунизации приведена в гл. 2) был использован препарат рекомбинантного BSAT1. При обнаружении адекватного титра специфических анти-BSAT1-АТ в АС иммунизированных мышей, проводили забор селезенки с целью проведения процедуры слияния. Принципиальная схема процедуры получения гибридом, продуцирующих моноклональные анти-BSAT1-АТ и выделения антител, представлена на рисунке 2.3. (глава 2). Анализ первичной структуры, физико-химических свойств и мембранной топологии BSAT1 позволил идентифицировать 12 трансмембранных доменов, а также внутри- и внеклеточные фрагменты. Для дальнейшей работы был выбран наиболее крупный внеклеточный фрагмент (451 — 557 а.о.), поскольку помимо достаточного для индукции иммунного ответа размера, этот фрагмент является наиболее функционально значимым для связывания с молекулой-мишенью, транспортируемой через ГЭБ. Выбранная схема иммунизации очищенными препаратами BSAT1 позволила получить у мышей Balb/c высокий титр специфических антител через два цикла иммунизации, как в случае применения BSAT1451-557, так и в случае иммунизации белком слияния BSAT1451-557 CBD. Титр секретирующих антител определяли с помощью иммуноферментного анализа и при наличии адекватного иммунного ответа, приготавливали В-лимфоциты селезенки мыши к слиянию. Клетки линии Sp2/0-Ag 14 (рисунок 3.1.), предварительно отобранные на селективной среде с 8-азагуанином (подготовка клеток плазмоцитомы к процедуре слияния приведена в гл. 2), трижды отмывали от ростовой среды. 99 Рисунок 3.1. Клетки линии Sp2/0-Ag14 в культуре перед слиянием,×400. Процедуру слияния В-лимфоцитов селезенки и миеломных клеток проводили с помощью раствора PEG/DMSO («Sigma», США). После слияния клетки высаживали в 96-луночные культуральные планшеты («Costar», США) (Рисунок 3.2.). а b Рисунок 3.2. Микрофотографии культуры клеток после слияния В-лимфоцитов селезенки иммунизированной мыши с клетками миеломы линии Sp2/0-Ag14 (а – увеличение ×200; b – увеличение ×400) Для отбора гибридных клеток, обладающих свойствами как плазмоцитомных, так и лимфоидных предшественников, проводили культивирование в течение первых 14 дней после слияния на селективной среде, содержащей НАТ, а затем в течение недели – на селективной среде НТ (рисунок 3.3). 100 а b Рисунок 3.3. Микрофотографии культуры гибридных клеток на этапе НАТселекции, увеличение ×400. Первую смену селективной среды проводили на 4 сутки, далее – по мере кондиционирования среды. Наблюдение за растущими гибридомами осуществляли ежедневно с помощью инвертированного светового микроскопа («Leica», Германия). Первые клоны гибридных клеток появлялись на 10-14 сутки (Рисунок 3.4.). Тестирование супернатантов из лунок проводили в случаях, когда клон состоял не менее чем из 150-200 клеток. к Рисунок 3.4. Клон гибридных клеток (к), увеличение×400. Отбор секретирующих клонов на первом этапе тестирования проводили с помощью иммуноферментного метода. В качестве посадочного АГ использовали препарат рекомбинантного BSAT1451-557 в концентрации 10 мкг/мл. В качестве вторых АТ 101 использовали коммерческий препарат конъюгата АТ козы к иммуноглобулинам мыши, меченный пероксидазой хрена («Sigma», USA). Тестирование супернатантов в динамике проводилось трижды. После проведения трех этапов иммуноферментного тестирования, были отобраны 8 клонов гибридных клеток, которые в динамике продуцировали анти-BSAT1-АТ с увеличением концентрации. На следующем этапе работы проводили процедуру клонирования – клетки из выбранных лунок рассеивали в ячейки 96-луночной плашки с фидерным слоем (в качестве фидерного слоя использовали перитонеальные макрофаги, рисунок 3.5.) таким образом, чтобы в каждой ячейки находилось только по одной гибридной клетке. ПМ ГК ПМ Рисунок 3.5. Микрофотография клеток фидерного слоя (увеличение ×400. ПМ – клетки фидерного слоя (перитонеальные макрофаги); ГК – гибридные клетки. Культивирование гибридом (рисунок 3.6.) проводили под постоянным контролем с помощью иммуноферментного анализа способности продуцировать антиBSAT1-АТ. Одновременно проводили определение Ig-принадлежности продуцируемых анти-BSAT1-АТ и в дальнейшую работу отобрали клоны, стабильно продуцирующие антитела, принадлежащие к классу Ig G1. На последнем этапе селекции положительные по результатам иммуноблоттанализа клоны тестировали с помощью иммунофлюоресцентного анализа на замороженных срезах головного мозга (иммуногистохимия) и на фиксированных препаратах различных клеточных культур (иммуноцитохимия). 102 Рисунок 3.6. Микрофотографии культуры гибридных клеток на этапе клонирования (при увеличении ×400). По результатам проведенного комплексного тестирования было отобрано три клона гибридом, продуцирующих анти-BSAT1-АТ, позволяющие визуализировать мембранные структуры на замороженных срезах головного мозга и в культуре эмбрионального почечного эпителия HEK293. При проведении процедур дальнейшего клонирования (всего было проведено четыре процедуры), для наращивания клеток отбирали те клоны, которые наиболее стабильно продуцировали анти-BSAT1-АТ. Наращивание клеток от выбранных клонов проводили вначале в ячейках 24луночных планшетов, а затем в матрасах (рисунок 3.7.). Рисунок 3.7. Микрофотографии культуры гибридных клеток, продуцирующих моноклональные анти-BSAT1-антитела, на этапе наращивания. 103 Часть гибридных клеток замораживали в среде для заморозки («Gibco», США) по 5 106 кл/мл и хранили в жидком азоте. Для получения асцита, содержащего анти-BSAT1-АТ, гибридомы в количестве 5 106 клеток вводили интраперитонеально самкам мышей линии Balb/C. За 5 дней до введения клеток, животным интраперитонеально вводили 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан, «Sigma», USA) с целью подавления у них местного иммунного ответа. Непосредственно перед введением в брюшную полость, клетки отмывали от ростовой среды в среде RPMI-1640 без добавления сыворотки. Асцит в виде серозного или серозно-геморрагического выпота появлялся через 10-14 дней после инъекции клеток. Асцитическую жидкость собирали в пробирки, предварительно обработанные гепарином для предотвращения образования фибриновых сгустков. Объем полученной асцитической жидкости от одного животного в среднем составлял 10 – 15 мл, при этом концентрация специфических антител в 1 мл асцита составляла от 1 до 10 мг. После сбора асцитическую жидкость центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g, для отделения от клеток. Полученный супернатант в дальнейшем применяли для выделения моноклональных анти-BSAT1-АТ с помощью иммуноаффинной хроматографии на CNBr-сефарозе. Также асцит использовали в иммуноцитохимии и иммуногистохимии для иммунофлюоресцентного или иммунопероксидазного анализа. Для длительного хранения полученный асцит замораживали и хранили при -70 С либо консервировали добавлением азида натрия и хранили при +4 С. Константу аффинности полученных антител определяли по методике ИФА. Константа аффинности моноклональных антител к рекомбинантному препарату BSAT1 составила Ка = 4,44 ± 0,39 × 108 M-1. В качестве отрицательного контроля использовались неспецифические IgG антитела. Эксперимент был проведен в трех повторах. Для подтверждения иммунохимической специфичности полученных антител по отношению к антигену BSAT1 был проведен иммуноблотт анализ, позволяющий идентифицировать молекулярную массу белка, который взаимодействует с полученными анти-BSAT1-АТ. В процессе проведения исследования на первом этапе провели диск-электрофорез с препаратами рекомбинантного BSAT1: белком BSAT451 и белком BSAT451_CBD. 104 Рисунок 3.8. Графики зависимости OD от концентрации антител. При проявлении время экспозиции рентгеновской пленки на мембране для всех анализируемых антител и антигенов были одинаковым. В результате было продемон- 105 стировано, что полученные анти-BSAT1-АТ селективно распознают рекомбинантные препараты BSAT451 и BSAT451_CBD (рисунок 3.9.). Рисунок 3.9. Результаты диск-электрофореза и иммуноблотт анализа BSAT451 и BSAT451_CBD, очищенных с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTAагарозе, в 15% ПААГ. 1 - Стандарт молекулярных масс (Promega, V8491); 2,3 – белок BSAT451; 4,5 - белок BSAT451_CBD; 6 - Иммуноблоттинг BSAT451 с помощью анти-BSAT1- антител. На следующем этапе иммунохимической характеристики анти-BSAT1-АТ, проводили иммунофлюоресцентный анализ на замороженных срезах головного мозга и на фиксированных препаратах HEK293. В качестве положительного контроля использовали коммерческие анти-BSAT1-АТ (10 мкг/мл, «Antibodies-online Inc», USA). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные IgG из асцита в эквивалентной концентрации. Проявляли козьими анти-мышиными антителами конъюгированными с Alexa Fluor® 488 («Invitrogen», США), ядра докрашивали DAPI («Invitrogen», США). 106 Рисунок 3.10. Результаты иммунофлюоресцентного анализа BSAT1. А, Б. Замороженные срезы мозга крысы. Визуализируются мембранные структуры клеток в паренхиме мозга (А) и в перивазальных пространствах (Б). Увеличение ×200 (А) и ×100. В. Культура клеток HEK293. Ядра клеток докрашены DAPI (Invitrogen, USA). Отрезок 20 мкм. В результате проведенного анализа было продемонстирировано, что антиBSAT1-АТ специфически визуализируют мембранные структуры клеток паренхимы мозга (рисунок 3.10.А) и мелких микрососудов (рисунок 3.10.Б). При иммунофлюоресцентном анализе препаратов клеточных линий наиболее яркая флюоресценция была обнаружена в препарате клеток HEK293. Флюоресцентный сигнал при этом также локализовался в области клеточных мембран (рисунок 3.10.В). Таким образом, в результате проведенного исследования с применением в качестве иммуногена препарата рекомбинантного BSAT451, были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфически распознающие нативный BSAT1 крысы и человека. Полученные антитела могут применяться как для фундаментальных исследований структур, образующих ГЭБ, так и для прикладных разработок направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов через ГЭБ. На основании полученных данных мы приступили к следующему этапу нашей работы – проведению иммуноморфологического анализа органной, тканевой и клеточной локализации BSAT1. 107 ГЛАВА 4. Иммуноморфологический анализ органной, тканевой и клеточной локализации BSAT. Согласно современным данным о мембранной топологии BSAT1, этот белок имеет 10-12 трансмембранных доменов и соответствующее число внутри- и внеклеточных фрагментов. Применяя для иммунизации наиболее крупный внеклеточный фрагмент с 451 по 557 а.о., были получены моноклональные анти-BSAT1-АТ. На этапе тестирования, нами было продемонстировано, что данные антитела при иммунофлюоресцентном анализе специфически выявляют мембранные структуры в паренхиме мозга и перивазальном пространстве. В связи с тем, что при иммуногистохимическом анализе срезов мозга моноклональными анти-BSAT1-АТ окрашивались клетки, морфологически похожие на астроциты, нами было проведено двойное иммунофлюоресцентное окрашивание с помощью моноклональных антител к BSAT1 и поликлональных антител к GFAP, полученных нами ранее [339, 341]. В результате этого исследования, было продемонстрировано, что специфическое свечение, обусловленное антителами к BSAT1 и GFAP локализуется в одних и тех же клетках (рисунок 4.1.), но не совпадает. В результате проведенного исследования, по совокупности с полученными результатами иммуноблотт анализа, результаты иммуногистохимического подтверждают специфичность полученных антител к BSAT1, поскольку последний является интегральным мембранным белком. Относительно экспрессии этого белка в HEK293, следует отметить, что ранее было показано, что клетки 293 продуцируют как белки плотных контактов (ZO1, окклюдин и клаудин), так и некоторые нейроспецифические белки [42]. 108 Рисунок 4.1. Результаты двойного иммунофлюоресцентного окрашивания замороженных срезов мозга крысы с помощью моноклональных антител к BSAT1 и поликлональных антител к GFAP. А. BSAT1. Б. GFAP. В. Ядра клеток докрашенные DAPI. Г. Совмещенное изображение. Отрезок 10 мкм. Таким образом, экспрессия в этих клетках цереброспецифического анионного транспортера вполне объяснима. Кроме того, положительное окрашивание клеток HEK293 позволяет заключить о том, что полученные нами антитела распознают BSAT1 крысы и человека. На следующем этапе исследования для оценки органной специфичности BSAT1, распознаваемого полученными моноклональными антителами проводили иммуногистохимический анализ на вибротомных срезах органов крысы (рисунок 4.2.). Учитывая высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей BSAT1 и других представителей семейства OATP, экспрессирующихся в печени и почках, прежде всего, проводили иммунофлюоресцентный анализ на срезах этих органов. В результате проведенного исследования, было продемонстрировано, что ни в печени, ни в почках флюоресценция, показывающая экспрессию BSAT1, не отличалась от контрольных срезов, окрашенных только вторичными антителами с AlexaFlu109 or® 488 (рисунок 4.2.А, Б). Отсутствие экспрессии BSAT1 по данным иммуногистохимического анализа также наблюдалось на срезах селезенки, легкого и сердца. В тоже время, на срезах яичников экспрессия BSAT1, выявляемая моноклональными анти-BSAT1-АТ, была обнаружена в примордиальных фолликулах (рисунок 4.2.В). Рисунок 4.2. Результаты иммуногистохимического анализа BSAT1 на вибротомных срезах органов крысы. А. Почка, Б. Печень. В. Яичник. 1. Суммарное изображение (дифференциально-интрерференционный контраст, синяя и зеленая флюоресценция). 2. Окрашивание ядер клеток (DAPI, Invitrogen). 3. Моноклональные антитела к BSAT1 и вторичные антимышиные антитела с AlexaFluor 488. В продолжение исследования, проводили двойное иммунофлюоресцентное окрашивание с помощью моноклональных антител к BSAT1 и поликлональных антител к GFAP срезов мозга крысы. При этом было продемонстрировано, что специфическая флюоресценция BSAT1 в нормальной нервной ткани локализуется преимущественно в GFAP-положительных астроцитах (рисунок 4.3.). 110 Рисунок 4.3. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализа BSAT1 и GFAP на срезах головного мозга. А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. ИммунофлюоресценцияBSAT1. Г. ИммунофлюоресценцияGFAP. Д., Е. Иммунофлюоресцентный анализ BSAT1 в глиальной опухоли 101/8. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. красная флюоресценция – поликлональные антитела к GFAP. При иммуногистохимическом исследовании срезов мозга, содержащих глиальные опухоли С6 и 101/8 мы также обнаружили экспрессию BSAT1 как в перитуморальной области в реактивных астроцитах, образующих глиальный вал вокруг опухоли, так и в самих глиомных клетках (рисунок 4.3.Д – Е). При иммуноцитохимическом исследовании в культуре клеток HEK293, синтезирующих белки плотных контактов окклюдин (рисунок 4.4.), кадгерин (рисунок 4.5.) и ZO1 (рисунок 4.6.) полученные моноклональные анти-BSAT1-АТ выявляли экспрессию данного белка преимущественно в мембранных структурах, при этом наблюдалась частичная колокализация BSAT1 и окклюдина (рисунок 4.4.А). В этих же клетках сигнал BSAT1 точно колокализовался с мембранным треккером Dil. При иммунофлюоресцентном анализе с коммерческими анти-BSAT1-АТ отмечалась подобная картина – ярко визуализировались мембранные структуры и гораздо слабее – область цитоплазмы. В отрицательном контроле специфического свечения не наблюдалось. 111 Рисунок 4.4. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и окклюдина в культуре клеток HEK293. А Б А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция окклюдин. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. красная флюоресценция – антитела к окклюдину. В Г Рисунок 4.5. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и кадгерина в культуре клеток HEK293. А Б А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция кадгерина. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция –антитела к кадгерину. В Г Рисунок 4.6. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и ZO1 в культуре клеток HEK293. А Б А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция ZO1. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция – антитела к ZO1. В Г 112 Иммуноцитохимический анализ BSAT1 в культуре церебральных эндотелиоцитов крысы (RBEC). После получения результатов иммуногистологического анализа анти-BSAT1АТ, мы приступили к следующему этапу исследования - иммуноцитохимическому анализу анти-BSAT1-АТ на культуре церебральных эндотелиоцитов крысы. Получение первичной культуры церебральных эндотелиальных клеток из мозга крысы проводили согласно протоколу [247, 285] в некоторой нашей модификации (глава 2). Эндотелиоциты в количестве 2 104 кл/см2 высаживали на предварительно покрытые раствором фибронектина-коллагена покровные стѐкла в лунки 48луночного планшета в 200 мкл ростовой среды. Через 12 часов объем среды увеличивали до 400 мкл и культивировали до образования монослоя на 70-80 % поверхности стекол в течение 2 – 3 дней. В дальнейшем проводили иммуноцитохимический анализ по протоколу, описанному в главе 2. Как видно на рисунке 4.7., при иммуноцитохимическом исследовании в культуре клеток церебральных эндотелиоцитов крысы визуализируется двойное окрашивание одних и тех же клеток, но с различной локализацией – внутриклеточное окрашивание ZO1 и отчетливо визуализируется клеточная мембрана, выявляемая антиBSAT1-АТ. В отрицательных контролях специфической флюоресценции не было. Рисунок 4.7. