ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА СЕМЯН ЛЬНА

23
УДК 582.751.4:581.134
ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА СЕМЯН ЛЬНА
Поляков В.А., магистр, Левчук А.Н., аспирант, Лях В.А., д.б.н., профессор
Запорожский национальный университет
Исследовали фракционный состав белкового комплекса семян культурного льна и его
однолетних диких видов – L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum.
Методом последовательной экстракции установлено, что в семенах льна изученных видов
присутствуют все четыре фракции белкового комплекса. Соотношение фракций белков у
разных видов существенно различается. У L. grandiflorum значительно преобладают
фракции проламинов и глютелинов. Отмечено неравномерное распределение групп белков
с преобладанием глютелиновой фракции у культурного льна, в том время как у
L. hispanicum и L. аngustifolium
белки разных фракций представлены в равном
соотношении.
Ключевые слова: L. humile, L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum, семена,
запасной белок, фракционный состав
Поляков В.О., Левчук Г.М., Лях В.О. ВИВЧЕННЯ БІЛКОВОГО КОМПЛЕКСУ НАСІННЯ
ЛЬОНУ / Запорізький національний університет, Україна
Досліджували фракційний состав білкового комплексу насінин льону культурного та його
однорічних диких видів - L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum. Методом
послідовної екстракції було встановлено, що в насінні льону досліджених видів наявні всі
чотири фракції білкового комплексу. Співвідношення фракцій білків у різних видів суттєво
різниться. У L. grandiflorum значно переважають фракції проламінів та глютелінів.
Відмічено нерівномірний розподіл груп білків із переважанням глютелінової фракції в
культурного льону, у той час як у L. hispanicum та L. аngustifolium білки різних фракцій
представлені в рівному співвідношенні.
Ключові слова: L. humile, L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum, насіння,
запасний білок, фракційний склад.
Poliakov V.A., Levchuk A.N., Lyakh V.A. STUDY OF PROTEIN COMPLEX IN OIL FLAX
SEEDS / Zaporizhzhya National University, Ukraine
Fractional composition of seeds’ protein complex for cultivated oil flax and its annual wild species
L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum was investigated. It was established
using consecutive extraction method that, in seeds of examined flax species all four protein
complex fractions were present. The ratio between the fractions varied substantially for different
species. Linum grandiflorum had predominating prolamin and glutelin fractions. Glutelin fraction
is also predominant for cultivated oil flax, while L. hispanicum and L. аngustifolium had an equal
fraction ratio.
Key words: L. humile, L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum, seed, reserve
protein, fractional composition
ВВЕДЕНИЕ
Методы биохимического маркирования открывают принципиально новые возможности
в решении как теоретических, так и практических задач современной биологии. Для
роли маркеров больше подходят запасные белки семян. Они полиморфны и
одновременно обладают биологической специфичностью, поэтому непосредственно и
наиболее ярко отражают принадлежность организма к биологическому виду, и
используются как факторы идентификации не только отдельных генетических систем,
но и сортов, биотипов и видов растений [1].
Белковый комплекс у разных видов растений представлен различными фракциями –
группами близких белков, которые отличаются разными физико-химическими
свойствами компонентов. Одной из особенностей белков является их неодинаковая
растворимость в растворах солей, щелочей и органических соединений. На принципе
растворимости белков основана условная классификация простых белков растений на
альбумины, глобулины, проламины и глютелины. Определение состава и соотношения
белковых фракций является важным качественным показателем белкового комплекса
растений [1,2,3].
Вісник Запорізького національного університету
№ 2, 2011
24
Многочисленными биохимическими исследованиями установлено, что все виды
растений имеют характерный, свойственный только данному виду химический состав
семян. В семенах двудольных растений преобладают запасные белки, однако белковый
комплекс семян характеризуется большой гетерогенностью. Различные группы
растений отличаются неодинаковым накоплением отдельных белковых фракций.
