МР микроморфологическое описание

1
ОРГАНИЗАЦИЯ, МЕТОДИКА И ТЕХНИКА
МИКРОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО И ГИСТОХИМИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ
Методические указания для аспирантов,
обучающихся по специальности
03.02.01. – БОТАНИКА
Пятигорск 2011
2
Авторы-составители:
Галкин Михаил Андреевич – заведующий кафедрой ботаники ГБОУ ВПО
«Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства
Здравоохранения и социального развития РФ, профессор, доктор биологических наук.
Серебряная Фатима Казбековна – доцент кафедры ботаники ГБОУ ВПО
«Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства
Здравоохранения и социального развития РФ, кандидат фармацевтических наук.
Организация,
методика
и
техника
микроморфологического
и
гитсохимического исследования растительных объектов: методические указания
для аспирантов специальности 03.02.01 «Ботаника». – Пятигорск: ПГФА, 2011. – 32 с.
Рецензент:
Михеев Анатолий Дмитриевич – доктор биологических наук, директор
Эколого-ботанической станции БИН РАН (г. Пятигорск).
Методические указания предназначены для подготовки аспирантов и соискателей
по 03.02.01 «Ботаника» и составлена в соответствии с требованиями Министерства
образования и науки Российской Федерации.
Данные методические указания составлены в соответствии с Федеральными
государственными требованиями
к структуре основной профессиональной
образовательной программы послевузовского профессионального образования
(аспирантура), утверждены приказом Минобрнауки России от 16 марта 2011г. № 1365
и РПД, составленной на основании учебного плана, утвержденного учёным советом
вуза от 30.08.2011 протокол № 1.
Методические указания предназначены для подготовки к практическим занятиям
и самостоятельной работы аспирантов.
Рекомендовано редакционно-издательским советом ГБОУ ВПО «Пятигорская
государственная фармацевтическая академия»
© Пятигорская государственная
фармацевтическая академия, 2011 г.
© Кафедра ботаники, 2011 г.
3
1 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ
Цель дисциплины - сформировать у аспирантов целостное представление о
происхождении, структуре и филогенетических связях, о географии и хозяйственном
значении растений, а также дать аспиранту и соискателю в области биологических
наук целостное представление об основных принципах и методах организации
микроморфологического исследования.
Задачи дисциплины:
− Приобретение представлений о проблемах происхождения и развития
растительного мира, разнообразии, классификации и номенклатуре разных групп
растений и растительных сообществ.
− Закрепление знаний о строении растительных организмов, их росте и развития,
основе их жизнедеятельности, приспособлении к условиям окружающей среды и
совместному существованию.
− Приобретение знаний о проблемах использования растений в практических целях
(лекарственных, пищевых, технических, кормовых, мелиоративных, озеленительных),
основах акклиматизации растений, индикации и мониторинга растительного покрова.
Требования к исходному состоянию знаний и навыков аспирантов.
Дисциплина «Ботаника» является частью биологии, изучается на первом курсе
обучения в аспирантуре, относится к блоку обязательных дисциплин ООП ППО.
Аспиранты и соискатели должны быть знакомы с основами методологии и
организации анатомических исследований, основами статистики и анализа данных при
помощи статистических методов, приемами анализа вторичных данных
количественного исследования.
Место дисциплины в системе учебного плана образовательнопрофессиональной ступени
Изучая данную дисциплину, аспиранты и соискатели осваивают принципы и
практические критерии выбора для использования в профессиональной работе уже
изученных ими методов, обработки, анализа микроморфологической информации.
Приобретенные знания и навыки завершают формирование блока квалификации
«Методика, техники и организации микроморфологических исследований» и служат
базой овладения последующими специальными методиками гистохимического
исследования.
В результате изучения дисциплины аспиранты и соискатели должны
знать:
− основные биологические закономерности развития растительного мира и элементы
морфологии растений;
− основы систематики высших растений;
− основные положения учения о клетке и растительных тканях, диагностические
признаки растений,
используемые при определении сырья;
− основные физиологические процессы, происходящие в растительном организме;
4
− основы ботанической географии
растений;
− проявления фундаментальных свойств живого на основных эволюционнообусловленных уровнях организации.
уметь:
- работать с микроскопом и бинокуляром, готовить временные микропрепараты;
− проводить анатомо-морфологическое описание и определение растения по
определителям;
− гербаризировать растения и проводить геоботаническое описание фитоценозов;
владеть:
− ботаническим понятийным аппаратом;
− техникой микроскопирования и гистохимического анализа микропрепаратов
растительных объектов;
− навыками постановки предварительного диагноза систематического положения
растения;
− навыками сбора растения и их гербаризации;
− методами описания фитоценозов и растительности;
− методами исследования растений с целью диагностики лекарственных растения и
их примесей.
− исследования растений с целью диагностики лекарственных растения и их примесей.
5
Основы ботанической микротехники
Успех микроскопического исследования в значительной мере определяется
качеством препаратов, приготовляемых из микропроб. В световой микроскопии
наиболее распространены препараты в виде поперечных шлифов и постоянных
препаратов. Постоянные препараты сохраняются в течение длительного времени.
Универсальные световые микроскопы предназначены для изучения
прозрачных объектов (фиксированных и окрашенных препаратов тканей и клеток) в
проходящем свете, причем, для освещения используется видимая часть спектра.
Отечественные микроскопы МБИ (микроскоп биологический исследовательский)
предназначены для научно-исследовательской работы, микроскопы МБР (микроскоп
биологический рабочий) – для лабораторного анализа препаратов по отработанным
методикам. Кроме того, существуют студенческие и упрощенные микроскопы.
Любой световой микроскоп состоит из двух систем: оптической и механической.
Оптическая система включает осветительную и наблюдательную системы.
Осветительная система предназначена для освещения объекта. К ней
относятся: источник света (зеркало или электрический осветитель) и многолинзовый
конденсор, формирующий световой поток. В состав конденсора кроме линз входят:
ирисовая диафрагма, регулирующая количество света, и разнообразные светофильтры.
При использовании естественного освещения свет направляется на входную линзу
конденсора с помощью двустороннего зеркала. При использовании рассеянного света
используется вогнутая сторона зеркала, при использовании точечного источника света
– плоская сторона зеркала. Электрические осветители разнообразны по своему
устройству и характеристикам.
Наблюдательная система обеспечивает увеличение размеров объекта:
полезное, бесполезное и общее. Наблюдательная система включает: объективы,
призму и окуляр монокулярной насадки. При использовании бинокулярной насадки в
ее состав входят призма и призменный блок.
Объектив
служит
для
формирования
обратного
(перевернутого)
действительного изображения препарата. Это полезное увеличение, поскольку
позволяет увидеть детали, неразличимые невооруженным глазом. Призма служит для
изменения направления лучей на 45 градусов, что облегчает работу с микроскопом.
Для рассматривания полученного изображения используется окуляр, который дает
прямое мнимое увеличение, то есть используется как лупа. Это бесполезное
(«слепое») увеличение, поскольку при использование даже самых мощных окуляров
не удается увидеть новые детали изображения. Общее увеличение микроскопа равно
произведению увеличения объектива на увеличение окуляра (при использовании
бинокулярной насадки это произведение умножается на собственное увеличение
бинокулярной насадки – обычно в 1,5 раза).
6
Объективы.