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и ZO1 на в культуре клеток RBEC. А Б А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция ZO1. Красная флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-АТ. Зеленая флюоресценция – антитела к ZO1. В Г 113 Иммуноцитохимический анализ BSAT1 в культуре эндотелиоцитов пупочной вены человека (HUVEC). После получения положительных результатов по визуализации BSAT1 на мембранах церебральных эндотелиоцитов с применением моноклональных анти-BSAT1АТ, необходимо было проанализировать экспрессию этого белка в эндотелиоцитах нецеребрального происхождения. В качестве опытных эндотелиоцитов, мы использовали культуру эндотелиоцитов, полученных из пупочной вены человека (HUVEC). В качестве протокола получения HUVEC мы использовали методику, предложенную Jaffe E.A. [137, 136] в некоторой нашей модификации (глава 2.). После выделения культуры эндотелиоцитов, для проведения эксперимента клетки в количестве 2 104 кл/см2 высаживали в лунки 48-луночного планшета на покровные стекла и культивировали до появления монослоя на 80-90 % площади. В дальнейшем проводили иммуноцитохимический анализ по протоколу, описанному в главе 2. В результате проведенного анализа, как видно на рисунке 4.8., в культуре клеток HUVEC экспрессии BSAT1 выявлено не было, в тоже время, антитела к кадгерину визуализировали мембранные структуры эндотелиоцитов. Так же не отмечалось специфической флюоресценции в отрицательных контролях. Рисунок 4.8. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и кадгерина в культуре клеток HUVEC А В Б Г А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция кадгерина. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция – антитела к кадгерину. Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать заключение о том, что эндотелиоциты, выделенные из пуповины человека, не способны 114 продуцировать BSAT1, что дало нам основания проводить дальнейшее изучение условий, способствующих появлению экспрессии этого белка. На сегодняшний день существует огромное количество научных данных об эффекте влияния астроцитов на фенотипические свойства эндотелиоцитов при совместном культивировании. В связи с этим, на следующем этапе нашего исследования мы изучали экспрессии BSAT1 в культуре эндотелиоцитов из вены пуповины после их кокультивирования с культурой первичных астроцитов. На основании литературных данных нами была выбрана модель несмешанного кокультивирования, при которой невозможно один вид клеток отделить от другого, а кокультивирования с использованием вкладок Transwell®, которые дают возможность совместного культивирования по разные стороны полупроницаемой мембраны, физически разделяя два типа клеток и исключая их миграцию, но, в тоже время, дают возможность свободного обмена ростовыми факторами между астроцитами и эндотелиоцитами. Протокол проведения ко-культивирования эндотелиоцитов и астроцитов приведен в главе 2. После совместного культивирования клеток культуры HUVEC и астроцитов в течении 7 суток, проводили иммуноцитохимический анализ эндотелиоцитов. На рисунке 4.9. в результате иммуноцитохимического анализа с помощью моноклональных анти-BSAT1-АТ выявляется экспрессия BSAT1 в мембранных структурах кокультивированных эндотелиоцитов. Рисунок 4.9. Результаты двойного иммунофлюоресцентного анализ BSAT1 и кадгерина в культуре клеток HUVEC А В Б Г А. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Г. Иммунофлюоресценция кадгерина. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция – антитела к кадгерину. 115 Иммуноцитохимический анализ BSAT1 в культуре астоцитов. Полученные при исследовании тканевой локализации BSAT1, предполагают проведение дальнейшего исследования экспрессии этого белка в культуре астроцитов и эндотелиоцитов. Таким образом, на следующем этапе исследования, нами была предпринята попытка анализа продукции BSAT1 в культуре первичных астроцитов из неонатального мозга крысы. Культуру клеток получали по протоколу, описанному в главе 2. Клетки, полученные после первого пассажа, высаживали на покровные стекла в лунки 48луночного планшета в концентрации 5 104 клеток/мл. К проведению иммуноцитохимического анализа приступали после 14 дней культивирования. Протокол проведения иммуноцитохимического анализа приведен в главе 2. В результате проведенного исследования, было продемонстрировано наличие специфического свечения в культуре первичных астроцитов при обработке и антиBSAT1-АТ, и анти-GFAP-АТ. Одновременное окрашивание анти-GFAP-АТ было обусловлено необходимостью идентификации астроцитов. При этом на суммарном изображении (рисунок 4.10.) отчетливо видно, что флюоресценция выявляется в одних и тех же клетках, но не совпадает по внутриклеточной локализации. В отрицательном контроле специфического свечения выявлено не было. 116 А Г Б В Д Е Рисунок 4.10.Результаты иммуноцитохимического анализа BSAT1 в культуре астроцитов крысы. А., Г. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Д. Иммунофлюоресценция GFAP. Е. Культура астроцитов, световая микроскопия. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция – антитела к GFAP. 117 Иммуноцитохимический анализ BSAT1 в культуре глиомы С6. Полученные в предыдущих экспериментах данные, могут служить предпосылкой для проведения следующего эксперимента – изучение экспрессии BSAT1 в опухолевых клетках. В качестве опытных образцов мы применяли клетки крысиной глиомы С6. Культивирование клеток проводили in vitro по протоколу, приведенному в главе 2. Клетки высаживали на покровные стекла в лунки 48-луночных плашек в концентрации 1-2 106 клеток/мл. Культивирование проводили на протяжении 3-4 суток, после чего приступали к проведению иммуноцитохимического анализа. Протокол проведения иммуноцитохимического анализа приведен в главе 2. При данном исследовании, нами проводилось одновременное окрашивание с антителами к антигенам, специфичным для клеток глиомы С6 – актину, тубулину и кадгерину. Как видно на представленных рисунках, в результате проведенного эксперимента, специфическая флюоресценция, выявляемая антителами к BSAT1 присутствовала на всех клетках глиомы С6. При суммарном изображении выявлялись структурные компоненты цитоскелета глиомных клеток, окрашиваемые антителами к актину, и выявляемые анти-BSAT1-АТ внутриклеточные структуры с ярким окрашиванием мебранных компонентов (рисунок 4.11.). При одновременном иммуноцитохимическом анализе с применением антител к тубулину и анти-BSAT1-АТ также выявлялась двойная флюоресценция одних и тех же глиомных клеток, практически совпадающая по внутриклеточной локализации (рисунок 4.12.). Одновременное окрашивание антителами к кадгерину и анти-BSAT1-АТ выявляло суммарное флюоресцентное окрашивание по периферии клеток (рисунок 4.13.). 118 А Г Б Д В Е Рисунок 4.11. Результаты иммуноцитохимического анализа BSAT1 в культуре клеток глиомы С6. А., Г. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция актина. Д. Иммунофлюоресценция BSAT1. Е. Культура клеток глиомы С6, световая микроскопия. Зеленая флюоресценция – антитела к актину. Красная флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. 119 А Б В Г Д Е Рисунок 4.12. Результаты иммуноцитохимического анализа BSAT1 в культуре клеток глиомы С6. А., Г. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция BSAT1. Д. Иммунофлюоресценция тубулина. Е.Культура клеток глиомы С6, световая микроскопия. Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Красная флюоресценция – антитела к тубулину. 120 А Г Б В Д Е Рисунок 4.13. Результаты иммуноцитохимического анализа BSAT1 в культуре клеток глиомы С6. А., Г. Суммарное изображение. Б. Ядра клеток, окрашенные DAPI В. Иммунофлюоресценция кадгерина. Д. Иммунофлюоресценция BSAT1. Е. Культура клеток глиомы С6, световая микроскопия. Зеленая флюоресценция – антитела к кадгерину. Красная флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-антитела. Таким образом, в результате проведенного иммуноморфологического анализа, включаещего в себя исследование органной, тканевой и клеточной локализации BSAT1 с применением полученных моноклональных анти-BSAT1-АТ, было продемонстрировано: - При иммуногистохимическом анализе ткани мозга крыс, выявлена экспрессия BSAT1, локализизующаяся в области свечения GFAP-положительных астроцитов; - Показано отсутствие экспрессии BSAT1 на срезах печени, почек, легкого крысы. В тоже время, в области примордиальных фолликулов яичников экспрессия BSAT1 обнаружена; 121 - При иммуноцитохимическом анализе культур церебральных эндотелиоцитов и эндотелиальных клеток из вены пуповины, кокультивированных с астроцитами выявляется специфическая флюоресценция, подтверждающая наличие BSAT1 с локализацией по периферии клеток и в области мембран клеток. В тоже время, специфического свечения эндотелиальных клеток из вены пуповины до кокультивирования с астроцитами выявлено не было; - При иммуноцитохимическом анализе астроцитов из неонатального мозга крысы и клеток глиомы С6 выявляется яркое свечение мембран клеток, обусловленное экспрессией BSAT1. Полученные результаты послужили предпосылкой для проведения следующего этапа исследования – анализу распределения меченных анти-BSAT1-АТ в организме взрослых и новорожденных крыс при внутривенном введении. 122 ГЛАВА 5. Изучение влияния анти-BSAT1-антител на когнитивные функции беременных крыс и их потомства Хорошо известно, что для проникновения через гематоэнцефалический барьер в нейроны и клетки глии гидрофильных тиреоидных гормонов необходимы специфические транспортеры тиреоидных гормонов (рисунок 5.1.) [89, 139, 205, 258, 336]. В случае мутации по гену транспортера монокарбоксильных соединений-8 (MCT8), одного из переносчиков ТГ, у людей вызывает синдром Аллана-Херндона-Данли, проявляющийся сильно выраженным слабоумием и неврологическими нарушениями, снижением тонуса и спастичностью мышц, а также увеличенной концентрацией Т3 и сниженной Т4 в крови [74, 89]. Рисунок 5.1. Схематическое изображение транспорта тиреоидных гормонов (ТГ) в ткани мозга мышей. T4 могут проникать через гематоэнцефалический барьер при помощи транпортеров Mct8 и Oatp1c1. Поглощение T3 в ЦНС также зависит от Mct8. 123 При дефиците МСТ8 у мышей также отмечаются изменения уровня ТГ, однако когнитивных нарушений у этих животных выявлено не было [45, 148, 316]. При исследовании метаболизма гормонов щитовидной железы у мышей, лишенных МСТ8, было показано, что у таких животных снижено проникновение Т3 через ГЭБ, но транспорт Т4 в мозг не нарушен [35, 127, 296]. Как было показано, дефицит МСТ8 у грызунов компенсируется за счет BSAT1 (или Oatp1c1) [225, 296]. В эндотелиоцитах мозга и сосудистого сплетения грызунов показан высокий уровень экспрессии BSAT1 [55], в то время как у людей он довольно слабо экспрессируется только в микрососудах мозга [233]. Несмотря на то, что у нокаутных по гену BSAT1 мышей, проводилось исследование концентрации Т3, Т4, тиреотропина и тиролиберина в сыворотке крови, эффекты снижения биосинтеза BSAT1 на когнитивные функции крыс изучены не были [127, 193]. В связи с этим, в одну из задач нашего исследования входило изучение когнитивных функций потомства беременных крыс, которым однократно в интранатальном периоде внутривенно вводили анти-BSAT1-АТ. С учетом того, что формирование ГЭБ плода происходит с 11 по 17 день эмбрионального развития [23], исследование по проникновению антител через фетоплацентарный и ГЭБ плода проводилось после введения меченых антител на 16 день гестации и после 72-часовой циркуляции в организме матери. В предварительных экспериментах нами было продемонстрировано специфическое накопление анти-BSAT1-АТ в ткани мозга плодов крыс после однократного внутривенного введения этих антител на 16 день гестации. При проведении экспериментального исследования животные были разделены на три группы: 1. Потомство, полученное от самок крыс, которым на 16 день гестации вво- дили анти-BSAT1-АТ; 2. Потомство, полученное от самок крыс, которым на 16 день гестации вво- дили неспецифические IgG мыши (группа сравнения) 3. Потомство, которым на 16 день гестации внутривенно вводили физиоло- гический раствор. Беременным самкам крыс (по 3 в каждой группе, возраст 3 мес., вес 240-280 г) на 16-й день гестации под общей анестезией кетамином (внутрибрюшинно, 100 мг/кг) 124 в бедренную вену вводили раствор анти-BSAT1-АТ, неспецифических IgG мыши из расчета 5 мг/кг или эквивалентное количество физраствора. К процедуре тестирования поведения потомства приступали по достижении возраста 30 дней. Дальнейшие экспериментальные исследования проводили на самцах. В опытной группе было 15 животных, группе сравнения – 21, в контрольной – 17. Исследование проводилось слепым методом (т.е. экспериментатор не знал, потомство каких крыс тестируется). Крыс содержали в клетках (55 х 35 х 20 см) по 5-7 особей при постоянной температуре 22С, световом дне 12 ч и свободном доступе к пище и воде. Эксперименты проводили с 9 до 16 часов с интервалом 2-3 дня в следующем порядке: (1) Y-лабиринт, (2) распознавание нового объекта, (3) пассивное избегание и (4) водный лабиринт Морриса. Методика проведения тестирования приведена в главе 2. К началу поведенческих экспериментов животные не различались по массе и динамике прироста веса. Индекс спонтанного чередования в Y-лабиринте, являющийся показателем рабочей памяти, у крыс опытной группы был достоверно ниже, чем у крыс группы сравнения и контрольной (20,4 ± 2, 29,2 ± 0,6 и 28,4 ± 0,9 соответственно; p<0,001), в то же время значения индекса между двумя последними не отличались (p>0.05) (рисунок 5.2.). Крысы все трех групп (анти-BSAT1-АТ, IgG и физраствор) не различались между собой по числу заходов в рукава лабиринта (17,0 ± 0,8; 16,7 ± 1 и 15,6 ± 1,0 соответственно; p > 0,05) (рисунок 5.2.). 125 Рисунок 5.2. Индекс спонтанного чередования в тесте Y-лабиринт (в условных единицах). *p<0.001 по сравнению с опытной группой. В тесте распознавания нового объекта значение индекса дискриминации, характеризующего соотношение времени исследования нового и знакомого предметов, у животных опытной группы составило -26,1 ± 7,0, что было существенно ниже, чем в группах сравнения и контрольной (41,8 ± 5,6 и 40,3 ± 8,4 соответственно; p < 0.001) (рисунок 5.3.). Статистически значимых отличий между двумя контрольными группами выявлено не было (p > 0.05). Более того, как видно из представленного рисунка, по данному параметру эти группы практически не отличались. Следует отметить, что двигательная активность, оцениваемая по пройденному пути (м) в первой сессии теста, не различалась у животных всех трех групп (8,1 ± 1,2; 6,7 ± 0,9 и 7,4 ± 1,4; p > 0.05). Латерализации, т.е. предпочтения какого-либо угла установки, которая оценивалась по плотности нахождения программой Any-Maze, также не выявлено ни в одной из групп. 126 Рисунок 5.3. Тест распознования нового объекта (в условных единицах). *p<0.001 по сравнению с опытной группой. При оценке долговременной рабочей памяти в модели пассивного избегания через 48 ч после обучения у крыс контрольной группы (с анти-BSAT1-АТ) сохранность навыка, оцениваемая по разнице времени перехода в темный отсек (с), была намного ниже (56,0 ± 27,0), чем в группах с введением физраствора и неспецифических IgG (225,0 ± 24,0 и 253,0 ± 10,0 соответственно; p < 0.001). Как видно из представленных на рисунке данных, достоверных различий между группой сравнения и группой контроля найдено не было (p > 0.05) (рисунок 5.4.). 127 Рисунок 5.4. Разница по времени (с) перехода в темный отсек в тесте пассивного избегания *p<0.001 по сравнению с опытной группой. При тестировании кратковременной пространственной памяти в лабиринте Морриса крысы всех групп обучались одинаково. Но через 48 ч при оценке долговременной памяти крысы контрольной группы (с анти-BSAT1-АТ) достоверно дольше находили платформу (53,2 ± 2,8), чем животные, матерям которым вводили физраствор и IgG (35,6 ± 4,4 и 33,1 ± 5,0 соответственно; p < 0.01). При этом разницы между группой контроля группой сравнения выявлено не было (p > 0.05) (рисунок 5.5.). 128 Рисунок 5.5. Время (с) нахождения животными платформы в тесте Морриса через 48 ч (при однократной пробе) после обучения. *p<0.01 по сравнению с опытной группой. В результате проведенного исследования были продемонстрированы нарушения когнитивных функций, возникающие при интранатальном внутривенном введении беременным самках крыс антител к BSAT1. Так, у потомства крыс, после внутривенного введения самкам моноклональных анти-BSAT1-АТ, наблюдаются нарушения рабочей памяти в Y-лабиринте, долговременной визуальной памяти в модели распознавания нового объекта, рабочей долговременной в тесте пассивного избегания и долговременной пространственной памяти в тесте Морриса. В пользу специфичности влияния этих антител на когнитивные процессы свидетельствует отсутствие достоверных различий в данных тестах между крысами группы сравнения, матерям которых вводили неспецифические IgG, и контрольной группой, матерям которой вводили физраствор. Результаты проведенных в нашем исследовании поведенческих тестов свидетельствуют о нарушениях функциональной активности различных структур мозга, вовлеченных в процессы памяти и обучения: периринальной и префронтальной коры 129 [208], а также гиппокампа [82]. В связи с этим, можно предположить, что наблюдаемые эффекты анти-BSAT1-АТ обусловлены нарушением транспорта Т4 через временную блокаду их мишени – BSAT1, что приводит к развитию локального гипотиреоидизма в мозге на критических стадиях его раннего развития, последствия чего проявляются уже в зрелом возрасте. Однако, для подтверждения наших предположений необходимо продолжения исследований, направленных на изучение влияния анти-BSAT1-АТ на уровень ТГ в мозге, а также на экспрессию Т3 зависимых генов. 