Т.Б. Осборн доказал, что нет двух видов растений, которые содержали бы идентичные
белки в семенах [4], а изменения в соотношении белковых фракций являются
признаком, наиболее ярко выявляющим степень реакции культур, видов, сортов на
изменение внешней среды [5].
Различные группы белков различаются по аминокислотному составу и другим своим
свойствам – растворимости, устойчивости к действию протеолитических ферментов,
локализации. Так, белки групп проламинов и глютелинов являются неполноценными с
точки зрения аминокислотного состава. Они не содержат вовсе или содержат
незначительное количество незаменимых аминокислот. Вместе с тем, именно эти белки
в первую очередь используются молодым растением при прорастании и чем их больше,
тем больше шансов выжить у растений на ранних этапах онтогенеза. Альбумины и
глобулины являются более полноценными по аминокислотному составу. Однако
альбумины представляют собой растворимые цитоплазматические белки, поэтому их
количество непостоянно и не может служить каким либо систематическим признаком.
Глобулины же преимущественно связаны с мембраной, их количество и качество
постоянны, в силу этого они могут выступать как маркерные признаки [2, 5].
Исследования запасных белков семян льна позволили обнаружить полиморфизм их
биохимических характеристик [6,7]. Однако вопрос их использования для решения
задач генетики, эволюции, систематики, селекции и семеноводства льна остается
открытым.
Известно, что род Linum включает в себя более 200 видов, которые отличаются
большим разнообразием признаков [7,8]. При этом многие его виды характеризуются
морфологическим сходством. Поэтому для более четкой идентификации того или
иного вида льна прибегают к цитологическим, ботаническим и биохимическим
исследованиям. К сожалению, биохимические характеристики белкового комплекса
семян льна изучены недостаточно, что, на наш взгляд, сдерживает решение вопросов
частной генетики и эволюции культуры и ограничивает использование белковых
продуктов, полученных из семян льна в пищевой промышленности.
Целью данной работы было исследовать фракционный состав белкового комплекса
семян культурного льна и его однолетних диких видов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве материала использовали образцы однолетних видов льна L. humile Mill.
(n = 15) сорт Південна ніч, L. angustifolium Huds. (n = 15), L. bienne Mill. (n = 15),
L. grandiflorum Desf. (n = 15), и L. hispanicum Mill. (n = 15) из коллекции кафедры
садово-паркового хозяйства и генетики растений ЗНУ.
Фракционный состав белков семян по растворимости определяли по Т.Осборну [4] в
пятикратной повторности. Семена размалывали и из муки последовательно извлекали
водо-, соле-, спирто- и щелочерастворимые белки. Для выделения из семян альбуминов
использовали дистиллированную воду, для выделения глобулинов использовали 0,5 М
NaCl, для выделения проламинов – 70% этанол, для выделения глютелинов – 0,2 %
раствор NaOH. Из полученных экстрактов белки концентрировали путём осаждения
сульфатом аммония и растворяли в небольшом объёме раствора. Количество белка
определяли спектрофотометрически по методу Варбурга-Кристиана [9] на
Біологічні науки
25
спектрофотометре СФ-46. Математическую обработку
осуществляли согласно общепринятым методикам [10].
полученных
данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Семена льна отличаются высоким содержанием как жира, так и белка, в чём и состоит
их высокая ценность. Согласно данным, приведенным Б.П. Плешковым, в семенах льна
содержится 37% жиров (у масличного льна – до 50%), 26% белков, 22% углеводов, 8%
клетчатки и 4% золы. Однако, по мнению автора, содержание основных составных
частей семян подвержено значительным колебаниям. В частности, содержание белка
может варьировать от 15 до 34% [2]. По другим данным, содержание белка в сыром
материале сортов масличного льна варьировало в пределах от 22,2 % до 26,3 %, у Linum
grandiflorum оно составила 23,7 %, а у L. angustifolium – 27,3 % [7].
