1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

1
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Сибирский федеральный университет»
Институт экономики, управления и природопользования
Укрупненная группа 020000 – естественные науки,
направление 020800.62 «Экология и природопользование»
«БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СОСТОЯНИЯ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ»
Учебное пособие по лабораторному практикуму
Красноярск
2008
2
Авторский коллектив:
Григорьев Ю.С., профессор кафедры экотоксикологии и микробиологии, к.б.н.
Пахарькова Н.В. доцент кафедры экотоксикологии и микробиологии,
к.б.н.
Прудникова С.В., доцент кафедры экотоксикологии и микробиологии,
к.б.н.
Крючкова О.Е., старший преподаватель кафедры биогеоценологии,
к.б.н.
3
В процессе изучения дисциплины «Биологический контроль состояния
окружающей среды» предусмотрены следующие лабораторные занятия:
№
№ раздела
п/п
дисциплины
1 Модуль 1.
Принципы организации
биологического мониторинга
2
3
4
Наименование лабораторных работ,
трудоемкость
Освоение методов работы на приборах для флуоресцентного анализа растений (2 часа)
«Фотон-10». Регистрация параметров быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла. Компьютеризированная обработка данных, построение графиков.
Изучение закономерностей изменения ОПЗФ (относительный показатель замедленной флуоресценции),
ЗФв (интенсивность замедленной флуоресценции на
свету высокой интенсивности), ЗФн (интенсивность
замедленной флуоресценции на свету низкой интенсивности) и др.
Влияние загрязнения атмосферного воздуха на показатели замедленной флуоресценции хвои сосны
обыкновенной (2 часа)
Определение параметров замедленной флуоресценции
хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей в районах с разным уровнем атмосферного
загрязнения.
Модуль 2.
Биоиндикация
окружающей
среды
Морфометрический анализ побегов сосны обыкновенной (2 часа)
Определение морфометрических показателей (линейный прирост побега, длина хвои, количество хвои на
единицу длины побега, процент хлорозов и некрозов)
побегов 1-6 годов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей в районах с разным уровнем
атмосферного загрязнения.
Лихеноиндикация качества атмосферного воздуха
(2 часа)
Определение видового состава и площади проектив-
4
ного покрытия лишайниковых сообществ из различных районов города с разной степенью загрязнения
воздуха. Изучение шкалы полеотолерантности. Особенности распространения кустистых, листоватых и
накипных лишайников.
5
6
Определение влияния атмосферного загрязнения на
жизненные циклы растений с использованием метода регистрации термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла (4
часа)
Регистрация термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла хвои и феллодермы побегов хвойных и лиственных деревьев из
районов с разным уровнем загрязнения воздуха, измеренных в зимнее время непосредственно после взятия
проб и после выведения из состояния покоя в лабораторных условиях.
Модуль 3.
Биотестирование окружающей среды
Биотестирование качества воды в водоеме с использованием ряски малой (2 часа)
Регистрация изменений интенсивности замедленной
флуоресценции хлорофилла ряски малой в пробах
природной воды и в ряде ее разбавлений дистиллированной водой с добавлением солей тяжелых металлов.
7
Биотестирование качества талого снега с использованием хлореллы (2 часа)
Сравнение степени прироста водоросли хлореллы в
талой воде и ряде ее разбавлений с величиной прироста в дистиллированной воде, используемой в качестве
контрольного образца.
8
Проведение токсикологических исследований на
дафниях (2 часа)
Регистрация изменений выживаемости и трофической
активности дафний под воздействием токсикантов.
5
Лабораторная работа № 1.
Освоение методов работы на приборах для флуоресцентного анализа растений (2 часа)
Фотосинтетический аппарат, имеющий огромную поверхность контакта
со средой, в первую очередь и в наибольшей степени подвергается неблагоприятным воздействиям загрязнения среды. К числу методов, способных давать оперативную информацию о физиологическом состоянии фотосинтетического аппарата, относится регистрация различных параметров флуоресценции хлорофилл содержащих растений. Преимущество флуоресцентных методов заключается в том, что информацию о содержании хлорофилла, организации фотосинтетического аппарата и его активности, можно получить за
очень короткий отрезок времени, как при контактном, так и бесконтактном
способах измерения, что очень важно для решения экологических проблем.
Фотосинтез зеленых растений очень чувствителен к различным изменениям факторов внешней среды. Сначала прошлого века его все чаще используют с помощью постоянно расширяющегося арсенала методов для определения реакции растений на стрессы, в особенности на загрязнение воздуха.
Фотосинтез – стабильное фундаментальное явление, поэтому, снижение
его интенсивности свидетельствует об ухудшении состояния растения. Флуоресценция выступает как инструмент исследования фотосинтеза.
Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно
отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических
мембранах клеток. Для понимания этой взаимосвязи достаточно напомнить,
что поглощение кванта света переводит молекулу хлорофилла в электронное
возбужденное состояние, энергия которого в растворе при отсутствии фотосинтеза переходит либо в тепло, либо в флуоресценцию. В фотосинтетической мембране энергия электронного возбуждения хлорофилла используется
в реакционных центрах (РЦ) для генерации потока электронов в первичных
стадиях фотосинтеза, необходимых для восстановления НАДФ и образования
АТФ. Первичные процессы фотосинтеза высших растений осуществляются
при участии двух фотосистем, функционирующих последовательно. Фотосистема 2 разлагает воду с выделением свободного кислорода и отдает электрон через цепь переносчиков на фотосистему 1, которая уже восстанавливает
НАДФ. В клетке в основном флуоресцирует хлорофилл, принадлежащий фотосистеме 2, и именно изменения его флуоресценции говорят о состоянии реакционных центров этой фотосистемы. При активном фотосинтезе, когда все
РЦ находятся в открытом рабочем состоянии, в условиях слабого освещения
почти вся поглощенная энергия света используется в процессе фотосинтеза.
Поэтому интенсивность флуоресценции хлорофилла в клетке намного ниже,
чем в растворе.
Однако и здесь небольшая часть энергии электронного возбуждения (не
более 3%) переходит в энергию света флуоресценции в виде так называемой
6
фоновой флуоресценции F0. Как правило, в нормальных условиях величина
F0 мала, что говорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. Но если при каких-либо воздействиях нарушается состояние
фотосинтетических мембран, то центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние, когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза. В этих условиях поглощенная энергия света уже
не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает. Можно полностью вывести из рабочего состояния РЦ, например, при действии ингибитора потока электронов диурона. В этом случае
флуоресценция сильно возрастает и приближается к своим максимальным
значениям Fт. Заметим, что закрыть центры можно создавая также избыточную освещенность клеток, когда происходит световое насыщение фотосинтеза. Фотосинтетическая цепь переноса электрона как бы захлебывается от избытка поглощенной световой энергии, переводя все большую часть поглощенной энергии света в флуоресценцию.
Можно найти разницу между интенсивностями флуоресценции хлорофилла при закрытых и открытых РЦ (Fv = Fт - F0), которую называют переменной флуоресценцией (Fv) хлорофилла в клетках. Как видно, величина Fv
соответствует той части энергии света, которая используется открытыми реакционными центрами в фотосинтезе, то есть может характеризовать активность начальных стадий фотосинтеза. На практике оценивают отношение
Fv./Fт, величина которого тесно связана с первичной продуктивностью фитопланктона в природных водоемах. Она хорошо коррелирует с фотосинтетической продукцией клеток, определенной классическими методами по восстановлению СО2 с помощью радиоактивных изотопов 14С.
Удобным и перспективным биофизическим методом, несущим информацию о функционировании первичных реакций фотосинтеза является метод
регистрации замедленной флуоресценции.
Явление замедленной флуоресценции наблюдается у всех видов фотосинтезирующих растений. Замедленная флуоресценция возникает при излучательной дезактивации первого синглетного возбужденного состояния хлорофилла и обусловлена вторичным возбуждением хлорофилла, а при обратных реакциях образования на свету фотопродуктов, в результате рекомбинации зарядов первичного акцептора электронов и хлорофилла реакционного
центра фотосистемы 2.
Замедленная флуоресценция зеленых растений возникает в основном в
реакционном центре фотосистемы 2, однако, чрезвычайно слабая замедленная
флуоресценция может наблюдаться в фотосистеме 1.
Интенсивность замедленной флуоресценции пропорциональна скорости
реакции зарядов в реакционном центре фотосистемы 2, пропорционально
концентрации центров с разделенными зарядами.
Концентрация последних зависит от скорости последующих стадий переносов электронов. Именно этим объясняется зависимость интенсивности и
7
других параметров замедленной флуоресценции от изменения скорости электронного транспорта в хлоропластах при изменении внешних условий.
Флуориметр для биологического контроля загрязнения окружающей
среды «Фотон 10» предназначен для регистрации у различных растительных
объектов (хлоропласты, водоросли, хвоя и листья растений, лишайники) нескольких параметров быстрой (БФ) и замедленной (ЗФ) флуоресценции хлорофилла. Все измерения выполняются в автоматическом режиме с выводом
получаемой информации на управляющий компьютер. Прибор разработан на
кафедре экотоксикологии и микробиологии Сибирского федерального университета под руководством профессора Ю.С. Григорьева.
Технические характеристики флуориметра «Фотон 10»
Наименование
Характеристика
Длина волны света, возбуждающего ЗФ, нм
64020
Длина волны света, возбуждающего БФ, нм
48020
Нижний предел спектрального диапазона регистрации
690
БФ и ЗФ, нм
Верхний предел спектрального диапазона регистрации
750
БФ и ЗФ, нм
Максимальная интенсивность возбуждающего ЗФ, Вт/м2
300
2
Максимальная интенсивность возбуждающего БФ, Вт/м
5
Диапазон изменения интенсивности БФ и ЗФ, относи0-4095
тельные единицы
Диапазон изменения интенсивности света, возбуждаю0-100
щего ЗФ, %
Диапазон изменения интенсивности света, возбуждаю0-100
щего БФ, %
Диапазон изменения длительности импульсов света,
0-50
возбуждающего ЗФ, миллисекунд
Диапазон изменения длительности темновых промежут0-200
ков между импульсами возбуждающего света, в которые
регистрируются БФ и ЗФ, миллисекунд
Воспроизводимость измерения интенсивности БФ и ЗФ,
20
%, не более
Отклонение от линейности показаний интенсивности БФ
±10
и ЗФ, %, не более
Пределы регулировки тракта усиления, раз
1-64
Количество кювет в приборе, шт
20
Объем/диаметр анализируемой пробы, мл/мм
4/25
Потребляемая мощность, Вт, не более
50
Напряжение питания, В
220В22
Габаритные размеры, мм, не более
415 365  150
Масса, кг, не более
7,5
8
Флуориметр Фотон 10 выполнен в двойном металлическом корпусе.
Наружная часть корпуса состоит из двух П-образных крышек: верхняя и
нижняя. К нижней крышке крепится внутренний светогерметичный корпус
прибора со все элементами конструкции. На задней стенке установлены: автоматический выключатель питания, сетевой кабель питания с заземляющей
вилкой, разъемы для подключения компьютера и осцилографа. На передней
стенки расположено загрузочное окно с внутренней и внешней крышками.
Внутри прибора установлены: кассета для кювет с датчиками положения,
двигатель вращения кассеты, оптический блок. Оптический блок содержит
источники возбуждающего света и фотоэлектронный умножитель (ФЭУ).
Электронный блок прибора включает: сетевой источник питания, высоковольтный источник питания ФЭУ, масштабирующий усилитель фототока,
аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор.
В основу работы прибора положен принцип измерения послесвечения
хлорофиллсодержащего растительного объекта, в промежутках между импульсами возбуждающего света.
По своей природе послесвечение является фотохемилюминесценцией
хлорофилла, которое благодаря идентичности спектру излучения быстрой
флуоресценции (фотолюминесценции), получило название замедленной
флуоресценции.
В приборе импульсы красного света миллисекундной длительности и
интенсивности, способной запустить процесс фотосинтеза, подаются от двенадцати ярких светодиодов. Они возбуждают ЗФ, которая регистрируется в
виде кривых затухания в миллисекундные темновые промежутки. Время световых импульсов и промежутков между ними устанавливаются оператором
перед началом работы. Быстрая флуоресценция, возбуждается от трех низкоинтенсивных светодиодов синего света, которые включается в каждый второй
темновой промежуток между импульсами красного света. Значение БФ вычисляется путем попарного вычитания из величины интенсивности свечения
на момент подачи импульса синего света, величины свечения (ЗФ), регистрируемой в предыдущий темновой интервал. Для предотвращения «ослепления» фотоумножителя в период подачи каждого импульса красного света перед ним установлен красный светофильтр (КС19), который практически полностью пропускает область излучения ЗФ, но значительно препятствует прохождение более коротковолнового возбуждающего света. Для исключения
перегрузки усилитель фототока, на момент подачи импульсов возбуждения,
полностью «запирается».
Перед началом работы в приборе размещаются кюветы с образцами, устанавливается режим измерения БФ и ЗФ и загружается программный модуль
управления прибором. После этого производится его запуск. Измерение свечения образцов во всех кюветах выполняется в автоматическом режиме.
Включив двигатель вращения кассеты с кюветами, прибор, ориентируясь на
показания датчиков ее положения, находит т.н. «нулевую» кювету, а затем
9
поочередно выполняет замеры свечения всех других загруженных кювет.
Снятые данные от очередной кюветы сразу передаются на управляющий
компьютер и после обработки высвечиваются на экране. Для устранения
влияния свечения самой кюветы из значений сигналов кювет с образцами вычитается сигнал, регистрируемый от «нулевой» кюветы. При работе с суспензиями водорослей или хлоропластов в эту кювету заливается такой же объем
среды, а в случае анализа «сухих» образцов, она оставляется пустой.
При регистрации «ОПЗФ» (относительный показатель замедленной
флуоресценции) измерение свечения каждой кюветы проводится для двух заранее установленных световых и временных режимов, условно обозначенные
как «режим высокого света» и «режим низкого света». В «режиме высокого
света» в ЗФ доминируют т.н. быстрые компоненты затухания, величина которых снижается при токсическом воздействии на растительный организм (фотосинтез). В «режиме низкого света» свечения в основном представлено медленными компонентами затухания ЗФ, значения которые при подавлении фотосинтетической активности тест-организма возрастают. В результате отношение этих двух показателей ЗФ снижается в десятки раз при токсическом
воздействии на растительный тест-организм.
Оба световых режима можно задать как изменением интенсивности
возбуждающего ЗФ света, так и соотношением световых и темновых периодов возбуждения и регистрации свечения. В приборе Фотон 10 выбран второй
из этих вариантов. Для этого «режим высокого света» достигается тем, что
длительность световых импульсов в несколько раз превышает темновые интервалы, в которые регистрируется ЗФ. И наоборот «режим низкого света»
создается путем подачи коротких импульсов возбуждающего света чередующиеся относительно «длительными» темновыми периодами.
В обоих световых режимах флуоресценция образцов регистрируется в
виде заданного по времени массива точек для каждой кривой затухания. В
связи с большим объемом получаемой информации, характер затухания свечения представляется в виде усредненных точек – из снятых массивов для
каждой кривой. При этом в «режиме высокого света» уровень свечения отображается начальными точками кривых затухания, а на «в режиме низкого» конечными.
Регистрация быстрой (вариабельной) флуоресценции производится
только в «режиме высокого света». Для этого в каждый второй темновой
промежуток подается слабый импульс синего возбуждающего света. Для
снижения актиничности этого света он включается только во второй половине темнового периода регистрации свечения. Значение интенсивности БФ
вычисляется в виде разницы сигналов флуоресценции, регистрируемых в каждой паре соседних темновых интервалов.
Процесс измерения свечений на каждом свету включает две серии рабочих циклов: серия №1 – включен только измерительный свет (4 рабочих
цикла) и серия №2 – включены оба источника света (50 рабочих циклов). По-
10
сле установки очередной кюветы сначала следуют серии замеров на «высоком» свету, затем, через 1 секунду, - на «низком» и производится перевод кюветы. Возможно проводить измерения свечения каждой кюветы многократно
при работе в режиме нескольких «кругов» вращения кассеты с кюветами.
При регистрации показателя «Индукция» измерение интенсивности БФ
и ЗФ проводятся только в режиме высокого света. При этом процесс измерения включает три серии рабочих циклов: серия №1 – включен только измерительный свет, серия №2 – включены оба источника света и серия №3 – включен измерительный свет и по запросу действующий свет. Количество рабочих
циклов в каждой серии устанавливается оператором. Поскольку запись всей
индукционной кривой флуоресценции растительного образца может занять
сравнительно большой отрезок времени (3-5 минут), то потребуется снять и
обработать данные нескольких тысяч рабочих циклов. Для этого надо существенной увеличить аппаратные и вычислительные возможности прибора, о
также иметь значительные объемы для хранения снятой информации. Вместе
с тем, эта информация может быть избыточной, поскольку большую часть
индукционной кривой флуоресценции занимает ее медленно изменяющая
часть. Для ее регистрации достаточно регулярно снимать не все рабочие циклы, а только часть, делая пропуски между ними. Такое «прореживание» позволяет иметь практически полную информацию о характере индукционных
изменений флуоресценции и при этом не усложнять системы ее регистрации.
Число «пропусков» при измерении ЗФ И БФ, которые не влияют на число самих рабочих циклов, устанавливается перед началом записи индукции, руководствуясь прежде всего величиной ее предполагаемой длительности. Чем
медленнее этот процесс, тем большее прореживание следует установить. Количество рабочих циклов в каждой серии устанавливается исходя требуемой
детализации нулевой, быстрой и медленной фаз индукции.
Снятые данные и параметры их замера могут быть сохранены в виде
отдельных файлов на управляющем компьютере. При необходимости они могут быть загружены и просмотрены программой Foton или Microsoft Excel.
После запуска программы Foton-10 на экран компьютера выводится
главное окно, предназначенное для управления прибором. В нем находятся
все элементы управления прибором и получаемыми данными. Назначения отдельных элементов управления разъясняют далее по тексту.
Главное окно программы состоит из двух частей. Левая – визуальное
отображение получаемых данных, правая – панель управления с закладками
выбора необходимого режима работы. В данной версии программы закладок
три – «ОПЗФ», «Быстрые настройки» и «Индукция».
Закладка «ОПЗФ» на панели управления (рис. 1.1) предназначена для
измерения относительного показателя замедленной флуоресценции. Назначение расположенных на ней элементов управления:
− кнопки «-- 0 --» и «-- +1 --» для установки в кассету кювет с исследуемыми образцами и извлечения после проведения измерения;
11
− кнопки «Старт» и «Стоп» для запуска и принудительной остановки
цикла автоматического измерения;
− кнопка «Таблица» для просмотра и сохранения результатов, полученных в процессе измерения, в виде общей таблицы по всем кругам и кюветам;
кнопки «Загрузить» и «Сохранить» для сохранения результатов измерения в отдельный файл на диске или загрузки в программу сохраненного ранее. Троеточие на кнопке обозначает, что будет вызвано дополнительное окно, в котором необходимо указать папку и имя файла с результатами замера.
Это окно стандартное для операционной системы «Windows» и работа с ним
объяснений не требует. Перед сохранением данных можно добавить комментарий в окно над кнопками. Он также будет сохранен вместе с результатами;
− элементы управления в группе «Выбор» для изменения номера кюветы с образцом в процессе просмотра результатов измерения. Данные по выбранной кювете выводятся в виде графиков в левой части главного окна и в
таблице группы «Текущий замер».
Рис. 1.1. Закладка «ОПЗФ» панели управления
Во время проведения измерения и последующего просмотра в левой
части главного окна на двух графиках выводятся данные текущего замера или
выбранной в режиме просмотра данных кюветы:
− на верхнем графике две отдельные кривые затухания ЗФ (светлосерая) и ЗФ+БФ (светло-зеленая), регистрируемых в режиме высокого света, а
12
также индукционные изменения усредненных точек начального (красная) и
конечного (зеленая) участков кривой затухания ЗФ и ЗФ+БФ (синяя) для каждой измеряемой кюветы с образцом или без него («нулевая» кювета) для обеих серий рабочих циклов;
− на нижнем – кривая затухания ЗФ регистрируемой в режиме низкого
света (светло-серая), и индукционные изменения медленной компоненты затухания свечения (красная) для каждой измеряемой кюветы с образцом или
без него («нулевая» кювета), представленные в виде усредненных конечных
точек каждой снятой кривой затухания для обеих серий рабочих циклов. Данные представляются в исходном виде без вычета значений для «нулевой» кюветы.
В таблице для каждой измеренной кюветы выставляются значения
основных параметров обоих видов флуоресценции за вычетом аналогичных
показателей для «нулевой» кюветы. Причем в таблице показаны значения выбранной кюветы и т.н. «нулевой», или опорной кюветы текущего круга измерения. Список сокращений, используемых в колонке «показатели» таблицы
текущего замера:
− Фо – флуоресценция нулевая. Интенсивность быстрой флуоресценции, возбуждаемой измерительным светом для рабочих циклов серии №1 в
режиме «высокий свет»;
− Фм - флуоресценция максимальная. Интенсивность быстрой флуоресценции, возбуждаемой измерительным светом для рабочих циклов серии №2
в режиме «высокий свет»;
− Фпер – величина переменной (вариабельной) флуоресценции, возбуждаемой измерительным светом;
− ЗФв – усредненное значение интенсивности замедленной флуоресценции, регистрируемой в режиме высокого возбуждающего свет;
− ЗФн – усредненное значение интенсивности замедленной флуоресценции, регистрируемой в режиме низкого возбуждающего свет;
В/Н – отношение ЗФв/ЗФн.
