012174 - 1 - Для фармакологического лечения церебрального

012174
Для фармакологического лечения церебрального инфаркта исторически использовались препараты
с очень низкой клинической эффективностью, среди которых следует упомянуть цитиколин. Недавнее
исследование, результаты которого были опубликованы в 2002г. (Dávalos A., Castillo J., Alvarez-Sabin J.,
Secades J.J., Mercadai J., Lopez S., Cobo E., Warach S., Sherman D., Clark W.M., Lozano R., Oral citicoline in
acute ischemic stroke: an individual patient data pooling analisis of clinical trials. Stroke 33 (12): 2850-2857,
2002 (Давалос А., Кастильо Х., Альварес-Сабин X., Секадес Х.Х., Меркадаи X., Лопес С., Кобо Э., Уорач С.,
Шерман Д., Кларк У.М., Лосано Р. "Оральное применение цитиколина при остром ишемическом приступе: анализ личных данных клинических исследований отдельного пациента", Инсульт 33 (12): 2850-2857,
2002)), показало, что этот препарат после 3 месяцев применения приводит к улучшению состояния пациентов, перенесших церебральный инфаркт, в среднем на 25%, в то время как состояние пациентов, получавших плацебо, улучшилось, в среднем на 20%. Как видно из этих результатов, данное фармакологическое лечение не способно уменьшить повреждение головного мозга, вызванного церебральным инфарктом, более чем на 20-30%.
С другой стороны, исследовательская деятельность и разработка других новых препаратов для сокращения последствий церебрального инфаркта также не дали положительных результатов. Например, в
2001 году Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами Соединенных Штатов одобрило использование 5 лекарств от сердечных заболеваний и ни одного препарата для лечения церебрального инфаркта. Следствием такой ситуации является то обстоятельство, что в настоящее время не существует альтернативного медикаментозного лечения этого тяжелого заболевания.
Настоящее изобретение имеет своей целью продемонстрировать применение дапсона в качестве
первого эффективного способа лечения у таких пациентов последствий, вызванных церебральным инфарктом, приводящих к недееспособности.
Дапсон является препаратом, который в настоящее время используется при химико-терапевтическом лечении проказы и для профилактики пневмонии, вызываемой pneumocytis carinii. Поскольку проказа является заболеванием, встречающимся все реже и реже, терапевтическое использование дапсона с
недавних пор является весьма ограниченным.
Острый церебральный инфаркт (мозговой инфаркт) является третьей по распространенности причиной смерти и главной причиной недееспособности населения земного шара. Учитывая серьезное влияние, которое церебральный инфаркт оказывает на общество относительно расходов на реабилитацию и
медицинское лечение, было решено проводить поиски нового терапевтического агента, более эффективного, чем существующие препараты, синтезировав дапсон с обновленной формулой.
Целью настоящего изобретения является разработка продукта, пригодного для терапевтического
использования при лечении острого церебрального инфаркта. Это заболевание широко распространено
среди населения во всем мире. Ежегодно только в одних в Соединенных Штатах церебральный инфаркт
переносят от 500000 до 750000 человек. Именно поэтому было решено искать альтернативные терапевтические методы, более эффективные, чем существующие в настоящее время.
При разработке нового, более эффективного, чем существующие, терапевтического агента для фармакологического лечения церебрального инфаркта дапсон синтезировали со следующей формулой:
В 80-е годы в Мексике производство препарата дапсон в виде лекарства было прекращено; также
перестали производить и сырье.
Настоящая работа на базе экспериментальной модели и с помощью плацебоконтролируемого клинического исследования пациентов, перенесших острый церебральный инфаркт, доказывает, что дапсон
является эффективным средством предотвращения неблагоприятных последствий заболевания, если его
вводят в течение первых 12 ч после ишемического приступа.
Изобретение иллюстрируется графиками, где на фиг. 1 представлены результаты оценки неврологических симптомов у крыс, на фиг. 2 - результаты объема повреждения, на фиг. 3 - результаты исследований пациентов с острым тромбоэмболическим церебральным инфарктом.
Фармакологические тесты проводили с использованием экспериментальной модели острого церебрального инфаркта, созданной посредством временной закупорки средней мозговой артерии у крыс за
счет введения хирургической нити через внутреннюю сонную артерию животных (см. пример 1).
Лекарство также вводили пациентам с острым церебральным инфарктом, которые обратились в отделение скорой помощи Национального Института Неврологии и Нейрохирургии «Мануэль Веласко
Суарес» города Мехико (см. пример 2).