130 ГЛАВА 6. Исследование распределения меченных I125 и AlexaFluor® 660 анти-BSAT1антител in vivo и оценка перспектив применения моноклональных антител для селективной доставки контейнерных систем экспериментальную глиому 101/8. В связи с тем, что одной из задач проводимого исследования, явилось обоснование применения полученных моноклональных анти-BSAT1-АТ для разработки систем направленного транспорта к клеткам церебрального эндотелия, мы приступили к анализу распределения этих антител в организме взрослых крыс и новорожденных крысят после внутривенного введения. Как уже было продемонстрировано в предыдущих исследованиях, в условиях in vitro, происходит связывание моноклональных анти-BSAT1-АТ с церебральными эндотелиоцитами и при флюоресцентном анализе четко визуализируются мембранные структуры этих клеток. До изучения вопроса применения антител в условиях in vivo у крыс с индуцированной глиомой С6, на первом этапе, мы приступили к анализу проникновения меченных анти-BSAT1-АТ через фето-плацентарный и гематоэнцефалический барьеры и накоплению этих антител в ткани головного мозга. Исследование накопления анти-BSAT1-АТ в головном мозге плода, введенных в кровоток беременной самки на 16 день гестации Экспериментальное исследование проводили на белых беспородных самках крыс и их потомстве. Исследование проводили на двух группах крысят: 1. Потомство, полученное от самок, которым на 16 сутки гестации вводили анти-BSAT1-антитела (опытная группа); 2. Группа контроля – потомство от самок, которым на 16 сутки гестации внутривенно вводили неспецифические IgG мыши. Проведение эксперимента: беременным самкам крыс (по 4 в каждой группе, возраст 3 мес., с весом 240-280 г) на 16-й день гестации под общей анестезией кетамином (внутрибрюшинно, 100 мг/кг) в бедренную вену вводили раствор 500 мкг меченых флуоресцентной меткой Alexa Fluor®660 анти-BSAT1-АТ. Контрольным животным вводили эквивалентное количество меченных неспецифических иммуногло131 булинов мыши. Анализ локализации и накопления антител в срезах мозга плода опытной и контрольных групп, проводили через 24 часа и через 72 часа после внутривенного введения В результате проведенного исследования было показано, что максимальная концентрация неспецифических IgG в контрольной группе наблюдалось через 24 часа после введения, однако, в дальнейшем происходила элиминация неспецифических антител из мозга, и к концу наблюдения (72 часов) флуоресценция отсутствовала (рисунок 6.1.). Рисунок 6.1. Распредение неспецифическихIgG мыши, меченных AlexaFluor 660 А – через 24 ч после введения Б – через 72 ч после введения. В тоже время, у плодов крысы, которым вводили анти-BSAT1-АТ, при анализе срезов мозга, в больших полушариях и мозжечке плода крысы обнаруживалась специфическая флюоресценция, обусловленная накоплением антител к BSAT1, вплоть до 72 часов после введения (рисунок 5.2.). С целью подтверждения клеточной локализации анти-BSAT1-АТ, cрезы мозга плодов докрашивали поликлональными антителами к GFAP и ZO1 (рисунок 5.3.). 132 Рисунок 6.2. Распредение анти-BSAT1-АТ, меченных AlexaFluor 660 А – через 24 ч после введения Б – через 72 ч после введения. А Рисунок 6.3. Результаты исследования колокализации BSAT1, GFAP и ZO1 в эндотелиоцитах мозжечка плодв крысы. Красная флюоресценция – моноклональные анти-BSAT1-АТ; Б Зеленая флюоресценция – моноклональные анти-GFAP-АТ; Оранжевая флюоресценция – поликлональные антитела к ZO1. 133 Таким образом, в результате проведенного эксперимента было подтверждено специфическое накопление моноклональных анти-BSAT1-АТ в ткани мозга плода, обусловленное селективным взаимодействием с антигеном, а не пассивную диффузию из плазмы в межклеточное пространство головного мозга и наглядно демонстрирует проникновение введеных антител через фето-плацентарный и гематоэнцефалический барьеры крыс. Исследование распределения меченных I125 анти-BSAT1-АТ при внутривенном введении крысам с индуцированной глиомой С6. После получения результатов анализа проникновения анти-BSAT1-АТ через фето-плацентраный и гематоэнцефалический барьеры и специфическому накоплению этих антител в ткани мозга плодов, мы приступили к анализу распределения этих антител в органах и тканях у взрослых крыс с индуцированной глиомой С6. Для этого мы использовали анти-BSAT1-АТ, предварительно меченные I125. Протокол приготовления анти-BSAT1-АТ конъюгированных с I125 приведен в главе 2. Для проведения эксперимента были взяты две группы крыс с 18-дневной экспериментальной глиомой С6: 1. Крысы, которым вводили меченные I125 анти-BSAT1-АТ; 2. Группа контроля – крысы, которым внутривенно вводили меченные I125 неспецифические IgG мыши. Антитела вводили крысам внутривенно под кетаминовым наркозом из расчета 250 мкг/кг (50 мкг антител на животное весом 200 г). После введения через 1 мин, 10 мин, 1, 24 и 48 часов у крыс забирали венозную кровь для построения кривой элиминации антител из кровотока. Через 48 часов после введения антител животных контрольной и опытной групп перфузировали 300 мл физраствора, органы выделяли, взвешивали и оценивали их радиоактивность (% от введенной дозы на 1 г сырого вещества). В результате проведенного эксперимента было наглядно продемонстрировано, что более 80% внутревенно введенных антител (и анти-BSAT1-АТ, и неспецифических иммуноглобулинов мыши) исчезает из кровотока в течение 48 часов после введения (таблица 6.1., рисунок 6.4.). Остаточная радиоактивность крови через 48 часов, составляющая 1,12% ± 0,1% от введенной дозы на мл крови для анти-BSAT1-АТ и 134 1,1% ± 0,07% от введенной дозы на мл крови для IgG мыши, может быть обусловлена пулом антител, потерявших иммунохимическую активность в результате йодирования. Таблица 6.1. Кинетика анти-BSAT1-АТ и неспецифических IgG мыши, меченных 125 Iв крови Вид антител MAb BSAT1 IgGm Радиоактивность крови (% от введенной дозы на мл, M ± m) 1 мин 10 мин 1 час 24 часа 48 часов 7,34± 0,59 6,58 ± 0,74 4,85 ± 0,71 1,19 ± 0,03 1,12 ± 0,10 6,34 ± 0,31 5,45 ± 0,39 4,29 ± 0,45 1,46 ± 0,05 1,10 ± 0,07 Рисунок 6.4. Кинетика моноклональных анти-BSAT1-АТ, меченных I125, в крови крыс с экспериментальной глиомой С6. Таким образом, анализ распределения меченых анти-BSAT1-АТ по органам подтвердил, что эти антитела не накапливаются в печени, почках, легком, сердце и селезенке, а также в интактном левом полушарии головного мозга. Накопление радиоактивных анти-BSAT1-АТ в этих органах не отличалось от накопления неспецифических иммуноглобулинов мыши (рисунок 6.5.). 135 Рисунок 6.5. Распределение меченых 125I моноклональных антител к BSAT1 по органам после внутривенного введения. * — p< 0.05 при сравнении с контролем (IgG мыши). Достоверно более высокое, по сравнению с контрольными иммуноглобулинами, накопление моноклональных анти-BSAT1-АТ наблюдалось в ткани глиальной опухоли (0,261 ± 0,064 % введенной дозы / г для анти-BSAT1-АТ и 0,095 ± 0,014 % введенной дозы / г для IgG мыши). Необходимо отметить, что аналогичное накопление анти-BSAT1-АТ по сравнению с IgG мыши наблюдалось в яичниках (0,259 ± 0,025 и 0,106 ± 0,007 % введенной дозы / г, соответственно). Полученные результаты полностью согласуются с предварительно полученными данными по анализу органной локализации анти-BSAT1-АТ. Направленный транспорт контейнерных систем на основе моноклональных анти-BSAT1-АТ в экспериментальную глиому 101/8. Накопление специфических анти-BSAT1-АТ в области глиомы, превышающее более чем в 20 раз накопление неспецифических IgG мыши, дает основания предпо- 136 ложить, что моноклональные антитела к BSAT1 могут быть использованы в качестве вектора при создании систем направленного транспорта в область глиом. Хорошо известно, что эффективность фармакологических препаратов центрального типа действия определяется по возможности проникновения лекарственного вещества их системного кровотока в ткань мозга. Этот фактор зависит о преодоления гематоэнцефалического барьера, одними из основных клеточных компонентов которого являются эндотелиоциты капилляров мозга. В связи с особенностями морфологического строения этого типа клеток – наличия плотных межклеточных контактов и отсутствие межклеточных пор, подавляющее большинство химических веществ практически не способно проникать через барьер. В связи с этим, проводились поиски различных веществ, способным проникнуть за пределы ГЭБ [21, 31, 90, 134, 138, 252]. На сегодняшний день в качестве контейнера для доставки множества биологически активных веществ и различных диагностических и лекарственных препаратов используются наноконтейнерные препараты различных видов – липосомы, наночастицы, ноногели. Наноконтейнерные препараты довольно широко используются в клинической практике, в частности, в противоопухолевой терапии в связи с тем, что способствуют снижению токсичности лекарственного препарата с одновременным повышением его терапевтического эффекта. В связи с развитием методов диагностики и химиотерапии были созданы препараты направленного типа действия, обладающие пролонгированными фармакокинетическими свойствами и способностью контролируемого высвобождения препаратов в очаге опухоли. В настоящее время одним из классических подходов к пролонгированию циркуляции лекарственных препаратов в крови, уменьшению системной токсичности и улучшению биодоступности, является заключение их в наноконтейнеры. В мировой литературе приводится множество научных исследований, посвященных разработке препаратов напраравленного типа действия – липосом, мицелл, наногелей и наночастиц [224]. При проведении конъюгации наноконтейнерных препаратов с моноклональными антителами к антигенам клеток опухолевой ткани и перитуморальной зоны, такие наноконтейнеры приобретаю векторные свойства. В качестве перспективного антигена с целью доставки лекарственных и диагностических препаратов к клетам глиомы можно рассмотривать и цереброспецифический анионный транспортер (BSAT1). 137 Как было показано при предыдущих исследованиях, моноклональные антиBSAT1-АТ при системном введении обладают способностью специфически накапливаться в очаге глиомы и, тем самым, повышать селективность наноконтейнерного препарата к клеткам опухоли. В связи с этим, на следующем этапе исследования проводилось изучение терапевтической эффективности химиопрепарата цисплатин, заключенного в наноконтейнер на моделях глиомы С6 и глиомы 101/8. В качестве векторного наноконтейнера применяли векторные наногели, любезно синтезируемые к.х.н. Нуколовой Н.В. и соавт. [21, 216]. Наногели представляют собой набухшую пространственную структурную сеть полимеров, которая способна сохранять форму и стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей (ковалентные сшивки). Наногели позволяют конструировать системы доставки лекарственных средств с контролируемым «спусковым механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, наногели могут быть модифицированы различными векторными группами, которые способствуют избирательной направленной доставке БАВ в определенные органы или клетки-мишени. Способ приготовления биодеградируемых биогелей описан в главе 2. Для проведения исследований по терапевтическому эффекту векторных наногелей, мы использовали крыс с экспериментальной глиомой 101/8. Глиома крысы 101/8 была получена в 1967 г. путем имплантации твердой пилюли диметилбензантрацена в мозжечок самки крысы Вистар [342]. Клетки глиомы 101/8 поддерживались в коллекции НИИ МЧ РАМН с помощью интрацеребральных пассажей, часть клеток находилась в глубокой заморозке в жидком азоте. При экспериментальном моделировании опухоль имеет признаки глиобластомы (high grade glioma) и по своим характеристикам (высокая пролиферативная активность, выраженная васкуляризация и некротизация ткани, склонность к инвазии) близка к глиобластоме человека и является наиболее адекватной моделью для проведения экспериментальной химиотерапии [278]. Таким образом, глиобластома 101/8 с одной стороны, является альтернативной моделью мультиформной глиобластомы человека [342], а, с другой стороны, данная глиобластома, несмотря на более злокачественный, чем у глиомы С6 рост и меньшую продолжительность жизни животных, более чувствительна к ле138 чению платина-содержащими цитостатиками. Вследствие этого данная экспериментальная модель и была выбрана в качестве модели для испытаний наноконтейнерных форм цисплатина. На первом этапе эксперимента, до проведения исследований in vivo, проводили исследование цитотоксичности (рисунок 6.6.) полученных наногелей в условиях in vitro на культуре клеток глиобластомы 101/8 с помощью MTS реагента («Invitrogen», США). Для определения цитотоксичности в монослой клеток глиобластомы 101/8 в убывающей концентрации, начиная от 1 мг/мл, вносили растворы наногеля. Оценку жизнеспособности клеток проводили через 48 часов после внесения препарата на планшетном анализаторе Enspire (Perkin Elmer). Для подсчета процента погибших клеток применяли формулу: ЦИ (%)= [1-(ОПо-ОПс)/ОПм - ОПс]*100% где ОПо – оптическая плотность в опытных пробах ОПс – оптическая плотность среды, ОПм – оптическая плотность в контрольных лунках При проведении MTS-тест было показано, что LD50 для свободного цисплатина составляет 62 мкг/мл. Процедура введения цисплатина в наноконтейнер позволяет повысить LD50 в 2,5 раза. Последующая конъюгация наноконтейнеров с моноклональными анти-BSAT1-АТ увеличивало специфическую цитоксичность по отношению к глиомным клеткам в 1,5 раза. На следующем этапе исследования проводили анализ специфического захвата векторных наноконтейнеров клетками глиобластомы 101/8 в условиях in vitro. Для этого, проводили мечение наногелей с помощью сукцинимидного эфира красителя AlexaFluor® 488 («Invitrogen», США) и оценивали динамику захвата наногелей с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа. Перед внесением векторных наногелей, клетки глиобластомы 101/8 метили с помощью ацидофильного флюоресцентного лизотреккера («Promega», США). Таким образом, было продемонстрировано, что при внесении векторных наногелей в концентрации 1 – 20 мкг/мл по общему белку происходит проникновение их внутрь клеток глиобластомы 101/8. 139 Рисунок 6.6. Результаты исследования специфической токсичности на культуре клеток глиомы 101/8. После проведения предварительных экспериментов in vitro, приступили к выполнению экспериментов на крысах с моделированной глиобластомой 101/8. Исследование проводили на самках породы Вистар (n = 37) с весом 200 ± 30 г., которым под наркозом кетамин (80 мг/кг) + ксилазин (20 мг/кг) имплантировали в дно третьего желудочка кусочки опухоли глиобластомы 101/8 (моделирование выполнялось в НИИ морфологии человека РАМН доктором А.С. Халанским). При проведении имплантации у крысы с подтвержденной опухолью забирались клетки глиобластомы 101/8 в количествее не менее 106 клеток опухоли и ткань опухоли измельчали. У экспериментальной крысы на правой теменной кости черепа на расстоянии 2,0 мм от саггитального шва и 2,0 мм каудально от венечного шва делали отверстие с помощью зубоврачебного бора ( 2,0 мм), затем с помощью троакара ( 1,8 мм) вводили измельченную ткань опухоли на глубину 4,0 мм от поверхности кости в дно правого бокового желудочка. Отверстие в кости обрабатывали Н2О2, затем засыпали порошком сульфаниламидных препаратов, рану на коже обрабатывали йодом и заклеивали коллодием; рана затягивалась в течение 24 часов. На 5 сутки после имплантации проводили МР-исследование на томографе 140 ClinScan («Bruker BioSpin», Германия) с напряженностью поля 7Т (300MГц для 1H). Изображения получали с использованием объемной 20-и см катушки как передатчика РЧ-импульса и двухсегментной поверхностной катушки для приѐма сигнала. После подтверждения наличия индуцированной глиобластомы, животным начинали проводить специфическую терапию. В дальнейшем, на протяжении эксперимента, МРисследования проводили на 10, 15, 20 и 25 сутки после имплантации. Для терапевтического применения на группе животных с имплантированной глиомой (n = 32) использовали следующие препараты: цисплатин (CDDP, n = 5), невекторные наногели (NG, n = 8), векторные наногели с неспецифическими IgG мыши в качестве вектора (NG-IgG, n = 4), векторные наногели с анти-BSAT1-АТ в качестве вектора (NG-BSAT1, n = 6) и группа животных с плацебо (5 % глюкоза, n = 9). Все препараты вводили в бедренную вену под кетаминовым наркозом, 1 раз в 5 дней, начиная с 5 суток после имплантации, в дозировке при пересчете на концентрацию цисплатина 5 мг/кг веса. Результаты экспериментальной терапии оценивали по динамике развития опухоли (на основании проводимого МРТ (ClinScan, «Bruker BioSpin», Германия) исследования и морфометрии) и увеличению продолжительности жизни. Результаты представлены в таблице 6.2. Таблица 6.2. Сводные данные по экспериментальной терапии крыс с экспериментальной глиобластомой 101/8 Название препа- Количество рата животных Схема терапии (сутки после имплантации) Медиана выМРТ (сутки после живаемости имплантации) (сутки после имплантации) NG 6 26 NG-IgG 6 20 NG-Мab-BSAT1 7 CDDP 8 28 Плацебо 10 15 5 – 10 – 15 5 – 10 – 15 – 20 - 25 39 (5% глюкоза) Морфометрический анализ глиобластомы проводили в динамике с помощью программного пакета ImageJ (Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, 141 Bethesda, Maryland, США) по Т2 взвешенным изображениям. Площадь повреждения измеряли отдельно на каждом срезе, а затем рассчитывали объем всей опухоли по следующей формуле: V = (S1 + … + Sn) * (h + d) V – объем опухоли S1...n – измеряемая площадь каждого среза h – толщина среза d – межсрезовый промежуток. В дальнейшем, объем, полученный расчетами двух ортогональных плоскостех (коронарной и трансверсальной), усредняли. Для статистической обработки данных морфометрии использовали непараметрический критерий Манна-Уитни для двух несвязанных групп. Используемый статистический уровень значимости p 0.05, минимальное количество данных для включения в сравнение n = 3. При имплантации приживаемость глиобластомы 101/8 составляла не менее 95 %. Крысы с имплантированной глиобластомой, по данным МРТ у которых начинался рост глиомы, без лечения погибали в 100 % случаев, медиана выживаемости этих крыс составляла 15 суток (Таблица 6.2.). Перед экспериментами по терапии образцы мозга крыс с экспериментальной глиомой 101/8 исследовали с помощью иммуногистохимического и гистологического методов на предмет экспрессии BSAT1. При гистологическом анализе развивающихся интрастриарных глиом в период с 5 по 15 сутки были обнаружены все признаки мультиформной глиобластомы: наличие полиморфизма клеток, параклеточного отека, кровоизлияний и центрального некроза, а также быстро развивающейся внутричерепной дислокацией (рисунки 6.7., 6.8.). 