Закладка «быстрые настройки» на панели управления (рис. 1.2) предназначена для оперативной или полной настройки режима проведения измерения. До начала измерения в этом режиме устанавливаются основные параметры для измерения интенсивности свечения на «высоком» и «низком» свету. Это:
− напряжение питания («чувствительность») фотоприемника (ФЭУ) в
условных единицах (регулируется только при выбранном режиме «Другая»);
− величина усиления фототока с ФЭУ в относительных единицах с шагом, кратным 2;
− интенсивность измерительного света в % (только в режиме «высокий
свет»);
− длительность импульсов действующего света в режиме низкого света,
мсек;
13
Рис. 1.2. Закладка «Быстрые настройки» панели управления
− количество кругов (повторов) измерения загруженных кювет в кассету прибора;
− сохранение и удаление выбранных условий измерения;
− переход в режим расширенных настроек прибора кнопкой «Больше >» (рис. 1.3).
В окне расширенных настроек устанавливаются:
− три уровня чувствительности ФЭУ: «высокая» (максимальная, устанавливается изготовителем), «низкая» (минимальная, устанавливается изготовителем) и «другая» (регулируется пользователем), в относительных единицах (шкала не линейна уровню фототока);
− коэффициент усиления фототока, кратный 2 (1-64 раза);
− интенсивность действующего света в относительных единицах (04095);
− интенсивность измерительного света относительных единицах (04095) (только в режиме «высокий свет»);
− длительность импульсов действующего высокого света, (0,5 - 50
мсек);
− длительность импульсов действующего низкого света, (0,25 - 25
мсек);
14
− время регистрации ЗФ в режиме высокого света (длительность темновых периодов между импульсами действующего света), (1,5 – 20 мсек, см.
ниже);
− время регистрации ЗФ на режиме низкого света (длительность темновых периодов между импульсами действующего света), (1 – 200 мсек, см. ниже)
− время замера ЗФв (от начало каждой кривой затухания в режиме высокого света, пределы варьирования зависят от выбранной длительности всего темнового периода);
− время подачи измерительного света и замера БФ (от конца каждой
второй кривой затухания в режиме высокого света, пределы варьирования зависят от выбранной длительности всего темнового периода);
− время замера ЗФн (от конца каждой кривой затухания в режиме низкого света, пределы варьирования зависят от выбранной длительности всего
темнового периода);
− число кругов (повторностей) измерения свечения всех кювет, установленных в кассете флуориметра;
− внизу - визуализация соотношения длительностей регистрации ЗФ и
БФ в темновой период между импульсами высокого света (верхняя цветная
полоса) и ЗФ на низком свету (нижняя цветная полоса).
Рис. 1.3. Окно расширенных настроек флуориметра Фотон-10
Управляющие
элементы
окна
расширенных
настроек
синхронизированы с закладкой «Быстрые настройки» и изменения в любом
из них равнозначны.
15
Закладка «индукция» на панели управления (рис. 1.4) предназначена
для измерения кинетики изменения интенсивности быстрой и замедленной
флуоресценции растений после включения возбуждающего (действующего)
света. Индукционные изменения флуоресценции, впервые обнаруженные Каутским (1931 г.) и впоследствии названные эффектом Каутского, отражают
характер перехода фотосинтеза растений от неактивного состояния в темноте
к активному на свету.
Рис. 1.4. Закладка «Индукция» панели управления с открытым окном
дополнительных настроек
Этот переход представлен быстрой фазой – выход интенсивности флуоресценции на максимальный уровень через промежуточный «нулевой» уровень и последующий значительно более медленной фазой - спад до стационарного уровня. Быстрая фаза БФ, называемая вариабельной флуоресценцией, обусловлена процессом перехода первичных акцепторов фотосистемы 2
от окисленного состояния в темноте (уровень Фо) до восстановленного в первые несколько секунд после включения яркого света (Фм). Медленный световой переход от максимального до стационарного уровня вызван с одной стороны окислением пула первичных акцепторов за счет постепенного запуска
самого процесса фотосинтеза (его темновых реакций), а с другой структурными изменениями мембран хлоропластов, приводящими к снижению квантового выхода флуоресценции хлорофилла фотосистемы 2.
16
Для замедленной флуоресценции индукционная кривая является отражением динамики изменения электрохимического градиента протонов на
мембране тилакоидов.
Назначение расположенных на ней элементов управления не отличается
от аналогичных на закладке «ОПЗФ», по этому отдельно они не рассматриваются. Добавлены следующие управляющие элементы:
− кнопка «Настройки …» для установки дополнительных параметров
измерения;
− кнопка «Данные» для вывода общей таблицы с необработанными
данными, полученными в результате замера и её сохранения в текстовом
представлении.
Цель работы – освоение методов работы на приборах для
флуоресцентного анализа растений на примере флуориметра «Фотон 10».
Оборудование, материалы и реактивы:
Флуориметр «Фотон 10», исследуемые образцы для анализа.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. При первом включении прибора необходимо подключить его кабелем-адаптером к USB порту компьютера.
Включите компьютер в сеть. После загрузки Windows запустите управляющую программу Foton-10. На экране монитора появится главное окно
программы.
2. Загрузите кюветы с исследуемыми образцами в прибор.
Нажмите мышкой кнопку «-- 0 --». Кассета придет в движение и остановится, когда напротив загрузочного окна станет кювета 0 (отмечена белой
точкой на диске кассеты). Затем последовательно нажимая кнопку и
«-- +1 --», установить все остальные кюветы.
3. Установите параметры замера.
Выбор параметров замера зависит от задачи исследования, вида растительного материала и его количества. При этом необходимо руководствоваться следующим:
− чувствительность прибора должна быть такой, чтобы для всех загруженных кювет регистрируемые величины показателей свечения не «зашкаливали», т.е укладывались с некоторым запасом в пределы всех графиков на экране монитора;
− чувствительность также не должна быть слишком низкой, что не
обеспечит надежную регистрацию уровней свечений.
4. Установив необходимые параметры замера (их можно также загрузить из файла), нажать на кнопку «СТАРТ». Кассета сначала установит в оптический блок прибора кювету «0», а затем последовательно все остальные
17
кюветы. На экране монитора будут отображаться номер кюветы и круга и
значения регистрируемых показателей.
5. Если для каких-либо кюветы величины показателей не будут соответствовать требованиям, необходимо прервать процесс измерения нажатием
кнопки «СТОП». При этом замер прекратится после завершения выполнения
замера текущей кюветы. Откорректировав параметры замера надо снова запустить замер нажатием кнопки «СТАРТ».
6. Сохраните результаты измерения.
После завершения процедуры замера необходимо сохранить полученные данные. Данные каждого замера сохраняются в виде отдельного файла
кнопкой «Сохранить». В качестве расширения имени файла по умолчанию
используется «.data». Для просмотра программой Foton-10 ранее сохраненные файлы надо «Загрузить».
Подпрограммой «Индукция» предусмотрено сохранения в текстовом
формате всех снятых данных через кнопку «Данные» и расчетных величин
параметров, как они представлены для каждой кюветы в таблице на экране,
кнопкой «Таблица».
Подпрограмма «ОПЗФ» аналогичным образом сохраняет исходные
(кнопка «Сохранить») и расчетные текстовые данные (кнопка «Таблица»).
Сохранения снятых данных невозможно после подачи команды
«СТАРТ», поскольку происходит автоматическая очистка памяти для приема
новых данных.
Вопросы:
Что такое Фо, Фм, Фпер, ЗФв, ЗФн?
Почему характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток?
Список литературы:
Веселовский В. А., Веселова Т. В. Люминесценция растений: Теоретические и практические аспекты. – М.: Наука, 1990. – 200с.
Гаевский Н. А. Моргун В. Н. Использование переменной и замедленной
флуоресценции хлорофилла для изучения фотосинтеза растений / Физиология
растений.- 1993.-Т.40.- С. 136-145.
Григорьев Ю.С., Фуряев Е.А., Андреев А.А. Способ определения содержания фитотоксических веществ. Патент № 2069851. Бюлл. изобр., №33
от 27.11.96.
Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла:
Учеб. пособие. / Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С., Попельницкий
В.А., Гехман А.В. – Красноярск; изд. КГУ, 1984. – 82 с.
18
Лабораторная работа № 2.
Влияние загрязнения атмосферного воздуха на показатели замедленной флуоресценции хвои сосны обыкновенной (2 часа)
Вокруг крупных промышленных районов среди функциональных нарушений растений часто упоминают резкое подавление деятельности ферментных систем, интенсивности фотосинтеза, повышения транспирации,
усыхание и опадание листьев, повреждение почек и т.д. подобные изменения
могут привести к гибели отдельных растений или исчезновение вида из загрязненного района. Испытания показали, что лиственные породы более устойчивы к загрязнению воздуха, чем хвойные, пылеулавливающая способность их выше.
Токсичные поллютанты оказывают разрушающее воздействие на фотосинтетический аппарат и деятельность устьиц, что является главной причиной ингибирования процесса СО2 – газообмена. В то же время деятельность
воздушных загрязнителей приводит к деструкции корневой системы и существенным изменениям в структуре проводящей ксилемы, вследствие чего
возникают нарушения в водном обмене деревьев. Усиливающийся водный
стресс является дополнительной причиной значительного снижения фотосинтеза.
В районах, в которых в течение нескольких лет происходит выброс SO2
и HF, у деревьев поражает листья и изменяет режим роста. Эти фенотипические изменения приводят, в основном, к снижению нормальной скорости роста, вызывают деформацию ствола, веток и кроны деревьев. Первыми изменениями реакции растения на загрязненную среду является снижение морозоустойчивости деревьев, характеризуется краевым поражением. Наблюдается
усиление повреждения хвойных зимой.
Изменение фотосинтетического аппарата под действием атмосферных
загрязнений определяется высокой реакционной способностью ХБК и переносчиков электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) и стабильностью мембранных
структур хлоропластов. Наблюдаемое при этом подавление фотосинтеза сопровождается трансформацией биохимических процессов и пигментного аппарата.
Загрязнение воздуха снижает содержание хлорофилла как в ССК, так и
в комплексах ФС1 и ФС2, приводит к возрастанию внешнего максимума отношения хлорофилла a/b, что свидетельствует о большой чувствительности
пораженной хвои к влиянию зимнего стресса. Загрязнение воздуха помимо
непосредственного повреждения фотосинтетического аппарата может влиять
на эффективность адаптации его к низким температурам в период покоя и
снижает его устойчивость к повреждениям в зимний период.
Хвойные относительно устойчивы в раннем периоде роста и становятся
очень чувствительными при пике роста древесины, при чем эта чувствительность сохраняется до ранней стадии зрелости.
19
Атмосферное загрязнение как фактор стресса в окружающей среде связано со многими другими факторами стресса. Загрязняющие вещества снижают устойчивость растений к морозу, зимним условиям, засухе. Фториды
обычно вызывают краевые некрозы листьев или некрозы кончиков игл хвойных.
Ассимиляционные органы растений первыми и в наивысшей степени
повреждаются токсическими веществами, содержащимися в воздухе промышленных районов и крупных городов. Это вызвано тем, что листья по своему строению функциональной роли приспособлены к более интенсивному
газообмену по с равнению с другими органами растения. Появление внешне
различимых признаков повреждения растения газами или аэрозолями свидетельствует о происшедших в организме глубоких, как правило, необратимых
изменениях, заканчивающихся разрушением пигментов, клеточных и субклеточных структур.
Растения делят по степени противодействия организма повреждающему
агенту на устойчивые, среднеустойчивые и нестойкие или по степени поражения – на нечувствительные, среднечувствительные и очень чувствительные.
При рассмотрении растений с точки зрения концентрации загрязненных
веществ в атмосфере, было отмечено, что растения более устойчивы зимой,
чем в вегетационный период. Первыми изменениями реакции растений на окружающую среду является снижение морозоустойчивости растений, характеризуется краевым поражением. Наблюдается усиление повреждения хвойных
зимой. Под действием загрязненного воздуха меняется состав сахаров в иглах.
Аккумуляция загрязняющих веществ на зеленую поверхность зимой
вызывает ее разрушение. Быстрее всего этот процесс протекает в январе и
феврале. Зимой хвойные обычно толерантны к более низким температурам,
чем те, которые имеют место в действительности, а зимние повреждения могут быть связаны с зимней засухой или токсичными свойствами аккумулированных загрязняющих веществ, влияющих на мембраны фотосинтетического
аппарата.
Вредное влияние загрязненного воздуха на растения происходит как
путем прямого действия газов на ассимиляционный аппарат, так и в результате косвенного влияния через почву. Причем прямое действие кислых газов
приводит к отмиранию отдельных органов растений, ухудшение их роста и
продуктивности. Трудно дать полную характеристику всех вредных поллютантов, так как их количество и удельный вес в загрязненном воздухе быстро
изменяются. В результате взаимодействия веществ образуются новые соединения, нередко даже более токсичные, чем исходные компоненты.
При воздействии различных доз токсикантов на растения можно выделить четыре типа повреждений, отличающихся по характеру и глубине расстройства метаболизма: острая, капельно-ожоговая, кумулятивное и скрытое.
20
Острые повреждения вызываются воздействием высоких концентраций поллютантов. Поражение развивается в течение нескольких часов (дней) и проявляются в виде хлороза с последующей некротизацией тканей. Кислый газ,
поступая в клетку через устьица или кутикулу, в значительных количествах
накапливается в хлоропластах и приводит к подавлению фотосинтеза.
Капельно-ожоговые в отличие от острого поражения, охватывающего
всю хвоинку и возникающего по всей кроне или большей ее части, проявляется в виде некрозных точек и более крупных пятен, перепоясывающих хвоинки и постепенно расширяющихся, и чаще всего образуется при высокой
влажности воздуха.
Кумулятивное повреждение развивается при длительном действии низких концентраций токсикантов. Для этого типа повреждений характерно
стойкое нарушение основных метаболических процессов, внешне выражающееся в уменьшении размеров и массы хвои, преждевременном их опадании,
изреженности крон деревьев, депрессии роста, ранним старением. Кумулятивное повреждение со временем приводит к избыточному накоплению токсикантов ассимиляционных органах и проявлению некрозов. Выше перечисленные типы повреждений определяются визуально или с помощью морфологического анализа.
Скрытые повреждения вызываются очень низкими концентрациями
токсикантов, действующими постоянно или переодически. К таким повреждениям относятся нарушения физиолого-биохимических процессов (увеличение проницаемости мембран, изменение активности ряда ферментов, ингибирование фотосинтеза и так далее) накопление скрытых повреждений приводит к снижению роста и продуктивности растений, потере резистентности к
климатическим факторам, патогенным микроорганизмам и насекомым.
Именно на стадии скрытых повреждений необходимо наладить контроль за
состоянием растений, подверженных к действию промышленного загрязнения воздуха, что может быть достигнуто с помощью методов флуоресцентного анализа.
Повышенная чувствительность хвойных связана с длительными сроками жизни хвои и поглощения газа, слабым развитием запасающих тканей и,
соответственно, недостаточными накоплениями резервных веществ, не высокой регенеративной способностью. Тем не менее, разные виды хвойных обладают различными биоиндикационными возможностями. Одна из наиболее
важных характеристик – сезонный ритм ростовых процессов, в частности
сроки начала и конца вегетации. Деревья и кустарники, рано начинающие и
рано заканчивающие вегетационный цикл особенно сильно повреждаются в
условиях загрязнения. Виды, начинающие вегетировать в более поздние сроки и поздно заканчивающие вегетацию, наиболее устойчивы к загрязнению.
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) – одна из важнейших лесообразующих пород, занимающая по численности треть хвойных. Своеобразие
21
климата Сибири предполагает высокую адаптацию к температурным условиям.
Одним из преимуществ данного объекта исследования является возможность использования его в течении всего года. Сосна сохраняет фотосинтетическую активность при низких температурах, квантовый выход не меняется.
Для хвойных характерны сезонные изменения содержания и соотношения хлорофилла, а так же каротиноидов. От начала формирования молодой
хвои, количество хлорофилла а, хлорофилла b и сумма каротиноидов в ней,
плавно нарастает с достижением максимума в августе – сентябре. Следует
отметить, что больше снижается содержание хлорофилла b, что приводит к
увеличению отношения хлорофиллов a/b.
Отношение хлорофиллов a/b в течение большей части года изменяется в
противофазе с содержанием хлорофилла b, и только в сентябре происходит
одновременное снижение как содержание хлорофилла b, связанного с компонентами фотосистемы 1 (ФС 1) и фотосистемы 2 (ФС 2) значительно превышает такую же для хлорофилла светособирающего комплекса (ССК). Известно, что хлорофилл b сосредоточен преимущественно с ССК и ФС 2. скорость
разрушения пигментов не одинакова в разные периоды года. Начинаясь осенью, процесс деградации хлорофилла развивается к зиме и затормаживается,
не смотря на морозы, в январе – феврале. Процесс деградации у хвои протекает при установлении холодной и солнечной погоды зимой. В конце весны с
началом нового вегетационного периода у хвои начинается активная регенерация фонда обоих компонентов хлорофилла, и как следствие, постепенное
восстановление окраски хвои в июле.
Метод регистрации ЗФ хлорофилла у такой древесной породы, как сосна обыкновенная, обеспечивает надежное выявление начальных стадий повреждения растений при загрязнении атмосферы.
Фотосинтез – один из важнейших процессов в живой природе. Ему
принадлежит центральная роль в общей энергетике растений и животных организмов, поскольку именно этот процесс служит первичным источником
всей энергии, используемой живыми организмами в процессе жизнедеятельности.
Солнечная энергия при участии зеленых растений и фотосинтезирующих бактерий преобразуется в свободную энергию органических соединений.
Для осуществления этого уникального процесса в ходе эволюции был создан
фотосинтетический аппарат, содержащий: набор фотоактивных пигментов,
способных поглощать электромагнитное излучение определенных областей
спектра и запасать эту энергию в виде энергии электронного возбуждения, и
специальный аппарат преобразования энергии электронного возбуждения в
разные формы химической энергии (редокс-энергия, энергия электрохимического потенциала, энергия фосфатных связей АТФ и др.).
22
Все эти виды химической энергии могут быть использованы в процессе
жизнедеятельности для поглощения и трансмембранного переноса ионов и в
большинстве реакций метаболизма. Успешное проведение экологического
мониторинга должно позволить прогнозировать изменение характеристик отдельных звеньев экологической системы и на основании этого предсказать
дальнейшую эволюцию экосистемы во времени. Принципиальное значение в
этом отношении имеет получение экспресс-информации состояния клеток организмов в результате различных внешних воздействий. Информация, которая позволила бы на ранних этапах диагностировать изменение клеточного
метаболизма под влиянием внешних факторов. Принципиально важно получить такую информацию задолго до того, как результат внешних воздействий
на организмы (особенно антропогенных) проявится в видимых признаках, таких как изменение формы и задержка роста клеток, уменьшение численности
клеточной популяции и общей биомассы. Эти признаки также важны для характеристики состояния отдельных звеньев, так и экосистемы в целом. Однако, на основании их изменения можно констатировать лишь конечный эффект
оказанного воздействия. Такие признаки могут служить источником информации для ранней диагностики нарушения состояния клетки при внешних
воздействиях. Отвечающие этим требованиям современные биофизические
методы экспресс-диагностики состояния клеток основаны на регистрации начальных нарушений клеточного метаболизма.
Наибольшее развитие в последние годы получили различные спектральные и люминесцентные методы. Характер изменения первичных стадий
фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток.
Процесс замедленной флуоресценции обнаружен Арноном и Стреллером в 1951 году. Это явление состоит в том, что после светового возбуждения
в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое, длительно затухающее
свечение, испускаемое хлорофиллом. Это свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (F0) за счет энергии, выделяемой в ходе темновых
реакций первичных фотопродуктов фотосинтеза в реакционном центре.
В РЦ при поглощении кванта света (hv) возбуждается молекула хлорофилла реакционного центра P (P → P*). Затем происходит переход электрона
от P* на первичный акцептор электрона А1 (восстаноыление первичного акцептора электронов А1P*А1→ P+ А1‾. Это одновременно сопровождается
окислением фотоактивного хлорофилла РЦ (P): PА1→ P*А1→ P+ А1‾.
Затем электрон уходит от акцептора А1‾ дальше в цепь переносчиков и
в итоге попадает на окисленную молекулу НАДФ+. Окисленный РЦ фотосистемы II (P+), в свою очередь, восстанавливается за счет электрона, полученного при разложении воды. Эти этапы ответственны за генерацию первичного
прямого потока электронов (рис.2.1). Однако, существует небольшая вероятность обратного переноса электрона в РЦ от А1‾ к P+, при котором происходит его рекомбинация с P+ с регенерацией возбужденного состояния P*. В ре-
23
зультате этого клетки испускают замедленное свечение с некоторой задержкой во времени
P*→ P+ hv.
Очевидно, интенсивность ЗФ пропорциональна количеству РЦ в состоянии P+ А1‾ с разделенными зарядами. Это состояние зависит от скорости
последующих стадий переноса электрона. При действии повреждающих факторов на фотосинтетический аппарат концентрация РЦ в состоянии P+ А1‾
может изменяться. Это позволяет использовать ЗФ для обнаружения загрязнений в окружающей среде.