Результаты экспериментов на крысах доказывают, что эффективность дапсона (I) с дозой 9,325 мг/кг
составила 93%, в то время как эффективность дозы в 12,5 мг/кг была равна 91% в части, касающейся сокращения размеров повреждения головного мозга, возникшего вследствие инфаркта в экспериментальной модели инфаркта, вызванного у крыс.
Что касается эффективности показателей у пациентов, то результаты демонстрируют, что дапсон
-1-
012174
при дозе, равной 200 мг, был способен уменьшить неврологические симптомы у больных, в среднем, на
67%.
Эффективная доза дапсона равна 0,013 моль/кг.
Негативная реакция на применяемые дозы не наблюдалась.
Применяли, в частности, следующие методики.
Синтез Дапсона
Дапсон может быть синтезирован различным образом, но здесь в качестве примера предлагается
следующий способ синтеза, который проводили в два этапа.
1. Помещали 60 г ацетанилида в колбу Эрленмейера и медленно нагревали на огне до тех пор, пока
твердое вещество не расплавилось полностью. Получившуюся вязкую жидкость охлаждали в сосуде со
льдом, при этом старались создать условия для того, чтобы затвердевающее вещество осталось на дне
колбы. Добавляли одной порцией 165 мл хлорсульфоновой кислоты, не вынимая колбу из ванночки со
льдом. Затем вынимали колбу изо льда, осторожно взбалтывали и отставляли на 10 мин, чтобы произошла реакция. По прошествии указанного времени смесь, полученную в результате реакции, снова нагревали до полного растворения остаточного ацетанилида и опять отставляли на 10 мин, чтобы произошла
реакция. Полученный продукт охлаждали, а затем осторожно переливали в емкость со льдом и водой,
профильтровав и промыв холодной водой осадок. Собирали осадок, растворяли его в хлороформе и экстрагировали 3 раза водой, собирая хлороформную фракцию, которую помещали в ванночку со льдом,
осадив очищенный хлорид тионила (точка кипения промежуточного вещества: 149°С).
2. Помещали 123,6 мл безводного нитробензола в реакционный сосуд, добавляли 89,2 г хлорида
алюминия и медленно нагревали. Соединяли горячую смесь с 41,3 г хлорида тионила, нагревали смесь,
полученную в результате реакции, до температуры 140-145°С, а затем медленно добавляли 13 г ацетанилида. Далее поддерживали температуру реакции в течение 2 ч. По окончании этого времени выливали
вещество, полученное в результате реакции, в 104 мл воды, подкисленной соляной кислотой, в результате чего в осадок выпали кристаллы темного цвета, которые были снова кристаллизованы после растворения в разбавленной уксусной кислоте. Эти кристаллы подвергали дистилляции с соляной кислотой 5N в
течение 30 мин, затем нейтрализовали смесь, полученную в результате реакции. Вследствие этого в осадок выпали белые кристаллы (неочищенный дапсон), которые снова кристаллизовали, растворив предварительно в этиловом спирте.
Химические характеристики синтезированного соединения
Для определения аутентичности синтезированных соединений устанавливали точку их плавления
равной 151-153°С для промежуточного вещества реакции, хлорида тионила, и 172-175°С для дапсона.
Точки плавления, определенные для этих соединений, равны 149 и 175-176°С для промежуточного
вещества и для дапсона, соответственно.
-2-
012174
Предпочтительный вариант воплощения изобретения
Пример 1.
Оценка нейропротекторного действия дапсона в модели острого церебрального инфаркта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии у крысы.
Дапсон оценивали в качестве нейропротектора в модели церебрального инфаркта, вызванного окклюзией средней мозговой артерии. Лекарство растворяли в подходящем веществе.
Задействовали 3 группы по 5 животных, которые проходили лечение изотоническим раствором соли (SSI, контрольная группа), дапсоном с дозировкой 12,5 мг/кг и дапсоном с дозировкой 9,375 мг/кг,
соответственно, введенными внутрибрюшинным путем через 30 мин после окклюзии средней мозговой
артерии, которую производили так, как описано ниже.
У животных вызывали временную селективную ишемию головного мозга с помощью введения хирургической нити в просвет через сонную артерию. Всем животным во время хирургической операции
делали анестезию 1,5% галотаном через лицевую маску. Животных клали на спину и фиксировали в такой позиции. Затем им выбривали область в верхней части шеи, чтобы сделать разрез по средней линии,
которая идет от рукоятки грудины к области грудино-подъязычной мышцы, а затем продолжается к ее
боковому краю. В этом месте определяли медиальный край грудино-ключично-сосцевидной мышцы и
поверхностную шейную фасцию, ее нижнюю пластинку, ту самую, которую было необходимо разрезать
для обнажения общей сонной артерии снизу и изнутри каудального брюшка двубрюшной мышцы.
