“УТВЕРЖДАЮ” Директор НПО “Иммунотэкс” ________________ Батурин М.В. «____»___________ 200 г. ИНСТРУКЦИЯ Набор реагентов предназначен для диагностики медикаментозной аллергии и непереносимости лекарственных препаратов у 24 пациентов (по 7 препаратов + контроль). В последние годы все более пристально внимание врачей к проблеме аллергии к лекарственным препаратам. Это обусловлено различными причинами, в том числе и тем, что все шире ассортимент поддельных или некачественных лекарственных средств. Аллергические реакции или реакции гиперчувствительности на лекарственные препараты – это иммунологический ответ на препарат или его метаболиты, приводящий к развитию клинически значимых нежелательных реакций (отечность, сыпь, зуд и т.д.). Для этих реакций характерны следующие черты: - в их основе лежат иммунологические механизмы. - возникают после предшествующего контакта с данным лекарственным препаратом или препаратом с подобным химическим строением. - развиваются быстро, при повторной встрече с аллергеном. Диагностика лекарственной аллергии основывается на комплексе мероприятий, включающих: анамнез, клинические данные и результаты лабораторного обследования. Показаниями для применения лабораторных методов выявления лекарственной аллергии являются: - больные с непереносимостью лекарств, - больные с отягощенным аллергоанамнезом; - больные с профессиональной аллергией (для постановки диагноза и трудоустройства); - неясные случаи для диагностики, подозрения на висцеральные формы лекарственной аллергии; - необходимость исключения псевдоаллергических реакций при введении лекарств и медикаментов больным с предрасположенностью к ним; -желание больного и/или врача (перед введением лекарства, операцией и др.). - шок, тяжелые токсикодермии в анамнезе на неизвестный препарат и необходимость лекарственной терапии; - непереносимость лекарств у детей раннего возраста и взрослых, когда кожные пробы недемонстративны или отрицательны на гистамин; - при обширных поражениях кожи (тяжелые токсикодермии) и необходимости подбора переносимых препаратов (антибиотики и др.); - на фоне приема антимедиаторных средств, при необходимости введения потенциально опасных лекарств и медикаментов. Специфические методы аллергодиагностики in vitro направлены на: - выявление свободных антител в сыворотке крови и секретах, - обнаружение антител, связанных с лейкоцитами (базофилами, нейтрофилами, тромбоцитами и др.), - определение Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену. Известно, что реакции реагинового типа индуцированы сенсибилизированными Т-лимфоцитами, следует предположить, что комплекс лабораторных тестов, включающий выявление Т- клеточной сенсибилизации, позволяет определить наличие немедленного и клеточно-опосредованого типов лекарственной аллергии у больного. Метод основан на специфическом изменении адгезивной способности поверхностных рецепторов клеток после предварительной инкубации с лекарственным препаратом. Оценка реакции рецепторов клеток на препарат проводится in vitro в тестах “активного” и “cпонтанного”ЕРОК. Лабораторные тесты, включающие выявление специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов позволяют определить наличие лекарственной аллергии иммунокомплексных и цитотоксических реакций у больного. Метод основан на специфическом образовании иммунных комплексов после предварительной инкубации с лекарственным препаратом. Определение специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов проводят с использованием иммунологических планшет, регистрируя результаты на спектрофотометре при длине волны 450 нм. В состав набора входят: Р1 – Разводящий и промывающий раствор 10-кратный Р2 - раствор для осаждения иммунных комплексов Р3 - раствор для выделения среднемолекулярных олигопептидов Р4 – эритроциты барана 10% взвесь Р5 - градиент для выделения мононуклеаров Р6 - фиксатор Р7 -96-луночный стриповый планшет - 50 мл 2 фл. - 30 мл 2 фл. - 25 мл 1 фл. - 5 мл 1 фл. - 12 мл 1 фл. - 0,5 мл 1 фл. - 2 шт. Необходимые материалы: -центрифужные пробирки, дозаторные пипетки, наконечники, химические пробирки, термостат, иммуноферментный планшетный анализатор, предметные стекла, микроскоп, холодильник, краска РомановскогоГимза. Подготовка реагентов к работе: Рабочий (однократный) разводящий и промывающий раствор, используемый для разведения лекарственных препаратов, отмывки эритроцитов барана и лимфоцитов крови получают при смешивании 1 части Р1 с 9 частями дистиллированной или деионизированной воды: рН раствора – 7.2-7.4 (дистиллированную воду предварительно кипятят); Рабочий раствор водорастворимых лекарственных препаратов (таблетированных или ампульных) готовят в двух разведениях в химических или центрифужных пробирках за 20-30 мин до использования. Для определения специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов при расчете концентрации лекарственного препарата руководствуются суточной терапевтической дозой в 1 литре раствора, с последующим пересчетом на 1 мл. Для диагностики лекарственной аллергии в нагрузочных тестах с Е-РОК, во избежание неспецифических токсических реакций на рецепторный аппарат клеток, приготовленные разведения препаратов разводят еще раз 1:1 рабочим раствором Р1. (П.