На правах рукописи Исаева Ольга Валерьевна ЭКОЛОГИЯ
реклама
На правах рукописи Исаева Ольга Валерьевна ЭКОЛОГИЯ ЭНДОФИТНЫХ ДРОЖЖЕЙ Специальность 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель член-корр. РАН Чернов Иван Юрьевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук Терехова Вера Александровна кандидат биологических наук Благовещенская Екатерина Юрьевна Ведущее учреждение Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН Защита состоится 14 февраля 2012 г. в 15 часов 30 мин. в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строение 12, МГУ им. М.В.Ломоносова, факультет почвоведения. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Автореферат разослан 13 января 2012 г. Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова Долгое время считалось, что ассоциированные с растениями микроорганизмы обитают только на поверхности, ткани здорового растения абсолютно стерильны, а размножение микроорганизмов внутри растения свидетельствует об их патогенности. Исключением являются специализированные симбионты такие, как клубеньковые бактерии или грибы эндотрофной микоризы. Однако в последнее время появляется все больше сведений о том, что внутренние ткани растений также заселены самыми различными микроорганизмами. Такие микроорганизмы принято называть «эндофитными», а характер их взаимодействия с растением расценивается не столько как паразитический, сколько как комменсальный или мутуалистический. Термин «эндофит» в самом общем смысле означает любой организм, развивающийся во внутренних тканях растения. Однако в современном понимании этот термин обычно используют по отношению к микроорганизмам, присутствие которых в растительных тканях бессимптомно и не сопровождается какими-либо патологическими изменениями растений. Растение обеспечивает микроорганизмы питанием и стабильной средой обитания. В свою очередь, метаболиты, выделяемые эндофитами, могут защищать растения от фитопатогенов и фитофагов, а также стимулировать их рост и развитие. Показано, что эндофитные грибы могут увеличивать устойчивость растений к болезням и абиотическим стрессам. Возникновение способности грибов к эндофитному развитию, возможно, связано с переходом растений к наземному образу жизни и представляет собой реализацию стратегии избегания негативного влияния факторов окружающей среды. Постоянное или временное развитие микроорганизмов в относительно стабильных и богатых питательными веществами условиях внутри тканей растения можно рассматривать как следствие их длительной коэволюции. Таким образом, изучение эндофитных микроорганизмов имеет практическую ценность и представляет интерес с позиций фундаментальных вопросов экологии и эволюции. На настоящий момент опубликовано значительное количество работ, посвященных различным аспектам биологии эндофитных бактерий и грибов, как фундаментального, так и прикладного характера. Значительно меньше известно о способности дрожжевых грибов к эндофитному образу жизни, хотя именно дрожжи относятся к числу наиболее 1 типичных эпифитных микроорганизмов, обитающих на поверхности растений в качестве эккрисотрофов. Систематических исследований эндофитных дрожжей до настоящего времени не проводилось, все имеющиеся данные носят отрывочный характер. Дрожжи в целом относятся к типичным копиотрофам, для роста и размножения которых требуется относительно высокая концентрация легкодоступных соединений. В отличие от мицелиальных грибов одноклеточные дрожжи не способны распространяться за счет апикального роста по межклеточному пространству. Однако дрожжевые клетки могут попадать внутрь растения через устьичные аппараты, гидатоды, механические микроповреждения кутикулы и эпидермы. Некоторые виды дрожжей обладают липолитической и пектинолитической активностью, что может позволить дрожжевым клеткам проникать во внутренние ткани с поверхности в результате локального разрушения кутикулы. Учитывая эти особенности, можно предположить, что эндофитные дрожжи должны наиболее активно развиваться в таких растительных субстратах, которые характеризуются высоким содержанием легкодоступных питательных веществ, например, в сочных плодах, запасающих вегетативных метаморфозах, крахмалсодержащих семядолях. Микроаэрофильные условия внутри растительных тканей могут способствовать росту дрожжевых грибов, многие из которых способны к брожению. Знание масштабов распространения и закономерностей развития эндофитных дрожжей может оказаться полезным не только с точки зрения более детальных представлений об особенностях экологии этой группы грибов, но и иметь практический аспект, связанный с разработкой методов хранения и контроля качества сельскохозяйственной продукции, биоконтролем фитопатогенов. В данной работе была предпринята попытка оценки распространения и видового разнообразия дрожжевых грибов в запасающих тканях плодов, семян, вегетативных метаморфозов различных диких и культурных растений. Цель настоящей работы – оценить масштабы и значимость такого явления, как эндофитное развитие дрожжей в запасающих тканях растений. 