Рис. 2.1. Схема возникновения замедленной флуоресценции хлорофилла листьев и
водорослей при возвращении от А1‾ на P.
K→ - прямой перенос электрона P*А1→ P*А1‾.
K← - обратный перенос электрона P*А1‾→ P*А1→ P+ hv, сопровождающийся замедленной флуоресценцией.
Сигналы замедленной флуоресценции: 1-контрольные пробы, 2 – под воздействием
загрязнителя.
Изменения параметров замедленной флуоресценции при действии факторов внешней среды можно использовать для определения устойчивости
растений. Максимальная амплитуда неблагоприятного фактора, при которой
еще нет существенных изменений параметров замедленной флуоресценции,
будет характеризовать устойчивость фотосинтетического аппарата растений к
этому фактору. Во многих случаях устойчивость фотосинтетического аппарата, регистрируемая методом замедленной флуоресценции, коррелирует с общей устойчивостью растительного организма к тому или иному фактору.
Преимущество флуоресцентных методов исследования заключается в
том, что информацию о содержании хлорофилла, организации фотосинтетического аппарата и его активности можно получить за очень короткий отрезок времени, как при контактном, так и бесконтактном способах измерения,
что очень важно для решения экологических проблем.
Методы, основанные на флуоресцентных параметрах, характеризуются
высокой чувствительностью, возможности автоматизации полученной информации, проведения ранней диагностики.
Таким образом, благодаря использованию метода замедленной флуоресценции мы можем с высокой оперативностью и чувствительностью полу-
24
чать многообразную информацию о фотосинтетическом аппарате, по которой
можно судить о влиянии стрессовых факторов на исследуемый объект.
Цель работы – определение параметров замедленной флуоресценции
хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей в районах с
разным уровнем атмосферного загрязнения
Оборудование, материалы и реактивы:
Флуориметр «Фотон 10», хвоя сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.),
собранная в районах с разным уровнем атмосферного загрязнения.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Включите компьютер в сеть. После загрузки Windows запустите
управляющую программу Foton-10. На экране монитора появится главное окно программы.
2. С побегов, собранных в районах с разным уровнем атмосферного
загрязнения, возьмите хвою второго года жизни. Сформируйте пробы
отдельно для каждого района. Затем, перемешав хвою, взятую в одном
районе, между собой, случайным образом выберите 10 хвоинок, и, обрезав
верхушку и основание, среднюю часть хвои длиной 2 см расположите
равномерно на дне кюветы. Таким образом заполняются все кюветы, кроме
нулевой.
Загрузите кюветы с исследуемыми образцами в прибор.
Нажмите мышкой кнопку «-- 0 --». Кассета придет в движение и остановится, когда напротив загрузочного окна станет кювета 0 (отмечена белой
точкой на диске кассеты). Затем последовательно нажимая кнопку и
«-- +1 --», установить все остальные кюветы.
3. Установите параметры замера.
Выбор параметров замера зависит от задачи исследования, вида растительного материала и его количества. При этом необходимо руководствоваться следующим:
− чувствительность прибора должна быть такой, чтобы для всех загруженных кювет регистрируемые величины показателей свечения не «зашкаливали», т.е укладывались с некоторым запасом в пределы всех графиков на экране монитора;
− чувствительность также не должна быть слишком низкой, что не
обеспечит надежную регистрацию уровней свечений.
4. Установив необходимые параметры замера (их можно также загрузить из файла), нажать на кнопку «СТАРТ». Кассета сначала установит в оптический блок прибора кювету «0», а затем последовательно все остальные
кюветы. На экране монитора будут отображаться номер кюветы и круга и
значения регистрируемых показателей.
5. Если для каких-либо кюветы величины показателей не будут соответствовать требованиям, необходимо прервать процесс измерения нажатием
кнопки «СТОП». При этом замер прекратится после завершения выполнения
25
замера текущей кюветы. Откорректировав параметры замера надо снова запустить замер нажатием кнопки «СТАРТ».
6. Сохраните результаты измерения.
После завершения процедуры замера необходимо сохранить полученные данные. Данные каждого замера сохраняются в виде отдельного файла
кнопкой «Сохранить». В качестве расширения имени файла по умолчанию
используется «.data». Для просмотра программой Foton-10 ранее сохраненные файлы надо «Загрузить».
Подпрограммой «Индукция» предусмотрено сохранения в текстовом
формате всех снятых данных через кнопку «Данные» и расчетных величин
параметров, как они представлены для каждой кюветы в таблице на экране,
кнопкой «Таблица».
Подпрограмма «ОПЗФ» аналогичным образом сохраняет исходные
(кнопка «Сохранить») и расчетные текстовые данные (кнопка «Таблица»).
Сохранения снятых данных невозможно после подачи команды
«СТАРТ», поскольку происходит автоматическая очистка памяти для приема
новых данных.
7. Полученные данные оформите в виде таблицы:
Район исследования
Уровень загрязнение
ОПЗФ
ЗФв
ЗФн
Вопросы:
Почему деревья хвойных пород часто используют в биоиндикации загрязнения воздуха?
От каких факторов среды могут изменяться параметры замедленной
флуоресценции?
Каким образом загрязнение среды влияет на интенсивность фотосинтеза и уровень замедленной флуоресценции?
Список литературы:
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Под ред. Р. Шуберта.М: Мир, 1988. С. 9-29.
Григорьев Ю. С., Бучельников М. А. Биоиндикация загрязнений воздушной среды на основе замедленной флуоресценции хлорофилла листьев и
феллодермы деревьев // Экология, 1999. № 4. С. 303-305, 273-275.
Григорьев Ю. С., Пахарькова Н. В. Влияние техногенного загрязнения
воздушной среды на состояние зимнего покоя сосны обыкновенной // Экология. – 2001. - № 6. – С. 471 – 473.
Гудериан Р. Загрязнение воздушной среды. – М.: Мир, 1979.
Загрязнение воздуха и жизнь растений // под ред. М. Трешоу. – Л. Гидрометиздат, 1988. – с. 535.
26
Лабораторная работа № 3.
Морфометрический анализ побегов сосны обыкновенной (2 часа)
Хвойные древесные растения являются хорошими биоиндикаторами
благодаря способности многолетней хвои накапливать атмосферные поллютанты в течение длительного времени. С другой стороны, их ксерофитные
свойства способствуют относительной устойчивости к загрязнению воздуха.
Известна высокая чувствительность хвойных растений к различным видам загрязнителей, что обуславливает их широкое использование в качестве биоиндикаторов при оценке качества окружающей среды (Рожков, Михайлова,
1989; Меннинг, 1985).
У большинства Хвойных имеются два типа побегов: неограниченные в
росте длинные побеги (ауксибласты) и ограниченные в росте укороченные
побеги (брахибласты).
Ветвление побегов у Хвойных – моноподиальное. При таком типе ветвления развивающийся из семени главный стебель (моноподий) имеет неограниченный верхушечный рост, за счет чего растение растет в высоту. От моноподия отходят боковые побеги первого, второго и т.д. порядков. Побеги,
отходящие от главного ствола, располагаются по спирали, однако они часто
так сближаются, что превращаются в мутовки (кольца из побегов вокруг
главного ствола), причем ежегодно образуется не больше одного такого кольца ветвей. Посчитав мутовки, можно определить возраст дерева, добавив к
полученной цифре 2 года, поскольку первые 2 года жизни у хвойных деревьев
мутовки не образуются. Однако этот метод применим для относительно молодых (до 50 лет) насаждений, в которых нижние мутовки на стволах еще не
успели полностью затянуться за счет вторичного прироста ствола.
Ветви таких ложных мутовок постепенно укорачиваются по направлению кверху, что придает дереву характерную пирамидальную форму. Вместе
с тем боковые ветви второго и следующих порядков располагаются двусторонне симметрично, делаясь иногда совершенно плоскими, что придает дереву ярусный характер. Если верхушечный побег повреждается, то одна из ветвей самой молодой мутовки боковых ветвей может начать расти вверх и принять роль главной. У старых деревьев обычно образуется широкая раскидистая крона, состоящая уже не из одной, а из нескольких главных ветвей, что
хорошо заметно, например, у старых сосен.
По мере старения дерева, на открытом месте его нижние ветви могут
сохраняться, доходя почти до земли (сбежистая крона), но в густом лесу они
обычно достаточно быстро отмирают из-за недостатка света. В результате
длинная нижняя часть ствола оголяется и остается практически без сучьев,
что очень ценится при заготовке древесины.
У большинства Хвойных, растущих в холодных областях, верхушка побега защищена плотно сидящими тонкими чешуями, образующими в конце
вегетационного сезона ясно выраженную почку. Почечные чешуи бывают по-
27
крыты защитным слоем смолы или плотно прикрыты толстым волосяным покровом.
Листья у большинства Хвойных узкие и игольчатые, такие листья называются хвоей, однако у более древних родов (например, у некоторых видов
Араукариевых и Подокарповых) листья ланцетные и даже широколанцетные.
Так, у подокарпа наибольшего (Podocarpus maximus) наиболее крупные листья достигают 35 см длины и 9 см ширины.
Зеленые листья Хвойных чаще всего сидячие, но иногда – с коротким
черешком. Почти всегда они цельные, и лишь у некоторых видов пихты листья на верхушке более или менее выемчатые. Их длина от 1–2 до 30–40 см.
Самые длинные листья среди современных Хвойных – у североамериканской
сосны болотной (Pinus palustris), хвоя которой достигает 45 см длины. За исключением нескольких листопадных или веткопадных родов (араукария, агатис, таксодиум, метасеквойя и куннингамия), листья Хвойных вечнозеленые,
плотные, болеe или менее жесткие и кожистые. Листорасположение, как правило, спиральное или очередное, реже – мутовчатое или супротивное. Узкие
листья (хвоя) имеют одну жилку, широкие – много параллельных жилок. В
сечение листья плоские, четырехгранные или округлые.
Кроме зеленых фотосинтезирующих листьев, у некоторых Хвойных
имеются коричневые чешуевидные листья.
Сосна (Pinus), род вечнозеленых хвойных деревьев и кустарников семейства сосновых (Pinaceae). Характеризуется игловидными листьями (хвоей), растущими пучками от двух до пяти в каждом (у некоторых видов – по
одному), и одревесневающими женскими шишками, созревающими в течение
двух вегетационных периодов. Описано около 90 видов, широко распространенных по всему Северному полушарию.
Сосна обыкновенная (лесная) − Pinus sylvestris L.
В природе встречается в Европе, на Урале, в Сибири, Монголии, Китае.
Дерево высотой 20-40 м и диаметром ствола до 1 м с высоко поднятой, конусовидной, а затем округлой широкой кроной с горизонтально расположенными в мутовках ветвями. Кора в верхней части ствола красновато-желтая тонко
шелушащаяся, в нижней части красно-бурая, толстая. Хвоя на укороченных
побегах в пучках по 2 шт., сизовато-зеленая, несколько изогнутая, с верхней
стороны выпуклая, плотная, длиной 4-7 см. Шишки яйцевидные, одиночные
или по 2-3 шт., длиной 2,5-7 см. Плодоношение с 15 лет, в частых насаждениях - с 40 лет. Высоко фитонцидная и декоративная порода. Мало требовательна к почвенно-грунтовым условиям, занимает часто непригодные для других
видов площади: пески, болота. Корневая система стержневая. Отличается
светолюбием.
Среди экологических проблем особое место занимает проблема взаимодействия загрязнённой токсическими выбросами окружающей среды и растительности. Основными источниками загрязнения служат продукты сгорания
ископаемого топлива, используемого для производства электроэнергии и ото-
28
пления, транспортные средства, различные промышленные процессы производства и переработки продукции.
Приземный слой воздуха обычно содержит, кроме свойственных ему
компонентов, примесь различных газов, жидких и твердых частиц. Они поступают в воздух с земной поверхности в результате человеческой деятельности, стихийных сил и биологического оборота веществ в биосфере. Многие
газообразные соединения, появляющиеся в воздухе в виде примесей, пагубно
действуют на растения. Рассмотрим некоторые из них.
Сернистый ангидрид (SO2) образуется при переработке и горении органических веществ (каменный и бурый угли, нефть и нефтепродукты, древесина), обжиги и плавки серосодержащих руд, при изготовлении и применении в
производственном процессе серной кислоты. Выбрасывают сернистый ангидрид в большом количестве тепловые электростанции, предприятия цветной и
черной металлургии, коксохимические, цементные, синтетических волокон и
аммиака, целлюлозные, сахароварения и др. Сернистый ангидрид способен
вступать во взаимодействие с содержащимися в воздухе водяным паром, капельками тумана или дождя и образовывать сернистую кислоту. Скорость
растворения SO2 зависит от концентрации ангидрида в атмосферном воздухе.
Серный ангидрид (SO3) обладает высокой гигроскопичностью и, соединяясь с водяным паром, образует аэрозоль серной кислоты, удерживающийся
в воздухе в виде тумана. Серная кислота обладает сильными окислительными
свойствами и активно присоединяет воду. Наличие а атмосферном воздухе
совместно сернистого и серного ангидридов обусловливает их высокую токсичность для растений.
Сероводород (H2S) поступает в атмосферу вместе с другими загрязнителями в относительно не большом количестве по сравнению с сернистым ангидридом. Он постоянно находится в выбросах коксохимических предприятий, выделяется при изготовлении искусственного волокна, сахара, в каменноугольных шахтах, на нефтяных промыслах, нефтеперерабатывающих заводах и др. сероводород обладает сильными восстановительными свойствами и
является токсичным для растений.
Окислы азота (NO2, N2O3, N2O5) выбрасывают предприятия, производящие туковые удобрения, азотистую кислоту и нитраты, анилиновые красители, нитросоединения, вискозный шелк, целлулоид, фотопленку, а так же
выхлопные газы автотранспорта. Окислы азота легко растворяются в воде,
содержащейся а воздухе, образуя аэрозоль азотной и малоустойчивой азотистой кислот.
Аммиак (NH3) выделяется в атмосферу в небольших количествах при
производстве аммонийных удобрений, мочевины, азотной кислоты, на сахарных, кожевенных и др. предприятиях. Аммиак обладает восстановительными
свойствами со слабовыраженной токсичностью.
Фтористые соединения являются одними из наиболее вредных для растений. Фтор легко вступает в реакцию почти со всеми элементами. Поэтому в
29
свободную атмосферу он поступает не в чистом виде, а в соединении с другими веществами в виде газа или пылевидных частиц. Источниками загрязнения воздуха фтористыми веществами являются алюминиевые и криолитовые
заводы, предприятия, производящие фосфаты и фосфорные удобрения, эмалевые и керамические изделия и т.д. некоторое количество фтористых соединений выделяется из топок при сжигании угля и из флюсов, применяемых
при выплавке чугуна. Газообразные или растворенные в воде соединения
фтора проникают в растения через листья и корни. Фтористые соединения являются высокотоксичными для растений. Не редки случаи полной гибели листьев деревьев у заводов. Губительное действие фтора на растения усиливается при высокой влажности воздуха и моросящих осадках.
Соединения хлора являются высокореакционными окислителями. Загрязнение атмосферного воздуха хлористыми соединениями происходит от
титано-магниевых заводов, химических предприятий, производящих инсектициды и гербициды, соляную кислоту, органические красители, цемент, суперфосфат, уксусную кислоту гидролизный спирт, хлорную известь, соду и
др. хлористый водород и другие его соединения необходимы растениям в ограниченном количестве. В случае попадания в организм в высоких дозах хлор
вызывает глубокие структурные и функциональные нарушения, нередко ведущие к гибели растений.
Окись углерода выделяется всюду при неполном сгорании веществ, содержащих углерод (каменный уголь, нефтепродукты, природный газ). Окись
углерода является восстановителем. Она отрицательно влияет на растения
при сравнительно высокой концентрации – свыше 1%.
Аэрозоли бывают твердые и жидкие. Под аэрозолями понимают содержащиеся в воздухе, как дисперсионной среде, мельчайшие твердые и капельно-жидкие частицы (диспергенты) во взвешенном состоянии. Совокупность
твердых частиц проявляется в виде дыма, а жидких – тумана или облака. Размер частиц аэрозолей колеблется в широких пределах – от сотых долей микрона до десятков и сотен микрон. Частицы менее 5 мк могут длительное время находиться в воздухе в виде взвесей, а при достижении размера более 10
мк они быстро оседают. Основными источниками выброса твердых и жидких
частиц в атмосферу являются тепловые электростанции, сжигающие бурый
уголь, металлургические предприятия, цементные и сажевые заводы, а так же
транспорт и другие. При изготовлении каждой тонны цемента завод теряет
240 кг продукции в виде пыли. Жидкие частицы аэрозоля образуются при
конденсации паров кислот, оснований, фенолов, смол и иных веществ, а так
же при химическом реагировании загрязнителей с водяным паром или капельками воды, содержащимися в атмосфере при тумане или дожде. Так, в
насыщенном влагой воздухе образуются сернистая серная, азотная, соляная,
фторидная и другие кислоты из соответствующих ангидридов, поступивших в
атмосферу в виде газа.
30
Древесные растения, обладающие огромной листовой поверхностью,
служат хорошим фильтром для очищения воздуха от аэрозолей. Твердые и
жидкие частицы, соударяясь с листьями, оседают на них и смываются жидкими осадками.
Указанные вещества в момент поступления в атмосферу или в ночное
время не оказывают повреждающего или раздражающего действия на живые
организмы. Их токсичность резко возрастает после некоторого периода освещения солнечными лучами.
У древесных растений кислотные выбросы вызывают задержку роста и
развития. Преждевременное старение и сокращение срока жизни обуславливают нарастающую деградацию растительного организма, снижение его устойчивости к негативным биотическим и абиотическим факторам, а в итоге к
отмиранию. Следует отметить более низкую устойчивость хвойных к кислым
токсикантам по сравнению с лиственными породами. Это явление связано с
длительным сроком жизни хвои и поглощением газа, вследствие чего развиваются обширные повреждения крон, снижение ассимиляционной поверхности, а также с относительно слабым развитием запасающих тканей и, соответственно, недостаточным накоплением резервных веществ.
Длительное воздействие токсикантов, ингибируя фотосинтез, естественно приводит к снижению интенсивности роста растений, к массовому опадению хвои и усыханию нижних мутовок.
Причиной прогрессирующего уменьшения приростов и структурных
изменений следует считать воздействие поллютантов на фотосинтетическую
активность хвои и деятельность устьиц, вызывающее значительное снижение
интенсивности фотосинтеза и синтеза ассимилятов, необходимых для роста.
Цель работы – определение морфометрических показателей (линейный
прирост побега, длина хвои, количество хвои на единицу длины побега, процент хлорозов и некрозов) побегов 1-6 годов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей в районах с разным уровнем атмосферного загрязнения.
Оборудование, материалы и реактивы:
Калькулятор, линейка, побеги сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.),
собранные в районах с разным уровнем атмосферного загрязнения.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Для исследования на каждой из площадок определите по 3 дерева,
визуально не поврежденных и расположенных в равных условиях освещенности, с учетом влияния факторов искусственного освещения, близости по отношению к дороге. При сборе образцов для исследования соберите побеги из
средней части кроны, без мужских и женских шишек.
31
2. Определите основные морфометрические показатели побегов и хвои
сосны обыкновенной, такие, как: линейный прирост побега, длина хвои и
число хвои на единицу длины побега, процент хвои с некрозами и хлорозами.
Линейный прирост побега определяют отдельно для каждого года жизни (начиная с верхушки – первый год, и т.д., включая боковые побеги). Единица измерения – 1 мм.
Длина хвои – измеряют среднюю длину для данного года. Единица измерения – 1 мм.
Число хвои на единицу длины побега – определяют общую число хвои
на данном побеге, после чего делится на длину побега.
Процент хвои с некрозами и хлорозами – из проб хвои отдельно для
каждого года подсчитывают количество хвои с хлорозами и количество хвои
с некрозами, затем полученные данные делят на общее число хвои.
3. Данные статистически обработайте по стандартным методикам.
4. Полученные данные оформите в виде таблицы:
Морфологический анализ побегов сосны обыкновенной
Проба № __________ Дата __________________________________
ФИО исследователя ________________________________________
Географическое положение пробной площади:
_________________________________________________________
Побег
Длина побега
Длина хвои
Количество хвои
Количество хвои на единицу длины побега
Количество хвои с хлорозами
Количество хвои с некрозами
Процент хвои с хлорозами
1 год 2 год 3 год 4 год 5 год 6 год
32
Процент хвои с некрозами
Сравните данные, полученные для побегов сосны обыкновенной, произрастающей в районах с разным уровнем загрязнения.
Вопросы:
Какие морфологические показатели побегов хвойных могут быть использованы в биоиндикации?
Какие типы некрозов встречаются у хвойных растений?
Почему хвойные растения по сравнению с лиственными более чувствительны к загрязнению воздуха?
Список литературы:
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Под ред. Р. Шуберта.М: Мир, 1988. С. 9-29.
Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. Пособие для студ. Высш. Учеб. Заведений / О.П. Мелехова,
Е.И. Егорова, Т.И. Евсеева и др.; под ред. О.П. Мелеховой и Е.И. Егоровой. –
М.: Издательский центр «Академия», 2007. – 288 с.