Наиболее
важной частью наблюдательной системы является
объектив. К его важнейшим характеристикам относятся: полезное увеличение и
разрешающая способность. Разрешающая способность – это расстояние между
точками (линиями), на котором они видны раздельно. Разрешающая способность а
зависит от длины волны света и от апертуры объектива и вычисляется по формуле:
а = 0,61 ∙ λ / А,
где λ – длина волны света, А = n ∙ sin a – числовая апертура объектива. В последней
формуле: n – показатель преломления среды, находящейся между препаратом и
фронтальной линзой объектива, a – угол между оптической осью объектива и
наиболее сильно отклоняющимся лучом, попадающим в объектив.
Таким образом, чем меньше длина света и чем больше апертура, тем выше
разрешающая способность. Поэтому часто используют синие светофильтры для
уменьшения длины волны света. Для увеличения апертуры между препаратом и
фронтальной линзой объектива помещают иммерсионную среду: дистиллированную
воду (n = 1,33), глицерин (n = 1,45) или иммерсионное масло (n = 1,51). Обычно
разрешающую способность (в микрометрах) указывают для монохроматического света
с длиной волны 589 нм (желто-оранжевый свет). Характеристики наиболее
распространенных объективов приведены в таблице:
Маркировка
Иммерсия
объектива
8´0,20
20´0,40
40´0,65
40´0,75
90´1,25
нет
нет
нет
водная
масляная
Числовая
Увеличение
апертура
8
20
40
40
90
0,20
0,40
0,65
0,75
1,25
Разрешающая
способность,
мкм
1,80
0,90
0,55
0,48
0,29
Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых
волн: от 400 до 700 нм в видимой части спектра и до 250 нм в ультрафиолетовой
области. Это не позволяет изучать частицы с размерами менее 100...300 нм (несколько
десятых микрона).
Окуляры обеспечивают дополнительное увеличение от 5´ до 20´. Иногда в
состав окуляров вводятся дополнительно различные сетки и шкалы (окулярмикрометры).
Механическая система микроскопа служит для размещения элементов
оптической системы и управления ими. Рассмотрим механическую систему
микроскопа «Биолам С–11». В данном случае к механической системе относятся:
•
основание, на котором монтируется коробка с механизмом
микрометрической фокусировки и микрометрическим винтом (рукоятка
этого винта может располагаться на коробке или на основании);
•
на коробке подвижно монтируются: кронштейн конденсора и
тубусодержатель; сверху закреплен кронштейн предметного столика;
имеется паз для зеркала в оправе;
7
внутри тубусодержателя
располагается
механизм
грубой фокусировки, две рукоятки которого располагаются на
тубусодержателе;
•
в верхней части тубусодержателя крепится револьвер с объективами и
тубус с окуляром.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Правила работы с микроскопом БИОЛАМ
Микроскоп устанавливается по левую руку от исследователя.
При помощи макровинта объектив малого увеличения устанавливается по
оптической оси в 1 см от предметного столика.
При помощи винта регулировки положения конденсора последний
устанавливается в верхнее положение.
Производится полное раскрытие диафрагмы.
При помощи зеркала регулируется освещение поля зрения. Эта операция
производится при контроле интенсивности освещения через окуляр микроскопа.
На предметный столик помещается препарат так, чтобы объект исследования
оказался в поле зрения.
При помощи макровинта регулируется четкость изображения объекта.
Производится исследование объекта при «малом» увеличении.
Левой рукой придержать микроскоп за основание.
Правой рукой, вращая револьверную головку по часовой стрелке, исследователь
устанавливает на оптической оси объектив большого увеличения.
Микровинтом регулируется четкость изображения.
С помощью конденсора и диафрагмы регулируется освещение поля зрения.
Производится исследование объекта при «большом» увеличении.
По оптической оси устанавливается объектив малого увеличения.
Препарат убирается со столика.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ БИОМЕД-2
При работе с микроскопом необходимо соблюдать операции в следующем порядке:
1. Работать с микроскопом следует сидя;
2. Микроскоп установить перед собой, слева от себя, на 2-3 см от края стола.
Микроскоп осмотреть на наличие всех комплектующих.
3. Взять мягкую салфетку с предметного столика и протереть объективы и окуляр.
4. Включить осветительную лампу с помощью переключателя, расположенного на
левой стороне подставки.
5. Поместить постоянный или временный микропрепарат на предметный столик,
отведя держатель микропрепарата на предметном столике в крайне правое положение,
а затем отпустить.
6. Установить изучаемый объект под объективом малого увеличения (4/0,1),
передвигая предметный столик с микропрепаратом НЕ РУКАМИ, а при помощи
ВИНТОВ, РАСПОЛОЖЕННЫХ СЛЕВА ПОД ПРЕДМЕТНЫМ СТОЛИКОМ.
8
Предметный столик имеет двукоординатное перемещение, винт состоит из двух
частей: нижний винт и верхний винт.
Нижний винт перемещает микропрепарат по горизонтали X (слева направо).
Верхний винт перемещает микропрепарат по вертикали Y(сверху вниз).
7. Начинать работу с микроскопом необходимо всегда с объектива малого
увеличения (4/0,1).
8. Установить объектив (4/0,1) можно, повернув револьвер с объективами строго
по часовой стрелке до щелчка, так, чтобы он занял рабочее положение. Настроить
четкое изображение можно при помощи макровинта, плавно поднимая либо опуская
предметный столик.
9. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6-10;
10. Для изучения объекта при большом увеличении при помощи объективов с
увеличениями 10/0,25 или 40/0,65, сначала нужно поставить выбранный участок в
центр поля зрения микроскопа при малом увеличении.
11. Повернуть револьвер с объективами до щелчка, так, чтобы он занял рабочее
положение. При помощи микрометрического винта добиться хорошего изображения
объекта.
12. По окончании работы с большим увеличением, перевести микроскоп на малое
увеличение (4/0,1), вращая револьвер с объективами до щелчка, так, чтобы он занял
рабочее положение.
13. Отведя держатель микропрепарата в крайне правое положение, снять
микропрепарат с предметного столика, а затем отпустить держатель.
14. Выключить осветительную лампу с помощью переключателя, расположенного
на левой стороне подставки.
15. Протереть чистой салфеткой все части микроскопа.
Устройство микроскопа БИОМЕД-2
1. Окуляр;
2. Монокулярная головка;
3. Револьвер на 4 позиций;
4. Объективы;
5. Предметный столик;
6. Кольцо регулировки ирисовой
диафрагмы;
7. Конденсор;
8. Осветительная лампа;
9. Основание подставки;
10. Штатив;
9
11. Измерительный нониус;
12. Ограничительный винт;
13. Держатель препарата с фиксатором;
14. Макровинт;
15. Микровинт;
16. Ручка перемещения столика по
горизонтали X (слева направо);
17. Ручка перемещения столика по
вертикали Y (сверху вниз);
18. Выключатель осветительной лампы;
19. Ручка регулировки яркости.
10
Приготовление временных микропрепаратов (основные методы)
1. Для изучения строения мелких объектов
1.1. Промываются и протираются предметное и покровное стекла.
1.2.На предметное стекло наносится капля воды.
1.3.Пинцетом объект помещается в каплю воды.
1.4.С помощью пинцета поверх капли воды помещается покровное стекло. Если
из-под стекла выступает вода, то она отсасывается фильтровальной бумагой,
если пространство под стеклом частично не заполнено водой, она добавляется
пипеткой.