2 Конкретные задачи работы: охарактеризовать таксономическое разнообразие эндофитных дрожжей; изучить особенности динамики их численности и видового состава; сравнить эпифитные и эндофитные дрожжевые сообщества; определить возможные механизмы формирования эндофитных дрожжевых сообществ; оценить характер взаимодействия эндофитных дрожжей с растениями. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проведено детальное исследование динамики численности и разнообразия эндофитных дрожжевых сообществ в запасающих растительных тканях с использованием современных методов видовой идентификации. Обнаружено, что растительные ткани с запасающими функциями в сочных сахаросодержащих плодах, подземных метаморфизированных органах, крахмалсодержащих семядолях содержат дрожжи, способные к активному размножению в этих тканях без их видимых повреждений. Дрожжевые клетки в запасающих тканях располагаются как в межклеточном пространстве, так и внутри крупных растительных клеток. Выявлены характерные особенности таксономического состава эндофитных дрожжевых сообществ в разных типах растительных субстратов. В тканях сочных плодов эндофитные дрожжи представлены теми же видами, что и эпифитные, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Hanseniaspora и Metschnikowia. Для крахмалсодержащих запасающих тканей семян характерно избирательное развитие одного вида Candida railenensis. В подземных вегетативных органах преимущественное развитие получают краснопигментированные базидиомицетовые дрожжи Rhodotorula mucilaginosa. Показано, что эти дрожжи способны продуцировать стимуляторы роста растений, среди которых была идентифицирована индолил-3-уксусная кислота (ИУК). ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Полученные в работе сведения по биологии эндофитных дрожжей могут быть использованы при разработке механизмов биологической защиты культурных растений от фитопатогенных грибов. Выявление индивидуальных циклов численности эндофитных дрожжей позволит более эффективно осуществлять поиск в природе штаммов, представляющих 3 интерес для биотехнологии. Особый интерес представляет обнаружение фитогормональной активности эндофитных дрожжей, связанной с синтезом ИУК, что может быть использовано для разработки биологических стимуляторов роста растений. Коллекция дрожжей КБП пополнена новыми изолятами редких видов, которые могут быть использованы для скрининга и в учебном процессе. Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по общей экологии, экологии организмов, биологии дрожжей. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были представлены на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, заседаниях Всероссийского общества почвоведов им. В.В.Докучаева, II съезде микологов России (Москва, 2008), XII Международном конгрессе по дрожжам (Киев, 2008), Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009). По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 110 страницах текста, иллюстрирована 22 рисунками, включает 7 таблиц. Список литературы состоит из 157 наименований. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю И.Ю.Чернову и А.М. Глушаковой за внимание и помощь в работе. Автор благодарит А.В.Качалкина, И.А.Максимову, А.М.Юркова, а также В.В.Демина и Ю.А.Завгороднюю за помощь в проведении хроматографических анализов и весь коллектив кафедры биологии почв за ценные советы и рекомендации. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования были выбраны растения, включающие типичные для умеренной полосы дикие и культурные виды. Объектами для анализов служили растительные субстраты с высокой 4 концентрацией углеводов: сочные плоды, крахмалсодержащие семядоли, а также подземные вегетативные метаморфозы с запасающей функцией (табл. 1). Сбор образцов проводили на территории Москвы и Московской области: в ботаническом саду МГУ, национальном парке Лосиный Остров, Измайловском парке, в окрестностях деревни Бурцево Шаховского района, а также вблизи станции Лобня Мытищинского района. Анализ образцов проводили непосредственно в день сбора или в течение ближайших 2–3 дней. Учет и выделение дрожжевых грибов осуществляли стандартным методом посева на глюкозо-пептонную среду, подкисленную молочной кислотой для подавления роста бактерий. Для учета эпифитных дрожжей анализировали покровные ткани образцов. Таблица 1. Характеристика объектов исследования. Исследованные