Подавление роста бактерий экзометаболитами культуры водоросли Chlorella Плеханов С.Е., Братковская Л.Б., Садчиков А.П. В настоящее время ведется поиск эффективных и безопасных методов снижения уровня бактериального загрязнения водоемов, инактивации бактерий в медицинской практике, – одним из которых является фотодинамическая терапия (ФДТ), заключающаяся в инактивации бактерий активными формами кислорода (АФК), которые образуются при комбинированном воздействии искусственно внесенных фотосенсибилизаторов и света спектрального состава, соответствующего полосам поглощения фотосенсибилизаторов. [1,2,3]. Однако, в водоемах постоянно идут естественные процессы образования АФК в связи с присутствием в водной среде фотосенсибилизаторов (пигментов), субстратов окисления (органических веществ), и металлов переменной валентности. Эти процессы, возможно и определяют антагонистические отношения водорослей и бактерий. Развитие культур микроводорослей сопровождается постепенным накоплением в среде внеклеточных органических веществ (ВОВ) [4]. В фильтратах водорослей обнаружены белки, липиды, аминокислоты, фенольные соединения, углеводы, гормоны, антибиотики, органические кислоты и другие соелинения, некоторые из которых физиологически активны [5]. При выяснении причин гибели бактерий в растущей культуре водоросли Westella botryoides было высказано предположение, что свет может инициировать образование веществ, обладающих антибактериальной активностью из неактивных предшественников, входящих в состав внеклеточных метаболитов. При этом имели в виду фотохимические дериваты хлорофиллидов в период активного роста и липиды в фазу отмирания культуры морской водоросли [6]. Несмотря на имеющиеся данные, остаются неясными причины возможного проявления бактерицидного действия внеклеточных веществ водорослей. В связи с вышеизложенным в данной работе представлены результаты изучения антибактериальных свойств компонентов внеклеточных метаболитов культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa в лабораторных условиях. Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования использовали аксеничную культуру водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. штамм DMMSU-S-39 из коллекции кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова. Культуры выращивали накопительным методом в оптимальных для роста условиях по освещенности и температуре. В качестве тест-объектов использовали культуры бактерий из той же коллекции: грамположительные Staphylococcus aureus шт. 205, Bacillus subtilis и грамотрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (выращивали на чашках Петри на МПА). Численность клеток определяли прямым счетом в камере Горяева Мертвые клетки определяли по окрашиванию метиленовым синим подсчетом 500–1000 клеток. Ошибка не превышала 5–7%. ВОВ определяли после сжигания с бихроматом калия колориметрически при 630 нм [7]. Для испытания антибактериальной активности метаболитов использовали экстракты среды водоросли C. pyrenoidosa с конца экспоненциальной фазы роста (7 сут.), численность (N) клеток приводили к 500 млн кл./мл. Ступенчатую экстракцию проводили растворителями различной полярности [8]. Антибактериальную активность экстрактов определяли методом дисков на чашках Петри [9]. Тонкослойную хроматографию липидов проводили в 12 Биологические науки соответствии с [10]. Состав ЖК определяли методом газо-жидкостной хроматографии. [11]. Концентрацию перекисных продуктов определяли по малоновому диальдегиду (МДА) [12]. Экзогенные ЖК ирименяли в виде солей аммония. Эксперименты проводились в 3–5 повторностях. Данные представлены с определением ошибки репрезентативности выборочной средней для малых выборок и 5% уровня значимости [13]. Результаты и обсуждение Рост культуры C. pyrenoidosa характеризоваля короткой лаг-фазой, быстро проходила фаза ускорения роста численность клеток в течение экспоненциальной фазы (3–7 сут.) увеличивалась со 170 до 600 млн/мл. По мере роста численности клеток в культуральной среде накапливались органические вещества, хотя прямой пропорциональности численности не наблюдали. К концу наблюдений (14 сут.) количество ВОВ достигало 600 мг/л. С развитием культуры происходило увеличение количества мертвых клеток, которое составило к концу опыта 32 %. Содержание липидов в составе ВОВ по мере роста культуры изменилось с 6 до 45 мг/л, свободных жирных кислот (СЖК) – с 0.24 до 2,4 мг/л (табл.1). Экперименты по определению антибактериальных свойств хлороформ-метанольного экстракта культуральной среды С. pyrenoidosa, находящейся в конце экспоненциальной фазы роста по отношению к бактериям Staphylococcus aureus показали зависимость величины антибактериального эффекта от освещенности. Размер зон угнетения бактерий возрастал с увеличением освещенности, однако рост не менялся после достижения освещенности 16–24 Вт/м2.. Параллельно было показано, что при наличии антибактериального эффекта экстрактов, он проявляется при времени освещения не менее 1 ч, а максимальный эффект проявляется через 24 ч освещения. Большинство испытанных экстрактов не оказывали угнетающего действия на грам-отрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, а в темноте не действовали и на грамположительные Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, возможно в связи с малым содержаниемв средах антибактериальных веществ или, как следует из данных литературы, определяется спецификой клеточной оболочки и мембраны бактерий [14]., проявляющих устойчивость к веществам, содержащимся в экстрактах Очевидно, в таком случае, что высокая антибактериальная активность гексанового и бензольного экстрактов, связана именно со СЖК (табл. 2). Хлороформ-метанольные экстракты и в темноте незначительно подавляли рост S. aureus. Этилацетатный экстракт также вызывал подавление роста бактерий. Хроматография на бумаге ацетоновых, спиртовых, хлороформ-метанольных экстракты среды в системе растворителей, применяющейся при работе с растительными пигментами (гексан–петролейный эфир–ацетон – 10:2,5:2) позволила обнаружить 2 зоны угнетения роста бактерий при наложении полосок хроматограмм на поверхность засеянной бактериями S. aureus плотной среды, но только на свету (через 24 ч). Подавление роста происходило вокруг участков хроматограмм с Rf 0; 0,93–0,99 и 0,69–0,87 (только для спиртового экстракта), соответствующих пятнам хлорофиллидов, b-каротина и феофитинов соответственно. Хроматографирование в тонком слое активных по отношению к бактериям участков бумажных хроматограмм проводили в системах растворителей для полярных (хлороформ-метанол–вода, 65:25:4) и неполярных (петролейный эфир–этиловый эфир–уксусная кислота – 80:20:1) липидов. Среди соединений со старта бумажных хроматограмм с Rf 0,00 наряду с веществами пигментной природы содержатся полярные липиды, не обладающие бактерицидным действием. Следовательно, антибактериальная активность связана с веществами пигментной и липидной природы В пятнах с Rf 0; 0,93–0,99 на бумажных хроматограммах при дальнейшем хроматографировании в тонком слое в системе для неполярных липидов были выявлены стерины (Rf 0,20). СЖК (Rf 0,29), триацилглицертны (Rf 0,48), эфиры стеринов (Rf 0,79), углеводороды (Rf 0,98). Качественный состав липидов среды представлен в табл. 3. Из данных табл. 3 следует, что накопление в среде водоросли ЖК максимально в начале кривой роста, затем уменьшается и вновь увеличивается в конце стационарной фазы роста. Относительное содержание полярных липидов, представленных фосфо- и гликолипидами, было существенно 17–28%). Среди неполярных липидов присутствовали диацилглицериды и стерины, СЖК и углеводороды, причем 2 последних группы имели высокое процентное содержание. Триацилглицерины и эфиры стеринов в средах присутствовали в незначительных количествах (в % от суммы). Таблица 1. Накопление внеклеточных органических веществ в среде при росте культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39 Время, сут. N кл., млн. кл/мл Метвые клетки, % ВОВ, мг/л Липиды, мг/л СЖК, мг/л 2 4 6 8 10 12 14 46,0 +12 284 + 9,0 510 + 15 683 + 22 824,0 + 44 880 + 30 831 + 42 1,0 2,6 7,4 9,4 15,0 24,3 32,4 122 + 16 200 + 31 282 + 28 372 + 16 440 + 29 494 + 10 600 + 34 5,9 + 3,0 18,3 + 4,3 20,4 + 3,8 27,8 + 9,1 46,2 + 7,5 44,8 + 11 45,2 + 12 0,24 +0,03 0,14 +0,1 0,42 +0,09 1,45 + 0,1 1,36 + 0,4 1,79 + 0,9 2,42 + 1,1 Таблица 2. Антибактериальная активность экстрактов среды культуры водоросли C. pyrenoidosa на свету (метод дисков). Экстракт 10-кратно сконцентрированная среда Спирт этиловый Ацетон Гексан Бензол Этилацетат Хлороформ-метанол Всероссийский журнал научных публикаций Размер зон угнетения роста, мм Bacillus subtilis Staphilococcus aureus 1,12 + 0,37 3,50 + 0,68 2,00 + 0,21 3,67 + 1,11 3,52 + 0,96 1,00 + 0,78 4,10 + 0,70 1,33 + 