142 А Б Рисунок 6.7. Результаты морфологического анализа экспериментальной глиобластомы 101/8. А - Общий вид опухоли ( 5) Б – Очаг некроза в центральной части глиомы ( 100) ткань мозга опухоль Б А Рисунок 6.8. Результаты морфологического анализа экспериментальной глиобластомы 101/8. А – Полиморфизм ядер ( 400) Б – Кровоизлияния в центральной части опухоли ( 200) При иммуногистохимическом анализе ткани опухоли глиобластомы 101/8 была продемонстрирована экспрессия BSAT1 в центральной части и в перитуморальной зоне (рисунок 6.9.). 143 Рисунок 6.9. Результаты иммуногистохимического анализа экспериментальной глиобластомы 101/8. A. Merge. В. Окрашивание ядер клеток DAPI. C. Иммунофлюоресценция BSAT1 в опухоли. D. Иммунофлюоресценция GFAP в перитуморальной зоне астроглиального вала. Отрезок 100 мкм. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия. Таким образом, результаты проведенных морфологического и иммуногистохимического анализов служили основанием для проведения эксперимента по изучению векторных наноконтейнерных препаратов цисплатина с анти-BSAT1-АТ в качестве вектора для терапии низкодифференцированных глиом. При проведении эксперимента после проведения МРТ внутривенно вводили векторные наноконтейнерные препараты цисплатина и контрольные препараты. Животные с имплантированной глиобластомой 101/8 и получавшие в качестве терапии 5% глюкозы (плацебо), погибали максимально в течение 21 суток (медиана выживаемости 15 суток), (рисунок 6.10.). При этом отмечалось постепенное снижение веса тела к 15 суткам после имплантации (рисунок 6.10.). 144 Рисунок 6.10. Результаты выживания крыс после терапии наноконтейнерным цисплатином. CDDP — свободный цисплатин; NG — невекторные наногели; NG-MAbBSAT1 — наногели с моноклональными антителами к BSAT1 NG-IgG — наногели с неспецифическими иммуноглобулинами. Плацебо – контрольная группа, получавшая 5% глюкозу; Относительное суммарное увеличение веса на 20 сутки объясняется тем, что у выживших животных на протяжении наблюдения не изменялся, а животные с резкой потерей веса к 20 суткам уже погибли. Постмортально у животных выявляли отек мозга с кровоизлиянием в ткань опухоли; при прорастании в желудочковую систему отмечалось присоединение окклюзионной гидроцефалии. 145 Рисунок 6.11. Динамика веса животных с имплантированной глиомой при терапии наноконтейнерным цисплатином. В группе животных, получавших терапию цисплатином (CDDP) отмечаловь увеличение выживаемости, по сравнению с группой плацебо. Однако клинически с 5 по 15 сутки состояние крыс было объективно тяжелее - двигательная активность снижалась, выявлялись признаки поражения ЦНС и периферической нервной системы. Потеря веса у животных этой группы к 15 суткам была большей, чем в группе животных с плацебо. Однако в дальнейшем значимой потери веса у этих животных не происходило. После 15 суток отмечалась относительная стабилизация состояния и продолжительность жизни увеличивалась до 45 суток. Таким образом, медиана выживаемости у животных этой группы (28 суток) была достоверно выше по сравнению с животными из группы плацебо (15 суток). У группы животных, получавших наноконтейнерный цисплатин (NG), отмечалась относительная сохранность двигательной активности до 25-27 суток (до гибели животных). Также была менее выраженная потеря веса у животных этой группы. Таким образом, объективное состояние крыс было объективно лучше, чем у животных групп плацебо и с цисплатином. Медиана выживаемости у этих животных была выше (26 суток), чем в группе плацебо. 146 Аналогичная ситуация наблюдалась в группе животных, получавших терапию наноконтейнерным цисплатином с неспецифическим вектором (NG-IgG): объективно отмечалось более легкое состояние, двигательная активность сохранялась практически до 25 суток жизни, когда развивались симптомы внутричерепной дислокации. Потери веса в группе этих животных не наблюдалось. Медиана выживаемости, однако, была несколько ниже (20 суток), чем у животных, получавших невекторный наноконтейнерный цисплатин. У животных, получавших препарат векторного наноконтейнерного цисплатина (NG-MAb BSAT1) не выявлялись признаки объективного ухудшения состояния и развития неврологической симптоматики вплоть до момента гибели. Медиана выживаемости крыс этой группы (39 суток) была достоверно выше, чем у животных других экспериментальных групп. Потери веса в этой группе животных не наблюдалось (рисунок 6.11.). Динамическое МРТ головного мозга крыс проводили на 5, 10, 15, 20 сутки после имплантации (рисунок 6.12.) и при этом на аксиальных и коронарных сканах определяли объем опухоли. При последующем морфометрическом анализе (рисунок 6.13.) было показано, что объем глиомы у крыс, получавших в качестве терапии наноконтейнерный невекторный цисплатин (NG), наноконтейнерный цисплатин с неспецифическим вектором (NG-IgG) и 5% глюкозу, достоверных отличий не имел до 15 суток включительно после имплантации, затем у животных групп с плацебо и NGIgG отмечалось резкое увеличение объема опухоли и животные погибали. Объем опухоли у животных, получавших препарат векторного наноконтейнерного цисплатина (NG-MAb BSAT1) практически до 30 суток исследования был достоверно ниже, чем у животных групп плацебо, NG и NG-IgG. В тоже время, у группы животных, получавших цисплатин (CDDP), объем опухоли достоверно не отличался от объема глиомы у крыс группы (NG-MAb BSAT1) до 30 суток наблюдения, однако после 30 суток выявлено быстрое увеличение роста опухоли. 147 5 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки Рисунок 6.12. Динамическая МРТ головного мозга крыс с имплантированной глиобластомой 101/8. CDDP — свободный цисплатин; NG — невекторные наногели; NG-MAbBSAT1 — наногели с антителами к MAb BSAT1 NG-IgG — наногели с неспецифическими иммуноглобулинами. Dextrose – контрольная группа, получавшая 5% глюкозу. 148 Рисунок 6.13. Результаты морфометрического анализа объема глиомы в экспериментальных группах животных. CDDP — свободный цисплатин; NG — невекторные наногели; NG-MAbBSAT1 — наногели с моноклональными антителами к BSAT1 NG-IgG — наногели с неспецифическими иммуноглобулинами. Плацебо – контрольная группа, получавшая 5% глюкозу. Таким образом, в результате проведенного эксперимента на основании анализа выживаемости показано, что терапия глиобластомы 101/8 адресными препаратами наноконтейнерного цисплатина достоверно более эффективна, чем терапия невекторными наногелями и свободным цисплатином. Кроме того, с применением объективных методов исследования – МРТ и морфометрии – продемонстрировано, что на начальных этапах развития опухолевого процесса при терапии препаратами векторных наногелей с цисплатином объем опухоли достоверно меньше, чем у крыс группы плацебо, а также получавших терапию невекторного наноконтейнерного цисплатина и препаратом наноконтейнерного цисплатина с неспецифическим вектором. Результаты проведенного эксперимента могут служить предпосылками для развития нового направления в области создания транспортных систем векторного типа действия – лекарственных препаратов на основе моноклональных антител к цереброспецифическомй анионному транспортеру BSAT1. 149 ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Изучение первичной структуры и мембранной топологии BSAT1 дало возможность выявить и локализовать внеклеточный фрагмент этого мембранно- ассоциированного белка, характеризующийся наличием сайта связывания с транспортируемым через ГЭБ лигандом, высокой степенью гомологии с BSAT1 человека и, что особенно важно в аспекте выполняемой работы, обладающим необходимой иммуногенностью для формирования антительного ответа. Клонирование BSAT451 в соответствующие векторы позволило получить штамм E. coli, продуцирующий рекомбинантный BSAT1 с относительно высоким выходом (10 мг/л). В результате проведенной работы был получен иммуногенный крупный внеклеточный фрагмент (451 — 557 а.о.), наиболее функционально значимый для связывания с молекулой-мишенью, транспортируемой через ГЭБ. Этот фрагмент BSAT1 крысы характеризовался высокой степенью гомологии с BSAT1 человека. После проведения цикла иммунизации мышей Balb/c внеклеточным фрагментом BSAT1 и последующего слияния В-лимфоцитов этих мышей с клетками миеломы линии Sp2/0-Ag14 были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к BSAT1. Эти антитела способны распознавать антиген, экспрессирующийся в нервной ткани, в ткани яичников, а также в тканях опухолей глиального происхождения. При проведении иммуногистохимического анализа ткани мозга крыс выявлена специфическая экспрессия BSAT1, что также подтверждает результаты исследований, проводимых Li J. et al. [178]. В своих исследованиях при анализе кДНК, полученной из суммарной мРНК фракции микрососудов, этими авторами была описана нуклеотидная последовательность новой изоформы OATP. В связи с тем, что астроциты, также, как и перициты прочно оплетают микрососуды, при выделении последних методом градиентного центрифугирования невозможно полностью разделить эндотелиальные и астроцитарные клетки. Таким образом, возможно, кДНК BSAT1 была получена из мРНК астроцитов. При иммуногистохимическом анализе BSAT1 на срезах почек, печени и сердца было показано отсутствие экспрессии этого белка, так же как и отсутствие накопления радиоактивно меченых моноклональных антител в этих органах. Таким образом, 150 полученые антитела к BSAT1 перекрестно не реагируют с OATP 1-3, экспрессирующимися в печени и почках, а также с OATP-D [5]. Накопление радиоактивно меченных антител к BSAT1 в яичниках и иммунофлюоресцентная визуализация клеток фолликулов объясняется перекрестным взаимодействием моноклональных антиBSAT1-АТ с его ближайшим гомологом у человека и крысы — белком OATP-F, экспрессия которого описана в мозге и репродуктивном тракте [225]. Идентичность аминокислотной последовательности BSAT1 и OATP-F составляет 86%. В результате проведения иммуноцитохимического анализа культур церебральных эндотелиоцитов и эндотелиальных клеток из вены пуповины, кокультивированных с астроцитами продемонстрирована специфическая флюоресценция, подтверждающая наличие BSAT1 с локализацией по периферии клеток и в области мембран клеток. Необходимо отметить, что специфического свечения эндотелиальных клеток из вены пуповины до кокультивирования с астроцитами выявлено не было. В связи с тем, что при исследованиях, проведенных Mayerl S. и соавт. [193, 206], Ferrara A.M. и соавт. [83] на нокаутных мышах было показано важное влияние BSAT1 для транспорта в ткань мозга тиреоглобулина, нами был проведен эксперимент по анализу поведенческих тестов у потомства крыс, матерям которых во время беременности проводилась однократная инъекция анти-BSAT1-АТ. В результате проведенного нами исследования наглядно продемонстрировано влияние воздействия антител к внеклеточному фрагменту BSAT1 на поведение экспериментальных животных. Так, было установлено, что у потомства крыс, получавших моноклональные анти-BSAT1-АТ, наблюдаются нарушения рабочей памяти в Yлабиринте, долговременной памяти в модели распознавания нового объекта, тесте пассивного избегания и долговременной пространственной памяти в тесте Морриса. В пользу специфичности влияния анти-BSAT1-АТ на когнитивные процессы свидетельствует отсутствие различий в данных тестах между крысами группы контроля антител, матерям которых вводили неспецифические IgG, и контрольной группой, матерям которой вводили физраствор. Полученные нами данные полностью согласуются с мировыми литературными данными [35, 36, 126, 127, 139, 148, 259] и результатами исследований других авторов [83, 89, 193, 206, 225]. Результаты проведенных нами поведенческих тестов свидетельствуют о нарушениях функциональной активности различных структур мозга, вовлеченных в про151 цессы памяти и обучения: периренальной и префронтальной коры [208], а также гиппокампа [82]. По всей видимости, наблюдаемые эффекты воздействия анти-BSAT1АТ связаны с нарушением транспорта Т4, и развитием эффекта гипотиреоидизма. Полученная экспериментальная модель может в дальнейшем быть использована для изучения петогенетической роли тиреоидных гормонов в механизмах интегративной деятельности ЦНС, а также для исследования действия различных фармакологических препаратов в условиях in vivo. Предпосылкой для проведения эксперимента, связанного изучением возможности использования анти-BSAT1-АТ в качестве векторов при создании систем направленного транспорта в ткань мозга, служило доказанное специфическое накопление анти-BSAT1-АТ в области глиомы, превышающее более чем в 20 раз накопление неспецифических IgG мыши. На начальных этапах эксперимента было показано, что у животных при лечении препаратом цисплатином в свободной форме медиана выживаемости достоверно выше, нежели чем у животных, пролеченных препаратом цисплатина в виде наногеля без вектора или наногеля с неспецифическим вектором. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что проникновение цисплатина в виде наногеля через неповрежденный гематоэнцефалический барьер более затруднено по сравнению со свободным низкомолекулярным цисплатином. В тоже время, при конъюгации наногелей, содержащих цисплатин, с анти-BSAT1-АТ позволило увеличить эффективность доставки этого препарата к клеткам глиомы, о чем косвенным образом свидетельствуют результаты МРТ–морфометрии и более высокая медиана выживаемости животных. Таким образом, на примере экспериментальной глиомы 101/8 была продемонстрирована эффективность терапевтического применения векторных наногелей, содержащих цисплатин, ковалентно связанными с моноклональными анти-BSAT1-АТ. Кроме того, показано, что данная экспериментальная модель может служить для разработки новых цитостатических препаратов. Локализация глиомы 101/8 позволяет учитывать такие феномены, как проникновение препарата через эндотелиальный барьер в неопластических церебральных микрососудах, наличие интерстициальный отѐка и повышения гидравлического давления в ограниченном костями черепа пространстве. В совокупности, эти факторы способствуют более адекватной экстраполяции получаемых экспериментальных данных на интрацеребральные опухоли челове152 ка. Полученные антитела могут применяться как для фундаментальных исследований структур, образующих гематоэнцефалический барьер, так и при разработке систем направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов через ГЭБ. 153 ВЫВОДЫ 1. Иммунизация мышей линии Balb/c рекомбинантным препаратом эктраклеточного фрагмента (451-557 а.o.) ассоциированного с нервной тканью анионного транспортера BSAT1 и последующее слияние В-лимфоцитов этих мышей с клетками миеломы линии Sp2/0-Ag14 позволили получить гибридому, продуцирующую моноклональные анти-BSAT1-АТ, характеризующиеся константой аффинности равной 4,4 108 М-1. 2. Полученные моноклональные анти-BSAT-АТ способны специфично распознавать экстраклеточный фрагмент (451-557 а.o.) ассоциированный с нервной тканью анионного транспортера BSAT1 в иммунохимическом анализе (иммуноблот, иммуноферментный и иммуноцитологический анализ) нативных препаратов дефинитивной и патологически измененной нервной ткани. 