Что касается информации по фракционному составу белков льна, то она крайне
противоречива. Так, Б.П. Плешков и Ф.Ф. Боечко указывают, что в семенах льна
преобладающей фракцией являются глобулины. Они составляет не менее 40-50% от
общего количества белков [1,3]. А согласно исследованиям А.В. Барбашова, белковый
комплекс семян льна представлен водо-, соле- и щелочерастворимыми белками. При
этом преобладающим компонентом являются водорастворимые белки, а доля
щелочерастворимых белков составляет до 10% [6]. По данным R.H. Sammour, семена
льна содержат все четыре белковые фракции, однако количество альбуминов и
глобулинов является преобладающим [11].
Методом последовательной экстракции нами установлено, что в семенах льна
однолетних видов присутствуют все четыре фракции белкового комплекса. При этом
наблюдается достаточно сильная изменчивость их соотношения (табл. 1).
Таблица 1 – Фракционный состав запасных белков семян однолетних видов рода Linum.
Виды
Группы
белков
альбумины
глобулины
проламины
глютелины
Показатели
Linum
humile
Linum
Linum
angustifolium bienne
Linum
grandiflorum
Linum
hispanicum
1,98 ±
0,142*
1,78 ±
0,294
Количество,
мг/мл
0,92 ±
0,290
2,50 ±
0,600
1,10 ±
0,376
td
–
-2,37
-0,38
-3,28
-2,08
Количество,
мг/мл
1,48 ±
0,036
2,26 ±
0,374
1,22 ±
0,242
1,14±
0,154***
1,70 ±
0,326
td
–
-2,08
1,06
8,80
-0,67
Количество,
мг/мл
0,92 ±
0,146
3,00 ±
0,434*
3,04 ±
0,080***
4,74 ±
0,438**
1,62 ±
0,112*
td
–
-4,54
-12,73
-8,27
-3,80
Количество,
мг/мл
2,20 ±
0,258
2,56 ±
3,62 ±
0,278
2,92 ±
0,468
0,274*
2,00 ±
0,030
td
–
-0,95
-1,35
-3,77
0,77
Примечание. *, **, *** – отличия от L. humile существенны при Р < 0,05; 0,01 и 0,001
соответственно.
Вісник Запорізького національного університету
№ 2, 2011
26
Как видно из результатов таблицы, содержание запасного белка в семенах льна
находилось в пределах от 5,52 до 11,48 мг/мл в экстракте. При этом большим
количеством белка отличается вид Linum grandiflorum, за ним следуют виды L.
аngustifolium, L. bienne и L. hispanicum. Содержание белка у образца культурного льна
Linum humile ниже, чем у диких видов, что мы связываем с более высокой
масличностью.
Фракционный состав белкового комплекса семян пяти однолетних видов льна
определяли по растворимости его составных частей в различных средах. Так, в
зависимости от вида содержание водорастворимой фракции составляет от 13,4% до
25,0%. В солевой раствор экстрагируется от 10,0% до 26,9% глобулинов, в спиртовой –
от 16,6% до 41,3% проламинов, а в щелочной раствор – от 24,2% до 40,0% глютелинов
от общего количества извлекаемых белков (рис. 1).
Как видно из рисунка, соотношение групп белков семян льна у разных видов
различается. Наиболее отличается от других однолетних диких видов и культурного
льна вид Linum grandiflorum. У него значительно преобладают фракции проламинов и
глютелинов. Хотя считается, что проламины встречаются, главным образом, в семенах
злаков, а в других растениях их очень мало [2]. Некоторые исследователи указывают на
роль белков проламиновой фракции в адаптации растений и на связь повышенного
содержания проламинов с макроэкологическим распространением некоторых видов
[12].