Рис. этапы приготовление микропрепарата.
Накрывание объекта покровным стеклом.
2. Для изучения строения эпидермиса
1.1. Промываются и протираются предметное и покровное стекла.
1.2. На предметное стекло наносится капля воды.
1.3. Эпидермис надрывается иглой.
1.4. Часть эпидермиса отделяется пинцетом и помещается в каплю воды.
1.5. С помощью пинцета поверх капли воды помещается покровное стекло.
Если из-под стекла выступает вода, то она отсасывается фильтровальной
бумагой, если пространство под стеклом частично не заполнено водой, она
добавляется пипеткой.
3. Для изучения поперечного среза органа
3.1.Промывают и протирают предметное и покровное стекла.
3.2.На предметное стекло наносится капля воды.
3.3.Лезвием вырезается неповрежденная часть органа.
3.4.Исследуемая поверхность выравнивается перпендикулярно к оси органа.
3.5.Лезвие помещается на изучаемую поверхность так, чтобы оно прикрывало
11
1/3 поверхности. Скользящим движением выполняется срез.
3.6.Срез с лезвия иглой снимается в каплю воды.
3.7.С помощью пинцета поверх капли воды помещается покровное стекло. Если
из-под стекла выступает вода, то она отсасывается фильтровальной бумагой,
если пространство под стеклом частично не заполнено водой, она добавляется
пипеткой.
4. Для изучения продольного среза органа
4.1.Промывают и протирают предметное и покровное стекла.
4.2.На предметное стекло наносится капля воды.
4.3.Лезвием вырезается неповрежденная часть органа.
4.4.Лезвием удаляется часть органа на глубину необходимую для исследования.
4.5.Лезвие помещается на изучаемую поверхность. Скользящим движением
выполняется срез.
4.6.Срез с лезвия иглой снимается в каплю воды.С помощью пинцета поверх
капли воды помещается покровное стекло. Если из-под стекла выступает вода,
то она отсасывается фильтровальной бумагой, если пространство под стеклом
частично не заполнено водой, она добавляется пипеткой.
Приготовление постоянных препаратов (основные методы)
Обязательным условием для долгосрочного хранения препарата из
растительного или животного материала является его фиксация. Фиксирующих
жидкостей много, самые доступные из них: этиловый спирт и продающийся в
аптеках препарат на основе формалина (формидрон)
Спирт-формол по Шафферу 10 % формалин, который готовят из 1 части 40 % формалина и 2 - 3 частей 96
% спирта.
Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не
требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт.
Выпадение белого осадка никак не сказываеться на свойстве фиксатора.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ
Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам поэтому
необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами.
Фиксация необходима с целью остановки (прекращения) жизнедеятельности
клеток. Для этого объект помещают на несколько часов в фиксатор.
12
Этапы приготовления постоянного микропрепарата
1
2
3
4
Изучаемый объект помещают в раствор 1части ФОРМИДРОНА с 2
частями воды на несколько дней.
Для мазков это время ограничивается 15 минутами и формидрон разводить
не следует.
После фиксации объект следует отмыть от фиксатора, для этого его
помещают на несколько часов в проточную воду. Для удержания объекта
при отмывке удобно поместить его в ситечко-шарик для заваривания чая.
Исследуемый объект перносят в батарею спиртов с целью удаления воды.
Мазки ополаскивают в проточной воде в течение 3-5 минут. Струя воды
должна быть не сильной, мазок сушат.
Далее если необходимо препарат может быть окрашен одним из доступных
вам красителей.
После окраски препарат готовят к заключению в монтирующую среду.
Приготовить батарею ( ряд флаконов ) растворов спиртов для удаления
воды. Возможно использовать как этиловый спирт (антисептический
раствор) так и Изопропиловый спирт (ИПС) который можно приобрести в
магазинах специализирующихся на продаже радиодеталей.
Последовательно наливаем в лабораторные стаканчики этанол или
изопропанол в концентрациях 50%, 70%, 96%, 99%.
Объект помещают в стаканчик, начиная с 50% этанолом на 10 минут. Затем
перемещают объект в стаканчики с все более высокой концентрацией
спирта, выдерживая в каждом по 10 минут. В процессе такого перемещения
этанол будет плавно вытягивать воду из объекта. Помещать объекты сразу в
концентрированный этанол нельзя, так как в этом случае, быстро выходящая
из клеток вода может повредить клеточные оболочки
Для мазков столь долгое пребывание в спиртах не нужно, достаточно 30-60
секунд, так как некоторые красители могут вымываться из мазка.
5
Если Вы хотите заключить препарат в канадский бальзам обезвоженный
материал переносят в уайт-спирит на 5-6 часов, Канадский бальзам можно
заменить на раствор канифоли в уайт-спирите, по консистенции
напоминающий сироп
6
Если препарат заключается в глицерин-желатиновую смесь, то объект
переносят не уайт-спирит, а в глицерин на несколько часов ( глицерин,
аптечный)
13
Заключение объекта в глицерин-желатин.
Последний приготовляется следующим образом. Чистый желатин (7 г)
размачивают в течение 2—3 ч в 42 см3 дистиллированной воды, добавляют
50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты. Все вместе
нагревается при помешивании на водяной бане, фильтруется и охлаждается.
При появлении осадка тщательно профильтровать через стекловату.
Готовый «глицерин-желатин» хранить в герметичном сосуде. При
комнатной температуре глицерин-желатин застывает.
Небольшой кусочек глицерин-желатина иглой или скальпелем переносят на
предметное стекло. Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицеринжелатин расплавляется. В него из глицерина переносится объект и
покрывается покровным стеклом.
Мазок заключают следующим образом, кусочек глицерин-желатина
помещают на покровное стекло Последнее слегка нагревают на спиртовке,
глицерин-желатин расплавляется, объект покрывается покровным стеклом.
Пространство между предметным и покровным стеклом заполняется
монтирующей средой, которая, прикреплеивает покровное и предметное
стекла и консервирует объект. Самым главным требованием к монтирующей
среде является соответствие ее коэффициента преломления света к
аналогичному показателю стекла.
Заключение объекта в канифоль или канадский бальзам
7
На покровное стекло по центру наносят каплю или, если стекло длинное, две
капли жидкого раствора канифоли. Покровное стекло помещают каплей
вниз и слегка прижимают
Края покровного стекла не следует вытирать ватой или марлей, смоченной
ксилолом, так как при этом часть смолы может растечься по чистой
поверхности покровного стекла. Засыхая, она образует неровности, которые
мешают наблюдению под микроскопом и от которых очень трудно
избавиться.
В результате неполного обезвоживания в окрашенных заключенных
препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под
микроскопом в таком участке среза и над ним обнаруживаются
многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы
избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом
синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте,
ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с
обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь
заключают.
14
Основные методы окрашивания препаратов
1. Окрашивание временных препаратов
1.1. Поднять покровное стекло препаровальной иглой.
1.2. Добавить к препарату каплю реактива.
1.3. Закрыть покровным стеклом.
1.4. Рассмотреть при малом увеличении.
1.5. Зарисовать объект при малом увеличении.
1.6. Записать результат окрашивания.
1.7. Поместить рядом с покровным стеклом каплю реактива так, чтобы она
прикасалась к ребру покровного стекла.