Производили рассечение общей сонной артерии до подъязычной петли. Определяли бифуркацию
сонной артерии, наружную сонную артерию и ее ветви, затылочную и щитовидную артерии. Последние
две артерии соединяли мононитью 8-0, а также с помощью электрокоагуляции с обеспечением возможности ее дальнейшей обрезки.
Рассекали внутреннюю сонную артерию на длину приблизительно в 5 мм и в этот момент определяли крыловидно-небную артерию. В нее помещали микрочип или, при его отсутствии, артерию сшивали мононитью 6-0. После остановки кровотока в этих артериальных сосудах приступали к введению нейлоновой мононити 3-0 в направлении к внутренней сонной артерии через культю наружной сонной артерии на длину в 17 мм, начиная с точки бифуркации. Затем зашивали рану и оставляли животное восстанавливаться после операции, обеспечив неограниченным количеством воды и пищи. Во всех случаях
ишемия подтверждалась макроскопическим наблюдением и по положению нити.
Оценка нейропротекторного действия дапсона у крыс.
В течение 96 ч после стимуляции ишемии каждые 24 ч с помощью функциональной шкалы осуществляли оценку неврологических признаков у животных. По этой шкале выставляли баллы от 0 до 5 в
соответствии с тяжестью симптомов, наблюдаемых у животного: 0 = без неврологических отклонений;
1 = затруднение полного выпрямления верхней конечности; 2 = круговое движение направо; 3 = падение
направо; 4 = животное не передвигается самостоятельно и имеет угнетенное сознание; 5 = смерть.
Определение объема поврежденных тканей.
По прошествии 96 ч наблюдения животных умерщвляли большой дозой пентобарбитала натрия,
введенного внутрибрюшинным путем. Затем с помощью трепанации черепа у них извлекали головной
мозг. После извлечения мозг помещали в чистый спирт на 2 недели. Затем проводили обычную гистологическую процедуру и делали срезы толщиной 10 мкм, с аккумуляцией срезов каждые 200 мкм. Последние окрашивали с помощью гематоксилинэозина. Все срезы были изучены патологоанатомом, которого
не информировали, к какой группе относятся образцы, чтобы определить макроскопически и микроскопически области ишемии.
Для каждого гистологического среза определяли области с помощью цифровой системы и фотографического увеличителя. Во всех случаях увеличение составляло 1:10. В отношении каждого среза проводили 3 измерения: А) общая область, включая вентрикулы, В) область вентрикул, С) область ишемического поражения, в соответствии с данными, полученными патологоанатомом.
Для определения объема поражения использовали следующую формулу:
где Р - сумма областей, мм2, 0,2 мм - фиксированная длина между срезами, а деление на 10 связано
увеличением каждого среза для измерения объема. После применения формулы получили три различных
объема: общий объем, объем вентрикул и объем ишемии. Вычли объем вентрикул из общего объема,
чтобы получить объем паренхимы головного мозга. Это последнее значение, а также и объем ишемии,
использовали для получения процента повреждения.
Пример 2.
Оценка нейропротекторного действия дапсона у пациентов, перенесших острый церебральный инфаркт.
В данном исследовании оценивали нейропротекторное действие дапсона у пациентов, перенесших
острый церебральный инфаркт вследствие тромбоэмболии, которые были помещены в отделение скорой
помощи Национального института неврологии и нейрохирургии «Мануэль Веласко Суарес». Дапсон
вводили пациентам оральным путем 1 дозой в объеме 200 мг в виде суспензии. Суспензия сохраняла
-3-
012174
свою стабильность в холодильнике при температуре 4°С в течение месяца.
Дапсон давали 15 пациентам, выбранным методом случайной выборки, в то время как другие 15 пациентов принимали противокислотную суспензию с лекарством плацебо. Пациенты случайным образом
были распределены для одного и другого типа лечения, при этом использовали случайные числа, полученные при помощи карманного калькулятора. Оба препарата вводили в течение первых 12 ч после церебрального инфаркта. По результатам этих процедур проводили двойное слепое и плацебоконтролируемое клиническое исследование с использованием случайной выборки.