3. Иммуноцитологический и иммуногистохимический анализ BSAT1 на основе полученных моноклональных анти-BSAT1-АТ позволяет специфично локализовать антиген в GFAP-положительных астроцитах нормальной нервной ткани и примордиальных фолликулах яичников. Моноклональные анти-BSAT1-АТ визуализируют глиомные клетки. При конфокальной микроскопии BSAT1 локализуется в структурных компонентах цитоскелета актин-позитивных глиомных клеток. 4. Выявлены ингибирующие эффекты анти-BSAT1-АТ на когнитивные функции потомства самок крыс, которым в пренатальном периоде парентерально вводили анти-BSAT1-АТ. Среди них: нарушение рабочей памяти в Y-лабиринте, снижение долговременной памяти в модели распознавания нового объекта, тесте пассивного избегания, а также долговременной пространственной памяти в тесте Морриса. 5. Полученные моноклональные анти-BSAT1-АТ, введенные внутривеннно крысам с глиомой С6 способны достоверно накапливаться в ткани глиомы (0,26 ± 0,02). 6. Применение с терапевтической целью векторной нанонтейнерной системы на основе моноклональные анти-BSAT1-АТ и полиэлектролитных гелей нагруженных цисплатином позволяет достоверно уменьшить скорость роста экспериментальной глиомы 101/8 крысы и достоверно увеличить медиану выживаемости лабораторных животных. 154 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Abbott NJ, Romero IA. Transporting therapeutics across the blood-brain barrier. // Mol Med Today // 1996 – V.2 (3) – P.106–113 2. Abbott NJ, Ronnback L, Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood- brain barrier. // Nat Rev Neurosci. – 2006 – V.7 (1) – P.41–53 3. Abbruscato TJ, Lopez SP, Mark KS et al. Nicotine and cotinine modulate cerebral mi- crovascular permeability and protein expression of ZO-1 through nicotinic acetylcholine receptors expressed on brain endothelial cells. // J Pharm Sci. – 2002 – V.91 (12) – P.2525–38 4. Abe T, Kakyo M, Sakagami H. et al. Molecular characterization and tissue distribution of a new organic anion transporter subtype (oatp3) that transports thyroid hormones and taurocholate and comparison with oatp2. // J Biol Chem – 1998 – V.273 – P. 22395-22401. 5. Adachi H, Suzuki T, Abe M. et al. Molecular characterization of human and rat organic an- ion transporter OATP-D. // Am J Physiol Renal Physiol – 2003 – V.285 – P.1188-1197 6. Al Ahmad A, Taboada CB, Gassmann M, Ogunshola OO. Astrocytes and pericytes dif- ferentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. // J Cereb Blood Flow Metab. – 2011 - V.31 (2) – P.693–705 7. Alebouyeh M, Takeda M, Onozato ML. et al. Expression of human organic anion trans- porters in the choroid plexus and their interactions with neurotransmitter metabolites. // J Pharmacol Sci - 2003 – V.93 – P. 430-436. 8. Allen JD, Brinkhuis RF, Wijnholds J, Schinkel AH. The mouse Bcrp1/Mxr/Abcp gene: amplification and overexpression in cell lines selected for resistance to topotecan, mitoxantrone, or doxorubicin. // Cancer research. – 1999 – V.59 (17) – P.4237–41 9. Amo EM, Urtti A, Yliperttula M. Pharmacokinetic role of L-type amino acid transporters LAT1 and LAT2. // European journal of pharmaceutical sciences: official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. – 2008 – V.35 (3) – P.161–74. 10. Angeletti RH, Novikoff PM, Juvvadi SR et al. The choroid plexus epithelium is the site of the organic anion transport protein in the brain. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1997 – V.94 (1) – P.283–6 11. Anzai N, Jutabha P, Kanai Y, Endou H. Integrated physiology of proximal tubular or- ganic anion transport. // Curr Opin Nephrol Hypertens. – 2005 – V.14 – P.472–479. 12. Anzai N., Kanai Y., and Endou H. Organic Anion Transporter Family: Current Knowledge. // J Pharmacol Sci – 2006 - V.100 - P. 411-426 13. Arian Emami Riedmaier, Anne T. Nies, Elke Schaeffeler et al. Organic Anion Trans- porters and Their Implications in Pharmacotherapy // Pharmacol Rev – 2012 – V.64 – P.421–449 14. Asif AR, Steffgen J, Grunewald RW. et al. Presence of organic anion transporters 155 3(OAT3) and 4(OAT4) in human adrenocortical cells. // Pflugers Arch – 2005 – V.450 – P. 88-95. 15. Au-Yeung SC, Rurak DW, Gruber N, Riggs KW. A pharmacokinetic study of diphenhy- dramine transport across the blood-brain barrier in adult sheep: potential involvement of a carriermediated mechanism. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2006 – V. 34 (6) – P.955–60. 16. Azzi G, Bernaudin JF, Bouchaud C et al. J. Permeability of the normal rat brain, spinal cord and dorsal root ganglia microcirculations to immunoglobulins G. // Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. – 1990 – V. 68 (1) - P.31–6. 17. Babu E, Takeda M, Narikawa S, et al. Role of human organic anion transporter 4 in the transport of ochratoxin A. // Biochimica et biophysica acta. – 2002 – V. 1590 (1-3) – P.64–75. 18. Bahn A, Ljubojevic M, Lorenz Het al. Murine renal organic anion transporters mOAT1 and mOAT3 facilitate the transport of neuroactive tryptophan metabolites. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2005 – V. 289 – P.1075–1084. 19. Baklaushev VP, Grinenko NF, Savchenko EA et al. Neural progenitor and hemopoietic stem cells inhibit the growth of low-differentiated glioma. // Bull Exp Biol Med. – V.152(4) – P.497-503. 20. Baklaushev VP, Grinenko NF, Tsitrin EB,et al. Downregulation of gap junctions in astrocytes by anti-Connexin-43 monoclonal antibodies. British Journal of Medicine & Medical Research – 2011 – V.1(2) – P.35-44. 21. Baklaushev VP, Kavsan VM, Balynska OV et al. New Experimental Model of Brain Tumors in Brains of Adult Immunocompetent Rats. // British Journal of Medicine & Medical Research – 2012 – V. 2(2) – P. 206-215 22. Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Tsitrin EB, et al. Visualization of connexin 43-positive cells of glioma and the periglioma zone by means of intravenously injected monoclonal antibodies. // Drug Deliv. – 2011 – V.18(5) – P.331-337. 23. Ballabh P, Braun A, Nedergaard M. The blood–brain barrier: an overview Structure, regulation, and clinical implications. // Neurobiology of Disease. – 2004 – V. 16 – P. 1–13 24. Ballerini P, Di Iorio P, Ciccarelli R et al. Glial cells express multiple ATP binding cas- sette proteins which are involved in ATP release.Neuroreport. – 2002 – V. 13 (14) - P.1789–92. 25. Bansal T, Jaggi M, Khar RK, Talegaonkar S. Emerging significance of flavonoids as P- glycoprotein inhibitors in cancer chemotherapy. // J Pharm Pharm Sci. – 2009 – V. 12 (1) – P.46– 78. 26. Bart J, Groen HJ, Hendrikse NH et al. The blood-brain barrier and oncology: new in- sights into function and modulation. // Cancer treatment reviews. – 2000 – V. 26 (6) – P.449–62. 156 27. Bauer H., Traweger A., Bauer H. Proteins of the tight junction in the blood brain barri- er. In: Sharma HSW.J, editor. // Blood-Spinal Chord and Brain Barriers in Health and Disease. Elsevier; San Diego – 2004 – P. 1-10. 28. Belitsky P., Ghose T., Aquino J. et al. Radionuclide imaging of metastases from renal- cell carcinoma by 131I-labelled antitumor antibody. // Radiology - 1978 - V. 126. - P. 515-517 29. Bendayan R, Lee G, Bendayan M. Functional expression and localization of P- glycoprotein at the blood brain barrier. // Microscopy research and technique. – 2002 – V. 57 (5) – P.365–80. 30. Bendayan R, Ronaldson PT, Gingras D et al. In situ localization of P-glycoprotein (ABCB1) in human and rat brain. // The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. – 2006 – V. 54 (10) – P.1159–67. 31. Bernacki J, Dobrowolska A, Nierwiñska K et al. Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier // Pharmacological Reports – 2008 – V.60 – P.600-622 32. Boron WF, Boulep EL. Medical Physiology. Elsevier Saunders // Philedelphia, PA – 2005 - P. 1269. 33. Borst P, Evers R, Kool M, Wijnholds J. A family of drug transporters: the multidrug re- sistance-associated proteins. // Journal of the National Cancer Institute. – 2000 – V. 92 (16) – P.1295–302. 34. Brady KP, Dushkin H, Fornzler D, et al. A novel putative transporter maps to the osteo- sclerosis (oc) mutation and is not expressed in the oc mutant mouse. // Genomics. – 1999 – V. 56 (3) – P.254–61. 35. Braun D, Kinne A, Bräuer AU et al. Developmental and cell type-specific expression of thyroid hormone transporters in the mouse brain and in primary brain cells. // Glia. – 2011 – V. 59 (3) – P. 463-471 36. Braun D, Wirth EK, Schweizer U. Thyroid hormone transporters in the brain. // Rev Neurosci. – 2010 – V. 21 (3) – P. 173-186. 37. Breedveld P, Pluim D, Cipriani G, et al. Effect of Bcrp1 (Abcg2) on the in vivo phar- macokinetics and brain penetration of imatinib mesylate (Gleevec): implications for the use of breast cancer resistance protein and P-glycoprotein inhibitors to enable the brain penetration of imatinib in patients. // Cancer research. – 2005 – V. 65 (7) - P.2577–82. 38. Bronger H, Konig J, Kopplow K et al. ABCC drug efflux pumps and organic anion up- take transporters in human gliomas and the blood-tumor barrier. // Cancer research. – 2005 – V. 65 (24) – P.11419–28. 157 39. Burckhardt BC, Burckhardt G. Transport of organic anions across the basolateral mem- brane of proximal tubule cells. // Reviews of physiology, biochemistry and pharmacology. – 2003 – V. 146 – P.95–158. 40. Busch AE, Karbach U, Miska D et al. Human neurons express the polyspecific cation transporter hOCT2, which translocates monoamine neurotransmitters, amantadine, and memantine. // Molecular pharmacology. – 1998 – V. 54 (2) – P.342–52. 41. Buxhofer-Ausch V, Secky L, Wlcek K et al. Tumor-specific expression of organic aniontransporting polypeptides: transporters as novel targets for cancer therapy. // J Drug Deliv. – 2013 42. Camassei FD, Boldrini R, Jenkner A, et al. Expression of glial cell line-derived neu- rotrophic factor and neurturin in mature kidney, nephrogenic rests, and nephroblastoma: possible role as differentiating factors. // Pediatr Dev Pathol. - 2003 - № 6 – V. 6 – P. 511 – 9 43. Cappa M, Bizzarri C, Vollono C et al. Adrenoleukodystrophy. Endocrine development. – 2011 – V. 20 – P.149–60. 44. Cha SH, Sekine T, Kusuhara H et al. Molecular cloning and characterization of multi- specific organic anion transporter 4 expressed in the placenta. // The Journal of biological chemistry. – 2000 – V. 275 (6) – P. 4507–12. 45. Chan SY, Martín-Santos A, Loubière LS et al. The expression of thyroid hormone trans- porters in the human fetal cerebral cortex during early development and in N-Tera-2 neurodifferentiation. // J Physiol. - 2011 – V. 1 – P. 2827-2845 46. Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM et al. Modeling and immunohisto- chemical analysis of C6 glioma in vivo. // Bull Exp Biol Med. - 2007 - №4 – V. 143 – P. 501-9. 47. Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM et al. Modeling and immunohistochemical analysis of C6 glioma in vivo. // Bull Exp Biol Med. – 2007 – V.143 (4) – P.501-509. 48. Chekhonin VP, Gurina OI, Dmitrieva TB et al. Monoclonal anti-GFAP antibodies: ex- traction, characteristics, and immunoenzyme assay. // Bull Exp Biol Med. – 2001 – №2 - V. 132 – P. 772-5. 49. Chen C, Pollack GM. Altered disposition and antinociception of [Dpenicillamine (2,5)] enkephalin in mdr1a-gene-deficient mice. // J Pharmacol Exp Ther. – 1998 – V. 287 (2) – P.545–52 50. Chen C, Pollack GM. Extensive biliary excretion of the model opioid peptide [D- PEN2,5] enkephalin in rats. // Pharmaceutical research. – 1997 – V. 14 (3) – P.345–50. 51. Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. // Cell. – 1986 – V. 47 (3) – P.381–9. 158 52. Chen YN, Mickley LA, Schwartz AM et al. Characterization of adriamycin-resistant hu- man breast cancer cells which display overexpression of a novel resistance-related membrane protein. // The Journal of biological chemistry. – 1990 – V. 265 (17) – P.10073–80. 53. Cheong HS, Kim HD, Na HS et al. Screening of genetic variations of SLC15A2, SLC22A1, SLC22A2 and SLC22A6 genes. // J Hum Genet -2011 –V. 56 – P. 666-670. 54. Choudhuri S, Cherrington NJ, Li N, Klaassen CD. Constitutive expression of various xenobiotic and endobiotic transporter mRNAs in the choroid plexus of rats. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2003 - V. 31 (11) – P.1337–45. 55. Chu C, Li JY, Boado RJ, Pardridge WM. Blood-brain barrier genomics and cloning of a novel organic anion transporter. // J Cereb Blood Flow Metab. – 2008 - №2 – V. 28 – P. 291-301 56. Ciarimboli G, Schlatter E. Regulation of organic cation transport. // Pflugers Archiv : European journal of physiology. – 2005 – V. 449 (5) - P.423–41. 57. Cohen TS, Prince A. Cystic fibrosis: a mucosal immunodeficiency syndrome. // Nature medicine. – 2012 – V. 18 (4) - P.509–19. 58. Cooray HC, Janvilisri T, van Veen HW et al. Interaction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols. Biochemical and biophysical research communications. – 2004 – V. 317 (1) – P.269–75. 59. Dallas S, Miller DS, Bendayan R. Multidrug resistance-associated proteins: expression and function in the central nervous system. // Pharmacol Rev. – 2006 – V.58(2) – P.140–61. 60. Davis B, Tang J, Zhang L et al. Role of vasodilator stimulated phosphoprotein in VEGF induced blood-brain barrier permeability in endothelial cell monolayers. // International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. – 2010 – V.28 (6) – P.423–8. 61. Davson H, Hollingsworth G, Segal MB. The mechanism of drainage of the cerebrospi- nal fluid. // Brain : a journal of neurology. – 1970 – V.93 – P.665–78. 62. Day E. D., Lassiter S., Woodhall B, et al. The localisation of radioantibodies in human brain tumors. // I. Preliminary exploration. // Cancer Res. - 1965 - V.25 - P. 773-778 63. De Gregori S, De Gregori M, Ranzani GN et al. Morphine metabolism, transport and brain disposition. // Metabolic brain disease. – 2012 – V.27(1) – P.1–5. 64. Dean M, Hamon Y, Chimini G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter su- perfamily. // Journal of lipid research. – 2001 – V.42 (7) – P.1007–17. 65. Dean M, Rzhetsky A, Allikmets R. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. // Genome research. – 2001 – V.11 (7) – P.1156–66. 159 66. Demeule M, Regina A, Jodoin J et al. Drug transport to the brain: Key roles for the ef- flux pump P-glycoprotein in the blood-brain barrier. // Vasc Pharmacol. – 2002 – V.38 (6) – P.339– 48. 67. Dickens D, Owen A, Alfirevic A et al. Lamotrigine is a substrate for OCT1 in brain en- dothelial cells. // Biochemical pharmacology – 2012 – V.83 (6) – P.805–14. 68. Diop NK, Hrycyna CA. N-Linked glycosylation of the human ABC transporter ABCG2 on asparagine 596 is not essential for expression, transport activity, or trafficking to the plasma membrane. // Biochemistry. – 2005 – V.44 (14) – P.5420–9. 69. Dmitriev RI, Korneenko TV, Bessonov AA et al. Characterization of hampin/MSL1 as a node in the nuclear interactome. // Biochem Biophys Res Commun. - 2007 - V.355 – P. 1051-7. 70. Doran A, Obach RS, Smith BJ et al. The impact of P-glycoprotein on the disposition of drugs targeted for indications of the central nervous system: evaluation using the MDR1A/1B knockout mouse model. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2005 – V.33 (1) – P. 165–74. 71. Doyle LA, Yang W, Abruzzo LV et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1998 – V.95 (26) – P.15665–70. 72. Dratman, M. B., Chrutchfield, F. L., and Schoenhoff, M. B. // Brain Res. – 1991 –V.554 – P.229–236 73. Dresser MJ, Leabman MK, Giacomini KM. Transporters involved in the elimination of drugs in the kidney: organic anion transporters and organic cation transporters. // J Pharm Sci. – 2001 – V.90 (4) – P. 397–421. 74. Dumitrescu AM, Liao XH, Best TB et al. A novel syndrome combining thyroid and neu- rological abnormalities is associated with mutations in a monocar-boxylate transporter gene. // Am J Hum Genet. – 2004 – V.74 – P. 168-175 75. Dyrna F, Hanske S, Krueger M, Bechmann I. The blood-brain barrier. // J Neuroimmune Pharmacol. – 2013 – V.8 (4) – P.763-73 76. Edwards JE, Alcorn J, Savolainen J et al. Role of P-glycoprotein in distribution of nelfinavir across the blood-mammary tissue barrier and blood-brain barrier. // Antimicrob Agents Chemother. – 2005 – V.49 (4) – P.1626–8. 77. Eisenblatter T, Huwel S, Galla HJ. Characterisation of the brain multidrug resistance protein (BMDP/ABCG2/BCRP) expressed at the blood-brain barrier. // Brain research – 2003 – V.971 (2) – P.221–31. 78. Emami Riedmaier A, Nies AT, Schaeffeler E, Schwab M. Organic anion transporters and their implications in pharmacotherapy. // Pharmacol Rev. – 2012 – V.64 (3) - P.421–49. 160 79. Engelhardt B, Sorokin L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. // Seminars in immunopathology. – 2009 – V.31 (4) – P.497–511. 80. Enomoto A and Endou H. Roles of organic anion transporters(OATs) and a urate trans- porter (URAT1) in the pathophysiology of human disease.. // Clin Exp Nephrol - 2005 –V.9 – P. 195-205. 81. Fenstermacher J, Gross P, Sposito N et al. Structural and functional variations in capil- lary systems within the brain. // Annals of the New York Academy of Sciences. – 1988 – V.529 – P.21–30. 82. Ferbinteanu J, Holsinger RM, McDonald RJ. Lesions of the medial or lateral perforant path have different effects on hippocampal contributions to place learning and on fear conditioning to context. // Behav Brain Res. – 1999 – V.101 – P. 65-84. 