Гудериан Р. Загрязнение воздушной среды. – М.: Мир, 1979.
Загрязнение воздуха и жизнь растений // под ред. М. Трешоу. – Л. Гидрометиздат, 1988. – с. 535.
Лабораторная работа № 4.
Лихеноиндикация качества атмосферного воздуха (2 часа)
Лихеноиндикация – метод определения степени загрязнения атмосферного загрязнения с применением лишайников как организмовбиоиндикаторов.
Лишайники, как известно – симбиотические организмы, состоящие из
двух компонентов: гриба и водоросли. Взаимоотношения между грибным и
водорослевым компонентом в лишайнике чаще рассматривают как мутуалистические, хотя и есть мнения, что союз гриб-водоросль представляет собой
пример взаимного паразитизма.
В зависимости от места обитания лишайники подразделяют на следующие экологические группы: эпигейные (напочвенные), эпилитные (наскальные), эпифитные (на коре деревьев), эпиксильные (на окоренной древесине), эпифильные (на листьях вечнозеленых растений.
Лишайники удивительно неприхотливы в выборе субстрата и способны
поселяться в местах, труднодоступных и малопригодных для других растений. Однако они очень требоватекльны к чистоте окружающего воздуха, и
именно эта их особенность позволяет использовать их в качестве индикато-
33
ров состояния атмосферы. Примечательно, что биологи практически не занимались лишайниками, пока те не стали объектом их внимания именно в связи
с их чувствительностью к атмосферным загрязнениям.
Особенности их морфофизиологии – большая продолжительность жизни отдельного таллома, отсутствие покровных тканей и органов газо- и водообмена, невозможность избавиться от токсических веществ, сильная зависимость от физико-химических свойств среды – как раз и обуславливают их высокую чувствительность к загрязнению атмосферы.
Изучение и районирование загрязнений при помощи лишайников как
раз и составляет суть метода лихеноиндикации. Важнейшим этапом лихеноиндикационных исследований является грамотный выбор пробных площадей
и модельных деревьев, на которых производятся измерения, а так же правильное коллекционирование образцов лишайников.
Для исследований закладываются пробные площади – участок территории, в пределах которого выбираются модельные деревья. Для долговременного мониторинга закладывают постоянные пробные площади, на которых
деревья маркируют металлическими пластинками с номером.
Если работы ведутся в лесном массиве, то площади закладываются регулярно или в узлах сетки со стороной квадрата от 1 до 5 км, или на трансектах, заложенных в различных направлениях от источника загрязнения на равном расстоянии друг от друга. (Как правило, это направления преобладающих
ветров). В условиях города площади закладываются в пределах городских зеленых насаждений, при этом по возможности в отдалении от дорожнотранспортной сети.
Требования к пробным площадям и модельным деревьям таковы:
1. Структура и состав фитоценозов на удаленных друг от друга пробных площадях должны быть по возможности схожими. Для этого учитывают:
тип леса, состав, сомкнутость крон древостоя, время, прошедшее с момента
последнего пожара.
2. Модельные деревья должны в среднем быть похожи по высоте, возрасту, диаметру, жизненному состоянию, радиусу, густоте, высоте прикрепления кроны, рельефу коры, углу отклонения поверхности ствола по вертикали.
Только при соблюдении всех этих требований можно с достаточной
степенью достоверности говорить о том, что различия в числе видов или проективном покрытии вызваны именно влиянием какого-либо вещества, а не
различиями в микроклиматических условиях.
При проведении лихеноиндикационных работ намечается центр пробной площади (первое дерево), и далее вокруг него выбираются ближайшие
10-20 деревьев, отвечающих требованиям модельных. Деревья помечаются
яркми полосками ткани и пластиковыми этикетками с нанесенными на них
несмываемыми номерами (от 1 до 10 или до 20).
34
Перед началом лихеноиндикационных работ необходимо произвести
предварительную идентификацию видового состава лишайников, чтобы затем
легко узнавать их при определении относительной численности тем или иным
методом.
Для этого сначала проводят рекогносцировочное обследование местности, собирая образцы лишайников для последующей идентификации в лабораторных условиях. При этом желательно охватить территории с предположительно различной степенью загрязнения среды.
При сборе лишайников с помощью ножа необходимо соблюдать технику безопасности: около ствола дерева должен находиться только один сборщик. Случайно соскользнувший с субстрата (коры дерева) нож может нанести
травму стоящему рядом человеку.
Лишайники собирают вместе с кусочком коры или иного субстрата так,
чтобы не повредить нижний коровый слой и ризины. При этом вред, причиняемый дереву, нужно по возможности свести к минимуму. Для этого лучше
брать лишайники с поверхностным слоем достаточно толстой корки ствола,
не затрагивая ее глубоколежащие слои.
При сборе лишайники упаковывают в индивидуальные конверты. На
них обязательно указывается место сбора, порода дерева, дата. Дополнительная информация (экспозиция, высота расположения и пр.) тоже может быть
указана, если в дальнейшем планируется изучение экологических или эколого-морфологических особенностей конкретных видов.
Если образцы лишайников были собраны во влажную погоду, при возвращении в лабораторию их необходимо будет просушить во избежание заплесневения.
При камеральной обработке лишайники идентифицируют, применяя
общепринятые методы микроскопирования и используя определительные
таблицы.
Методика визуальной оценки обилия лишайников. Эта самая простая и
одновременно самая субъективная и потому недостаточно точная методика
является вариантом шкалы балльной Браун-Бланке, используемой для стандартных геоботанических исследований.
+ - встречаются единичные талломы, степень покрытия ничтожна.
1 – талломов достаточно много, но ПП невелико или особи разрежены
при большой площади покрытия.
2 – ПП 10-25 %.
3 – ПП 25-50 %.
4 – ПП 50-75 %.
5 – ПП более 75 %.
Она приемлема при предварительной оценке обилия лишайников или
при быстрых, но широкомасштабных лихеноиндикационных работах.
Также при экспресс-анализе состояния среды применяется такая характеристика обилия лишайников, как встречаемость. При этом учитывается, на
35
скольких стволах из всего числа модельных деревьев встречается какой-либо
вид лишайника, и это число переводится в проценты.
Методики измерения относительной численности лишайников:
1. Методика измерения линейных пресечений.
На ствол дерева на заданной высоте накладывается гибкая лента с миллиметровыми делениями. Она начинается в определенной относительно сторон света точке, обычно с северной стороны, оборачивается вокруг ствола и
закрепляется зажимом. Длину окружности ствола при дальнейших вычислениях принимают за 100%.
При измерениях фиксируют начало и конец каждого пересечения ленты
с талломами лишайников с точностью до 1 мм.
При обработке результатов измерений подсчитывается суммарная протяженность талломов лишайников каждого вида. Затем, зная длину окружности ствола дерева и принимая ее за 100%, пропорцией рассчитываем проективное покрытие лишайников.
2. Методика измерения проективного покрытия.
Для измерения проективного покрытия (далее – ПП) используют рамку,
или сеточку. Она представляет собой жесткий контур с соотношением сторон
1:1 или 1:2, разделенный леской или нитями на квадраты-ячейки со стороной
1 х 1 см. Рамку прикладывают к стволу дерева на определенной высоте.
Количественный учет лишайников производится чаще всего на двух
уровнях: у комля дерева и на высоте 1,3-1,5 м от поверхности земли (на уровне груди или на уровне глаз) Высоту измерения ПП обязательно отмечают в
протоколе. Измерения проводят или с четырех сторон света, или, чаще, в направлении к источнику загрязнения и с противоположной стороны, от него.
При мозаичном распределении нескольких источников загрязнения на исследуемой территории рамку накладывают с двух сторон: с северо-западной (как
правило, наиболее густо обросшей лишайниками) и юго-восточной стороны
(менее всего покрытой лишайниками) ствола дерева.
При подсчете каждая ячейка при размере рамки 10 х 10 см будет соответствовать одному проценту проективного покрытия (ПП).
Полученные для каждого вида лишайника проценты ПП складывают и
делят на число обследованных деревьев, чтобы вычислить среднее ПП для
всей пробной площади.
По результатам измерений можно вычислить ПП в разных вариантах:
для каждого обнаруженного вида лишайника, для всей синузии в целом, для
лишайников, растущих на комле дерева, для растущих на стволе, для определенной экспозиции и т.д. Эти данные характеризуют распределение лишайников по субстрату на различных пробных площадях и могут быть информативны при их последующем сравнении.
Использование классов полеотолерантности лишайников.
На основании результатов подробных исследований лихенофлоры некоторых регионов лишайники группируются в классы полеотолерантности. В
36
один класс попадают виды, примерно одинаково реагирующие на тот или
иной уровень загрязнения среды.
Полученная шкала полеотолерантности будет корректна для определения степени загрязнения районов, территориально и флористически близких к
тому, на основании изучения которого она создавалась. Она используется или
для приблизительной качественной, или для более точной количественной
оценки состояния среды.
Для качественной оценки достаточно определить, к какому классу полеотолерантности относятся доминанты лишайникового покрова, относительно часто встречающиеся на той или иной исследуемой территории. Для
этого бывает достаточно визуально оценить их обилие на пробной площади.
Для количественной оценки необходимо тщательное измерение ПП
лишайников и применение лихеноиндикационных индексов.
Индекс полеотолерантности вычисляется по формуле:
n
IP  
j i
AiCi
Cn
где n – число видов на описанной пробной площади, Ai – класс полеотолерантности вида (от 1 до 10), Ci – проективное покрытие вида в баллах, Cn
– сумма значений покрытия всех видов в баллах.
Оценка проективного покрытия дается по 10-балльной шкале (табл.
4.1).
Таблица 4.1.
Балл
Оценка проективного покрытия, %
1
1-3
Оценка проективного покрытия лишайников
2
3
4
5
6
7
8
3-5
5-10
102030405020
30
40
50
60
9
6080
10
80100
Класс
Для вычисления IP для какой-либо пробной площади для каждого вида
определяется класс полеотолерантности и проективное покрытие в баллах.
Затем полученные данный подставляются в формулу. После получения значений IP для некоторого числа пробных площадей становится возможным
создание лихеноиндикационной карты и сравнительная оценка состояния атмосферы исследованных территорий. Наблюдается закономерность: чем
больше значение IP, тем более загрязнен воздух на территории, на которой
располагалась данная пробная площадь. Для использования на территории
Красноярского края предлагается следующая шкала полеотолерантности лишайников (таб. 4.2).
I
Таблица 4.2.
Классы полеотолерантности лишайников г. Красноярска и его окрестностей
Тип местообитаний по степени
Виды
влияния антропогенных факторов
и встречаемость в них видов
Естественные
местообитания Athroniа radiata, Bacidia albescens, B. be-
37
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
(ландшафты) без ощутимого ан- chausii, Bryoria sp., Buellia alboathra, Сyтропогенного влияния
phellium lucidum, Graphis scripta, Hypogymnia tubulosa, Lecanora allophana, L.
argentata, L. fuscescens, Lepraria incana,
Leptogium saturninum, Opegrafa vulgata,
Pseudoevernia furfuracea, Vulpicida pinastri,
Usnea sp.
Естественные (часто) и антропо- Biatora sp., Cladonia fimbriata, C. coгенно-слабоизмененные
(редко) niocraea, Evernia mesomorpha, Heterodermia
местообитания
speciosa, Hypogymnia physodes, Phaeophyscia ciliata, Physconia detersa, Peltigera canina, Pertusaria amara, Ramalina dilacerata, R.
roeslerii, Usnea subfloridana
Естественные (часто) и антропо- Lecanora symmicta, Melanelia olivacea,
генно-слабоизмененные
(часто) Opegrapha rufescens, Parmelia sulcata, Phaeместообитания
ophyscia kairamoi, Physconia perisidiosa,
Physcia tribacea, Rinodina pyrina, Usnea
hirta, Xanthoria candelaria
Естественные (часто), слабо (час- Amandinea punctata, Caloplaca haematites,
то) и умеренно (редко) изменен- Candelariella xanthostigma, Physcia caesia,
ные местообитания
Ph. tenella, Ramalina sp., Ph. stellaris
Естественные, антропогенно слабо Melanelia exasperatula, Physcia dubia,
и умеренно измененные местооби- Rinodina sophodes
тания (с равной встречаемостью)
Естественные (сравнительно ред- Candelariella
vitellina,
Flavopunctelia
ко) и антропогенно-умеренно из- soredica, Phaeophyscia nigricans, Physcia
мененные местообитания
aipolia
Умеренно (часто) и сильно (редко) Candelaria concolor, Oxneria fallax
антропогенно-измененные местообитания
Умеренно и сильно антропогенно Phaeophyscia cf. оrbicularis, Physcia adscenизмененные местообитания (с dens, Phaeophyscia sp.
равной встречаемостью)
Сильно антропогенно измененные Caloplaca ferruginea, C. cerina
местообитания (часто)
Очень сильно антропогенно изме- Lecanora hageni, Candelariella aurella
ненные местообитания (встречаемость и жизненность низкие)
По результатам изучения особенностей лихенофлоры производится выделение нескольких зон загрязнения атмосферы и/или лихенокартирование
исследованной территории.
Для этих целей могут использоваться такие показатели, как число видов, обнаруженных на определенной территории (рис 4.1), проективное покрытие какого-либо вида (рис. 4.2), значение индексов полеотолерантности и
пр. В любом случае карта будет тем точнее, чем большее число пробных
площадей было обследовано.
38
Условные обозначения
Проективное покрытие
лишайников
>3,0 %
2,1-3,0 %
1,1-2,0 %
0,5-1,0 %
<0,5 %
Встречаемость видов
лишайников
Береза
Тополь
Рис. 4.1. Количественные показатели видового разнообразия лишайников на территории г. Красноярска. Цифры – число видов лишайников на площади (1 х 1 км); в квадратах – число видов в городе; в кругах – число видов вне городской черты; сплошная линия
– ориентировочные границы строений промышленных предприятий (заштрихованы),
пунктирная линия – ориенти-ровочные границы крупных лесопарковых массивов (Крючкова, 2006)
Рис. 4.2. Распространение и проективное покрытие лишайника Physcia aipolia
(Ehrh.) Fürnr. на березе и тополе в г. Красноярске и его окрестностях (Крючкова, 2006)
Цель работы: Ознакомиться с методами заложения пробных площадей, коллектирования лишайников, визуальными методами оценки их обилия
и методиками измерения относительной численности лишайников.
Оборудование и материалы: Лупы, ножи и конверты для сбора образцов, яркие ленты или полоски ткани, пластиковые этикетки с номерами, микроскопы, наборы для изготовления микропрепаратов, определители лишай-
39
ников, сантиметровая лента, зажимы или скрепки, рамка 10 х 10 см, таблицы
для записи результатов измерений, калькуляторы, бланки картосхем исследуемых территорий.
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. На территории исследуемого фитоценоза заложите пробную площадь. Затем на ней выбираются модельные деревья и маркируются полосками ткани и этикетками.
2. В пределах пробной площади на модельных деревьях визуально оцените относительную численность лишайников.
3. За пределами пробной площади соберите образцы лишайников для
коллектирования и идентификации видового состава.
Такие же действия произведите на пробной площади, расположенной в
отличающихся от первой условиях (к примеру, площади в глубине лесного
массива и на его окраине, ближе к автомагистрали).
4. Определите собранные образцы, используя определительные таблицы.
5. Определите принадлежность собранных видов к классам полеотолерантности лишайников г. Красноярска и его окрестностей согласно таблице
№ 2.
6. Произведите измерение линейных пресечений и проективного покрытия лишайников.
На ствол дерева на заданной высоте накладываем гибкую ленту с миллиметровыми делениями. Она начинается в определенной относительно сторон света точке, обычно с северной стороны, оборачивается вокруг ствола и
закрепляется зажимом. Длину окружности ствола при дальнейших вычислениях принимаем за 100%. При измерениях фиксируют начало и конец каждого пересечения ленты с талломами лишайников с точностью до 1 мм.
При обработке результатов измерений подсчитываем суммарную протяженность талломов лишайников каждого вида. Затем, зная длину окружности ствола дерева и принимая ее за 100%, пропорцией рассчитываем проективное покрытие лишайников.
Результаты занесите в таблицу 4.3:
Таблица 4.3.
Определение относительной численности лишайников методом линейных пресечений
Дата ________
Ф.И.О. коллектора ___________
Пробная площадь № _____
Географическое положение __________________________________
Древесная порода ______________
Средний диаметр стволов _____________
Характеристика древостоя
_________________________________________________________
_________________________________________________________
40
Число деревьев
Дл. окруж. ствола, 1
2
см
Вид лишайника
3
4
…n
1
2
…
Для измерения проективного покрытия используют рамку, или сеточку.
Она представляет собой жесткий контур с соотношением сторон 1:1 или 1:2,
разделенный леской или нитями на квадраты-ячейки со стороной 1 х 1 см.
Рамку прикладывают к стволу дерева на определенной высоте.
Количественный учет лишайников производится чаще всего на двух
уровнях: у комля дерева и на высоте 1,3-1,5 м от поверхности земли (на уровне груди или на уровне глаз) Высоту измерения ПП обязательно отмечают в
протоколе. Измерения проводят или с четырех сторон света, или, чаще, в направлении к источнику загрязнения и с противоположной стороны, от него.
При мозаичном распределении нескольких источников загрязнения на исследуемой территории рамку накладывают с двух сторон: с северо-западной (как
правило, наиболее густо обросшей лишайниками) и юго-восточной стороны
(менее всего покрытой лишайниками) ствола дерева.
При подсчете каждая ячейка при размере рамки 10 х 10 см будет соответствовать одному проценту проективного покрытия (ПП).
Результаты внесите в таблицу 4.4:
№
Таблица 4.4.
Определение относительной численности лишайников методом проективного покрытия
Дата ________
Ф.И.О. коллектора _________________________________________
Пробная площадь № _____
Географическое положение __________________________________
Древесная порода __________________________________________
Средний диаметр стволов _____________
Характеристика древостоя
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
№ дерева
1
2
…n
с\з
ю\в
с\з
ю\в
с\з
ю\в
Вид
лишайника, в
н
в
н
в
н
в
н
в
н
в
н
экспозиция
1
2
…
Полученные для каждого вида лишайника проценты ПП складывают и
делят на число обследованных деревьев, чтобы вычислить среднее ПП для
41
всей пробной площади. По результатам измерений можно вычислить ПП в
разных вариантах: для каждого обнаруженного вида лишайника, для всей синузии в целом, для лишайников, растущих на комле дерева, для растущих на
стволе, для определенной экспозиции и т.д. Эти данные характеризуют распределение лишайников по субстрату на различных пробных площадях и могут быть информативны при их последующем сравнении.
На основании результатов, полученных при применении всех вышеописанных методик, сделайте выводы о степени загрязнения атмосферы исследованных пробных площадей.
Вопросы:
Какие особенности морфофизиологии лишайников обуславливают их
высокую чувствительность к загрязнению атмосферы?
Опишите методики измерения относительной численности лишайников.
Как определяется индекс полеотолерантности?
Список литературы:
Андерсон Ф.К. Реакция лишайников на атмосферное загрязнение / Ф.К.
Андерсон, М. Трешоу // Загрязнение воздуха и жизнь растений. - Л.: Гидрометеоиздат, 1988. - C. 295-326.
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Э Вайнерт [и др.]; под
общ. ред. Р. Шуберта; - М: Мир. -1988.-350 с.
Бязров Л.Г. Лишайники в экологическом мониторинге / М.: Научный
мир, 2002. - 336 с.
Крючкова О.Е., Эпифитная лихенофлора города в связи с кислотностью
коры деревьев и загрязнением воздушной среды. Автореферат диссертации на
соискание ученой степени кандидата биологических наук. – Красноярск,
2006.
Окснер А.Н. Определитель лишайников СССР. Вып.2. Морфология,
систематика и географическое распространение / А.Н. Окснер // Л.: Наука,
1974. - 284 с.
Определитель лишайников России. Вып.8. Бацидиевые и др. / С.-Пб.:
Наука, 2003. - 277 с.
Определитель лишайников России. Вып.9. Фусцидиевые и др. / С.-Пб.:
Наука, 2004. - 339 с.
Определитель лишайников СССР. Вып. 3 Калициевые – Гиалектовые /
Л.: Наука, 1975. - 275 с.
Определитель лишайников СССР. Вып. 4. Веррукариевые – Пилокарповые / Л.: Наука, 1977. - 344 с.
Определитель лишайников СССР. Вып. 5. Кладониевые – Акароспоровые / Л.: Наука, 1978. - 304 с.
42
Определитель лишайников СССР. Вып.1. Пертузариевые, Леканоровые,
Пармелиевые / Л.: Наука, 1971. - 412 с.
Трасс Х.Х. Классы полеотолерантности лишайников и экологический
мониторинг / Трасс Х.Х. // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.: Гидрометеоиздат, 1985. - Т. 7. - С. 122-137.
Трасс Х.Х. Лихеноиндикационная оценка степени загрязненности атмосферной среды южного Прибайкалья / Х.Х. Трасс, А.Й. Пярн, К.Р. Цобель //
Региональный мониторинг состояния оз. Байкал: сб. науч. статей / Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - С. 54-63.
Трасс Х.Х. Лихеноиндикационные индексы и SO2 / Х.Х. Трасс // Биогеохим. круговорот веществ в биосфере: сб. науч. статей / - М.: 1987. - C.
