УДК 630*181.324 Красноярская государственная технологическая академия

УДК 630*181.324
П.В.МИРОНОВ, С.Р.ЛОСКУТОВ
Красноярская государственная технологическая академия
Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН
Миронов Петр Викторович родился в 1950 г.,
окончил в 1973 г. Красноярский государственный
университет, кандидат биологических наук, доцент
кафедры химической технологии древесины Красноярской государственной технологической академии. Имеет 35 печатных работ в области биофизики водных систем, физиологии устойчивости
древесных растений к низким температурам.
Лоскутов Сергей Реджинальдович родился в
1951 г., окончил в 1973 г. Красноярский государственный университет, кандидат химических наук,
заведующий лабораторией химии растительных
ресурсов Института леса им. Сукачева СО РАН,
член Координационного совета по современным
проблемам древесиноведения. Имеет около 45 научных публикаций по проблеме взаимодействия
древесины с физически активными низкомолекулярными веществами.
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРОЗОСТОЙКОСТИ ДРЕВЕСНЫХ
РАСТЕНИЙ, ИНТРОДУЦИРУЕМЫХ В ДЕНДРАРИИ
ИНСТИТУТА ЛЕСА СО РАН
РОЛЬ БЕЛКОВ - КРИОПРОТЕКТОРОВ
В ПЕРЕОХЛАЖДЕНИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ВОДЫ
В ТКАНЯХ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ*
Показано, что водорастворимые белки цитоплазмы меристематических тканей лиственницы сибирской обладают выраженным криозащитным действием, проявляющимся в значительном переохлаждении воды и снижении активности центров гетерогенной нуклеации.
It is shown that water-soluble cytoplasm proteins of meristematic tissues of Siberian larch display a distinct cryoprotective action, manifesting itself in substantial supercooling and activity reduction heterogeneous nucleation centres.
При исследовании морозостойкости растений-интродуцентов важно
знать, какие механизмы устойчивости к низким зимним температурам реализуются у заведомо устойчивых экологически пластичных видов древесных растений.
*
Работа выполнена при финансовой поддержке Красноярского краевого фонда
науки. Грант 3F0172.
2
П. В. Миронов, С. Р. Лоскутов
Одним из существенных элементов морозостойкости может быть
глубокое переохлаждение внутриклеточной воды в зимующих жизненноважных органах и тканях древесных растений. Способность к переохлаждению при снижении температуры предотвращает кристаллизацию внутри
клеток и обеспечивает движущую силу миграции воды по незамерзающим
коммуникациям к зонам льдообразования, расположенным вне клеток или
целых тканей и органов.
Ранее нами было установлено значительное переохлаждение внутриклеточной воды меристематических тканей почек и клеток камбиальной
зоны лиственницы сибирской. При этом разность температур плавления и
кристаллизации превышала 25 оС [1, 2]. Доказано, что переохлаждение обусловлено свойствами водорастворимых веществ клеток, главным образом
белков цитоплазмы, которые накапливаются в период глубокого покоя растения. Их содержание достигает 22...24 % от сухой массы растворимых веществ клеток; растворимые вещества цитоплазмы составляют 50...55 % от
сухой массы меристематических тканей.
Цель данной работы – установить механизм переохлаждения на основе анализа кинетики нуклеации льда в растворах белков, выделенных из
почек лиственницы.
Кинетику кристаллизации воды
изучали методом низкотемпературной
дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) эмульсий. Эмульсионный метод основан на том, что при диспергировании воды (раствора), присутствующие в ней «посторонние» частицы,
могущие служить центрами кристаллизации, изолируются в отдельных каплях,
число которых обычно мало, поэтому
основная масса воды (раствора) в эмульсии может переохлаждаться до температуры спонтанного образования ядер льда
[5].
Эмульсионный метод применяли
также для изучения кристаллизации воды в присутствии суспендированных в
каплях эмульсии клеточных частиц (органеллы и их фрагменты), которые могут
играть роль центров гетерогенного ядрообразования.