органы Луковицы Allium сера L. (лук) Запасающие корни Anthriscus sylvestris L. (купырь) Запасающие корни Arctium tomentosum Mill. (лопух) Armoracia rusticana Gaertn., B. Mey. et Schreb. (хрен) Запасающие корни Плоды Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot (арония) Корневища Cichorium intybus L. (цикорий) Плоды Crataegus oxyacantha L. (боярышник) Плоды Euonymus verrucosa Scop. (бересклет) Корневые шишки Ficaria verna Huds. (чистяк) Клубни Helianthus tuberosus L. (топинамбур) Корневища Heracleum sosnowskyi Manden. (борщевик) Плоды Hippophae rhamnoides L. (облепиха) Корни Impatiens noli-tangere L. (недотрога) Плоды Lonicera xylosteum L. (жимолость) Плоды Malus domestica Borkh. (яблоня) Клубни Orchis maculata L. (ятрышник) Плоды Prunus domestica L. (слива) Плоды Quercus robur L. (дуб) Плоды Rosa canina L. (шиповник) Клубни Solanum tuberosum L. (картофель) Плоды Sorbus aucuparia L. (рябина) Вид растения Viburnum opulus L. (калина) Плоды 5 Для выделения эндофитных дрожжей образцы предварительно промывали водой и поверхностно стерилизовали 96% этанолом. Затем удаляли покровные ткани стерильным скальпелем, участки внутренних запасающих тканей вырезали и измельчали. Выросшие колонии дрожжей разделяли на морфологические типы с помощью бинокулярной лупы. В чистую культуру выделяли не менее 3-х колоний каждого типа. Чистые культуры идентифицировали по стандартному набору морфологических и физиологических признаков (Kurtzman, Fell, 1998) с использованием расширенного физиологического спектра (Fonseca et al., 2000). Окончательную идентификацию дрожжевых грибов проводили анализом нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК. Микроскопирование эндофитных дрожжей проводили после окрашивания срезов растительных тканей 0.1% толуидиновым синим в течение 5–10 минут. Для получения культуральной жидкости дрожжи выращивали на качалке в жидкой питательной среде (стандартная азотная основа Difco 6,7 г/л, глюкоза 5 г/л) в стандартных условиях при комнатной температуре в течение 5 дней. Культуральную жидкость дрожжей исследовали на способность влиять на прорастание семян и рост проростков горчицы белой. Для этого на дно стерильных чашек Петри помещали фильтровальную бумагу, равномерно распределяли семена, пипеткой вносили по 10 мл отцентрифугированной культуральной жидкости (неразведенной или в разведениях 1/10, 1/100, 1/1000), воды или питательной среды. В качестве контроля использовали воду и жидкую питательную среду. Чашки с семенами помещали в термостат при 26°С. Наличие ИУК в культуральной жидкости дрожжей определяли с помощью высокоспецифичной качественной реакции. К 1мл супернатанта добавляли 1мл реагента Сальковского (12г FeCl3/л 7,9М H2SO4), выдерживали в течение 30 минут в темном месте и отмечали изменение окраски. Количественное определение ИУК проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 series c УФ-детектором (длина волны детектирования – 222 нм). Использовались предколонка Security Guard Catridges C18 4x3.0мм и аналитическая колонка ВЭЖХ 6 Диасфер 110-С18 5мкм 4.0х250мм. Подвижная фаза– вода, ацетонитрил, 0,05% трифторуксусная кислота (45:54:1% v/v). Для калибровки прибора использовали растворы стандартного образца индолил-3-уксусной кислоты фирмы ДиаМ в ацетонитриле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты показали, что дрожжи постоянно присутствуют не только на поверхности растений, но и внутри запасающих растительных тканей. При этом можно выделить, по крайней мере, три типа эндофитных дрожжевых группировок: в сочных плодах, крахмалсодержащих семядолях и в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией. Сочные плоды Дрожжевые грибы были выделены с поверхности и из внутренних запасающих тканей большинства проанализированных плодов. На поверхности плодов дрожжи присутствовали практически всегда (встречаемость по видам растений – 100%, по отдельным плодам – 90%). Их средняя численность здесь составляла порядка 104 КОЕ/г. Встречаемость дрожжей во внутренних тканях плодов была существенно ниже и варьировала у разных видов растений в пределах от 20 до 94% (по отдельным плодам), в среднем составляя около 55%. При этом на поверхности и внутри плодов распределение дрожжей существенно различалось (рис. 1). На поверхности распределение численности по образцам нормальное, тогда как во внутренних тканях – сильно агрегированное. Плоды трех видов растений: шиповника (Rosa canina), сливы (Prunus domestica) и яблони (Malus domestrica) были исследованы в динамике, начиная с периода их формирования и заканчивая почти полным их разложением осенью-зимой. На поверхности плодов дрожжи обнаруживались во все сроки анализа в средней численности 104–106 КОЕ/г. Внутри молодых формирующихся и незрелых плодов дрожжи обнаруживались редко, но по мере созревания их численность закономерно увеличивалась (рис. 2). В старых высохших или разлагающихся плодах численность дрожжей на поверхности и внутри была практически одинаковой. 