1.8. У другого противоположного ребра покровного стекла приложить полоску
фильтровальной бумаги, для оттягивания воды препарата.
1.9. Проследить постепенное окрашивание объекта при мало увеличении.
1.10.Зарисовать объект. Записать результат окрашивания.
2. Окрашивание препаратов с применением реактивов
с концентрированной серной кислотой
2.1. Проверить качество приготовления временного препарата при малом
увеличении микроскопа.
2.2. Поднять покровное стекло при помощи препаровальной иглы.
2.3. Снять покровное стекло.
2.4. Осушить препарат фильтровальной бумагой.
2.5. Добавить реактив, а затем конц. серную кислоту.
2.6. Выдержать препарат 1-2 мин. до появления окрашивания.
2.7. Промыть препарат водой.
2.8. Осушить предметное стекло, убрав избыток воды.
2.9. Накрыть покровным стеклом.
2.10.Рассмотреть при малом увеличении микроскопа.
2.11.Зарисовать объект. Записать результат окрашивания.
15
Основные гистохимические реактивы и их действие
Длительное время для изучения химического состава клеток и тканей
пользовались исключительно классическими биохимическими методами, в
основе которых лежит суммарное определение химических веществ в
размельченной ткани.
Однако, несмотря на свои положительные качества, эти методы не
обеспечивали полного представления о локализации тех или иных химических
веществ в различных структурных компонентах клеток и тканей. Поиски
методов, с помощью которых можно было бы определять локализацию
химических веществ в целостных микроструктурах органов и тканей, привели к
созданию гистохимического метода, объединяющего в себе гистологический и
биохимический методы.
При гистохимических реакциях неорганические и органические вещества,
входящие в состав клеток, вступают в химическую реакцию с различными
реактивами (красителями) и образуют окрашенные продукты реакции. По
степени интенсивности этих продуктов можно до некоторой степени судить и о
количественном содержании химического вещества в той или иной структуре.
В основе большинства гистохимических реакций лежат общие принципы.
1. Определенные химические группировки окрашиваются тем или иным
красителем. Например, фосфатные группы РНК образуют с основными
красителями (пиронин, толуидиновый синий и др.) солеобразные окрашенные
соединения
2. Краситель растворяется в определенном субстрате, входящем в состав
клеточных структур. Например, окраска жировых включений в клетке
основана на растворении Судана в жировой капле.
3. Некоторые химические компоненты клеток, такие, как ДНК, полисахариды,
неспособны реагировать с красителями. В таких случаях прибегают к
превращению их химических группировок в реакционно-активное состояние
(гидролиз ДНК хлористоводородной кислотой, окисление полисахаридов
йодной кислотой). При этом освобождаются или создаются вновь химические
группировки, которые способны реагировать с соответствующими реактивами,
в результате чего образуется окрашенный продукт реакции.
4. При выявлении локализации некоторых компонентов клетки прибегают к
многоступенчатым промежуточным реакциям и переводу неокрашенного
продукта реакции в окрашенный. Например, так поступают при гистохимическом окрашивании ферментов (подробнее об этом см. ниже).
Новый метод получил широкое распространение в исследовательской
практике. В настоящее время ни одна морфологическая лаборатория не
обходится без применения гистохимических методик. Однако успешное
владение ими требует усвоения определенных навыков и соблюдения ряда
условий, так как в отличие от гистологических методик, носящих большей
частью эмпирический характер, гистохимические основаны на определенных
16
химических механизмах и обладают строгой специфичностью. Отсюда главное
требование — особая точность и тщательность в работе. Критерием в оценке
результатов гистохимической реакции является не только локализация
химических веществ, но и интенсивность окраски исследуемых компонентов
клеток и тканей, так как именно она свидетельствует о концентрации
выявляемых веществ.
Если при гистологической обработке материала возможны некоторые
отклонения в ходе окрашивания препарата, то приемы, используемые для
подготовки материала и проведения гистохимических реакций, должны
тщательно соблюдаться, ибо отклонения на любом этапе могут изменить ход
реакции и в конечном итоге привести к неправильной оценке препарата.
Для создания надлежащих условий протекания химических реакций особое
внимание нужно уделить приготовлению рабочих растворов, а также чистоте
применяемой посуды и стекол, качеству реактивов и т. д.
В настоящее время гистохимия перешла на количественный уровень
исследования с применением специальных приборов (цитоспектрофотометров),
позволяющих довольно точно определять количественную характеристику
интенсивности окраски (продукта реакции), что особенно важно для оценки
состояния метаболизма в исследуемых органах, тканях и отдельных клетках.
Это еще в большей степени предъявляет повышенные требования к
качеству проведения гистохимических реакций и соблюдению строгой
стандартизации обработки сравниваемых объектов на всех этапах. Именно в
этих целях в первую очередь применяют совмещение сравниваемых образцов в
одном блоке с последующим получением срезов одинаковой толщины на одном
стекле. Когда это сделать невозможно, необходимо в ходе резки располагать
разные срезы на одном предметном стекле.
При любом способе совмещения сравниваемые срезы следует подвергать
всем этапам гистохимических реакций одновременно, используя одни и те же
порции реактивов.
НАЗВАНИЕ РЕАКТИВА
ОБЪЕКТ ОКРАШИВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТ ДЕЙСТВИЯ,
ЦВЕТ
1
2
3
ОРАНЖ. (КИСЛОТНЫЙ
КРАСИТЕЛЬ)
ДРЕВЕСИНА
КРАСНЫЙ
ХЛОР-ЦИНК-ЙОД
ДРЕВЕСНЫЕ ВОЛОКНА
ЖЕЛТО-КОРИЧНЕВЫЙ
ХЛОР-ЦИНК-ЙОД
КЛЕТЧАТКА
СИНЕ-ФИОЛЕТОВЫЙ
КРАХМАЛ
СИНИЙ, ФИОЛЕТОВЫЙ
БЕЛКИ
ЖЕЛТЫЙ, ОРАНЖЕВЫЙ
I2 В KI (Р-Р ЛЮГОЛЯ)
ЖИРЫ,
СУДАН III
ФЛОРОГЛЮЦИН + 50%-НАЯ
H2SO4
ЖИРОПОДОБНЫЕ ВЕЩЕСТВА,
ПРОБКА, КУТИН
ДРЕВЕСИНА (ЛИГНИН)
ОРАНЖЕВЫЙ ИЛИ
ОРАНЖЕВО-КРАСНЫЙ
МАЛИНОВО-КРАСНЫЙ
17
ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ
ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И СТРОНЦИЯ В ТКАНЯХ ВЫСШИХ
РАСТЕНИЙ
Одной из важнейших проблем экологической физиологии растений
является изучение ответной реакции растений на ионы тяжелых металлов,
которые при повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на
самые разнообразные физиологические процессы.
Данная проблема имеет не только очевидное практическое значение, которое
определяется возрастающим загрязнением окружающей среды тяжелыми
металлами, но также имеет и важное фундаментальное значение, которое
связано с исследованием механизмов адаптации и устойчивости растений к
тяжелым металлам.
По ряду причин растения не могут не поглощать большинство тяжелых
металлов и, в отличие от животных, способны накапливать их в больших
количествах. Именно поэтому проблема компартментации металлов в растении
является определяющей при изучении их токсического действия и механизмов
устойчивости.