0,11 2,67 + 0,78 нет данных 2,42 + 0,98 3,40 + 0,54 1,15 + 0,22 5,45 + 0,51 № 5(15) 2013 13 Угнетение роста бактерий S. аureus происходило лишь вокруг пятна СЖК. Близкие результаты были получены для экстрактов клеток морской водоросли Westella botryoides [6] и липидных экстрактов сред диатомовой Nitzschia ovalis [7]. Следовательно, основными бактерицидными веществами, выделяемыми водорослью С. pyrenoidosa следует считать вещества пигментной природы и СЖК. Этилацетатный экстракт, содержащий, в основном вещества фенольной природы, также вызывал подавление роста бактерий. Это может быть обусловлено как способностью фенольных соединений легко проникать в клетки и подавлять энергетику, так и с их способностью при окислении образовывать высокотоксичные хиноны [15, 16]. С целью определения, достаточны ли реальные концентрации СЖК в средах водоросли C. pyrenoidosa для подавления роста бактерий, были поставлены опыты, в ходе которых методом дисков определяли антибактериальную активность фракции СЖК сред, опираясь на их концентрации в разные фазы роста. В период интенсивного роста (4–6 сут.) содержание СЖК в средах было невелико и составляло 0,2–0,4 мг/л. Резкое увеличение содержания СЖК наблюдали в стационарной фазе: от 12 до 14 сут. содержание СЖК увеличилось с 1,8 до 2,4 мг/л (табл. 1, 3). Судя по данным табл. 5, антибактериальный эффект связан с количеством внеклеточных СЖК и является светозависимым – зоны инактивации бактерий на свету значительно превышают по размерам таковые в темноте. Количество СЖК в среде C. pyrenoidosa достаточно для проявления антибактериального эффекта уже в начале кривой роста. Данные свидетельствуют, что СЖК в концентрации 0,42 мг/л способны подавлять рост бактерий. Очевидно, действе света стимулирует процесс окисления ЖК и ускоряет образование продуктов их окисления, хотя известно, что и сами ЖК являются биологическими детергентами и физиологически активны. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (судя по накоплению МДА) возрастало в экспоненциальную фазу роста культуры и и увеличивалось на протяжении рост а культуры и в стационарную фазу (табл. 4). Ранее методом газо-жидкостной хроматографии нами показало, что в средах C. pyrenoidosa содержатся насыщенные и ненасыщенные ЖК (НЖК) с числом углеродных атомов от 14 до 18. Степень ненасыщенности ЖК возрастала в экспоненциальной фазе роста (2 сут.), затем снижалась и вновь возрастала при переходе в стационарную фазу роста (8 сут.) [17]. Одновременно к концу кривой роста наблюдали и увеличение содержания МДА, что свидетельствует об усилении процессов окисления ЖК с образованием гидроперекисей, альдегидов, кетонов, являющихся токсичными. Для сравнения антибактериальной активности ЖК были испытаны химически чистые препараты арахидоновой (20:4), линоленовой (18:3), олеиновой (18:1), стеариновой (18:0) и пальмитиновой (16:0) ЖК по отношению к культуре S. aureus. Оказалось, что при концентрации 10 мкг/мл в темноте только НЖК обладали антибактериальной активностью: арахидоновая, линоленовая и линолевая. При освещении 24 Вт/м2 антибактериальная активность НЖК существенно возрастала и была тем значительней, чем больше двойных связей содержала ЖК. Таким образом, внеклеточное органическое вещество зеленых микроводорослей обладает антибактериальной активностью, которая определяется наличием в своем составе антибактериальных веществ – СЖК. Как показано в нашей рабочей группе, антибактериальная активность на свету феофитинов, хлорофиллидов, НЖК связывается и с их прямым действием: хлорофиллиды вызывали гибель 50% клеток S. aureus при их концентрации в средах 0,05 мкг/мл, а НЖК – при 2 мкг/мл [18]. Есть основания полагать, что существенное значение в антибактериальном действии культуральных сред водоросли C. pyrenoidosa и экстрактов из них может иметь синглетный кислород. Время жизни его невелико (около 2 мкс) и он реагирует прежде всего с молекулами, вблизи которых образовался. Такими молекулами являются молекулы хлорофилла и полиненасыщенных кислот липидов, с которыми хлорофилл гидрофобно связан. Образование синглетного или других активных форм кислорода ведет к инициации свободнорадикальных процессов окисления липидов клеток бактерий и развитию окислительного повреждения. Наличие НЖК в составе метаболитов, пигментов-сенсибилизаторов, синглетного кислорода, металлов переменной валентности может инициировать