Оценка клинических признаков и симптомов осуществлялась также методом случайной выборки
специалистом-невропатологом по шкале Национального института здоровья, которая давала количественную оценку интенсивности изменений, вызванных церебральным инфарктом. Указанную шкалу применяли в момент регистрации пациента для участия в программе исследования (нулевой день), а затем
через 2, 6 и 30 дней после церебрального инфаркта. Инфаркт считался умеренно тяжелым или тяжелым,
если по шкале Национального института здоровья получали значение больше 7.
Статистический анализ.
Применяли дозировки дапсона в диапазоне от 1 до 12,5 мг/кг, которые вводили пациентам оральным путем (в случае с пациентами-людьми) и внутрибрюшинным путем (в случае с крысами).
Чтобы дать оценку симптомам по неврологической шкале и проценту объема поражения у крыс,
определяли статистическую значимость с помощью теста Краскэла-Уоллиса, проведенного после применения критерия U Манна-Уитни.
Результаты шкалы Национального института здоровья для двух групп пациентов подвергли статистическому анализу с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). При этом в
качестве сопутствующих дню поступления (нулевой день) переменных шкалы Национального института
здоровья, использовали такие данные, как пол, возраст, артериальное давление и другие клинические
параметры, важные для характеристики пациента.
Для установления предела статистической значимости брали значения р≤0,01 и 0,05.
Результаты оценки неврологических симптомов у крыс показаны на фиг. 1. На чертеже изображены
пункты неврологического теста в зависимости от времени, прошедшего после стимуляции инфаркта у
крыс. Результаты даны как среднее значение 4 независимых экспериментов. D=Дапсон (9,375 и 12,5 - это
дозы в мг/кг, ip), *p<0,05 (тест Краскэла-Уоллиса, проведенный после анализа Манна-Уитни).
Данные неврологического теста у крыс показывают, что животные, при лечении которых применяли дапсон в двух вариантах дозировки, восстанавливались после ишемического повреждения более успешно по сравнению с контрольной группой.
Результаты объема повреждения представлены на фиг. 2. На чертеже изображен процент ишемического повреждения через 96 ч после вызывания инфаркта у крыс. Результаты даны как среднее значение±стандартная погрешность 4 независимых экспериментов. D=Дапсон (9,375 и 12,5 - это дозы в мг/кг,
ip), *p<0,05 (тест Краскэла-Уоллиса, проведенный после анализа Манна-Уитни).
Полученные данные показывают, что дапсон снизил тяжесть неврологических симптомов на 93%
при дозе в 9,375 мг/кг и на 90% при дозе в 12,5 мг/кг, соответственно, по сравнению с контрольной группой.
Результаты исследований пациентов с острым тромбоэмболическим церебральным инфарктом
представлены на фиг. 3. На нем изображены пункты неврологической шкалы Национального института
здоровья в зависимости от времени (в днях), прошедшего с момента приема дапсона или плацебо. Результаты даны как среднее значение для группы из 15 пациентов±стандартная погрешность. D=Дапсон,
*р<0,05, **р<0,01 (метод дисперсионного анализа с использованием сопутствующих переменных).
Результаты анализа пациентов, получавших при лечебном курсе 200 мг дапсона, вводившегося
оральным путем, демонстрируют значительное клиническое улучшение состояния больных. Показатель
этого улучшения составил в среднем 67%.
Оценивая нейропротекторное действие дапсона, можно отметить следующее.
Наблюдали значительное уменьшение тяжести неврологических симптомов у крыс - снижение на
50% по сравнению с контрольной группой. Также наблюдалось уменьшение на 93 и 90% объема повреждения у тех же самых животных.
Эти результаты указывают на то, что дапсон воздействует эффективнее, чем существующие в настоящее время на рынке препараты, при лечении острого церебрального инфаркта. Это подтверждается
для дозы дапсона в диапазоне от 1 до 12,5 мг/кг, введенной в течение первых 12 ч после острого церебрального инфаркта. Хотя дапсон может использоваться и при введении повторных доз.
В заключении описания изобретения следует отметить, что терапевтическое применение дапсона
при медикаментозном лечении острого церебрального инфаркта считается новшеством, а потому при
воплощении изобретения требуется точное соблюдение изложенного в пунктах формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение дапсона для создания медицинского препарата для лечения острого церебрального
инфаркта.
-4-
012174
2. Применение по п.1, при котором медицинский препарат предназначен для перорального введения.
3. Применение по п.2, при котором медицинским препаратом для перорального введения является
суспензия.
4. Применение по п.3, при котором суспензия содержит 200 мг дапсона.
Фиг. 1
Фиг. 2
-5-
012174
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-6-