16,5
13,4
24,2
24,5
35,2
40,0
14,7
26,9
21,9
29,4
16,6
а)
36,7
б)
28,1
25,0
в)
17,0
Альбумины
31,7
10,0
Глобулины
Проламины
22,9
24,0
г)
Глютелины
41,3
д)
Рис 1. Соотношение групп белков семян льна однолетних видов, %: a) L. humile;
б) L. angustifolium; в) L. bienne; г) L. hispanicum; д). L. grandiflorum
Следует отметить неравномерное распределение фракционных групп белков с
преобладанием глютелиновой фракции (40%) у культурного льна, в то время как у
Біологічні науки
27
L. hispanicum и L. аngustifolium все четыре фракции находятся в достаточно равном
соотношении.
Наблюдаемую изменчивость качественного состава белков у разных однолетних диких
видов льна можно связать с повышением устойчивости, в частности, к
протеолитическим ферментам [12]. На наш взгляд, присутствие проламиновой
фракции, которая является субстратом для протеолитических ферментов, повышает
адаптивный потенциал растений диких видов к неблагоприятным условиям
окружающей среды, начиная со стадии прорастания, и впоследствии оказывает
положительный эффект на рост и развитие растений. Дальнейшие исследования
фракционного состава запасных белков льна откроют возможности получения
детальных характеристик белкового состава семян для их использования в
биохимическом маркировании различных генотипов рода Linum.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что в семенах культурного льна L. humile и однолетних диких видов
L. angustifolium, L. bienne, L. grandiflorum, L. hispanicum присутствуют все четыре
фракции белкового состава.
2. Выявлено, что соотношение белковых фракций у L. hispanicum и L. аngustifolium
достаточно равномерное, а у L. bienne и L. grandiflorum преобладают проламиновая
и глютелиновая фракции.
3. Значительная изменчивость качественного состава запасных белков у разных
однолетних диких видов, очевидно, обусловлена широтой нормы реакции,
характерной для рода Linum.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений / Б. П. Плешков. – М.: Колос,
1968. – 183 с.
2.
Плешков Б. П. Биохимия сельскохозяйственных растений / Б. П. Плешков. – М.:
Колос, 1965. – 447 с.
3.
Боечко Ф. Ф. Биологическая химия / Ф. Ф. Боечко. – К.: Высшая школа, 1985. –
658 с.
4.
Thomas Burr Osborne. The proteins of wheat kernel / Thomas Burr Osborne. –
Карнеги, Вашингтон, 1907. – 192 с.
5.
Ресурсы биохимических признаков для селекции на качество урожая /
[Ермаков А. И., Смирнова-Иконникова М. И., Луковникова Г. А., Ярош Н. П.] //
Труды по прикладной ботанике, генетике, селекции – 1968. Т. XXXIX. – С. 56-63.
6.
Барбашов А. В. Групповой состав белкового комплекса семян льна современных
сортов / А. В. Барбашов, С. Ю. Ксандопуло. // Известия вузов. Пищевая
технология, 2005. - №4. – С. 71-72.
7.
Лях В. А. Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и
биотехнологические пути работы с ним: монография / В. А. Лях, А. И. Сорока. –
Запорожье: Запорожский национальный университет, 2008. – 182 с.
8.
Кутузова С. Н. Генетика льна / С. Н. Кутузова // Генетика культурных растений
(лен, картофель, морковь, зеленные культуры, гладиолус, яблоня, люцерна). Под
редакцией В. А. Драгавцева, Т. С. Фадеевой. – Санкт-Петербург: ВИР, 1998. –
С. 6-52.
9.
10.
Handbook of biochemist / [R. Doson, D. Elior, U. Eliot, K. Jons] – M. – 1991. – 464 p.
Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин – М.: Высшая школа, 1990. – 352 с.
Вісник Запорізького національного університету
№ 2, 2011
28
11.
Sammour R. H. Proteins of linseed (Linum usitatissimum L.), extraction and
characterization by electrophoresis / R. H. Sammour // Botanical Bulletin of Academia
Sinica, 1999. – Vol. 40. – Р. 121-126
12.