83. Ferrara AM, Liao XH, Gil-Ibáñez P. et al. Changes in thyroid status during perinatal development of MCT8-deficient male mice. // Endocrinology. – 2013 – V.154 (7) – P. 2533-2541. 84. Fetsch PA, Abati A, Litman T et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone re- sistance-associated protein in normal tissues. // Cancer letters. – 2006 – V.235 (1) P.84–92. 85. Fishman JB, Rubin JB, Handrahan JV et al. Receptor-mediated transcytosis of transfer- rin across the blood-brain barrier. // Journal of neuroscience research. – 1987 – V.18 (2) – P.299– 304. 86. Forrest, D., Reh, T. A., and Rusch, A. Neurodevelopmental control by thyroid hormone receptors // Curr. Opin. Neurol. – 2002 –V.12 - P.49–56 87. Fortuna A, Alves G, Falcão Evaluation of the permeability and P-glycoprotein efflux of carbamazepine and several derivatives across mouse small intestine by the Ussing chamber technique.// Epilepsia. – 2012 – V.53 (3) – P. 529-538 88. Fournet JC, Mayaud C, de Lonlay P, et al. Unbalanced expression of 11p15 imprinted genes in focal forms of congenital hyperinsulinism: association with a reduction to homozygosity of a mutation in ABCC8 or KCNJ11. // The American journal of pathology. – 2001 – V.158 (6) – P.2177–84. 89. Friesema EC, Jansen J, Milici C, Visser TJ. Thyroid hormone transporters. // Vitam Horm. – 2005 – V.70 – P. 137-167 90. Fu BM. Experimental methods and transport models for drug delivery across the bloodbrain barrier. // Curr Pharm Biotechnol. – 2012 – V.13 (7) - P.1346-59 91. Fujita T, Brown C, Carlson EJ, et al. Functional analysis of polymorphisms in the or- ganicanion transporter, SLC22A6 (OAT1). // Pharmacogenet Genomics. – 2005 – V.15 – P.201– 209. 161 92. Fujiyoshi M, Ohtsuki S, Hori S et al. 24S-hydroxycholesterol induces cholesterol re- lease from choroid plexus epithelial cells in an apical- and apoE isoform-dependent manner concomitantly with the induction of ABCA1 and ABCG1 expression. // J Neurochem. – 2007 – V.100 (4) - P.968–78. 93. Furuse M, Fujita K, Hiiragi T et al. Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. // The Journal of cell biology. – 1998 – V.141 (7) - P.1539–50 94. Furuse M, Sasaki H, Tsukita S. Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands. // The Journal of cell biology – 1999 – V.147 (4) – P.891–903. 95. Gao B, Hagenbuch B, Kullak-Ublick GA et al. Organic anion-transporting polypeptides mediate transport of opioid peptides across bloodbrain barrier. // J. Pharmacol. Exp. – 2000 - Ther. V.294 – P.73-79 96. Gao B, Stieger B, Noé B et al. // Localization of the organic anion transporting polypep- tide 2 (Oatp2) in capillary endothelium and choroid plexus epithelium of rat brain. // J Histochem Cytochem. – 1999 – V.47 – P. 1255-1264 97. Gibson CJ, Hossain M, Richardson JR, Aleksunes LM. Inflammatory Regulation of ABC Efflux Transporter Expression and Function in Microglia. // J Pharmacol Exp Ther. – 2012 – V.343 (3) – P. 650-660. 98. Glaser B, Blech I, Krakinovsky Y et al. ABCC8 mutation allele frequency in the Ashke- nazi Jewish population and risk of focal hyperinsulinemic hypoglycemia. // Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics. – 2011 – V.13 (10) - P.891–4. 99. Goard CA, Mather RG, Vinepal B et al. Differential interactions between statins and P- glycoprotein: implications for exploiting statins as anticancer agents. // International journal of cancer Journal international du cancer. – 2010 – V.127 (12) – P.2936–48. 100. Goda K, Fenyvesi F, Bacsó Z, et al. Complete inhibition of P-glycoprotein by simulta- neous treatment with a distinct class of modulators and the UIC2 monoclonal antibody. // J Pharmacol Exp Ther. – 2007 – V.320 (1) – P.81–8. 101. Golden PL, Pardridge WM. P-Glycoprotein on astrocyte foot processes of unfixed iso- lated human brain capillaries. // Brain research. – 1999 – V.819 (1-2) - P.143–6. 102. Goldenberg D. M., Deland F., Kim E. et al. Use of radiolabelled antibod-ies to carci- noembryonic antigen for the detection and localisation of diverse cancers by external photoscanning. // N. Engl. J. Med. - 1978. — V.298 - P. 1384 – 1388 162 103. Goldenberg D. M., Kim E. E., Deland F. H. et al. Human chorionic gon-adotropin radi- oantibodies in the radioimmunodetection of cancer and for disclosure of occult metastases. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1981 - V.78 - P. 7784 - 7758. 104. Gorboulev V, Ulzheimer JC, Akhoundova A et al. Cloning and characterization of two human polyspecific organic cation transporters. DNA and cell biology. – 1997 – V.16 (7) – P.871– 81. 105. Gottesman MM, Hrycyna CA, Schoenlein PV et al. Genetic analysis of the multidrug transporter. // Annual review of genetics. – 1995 – V.29 – P.607–49. 106. Graf GA, Li WP, Gerard RD et al. Coexpression of ATP-binding cassette proteins ABCG5 and ABCG8 permits their transport to the apical surface. // The Journal of clinical investigation. – 2002 – V.110 (5) - P.659–69. 107. Graf GA, Yu L, Li WP et al. ABCG5 and ABCG8 are obligate heterodimers for protein trafficking and biliary cholesterol excretion. // The Journal of biological chemistry. – 2003 – V.278 (48) - P.48275–82. 108. Gribar JJ, Ramachandra M, Hrycyna CA et al. Functional characterization of glycosyl- ation-deficient human P-glycoprotein using a vaccinia virus expression system. // The Journal of membrane biology – 2000 – V.173 (3) - P.203–14. 109. Grobben B, De Deyn PP, Slegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. // Cell Tissue Res. - 2002. - V.310. - P. 257-270 110. Grundemann D, Babin-Ebell J, Martel F et al. Primary structure and functional expres- sion of the apical organic cation transporter from kidney epithelial LLC-PK1 cells. // The Journal of biological chemistry. – 1997 – V.272 (16) – P.10408–13 111. Grundemann D, Gorboulev V, Gambaryan S et al. Drug excretion mediated by a new prototype of polyspecific transporter. // Nature. – 1994 – V.372 (6506) - P. 549–52 112. Grundemann D, Koster S, Kiefer N et al. Transport of monoamine transmitters by the organic cation transporter type 2, OCT2. // The Journal of biological chemistry. – 1998 – V.273 (47) – P.30915–20. 113. Grundemann D, Schechinger B, Rappold GA, Schomig E. Molecular identification of the corticosterone-sensitive extraneuronal catecholamine transporter. // Nat Neurosci – 1998 – V.1 (5) – P.349–51. 114. Haarmann A, Deiss A, Prochaska J et al. Evaluation of soluble junctional adhesion molecule-A as a biomarker of human brain endothelial barrier breakdown. // PloS one. – 2010 – V.5 (10) – P.e13568. 115. Habgood MD, Begley DJ, Abbott NJ. Determinants of passive drug entry into the cen- tral nervous system. // Cellular and molecular neurobiology. – 2000 – V.20 (2) – P.231–53. 163 116. Hagenbuch B, Meier PJ. Organic anion transporting polypeptides of the OATP/ SLC21 family: phylogenetic classification as OATP/ SLCO superfamily, new nomenclature and molecular/functional properties. // Pflugers Archiv : European journal of physiology. – 2004 – V.447 (5) P.653–65. 117. Hagenbuch B, Meier PJ. Organic anion transporting polypeptides of the OATP/ SLC21 family: phylogenetic classification as OATP/ SLCO superfamily, new nomenclature and molecular/functional properties. // Pflugers Arch. – 2004 – V.447(5) – P.653-65. 118. Hagenbuch B, Meier PJ. The superfamily of organic anion transporting polypeptides. // Biochimica et biophysica acta. – 2003 – V.1609(1) - P.1–18. 119. Hagenbuch B, Stieger B. The SLCO (former SLC21) superfamily of transporters. // Mol Aspects Med. – 2013 – V.34 (2-3) – P.396-412. 120. Hartz AM, Bauer B, Fricker G, Miller DS. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. // Molecular pharmacology. – 2004 – V.66 (3) – P.387–94. 121. Hau VS, Huber JD, Campos CR et al. Effect of lambdacarrageenan-induced inflamma- tory pain on brain uptake of codeine and antinociception. // Brain research. – 2004 – V.1018 (2) – P.257–64. 122. Hawkins BT, Davis TP. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and dis- ease. // Pharmacol Rev. – 2005 – V.57 (2) – P.173–85. 123. He X, Anzai N, Ueno T et al. Trasport of nicotinate by human organic anion transporterh OAT2 and its possible interaction with transport of salicylate. // J Pharmacol Sci. – 2006 – V.100 – P.126. 124. Hediger MA, Romero MF, Peng JB et al. The ABCs of solute carriers: physiological, pathological and therapeutic implications of human membrane transport proteinsIntroduction. // Pflugers Archiv. European journal of physiology. – 2004 – V.447 (5) - P.465–8. 125. Hennessy M, Spiers JP. A primer on the mechanics of P-glycoprotein the multidrug transporter. // Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. – 2007 – V.55 (1) – P.1–15 126. Heuer H, Visser TJ. The pathophysiological consequences of thyroid hormone transporter deficiencies: Insights from mouse models. // Biochim Biophys Acta. – 2013 – V.1830 (7) – P. 3974-3978 127. Heuer H. The importance of thyroid hormone transporters for brain development and function. // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. – 2007 – V.21 (2) – P. 265-276. 128. Hirrlinger J, Konig J, Dringen R. Expression of mRNAs of multidrug resistance pro- teins (Mrps) in cultured rat astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells and neurones. // J Neurochem. – 2002 – V.82 (3) - P.716–9. 164 129. Hori S, Ohtsuki S, Tachikawa M et al. Functional expression of rat ABCG2 on the lu- minal side of brain capillaries and its enhancement by astrocyte-derived soluble factor(s) // J Neurochem. – 2004 – V.90 (3) - P.526–36. 130. Hosoya K., Tachikawa M. Roles of organic anion/cation transporters at the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers involving uremic toxins. //Clin Exp Nephrol - 2011 – V.15 – P. 478-485 131. Huber RD, Gao B, Sidler Pfandler MA et al. Characterization of two splice variants of human organic anion transporting polypeptide 3A1 isolated from human brain. // American journal of physiology Cell physiology. – 2007 – V.292 (2) - P.C795–806. 132. Hyde SC, Emsley P, Hartshorn MJ et al. Structural model of ATP-binding proteins as- sociated with cystic fibrosis, multidrug resistance and bacterial transport. // Nature. – 1990 – V.346 (6282) – P.362–5. 133. Inano A, Sai Y, Nikaido H et al. Acetyl-L-carnitine permeability across the blood-brain barrier and involvement of carnitine transporter OCTN2. // Biopharmaceutics & drug disposition. – 2003 – V.24 (8) – P.357–65. 134. Inge van Rooy, Serpil Cakir-Tascioglu. Wim E. et al. In Vivo Methods to Study Uptake of Nanoparticles into the Brain // Pharm Res – 2011 – V.28 – P.456–471 135. Iyer S, Ferreri DM, DeCocco NC et al. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. // American journal of physiology // Lung cellular and molecular physiology. – 2004 – V.286 (6) – P.1143–53. 136. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. // J Clin Invest. – 1973 – V.52 (11) – P. 2745-2756 137. Jaffe EA. Culture of human endothelial cells. // Transplant Proc. – 1980 – V.12 (3, Suppl 1) – P. 49-53 138. Jain KK. Nanobiotechnology-based strategies for crossing the blood-brain barrier. // Nanomedicine (Lond). – 2012 - V.7 (8) – P.1225-33 139. Jansen J, Friesema EC, Milici C, Visser TJ. Thyroid hormone transporters in health and disease. // Thyroid. – 2005 – V.15 (8) – P. 757-768 140. Janzer RC, Raff MC. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. // Nature. – 1987 – V.325 (6101) - P.253–7. 141. Jonker JW, Schinkel AH. Pharmacological and physiological functions of the polyspe- cific organic cation transporters: OCT1, 2, and 3 (SLC22A1-3) // J Pharmacol Exp Ther. – 2004 – V.308 (1) – P.2–9. 165 142. Kekuda R, Prasad PD, Wu X et al. Cloning and functional characterization of a poten- tial-sensitive, polyspecific organic cation transporter (OCT3) most abundantly expressed in placenta. // The Journal of biological chemistry. – 1998 – V.273 (26) - P.15971–9. 143. Kellner U, Hutchinson L, Seidel A et al. Decreased drug accumulation in a mitoxan- trone-resistant gastric carcinoma cell line in the absence of P-glycoprotein. // International journal of cancer Journal international du cancer. – 1997 – V.71 (5) – P 817–24. 144. Kido Y, Tamai I, Ohnari A et al. Functional relevance of carnitine transporter OCTN2 to brain distribution of L-carnitine and acetyl-L-carnitine across the blood-brain barrier. // J Neurochem. – 2001 – V.79 (5) - P.959–69. 145. Kikuchi R, Kusuhara H, Sugiyama D and Sugiayma Y. Contribution of organic anion transporter 3(Slc22a8) to the elimination of p-aminohippuric acid and benzylpenicillin across the blood-brain barrier. // J Pharmacol Exp Their – 2003 – V.306 – P. 51-58. 146. Kimura H, Takeda M, Narikawa S et al. Human organic anion transporters and human organic cation transporters mediate renal transport of prostaglandins. // J Pharmacol Exp Ther. – 2002 – V.301 (1) - P.293–8. 147. King GL, Johnson SM. Receptor-mediated transport of insulin across endothelial cells.Science // (New York, NY) – 1985 – V.227 (4694) – P.1583–6. 148. Kinne A, Schülein R, Krause G. Primary and secondary thyroid hormone transporters. // Thyroid Res. - 2011 – V.3 – P. 1:7. 149. Kis B, Isse T, Snipes JA et al. Effects of LPS stimulation on the expression of prosta- glandin carriers in the cells of the bloodbrain and blood-cerebrospinal fluid barriers. // J Appl Physiol. – 2006 – V.100 (4) –P.1392–9. 150. Koepsell H, Endou H. The SLC22 drug transporter family. // Pflugers Archiv: European journal of physiology. – 2004 – V.447 (5) – P.666–76. 151. Koepsell H, Gorboulev V, Arndt P. Molecular pharmacology of organic cation trans- porters in kidney. // The Journal of membrane biology. – 1999 – V.167 (2) – P.103–17. 152. Koepsell H, Schmitt BM, Gorboulev V. Organic cation transporters. // Reviews of phys- iology, biochemistry and pharmacology. - 2003 – V.150 – P.36–90. 153. Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature. – 1975 – V.256 – P. 495-7. 154. Kong W, Engel K, Wang J. Mammalian nucleoside transporters. // Current drug metabo- lism. – 2004 – V.5 (1) - P.63–84. 155. König J. Uptake transporters of the human OATP family: molecular characteristics, substrates, their role in drug-drug interactions, and functional consequences of polymorphisms. // Handb Exp Pharmacol. – 2011 – V.201 – P.1-28. 166 156. Kristufek D, Rudorfer W, Pifl C, Huck S. Organic cation transporter mRNA and function in the rat superior cervical ganglion. // The Journal of physiology. – 2002 – V.543 – P.117–34. 157. Kruh GD, Belinsky MG. The MRP family of drug efflux pumps. // Oncogene. – 2003 – V.22 (47) – P.7537–52. 158. Kullak-Ublick GA, Ismair MG, Stieger B, et al. Organic anion-transporting polypeptide B (OATP-B) and its functional comparison with three other OATPs of human liver. // Gastroenterology - 2001 – V.120 – P. 525-533 159. Kuo KL, Zhu H, McNamara PJ, Leggas M. Localization and functional characterization of the rat Oatp4c1 transporter in an in vitro cell system and rat tissues. PLoS One. – 2012 – V.7 – P.6 160. Kuppens IE, Witteveen EO, Jewell RC, et al. A phase I, randomized, open-label, parallelcohort, dose-finding study of elacridar (GF120918) and oral topotecan in cancer patients. // Clin Cancer Res. – 2007 – V.13 (11) – P.3276–85. 161. Kusch-Poddar M, Drewe J, Fux I, Gutmann H. Evaluation of the immortalized human brain capillary endothelial cell line BB19 as a human cell culture model for the blood-brain barrier. // Brain research. – 2005 – V.1064 (1-2) – P.21–31. 162. Kusuhara H and Sugiyama Y // Drug Discov – 2001 – P. 150-156 163. Kusuhara H, Sekine T, Utsunomiya-Tate N et al. Molecular cloning and characterization of a new multispecific organic anion transporter from rat brain. // The Journal of biological chemistry. – 1999 – V.274 (19) – P.13675–80. 164. Kusuhara H, Sugiyama Y.Active efflux across the blood-brain barrier: role of the solute carrier family. // NeuroRx. – 2005. – V.2 – P. 73-85 165. Kwak JO, Lee SH, Lee GS, et al. Selective inhibition of MDR1 (ABCB1) by HM30181 increases oral bioavailability and therapeutic efficacy of paclitaxel. // Eur J Pharmacol. – 2010 – V.627 – P.92–8. 166. Lamhonwah A-MTI, Ackerly CA, Tilups A et al. OCTN3 is a mammalian peroxisomal membrane carnitine transporter. // Biochemical and biophysical research communications. – 2005 – V.338 – P.1966–72. 167. Lee G, Babakhanian K, Ramaswamy M et al. Expression of the ATP-binding cassette membrane transporter, ABCG2, in human and rodent brain microvessel endothelial and glial cell culture systems. Pharmaceutical research. – 2007 – V.24 (7) – P.1262–74. 168. Lee G, Dallas S, Hong M, Bendayan R. Drug transporters in the central nervous system: Brain barriers and brain parenchyma considerations. // Pharmacol Rev. – 2001 – V.53 (4) –P.569– 96. 167 169. Lee JS, Scala S, Matsumoto Y et al. Reduced drug accumulation and multidrug resistance in human breast cancer cells without associated P-glycoprotein or MRP overexpression. // Journal of cellular biochemistry. – 1997 – V.65 (4) – P.513–26. 