111-115.
Трасс Х.Х. Полеотолерантность лишайников / Х.Х. Трасс // Материалы
6 симпозиума микологов и лихенологов Прибалтийских республик. Рига,
1971. Т. 1. С. 66-70
Трасс Х.Х. Трансплантационные методы лихеноиндикации / Х.Х. Трасс
// Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем: Т. 8. Л.: Гидрометеоиздат, 1985. - C. 140-144.
Шкараба Е.М., Селиванов А.Е. Использование лишайников в качестве
индикаторов загрязнения окружающей среды: Учебное пособие. - Пермь. Изд.
ПГПУ, 2001.
Экологический мониторинг / под ред. Т.Я. Ашихминой. М.: Академический проект, 2005. – 416 с.
Лабораторная работа № 5.
Определение влияния атмосферного загрязнения на жизненные
циклы растений с использованием метода регистрации термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла (4 часа)
Техногенное загрязнение атмосферы изменяет многие эволюционно
сложившиеся комплексы приспособительных реакций живых организмов к
условиям существования. Одним из возможных проявлений такого воздействия может быть нарушение естественной динамики перехода древесных растений в состояние покоя и выхода из него. При изучении этого явления хорошо зарекомендовала себя регистрация термоиндуцированных изменений
нулевого уровня флуоресценции (ТИНУФ).
Согласно современной точке зрения все процессы трансформации световой энергии, в том числе и флуоресценция, связаны с мембранами тилакоидов хлоропластов, представляющих собой жидкие кристаллы с «айсбергами»
белковых комплексов.
При помощи электрофореза фрагментов тилакоидов удается выделить
хлорофилл-белковые комплексы (ХБК) фотосистемы 1 (ХБК-1), фотосистемы
43
2 (ХБК-2) и светособирающий хлорофилл а/б белковый комплекс (СХБК)
(Сорокина, 1985).
Различают поверхностные и внутренние белки. Исследования показали,
что основная часть внутренних белков представлена как минимум тремя
группами крупных хлорофилл-белковых комплексов, в которых и сосредоточены пигменты, участвующие в фотосинтезе. Относительно мелкая фракция хлорофилл-белковый комплекс фотосистемы 1 (ФС-1), включает соответствующий реакционный центр и матрицу пигментов сборщиков. Средняя фракция - комплекс фотосистемы 2 (ФС-2), включает реакционный центр ФС-2 и
матрицу собственных пигментов сборщиков. Наиболее крупная фракция светособирающий хлорофилл а/б белковый комплекс, главная функция которого заключается в «светосборе», данный хлорофилл-белковый комплекс не
содержит реакционных центров.
Вся совокупность первичных процессов фотосинтеза осуществляется
отдельными системами, из которых, в первую очередь, необходимо выделить:
системы поглощения и концентрации световой энергии; электронтранспортную цепь, ответственную за образование фотовосстановителя (RH2)
и разделение зарядов на мембране и, наконец, систему сопряжения транспорта электронов с накоплением на мембранах ΔμН и образованием АТФ. Именно восстановитель, в виде НАДФН, и АТФ являются необходимыми компонентами для темновой фиксации СО2.
В систему поглощения и концентрации световой энергии включаются
СХБК и пигменты антенны фотосистем 1 и 2, основная функция которых заключается в поглощении световой энергии и передаче её в реакционный
центр. Светособирающий комплекс, включающий 50-70% всего количества
хлорофилла фотосинтезирующей мембраны и около 30% общего белка,
функционально тесно связан с ХБК-2 и не обладает собственной фотохимической активностью. В состав СХБК входят коротковолновые формы хлорофилла а (максимум поглощения - 661, 670, 676, 679 нм), хлорофилл б, лютеин, неаксантин и т.д.
Реакционным центром ФС-1 является особая форма хлорофилла а с
максимумом поглощения 700 нм. Хлорофилл а реакционного центра ФС-2
поглощает в максимуме 680 нм. В хлоропластах область гран обогащена ХБК
ФС-2 и СХБК, тогда как в тилакоидах стромы локализуется ХБК ФС-1 и система синтеза АТФ.
Скорость захвата квантов реакционными центрами ФС-1, за исключением экстремальных условий, практически не зависит от состояния реакционного центра. Два первичных акцептора ФС-1 так быстро передают электрон
на вторичные акцепторы, что в обычных условиях их невозможно накопить в
восстановленной форме. При комнатной температуре ФС-1 не флуоресцирует. ФС-2 и светособирающий комплекс являются основными флуоресцирующими единицами в этих условиях.
44
Показано, что способность растений противостоять действию высоких
температур во многом определяется устойчивостью их фотосинтетического
аппарата. Повреждающее действие высоких температур проявляется в нарушении структуры и функций хлорофилл-белковых комплексов и изменении
эффективности межкомплексной передачи энергии возбуждения. Одним из
оперативных способов оценки этих явлений может служить регистрация термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции (ТИНУФ).
Нулевой уровень флуоресценции регистрируется в положении, когда все реакционные центры ФС-2 находятся в окисленном состоянии («открыты»).
Общий вид кривой ТИНУФ представлен на рис. 5.1.
Рассмотрим сложившиеся к настоящему времени представления о природе процессов, лежащих в основе формирования данного вида кривой. Интенсивность флуоресценции при температуре 40-55°С (низкотемпературный
пик) определяется действием нагревания на структуру и функции компонентов фотосистемы 2 (ФС 2). В фазу подъёма это выражается в нарушении
функциональной связи между антенным комплексом ХБК-2 и его энергетической ловушкой - открытым реакционным центром (РЦ), при котором возможно повреждение самого реакционного центра фотосистемы 2. В фазу спада,
вызванную нагреванием, наблюдается функциональное и, вероятно, структурное разделение светособирающего Хл-белкового комплекса фотосистемы
2, а также снижением эффективности передачи энергии от хлорофилла б к
хлорофиллу а. Для оценки этого явления можно использовать относительную
величину низкотемпературного максимума R1 = Флнт-Фл25/Флнт, где Флнт - интенсивность флуоресценции при низкотемпературном максимуме, Фл25 - интенсивность флуоресценции при 25° С.
Поскольку для флуоресцирующей пигментной системы нет принципиальной разницы, каким образом она «теряет» энергетическую ловушку (в результате теплового нарушения связи между реакционными центрами ХБК-2 и
антенной или путём фотохимического восстановления первичного акцептора
электронов), относительную величину низкотемпературного максимума можно считать показателем эффективности захвата энергии возбуждения в реакционных центрах фотосистемы 2.
45
Рис. 5.1. Термоиндуцированные изменения нулевого уровня флуоресценции хлорофилл-содержащих тканей
Причиной высокотемпературного максимума может быть «разгорание»
флуоресценции более термостабильного хлорофилл-белкового комплекса фотосистемы 1 при инактивации её реакционных центров. Определённый вклад
в появление высокотемпературного пика может дать и хлорофилл-белковый
комплекс фотосистемы 2 при условии его локализации в межгранных участках мембран тилакоидов и дефиците светособирающего хлорофилл-белкового
комплекса. Соотношение низко- и высокотемпературного максимумов (R)
определяли по формуле:
R2 = Фл нт/Фл вт,
где Флвт - интенсивность флуоресценции при высокотемпературном
максимуме. По отношению низко- и высокотемпературного максимумов (R2)
можно оценивать картину структурной организации мембран хлоропластов.
Помимо предложенных параметров положение точек низко- и высокотемпературного максимумов на кривой ТИНУФ позволяет судить о термоустойчивости фотосинтетического аппарата к повреждающему действию повышенных температур.
Способность противостоять низким отрицательным температурам - одно из интересных и малоизученных свойств хлоропластов «вечнозелёных»
тканей деревьев и кустарников. Видовая специфика процессов, сопровождающих переход хлоропластов в криорезистентное состояние (состояние покоя) – снижение фотосинтетической активности, изменения химического состава и структурной организации мембран хлоропластов – затрудняет выбор
46
надёжного критерия для оценки криорезистентности хлоропластов и её сезонной динамики.
Кривая ТИНУФ хлорофилл-содержащих тканей в зимний период представлена на рисунке 5.2.
Рис. 5.2. Термоиндуцированные изменения нулевого уровня флуоресценции в состоянии зимнего покоя
Наблюдается качественное изменение формы кривой, что свидетельствует, по-видимому, о различной природе термоиндуцированных переходов в
зимнее и летнее время. «Зимний» вид кривой ТИНУФ определяется, вероятно, не количественными изменениями форм хлорофилла и хлорофиллбелковых комплексов, а особыми физико-химическими свойствами мембран
тилакоидов и самих белковых комплексов. Этому предположению соответствует также значительное снижение удельного выхода флуоресценции у зимних образцов.
Принимая во внимание кинетические характеристики и амплитуду высокотемпературного подъёма флуоресценции, полную необратимость вызванных нагревом изменений, можно предположить, что данное увеличение
интенсивности флуоресценции связано с нарушением связи белков с пигментами фотосистемы и растворением последних в липидной фазе тилакоидных
мембран в ходе термотропного фазового перехода.
Следует также отметить, что «зимний» тип термограмм у изученных
хлорофилл-содержащих тканей, по-видимому, наиболее универсален из известных в настоящее время критериев криорезистентного состояния хлоропластов.
Рассчитанное отношение низко - и высокотемпературного максимумов
(R2) может служить показателем степени глубины покоя. Для периода зимнего покоя отношение составляет 0,08, возрастая при переходе растений к активному метаболизму до 1,7.
47
Величина отношения R2, свидетельствующая о переходе к активному
метаболизму, всегда выше для растений, произрастающих в местности с высоким уровнем техногенного загрязнения. Промежуточное положение занимает величина отношения для образцов, взятых из района со средним уровнем загрязнения. Наиболее низкая величина R2 характерна для чистого района. По-видимому, более короткие сроки состояния покоя являются универсальной реакцией древесных растений на увеличение уровня техногенного
загрязнения. В результате незавершенности процесса подготовки к зиме, который, прежде всего, формирует условия по связыванию воды в тканях, растения на загрязненных территориях оказываются не готовы переносить воздействие низких температур и препятствовать возникновению водного дефицита в зимний период, при этом они оказываются более уязвимы для суровых
внешних условий.
Свойство морозоустойчивости формируется в процессе онтогенеза растения под влиянием определенных условий среды в соответствии с генотипом
растения, связано с резким снижением темпов роста, переходом растения в
состояние покоя.
Жизненный цикл развития многолетних растений контролируется сезонным ритмом светового и температурного периодов. В отличие от яровых
однолетних растений они начинают готовиться к перенесению неблагоприятных зимних условий с момента остановки роста и затем в течение осени во
время наступления пониженных температур. Повышение морозоустойчивости растений тесно связано с закаливанием – постепенной подготовкой растений к воздействию низких зимних температур. Закаливание – это обратимая
физиологическая устойчивость к неблагоприятным воздействиям среды.
Способностью к закаливанию обладают не все растения. Растения южного происхождения не способны переносить морозы. Способность к закаливанию у древесных и зимующих травянистых растений северных широт, переживающих значительное понижение температуры в зимний период, в период летней вегетации отсутствует и проявляется только во время наступления
осенних пониженных температур (если растение к этому времени прошло необходимый цикл развития). Процесс закалки приурочен лишь к определенным этапам развития растений. Для приобретения способности к закаливанию растения должны закончить процессы роста. Разные органы растений
имеют неодинаковую способность к закаливанию, например, листья листопадных деревьев (яблоня, груша, вишня) не обладают способностью к закаливанию; цветочные почки закаливаются хуже, чем листовые. У вегетирующих
растений легко вымерзают растущие и не закончившие рост органы. Выносливость растений к низким температурам в этот период незначительная.
Следует также учитывать, что способность растений противостоять морозным повреждениям сильно изменяется в зависимости от погодных условий летне-осеннего и предзимнего периодов.
48
Флуориметр «Фотон 5» (рис. 5.3) предназначен для регистрации индукционных кривых быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла различных растительных объектов в условиях варьирования интенсивностью возбуждающего света и температуры.
Прибор включает в себя два источника света, модулятор света и фотоприемник. В качестве источника интенсивного действующего (актиничного)
света используется лампа накаливания. Источником слабого измерительного
света является зеленый светодиод. Механический модулятор обеспечивает
прерывание света с частотой 35 гц. Между импульсами действующего света
длительностью 17 мсек регистрируется в течении 15 мсек интенсивность замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла растительного объекта. В это
время перед фотоприемником (ФЭУ) открыто специальное окно в модуляторе, а окно, через которое поступает действующий свет, находится в закрытом
состоянии. В конце каждого темнового промежутка подается короткий импульс измерительного света интенсивностью 0,1 вт/м2 , с длиной волны 540570 нм для возбуждения быстрой флуоресценции (БФ). Сигнал БФ вычитается из одновременно регистрируемого в этот момент сигнала ЗФ и подается по
отдельному каналу прибора на самописец. Со второго канала также с помощью самописца регистрируется ЗФ. В отсутствии яркого (действующего) света (при закрытой шторке) прибор измеряет только интенсивность БФ (Fo),
возбуждаемой измерительным светом.
Включение актиничного света вызывает восстановление первичного
акцептора фотосистемы 2 фотосинтетического аппарата растений, что сопровождается повышением квантового выхода БФ (Fм) и регистрируется как вариабельная флуоресценция. Для записи Fм прибор оборудован кнопкой
включения актиничного света максимальной интенсивности (500 вт/м2). При
выключенной кнопке регистрируется БФ и ЗФ при установленной оператором интенсивности актиничного света в диапазоне 10-500 вт/м2.
Прибор позволяет реализовать флуоресцентный метод измерения глубины зимнего покоя растений, разработанный в Красноярском государственном университете. Метод основан на регистрации изменений интенсивности
флуоресценции при нагревании хлорофилл-содержащего растительного образца (напр., листья, хвоя, кора и др.) в диапазоне 25-80 ºС. В результате деструктивного действия высоких температур на кривой термоиндукции растений в летнее время четко регистрируются два пика флуоресценции, свидетельствующие о присутствии в фотосинтетическом аппарате обеих пигментных систем. И, наоборот, при переходе в состояние зимнего покоя, который
сопровождается существенными перестройками в структурной и функциональной организации пигментного аппарата растений, на термограмме флуоресценции регистрируется только один высокотемпературный пик, принадлежащий агрегированным формам хлорофилла первой пигментной системе.
Для количественной оценки глубины зимнего покоя используется величина отношения интенсивности флуоресценции хлорофилла низкотемпера-
49
турного максимума (около 50 ºС) к максимуму при температуре 70-75 ºС. Регистрация термоиндуцируемых изменений интенсивности флуоресценции
производится при заданной скорости нагрева (8-10 град/мин).
Рис.5.3. Органы управления прибора Фотон 5.
1 – корпус прибора
2 – модулятор света
3 – кюветный блок с системой термостатирования
4 – шнур питания кюветного отделения
5 – регулятор интенсивности действующего света
6 – выключатель питания фотоумножителя
7 – регулятор интенсивности измерительного света
8 – регулятор тока ячейки Пельтье
9 – выключатель измерительного света
10 – переключатель режимов нагрев-охлаждения
11 – маркер отметки температур на ленте самописца
12 – кнопка включения максимального действующего света
13 – регулятор положения нулевой линии канала регистрации ЗФ
14 – светодиодный индикатор усиления прибора
15 – цифровой индикатор температуры ячейки с образцом
16 – кнопка переключения усиления прибора
17 – выключатель сетевого питания прибора
Нагрев и охлаждение кюветы с образцом производится термоэлектрическим элементом Пельтье, который установлен в кюветном блоке между металлической теплопроводящей ячейкой для исследуемого образца и радиатором охлаждения. При прохождении электрического тока через элемент Пельтье одна из его боковых поверхностей нагревается, а другая охлаждается. При
изменении направления электрического тока (полярности подаваемого напряжения) нагреваемая и охлаждаемая поверхности меняются местами. Степень нагрева или охлаждения находятся в прямой зависимости от величины
пропускаемого электрического тока. Температура ячейки с образом контро-
50
лируется датчиком, смонтированном на самой ячейки. Значение температуры
отображается на экране цифрового индикатора. Для обеспечения хорошего
теплового контакта образца с ячейкой она заполняется водой.
Цель работы – регистрация термоиндуцированных изменений нулевого уровня флуоресценции хлорофилла хвои и феллодермы побегов хвойных и
лиственных деревьев из районов с разным уровнем загрязнения воздуха, измеренных в зимнее время непосредственно после взятия проб и после выведения из состояния покоя в лабораторных условиях.
Оборудование, материалы и реактивы:
Флуориметр «Фотон 5», побеги сосны обыкновенной (Pinus sylvestris
L.), собранные в районах с разным уровнем атмосферного загрязнения,
климатические камеры для выведения растений из состояния зимнего покоя в
лабораторных условиях.
Порядок выполнения лабораторной работы:
Побеги, собранные в районах с разным уровнем атмосферного
загрязнения разделите на две половины. Одну половину поместите в
климатические камеры для выведения их из состояния зимнего покоя.
С побегов из второй половины соберите хвою второго года жизни.
Сформируйте пробы отдельно для каждого района. Затем, перемешав между
собой хвою, собранную в одном районе, случайным образом выберите 10
хвоинок, и, обрезав верхушку и основание, среднюю часть хвои длиной 2 см
равномерно разместите в кювете.
С помощью шприца с иглой аккуратно заправьте доверху кювету с образцом отстоянной водопроводной водой. При этом для обеспечения равномерного прогрева образца нельзя допускать его всплывания и наличие воздушных полостей в самой ячейке. Установите кюветный блок в прибор и зафиксируйте его специальным винтом.
Перед включением прибора в сеть убедитесь, что шторка источника
действующего света находится в закрытом состоянии, тумблер блока питания
фотоэлектронного умножителя (6) находится в выключенном состоянии, а
тумблер питания элемента Пельтье (10) в нейтральном (среднем) положении.
После включения сетевого питания (17) заработает механический модулятор света (2) и на экран цифрового индикатора (15) высветится значение
температуры. Подключите к прибору самописец КСП-4 для регистрации индукционных изменений быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла
растительных образцов. После включения самописца выставьте положение
нулевой линии канала замедленной флуоресценции регулятором (13), а канала БФ регулятором, расположенным на задней стороне флуориметра. Прибор
готов к работе.
51
Для записи термоиндуцируемых изменений нулевого уровня флуоресценции надо включить питание ФЭУ (6), измерительный свет (9) и регулятором интенсивности измерительного света (7) добиться отклонения пера самописца на одно четверть шкалы. Если усиление оказывается недостаточным, то
следует, нажимая кнопку (16) поднять усиление прибора до необходимого
уровня. Затем, надо вывести регулятор (8) тока ячейки Пельтье в положение
минимума тока, включить двигатель диаграммной ленты самописца и перевести переключатель (10) в положение нагрев. Наблюдая за ростом температуры на индикаторе (15) и делая через каждые 2 градуса отметки на диаграммной ленте кнопкой (11) обеспечить с помощью регулятора тока нагревателя (8) равномерную скорость нагрева в диапазоне 20-80 ºС скорость близкую 10 градусам в минуту. После записи всей термограммы, выключите движение ленты и переключите прибор в режим охлаждения. При достижении
температуры кюветы 20-25 градусов переведите переключатель (10) в нейтральное положение. Выключите питание ФЭУ и выньте из модулятора кюветный блок. Удалите из ячейки отработанный образец и воду.
Проведите анализ кривых термоиндуцируемых изменений нулевого
уровня флуоресценции, определите, в каком состоянии (вегетации или покоя)
находятся изучаемые побеги.
Через неделю, на следующем занятии повторите работу, использовав
вторую половину ранее собранных побегов сосны обыкновенной. Сравните
полученные кривые ТИНУФ между собой и с данными, полученными на
прошлом занятии.
Вопросы:
Что такое «нулевой уровень флуоресценции»?
В чем заключаются отличия между «зимним» и «летним» типами
термограмм ТИНУФ?
Какие изменения происходят в клетках растений при подготовке к
зиме?
Список литературы:
Гаевский Н.А., Моргун В.Н. Использование переменной и замедленной
флуоресценции хлорофилла для изучения фотосинтеза растений // Физиол.
раст., 1993 т.40. № 4, с.136-145.
Гаевский Н.А., Сорокина Г.А., Гехман А.В., Фомин С.А.. Гольд В.М.
Способ определения степени глубины покоя древесных растений. А.С. №
1358843 от 6.01.86, опубл. 15.12.87. Б.И .№ 46.
Григорьев Ю.С. Бучельников М.А. Биоиндикация загрязнений
воздушной среды на основе замедленной флуоресценции хлорофилла листьев
и феллодермы деревьев // Экология, 1999, № 4, с.303-305.
52
Григорьев Ю.С., Пахарькова Н.В. Влияние техногенного загрязнения
воздушной среды на состояние зимнего покоя сосны обыкновенной //
Экология, 2001, № 6, с.471-473.
Григорьев Ю.С. Фуряев Е.А. Андреев А.А. Способ определения
содержания фитотоксических веществ Патент России № 2069851, опубл. в
Бюл. изобр. № 33 27.11.96.
Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Замедленная
флуоресценция и ее использование для оценки состояния растительного
организма // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1985, № 4, с.508-520.
Рубин А. Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге //
Соросовский образовательный журнал, т.8, №4, с.7-13.
Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла:
учебное пособие / Под ред. Гольда В. М., Гаевского Н. А., Григорьева Ю. С. и
др. Красноярск: Изд-во КГУ, 1984. 82 с.
Лабораторная работа № 6.
Биотестирование качества воды в водоеме с использованием ряски
малой (2 часа).
Любая система контроля окружающей среды складывается из экологического мониторинга и анализа полученных данных, на основе которого принимаются решения о перспективах функционирования и практического использования экосистемы. В современных условиях сильного антропогенного
воздействия на внешнюю среду экологический мониторинг имеет огромное
практическое значение.
Многообразные загрязняющие вещества, попадая в окружающую среду,
могут претерпевать в ней различные превращения, усиливая при этом свое
токсическое действие. По этой причине оказались необходимыми методы интегральной оценки качества среды (воды, почвы, воздуха). Огромную роль
при этом играют методы биотестирования и биоиндикации.
Биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или накапливающегося загрязнения по индикаторным видам живых организмов и
экологическим характеристикам сообществ организмов. Пристальное внимание в настоящее время уделяется приемам биотестирования, т. е. использования в контролируемых условиях биологических объектов в качестве средства
выявления суммарной токсичности среды. Биотестирование представляет собой методический прием, основанный на оценке действия фактора среды, в
том числе и токсического, на организм, его отдельную функцию или систему
органов и тканей.
Наиболее информативны интегральные параметры, характеризующие
общее состояние живой системы соответствующего уровня. Для отдельных
организмов к интегральным параметрам обычно относят характеристики выживаемости, роста, плодовитости, тогда как физиологические, биохимиче-
53
ские, гистологические и прочие параметры относят к частным. Для популяций интегральными параметрами являются численность и биомасса, а для
экосистем – характеристики видового состава, активности продукции и деструкции органического вещества.
С увеличением интегральности тест-реакции повышается «экологический реализм» теста, но обычно снижаются его оперативность и чувствительность. Функциональные параметры оказываются более лабильными, чем
структурные, а параметры клеточного и молекулярного уровней проигрывают
в отношении экологической информативности, но выигрывают в отношении
чувствительности, оперативности и воспроизводимости.
Для биотестирования водной среды используются широкий круг гидробионтов - водоросли, микроорганизмы, растения, беспозвоночные, рыбы. В
качестве показателей биотестирования используются различные тестфункции – жизненные функции или критерии токсичности, характеризующие
отклик тест-объекта на повреждающее действие среды. Для культур одноклеточных водорослей и инфузорий тест-функциями являются гибель клеток,
изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент
деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры. Токсичность испытываемых веществ определяют также по визуальным показателям (изменение окраски культуры водорослей, лизис клеток), значениям рН
культуры, выделению и поглощению кислорода, соотношению живых и
мертвых клеток.
Выбор фототрофных организмов в качестве тест-объектов обусловлен
тем, что они являются первичным звеном трофической цепи водоемов и, как
правило, оказываются основной мишенью токсичных антропогенных воздействий. В многочисленных экофизиологических лабораторных исследованиях
отмечается высокая чувствительность прокариотных и эукариотных клеток
фототрофов к воздействию тяжелых металлов.
Ряска малая Lemna minor L. как тест-объект.
Представители семейства рясковых являются самыми маленькими
цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они
достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте
строения занимают первое место среди цветковых растений. Это – водные,
свободно плавающие, многолетние травянистые растения.
Вегетативное тело рясковых называется листецом. Листецы одиночные
или собраны в небольшие группы с помощью гиалиновой нити – тонкого выроста мембраны. Листецы состоят из паренхимных клеток хлоренхимы, разделенных большими межклеточными полостями, заполненными воздухом.
Проводящая система неразвита. Корни развиты слабо и не достают грунта, по
строению простые, одинарные (у многокоренника их число составляет от 3 до
10), отходят от брюшной поверхности листеца, зеленые, поскольку содержат
хлорофилл. Рясковые – растения космополиты, распространены по всему свету. Вегетативное тело по виду напоминает крошечный плавающий лист или
54
слоевище низших растений, поэтому длительное время их считали водорослями.
Листецы рясковых либо одиночные, либо соединены в небольшие
группы. Форма листецов может быть почковидной или шаровидной. Цветение у рясок наблюдается крайне редко. Плоды хорошо видны невооруженным
глазом, они чуть больше макового зернышка.
Ряску называют «экологической дрозофилой». Особенности морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания – все это сделало ряску удобным объектом для биологического
тестирования. Семейство рясковых содержит более 40 видов, из них в России
обитает только 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela
polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.).
Ряска малая (Lemna minor L.) – растение, плавающее на воде. Размер
листецов 2-4 мм. Число жилок 3 (рис. 6.1.). Листецы плоские, образуют группы из 3-6 растений. Встречается в стоячих водах. Корни длинные, но не достигают грунта, а выполняют главным образом функцию якоря, предотвращая
переворачивание растений в воде. Встречается чаще всего в стоячих водах.
Рис. 6.1. Строение ряски малой (Lemna minor L.):
А – общий вид; Б – группа листецов: один материнский и два дочерних (по Савельеву, 2005).
Рясковые размножаются преимущественно вегетативно, отдельный
лист может пройти 10 делений за период 7-10 суток. Рясковые могут удваивать свою массу за время от 10 ч до 2 суток при оптимальных температуре,
освещении и питании.
Особенности действия тяжелых металлов, как токсикантов.
Тяжелые металлы играют большую роль в жизненных процессах, что в
значительной мере связано с биологической активностью многих из них.
Среди тяжелых металлов есть как необходимые для жизнеобеспечения организма биогенные элементы, так и ксенобиотики, вызывающие отравление или
гибель. Увеличение концентрации тяжелых металлов в среде приводит не
только к накоплению значительных количеств соответствующих ионов в растениях, но и к нарушениям основных процессов жизнедеятельности. Повреждения приводят к снижению первичной продуктивности как отдельных растений, так в целом гидроценозов.
Тяжелые металлы относятся к группе неконсервативных металлов, то
есть их содержание в воде, почве, иле зависит от температуры, солесодержания, наличия неорганических и органических комплексообразователей, био-
55
логической активности, времени года и величины pH. В водных средах металлы присутствуют в трех формах: взвешенные частицы, коллоидные частицы и растворенные соединения. Последние представлены свободными ионами и растворимыми комплексными соединениями. Выраженные комплексообразующие свойства проявляют многие тяжелые металлы. В водных средах
ионы этих металлов гидратированы и способны образовывать различные гидроксокомплексы с органическими (гуминовые и фульвокислоты) и неорганическими (галогениды, сульфаты, фосфаты, карбонаты) лигандами, состав которых зависит от кислотности раствора. Образование комплексов с органическими лигандами зачастую делает ионы металлов биологически недоступными и малотоксичными. Таким образом, влияние поступающих в водную среду
ионов тяжелых металлов на живые организмы и экосистему в целом зависит
от состава самой воды.
Существует множество источников загрязнения окружающей среды
тяжелыми металлами. Тяжелые металлы применяются во многих отраслях
промышленности, таких как химическая технология, электрохимия, резиновая, текстильная, фарфоровая и другие. Также существует возможность загрязнения воздуха, воды водоемов, грунта и подземных вод вследствие накопления твердых отходов на свалках, шламонакопителях, а также при их уничтожении. Тяжелые металлы содержатся и в минеральных удобрениях. Однако
основной вклад в загрязнение окружающей среды вносят предприятия теплоэнергетики. Наряду со сжиганием минерального топлива важнейшим путем
техногенного рассеяния металлов является их выброс в атмосферу при высокотемпературных технологических процессах (металлургия, обжиг цементного сырья и др.), а также транспортировка, обогащение и сортировка руды.
В присутствии солей тяжелых металлов происходит нарушение фотосинтеза и митохондриального дыхания. В опытах на изолированных хлоропластах было неоднократно показано ингибирующее действие солей тяжелых
металлов на транспорт электронов: первичной мишенью при воздействии тяжелых металлов на фотосинтез являются компоненты фотосистемы ІІ, причем
изменения возникают довольно быстро. Под влиянием избытка меди нарушается баланс между потребляемой и производимой энергией, ритм АТФазной
активности и газообмен. Выделяют следующие направления действия избытка меди на метаболические превращения: во-первых, ингибирование процессов фотосинтеза и дыхания; во-вторых, индукция ферментов «стрессового
метаболизма». Отмечается, что влияние меди на ферменты может быть как
прямое, так и опосредованное.
Кадмий – тяжелый металл, характеризующийся высокой токсичностью,
обладает очень высокой подвижностью и проницаемостью. По химическим
свойствам кадмий подобен цинку. Он может замещать последний в активных
центрах металлсодержащих ферментов, приводя к резкому нарушению в
функционировании ферментативных процессов. Для кадмия специфические
механизмы поглощения пока не выявлены. Предполагают, что в большинстве
56
случаев ионы кадмия проникают в клетку в результате ионно-обменных процессов.
Цинк поступает в растение в виде ионов Zn2+. Он входит в состав ферментов – фосфатазы, карбоангидразы и др. Карбоангидраза катализирует разложение гидрата окиси углерода на воду и углекислый газ. Эта реакция важна
для процесса фотосинтеза. Кроме того, цинк активирует такие ферменты, как
енолаза, альдолаза, гексокиназа, триозофосфатдегидрогеназа. В этой связи
понятно значение цинка для дыхания.
Таким образом, не исключено, что ПДК для многих химических элементов не отражают реальную ситуацию, которая складывается на техногенно загрязненной территории, поскольку при разработке нормативов не учитывалась или учитывалась недостаточно буферная способность среды по отношению к тяжелым металлам. В настоящее время санитарно-гигиенические
ПДК ориентированы на валовое содержание тяжелых металлов, тогда как
правильнее было бы учитывать доступные для растений соединения.
В данной работе изучается действие тяжелых металлов на растения
ряски в природной воде, обладающей своей буферной емкостью, показывая,
таким образом, насколько могут связываться вносимые токсиканты.
При изучении связывающей способности воды проводятся опыты по
воздействию меди, цинка и кадмия на фотосинтетическую активность ряски
малой, оцениваемую методом регистрации ее замедленной флуоресценции.
При этом проводится титрование раствором сульфатов тяжелых металлов
опытных образцов тестируемой воды в ряде разбавлений. В контрольном образце используется дистиллированная вода с добавлением питательной среды.
Источником информации о характере функционирования фотосинтетического аппарата в данной работе является процесс замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла. Он заключается в регистрации степени снижения величины отношения интенсивности ЗФ при возбуждении свечения светом высокой и низкой интенсивности (относительный показатель замедленной флуоресценции, ОПЗФ).
Цель работы:
Регистрация изменений интенсивности замедленной флуоресценции
хлорофилла ряски малой в пробах природной воды и в ряде ее разбавлений
дистиллированной водой с добавлением солей тяжелых металлов.
Оборудование, материалы и реактивы:
Флуориметр Фотон-10, климатостат В-2, УЭР-03; стаканы, мерный цилиндр, комплект флаконов, комплект кювет для работы с флуориметром, колечки для кювет, дозаторы (1-5 мл; 0,1-1 мл), наконечники для дозаторов (1-5
мл; 0,1-1 мл), игла; пробы природных вод, 100% среда Штейнберга, растворы
57
солей тяжелых металлов (CuSO4, CdSO4, ZnSO4), дистиллированная вода, сода, губка с держателем; культура ряски малой.
Порядок выполнения лабораторной работы:
Подготовка проб воды: пластиковые бутылки (из под минеральной воды) промываются с содой, и затем многократно ополаскиваются водопроводной водой. Пробы отбираются в пластиковые бутылки, которые предварительно несколько раз ополаскиваются отбираемой водой. Привезенные пробы
хранятся в холодильнике не более суток.
Подготовка посуды: стаканы, цилиндр, комплекты флаконов, кювет,
колечки для кювет промываются с содой, многократно прополаскиваются водопроводной водой, после чего ополаскиваются дистиллированной водой.
Подготовка тест-объекта: отбирают из культуры ряску малую, выбирают трехлистецовые, одинаковые на вид, активно растущие экземпляры, чистые, зеленые, неповрежденные, здоровые на вид. В кюветы разлить по 4 мл
дистиллированной воды, положить на поверхность колечки для фиксации в
центре кюветы тест-оббъекта. Отобранную ряску по одной розетке поместить
в кюветы. Кюветы с ряской проанализировать на флуориметре при оптимальных настройках и выбрать из всей совокупности экземпляры с близкими по
ЗФв значениями.
Приготовление тестируемых растворов:
Схема опыта представлена на рис. 6.2.
2% Ш
2% Ш + 100%
тестируемая
вода
контроль
2% Ш +
ДКМ
100%
2% Ш +
100% тестируемая вода +
ДКМ
контроль+ТМ
2% Ш + 33%
ттестируемая
вода + ДКМ
100%+ТМ
2% Ш + 11%
33%+ТМ
тестируемая
вода + ДКМ
11%+ТМ
Рис. 6.2. Схема опыта, где
Ш – среда Штейнберга;
Тестируемая вода – пробы природных вод;
ДКМ – действующая концентрация металла, вызывает подавление ОПЗФ в среднем
на 50% по сравнению с контролем (Cu – 0.063 мг/л, Cd – 0.125 мг/л, Zn – 32-64 мг/л).
Объем растворов во флаконах 50 мл, в каждый флакон помещается одна
розетка растения. Каждая проба выполняется в трех повторностях. В итоге
готовится 150 мл каждого раствора.
58
Для приготовления контрольного раствора в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды Штейнберга и доводится до 150 мл дистиллированной
водой. Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
100% – в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды Штейнберга и
доводится тестируемой водой до 150 мл. Полученный раствор разливается во
флаконы по 50 мл.
Контроль+ТМ – в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды
Штейнберга добавляется немного дистиллированной воды, затем вносится
токсикант (ДКМ, рис. 6.3.) и доводиться до 150 мл дистиллированной водой.
Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
100%+ТМ – в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды Штейнберга, добавляется немного тестируемой воды, затем вносится токсикант, после
чего доводиться до 150 мл тестируемой водой. Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
33%+ТМ – в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды Штейнберга, добавляется 50 мл тестируемой воды, затем вносится токсикант, после чего доводиться до 150 мл дистиллированной водой. Полученный раствор разливается во флаконы по 50 мл.
11%+ТМ – в мерный цилиндр наливается 3 мл 100% среды Штейнберга, добавляется 16,5 мл тестируемой воды, затем вносится токсикант, после
чего доводиться до 150 мл дистиллированной водой. Полученный раствор
разливается во флаконы по 50 мл.
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
1 мл
ДКМ
исходный
раствор
сульфата
меди 10 г/л
67 мл дистиллированной воды
ДКМ
исходный
раствор
сульфата
кадмия 10 г/л
85 мл дистиллированной воды
2,1 мл
ДКМ
исходный
раствор
сульфата
цинка 10 г/л
Рис. 6.3. Схема разведения металлов для получения действующих концентраций
тяжелых металлов.
59
Во флаконы с готовыми растворами помещается по одной розетке ряски. Флаконы вставляются в УЭР-03, который находится в климатостате. При
круглосуточном освещении и температуре 27-28° C.
Получение результатов: экспозиция длится в течение 18-22 часов. После чего проводиться анализ морфологических изменений розеток (результаты описаний записать). Если растения в контрольном варианте не приросли
или выглядят не совсем здоровыми, то результаты эксперимента аннулируются. Возможно, растения были не здоровы в самом начале эксперимента,
либо посуда недостаточно отмыта.
Затем ряска анализируется на флуориметре Фотон-10 (измерение проводиться в четыре круга, для расчетов нулевой круг не берется). Полученные
данные по замедленной флуоресценции статистически обрабатываются (определение средней величины в каждом варианте, стандартное отклонение σ) и
представляются в виде графиков.
Критерием токсичности выступает подавление и стимулирование
ОПЗФ более чем на 30% по сравнению с контролем, а также изменение морфологических параметров розеток в сравнении с контрольными.
Сделайте вывод о связующей способности природной воды по отношению к тяжелым металлам.
Вопросы:
В каких основных формах присутствуют тяжелые металлы в водной
среде?
Объясните наблюдаемые морфологические изменения розеток ряски
малой при воздействии тяжелых металлов.
Перечислите основные источники загрязнения водной среды тяжелыми
металлами.
Назовите возможные пути связывания тяжелых металлов в исследованной воде.
Список литературы:
Будников, Г. К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем / Г. К. Будников // Соросовский образовательный журнал, 1998. № 5. – С. 23-29
Булгаков, Н. Г. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды: обзор существующих подходов / Н. Г.
Булгаков //Успехи современной биологии, 2002. – Т. 122. - № 2. - С. 115-135
Григорьев, Ю. С. Методика определения токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы,
осадков сточных вод и отходов по изменению оптической плотности культу-
60
ры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer). ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04
16.1:2.3:3.7-04 - Москва, 2004. -24 с.
Демидчик, В. В. Поступление меди в растения и распределение в клетках, тканях и органах / В. В. Демидчик, А. И. Соколик, В.М. Юрин // Успехи
современной биологии, 2001. – Т. 121. - № 2. - С. 190-197
Демидчик, В. В. Токсичность избытка меди и толерантность к нему
растений / В. В. Демидчик, А. И. Соколик, В. М. Юрин //Успехи современной
биологии, 2001. – Т. 121. - № 5. - С. 511-525
Жукова, Н. И. Влияние тяжелых металлов на рост и развитие растений /
Н. И. Жукова, Е. И. Потенко / Материалы региональной научно-практической
конференции «Стратегия развития Дальнего Востока: возможности и перспективы». - Хабаровск: издательство Дальне-восточной народной академии
наук, 2003
Константинов, А. С. Общая гидробиология / А. С. Константинов. – М.:
Высш. шк., 1986.-472 с.
Малева, М. Г. Реакция гидрофитов на загрязнение среды тяжелыми металлами / М. Г. Малева, Г. Ф. Некрасова, В. С. Безель //Экология, 2004. - № 4.
- С. 266-272
Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Замедленная флуоресценция и ее использование для оценки состояния растительного организма // Изв.
АН СССР. Сер. биол. -1985, № 4. -С.508-520.
Рубин, А. Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге / А.
Б. Рубин // Соросовский образовательный журнал, 2000. - Т 6. - № 4. – С. 7-13
Рубин, А. Б. Регуляция первичных процессов фотосинтеза / А. Б. Рубин,
Т. Е. Кренделева // Успехи биологической химии, 2003. – Т. 43. – С. 225-266
Савельев, И. Б. Фототрофные организмы в системе мониторинга окружающей среды, 2005. http://phm.bio.msu.ru
Селивановская, С. Ю. Создание тест-системы для оценки токсичности
многокомпонентных образований, размещаемых в природной среде / С.Ю.
Селивановская, В.З. Латыпова //Экология, 2004. - № 1. -С. 21-25
Синицкая, А. М. Сравнительный анализ токсичности соединений тяжелых металлов и источники их возникновения / А. М. Синицкая, Е. А. Семенов, А. Ю. Олефиренко / http://conf.bstu.ru
Тихая, Н. И. Биохимическая адаптация корневых клеток ячменя к токсическим веществам. II. Действие тяжелых металлов на фосфогидролазную
активность / Н. И. Тихая, М. Д. Федоровская //Известия АН. Серия биологическая, 2000. - № 6. - С. 688-694
Цаценко Л.В. Биотестирование загрязнений воды с помощью ряски малой (Lemna minor L.) / Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /
О.П. Мелехова, Е.И. Егорова, Т.И. Евсеева и др.; под ред. О.П. Мелеховой,
Е.И. Егоровой. -М.: Издательский центр «Академия», -2007. -С. 188-199.
61
Цикуниб, А.Д. Оценка токсичности сточных вод / А. Д. Цикуниб, О. Ю.
Борсук //Экология и промышленность России, 2006. - № 6. - С. 40-41
Якушкина, Н.И. Физиология растений / Н. И. Якушкина, Е. Ю. Бахтенко. – М.: Владос, 2005. -463 с.
Лабораторная работа № 7.
Биотестирование качества талого снега с использованием хлореллы (2 часа).
Атмосфера, являясь одним из основных компонентов биосферы, оказывает интенсивное и разностороннее воздействие на гидросферу, геологическую среду, почвенный покров, здания, сооружения, другие техногенные объекты, а также на биоту в целом и на человека в частности. Поэтому охрана
атмосферного воздуха представляет собой приоритетную экологическую
проблему, которой уделяется пристальное внимание во всех развитых странах. Активное воздействие атмосферы на наземные экосистемы и гидросферу
проявляется через атмосферные осадки в виде дождя и снега. Поверхностные
и подземные воды суши имеют главным образом атмосферное питание и их
химический состав в значительной степени зависит от состояния атмосферы.
Техногенное загрязнение воздушной среды оказывает негативное влияние на почвенно-растительный покров, проявляющееся в выпадении кислотных осадков, вымывающих кальций, гумус и микроэлементы из почв, в нарушении процессов фотосинтеза, приводящих к замедлению роста и гибели
растений. Совместное действие этих процессов приводит к заметному
уменьшению плодородия почв, снижению продуктивности лесов и даже к их
исчезновению.