Способность растений накапливать тяжелые металлы реализуется на
разных уровнях организации: клеточном, тканевом и органном, что связано,
прежде всего, со способностью растений накапливать металлы в клеточных
оболочках и вакуолях клеток разных тканей и органов, а также с
существованием барьерных тканей, ограничивающих передвижение ряда
тяжелых металлов.
Распределение и накопление металлов в тканях растений, а в ряде случаев
и в различных клетках одной и той же ткани, может быть крайне
неравномерным. При количественном анализе содержания металла в единице
массы, который часто проводят с помощью, например, атомно-абсорбционной
спектрофотометрии, усредняются не только различия в содержании металла в
различных зонах и участках корня и побега, но и различия в содержании металла
в различных тканях растений.
В итоге это может привести к недостаточно корректной интерпретации
полученных результатов. Неоценимую помощь в изучении распределения и
накопления металлов по тканям растений могут оказать простые в
использовании гистохимические методы. Полученные с их помощью данные
дополняют результаты количественного анализа, что позволяет полнее понять
основные закономерности распределения, накопления, а также пути
передвижения металлов по растению, что является насущной проблемой
современной иономики. В ранних работах для определения Pb использовали
сульфидный метод [1]. Позднее для гистохимического определения металлов
стали применять органические нефлуоресцентные и флуоресцентные
индикаторы.
В 1972 г. впервые был разработан гистохимический метод определения Pb
с использованием родизоната натрия [2].
18
Гистохимический метод определения Ni появился несколько позже [3]. В
настоящее время он модифицирован, что позволило повысить его
чувствительность [4].
Кроме того, разработаны гистохимические методы определения других тяжелых
металлов, а также стронция [5-7].
Для выявления Zn существует ряд методик с использованием
флуоресцентных индикаторов Zinquin, RhodZin-3, FluoZin-1, FluoZin-2, FluoZin3, IndoZin-1, FuraZin-1, TSQ, Newport Green PDX и Newport Green DCF,
различающихся по своей специфичности и чувствительности к ионам Zn, а
также по способности проникать через плазматическую мембрану [8, 9]. Для
определения Cu и Fe, а также Hg, Ni, Cd и Pb используют малоспецифичные
флуоресцентные красители Phen Green SK и Phen Green FL [8, 9].
Вышеперечисленные флуоресцентные индикаторы применяются, главным
образом, в физиологии животных, а в физиологии растений используются при
изучении транспорта металлов через клеточные мембраны.
Целью настоящей работы является обсуждение принципов разработки и
использования гистохимических методов определения тяжелых металлов (Cd,
Pb, Ni, Zn) и стронция с целью изучения их распределения, накопления и
передвижения по тканям высших растений, а также подробный анализ
интерпретации полученных результатов и возможных проблем, связанных с
проведением гистохимического анализа распределения этих металлов.
Основные принципы разработки гистохимических методов
Гистохимические методы определения металлов основаны на образовании
окрашенных или флуоресцирующих комплексов аналитических реагентов с
изучаемыми металлами. При разработке гистохимических методов для
выявления металлов в тканях растений учитываются следующие основные
принципы.
1.Аналитический
реагент
должен
образовывать
окрашенный
или
флуоресцирующий комплекс с изучаемым металлом, который будет отчетливо
виден под микроскопом, так как именно по его распределению можно судить о
распределении металла по тканям.
2.Используемый реагент должен обладать высокой чувствительностью и
селективностью по отношению к изучаемому металлу.
3.Реагент должен проникать в неповрежденные клетки.
4.Возможность перераспределения металла во время проведения анализа должна
быть незначительной, что особенно важно для ионов, поступающих внутрь
клетки.
19
5.При разработке метода данные гистохимического анализа должны быть
подтверждены результатами, полученными с помощью альтернативных
методов.
Ход определения
Протоколы подготовки индикаторов для проведения гистохимического анализа
приведены в таблице.
Серии срезов изучаемого материала, выполненные с помощью безопасной
бритвы, помещают на предметное стекло, на которое наносят 3-4 капли
аналитического реагента, осторожно накрывают покровным стеклом и через
несколько минут рассматривают под микроскопом.
При подсыхании реагента на предметном стекле его необходимо подслаивать
под стекло, а избыток удалять фильтровальной бумагой. Для протекания
реакций необходимо несколько минут. Препараты длительно не хранятся.
Локализацию металлов определяют по соответствующему окрашиванию тканей
или по флуоресценции. Для анализа распределения Сd, Pb, Ni и Sr, а также Zn c
помощью цинкона используют световую микроскопию, а для изучения
распределения Zn с помощью флуоресцентного сенсора Zinpyr-1 используют
конфокальную сканирующую флуоресцентную световую микроскопию или
флуоресцентную световую микроскопию.
Интерпретация результатов гистохимического анализа
Описанные гистохимические методы выявления металлов в тканях растений
являются полуколичественными или в ряде случаев - качественными.
Результаты анализа приведены на рис 1. По интенсивности окрашивания можно
судить о накоплении металла в клетках и тканях. Можно также провести
сравнительный анализ накопления металла в клеточных оболочках и в
протопластах клеток разных тканей. Для идентификации металлов, связанных с
материалом клеточных оболочек, а также находящихся в периплазматическом
пространстве и на поверхности протопласта, можно использовать плазмолиз
перед проведением гистохимического анализа (рис. 1д) [13, 14].
Следует, однако, сразу отметить, что при изучении окрашенных срезов по
интенсивности окрашивания мы можем полуколичественно оценивать и
сравнивать содержание металла в разных участках среза в расчете на единицу
площади, в то время как сравнение содержания металла в клетках разных тканей
возможно лишь при сходном размере клеток этих тканей на срезах.
20
Анализируя распределение металлов в растущих частях растений необходимо
учитывать, что уменьшение интенсивности окрашивания растягивающихся
клеток по сравнению с меристематическими свидетельствует лишь об
уменьшении содержания металла в растягивающихся клетках в единице объема
клетки. Содержание металла в пересчете на клетку может и не уменьшаться или
даже увеличиваться в результате его поглощения, например, в зоне растяжения
корня.
21
Строение клетки растений. Типы клеток. Включения.
Паренхимные и прозенхимные клетки. Хлоропласты в клетках листа мха мний
(Mnium cuspidatum)
От тела мха мний пинцетом отделить лист, промыть в воде и поместить в
каплю воды на предметное стекло. Приготовить временный препарат. При
малом увеличении микроскопа найти участок листа с четко видными клетками.
При большом увеличении микроскопа найти паренхимные и прозенхимные
клетки. Рассмотреть стенку клетки и найти хлоропласты. Зарисовать 3
паренхимные и 3 прозенхимные клетки с хлоропластами. Обозначить:
паренхимную и прозенхимную клетки, клеточную стенку и хлоропласты.
Крахмальные зерна в клубнях картофеля
(Solanum tuberosum)
В каплю воды на предметном стекле сделать лезвием соскоб с части
клубня картофеля. Приготовить временный препарат. Сначала при малом, затем
при большом увеличении микроскопа рассмотреть крахмальные зерна. Слегка
вращая микрометрический винт, обнаружить их слоистость. Перемещая
осторожно препарат (рукой или с помощью винтов рабочего столика)
идентифицировать крахмальные зерна. Зарисовать их, показав слоистость и
подписать виды зерен.