7 Рис. 1. Распределение численности дрожжей по отдельным образцам на поверхности и внутри сочных плодов. Рис. 2. Динамика общей численности дрожжей на поверхности (1) и внутри (2) плодов, на примере шиповника и сливы; точки – среднемесячные значения, вертикальные отрезки – ошибки среднего. Всего с поверхности и из внутренних тканей плодов было выделено 29 видов дрожжей (табл. 2). Выделенные виды являются преимущественно типичными эпифитными и эврибионтными формами. Особенно типично для сочных плодов сочетание доминирования филобазидиевых криптококков (Cryptococcus magnus), которые очень часто обнаруживается на любых растительных субстратах, апикулятных аскомицетовых дрожжей из рода Hanseniaspora, которые чаще всего встречаются 8 Таблица 2. Среднее относительное обилие видов дрожжей на поверхности и внутри сочных плодов, % Вид Cryptococcus magnus Hanseniaspora uvarum Metschnikowia pulcherrima Candida oleophila Debaryomyces hansenii Rhodotorula colostri Candida sp. Rhodotorula mucilaginosa Schwanniomyces vanrijiae Rhodotorula fujisanensis Cryptococcus victoriae Tremella encephala Cystofilobasidium capitatum Wickerhamomyces anomalus Candida kunwiensis Meyerozyma guilliermondii Cryptococcus albidus Pichia membranifaciens Sporobolomyces roseus Rhodotorula graminis Rhodotorula ingeniosa Rhodotorula vanillica Cryptococcus wieringae Rhodotorula glutinis Trichosporon porosum Rhodotorula sp.1 Sporobolomyces sp. Rhodotorula sp.2 Pichia kluyveri На поверхности 38.15 15.46 12.48 2.77 0.69 2.77 2.77 4.16 0.69 3.47 3.47 2.08 1.39 1.39 0.9 1.04 0.69 0.35 0.83 0.70 0.69 0.07 0.69 0.69 0.69 0.28 0.36 0.14 0.14 Внутри 24.71 35.91 12.68 4.22 5.28 3.16 3.16 1.06 4.22 1.06 0.00 0.00 0.42 0.42 0.74 0.21 0.53 0.85 0.11 0.21 0.11 0.63 0.10 0.10 0.00 0.11 0.00 0.00 0.00 именно на сахаристых плодах, и Metschnikowia pulcherrima – типичных обитателей цветочного нектара. Эндофитные дрожжи, выделенные из внутренних тканей представлены в основном теми же видами, что и на поверхности плодов. 9 Рис. 3. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей на поверхности (1) и внутри (2) плодов шиповника. Тем не менее, определенные различия в соотношении доминирующих видов эпифитных и эндофитных дрожжей имеются. Так, филобазидиевые криптококки, в основном представленные видом Cryptococcus magnus, были более обильны на поверхности плодов. В то же время, среднее относительное обилие апикулятных аскомицетовых дрожжей Hanseniaspora uvarum было выше именно внутри плодов. Анализ динамики обилия доминирующих видов дрожжей на примере шиповника и сливы показал, что их относительное обилие существенно изменяется по мере созревания плодов (рис. 3, 4). Так, филобазидиевые криптококки были наиболее обильны на поверхности молодых и зрелых плодов в течение лета, затем их доля снижалась. Относительное обилие Hanseniaspora uvarum, напротив, закономерно возрастало в ходе онтогенеза плодов и достигало максимума в октябре-ноябре ме10 Рис. 4. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей на поверхности (1) и внутри (2) плодов сливы. сяцах. При этом характер динамики относительного обилия видов на поверхности и внутри плодов был сходным. Сходство видового состава эпифитных и эндофитных дрожжей, а также одинаковый характер динамики отдельных видов снаружи и внутри плода говорит о том, что основной механизм попадания дрожжей в плоды – достаточно частое проникновение дрожжевых клеток через микроповреждения покровов, устьица и т.п. Известно, что случайное попадание микробных клеток в растительные ткани – достаточно обычный процесс. Очевидно, попавшие в плод дрожжевые клетки способны к дальнейшему размножению в межклеточном пространстве и внутри растительных клеток. Отсутствие при этом видимых повреждений тканей плода говорит о том, что основная функция таких дрожжей – «подбор» простых сахаров без гидролиза растительных полимеров. Следует отметить, что виды дрожжей, обилие которых на поверхности плодов несколько больше, чем внутри, относятся к типичным эпифитам и обладают адаптациями к эпифитному образу жизни такими, 11 как каротиноидная пигментация или формирование мощных полисахаридных капсул. Это говорит о том, что эндофитное развитие дрожжей можно также рассматривать как проявление адаптивной стратегии избегания. Считается, что возникновение истинного эндофитного образа жизни у некоторых бактерий и мицелиальных грибов связано именно с избеганием негативного влияния факторов, лимитирующих рост эпифитных