Многолетними исследованиями показано, что зимой наблюдается повышение концентрации различных химических веществ в атмосфере, обусловленное ухудшением метеорологических условий рассеяния примесей,
увеличением количества промышленных выбросов, замедлением химических
процессов трансформации веществ при низкой температуре воздуха. По этим
причинам в снежном покрове городов накапливается основная масса атмосферных поллютантов.
Снежный покров обладает высокой сорбционной способностью и является наиболее информативным объектом при выявлении техногенного загрязнения атмосферы. Снежный покров фактически аккумулирует и сохраняет в себе все загрязняющие атмосферу компоненты. Химический состав
фильтрата талого снега формируется в результате поступления с осадками
различных химических элементов, поглощения снежным покровом газов, водорастворимых аэрозолей и взаимодействия со снежным покровом твердых
пылевых частиц, оседающих из атмосферы.
Основными загрязнителями, содержащимися в снежном покрове, являются ртуть, свинец, кадмий, цинк, медь, никель и другие тяжелые металлы.
62
Помимо этих полютантов, высокий уровень загрязнения может быть обусловлен присутствием в снежном покрове и гидросфере: анионов - хлоридов,
сульфатов, сульфидов, нитратов и др.; катионов, например NH4+, содержащих
Cr(III) и Cr(VI); взвешенных и органических веществ, например, формальдегид, нефтепродукты, синтетические ПАВ и др.
Таким образом, снежный покров, аккумулируя значительную часть атмосферных загрязнителей, является индикатором техногенной нагрузки на
окружающую среду. Определить интегральную токсичность снега можно методами биотестирования.
Под биотестированием понимают приемы исследования, при котором о
качестве среды, факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с
другими, судят по выживаемости, состоянию и поведению специально помещенных в эту среду организмов – тест-объектов. При выборе таких организмов приходится соблюдать определенные требования, среди которых возможность фиксировать четкий, воспроизводимый и объективный отклик на
воздействие внешних факторов, чувствительность этого отклика на малые содержания загрязнителей и др. Для биотестирования проб воды используются
различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы.
Выбор фототрофных организмов в качестве тест-объектов обусловлен
тем, что они являются первичным звеном трофической цепи водоемов и, как
правило, оказываются основной мишенью токсичных антропогенных воздействий. В многочисленных экофизиологических лабораторных исследованиях
отмечается высокая чувствительность прокариотических и эукариотических
клеток фототрофов к воздействию тяжелых металлов. При этом многие культуры цианобактерий и микроводорослей, обладая быстрыми физиологическими откликами на токсические воздействия, достаточно устойчивы, сохраняют жизнеспособность, а в случае прекращения поступления в среду тяжелых металлов, могут вернуться в исходное состояние. Подбор таких культур в
качестве тест-объектов, а также выявление простых и надежных физиологических откликов клеток в качестве тест-параметров — важнейшая задача в
системе мониторинга загрязнения водной среды тяжелыми металлами.
Клетки одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris шаровидные
или эллиптические диаметром 2-10 мкм, с тонкой оболочкой без слизи, одним
или двумя ядрами и одним чашеобразным хлоропластом.
Для некоторых видов хлореллы, в том числе и для Chlorella vulgaris, описано сложное строение клеточной стенки. Наружный трехслойный – триламинарный компонент стенки образован двумя электронно-плотными зонами,
заключающими электронно-прозрачную центральную зону. Он содержит
спорополленин – чрезвычайно устойчивое к действию различных ферментов,
кислот и щелочей вещество, представляющее собой продукт полимеризации
каратиноидов и встречающееся в пыльцевых зернах и спорах высших расте-
63
ний. Внутренний более толстый компонент содержит целлюлозные микрофибриллы.
Размножение бесполое, автоспорообразованию предшествует ряд митозов. Автоспоры освобождаются после разрыва стенки материнской клетки, от
которой остается только тонкий наружный спорополлениновый компонент,
очень стойкий по отношению к химическим, но не механическим воздействиям. Автоспор от 2 до 32 в зависимости от условий выращивания. Деление
происходит, как правило, один раз в сутки, но в условиях интенсивной культуры хлорелла способна к большому активному размножению. Хлорелла обладает хорошей приспособляемостью к условиям среды, может выдерживать
кратковременное воздействие крайних значений рН среды, резкое изменение
концентрации элементов и колебание температур. Хлореллу можно культивировать длительное время при интенсивном размножении без периода покоя.
Систематическая принадлежность: отдел Chlorophyta, класс Euchlorophyceae, порядок Chlorococcales, семейство Chlorellaceae, подсемейство Chlorelloideae, род Chlorella Beijer, вид Chlorella vulgaris Beijer.
Цель работы – сравнение степени прироста водоросли хлорелла в талой
воде и ряде ее разбавлений с величиной прироста в дистилированной воде,
используемой в качестве контрольного образца.
Оборудование, материалы, реактивы.
Для проведения исследований необходимы следующие средства измерений, материалы и реактивы:
– многокюветный культиватор водорослей КВМ – 05, ТУ 3615-00626218570-2007 или ТУ 5100-002-02067876-2004;
– измеритель ИПС-03 или фотоэлектроколориметр КФК-3 (КФК-2);
– культиватор КВ–05, ТУ 3615-006-26218570-2007 или ТУ 5100-00102067876-2004;
– Watertester
– холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-181С) и
хранения проб (+2–+4) 1С
– перестраиваемая автоматическая пипетка на 1-5 см3 или стеклянные
пипетки на 1, 5 и 10 см3 (ГОСТ 29227-91);
– термометр лабораторный жидкостной стеклянный (ГОСТ 29224-91)
– мерный цилиндр на 100 см3 (ГОСТ 1770-74);
– стаканы на 50 и 200 см3 (ГОСТ 25336-82);
– дистиллированная вода (ГОСТ 6709-72);
– среда Тамия 50%
– культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer.
64
Порядок выполнения лабораторной работы:
1. Подготовка посуды.
Для проведения биотестирования используется стеклянная посуда, вымытая раствором пищевой соды и сполоснутая дистиллированной водой.
2. Забор и подготовка проб снега для биотестирования.
Забор проб осуществляется в конце февраля – начале марта перед началом таяния снежного покрова. Отбор проб проводится пластиковым или металлическим совком, при этом в пробе должна быть представлена вся толща
снежного покрова. Отобранные пробы объемом 2 л переносятся в полиэтиленовые пакеты или чистые стеклянные банки, имеющие соответствующую
маркировку с датой и местом забора пробы.
Отобранные пробы хранятся в морозильной камере не более 24 часов с
момента забора.
Перед биотестированием пробы снега должны быть перенесены в чистые стаканы для таяния при комнатной температуре. Не допускается нагревание проб.
Растаявшие пробы фильтруются через широкопористые бумажные
фильтры («белая лента»). Приготовленные таким образом пробы делятся на
две части: 100 мл для биотестирования и 100 мл для определения показателей
оптической плотности, рН и электропроводности. Остатки проб сохраняют в
закрытой посуде на случай, если в ближайшее время необходимо будет провести повторное биотестирование.
В каждой подготовленной пробе измеряют оптическую плотность с помощью прибора ИПС-03 (см. далее), а также уровень рН и электропроводность. Данные заносят в журнал.
3. Приготовление разбавлений исследуемых проб снега для биотестирования.
Для приготовления разбавлений исследуемых проб используется дистиллированная вода. Предварительно, перед приготовлением необходимых
разбавлений вод для исследования, подготавливают соответствующей емкости посуду, в которой будут готовить растворы. Объем используемой посуды
должен на 1/3 превышать необходимый объем приготавливаемого разбавления исследуемых вод.
Приготовление растворов, разбавлений, проведение биотестирования
выполняются при комнатной температуре. Температура дистиллированной и
исследуемой воды должна быть также доведена до комнатной температуры
перед приготовлением разбавлений.
Талые пробы снега анализируются в 100, 33, 11, 3,7 и 1,2%-ной концентрациях (ряд разбавлений, кратных трем). В процессе приготовления разбавлений пробы тщательно перемешивают.
При выполнении практического биотестирования используют, в основном, два (наиболее важных) показателя, характеризующих содержание исследуемой воды в разбавленном (дистиллированной водой) растворе: во сколько
65
раз исследуемая вода разбавлена и каково ее процентное содержание в разбавлении. Данные показатели заносят в рабочий журнал.
Подготовленная к биотестированию проба в объеме 100 см3 переносится в стеклянный стакан емкостью 100-200 см3. Для получения ряда разбавлений анализируемой пробы, кратным трем, в четыре аналогичных стакана добавляется по 48 см3 дистиллированной воды. После этого в первый из них
переносится 24 см3 тестируемой воды, во второй, третий и четвертый – по 24
см3, соответственно, из первого, второго и третьего стаканов. 24 см3 из последнего стакана отбрасывается. Наряду с разбавленной тестируемой водой в
отдельные стаканы вносится 48 см3 исходной воды для тестирования и 48
см3 контрольной (дистиллированной) воды. Таким образом, получим 6 следующих вариантов тестируемой пробы снега объемом 48 см3 каждая, включая контрольную пробу:
исходная (не разбавленная) проба воды, 100%;
проба, разбавленная в 3 раза, 33%;
проба, разбавленная в 9 раз, 11%;
проба, разбавленная в 27 раз, 3,7%;
проба, разбавленная в 81 раз, 1,2%
контрольная проба, 0%.
Схема приготовления разбавлений исследуемых проб снега для биотестирования
24 мл т.в.
24 мл
48 мл д.в.
48 мл т.в.
48 мл д.в.
Контроль
100%
33%
(0%)
д.в. – дистиллированная вода
т.в. – тестируемая вода
24 мл
24 мл
24 мл
48 мл д.в.
48 мл д.в.
48 мл д.в.
11%
3,7%
1,2%
66
4. Подготовка тест-культуры водоросли.
Перед биотестированием культура водоросли Chlorella vulgaris, выращенная на 50% среде Тамия в культиваторе КВ-05, профильтровывается через
4 слоя марли или вату и разбавляется до оптической плотности 0,125±0,005
50% средой Тамия. Регистрация оптической плотности культуры тест-объекта
проводится с помощью специализированного измерителя плотности суспензии ИПС-03. Он позволяет проводить регистрацию оптической плотности в
круглых 2-см. кюветах («пеннициллинках»), в которых выращивается тесткультура водоросли при биотестировании токсичности воды.
Если накопительная культура, выращенная в культиваторе КВ-05, имеет большую плотность, то ее сначала следует разбавить 50% средой Тамия до
указанного диапазона, а затем, разделив на величину 0,125, определить степень ее дальнейшего разбавления для получения культуры водоросли с требуемой для засева в тестируемую воду оптической плотностью (0,125±0,005).
Общий объем засеваемой суспензии водоросли данной плотности должен быть не менее 20 см3 на каждый используемый в работе многокюветный
культиватор КВМ-05. Если одновременно планируется проведение биотестирования нескольких проб снега, то количество культиваторов КВМ-05 должно соответствовать их числу, а объем тест-культуры водоросли необходимо
увеличить кратно числу анализируемых проб воды.
5. Проведение биотестирования
Для биотестирования используют альгологически чистую культуру водорослей Chlorella vulgaris Beijer, находящуюся в экспоненциальной стадии
роста (через одни сутки после пересева в культиватор КВ-05). Для поддержания экспоненциальной стадии роста водорослей пересев осуществляется ежедневно.
Приготовленная согласно п. 7 тест-культура водоросли вносится по 2
3
см в 6 стаканов с 48 см3 контрольной и тестируемых проб воды. При этом в
результате 25-кратного разбавления засеваемой культуры содержание элементов питания в тестируемой воде, необходимых для обеспечения роста
клеток водоросли, будет соответствовать 2% среде Тамия, а исходная оптическая плотность тест-культуры водоросли будет равна 0,005.
Содержимое каждого стакана разливается по 6 см3 во флаконыреакторы (по 4 флакона на каждый вариант тестируемой воды, включая контрольную пробу).
Ростовые характеристики культуры водоросли хлорелла определяются
в многокюветном культиваторе КВМ-5. Прибор позволяет в одинаковых и
контролируемых условиях по температуре, интенсивности света, снабжению
СО2 (0,03%) и перемешиванию одновременно выращивать 24 пробы культуры
водорослей. При оптимальном режиме (T=36±0,5 C, средней интенсивности
света – 60 вт/м2) увеличение оптической плотности контрольной культуры
водоросли и, следовательно, численности клеток за 22 часа составляет 25–35
67
раз (Dконечная = 0,1500,03). Таким образом, за это время действия загрязняющих веществ, содержащихся в пробах, проявится примерно в пяти поколениях клеток водоросли.
Все 24 заправленных флакона закрываются чистыми полиэтиленовыми
пробками, в которых для обеспечения оптимального газообмена со средой и
предотвращения излишнего испарения культуральной жидкости сделаны отверстия диаметром 6 мм. Перед использованием пробки необходимо залить
кипящей водой, выдержать в ней 10 минут, а затем, слив воду, просушить
фильтровальной бумагой. После этого флаконы с пробками строго по вариантам устанавливаются в предварительно включенный в сеть культиватор КВМ05. Флаконы загружаются в приостановленную кассету по ходу ее вращения,
т.е. против часовой стрелки. В конце первого часа эксперимента после стабилизации температуры во флаконах проверяется ее значение в контрольном
варианте. Для этого термометр вводится через отверстие в пробке внутрь одного из контрольных флаконов. Чтобы точнее и быстрее произвести замер
температуры необходимо сделать несколько помешивающих движений в измеряемой среде. Если температура оказалась ниже или выше рекомендованной (360,5 С), то прибор необходимо настроить на поддержание требуемой
температуры с помощью регулятора, имеющего выход на боковую стенку
прибора. Измерение температуры надо проводить в одном и том же флаконе,
не выключая сам культиватор.
6. Снятие и обработка результатов токсикологического эксперимента
Через 22 часа культивирования выключить культиватор КВМ-05 из сети и провести измерение оптической плотности суспензии водоросли во всех
флаконах. Для этого флаконы надо извлечь из культиватора и разместить в
штативе. Затем, поочередно устанавливая флаконы в измеритель ИПС-03,
провести замеры их оптической плотности. Эксперимент можно считать успешным, если величины оптической плотности в контрольных флаконах были не ниже 0,120.
О степени острого токсического воздействия тестируемой воды на водоросли судят по разнице величины оптической плотности тест-культуры в
контрольных и опытных вариантах после 22 часов выращивания в культиваторе КВМ-05. С этой целью для каждого разведения по результатам четырех
параллельных определений вычисляют среднее значение оптической плотности по формуле:
Х=∑Хi / n,
где Х— среднее значение оптической плотности;
Xi– значения оптической плотности в i-том параллельном определении;
n – количество параллельных определений.
Если для одного из флаконов конкретного варианта опыта получено явно выпадающее значение оптической плотности (чаще всего из-за недостаточной чистоты флакона), то оно может быть отброшено, а средняя величина
плотности определяется из трех оставшихся значений.
68
Рассчитывают относительную (в %) разницу величины оптической
плотности для каждого разведения по сравнению с контролем (I):
I=(Xк – Xо) / Xк  100 %,
где Xк и Xо – средние значения оптической плотности в контроле и в
опыте, соответственно.
Критерием токсичности пробы воды является снижение средней величины оптической плотности по сравнению с контрольным вариантом на 20%
и более в случае подавления роста тест-культуры или ее повышение на 30% и
более – при стимуляции ростовых процессов.
Качество тестируемой воды устанавливается на основе ее токсикологических характеристик через величину токсичной кратности разбавления вод и
водных вытяжек согласно таблице 7.1. Для этого из результатов биотестирования разведений пробы воды, кратных трем, выбирают то разбавление, для
которого рассчитанный по формуле индекс отклонения I превысил критерий
токсичности воды. При этом процент отклонения в величине оптической
плотности по сравнению с контролем, проявляющийся в виде подавления
роста, приводятся со знаком (+), его стимуляции со знаком (–).
Если в ряду разбавлений имеются отклонения в оптической плотности
как в ту, так и другую сторону, то качество пробы снега устанавливается по
наибольшей величине разбавления, для которой превышен критерий токсичности. Если критерий токсичности не превышен ни при одном разбавлении
воды, включая ее исходный неразбавленный вариант, то проба считается нетоксичной.
Таблица 7.1
Токсикологические характеристики качества испытуемой воды
Величина разбавления тестируемой воды, при котоКачество пробы
рой превышен критерий токсичности
1 (неразбавленная)
слаботоксичная
3
среднетоксичная
9
токсичная
27
сильнотоксичная
81
гипертоксичная
Пример №1: Значения отклонения в % от контроля средней величины
оптической плотности тест-культуры водоросли для 1, 3, 9, 27 и 81 кратного
разбавления тестируемой пробы снега составили соответственно: 83, 65, 37,
25 и 7. Тогда, руководствуясь таблицей 7.1, качество воды определяется как
«сильнотоксичная», поскольку критерий токсичности (20% подавление) превышен для 27-кратного разбавления.
Пример №2: Значения отклонения в % от контроля средней величины
оптической плотности тест-культуры водоросли для 1, 3, 9, 27 и 81 кратного
разбавления тестируемой пробы снега составили соответственно: 24, –5, –36,
–22 и –8. Тогда, согласно таблицы 7.1, качество воды определяется как «ток-
69
сичная», поскольку критерий токсичности (30% стимуляция) превышен для
9-кратного разбавления.
Для графического отображения зависимости величины прироста тесткультуры водоросли хлорелла от разведения пробы снега строят график в
приложении Microsoft Exсel, где по оси абсцисс откладывается вариант разбавления пробы снега, а по оси ординат – соответствующие средние значения
оптической плотности культуры водоросли хлорелла. Также рассчитывается
и указывается на графике значение стандартного отклонения для каждого варианта разбавления пробы.
Вопросы:
Перечислите причины накопления основной массы атмосферных поллютантов в снежном покрове городов.
Какие основные загрязнители могут содержаться в снежном покрове?
Что понимают под биотестированием?
Что такое тест-объект? Какие тест-объекты используются в целях биотестирования?
Чем обусловлен выбор фототрофных организмов в качестве тестобъектов?
Список литературы:
Ажаев, Г.С. Оценка экологического состояния г.Павлодара по данным
геохимического изучения жидких и пылевых атмосферных выпадений: автореф. дис. … канд. биол. наук. / Г.С. Ажаев – Томск, 2007. – 25 с.
Артемов, В.М. Анализ состояния загрязнения снегового покрова для
проектирования сети станций АНКОС-А. В кн.: Методические и системотехнические вопросы контроля загрязнения окружающей среды / В.М. Артемов,
Д.П. Парцеф, Ю.Е. Сает и др.// Труды ИМПГ. 1982. Вып. 48. С. 144 - 149.
Булгаков Н.Г. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды: обзор существующих подходов//Успехи
современной биологии, 2002, том 122, № 2, с. 115-135
Водоросли, лишайники, мохообразные СССР./Отв. ред. М. В. Горленко.
М., «Мысль», 1978
Водоросли. Справочник/Отв. Ред. Вассер С. П. Киев: Наук. думка, 1989.
608 с.
Курбатова, А.С. Экология города / А.С. Курбатова, В.Н. Башкин, Н.С.
Касимов. – М.: Научный мир, 2004. – 624 с.
Методика определения токсичности проб поверхностных пресных,
грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов по изменению оптической плотности культуры водоросли
хлорелла (CHLORELLA VULGARIS BEIJER). ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04
16.1:2.3:3.7-04, Москва, 2007
70
Протасов, В.Ф. Экология, здоровье и охрана окружающей среды в России / В.Ф. Протасов. – М.: Финансы и статистика, 1999. – 672 с.
Рогулева, Н.О. Эколого-геохимические особенности снежного покрова
парков города Самары / Н.О. Рогулева, Н.В. Прохорова // Вестник СамГУ –
Естественнонаучная серия, №8(58), 2007. – С.206.
Строкина, Н.О. Эколого-геохимические особенности городской среды //
Наука. Творчество: материалы молодежной научной конференции Самарского муниципального университета Наяновой, 27 апреля 2005 г. – Самара, 2005.
– 220 с.
Лабораторная работа № 8.
Проведение токсикологических исследований на дафниях (2 часа)
Метод биотестирования с использованием дафний широко применяется
у нас в стране и за рубежом. Daphnia magna используется как тест-объект в
водно-токсикологических исследованиях уже около 75 лет. Позже последователями американской школы биотестирования была предложена Ceriodaphnia
affinis, и этот вид, наряду с D. magna и D. pulex, был введен в руководства по
биотестированию во многих странах мира.
Во второй половине XX века в связи с возникшей повсеместно необходимостью оценки токсичности сточных вод, мониторинга природных вод,
выяснения токсичности химических продуктов, широко используемых в народном хозяйстве и представляющих реальную или потенциальную угрозу
для гидробионтов, и решения ряда других водоохранных задач, биотестирование на дафниях стало широко использоваться в исследовательской деятельности и в оперативном контроле загрязнения вод в США, Франции, Германии
и других европейских странах, а так же в России. Несмотря на разработку в
последние десятилетия многочисленных биотестов (более 1500) на сотнях видов гидробионтов, D. magna продолжает интересовать экотоксикологов как
базовый объект биотестирования. Биотесты на дафниях стандартизированы в
ряде стран. Их применяют не только для оценки токсичности различных вод,
но и для установления токсичности загрязнений почв и отходов в вытяжках.