Не снимая покровного стекла, при малом увеличении произвести
окрашивание препарата раствором I2 в KI (на крахмал), для чего нанести каплю
раствора рядом с покровным стеклом, а с другой стороны положить
фильтровальную бумагу. При малом увеличении наблюдать постепенное
окрашивание от синего до почти черного. Записать в альбом эту характерную
реакцию на крахмал.
Сложные алейроновые зерна в клетках семени клещевины
(Ricinus communis L.)
Сделать тонкий поперечный срез обезжиренного эндосперма семени
клещевины и поместить его в каплю реактива I2 в KI (на белок). Накрыть
покровным стеклом. При малом увеличении микроскопа найти наиболее тонкую
часть среза со сложными алейроновыми зернами. При большом увеличении
зарисовать 2-3 клетки со сложными алейроновыми зернами. Зарисовать
отдельно алейроновое зерно. Обозначить оболочку алейронового зерна,
аморфный белок, кристаллоид белка, глобоид фитина. Записать результат
реакции на белок.
22
Кристаллы минеральных солей в клетках черешка листа бегонии (Begonia)
Приготовить временный препарат продольного среза черешка листа
бегонии. Сначала при малом, затем при большом увеличении микроскопа найти
клетки с октаэдрами и друзами.
Клеточная стенка.
Строение стенки клеток эндокарпа и хромопластов перца однолетнего (Capsicum
annuum)
Приготовить временный препарат эндокарпа. Для этого препаровальной
иглой надорвать эндокарп, пинцетом отделить часть эндокарпа и поместить
объект в каплю воды на предметном стекле, накрыть покровным стеклом.
а) при малом увеличении микроскопа найти четкое изображение клеток
эндокарпа. При большом увеличении рассмотреть часть препарата на месте
стыка двух соседних клеток. Найти первичную и вторичную клеточную стенку.
Зарисовать 2-3 клетки. Обозначить первичную клеточную стенку, вторичную
клеточную стенку, поры.
б) рассмотреть в поле зрения хромопласты; зарисовать, обозначить окраску.
Образовательные ткани: верхушечные меристемы, латеральные
меристемы
Первичная образовательная ткань в конусе нарастания стебля элодеи (Elodea)
На постоянном препарате при малом и большом увеличении микроскопа
рассмотреть верхушечную почку побега. При малом увеличении сделать
контурный рисунок почки. Обозначить конус нарастания, листовые бугорки и
бугорки пазушных почек, границы туники и корпуса. При большом увеличении
микроскопа зарисовать 2-3 клетки первичной меристемы конуса нарастания.
Обозначить стенку, цитоплазму и ядро.
Верхушечная меристема корня пшеницы
(Triticum aestivum)
Приготовить временный препарат кончика корня проростка пшеницы. При
малом увеличении микроскопа найти четкое изображение клеток корневого
чехлика, зон роста и всасывания. При большом увеличении микроскопа
рассмотреть зону роста. Зарисовать конус нарастания. Обозначить клетки
дерматогена, периблемы, плеромы.
23
Камбий в стеблях кирказона (Aristolochia) и подсолнечника (Helianthus)
а) на постоянном препарате поперечного среза стебля кирказона на малом, а
затем на большом увеличении микроскопа рассмотреть клетки камбия.
Зарисовать 2-3 клетки. Обозначить стенку и протопласт.
б) на постоянном препарате продольного среза стебля подсолнечника на малом,
а затем на большом увеличении микроскопа рассмотреть прозенхимные клетки
камбия. Зарисовать 2-3 клетки. Обозначить стенку и протопласт.
Покровные ткани
Строение эпидермы листа ириса (Iris sp).
А. Пользуясь постоянным препаратом поперечного среза листа ириса,
рассмотреть при малом и большом увеличении микроскопа участок эпидермы и
зарисовать его. Обозначить основные клетки эпидермы, замыкающие и
побочные клетки устьиц, устьичную щель и подустьичную полость.
Б. Приготовить временный препарат эпидермы листа ириса. Рассмотреть при
малом увеличении микроскопа и зарисовать участок эпидермы. Обозначить
замыкающие клетки устьица, устьичную щель, основные клетки эпидермы.
Указать тип устьичного аппарата, характер извилистости антиклинальных
стенок основных клеток эпидермы.
Строение эпидермы листа герани сильнопахнущей
(Pelargonium graveolens).
Пользуясь постоянным препаратом, рассмотреть при малом и большом
увеличении микроскопа и зарисовать участок эпидермы. Обозначить
замыкающие клетки устьиц, устьичную щель, основные клетки эпидермы,
трихомы. Указать тип устьичного аппарата, характер извилистости
антиклинальных стенок основных клеток эпидермы.
Строение эпидермы листа бегонии королевской (Begonia rex).
Приготовить временный препарат нижней эпидермы листа. Рассмотреть при
малом и большом увеличении микроскопа и зарисовать участок эпидермы.
Обозначить замыкающие клетки устьица, устьичную щель, побочные клетки,
основные клетки эпидермы. Указать тип устьичного аппарата, характер
извилистости антиклинальных стенок основных клеток эпидермы.
Трихомы эпидермы листа лоха (Elaeagnus sp.
)и коровяка (Verbascum sp.)
Приготовить временный препарат трихом эпидермы листьев лоха и коровяка.
Рассмотреть препарат при малом увеличении микроскопа. Зарисовать волоски
коровяка и лоха. Обозначить базальную клетку, апикальные клетки. Указать
виды волосков.
24
Строение перидермы стебля бузины (Sambucus racemosa)
На постоянном препарате при малом увеличении микроскопа найти перидерму с
чечевичкой, рассмотреть при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать строение чечевички и участок перидермы, прилегающий к ней.
Обозначить феллему, феллоген, феллодерму, выполняющую ткань чечевички,
остатки эпидермы.
Механические ткани. Проводящие ткани.
Работа 1. Уголковая колленхима в стебле тыквы (Cucurbita pepo)
Приготовить временный препарат поперечного среза стебля тыквы. Рассмотреть
препарат при малом увеличении микроскопа. В выступающих ребрах стебля
найти тяжи колленхимы. При большом увеличении микроскопа рассмотреть
отдельные тяжи колленхимы. Зарисовать 3-4 клетки, указать тип колленхимы.
Обозначить уголковые утолщения первичной стенки, неутолщенные участки
первичной стенки, протопласт.
Работа 2. Склеренхима в стебле льна (Linum usitatissimum)
Задание 1. На постоянном препарате стебля льна найти участки склеренхимы,
зарисовать 2-3 клетки. Обозначить первичную клеточную стенку, вторичную
клеточную стенку, поры и полость клетки.
Задание 2. Для приготовления временного препарата необходимо «потрепать»
часть стебля льна, разорвать его, пинцетом отделить часть тяжа лубяных
волокон. Сделать временный препарат и рассмотреть при малом увеличении
микроскопа. Зарисовать 2-3 клетки и обозначить первичную стенку, вторичную
стенку, поры, полость клетки.
Работа 3. Склереиды в мякоти плода груши (Pyrus communis)
Препарат готовиться методом соскоба с мезокарпа. Не накрывая объект
покровным стеклом, провести окрашивание на лигнин. При малом увеличении
микроскопа поместить группу склереид в центр поля зрения. Детальное
строение склереид рассмотреть при большом увеличении микроскопа.