микроорганизмов, прежде всего иссушения и инсоляции. С другой стороны, виды, преобладающие на поверхности – строгие аэробы, и, в отличие от способных к брожению аскомицетовых дрожжей, должны хуже развиваться в микроаэрофильных условиях в тканях плодов. Запасающие ткани семян Представленные выше результаты показывают, что поверхностные покровы сочных плодов не являются серьезным препятствием для проникновения дрожжевых клеток во внутренние запасающие ткани. В то же время, нам удалось установить, что в плодах с толстыми плотными покровами также могут присутствовать дрожжевые грибы. В частности, было показано, что в семядолях целых неповрежденных желудей дуба на определенных стадиях их развития обнаруживаются дрожжи, численность которых может достигать 107 КОЕ/г. Нами была изучена динамика численности и видового состава дрожжей, начиная с момента формирования желудей на плодоножках и заканчивая их прорастанием в почве весной будущего года. В семядолях целых желудей в течение всего периода от их формирования до опадания осенью дрожжи практически не обнаруживались. В перезимовавших целых желудях дрожжи встречались чаще и в большей численности, которая достигала 103 КОЕ/г. Однако в мае, непосредственно перед началом прорастания желудей, дрожжи были обнаружены практически во всех проанализированных семядолях, причем их средняя численность резко возросла и в отдельных семядолях достигала 107 КОЕ/г (рис. 5). После периода прорастания численность дрожжей начала уменьшаться и к концу осени снизилась до минимума, несмотря на разрушение покровов желудей. Таким образом, возрастание численности эндофитных дрожжевых грибов в семядолях соответствовало тому периоду, когда в запасающих паренхимных тканях семядолей происходил активный гидролиз крахмала и высвобождение простых сахаров, 12 Рис. 5. Динамика общей численности дрожжей в семядолях желудей; типы желудей: 1 – на дереве, 2 – опавшие, 3 – опавшие прорастающие. необходимых для развития зародыша семени. По-видимому, повышение количества доступных питательных веществ стимулировало интенсивное размножение дрожжей, клетки которых присутствовали в семядолях желудей. В отличие от сочных плодов, эндофитные дрожжи в желудях оказались представлены в основном только одним аскомицетовым видом, который был идентифицирован по физиологическим признакам и последовательности D1D2 региона рДНК как Candida railenensis. Этот вид филогенетически наиболее близок к виду Candida oleophila, который широко распространен в филлосфере растений. Из молодых желудей на дереве удавалось выделить дрожжи лишь этого вида. Он же был также обнаружен в качестве абсолютного доминанта в опавших перезимовавших желудях до периода их прорастания. Постепенно, по мере прорастания или разложения желудей относительное обилие C. railenensis в них уменьшалось, и после нарушения экзокарпия они заселялись типичными эпифитными и подстилочными базидиомицетовыми видами, среди которых преобладали Cryptococcus magnus и Cystofilobasidium capitatum (рис. 6). Очевидно, плотные кожистые покровы желудей являются более серьезным препятствием для проникновения дрожжевых клеток, чем пок13 Рис. 6. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей в семядолях желудей. 1 – Candida railenensis, 2 – Cryptococcus magnus, 3 – Cystofilobasidium capitatum, 4 – прочие. ровы большинства сочных плодов. Поэтому наряду со случайным проникновением клеток дрожжей через микроповреждения покровов можно допустить, что дрожжи попадают в желудь в процессе его формирования с цветка дуба, сохраняются в семядолях и размножаются при активизации процесса развития зародыша, который, как известно, сопровождается гидролизом крахмала. В любом случае, к активному размножению внутри семядолей способен лишь один вид Candida railenensis. Вегетативные метаморфозы с запасающей функцией Другим типом растительных субстратов, в которых обнаруживаются эндофитные дрожжи, являются подземные запасающие метаморфизированные органы растений (клубни, запасающие корни, корневища, корневые шишки, луковицы). На поверхности корней, также как и на поверхности метаморфозов дрожжи присутствуют практически всегда. При этом состав доминирующих видов дрожжей в ризоплане существенно иной по сравнению с филлопланой. На поверхности корней и в ризосфере наиболее часто встречаются типичные педобионтные (Cryptococcus terricola, Cr. podzolicus) виды. При этом последние практически не обнаруживаются на надземных органах растений, тогда как эпифитные дрожжи постоянно выделяются также и с поверхности подземных вегетативных органов. 