170. Lee W, Glaeser H, Smith LH et al. Polymorphisms in human organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2): implications for altered drug disposition and central nervous system drug entry. // The Journal of biological chemistry. – 2005 – V.280 (10) – P.9610–7. 171. Lee YJ, Kusuhara H, Jonker JW et al. Investigation of efflux transport of dehydroepiandrosterone sulfate and mitoxantrone at the mouse blood-brain barrier: a minor role of breast cancer resistance protein. // J Pharmacol Exp Ther. – 2005 – V.312 (1) – P.44–52. 172. Lee YJ, Kusuhara H, Sugiyama Y. Do multidrug resistance-associated protein-1 and -2 play any role in the elimination of estradiol-17 beta-glucuronide and 2,4-dinitrophenyl-Sglutathione across the blood-cerebrospinal fluid barrier? // J Pharm Sci. – 2004 – V.93 (1) – P.99– 107. 173. Leitner I, Nemeth J, Feurstein T, et al. The third-generation P-glycoprotein inhibitor tariquidar may overcome bacterial multidrug resistance by increasing intracellular drug concentration. // J Antimicrob Chemother. – 2011 – V.66 (4) – P.834–9. 174. Leslie EM, Deeley RG, Cole SP. Bioflavonoid stimulation of glutathione transport by the 190-kDa multidrug resistance protein 1 (MRP1) // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2003 – V.31 (1) – P.11–5. 175. Leslie EM, Deeley RG, Cole SP. Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense. // Toxicology and applied pharmacology. – 2005 – V.204 (3) – P.216–37. 176. Leslie EM, Deeley RG, Cole SP. Toxicological relevance of the multidrug resistance protein 1, MRP1 (ABCC1) and related transporters. // Toxicology. – 2001 – V.167 (1) - P.3–23 177. Leuthold S, Hagenbuch B, Mohebbi N et al. Mechanisms of pH-gradient driven transport mediated by organic anion polypeptide transporters. // American journal of physiology Cell physiology. – 2009 – V.296 (3) – P.570–82. 178. Li, J. Y., Boado, R. J., and Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. // J.Cereb. Blood Flow Metab.- 2001 – V.21 – P. 61—68 179. Lichota J., Skjorringe T., Thomsen L.B. and Moos T. Macromolecular drug transport into the brain using targeted therapy.// J. Neurochem - 2010 – V.113 – P. 1-13 180. Lin JH, Yamazaki M. Role of P-glycoprotein in parmacokinetics: clinical implications. // Clin Pharmacokinet. – 2003 – V.42 (1) - P.59–98. 181. Ling V, Thompson LH. Reduced permeability in CHO cells as a mechanism of resistance to colchicine. // Journal of cellular physiology. – 1974 – V.83 (1) – P.103–16. 168 182. Liu T, Li Q. Organic anion-transporting polypeptides: a novel approach for cancer ther- apy. // J Drug Target. – V.22 (1) – P.14-22. 183. Lomovskaya O, Bostian KA. Practical applications and feasibility of efflux pump inhibitors in the clinic—a vision for applied use. // Biochem Pharmacol. – 2006 - V.71 (7) – P.910–8. 184. Lopez-Nieto CE, You G, Bush KT et al. Molecular cloning and characterization of NKT, a gene product related to the organic cation transporter family that is almost exclusively expressed in the kidney. // The Journal of biological chemistry. – 1997 – V.272 – P.6471–8. 185. Ma JD, Tsunoda SM, Bertino JS et al. Evaluation of in vivo P-glycoprotein phenotyping probes: a need for validation. // Clin Pharmacokinet. – 2010 – V.49 (4) – P.223–37. 186. Mahagita C, Grassl SM, Piyachaturawat P. Human organic anion transporter 1B1 and 1B3 function as bidirectional carriers and do not mediate GSHbile acid cotransport. // Am J Physiol-Gastr L. – 2007 – V.293 (1) – P.271–8. 187. Mao Q, Unadkat JD. Role of the breast cancer resistance protein (ABCG2) in drug transport. // The AAPS journal. – 2005 – V.7 (1) – P.118–33. 188. Mark KS, Davis TP. Cerebral microvascular changes in permeability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2002 – V.282 (4) – P.1485–94 189. Martinez-Becerra P, Briz O, Romero MR et al. Further Characterization of the Electrogenicity and pH Sensitivity of the Human Organic Anion-Transporting Polypeptides OATP1B1 and OATP1B3. // Molecular pharmacology. – 2011 - V.79 (3) - P.596–607. 190. Martins A, Vasas A, Schelz Z, et al. Constituents of Carpobrotus edulis inhibit Pglycoprotein of MDR1-transfected mouse lymphoma cells. // Anticancer Res. – 2010 - V.30 (3) – P.829–35. 191. Mayerl S, Müller J, Bauer R et al. Transporters MCT8 and OATP1C1 maintain murine brain thyroid hormone homeostasis. // J Clin Invest. – 2014 –V.1 – P. 1987-1999. 192. Mayerl S, Müller J, Bauer R et al. Transporters MCT8 and OATP1C1 maintain murine brain thyroid hormone homeostasis. // J Clin Invest. – 2014 – V.124 (5) – P.1987-99 193. Mayerl S, Visser TJ, Darras VM et al. Impact of Oatp1c1 deficiency on thyroid hormone metabolism and action in the mouse brain. // Endocrinology. – 2012 – V.153 – P. 1528-1537 194. McCaffrey G, Seelbach MJ, Staatz WD et al. Occludin oligomeric assembly at tight junctions of the blood-brain barrier is disrupted by peripheral inflammatory hyperalgesia. // J Neurochem. – 2008 – V.106 (6) - P.2395–409. 195. McCaffrey G, Staatz WD, Quigley CA et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining bloodbrain barrier integrity in vivo. // J Neurochem. – 2007 V.103 (6) – P.2540–55. 169 196. McCaffrey G, Staatz WD, Sanchez-Covarrubias L et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. // J Neurochem. – 2012 – V.122 (5) – P.962–75. 197. McCarthy KM, Skare IB, Stankewich MC et al. Occludin is a functional component of the tight junction. // J Cell Sci. – 1996 – V.109 – P.2287–98. 198. Meyer Zu Schwabedissen HE, Ware JA et al Identification, expression, and functional characterization of full-length and splice variants of murine organic anion transporting polypeptide 1b2. // Mol Pharm. - 2009 – V.6 (6) – P.1790-7. 199. Mikkaichi T, Suzuki T, Onogawa T et al. Isolation and characterization of a digoxin transporter and its rat homologue expressed in the kidney. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2004 – V.101 (10) – P.3569–74 200. Miyazaki H, Sekine T, Endou H. The multispecific organicanion transporter family: properties and pharmacological significance. // Trends Pharmacol Sci. – 2004 – V.25 – P.654–662. 201. Mohrmann K, van Eijndhoven MA, Schinkel AH, Schellens JH. Absence of Nlinked glycosylation does not affect plasma membrane localization of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) // Cancer chemotherapy and pharmacology. – 2005 – V.56(4) – P.344–50. 202. Monte JC, Nagle MA, Eraly SA, Nigam SK. Identification of a novel murine organic an- ion transporter family member, OAT6, expressed in olfactory mucosa. Biochemical and biophysical research communications. – 2004 – V.323 (2) – P.429–36. 203. Mori K, Ogawa Y, Ebihara K et al. Kidneyspecific expression of a novel mouse organic cation transporter-like protein. // FEBS letters. – 1997 – V.417 (3) – P.371–4. 204. Mori S, Ohtsuki S, Takanaga H, et al. Organic anion transporter 3 is involved in the brain-to-blood efflux transport of thiopurine nucleobase analogs. // J Neurochem. – 2004 – V.90 – P.931–941. 205. Morte B, Bernal J. Thyroid hormone action: astrocyte-neuron communication. // Front Endocrinol (Lausanne). – 2014 – V.30 – P.5:82. 206. Müller J, Mayerl S, Visser TJ et al. Tissue-specific alterations in thyroid hormone ho- meostasis in combined Mct10 and Mct8 deficiency. // Endocrinology. – 2014 – V.155 (1) – P. 31525. 207. Nachman RL, Jaffe EA. Endothelial cell culture: beginnings of modern vascular biology. // J Clin Invest. – 2004 – V.114 (8) – P.1037-40. 208. Nagai T, Takuma K, Kamei H. et al. Dopamine D1 receptors regulate protein synthesisdependent long-term recognition memory via extracellular signal-regulated kinase 1/2 in the prefrontal cortex. // Learn Mem. – 2007 – V.14 – P. 117-125 170 209. Nagata Y, Kusuhara H, Endou H, Sugiyama Y. Expression and functional characteriza- tion of rat organic anion transporter 3 (rOat3) in the choroid plexus. // Molecular pharmacology. – 2002 – V.61 (5) – P.982–8 210. Nakagawa M, Schneider E, Dixon KH et al. Reduced intracellular drug accumulation in the absence of P-glycoprotein (mdr1) overexpression in mitoxantrone-resistant human MCF-7 breast cancer cells. // Cancer research. – 1992 – V.52 (22) – P.6175–81. 211. Nies AT, Jedlitschky G, Konig J et al. Expression and immunolocalization of the multi- drug resistance proteins, MRP1-MRP6 (ABCC1-ABCC6), in human brain. // Neuroscience. – 2004 – V.129 (2) – P.349–60. 212. Nies ATR, Keppler D. Mutlidrug Resistance Proteins of the ABCC Subfamily. In: You GMME, editor. // Drug Transporters: Molecular Characterization and Role in Drug Disposition. – 2007 - P. 263–318. 213. Nishio T, Adachi h, Nakagomi R, et al // Biochem. Biophys. Res. Commun -2000 – V.275 – P. 831-838 214. Noe B, Hagenbuch B, Stieger B and Meier PJ. Isolation of a multispecific organic anion and cardiac glycoside transporter from rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1991 - V.94 – P.10346-10350 215. Nozawa T, Sugiura S, Nakajima M et al. Involvement of organic anion transporting pol- ypeptides in the transport of troglitazone sulfate: Implications for understanding troglitazone hepatotoxicity. // Drug Metabolism and Disposition. – 2004 – V.32 (3) – P.291–4. 216. Nukolova NV, Oberoi HS, Cohen SM, Kabanov AV. Folate-decorated nanogels for targeted therapy of ovarian cancer. // Biomaterials – 2011 – V.32 – P.5417-5426 217. Obaidat A, Roth M, Hagenbuch B.The expression and function of organic anion transporting polypeptides in normal tissues and in cancer.//Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 2012 – V.52 – P.135-51. 218. Ohtsuki S, Hirayama M, Ito S, Uchida Y, Tachikawa M, Terasaki T. Quantitative target- ed proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. // Expert Rev Proteomics. - 2014 - V.11 (3) – P.303-13. 219. Ohtsuki S, Takizawa T, Takanaga H et al. In vitro study of the functional expression of organic anion transporting polypeptide 3 at rat choroid plexus epithelial cells and its involvement in the cerebrospinal fluidto-blood transport of estrone-3-sulfate. // Molecular pharmacology. – 2003 – V.63 (3) – P.532–7. 220. Okura T, Hattori A, Takano Y et al. Involvement of the pyrilamine transporter, a puta- tive organic cation transporter, in blood-brain barrier transport of oxycodone. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2008 – V.36 (10) – P.2005–13. 171 221. Oppenheimer, J. H., and Schwartz, H. L. -1997 - Endocr. Rev.- V.18 – P.462–475 222. Pao SS, Paulsen IT, Saier MH., Jr. Major facilitator superfamily. // Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. – 1998 – V.62 (1) – P.1–34. 223. Pardridge WM, Golden PL, Kang YS, Bickel U. Brain microvascular and astrocyte lo- calization of P-glycoprotein. // J Neurochem. – 1997 – V.68 (3) – P.1278–85. 224. Pardridge WM. Drug transport across the blood-brain barrier. // J Cereb Blood Flow Metab. – 2012 – V.32 (11) – P. 1-14 225. Pizzagalli F, Hagenbuch B, Stieger B et al. Identification of a novel human organic anion transporting polypeptide as a high affinity thyroxine transporter.. //Mol. Endocrinol. -2002 –V.16 – P. 2283-2296 226. Pizzagalli F. Identification and Functional Characterization of Human Organic Anion Transporting Polypeptides // Dissertation – 1974 227. Puntoni M, Sbrana F, Bigazzi F, Sampietro T. Tangier disease: epidemiology, patho- physiology, and management. // American journal of cardiovascular drugs: drugs, devices, and other interventions. – 2012 – V.12 (5) - P.303–11. 228. Rabindran SK, He H, Singh M et al. Reversal of a novel multidrug resistance mecha- nism in human colon carcinoma cells by fumitremorgin C. // Cancer research. – 1998 – V.58 (24) – P. 5850–8. 229. Raff MC, Abney ER, Cohen J, Lindsay R, Noble M. Two types of astrocytes in cultures of developing rat white matter: differences in morphology, surface gangliosides, and growth characteristics. // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. – 1983 – V.3 (6) – P.1289–300. 230. Rao VV, Dahlheimer JL, Bardgett ME et al. Choroid plexus epithelial expression of MDR1 P glycoprotein and multidrug resistance-associated protein contribute to the bloodcerebrospinal-fluid drugpermeability barrier. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1999 – V.96 (7) – P.3900–5. 231. Riedmaier A.E, Nies A.T, Schaeffeler E, Schwab M. Organic anion transporters and their implications in pharmacotherapy. // Pharmacologial Rev - 2012 - V.64 – P. 421-449. 232. Rius M, Nies AT, Hummel-Eisenbeiss J. Cotransport of reduced glutathione with bile salts by MRP4 (ABCC4) localized to the basolateral hepatocyte membrane. // Hepatology (Baltimore, Md) – 2003 – V.38 (2) – P.374–84. 233. Roberts L.M., Woodford K., Zhou M. et al. Expression of the thyroid hormone transporters monocarboxylate transporter-8 (SLC16A2) and organic ion transporter-14 (SLCO1C1) at the blood-brain barrier. // Endocrinology. – 2008.– V.149 – P. 6251-6261 172 234. Roberts LM, Black DS, Raman C et al. Subcellular localization of transporters along the rat blood-brain barrier and bloodcerebral-spinal fluid barrier by in vivo biotinylation. // Neuroscience. – 2008 – V.155 (2) - P.423–38. 235. Robey, RWP,O.; Deeken, J. et al.. Breast Cancer Resistance Protein. In: You, GMME., editor. Drug Transporters: Molecular Characterization and Role in Drug Disposition. // John Wiley & Sons, Inc; Hoboken, NJ: - 2007 - P. 319-58. 236. Roef GL, Rietzschel ER, De Meyer T et al. Associations between single nucleotide polymorphisms in thyroid hormone transporter genes (MCT8, MCT10 and OATP1C1) and circulating thyroid hormones. // Clin Chim Acta. – 2013 – V.425 – P.227-32 237. Rolfe DF, Brown GC. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. // Physiological reviews. – 1997 – V.77 (3) – P.731–58 238. Ronaldson PT Drug Transport in the Brain. In: You GMME, editor. Drug Transporters: molecular characterization and role in drug disposition. // John Wiley & Sons, Inc.; Hoboken, N.J. – 2007 - P. 411–62. 239. Ronaldson PT, Bendayan M, Gingras D et al. Cellular localization and functional ex- pression of P-glycoprotein in rat astrocyte cultures. // J Neurochem. – 2004 – V.89 (3) – P.788–800. 240. Ronaldson PT, Davis TP. Targeted drug delivery to treat pain and cerebral hypoxia. // Pharmacol Rev. – 2013 – V.65 (1) – P.291–314. 241. Ronaldson PT, Finch JD, DeMarco KM et al. Inflammatory Pain Signals an Increase in Functional Expression of Organic Anion Transporting Polypeptide 1a4 at the Blood-Brain Barrier. // J Pharmacol Exp Ther. – 2011 – V.336 (3) – P.827–39. 242. Ronaldson PT, Persidsky Y, Bendayan R. Regulation of ABC membrane transporters in glial cells: relevance to the pharmacotherapy of brain HIV-1 infection. // Glia. – 2008 – V.56 (16) – P.1711–35. 243. Ronaldson PT, Demarco KM, Sanchez-Covarrubias L et al. Transforming growth fac- tor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the bloodbrain barrier during inflammatory pain. // J Cereb Blood Flow Metab. – 2009 – V.29 (6) – P.1084– 98 244. Ronaldson PTD . Targeted Drug Delivery to Treat Pain and Cerebral Hypoxia. // Curr Pharm Des. - 2014 - V.20 (10) – P.1419-21. 245. Roninson IB, Chin JE, Choi KG et al. Isolation of human mdr DNA sequences ampli- fied in multidrug-resistant KB carcinoma cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1986 – V.83 (12) – P.4538–42. 173 246. Roth M, Obaidat A, Hagenbuch B. OATPs, OATs and OCTs: the organic anion and cat- ion transporters of the SLCO and SLC22A gene superfamilies. // British journal of pharmacology. – 2012 – V.165 (5) – V.1260–87. 247. Roux F.S., Mokni R., Hughes C.C. et al. Lipid synthesis by rat brain microvessel endo- thelial cells in tissue culture. // J. Neuropathol Exp Neurol. – 1989 – V.48 (4) – P. 437-447. 248. Russel FG, Masereeuw R, van Aubel RA. Molecular aspects ofrenal anionic drug transport. // Annu Rev Physiol. – 2002 – V.64 – P.563–569 249. Sai Y, Kaneko Y, Ito S et al. Predominant contribution of organic anion transporting polypeptide OATP-B (OATP2B1) to apical uptake of estrone-3-sulfate by human intestinal Caco-2 cells. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2006 – V.34 (8) – P.1423–31. 250. Sampson J. H., Archer G. E., Bigner D. D. Use of experimental models in neurooncological research. - In: Clockard A., Hayward R., Hoff J. T. (Eds) // Neurosurgery: The scientific basis of clinical practice. -1990 - Oxford: Blackwell Science 251. Santamarina-Fojo S, Remaley AT, Neufeld EB, Brewer HB., Jr. Regulation and intracel- lular trafficking of the ABCA1 transporter. // Journal of lipid research. – 2001 – V.42 (9) - P.1339– 45. 252. Saunders NR, Daneman R, Dziegielewska KM, Liddelow SA. Transporters of the blood- brain and blood-CSF interfaces in development and in the adult. // Mol Aspects Med. – 2013 – V.34 (2-3) – P.742-52. 253. Saunders NR, Habgood MD, Dziegielewska KM. Barrier mechanisms in the brain, I. Adult brain. // Clinical and experimental pharmacology & physiology. – 1999 – V.26 (1) – P.11–9. 254. Scherrmann JM. Drug delivery to brain via the blood-brain barrier. // Vascular pharma- cology. – 2002 – V.38 (6) - P.349–54. 255. Schinkel AH, Smit JJM, Vantellingen O et al. Disruption of the Mouse Mdr1a P- Glycoprotein Gene Leads to a Deficiency in the Blood-Brain-Barrier and to Increased Sensitivity to Drugs. // Cell. – 1994 – V.77 (4) - P.491–502. 