процессы перекисного окисления пригодных субстратов из состава ВОВ с повреждением бактериальных клеток продуктами окисления. Вышесказанное свидетельствует в пользу тесной связи антимикробного действия на свету веществ пигментной и липидной природы. Спектр действия этих соединений сходен: они подавляли на свету рост на плотных средах грамположительных бактерий и не влияли или влияли слабо на рост грамотрицательных бактерий. Таблица 3. Липиды (% от суммы) в среде культуры С. pyrenoidosa в процессе роста. Время, сут. 3 7 11 14 Полярные липиды 17,0 + 0,8 30,8 + 5,9 27,4 +6,9 28,8+ 4,8. Диацил-глицерины +стерины 14,5 + 2,8 17,7 + 5,4 27,0 + 2,7 22,8 + 1,3 СЖК Триацил-глицерины 9,2 +1,7 14,4 + 6,6 7,7 + 7,9 12,1 + 1,4 9,2 + 2,2 2,8 + 1,9 8,2 + 2,1 Эфиры стеринов Углево-дороды 16,5 + 5,2 9,7 + 1,8 6,7 + 1,5 33,6 + 7,0 37,1 + 7,0 26,4 + 5,3 22,2 + 5,5 Таблица 4. Накопление в среде C. pyrenoidosa СЖК и МДА. Антибактериальная активность хлороформ-метанольных экстрактов среды C. pyrenoidosa в процессе роста культуры (тест-объект – S. aureus) Время, сут. 2 6 8 14 14 СЖК, мг/л 0,24 0,42 1,36 2,42 Размер зон угнетения бактерий, мм МДА, мМ/л-8 8 11 12 14 на свету 0,75 5,40 6,2 5 9,15 в темноте 0 0,35 0,75 3,75 Биологические науки Искусственно вносимые источники АФК, очевидно повысят значение процессов светозависимой окислительной деструкции внутриклеточных структур бактерий [14], которая будет происходить одновременно с прямой инактивацией бактерий функционально активными экзометаболитами водорослей. Полученные данные свидетельствуют о значении внеклеточных метаболитов в регуляции взаимоотношений в альгобактериальных сообществах при совместном культивировании или в естественных условиях. Список использованных источников 1. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). // J. Antimicrob. Chemother. 1998. V. 42. P. 13–28. 2. Jori G., Brown S.B. Photosensitized inactivation of microorganisms. // Photochem.Photobiol.Sci. 2004. V. 3. P. 403–405. 3. Hamblin MR, Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. P. 436–450. 4. Плеханов С.Е., Максимова И.В. Функциональное состояние культур хлорококковых водорослей и накопление внеклеточных органических веществ // Физиол. раст. 1996. Т. 43, № 1. С. 142–149. 5. Сиренко Л.А., Козицкая В.Н. Биологически активные вещества водорослей и качество воды. Киев: Наукова думка, 1988. 256 с. 6. Максимова И.В., Сидорова О.А. Светозависимый антибактериаль­ный эффект водорослей и его экологическое значение // Гидробиол. ж. 1986. Т. 22, № 6. С. 3–11. 7. Максимова И.В., Малаховская О.О., Прядильщикова Е.Г. Антибактериальная активность диатомовых водорослей. I. Липиды Nitrzschia ovalis и их антибактериальная активность .// Физиол. раст. 1984. Т. 31, В. 5. С. 944–950 8. Тамбиев А.Х., Шелястина Н.Н., Болдырева Л.С. Изучение биологической активности экзометаболитов одноклеточных морских водорослей // Физиол. раст. 1981. Т. 28, № 3. С. 31–35. 9. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1979. 455 с. 10. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 324 с. 11. Юськович А.К. Экстракция неэтерифицированных жирных кислот из плазмы крови //Лаб. дело. 1985, № 8. С. 488–489. 12. Ланкин В.В., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбат-зависимого переокисления липидов тканей с помощью теста с 2-тиобарбитуровой кислотой / Биоантиокислители. М.: Наука. 1975. С. 73–78. 13. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: МГУ, 1980. 279 с. 14. Страховская М.Г. Фотодинамическая инактивация микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты// Автореф. дис… докт. биол. наук. 2010. М.: МГУ, 49 с. 15. Стом Д.И., Бобовская Л.П., Тимофеева С.С. Влияние фенолов и продуктов их окисления на водные растения и содержание в них сульфгидрильных групп // ДАН СССР. 1974. Т. 216, № 3. С. 698–701. 16. Плеханов С.Е. Первичные функциональные реакции пресноводных зеленых водорослей на химическое загрязнение. // Автореф. дис… докт. биол. наук. 1999. М.: МГУ. 50с. 17. Максимова И.В., Плеханов С.Е., Светлова Е.Н. Жирные кислоты культуры водорослей Westella botryoides // Известия РАН. Сер. биол. 1995, № 6. С. 669–673. 18. Сидорова О.А., Максимова И.В. Причины антибактериальной активности хлорофиллидов при их освещении // Вестник Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 1989, № 3. С. 31–35. Всероссийский журнал научных публикаций № 5(15) 2013 15