14 Средняя численность дрожжевых грибов во внутренних тканях подземных запасающих органов обычно не превышала 103 КОЕ/г. Показатель встречаемости эндофитных дрожжей по отдельным образцам варьировал в зависимости от вида растения и не превышал 40%. Видовое разнообразие дрожжей во внутренних тканях также было значительно более низким, чем на поверхности метаморфозов (табл. 3). В большинстве случаев из каждого образца выделялось не более одного-двух видов эндофитных дрожжей. Всего из внутренних запасающих тканей было выделено 6 видов дрожжей, тогда как с поверхности – 14. Все виды, обнаруженные внутри, встречались и на поверхности метаморфозов. Как на поверхности, так и внутри доминировали краснопигментированные анаморфные споридиоболовые дрожжи Rhodotorula mucilaginosa. При этом встречаемость этого вида внутри вегетативных органов была в полтора, а среднее относительное обилие в два раза выше, чем на поверхности. В то же время, типичные педобионтные виды дрожжей в запасающих тканях обнаружены не были. Таблица 3. Встречаемость видов дрожжей на поверхности и внутри подземных запасающих вегетативных метаморфозов, %. Вид Rhodotorula mucilaginosa Debaryomyces hansenii Cryptococcus magnus Candida oleophila Cryptococcus terricola Rhodotorula glutinis Cystofilobasidium macerans Schwanniomyces vanrijiae Pichia membranaefaciens Rhodotorula minuta Trichosporon sp. Cryptococcus podzolicus Metschnikowia pulcherrima Sporobolomyces roseus На поверхности 8.5 10.2 5.1 10.2 8.2 5.1 1.6 3.1 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Внутри 13.3 3.8 3.9 0.0 0.0 0.0 1.2 0.0 0.0 1.6 0.0 0.0 0.0 0.8 15 Фитогормональная активность эндофитных дрожжей Известно, что эндофитные микроорганизмы могут оказывать прямой положительный эффект на хозяина за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений, в том числе различных регуляторов роста. Сведения о способности дрожжевых грибов к синтезу регуляторов роста растений немногочисленны. Показано, что некоторые виды дрожжей, в частности Lindnera saturnus, обнаруженные в корнях кукурузы, способны продуцировать фитогормоны, стимулирующие развитие корневой системы. В связи с этим нами было проведено исследование влияния доминирующих в подземных метаморфозах видов дрожжей на прорастание семян и рост проростков. При проращивании семян в культуральных жидкостях дрожжей Debariomyces hansenii и Cryptococcus magnus длина проростков во всех разведениях не превышала длину в контрольном опыте с водой. Однако для вида Rhodotorula mucilaginosa в ряде случаев показатели превышали контрольные значения. Наибольшая длина проростков была отмечена при прорастании семян в разведенной культуральной жидкости дрожжей Rh. mucilaginosa. Данный показатель возрастал по мере увеличения степени разбавления, минимальные значения были отмечены в неразведенной культуральной жидкости. Следует отметить, что прорастание семян в разведенной культуральной жидкости Rh. mucilaginosa начиналось раньше по сравнению с контрольным опытом в воде. На основании этих данных было сделано предположение, что доминирующий в подземных метаморфизированных органах растений вид Rh. mucilaginosa, возможно, способен к синтезу фитогормона ауксина, который стимулирует развитие корневой системы и индуцирует рост растений путем растяжения клеток. Для подтверждения этой гипотезы были использованы химико-аналитические методы. Все штаммы дрожжей, выделенные из подземных запасающих метаморфизированных органов, были исследованы на способность продуцировать ауксин с помощью высокоспецифичной качественной реакции. Появление красной окраски фильтрата после добавления реагента Сальковского и соответственно способность продуцировать ИУК продемонстрировали штаммы дрожжей относящиеся исключительно к доминиру16 ющему виду Rh. mucilaginosa. Аналогично появление красной окраски также было отмечено в стандартных растворах ИУК (контроль).При добавлении реагента в культуральные экстракты других видов дрожжей и в стерильную среду (контроль) изменения окраски не происходило. Способность эндофитных дрожжей Rh. mucilaginosa синтезировать индолил-3-уксусную кислоту была также подтверждена с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). По результатам высокоспецифичной качественной реакции был выбран один из штаммов, способных к биосинтезу ИУК. Была проведена идентификация и количественное определение ауксина в культуральной жидкости этого штамма дрожжей. На хроматограмме испытуемого образца наблюдается отчетливый пик, совпадающий по времени удержания со стандартным образцом ИУК (рис. 7). При проведении соответствующих пересчетов была определена концентрация ИУК в исследуемом образце культуральной жидкости, которая составила 0,9 мкг/мл. Рис. 7. Хроматограммы: 1 – испытуемого раствора (экстракт культуральной жидкости дрожжей Rhodotorula mucilaginosa), 2 – раствора стандартного образца ИУК. 17 Таким