256. Schlachetzki F, Pardridge WM. P-glycoprotein and caveolin-1 alpha in endothelium and astrocytes of primate brain. // Neuroreport. – 2003 – V.14 (16) P.2041–6. 257. Schmitt A, Mossner R, Gossmann A et al. Organic cation transporter capable of trans- porting serotonin is up-regulated in serotonin transporter-deficient mice. // Journal of neuroscience research. – 2003 – V.71 (5) – P.701–9. 258. Schweizer U, Köhrle J. Function of thyroid hormone transporters in the centralnervous system. // Biochim Biophys Acta. – 2013 – V.1830 (7) – P. 3965-3973 174 259. Sebastian K, Detro-Dassen S, Rinis N. et al. Characterization of SLCO5A1/OATP5A1, a Solute Carrier Transport Protein with Non-Classical Function. // PLoS One. – 2013 – V.8 (12) – P. 1-13 260. Seelbach MJ, Brooks TA, Egleton RD, Davis TP. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. // J Neurochem. – 2007 – V.102 (5) - P.1677–90. 261. Sekine T, Cha SH, Endou H. The multispecific organic anion transporter (OAT) fami- ly. Pflugers Archiv // European journal of physiology. – 2000 - V.440 (3) – P.337–50. 262. Sekine T, Cha SH, Tsuda M et al. Identification of multispecific organic anion trans- porter 2 expressed predominantly in the liver. // FEBS letters. – 1998 – V.429 (2) – P.179–82. 263. Sharom FJ. Multidrug Resistance Protein: P-glycoprotein. In: GYaME Morris., edi- tor.Drug Transporters: Molecular Characterization and Role in Drug Disposition. // John Wiley & Sons, Inc.; Hoboken, NJ – 2007 - P. 263–318. 264. Sharom FJ. The P-glycoprotein multidrug transporter. // Essays Biochem. – 2011 – V.50 (1) – P.161–78. 265. Shi, Y. B., Ritchie, J. W. A., and Taylor, P. M. //Pharmacol. Ther.- 2002 -V.94 – P.235– 266. Shin HJ, Anzai N, Enomoto A, et al. Functional characterization and tissue localization 251 of SLC22 organic anion transporter OAT7. // J Pharmacol Sci. – 2005 – V.97 – P. 201 267. Shirasaka Y, Suzuki K, Nakanishi T, Tamai I. Differential effect of grapefruit juice on intestinal absorption of statins due to inhibition of organic anion transporting polypeptide and/or Pglycoprotein. // J Pharm Sci. – 2011 – V.100 (9) - P.3843–53. 268. Shirasaka Y, Suzuki K, Shichiri M, Nakanishi T, Tamai I. Intestinal absorption of HMG- CoA reductase inhibitor pitavastatin mediated by organic anion transporting polypeptide and Pglycoprotein/multidrug resistance 1. // Drug metabolism and pharmacokinetics. – 2011 – V.26 (2) – P.171–9. 269. Shusta EV. Blood-brain barrier genomics, proteomics, and new transporter discovery. // NeuroRx – 2005. - №1 –V.2. – P. 151-161 270. Simionescu M, Gafencu A, Antohe F. Transcytosis of plasma macromolecules in endo- thelial cells: a cell biological survey. // Microscopy research and technique. – 2002 – V.57 (5) P.269–88. 271. Simonson GD, Vincent AC, Roberg KJ et al. Molecular cloning and characterization of a novel liver-specific transport protein. // J Cell Sci. – 1994 – V.107 (Pt 4) – P.1065–72. 175 272. Slitt AL, Cherrington NJ, Hartley DP et al. Tissue distribution and renal developmental changes in rat organic cation transporter mRNA levels. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. – 2002 – V.30 (2) - P.212–9. 273. Smit JJ, Schinkel AH, Oude Elferink RP et al. Homozygous disruption of the murine mdr2 P-glycoprotein gene leads to a complete absence of phospholipid from bile and to liver disease. // Cell. – 1993 – V.75 (3) - P.451–62. 274. Smith DE, Johanson CE, Keep RF. Peptide and peptide analog transport systems at the blood-CSF barrier. // Advanced drug delivery reviews. – 2004 – V.56 (12) - P.1765–91. 275. Srimaroeng C, Perry JL, and Pritchard JB. Physiology, structure, and regulation of the cloned organic anion transporters. // Xenobiotica - 2008 – V.38 - P. 889-935. 276. Staud F, Ceckova M, Micuda S, Pavek P. Expression and function of p-glycoprotein in normal tissues: effect on pharmacokinetics. // Methods Mol Biol. – 2010 – v. 596 – p. 199-222 277. Staud F, Pavek P. Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) // The international journal of biochemistry & cell biology. – 2005 – V.37 (4) – P.720–5. 278. Steiniger SC, Kreuter J, Khalansky AS, et al. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles. // Int J Cancer - 204 – V.109 –P. 759–767 279. Sugiyama D, Kusuhara H, Shitara Y. et al. Characterization of the efflux transport of 17beta-estradiol-D-17beta-glucuronide from the brain across the blood-brain barrier. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2001 – V.298 – P. 316-322 280. Sugiyama D, Kusuhara H, Taniguchi H et al. Functional characterization of rat brain- specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. // The Journal of biological chemistry. – 2003 – V.278 (44) - P.43489–95. 281. Sun J, He ZG, Cheng G et al. Multidrug resistance P-glycoprotein: crucial significance in drug disposition and interaction. // Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research. – 2004 – V.10 (1) – P.5–14. 282. Sun YN, Liu YJ, Zhang L et al. Expression of organic anion transporting polypeptide 1c1 and monocarboxylate transporter 8 in the rat placental barrier and the compensatory response to thyroid dysfunction. // PLoS One. – 2014 – V.24 – P.9(4) 283. Svoboda M, Riha J, Wlcek K et al. Organic anion transporting polypeptides (OATPs): regulation of expression and function. // Curr Drug Metab. – 2011 – V.12 (2) – P. 139-53 284. Sweet DH, Miller DS, Pritchard JB et al. Impaired organic anion transport in kidney and choroid plexus of organic anion transporter 3 (Oat3 (Slc22a8)) knockout mice. // The Journal of biological chemistry. – 2002 – V.277 (30) – P.26934–43 285. Szabó C.A., Deli M.A., Ngo T.K., Joó F. Production of pure primary rat cerebral endo- thelial cell culture: a comparison of different methods. // Neurobiology – 1997 – V.5 (1) – P. 1-16 176 286. Tachikawa M, Ozeki G, Higuchi T et al. Role of the blood-cerebrospinal fluid barrier transporter as a cerebral clearance system for prostaglandin E(2) produced in the brain. // J Neurochem. – 2012 – V.123 (5) – P. 750-760. 287. Takakura Y, Audus KL, Borchardt RT. Blood-brain barrier: transport studies in isolated brain capillaries and in cultured brain endothelial cells. // Advances in pharmacology (San Diego, Calif) – 1991 – V.22 - P.137–65. 288. Tamai I, Ohashi R, Nezu J et al. Molecular and functional identification of sodium ion- dependent, high affinity human carnitine transporter OCTN2. // The Journal of biological chemistry. – 1998 – V.273 (32) - P.20378–82. 289. Tamai I, Tsuji A. Transporter-mediated permeation of drugs across the blood-brain bar- rier. // J Pharm Sci. – 2000 – V.89 (11) – P.1371–88. 290. Tamai I, Yabuuchi H, Nezu J et al. Cloning and characterization of a novel human pH- dependent organic cation transporter // OCTN1.FEBS letters. – 1997 - V.419 (1) – P.107–11. 291. Thomas H, Coley HM. Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein. // Cancer control : journal of the Moffitt Cancer Center. – 2003 – V.10 (2) – P.159–65. 292. Tian Y, Han X, Tian DL. The biological regulation of ABCE1. // IUBMB life. – 2012 – V.64 (10) – P.795–800. 293. Tohyama K, Kusuhara H, Sugiyama Y. Involvement of multispecific organic anion transporter, Oatp14 (Slc21a14), in the transport of thyroxine across the blood-brain barrier. // Endocrinology. – 2004. – V.145. – P. 4384-4391 294. Tokui T, Nakai D, Nakagomi R et al. Pravastatin, an HMG-CoA reductase inhibitor, is transported by rat organic anion transporting polypeptide, oatp2. // Pharmaceutical research. – 1999 – V.16 (6) – P.904–8. 295. Torchilin VP. Targeted polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs. // Cell Mol Life Sci – 2004 – V.61 – P.2549–59 296. Trajkovic M, Visser TJ, Mittag J et al. Abnormal thyroid hormone metabolism in mice lacking the monocarboxylate transporter 8. // J Clin Invest. – 2007 – V.117 – P. 627-635 297. Uchida Y, Ohtsuki S, Katsukura Y et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. // J Neurochem. – 2011 – V.117 (2) - P.333– 45. 298. Ueda K, Cardarelli C, Gottesman MM, Pastan I. Expression of a full-length cDNA for the human "MDR1" gene confers resistance to colchicine, doxorubicin, and vinblastine. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1987 – V.84 (9) – P.3004–8. 177 299. Uldry M, Thorens B. The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. // Pflügers Archiv European Journal of Physiology. – 2004 – V.447 (5) - P.480–9. 300. Ullrich KJ. Specificity of transporters for ‗organic anions‘ and ‗organic cations‘ in the kidney. // Biochimica et biophysica acta. – 1994 – V.1197 (1) - P.45–62. 301. Varma MV, Rotter CJ, Chupka J et al. pHsensitive interaction of HMG-CoA reductase inhibitors (statins) with organic anion transporting polypeptide 2B1. // Molecular pharmaceutics. – 2011 – V.8 (4) - P.1303–13. 302. Visser WE, Friesema EC, Visser TJ. Minireview: thyroid hormone transporters: the knowns and the unknowns. // Mol Endocrinol. – 2011 – V.25 (1) – P.1-14. 303. Vliet EA, Redeker S, Aronica E et al. Expression of multidrug transporters MRP1, MRP2, and BCRP shortly after status epilepticus, during the latent period, and in chronic epileptic rats. // Epilepsia. – 2005 – V.46 (10) – P.1569–80. 304. Volk HA, Burkhardt K, Potschka H et al. Neuronal expression of the drug efflux trans- porter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures. // Neuroscience. – 2004 – V.123 (3) – P.751–9. 305. Wada M, Toh S, Taniguchi K et al. Mutations in the canilicular multispecific organic anion transporter (cMOAT) gene, a novel ABC transporter, in patients with hyperbilirubinemia II/Dubin-Johnson syndrome. // Human molecular genetics. – 1998 – V.7 (2) – P.203–7. 306. Walsh CTS-B. R. Levine‘s Pharmacology: Drug interactions and reactions. // Seventh ed. Taylor & Francis - 2005 - P. 545. 307. Wanders RJ, Visser WF, van Roermund CW et al. The peroxisomal ABC transporter family. Pflugers Archiv // European journal of physiology. – 2007 – V.453 (5) – P.719–34. 308. Wawrzenczyk A, Nalecz KA, Nalecz MJ. Effect of externally added carnitine on the syn- thesis of acetylcholine in rat cerebral cortex cells. // Neurochemistry international. – 1995 – V.26 (6) - P.635–41. 309. Weinstein DE. Isolation and purification of primary rodent astrocytes. // Curr Protoc Neurosci. – 2001 - Chapter 3:Unit 3.5. 310. Weiss N, Miller F, Cazaubon S, Couraud PO. The blood-brain barrier in brain homeo- stasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. - 2009 – V.1788 – P. 842-57 311. Wen Z., Yan Z, He R et al Brain targeting and toxicity study of odorrana-lectin conju- gated nanoparticles following intranasal administration. // Drug Delivery, - 2011 – V.18 (8) – P.555–561 312. Westholm DE, Rumbley JN, Salo DR et al. Organic anion-transporting polypeptides at the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers. // Curr Top Dev Biol. – 2008 – V.80 – P.135-70. 178 313. Wijnholds J, Mol CA, van Deemter L et al. Multidrug-resistance protein 5 is a multi- specific organic anion transporter able to transport nucleotide analogs. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2000 – V.97 (13) – P.7476–81. 314. Willis CL, Leach L, Clarke GJ et al. Reversible disruption of tight junction complexes in the rat blood-brain barrier, following transitory focal astrocyte loss.Glia. – 2004 – V.48 (1) - P.1– 13. 315. Winters B.D., Bussey T.J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. // J Neurosci - 2005 - V.25 - P. 52 – 61. 316. Wirth EK, Conrad M, Winterer J. et al. Neuronal selenoprotein expression is required for interneuron development and prevents seizures and neurodegeneration. // FASEB J. – 2010 – V.24 (3) – P. 844-852. 317. Wirth EK, Roth S, Blechschmidt C et al. Neuronal 3',3,5-triiodothyronine (T3) uptake and behavioral phenotype of mice deficient in Mct8, the neuronal T3 transporter mutated in AllanHerndon-Dudley syndrome. // J Neurosci. – 2009 – V.29 – P. 9439-9449 318. Wolka AM, Huber JD, Davis TP. Pain and the blood-brain barrier: obstacles to drug de- livery. // Advanced drug delivery reviews. – 2003 – V.55 (8) – P. 987–1006. 319. Wong AD, Ye M, Levy AF et al. The blood-brain barrier: an engineering perspective. // Front Neuroeng. – 2013 - V.30 – P.6-17 320. Wu X, George RL, Huang W et al. Structural and functional characteristics and tissue distribution pattern of rat OCTN1, an organic cation transporter, cloned from placenta. // Biochimica et biophysica acta. – 2000 – V.1466 (1-2) – P.315–27. 321. Wu X, Huang W, Ganapathy ME et al. Structure, function, and regional distribution of the organic cation transporter OCT3 in the kidney. // American journal of physiology Renal physiology. – 2000 – V.279 (3) – P.449–58. 322. Wu X, Huang W, Prasad PD et al. Functional characteristics and tissue distribution pat- tern of organic cation transporter 2 (OCTN2), an organic cation/carnitine transporter. // J Pharmacol Exp Ther. – 1999 – V.290 (3) – P.1482–92 323. Wu X, Kekuda R, Huang W et al. Identity of the organic cation transporter OCT3 as the extraneuronal monoamine transporter (uptake2) and evidence for the expression of the transporter in the brain. // The Journal of biological chemistry. – 1998 – V.273 (49) – P.32776–86. 324. Xie Y, Burcu M, Linn DE, Qiu Y, Baer MR. Pim-1 kinase protects Pglycoprotein from degradation and enables its glycosylation and cell surface expression. // Molecular pharmacology. – 2010 – V.78 (2) - P.310–8. 179 325. Xu G, Bhatnagar V, Wen G,et al. Analyses of coding region polymorphisms in apical and basolateral human organic anion transporter (OAT) genes [OAT1 (NKT), OAT2, OAT3, OAT4, URAT (RST)] // Kidney international. – 2005 – V.68 (4) – P.1491–9. 326. Yabuuchi H, Tamai I, Nezu J et al. Novel membrane transporter OCTN1 mediates mul- tispecific, bidirectional, and pHdependent transport of organic cations. // J Pharmacol Exp Ther. – 1999 – V.289 (2) – P.768–73. 327. Yarnitsky D, Gross Y, Lorian A et al. Blood-brain barrier opened by stimulation of the parasympathetic sphenopalatine ganglion: a new method for macromolecule delivery to the brain. // Journal of neurosurgery. – 2004 – V.101 (2) – P.303–9. 328. You GMME. Overview of Drug Transporter Families. In: You GMME, editor. Drug Transporters: molecular characterization and role in drug disposition. // John Wiley & Sons, Inc.; Hoboken, NJ – 2007 - P.1–10. 329. Youngblood GL, Sweet DH. Identification and functional assessment of the novel mu- rine organic anion transporter Oat5 (Slc22a19) expressed in kidney. // American journal of physiology Renal physiology. – 2004 - V.287 (2) - P.236–44. 330. Zelcer N, Saeki T, Reid G, Beijnen JH, Borst P. Characterization of drug transport by the human multidrug resistance protein 3 (ABCC3) // The Journal of biological chemistry. – 2001 – V.276 (49) – P.46400–46407. 331. Zhang L, Gorset W, Dresser MJ, Giacomini KM. The interaction of ntetraalkylammoni- um compounds with a human organic cation transporter, hOCT1. // J Pharmacol Exp Ther. – 1999 – V.288 (3) - P.1192–8. 332. Zhang S, Yang X, Morris ME. Flavonoids are inhibitors of breast cancer resistance pro- tein (ABCG2)-mediated transport. // Molecular pharmacology. – 2004 - V.65 (5) – P.1208–16 333. Zhang W, Mojsilovic-Petrovic J, Andrade MF et al. The expression and functional char- acterization of ABCG2 in brain endothelial cells and vessels. // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. – 2003 – V.17 (14) - P.2085–7. 334. Zhang Y, Han H, Elmquist WF, Miller DW. Expression of various multidrug resistance- associated protein (MRP) homologues in brain microvessel endothelial cells. // Brain research. – 2000 – V.876 (1-2) – P.148–53. 335. Zhou SF. Structure, function and regulation of P-glycoprotein and its clinical relevance in drug disposition. // Xenobiotica; the fate of foreign compounds in biological systems. – 2008 – V.38 (7-8) - P.802–32. 336. Zubkov EA, Kulikov AV, Naumenko VS, Popova NK. Chronic actions of thyroxine on behavior and serotonin receptors in mouse strains with contrasting predispositions to catalepsy. // Neurosci Behav Physiol. – 2009 - V.39(9) – P. 909 180 337. Баклаушев В.П., Чехонин В.П., Павлов К.А. Моноклональные антитела в диагностике и терапии глиом. // Биомедицинская химия – 2009 - т.55 - № 2 - С.140-154. 338. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. -1991 – М. 339. Гурина О.И. Моноклональные антитела к нейроспецифическим антигенам. Получение, иммунохимический анализ, исследование проницаемости гематоэнцефалического барьера.. // Дис. докт. мед.наук. — М., - 2005. 340. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., и др. Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы С6 in vivo. // Клеточные технологии в биологии и медицине – 2007 - № 2 - с. 65-73. 341. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б. Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. // М. "Медицина" – 2007 – С.344 342. Яблоновская Л.Я., Спрышкова Н.А. Морфологическая и биологическая характери- стика экспериментальных опухолей мозжечка крыс. // Архив патологии – 1971 – т. 33 - № 2 с. 50-53. 181