Прусаков А. Н. Об адаптивных типах проламинов / А. Н. Прусаков,
В. Ф. Семихов, А. С. Тимощенко // Проблемы интродукции растений и
отдаленной гибридизации. – М.: Главный ботанический сад, 1998. – С. 171-173.
УДК 582.751.42:581.4/8
БІОХІМІЧНІ ТА АНАТОМО-МОРФОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ
БУДОВИ ФОТОСИНТЕТИЧНОГО АПАРАТУ ХЛОРОФІЛЬНИХ
МУТАНТІВ ЛЬОНУ ОЛІЙНОГО
Полякова І.О., к.б.н., доцент, Яранцева В.В., студент,
Левчук Г.М., аспірант, Лях В.О., д.б.н., професор
Запорізький національний університет
Досліджено хлорофільні мутанти льону олійного, які вирізняються дефіцитом хлорофілу b.
Встановлено, що мутант М-81 типу xantha мав значно змінені за формою та зменшені за
розмірами хлоропласти, знижений рівень лектинової активності в порівнянні з вихідним
зразком. Мутант М-28 типу viridis характеризується значно збільшеною лектиновою
активністю в порівнянні з контролем та частково зменшеними за розмірами та незмінними
за формою хлоропластами. Припущено, що виявлені зміни морфології пластидного апарату
та підвищення рівня лектинової активності хлоропластів можуть виступати шляхами
оптимізації фотосинтетичного апарату рослин льону олійного.
Ключові слова: Linum humile Mill, хлорофільна недостатність, viridis, xantha, фотосинтетичні
пігменти, хлоропласти, морфологія, лектинова активність
Полякова И.А., Яранцева В.В., Левчук А.Н., Лях В.А. БИОХИМИЧЕСКИЕ И АНАТОМОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ
ОСОБЕННОСТИ
СТРОЕНИЯ
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО
АППАРАТА ХЛОРОФИЛЬНИХ МУТАНТОВ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО / Запорожский
национальный университет, Украина.
Исследованы хлорофильные мутанты льна масличного, отличающиеся дефицитом
хлорофилла b. Установлено, что мутант М-81 типа xantha имел значительные изменения по
форме и уменьшенные по размерам хлоропласты, пониженный уровень лектиновой
активности по сравнению с исходным образцом. Мутант М-28 типа viridis характеризуется
значительно увеличенной лектиновой активностью по сравнению с контролем и частично
уменьшенными по размерам и неизменными по форме хлоропластами. Предположено, что
обнаруженные изменения морфологии пластидного аппарата и уровня лектиновой
активности хлоропластов вероятно являются путями оптимизации фотосинтетического
аппарата растений льна масличного.
Ключевые слова: Linum humile Mill, хлорофильная недостаточность, viridis, xantha,
фотосинтетические пигменты, хлоропласты, морфология, лектиновая активность
Poliakova I.O., Yaranceva V.V., Levchuck A.M., Lyakh V.O. BIOCHEMICAL, ANATOMICAL
AND MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PHOTOSYNTHETIC APPARATUS IN OIL
FLAX CHLOROPHYLL MUTANTS / Zaporizhzhya national university, Ukraine.
We analyzed chlorophyll mutants of oil flax that show lack of chlorophyll b. We discovered that
M-81 mutant (xantha type) chloroplasts differed significantly in shape and were smaller. M-81
also had lowered level of lectin activity compared to initial sample. Mutant M-28 (viridis type)
was characterized by heightened level of lectin activity compared to control samples and
chloroplasts partially smaller and with unchanged shape. We suggest that these changes of plastid
apparatus morphology and heightened level of lectin activity can act as optimizing ways for the
photosynthetic apparatus of oil flax plants.
Key words: Linum humile Mill, chlorophyll insufficiency, "viridis", "xantha", photosynthetic pigments,
chloroplasts, morphology, lectin activity.
Біологічні науки