Определить тип склереид. Зарисовать 1 клетку. Обозначить первичную стенку,
вторичную стенку, поровые каналы, полость клетки.
Работа 4. Проводящие элементы ксилемы и флоэмы стебля подсолнечника
(Helianthus annuus) и стебля кукурузы (Zea mays L)
А.При малом увеличении микроскопа рассмотреть постоянный препарат
продольного среза стебля подсолнечника. Найти ксилемную часть среза и
зарисовать части кольчатого, спирального и пористого сосудов. Найти
флоэмную часть среза и зарисовать 2-3 членика ситовидной трубки. Сделать
подписи к рисункам.
25
Б. При малом увеличении микроскопа рассмотреть постоянный препарат
поперечного среза стебля кукурузы. Найти проводящие элементы ксилемы и
флоэмы и зарисовать их. Сделать подписи к рисункам.
Работа 5. Трахеиды в проводящей системе стебля сосны (Pinus sylvestris)
При малом увеличении микроскопа рассмотреть постоянный препарат
радиального среза ксилемы сосны. Найти трахеиды. Зарисовать части двух
соединяющихся вертикально трахеид. Определить тип трахеид. Обозначить
первичную стенку, вторичную стенку, поры (указать тип пор).
Типы строения проводящей системы в членах растения
Работа 1. Непучковый тип проводящей системы
На постоянном препарате поперечного среза ветки липы при малом увеличении
микроскопа найти ксилему и флоэму. Зарисовать схему строения проводящей
системы. Обозначить ксилему и флоэму. В схему врисовать клетки,
составляющие проводящие ткани. Обозначить проводящие элементы ксилемы и
флоэмы.
Работа 2. Пучковый тип проводящей системы
А. На постоянном микропрепарате поперечного среза стебля кукурузы при
малом увеличении микроскопа найти проводящий пучок. Зарисовать клеточное
строение проводящего пучка. Обозначить ткани, составляющие проводящий
пучок. Дать определение проводящему пучку.
Б. На постоянном микропрепарате поперечного среза стебля тыквы найти
проводящий пучок. Зарисовать клеточное строение проводящего пучка.
Обозначить ткани, составляющие проводящий пучок. Дать определение
проводящего пучка.
В. На постоянном микропрепарате поперечного среза стебля клевера при малом
увеличении микроскопа найти проводящий пучок. Зарисовать клеточное
строение проводящего пучка. Обозначить ткани, составляющие проводящий
пучок. Дать определение проводящего пучка.
Г. На постоянном микропрепарате поперечного среза корневища орляка при
малом увеличении микроскопа найти проводящий пучок. Зарисовать клеточное
строение проводящего пучка. Обозначить ткани, составляющие проводящий
пучок. Дать определение проводящего пучка.
26
Д. На постоянном микропрепарате поперечного среза корня ириса при малом
увеличении микроскопа найти проводящий пучок. Зарисовать клеточное
строение проводящего пучка. Обозначить ткани, составляющие проводящий
пучок. Дать определение проводящего пучка.
Основные ткани. Выделительные ткани.
Работа 1. Основные ткани в стебле тыквы (Cucurbita pepo)
а) ассимиляционная основная ткань
На постоянном или временном микропрепарате поперечного среза стебля
тыквы при малом увеличении микроскопа найти ассимиляционную ткань.
Зарисовать несколько клеток ассимиляционной паренхимы. Обозначить стенку,
протопласт и хлоропласты.
б) выполняющая основная ткань
На постоянном микропрепарате поперечного среза стебля тыквы при малом
увеличении микроскопа найти выполняющую основную ткань. Зарисовать
несколько клеток выполняющей паренхимы. Обозначить стенку, протопласт.
Работа 2. Запасающая паренхима в клубнях картофеля (Solanum tuberosum)
Сделать с помощью лезвия срез части клубня картофеля. Промыть срез и
поместить в каплю воды на предметное стекло, закрыть покровным стеклом.
Рассмотреть при малом и большом увеличении микроскопа. Обратить внимание
на форму клеток, их размеры, содержимое. Зарисовать 4-5 клеток запасающей
ткани. Обозначить клеточную стенку, цитоплазму, крахмальные зерна.
Работа 3. Строение железки эпидермы листа мяты (Mentha piperita) или
плектрантуса( Plectranthus sp.)
Приготовить временный препарат эпидермы предложенного листа. Рассмотреть
при малом и большом увеличении микроскопа. Зарисовать железку (вид сверху
и сбоку). Обозначить ножку и головку.
Работа 4. Строение выделительных тканей внутренней секреции
а) членистые млечники в корнях одуванчика лекарственного (Taraxacum
officinale).
Приготовить временный микропрепарат продольного среза корня одуванчика.
Срезы необходимо делать неглубоко под покровной тканью корня. Найти
млечники при малом увеличении микроскопа. Рассмотреть строение млечников
при большом увеличении. Зарисовать и обозначить членистый млечник и
окружающие его клетки паренхимы.
27
б) смоляные ходы в хвоинке сосны (Pinus).
На постоянном микропрепарате поперечного среза хвоинки сосны при малом
увеличении микроскопа найти смоляные ходы. Рассмотреть строение смоляного
хода при большом увеличении. Зарисовать смоляной ход и обозначить полость
смоляного хода, секреторные клетки, клетки стенки смоляного хода.
Анатомическое строение корня травянистых растений
Работа 1. Анатомическое строение корня ириса (Iris sp.)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа временный или
постоянный микропрепарат поперечного среза корня ириса в зоне проведения.
Зарисовать схему анатомо-топографического строения корня. Обозначить: I покровную ткань, II - первичную кору, III – центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть микропрепарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение корня. Обозначить эпиблему,
экзодерму, мезодерму, эндодерму, перицикл, флоэму, ксилему. Указать тип
проводящего пучка.
Работа 2. Анатомическое строение корня тыквы (Cucurbita pepo)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа временный или
постоянный микропрепарат поперечного среза корня тыквы в зоне проведения.
Зарисовать схему анатомо-топографического строения корня. Обозначить: I –
покровную ткань, II – центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть при большом увеличении микроскопа временный или
постоянный микропрепарат поперечного среза корня тыквы.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение корня. Обозначить перидерму,
перицикл, флоэму, камбий, вторичную ксилему, первичную ксилему, паренхиму
радиальных лучей. Указать тип строения проводящей системы.
Задание 3. Составить таблицу, отражающую отличительные анатомические
признаки строения корня в зоне проведения у ириса и тыквы.
28
Анатомическое строение корней древесных растений и корнеплодов
Работа 1. Анатомическое строение корня липы (Tilia cordata)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
микропрепарат поперечного среза корня липы. Зарисовать анатомотопографическую схему с указанием годичных колец, первичных и вторичных
радиальных лучей. Обозначить: I – покровную ткань, II – центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть микропрепарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать гистологическое строение корня. Обозначить перидерму, перицикл,
флоэму, камбий, ксилему вторичную, ксилему первичную, паренхиму
радиальных лучей. Указать тип проводящей системы.
Работа 2. Анатомическое строение корнеплодов
а) корнеплод моркови (Daucus sativa).
Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный микропрепарат
поперечного среза корнеплода моркови. Зарисовать схему строения корнеплода
с указанием границ покровной ткани, перицикла, флоэмы, камбия, ксилемы.