Для получения образцов водорастворимого белка и низкомолекулярных веществ цитоплазмы из почек лиственницы выделяли меристематические
ткани, гомогенизировали с двадцати-
Исследование морозостойкости растений…
3
кратным объемом воды, гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при
22 000 g. Водный экстракт концентрировали с помощью ротационного вакуумного испарителя до содержания белка около 20 мг/мл, пропускали через
колонку с сефадексом G-50 и отбирали фракцию, содержащую белок в количестве до 90 % от массы сухих
веществ, затем вновь концентрировали до необходимых значений.
Доля белков в общей массе растворимых веществ цитоплазмы
меристематических тканей составляла примерно 20 % (см. схему).
Для приготовления эмуль- Рис. 1. Термограммы переохлажденных касий использовали вазелиновое пель в эмульсии: а – гомогенная нуклеация: 1 – вода; 2 – 2 %-й раствор белка; 3 –
масло с добавкой Tween-80 (1 %) в 15 %-й раствор глицерина в воде; 4 – 5 %-й
качестве стабилизатора; соотно- раствор белка; б – гетерогенная нуклеация:
шение масла и воды (раствора) по 1 – вода; 2 – суспензия клеточных фрагобъему составляло 10:1. Эмульсии ментов в чистой воде; 3 – суспензия клеводы и водных растворов получа- точных фрагментов в 2 %-м растворе
белка
ли с помощью гомогенизатора.
Размер капель определяли по их микрофотографиям. Скорость охлаждения
образцов в калориметре составляла 15 оС/ч.
Скорость гомогенной нуклеации льда в воде и водных растворах
определяли по пику тепловыделения, сопровождающему кристаллизацию
переохлажденной воды [4]:
J = – (v t)-1 ln(At + t/At),
(1)
где J – скорость гомогенной нуклеации, с-1 м-3;
v – средний объем капель воды или раствора, м3;
At – площадь под кривой, соответствующая еще не замерзшей воде в
момент времени t;
t – интервал времени, с (см. схему; здесь В - вода; ВМ - вазелиновое
масло; Т80 - Tween-80; РБ - раствор белка; РГ - раствор глицерина).
На рис. 1 приведены калориметрические кривые замерзания переохлажденной воды в каплях эмульсий воды и водных растворов, по которым
определяли скорость гомогенной нуклеации J (см. уравнение (1)).
В работе [6] показано, что J зависит от температуры:
J = Q exp(K ).
(2)
Здесь Q, K – константы кинетического уравнения;
– параметр переохлаждения,
2 -1
=[ 3
] ;
= T/Tm;
= (Tm – T)/Tm,
где Tm – температура плавления, К;
Т – температура нуклеации в момент времени t, К.
Из сравнения уравнений (1) и (2) следует, что основные параметры,
характеризующие процесс гомогенной нуклеации в водных системах (Q, K и
П. В. Миронов, С. Р. Лоскутов
4
работа образования устойчивого зародыша), могут быть рассчитаны по результатам их низкотемпературной сканирующей калориметрии.
На рис. 2 приведены кривые, отражающие зависимость температуры
плавления Тпл и гомогенной нуклеации Т h водных растворов от концентрации С, на рис. 3 показана связь логарифма скорости нуклеации J с параметром переохлаждения для воды и некоторых образцов. Эти зависимости
использованы для расчета констант Q и K, а также работы образования устойчивых зародышей льда (в единицах kT, где k – постоянная Больцмана).
Результаты расчета приведены в таблице.
Кинетические характеристики гомогенной нуклеации
воды и водных растворов
Образец
Вода
Растворимые вещества
Водораствормый белок
Глицерин
Концентрация, %
–
6
15
2
5
15
Q, м-3·с-1
3·1040
1·1038
7·1035
5·1038
5·1035
5·1037
К
–0,80
–0,80
–0,80
–0,80
–0,80
–0,80
G/kТ
57
53
45
52
47
52
Рис. 2. Зависимость температуры плавления (а) и гомогенной нуклеации (б) водных растворов от концентрации: 1 – водорастворимый белок цитоплазмы; 2 – растворимые вещества цитоплазмы; 3 –
низкомолекулярные растворимые вещества цитоплазмы
Как видно, замерзание капель воды и растворов указанных
концентраций характеризуется практически одинаковыми интервалами
скоростей зародышеобразования. Это обусловлено противоположным
действием двух факторов – снижением значений предэкспоненциального
множителя и показателей экспоненты.