Дафнии как обязательный тест-объект включены в схему установления ПДК
веществ-загрязнителей и сточных вод в России.
Биология дафний. Дафнии – низшие ракообразные, являющиеся частью
планктона. Принадлежат к массовым видам, населяющим континентальные
водоемы. Обитают в стоячих и слабопроточных пресноводных водоемах, широко распространены на территории России, встречаются в пресных водах северных и южных широт, населяя водоемы различных типов: озера и водохранилища, реки и их поймы, пруды, рисовые поля, всевозможные искусственные и временные водоемы.
Дафнии относятся к типу членистоногих. Род Daphnia включает 50 видов и имеет повсеместное распространение. В пресноводных водоемах Рос-
71
сии широко распространены следующие виды дафний: D. magna, D. pulex, D.
longispina.
Рачки вида D.mMagna имеют более крупные размеры и их применение
в токсикологических экспериментах предпочтительнее. Другие рачки более
мелких размеров родов Ceriodaphnia и Moina так же часто используются в
биотестировании, среди преимуществ этих тест-объектов – их короткий жизненный цикл, что облегчает процедуру определения хронического (длительного) токсикологического действия токсикантов.
Рост дафний в течение всей жизни неравномерный, с возрастом замедляется и связан с периодическими линьками; первые три – ювенильные – следуют через 20, 24, 36 ч, четвертая – созревание яиц в яичнике – и пятая – откладывание яиц в выводковую камеру – следуют с интервалом 24-36 ч. Начиная с шестой, каждая линька сопровождается откладыванием яиц. Растет
дафния наиболее интенсивно в первые дни после рождения. При хорошем питании размеры молодых дафний после каждой линьки удваиваются. Новорожденная молодь имеет размеры – 0,7-0,9 мм в длинну, к моменту половозрелости самки достигают – 2,2-2,4, максимальная длинна тела - 6,0 мм, а самцы
– 2,0-2,1
Движение. Планктонные дафнии и некоторые другие ветвистоусые после взмаха задними антеннами и вызванного этим движением скачка, некоторое время неподвижно парят в воде. Благодаря тому, что центр тяжести их
тела находится ниже места прикрепления антенн, в момент удара антенн тело
рачка наклоняется, а в период покоя снова выпрямляется. Распростертые антенны препятствуют погружению рачка.
При благоприятных условиях имеют розовато-желтый цвет. При низком содержании растворенного в воде кислорода приобретают красноватый
цвет (происходит запасание гемоглобина). Дафнии с темно-красной кровью в
воде с низким содержанием кислорода живут значительно дольше, чем дафнии, имеющие светлую, бедную гемоглобином кровь. Очевидно, гемоглобин,
как и у позвоночных животных, связывает кислород. Это своеобразный механизм адаптации к неблагоприятным условиям.
Тело дафний (рис. 8.1) овальной формы, сжато с боков, заключено в
прозрачный панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и
брюшной отделы. Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут,
образуя рострум. Под рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно развиты, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. По бокам головы под кожей расположены большие
сложные глаза и простой науплиусов глаз. Туловище дафний покрыто прозрачным хитиновым панцирем, створки которого со спинной стороны плотно
соединены со стенкой тела, а с брюшной – свободно открыто. Под защитой
панциря находится пять пар конечностей. На спинной стороне тела, между
панцирем и стенкой тела, у самок образуется полость – зародышевая или выводковая камера, в которой вынашиваются яйца и эмбрионы. Абдомен лишен
72
конечностей. Передний, самый большой его отросток прикрывает заднюю открытую часть зародышевой камеры, предохраняя яйца и эмбрионы от выпадения. Заканчивается тело подвижным постабдоменом. Нижний его край переходит в два коготка, верхний изогнут и усажен анальными зубчиками, вместе с коготками принимающими участие в чистке грудных ножек. К основанию постабдомена прикреплены плавательные щетинки, вооруженные мелкими волосками.
1
13
2
12
3
11
4
5
10
6
7
8
9
Рис. 8.1. Строение Daphnia magna Straus: 1 — антенна, 2 — сложный глаз, 3 — антеннула, 4 — грудные ножки, 5 — яичник, 6 — створки панциря, 7 — каудальные когти, 8
— постабдомен, 9 — хвостовые щетинки, 10 — выводковая камера, 11 — сердце, 12 —
кишечник, 13 — печеночные выросты (Григорьев Ю.С., Шашкова Т.Л., 2006)
Питание. Большинство ветвистоусых питается, отфильтровывая мелкую, находящуюся в воде взвесь. Основной их пищей служат бактерии, и
мелкие органические остатки – детрит. Наибольше значение имеют бактерии.
В природных водоемах ветвистоусые прекрасно живут и размножаются при
концентрации бактерий не менее 1 миллиона в 1 см3 воды. Если численность
бактерий менее 500 тысяч на 1 см3, наступление плодовитости дафний задерживается; если же численность бактерий меньше 200 тысяч на 1 см3, жизнь
рачков становится невозможной. С другой стороны, избыточное количество
бактерий (более 3-5 млн. на 1 см3) также вредно влияет на рачков и вызывает
прежде всего замедление или приостановку их размножения, а иногда даже и
гибель. Это объясняется выделением бактериями продуктов обмена веществ,
73
ядовитых для ветвистоусых. От количества бактерий в водоеме зависит численность ветвистоусых. Помимо бактерий, фильтрующие ветвистоусые используют в пищу одноклеточные водоросли. Они могут заглатывать только
самые мелкие виды протококковых и зеленых водорослей. Во многих случаях
водоросли приобретают большое значение для ветвистоусых не потому, что
поедаются ими, а потому, что после отмирания вызывают массовое развитие
бактерий – основного корма рачков.
Фильтрация пищи рачками происходит непрерывно. Время необходимое для заполнения кишечника колеблется от 10 до 240 мин и зависит от величины рачков, размеров пищевых частиц, их концентрации и температуры.
Даже после наполнения кишечника рачки продолжают фильтровать, и отфильтрованные частицы двигаются вперед по их брюшному желобку, но в
рот они не попадают: ротовые придатки и задний отдел тела выталкивают их
снова в воду. Рачки начинают заглатывать пищу только после того, как кишечник хотя бы частично освободится от ее остатков.
При фильтрации пищи рачки не могут отсортировывать съедобные частицы от несъедобных. Они способны отбирать частицы только по их размеру,
отбрасывая только слишком крупные.
При разнообразном полноценном питании жировые капли Daphnia
magna окрашены в желтый цвет, при кормлении только протококковыми водорослями в ее теле накапливаются обильные капли жира, окрашенного в розовый цвет, причем такие дафнии перестают размножаться, а при голодании
не используют жировые запасы и погибают за два дня. Нормально питавшиеся Daphnia magna могут жить за счет резервов жира без пищи несколько дней.
Дафнии имеют своеобразный способ размножения, что сказывается в
положительную сторону при их использовании в биотестировании.
В природе в летнее время, а в лаборатории при оптимальных условиях
культивирования круглый год дафнии размножаются без оплодотворения —
партеногенетически (рождаются только самки). При резком изменении условий существования или культивирования (похолодание, голод, перенаселенность и т.п.) в культуре появляются самцы. Самцы отличаются от самок
меньшими размерами, видоизмененной формой тела, антеннул, постабдомена. Резкое изменение условий существования вызывает переход к половому
размножению, дафнии откладывают «зимние яйца» (1—2 шт.), размещающиеся в эффипиуме, образованном из частей створок панциря. При очередной
линьке эффипиум отделяется (в природе – осенью), падает на дно водоема,
где яйца проходят стадию зимнего покоя. Весной из них появляются самки,
снова переходящие к партеногенетическому размножению.
Период созревания рачков, при оптимальной температуре (20±2°С) и
хорошем питании, составляет 5-8 сут. Наступление половозрелости отмечают
по моменту выхода яйцеклеток в выводковую камеру. Длительность эмбрионального развития обычно 3-4 сут, а при повышении температуры до 25 °С –
46 часов. Число яиц в кладке увеличивается от 10—15 (в первых пометах) до
74
30-40 и более (у самок среднего возраста), а затем снижается (по мере старения) до 3-8.
В природе дафнии живут в среднем 20-25 суток, а в лаборатории при
оптимальном режиме 3-4 месяца и более. При температуре свыше 25°С продолжительность жизни дафний может сокращаться до 25 суток. Голодание
увеличивает продолжительность жизни, но задерживает рост и наступление
линек.
Биотестирование водной среды проводят только на синхронизированной культуре рачков. Синхронизированной является одновозрастная культура, полученная от одной самки путем ациклического партеногенеза в третьем
поколении. Такая культура генетически однородна. Рачки ее составляющие,
обладают близкими уровнями устойчивости к токсическим веществам, одновременно созревают и в одно время дают генетически однородное потомство.
Различают острые и хронические тесты. Первые рассчитаны на получение экспресс-информации о токсичности исследуемого вещества для данного
тест-организма, хронические опыты (обычно по плодовитости дафний) – на
выявление долговременного эффекта действия токсикатов, в частности малых
и ультра малых концентраций.
Острые опыты проводятся в различные сроки: от нескольких минут
(при достаточной экспрессности тест-реакции) до 96 часов. Чаще всего для
этих целей применяется биотест на выживаемость дафний. В результате проведенных опытов учитывается величина выживаемости (или обратная величина смертности), т.е. статистически достоверный процент выживаемых или
гибнущих особей за определенное время при определенной концентрации
вещества.
При определении острой токсичности, питьевых, сточных, поверхностных пресных, грунтовых вод, а также их разбавлений на основе выживаемости рачков устанавливают:
– среднюю летальную кратность разбавления вод, вызывающую гибель
50% тест- объектов за 48-часовую экспозицию – ЛКР50-48
– безвредную кратность разбавления вод, вызывающую гибель не более
10 % тест-объектов за 48-часовую экспозицию – ЛКР10-48
Для определения острой токсичности исследуемой воды рассчитывается процент погибших дафний (А, %) в тестируемой воде по сравнению с контролем:
A
X K  XT
100
XK
,
где XK – количество выживших дафний в контроле, ХТ – количество
выживших дафний в тестируемой воде.
Если А ≤ 10%, тестируемая вода не оказывает острого токсического
действия (безвредная кратность разбавления).
Если А ≥ 50%, тестируемая вода оказывает острое токсическое действие
(средняя летальная кратность разбавления).
75
Острые опыты позволяют достаточно оперативно выяснить, оказывает
ли данное вещество химической природы угнетающее, стимулирующее или
иное действие на исследуемую тест-функцию у данного тест-объекта. На их
основе можно установить интенсивность угнетения тест-функции за определенное время и развития этого процесса во времени, определить широту
спектра действия токсиканта или наличие у него избирательной токсичности
отдельных видов.
Для определения острой токсичности воды можно также использовать и
другие методы, связанные с регистрацией поведенческих реакций, такие как
подвижность, трофическая активность и др. Преимущество использования
этих методов связано с их большей чувствительностью к загрязняющим веществам, а также с их оперативностью.
Для регистрации снижения количества клеток водоросли в воде при наблюдении за изменением трофической активности дафний можно использовать методы подсчета клеток под микроскопом, с помощью автоматического
счетчика частиц, а также посредством измерения флуоресценции хлорофилла
водоросли. При этом ряд исследователей отдают предпочтение использованию параметров замедленной флуоресценции (ЗФ), объясняя это тем, что
данный вид свечения свойственен только живым клеткам водоросли и отсутствует у клеток, инактивированных желудочным соком дафний. Это имеет
значение, если в момент измерения показаний рачки находятся в исследуемой
воде. Однако, интенсивность ЗФ в этом случае будет определяться не только
количеством клеток в среде, но и степенью воздействия на них токсических
веществ, содержащихся в тестируемой пробе воды.
В этом плане для регистрации трофической активности рачков корректнее использовать изменение интенсивности нулевого уровня быстрой
флуоресценции (БФ) водоросли. Величина данного показателя напрямую связана с концентрацией клеток в среде и при этом мало зависит от их физиологического состояния. А применение высокочувствительного флуориметра
Фотон-10, разработанного на кафедре экотоксикологии СФУ позволит упростить и ускорить процедуру биотестирования.
Цель работы: освоить методы биотестирования вод на основе регистрации изменений выживаемости и трофической активности дафний под воздействием токсикантов.
Оборудование, материалы и реактивы:
Климатостат Р2, устройство для экспонирования рачков УЭР-03 (2 шт),
флуориметр Фотон-10, ИПС-03, центрифуга, пробирки стеклянные объемом
100 мл (36 шт), штатив для пробирок, стеклянная трубочка с внутренним
диаметром 4-5 мм, стеклянные стаканы на 100 мл (6 шт), стеклянные стаканы
на 250-400 мл (2 шт), мерный цилиндр на 50 мл, пипетки-дозаторы на 1 и 5
мл, пенициллиновые флаконы (2 шт), центрифужные пробирки объемом 50-
76
100 мл, ершики и губки для мытья посуды, шприц одноразовый на 5 мл, раствор бихромата калия, натрия бикарбонат (сода питьевая), культура водоросли хлореллы, синхронизированная культура рачков дафний (150 особей возрастом 1,5-2 суток, 180 особей дафний возрастом менее суток), культивационная вода для дафний, кюветы для флуориметра Фотон 10 (19 шт).
Порядок выполнения лабораторной работы:
Эксперимент 1: Оценка выживаемости дафний в присутствии бихромата калия.
Всю посуду, необходимую для проведения эксперимента, вымыть раствором соды, тщательно прополоскать и затем высушить.
0,5 мг/л
1,0 мг/л
2,0 мг/л
1,5 мг/л
2,5 мг/л
29,4 г/л
K2Cr2O7
1 мл
дафнии
дафнии
дафнии
дафнии
дафнии
+ 99 мл
дистиллята
7,5 мл
10 мл
19,4 мл
дистиллята
1 мл
10 мл дистиллята
1 мл
10 мл дистиллята
1 мл
1 мл
1 мл
10 мл
10 мл
21,9 мл
дистиллята
12,5 мл
294 мг/л
бихромата
16,9 мл
дистиллята
Рис. 8.2. Схема разведения бихромата калия для контроля чувствительности культуры дафний.
Приготовить растворы токсиканта в концентрациях 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5
по схеме, представленной на рисунке 8.2.
Каждый стаканчик необходимо пометить стикером с указанием приготовленной концентрации модельного токсиканта.
В пробирки (18 шт.) объемом 100 мл рассадить по 10 дафний возраста
8-24 часов. Дафний отловить пипеткой (с отпиленным и оплавленным концом) объемом 2 см3 из емкостей, в которых выращивается синхронизирован-
77
ная культура. Далее поочередно из каждого флакона удалить с помощью одноразового шприца культивационную воду, попавшую вместе с дафниями,
таким образом, чтобы не повредилась ни одна дафния. Еще раз пересчитать
количество особей (10 шт. в пробирке) и затем аккуратно, по стенке сосуда
налить, предварительно отмеренные цилиндром, 49 мл культивационной воды. В последние три флакона с рачками налить 50 мл культивационной воды.
В опытные пробирки (с 1 по 16) добавить по 1 мл приготовленного раствора токсиканта. Для каждой концентрации токсиканта по 3 повторности
(пробирки). Токсикант необходимо разливать пипеткой-дозатором на 1 мл,
начиная с раствора меньшей концентрации и далее последовательно ее увеличивая.
Приготовленные пробы испытуемых растворов с дафниями последовательно поместить в устройство для экспонирования рачков в следующем порядке:
контрольные пробы (без токсиканта)
с 1 по 3
0,5 мг/л бихромата калия
с 4 по 6
1,0 мг/л бихромата калия
с 7 по 9
1,5 мг/л бихромата калия
с 10 по 12
2,0 мг/л бихромата калия
с 13 по 15
2,5 мг/л бихромата калия
с 16 по 18
Включить устройство для экспонирования рачков и зарегистрировать
время его включения.
Через 24 часа экспонирования остановить УЭР и последовательно переместить флаконы в штатив, произвести подсчет выживших рачков с занесением полученных значений в таблицу. Рассчитать среднее значение выживаемости (в процентах) и стандартное отклонение для каждой концентрации
модельного токсиканта и контроля. Занести рассчитанные значения в таблицу
8.1.
Таблица 8.1
Выживаемость дафний в присутствии бихромата калия в течение 24 часов
Концентрация
Среднее значеВыживаемость, шт.
Стандартное
бихромата кание выживаемоотклонение
1 флакон 2 флакон 3 флакон
лия, мг/л
сти, %
Контроль
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Эксперимент 2: Оценка трофической активности дафний в присутствии
бихромата калия.
Подготовка посуды и растворов токсиканта производится аналогично
указанному в эксперименте 1.
78
При посадке дафний во флаконы осуществляются действия, указанные
в предыдущей работе, но в опытные пробы наливают по 47 мл культивационной воды, а в контрольные – 48 мл. Первые три флакона необходимо оставить
без дафний (только 48 мл культивационной воды) для контроля за исходным
уровнем хлореллы. Пробирки с пробами воды и тест-организмами помещаются на 2 часа во вращающуюся кассету устройства для экспонирования рачков (УЭР-03).
Общая схема размещения пробирок в УЭР-03 следующая:
Хлорелла
с 1 по 3
Дафнии + Хлорелла
с 4 по 6
Дафнии + 0,5 мг/л бихромата калия + Хлорелла
с 7 по 9
Дафнии + 1,0 мг/л бихромата калия + Хлорелла
с 10 по 12
Дафнии + 1,5 мг/л бихромата калия + Хлорелла
с 13 по 15
Дафнии + 2,0 мг/л бихромата калия + Хлорелла
с 16 по 18
После двух часов экспонирования рачков в исследуемой пробе воды во
все варианты опыта, включая те, где нет рачков, добавляют по 2 мл суспензии
клеток водоросли хлорелла оптической плотностью 0,500 (кювета 2 см, длина
волны 560 нм, прибор ИПС-03). Затем все пробирки вновь экспонируются в
УЭР-03 в течение 17-24 часов.
После экспонирования проводится регистрация трофической активности. Изменение содержания клеток водоросли в растворе определяют путем
регистрации интенсивности нулевого уровня флуоресценции хлорофилла
клеток хлореллы, находящихся в воде. Для этого из каждой пробирки с помощью пипетки-дозатора на 5 мл отбирают по 4 мл пробы с клетками хлореллы (исключить попадание рачков) и помещают в кювету флуориметра Фотон 10 для измерения показателей флуоресценции.
Для измерения концентрации клеток водоросли в испытуемых растворах в меню фотона-10 устанавливаются параметры, указанные на рисунке 8.3.
Данные, полученные при измерении фотоном, сохраняются и передаются в таблицу Excel, где рассчитываются значения трофической активности
по следующей формуле:
ТА =
Fхл  Fхл  р
Fхл
,
где ТА – трофическая активность;
Fхл – показатель флуоресценции в суспензии хлореллы;
Fхл+р - показатель флуоресценции в суспензии хлореллы с рачками.
79
Рис. 8.3. Параметры замера для регистрации нулевого уровня флуоресценции при
измерении трофической активности дафний.
Результаты расчета занесите в таблицу 8.2, по которой затем постройте
диаграмму.
Таблица 8.2
Трофическая активность дафний в присутствии бихромата калия в течение 24 часов
Трофическая активность,
отн. ед.
Среднее значеКонцентрация
ние трофической
Стандартное
бихромата каактивности,
отклонение
лия, мг/л
1 флакон 2 флакон 3 флакон
отн. ед.
Контроль
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Вопросы:
Для чего необходимо проводить биотестирование культивационной воды с модельным токсикантом раз в квартал?
Какую культуру рачков используют в биотестировании?
Назовите способы регистрации трофической активности рачков, их основные преимущества и недостатки, если они есть.
Какими путями может происходить отравление рачка токсикантом?
80
Какой способ биотестирования из двух рассмотренных в данной работе
вам кажется наиболее эффективным? Назовите недостатки и преимущества
каждого из них в сравнении между собой и с другими методами биотестирования.
Список литературы:
Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. Пособие для студ. Высш. Учеб. Заведений / О.П. Мелехова,
Е.И. Егорова, Т.И. Евсеева и др.; под ред. О.П. Мелеховой и Е.И. Егоровой. –
М.: Издательский центр «Академия», 2007. – 288 с.
Брагинский, Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных
(критический обзор). // Гидробиол. журн., 2000. - Т. 36.- № 5. - С. 50-70
Григорьев Ю.С., Шашкова Т.Л. Методика определения токсичности
водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной,
природной воды по смертности тест-объекта Daphnia magna Straus (ПНД Ф
14.1:2:4.12-06 16.1:2.3.3.9-06). / Москва, 2006, 44 с.
Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Венедиктов П.С. О возможности использования флуоресцентных методов для изучения питания ракообразных. //
Биологические науки, 1990. №1. С. 146-152
Руководство по определению методом биотестирования токсичности
вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов // Министерство природных ресурсов РФ РЭФИА, НИА – М.: Природа, 2002.
Шашкова Т.Л., Григорьев Ю.С., Березина О.А. Влияние условия среды
на чувствительность рачков Daphnia magna к токсикантам. // Вестник КрасГУ,
естественные науки, 2006, №5/1, стр. 81-85
Шашкова Т.Л., Григорьев Ю.С. Оперативный биотест на основе трофической активности рачков Daphnia magna. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях
устойчивого развития» Киров, 2007, С. 55-58