Врисовать сосуды. Сделать обозначения.
б) корнеплод редьки (Raphanus sativus).
Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный микропрепарат
поперечного среза корнеплода редьки. Зарисовать схему строения корнеплода с
указанием границ покровной ткани, перицикла, флоэмы, камбия, ксилемы.
Врисовать сосуды. Сделать обозначения.
в) корнеплод свеклы (Beta vulgaris).
Рассмотреть при малом увеличении микроскопа поперечный срез корнеплода
свеклы. Зарисовать схему строения корнеплода с указанием границ покровной
ткани, перицикла, добавочных камбиальных колец с их производными, флоэмы,
камбия, ксилемы. Врисовать сосуды. Сделать обозначения.
г) Заполнить следующую таблицу:
Объект изучения
Корнеплод
моркови
Корнеплод
редьки
Корнеплод
свеклы
Место локализации
запасающей паренхимы:
1
2
3
Ксилема
Флоэма
Кольцевая паренхима
Условные обозначения: «+» - место локализации запасающей паренхимы.
Анатомическое строение стебля древесных растений
Работа 1. Анатомическое строение стебля сосны (Pinus sp.)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
микропрепарат поперечного среза стебля сосны. Зарисовать схему
анатомо-топографического строения стебля. Обозначить: I – покровную
ткань, II – кору, III - центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
перидерму, паренхиму коры, схизогенные вместилища, флоэму, камбий,
годичные кольца вторичной ксилемы, первичную ксилему, паренхиму
сердцевинных лучей, паренхиму сердцевины.
Работа 2. Анатомическое строение стебля липы (Tilia sp.)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
микропрепарат поперечного среза стебля липы. Зарисовать схему анатомотопографического строения стебля. Обозначить: I – покровную ткань, II –
кору, III - центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
перидерму, колленхиму, паренхиму коры, эндодерму, перициклическую
склеренхиму, флоэму, камбий, годичные кольца вторичной ксилемы,
первичную ксилему, паренхиму сердцевинных лучей, паренхиму
сердцевины.
. Анатомическое строение стебля травянистых растений
Работа 1. Анатомическое строение стебля кирказона (Aristolochia sp.)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
микропрепарат поперечного среза стебля кирказона. Зарисовать схему
анатомо-топографического строения стебля, отметив расположение
проводящих пучков. Обозначить: I – покровную ткань, II – кору, III центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
эпидерму, колленхиму, паренхиму коры, эндодерму, перициклическую
склеренхиму, флоэму, камбий, ксилему, паренхиму сердцевинных лучей,
паренхиму сердцевины.
Указать тип проводящей системы.
Работа 2. Анатомическое строение стебля спаржи (Asparagus sp.)
Задание 1. Приготовить временный микропрепарат поперечного среза
стебля спаржи, рассмотреть при малом увеличении микроскопа.
Зарисовать схему анатомо-топографического строения стебля, отметив
расположение проводящих пучков. Обозначить: I – покровную ткань, II –
кору, III - центральный цилиндр.
5
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
эпидерму, хлоренхиму, перициклическую склеренхиму, флоэму, ксилему,
паренхиму сердцевины.
Указать тип проводящей системы.
Работа 3. Анатомическое строение стебля корневища мать-и-мачехи
(Tussilago farfara)
Задание 1. Приготовить временный микропрепарат поперечного среза
стебля, рассмотреть при малом увеличении микроскопа. Зарисовать схему
анатомо-топографического строения стебля, отметив расположение
проводящих пучков. Обозначить: I – покровную ткань, II – кору, III центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
перидерму, запасающую паренхиму, эндодерму, перициклическую
склеренхиму, флоэму, камбий, ксилему, паренхиму сердцевинных лучей,
паренхиму сердцевины.
Работа 4. Анатомическое строение стебля корневища
ландыша майского (Convallaria majalis)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
микропрепарат поперечного среза стебля корневища ландыша. Зарисовать
схему анатомо-топографического строения стебля, отметив расположение
проводящих пучков. Обозначить: I – покровную ткань, II – кору, III центральный цилиндр.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Зарисовать анатомо-гистологическое строение стебля. Обозначить
эпидерму, запасающую паренхиму, эндодерму, перицикл, флоэму,
ксилему, паренхиму сердцевины.
Анатомическое строение листа
Работа 1. Анатомическое строение листовой пластинки дорзовентрального
листа камели (Camellia sp.) или самшита (Buxus sp.)
Задание 1. Пользуясь готовым микропрепаратом поперечного среза
листовой пластинки камелии или временным микропрепаратом
поперечного среза листовой пластинки самшита, рассмотреть
анатомическое строение при малом увеличении микроскопа. Составить
анатомо-топографическую схему строения листовой пластинки в районе
главной жилки. Обозначить: I - покровную ткань, II - мезофилл, III проводящие пучки.
Задание 2. При большом увеличении микроскопа детально изучить ткани
листовой пластинки и врисовать клетки в ранее заготовленную схему.
6
Обратить внимание на размеры и форму клеток, толщину стенок, наличие
межклетников, содержимое клеток. Обозначить эпидерму ( верхнюю и
нижнюю), устьица, колленхиму, склеренхиму, палисадную и губчатую
паренхиму, флоэму, ксилему, камбий.
Работа 2. Анатомическое строение листовой пластинки
изолатерального листа ириса (Iris sp.)
Задание 1. На постоянном или временном микропрепарате поперечного
среза листовой пластинки ириса рассмотреть расположение тканей.
Составить анатомо-топографическую схему строения листовой пластинки.
Обозначить: I - покровную ткань, II - мезофилл, III - проводящие пучки.
Задание 2. Рассмотреть препарат при большом увеличении микроскопа.
Обратить внимание на размеры и форму клеток, расположение устьиц,
толщину клеточных стенок, наличие межклетников, расположение и
строение проводящих пучков. Заполнить клетками ранее заготовленную
схему. Обозначить эпидерму, устьица, палисадную паренхиму, губчатую
паренхиму, склеренхиму, флоэму, ксилему.
Работа 3. Анатомическое строение листа сосны (Pinus sp.)
Задание 1. Рассмотреть при малом увеличении микроскопа постоянный
или временный микропрепарат поперечного среза хвои сосны. Сделать
анатомо-топографическую схему. Обозначить эпидерму, гиподерму,
складчатый мезофилл, смоляные ходы, эндодерму, проводящие пучки,
трансфузионную ткань.
Задание 2. Изучить препарат при большом увеличении микроскопа
обратить внимание на размер и форму клеток, толщину стенок, наличие
межклетников.
Выполнить рисунки 2-3 клеток или отдельных структурных элементов
рядом с обозначениями, сделанными на анатомо-топографической схеме.
7
ОРГАНИЗАЦИЯ, МЕТОДИКА И ТЕХНИКА
МИКРОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Методические указания для аспирантов,
обучающихся по специальности
03.02.01. – БОТАНИКА
Технический редактор: Браташова Т.М.
Подписано к печати «___»______________2011 г.
Формат 60X84, 1/16, бумага писчая, белая.
Усл. печ. л. _____
Уч.-изд.л. Тираж____экз. Заказ ________
Пятигорская государственная фармацевтическая академия
357532, г. Пятигорск, проспект Калинина, 11.