образом, эндофитные дрожжи обладают фитогормональной активностью и способны стимулировать рост растений. Максимальная стимулирующая активность выявлена у штаммов Rh. mucilaginosa, синтезирующих ауксин, который индуцирует развитие корневой системы и рост проростков. У большинства исследованных штаммов стимулирующий эффект проявлялся в опытах с разбавленной культуральной жидкостью, тогда как неразбавленная культуральная жидкость, как правило, оказывала ингибирующее действие. По всей видимости, в неразведенной культуральной жидкости концентрация ИУК оказалась достаточно велика. Как известно, в больших концентрациях индолилуксусная кислота может действовать как ингибитор роста растений. Рост растяжением растительных клеток осуществляется главным образом тургорными процессами и сопровождается усилением поглощения воды и солей. В малых концентрациях ИУК усиливает поглощение воды, при дальнейшем увеличении концентрации наблюдается торможение поступления воды, а при больших − полное прекращение. Прямые микроскопические наблюдения эндофитных дрожжей Непосредственным микроскопированием дрожжевые клетки удалось обнаружить в тканях большинства видов проанализированных растений (рис. 8). На срезах запасающих тканей были видны круглые и короткоовальные дрожжевые клетки диаметром до 2–3 мкм. Реже обнаруживались псевдомицелиальные нити и цепочки клеток. В период созревания плодов, когда численность эндофитных дрожжей увеличивалась, большинство клеток почковалось, часто встречались скопления клеток, что свидетельствует об их активном размножении в тканях. В незрелых плодах дрожжевые клетки наиболее часто встречались в поверхностных слоях или непосредственно под экзокарпием. В зрелых плодах, в которых начиналась мацерация внутренних тканей, встречались большие скопления активно почкующихся клеток. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные данные показывают, что эндофитное развитие дрожжей следует рассматривать как широко распространенное явление. Дрожжевые грибы регулярно выделяются не только с поверхности растений, но и из внутренних запасающих тканей с высоким содержанием 18 Рис. 8. Клетки дрожжей в плодах бересклета (а), в клубнях картофеля (б), в клетках корня недотроги (в), в семядолях желудей (г). легкодоступных питательных веществ. Эндофитные дрожжи способны к активному размножению в таких тканях без проявления видимых признаков их повреждения. Численность дрожжей в запасающих тканях растений в среднем ниже, чем на поверхности, однако в некоторых случаях может достигать значительных величин (до 106–107 КОЕ/г). При этом можно выделить, по крайней мере, три типа эндофитных дрожжевых группировок: 1) в сочных сахаристых плодах, 2) в крахмалсодержащих семядолях, 3) в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией (клубнях, корневищах, запасающих корнях и т.п.). Эндофитные дрожжевые группировки в тканях сочных плодов неспецифичны по составу и представлены теми же видами, что и эпифитные, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Hanseniaspora и Metschnikowia. Однако филобазидиевые криптококки и краснопигментированные виды рода Rhodotorula более обильны 19 на поверхности, а бродящие аскомицетовые дрожжи – внутри плодов. Сходство видового состава эпифитных и эндофитных дрожжей, а также одинаковый характер динамики отдельных видов снаружи и внутри плода говорит о том, что основной механизм попадания дрожжей в плоды – достаточно частое проникновение дрожжевых клеток через микроповреждения покровов. По-видимому, «уход» во внутренние ткани плода способствует лучшему выживанию эпифитных дрожжей, особенно аскомицетовых, не имеющих таких адаптаций, как каротиноидная пигментация или капсульные полисахариды. Способность к эндофитному развитию дрожжей можно рассматривать как проявление стратегии избегания неблагоприятных факторов, которые лимитируют рост микроорганизмов на поверхности растений. Эндофитные дрожжевые группировки в крахмалсодержащих семядолях специфичны по составу и характеризуются избирательным развитием преимущественно одного вида дрожжей. В семядолях желудей эндофитные дрожжи представлены в основном одним видом – Candida railenensis. Численность эндофитных дрожжей резко возрастает перед прорастанием желудей, когда в запасающих паренхимных тканях семядолей идет активный гидролиз крахмала, и достигает 107 КОЕ/г. После прорастания или разрушения экзокарпия семядоли заселяются обычными эпифитными и подстилочными базидиомицетовыми видами, среди которых преобладают Cryptococcus magnus и Cystofilobasidium capitatum. Эндофитные дрожжевые группировки в запасающих тканях вегетативных метаморфозов так же, как и в сочных плодах, неспецифичны по таксономическому составу, для них характерно доминирование