Флуоресцентные методы – для контроля наличия

И.М. МИЩЕНКО2, М.С. МИХАЙЛОВА2, Р.В. СОЛОДИМОВ1
1Московский
инженерно-физический институт (государственный университет)
Государственный Технический Университет им. Н.Э. Баумана
2Московский
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ – ДЛЯ КОНТРОЛЯ НАЛИЧИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ
Разработаны лазерные флуоресцентные экспресс методы диагностики микробов, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. Определена возможность перспективы этих методов в биотехнологиях.
Флуоресцентные методы признано считаются одними из самых чувствительных для работы с биомолекулами. Их чувствительность сочетается с коротким временем получения информации, возможностью бесконтактной регистрации и потенциальной способностью контролировать большие площади или объёмы. Всё
это вместе делает флуоресцентные методы привлекательными для использования их в контроле за бактериальным загрязнением окружающей среды. Однако для достижения этой цели необходимо, чтобы используемый метод, в добавление к вышеперечисленным преимуществам, обладал ещё и специфичностью.
Обычный способ сделать метод специфичным – связать какой-либо искусственный флуорофор с веществом, заведомо связывающимся с данным типом (а лучше видом и даже штаммом) клеток микроорганизмов. Так Hughes, Bittner и Olsen предлагают метить субстраты для определённых ферментов микроорганизмов. Наличие и степень жизнеспособности искомых бактерий авторы определяли по изменению флуоресценции в процессе. Fazii, Ciancaglini и Riario Sforza определяли Грам-статус микроорганизмов крови человека с помощью двух флуорофоров – акридина оранжевого и флюоресцеина. В их экспериментах Грамположительные бактерии выглядели жёлтыми, а Грам-отрицательные бактерии – зелёными. Stitt et all регистрировали наличие аэробных микроорганизмов и даже их первичную идентификацию с помощью флуорофоров, чувствительных к концентрации кислорода в среде измерения.
Самым распространённым и, в настоящий момент, бурно развивающимся методом, основанным на меченных флуорофорами молекулах-маркерах, является FISH (fluorescence in situ hybridization). Этот метод
основан на введении в живые клетки микроорганизмов меченных флуорофорами фрагментов рибосомальной ДНК известных бактерий. Далее, в случае удачной гибридизации, что говорит о наличие искомых клеток в пробе, последние можно подсчитать с точностью до одной клетки. Статей на эту тему очень много.
Другой подход – использовать собственную флуоресценцию микроорганизмов. Из литературы известно,
что естественными флуорофорами являются аминокислоты, имеющие в структуре бензольное кольцо – фенилаланин, тирозин и триптофан. Кроме того, способность к флуоресценции демонстрируют восстановленные пиридиннулеотиды, такие как NADH и NADPH, а также флавопротеины и некоторые вторичные метаболиты. Большинство авторов сходится на том, что именно восстановленные пиридиннулеотиды (NADH и
NADPH) дают основной вклад в флюоресценцию живых организмов микроорганизмов (1).
Для придания методам, использующим собственную флуоресценцию, специфичности, некоторые авторы
используют фиксацию клеток на подложку. Причём в качестве фиксаторов используются специфичные для
данного вида микроорганизмов молекулы, которые распознают компоненты бактериальной стенки (липополисахариды, рецепторы белков) (1, 2). Можно подойти с другой стороны – использовать флуоресцентный
метод как часть комплексной технологии контроля за окружающей средой. В этом случае обнаружение частиц, обладающих собственной флуоресценцией в заданном диапазоне, является лишь первым этапом, за
которым следует использование других методов (например, FISH) с целью полной идентификации обнаруженных биологических частиц.
В заключение следует отметить, что в литературе не удалось найти ссылок на работы, в которых бы использовались методы, основанные на регистрации собственной флюоресценции микроорганизмов, для их
достоверной идентификации.
Список литературы
1. Estes С., Duncan A., Wade B., Llloyd C., Ellis W., Powers L. Reagentless detection of microorganisms by intrinsic fluorescence Biosensors and Bioelectronics. 18 (2003). 5–6. 511–519.
2. Mason H.-Y., Lloyd C., Dice M., Sinclair R., Ellis W., Powers L. Taxonomic identification of microorganisms by capture and intrinsic
fluorescence detection Biosensors and Bioelectronics. 18 (2003). 5–6. 521–527.