Из рис. 2 следует, что растворимые вещества, особенно водорастворимые белки, оказывают существенное влияние на переохлаждение растворов. Это влияние выражается в значительном понижении температуры нуклеации, уменьшении предэкспоненциального множителя и работы образования устойчивого зародыша льда.
Исследование морозостойкости растений…
5
Из теории гомогенной нуклеации известно, что предэкспоненциальный множитель, равный частоте переходов
зародышей льда через критический размер,
включает в качестве сомножителя член, зависящий от энергии активации вязкого течения
или самодиффузии в расплаве [3]. Таким образом, уменьшение предэкспоненциального
множителя можно интерпретировать как увеличение энергии активации диффузии молекул
воды, а снижение работы образования зароРис. 3. Связь между логадышей G – как повышение вероятности обрарифмом скорости гомогензования новых центров кристаллизации при
ной нуклеации и параметром
переохлаждения: 1 – вода; пониженной температуре. Это соответствует, с
2 – водный раствор белка, одной стороны, образованию в переохлажденконцентрация 5 %; 3 – рас- ном растворе множественных центров критворимые вещества цито- сталлизации (устойчивых ядер льда), а с друплазмы, концентрация 15 %; гой – снижению скорости роста кристаллов.
4 – Раствор глицерина в воде, Следует отметить также, что рост микрокриконцентрация 15 %
сталлов льда ограничен областью гидратированного матрикса, который при данной температуре переходит в стеклообразное состояние.
Образование диспергированного микрокристаллического льда в
клетках происходит в интервале температуры –(35...60) оС, а плавление
–(40...20) оС.
В таблице приведены для сравнения кинетические характеристики
низкотемпературной кристаллизации в 15 %-м растворе глицерина, обладающего, как известно, криозащитным действием. Водорастворимый белок,
выделенный из меристематических тканей зимующих почек лиственницы,
обладает близкими свойствами, но при существенно меньших концентрациях раствора. Он оказывает также выраженное влияние на кристаллизацию
переохлажденной воды по гетерогенному механизму. Об этом свидетельствуют результаты калориметрии эмульсий, содержащих диспергированные
клеточные частицы (фрагменты клеточных стенок и органелл, органеллы).
Как видно из рис. 1, гетерогенная кристаллизация в растворе белка в присутствии клеточных частиц происходит при более низкой температуре, чем
в чистой воде.
Таким образом, водорастворимые белки цитоплазмы клеток меристематических тканей почек лиственницы обладают выраженным криозащитным действием. Оно проявляется в том, что белки способствуют переохлаждению воды, снижая активность центров гетерогенной нуклеации, а
при низких температурах способствуют формированию изолированных в
стеклообразном матриксе микрокристаллов льда, что снижает вероятность
повреждений в случае внутриклеточной кристаллизации.
6
П. В. Миронов, С. Р. Лоскутов
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1]. М и р о н о в П . В . , Л е в и н Э . Д . Переохлаждение и обезвоживание хвойных
зачатков в зимующих почках лиственницы сибирской//Физиология растений.1985.- Т. 32, вып. 5. - С. 695-701. [2] . М и р о н о в П . В . , Л о с к у т о в С . Р . , Л е в и н Э . Д . Образование и плавление льда в зимующих почках лиственницы сибирской//Тез. докл. Международн. симпозиума «Экологическая физиология хвойных».Абакан, 1991.- С. 18. [3]. M i c h e l m or e R . W . , F r a n k s F . Nucleation rates of ice in
undercoold water and aqueous solution of polyethylene glycol//Cryobiology.- 1982.- Vol.
19, N 2.- P. 163-171. [4]. R a s m u s s e n D . H . , L o p e r C . K . DSC: Rapid method for
isothermal nucleation rate measurement//Acta Metallurg. - 1976.- Vol. 24.- P. 117-123.
[5]. R a s m u s s e n D . H . , M a c K e n z i e A . P . Clastering in supercoold water//J. Chem.
Phys. - 1973.- Vol. 59, N 9.- P. 5003-5013. [6]. W o o d G . , W a l t o n A . G . Homogeneous nucleation kinetics of ice from water//J. Appl. Phys.- 1970.- Vol. 41, N 7.- P. 30273036.
________________________
Поступила 18 января 1995 г.