краснопигментированных анаморфных споридиоболовых дрожжей Rhodotorula mucilaginosa. Встречаемость этого вида внутри запасающих метаморфозов в полтора, а среднее относительное обилие в два раза выше, чем на поверхности. Показано, что эти дрожжи обладают фитогормональной активностью и способны стимулировать рост растения. В частности, методом ВЭЖХ было установлено присутствие индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости Rh. mucilaginosa. Микроскопические исследования подтверждают, что дрожжи, выделенные из запасающих растительных тканей, действительно являются эндофитными, то есть существуют как в межклеточном пространс20 тве, так и внутри крупных растительных клеток. В тканях растений они способны к активному размножению в период высвобождения сахаров при созревании плода: в этот период дрожжевые клетки почкуются и образуют скопления. Полученные результаты корректируют сложившиеся представления об особенностях распространения дрожжевых грибов в природных местообитаниях и позволяют рассматривать внутренние запасающие ткани растений как достаточно обычное местообитание дрожжей, как перспективный источник для поиска новых таксонов и как новую интересную модель для исследования коэволюционирующих микробно-растительных ассоциаций. Знание масштабов распространения и особенностей биологии эндофитных дрожжей важно с практической точки зрения в связи с разработкой методов биоконтроля фитопатогенов, хранения и контроля качества сельскохозяйственной продукции. ВЫВОДЫ 1. Дрожжевые грибы постоянно присутствуют не только на поверхности растений, в качестве типичных эккрисотрофных эпифитов, но и во внутренних тканях, которые характеризуются высокой концентрацией легкодоступных соединений, в сочных плодах, крахмалсодержащих семядолях и в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией. 2. Эндофитные дрожжи в тканях сочных плодов представлены теми же видами, что и на поверхности, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Hanseniaspora и Metschnikowia, но с некоторым преобладанием аскомицетов и с меньшим обилием базидиомицетов. Наиболее вероятный механизм формирования эндофитных сообществ – регулярное попадание дрожжевых клеток внутрь плода через микроповреждения покровных тканей. 3. Численность эндофитных дрожжей внутри плодов в среднем меньше, чем на поверхности, она закономерно возрастает в ходе онтогенеза плодов, достигая максимума после их полного созревания. 4. Дрожжевые грибы активно размножаются в запасающих тканях крахмалсодержащих семядолей в период, предшествующий прорастанию семени. В семядолях целых неповрежденных желудей эндофитные дрожжи представлены в основном одним видом – Candida railenensis. 21 После прорастания или разрушения экзокарпия семядоли заселяются типичными эпифитными и подстилочными дрожжами. 5. Эндофитные дрожжи также регулярно обнаруживаются в подземных запасающих метаморфизированных органах (клубнях, корневищах и т.п.). Эти группировки неспецифичны по таксономическому составу, для них характерно доминирование краснопигментированных анаморфных споридиоболовых дрожжей Rhodotorula mucilaginosa. 6. Доминирующие в подземных запасающих метаморфозах дрожжи Rhodotorula mucilaginosa продуцируют ауксин (индолил-3-уксусную кислоту) и способны стимулировать рост растения за счет прямого влияния на его метаболические процессы. 7. Микроскопические исследования показали, что дрожжи, обнаруживаемые в запасающих тканях, действительно являются эндофитными, то есть существуют как в межклеточном пространстве, так и внутри крупных растительных клеток. 8. Полученные данные меняют представления о формах взаимодействия дрожжевых грибов и растений и позволяют расценивать внутренние запасающие ткани растений в качестве достаточно обычного местообитания как широко распространенных, так и экологически специализированных видов дрожжей. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Исаева О.В. Эндофитные дрожжевые грибы в плодах дуба черешчатого. Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008, c. 275. 2. Isaeva O.V. Yeasts in storage tissues of plants. Abstracts of 12th International Congress on Yeasts. Kyiv, 2008, p. 38. 3. Исаева О.В. Эндофитные дрожжевые грибы в запасающих тканях растений. Материалы Междисциплинарного микологического форума. Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2009, № 1, с. 29. 4. Исаева О.В., Глушакова А.М., Юрков А.М., Чернов И.Ю. Дрожжи Candida railenensis в плодах дуба черешчатого (Quercus robur L.). Микробиология, 2009, т. 78, № 3, с. 399–403. 5. Исаева О.В., Глушакова А.М., Гарбуз С.А., Качалкин А.В., Чернов И.Ю. Эндофитные дрожжевые грибы в запасающих тканях растений. Известия РАН, серия биологическая, 2010, № 1, с. 1–10. 23