Д.Новиков, Д.К.Новиков, Ю.В.Сергеев - Диагностика лекарственной аллергии,- Витебск, 2001). 1. Лидокаин 2% - 2 мл. По М.Д. Машковскому суточная доза составляет 750 – 1500 мг следовательно, в 1 мл Р1 должно содержаться 375 мкг препарата. В ампуле – 40 мг вещества: 40000 мкг – 2000 мкл 40 мкл лидокаина доводим до 1 мл рабочим раствором Р1. 2. Кавинтон 10 мг в 2 мл раствора, или 5 мкг в 1 мкл. Берем 40 мкл раствора и доводим до 1 мл рабочим раствором Р1. 3. Ультракаин (Убистезин и другие анестетики) – 100 мкл доводим до 1 мл рабочего раствора Р1 Таблетированные препараты предварительно тщательно измельчают, помещают в рабочий раствор Р1, перемешивают и через 20-30 мин нерастворимые компоненты (наполнители таблетированных препаратов) осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2-3 мин. Оболочку, при необходимости, исследуют отдельно. Рабочие растворы лекарственных препаратов хранению не подлежат. В бланках результатов рекомендуется указывать данные исследования и лекарственного препарата и оболочки, а также фирму-изготовителя. Это обусловлено тем, что аналогичные препараты разных фирм-изготовителей могут вызывать неоднозначную реакцию у пациента, что может быть связано с использованием различных наполнителей и консервантов. Формалинизированные эритроциты барана Р4 отмывают центрифугированием в большом объеме (3-4 мл) рабочего раствора Р1 3-4 раза, сливая надосадочную жидкость. Из плотного осадка, который принимаем за 100%, готовим рабочую взвесь из расчета 0,1 мл осадка + 9,9 мл. рабочего раствора Р1. Рабочая взвесь стабильно хранится в течение 5 суток при t° от +2 до +6° С (в холодильнике). Рабочий раствор фиксатора готовять смешиванием 0,1 мл Р6 с 9,9 мл бидистиллированной или деионизированной воды (можно использовать кипяченую дистиллированную воду). Подготовка биологического материала. Из локтевой вены пациента берут 7-10 мл крови, переносят 3 мл в пробирку с раствором гепарина (25 ЕД на 1 мл), осторожно перемешивают покачиванием или вращением в ладонях, во избежание образования сгустков. Оставшуюся кровь помещают в сухую чистую центрифужную пробирку и оставляют на 30 мин в термостат при 37° С для образования сгустка. Сыворотку отделяют центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об/мин или 10- 15 мин при 1500 об/мин. Ход реакции выявления специфических иммунных комплексов К 300 мкл сыворотки крови, помещаемым в центрифужную пробирку, добавляют равное количество раствора лекарственного препарата (каждая проба набирается отдельным наконечником). В качестве контроля к 300 мкл сыворотки крови добавляют равное количество рабочего раствора Р1. Пробы перемешивают пипетированием (без образования пены) и инкубируют при 37° С в течение 1 часа. В лунки планшета раскапывают по 150 мкл раствора Р2 и по 50 мкл исследуемых проб и контроля. Исследования проводят в дублях. (Например: лунки А1 и А2 – контроль; В1 и В2 – исследуемая проба) Планшет накрывают крышкой, выдерживают 60-90 мин при комнатной температуре (20-22° С). Проводят измерение оптической плотности на планшетном иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Определяют среднюю величину показателей контроля и исследуемой пробы. Разность оптической плотности опыта и контроля оценивают в процентах, при этом, оптическую плотность контроля принимают за 100%. Нарастание уровня оптической плотности опытной пробы до 10% расценивают как нормальное значение. От 10 до 15% - возможность развития аллергической реакции, свыше 15% - наличие аллергической реакции. Пример 1: ОП контроля = 0,234 ОП пробы = 0, 312 - 0,312 х 100 : 0,234 = 133,3% нарастание на 33,3% - наличие аллергической реакции; Пример 2: ОП контроля = 0,164 ОП пробы = 0,153 0,153 х 100 : 0,164 = 93,3% уменьшение на 6,7% - реакции к препарату не выявлено. Ход определения специфических среднемолекулярных олигопептидов К оставшимся 500 мкл пробы сыворотки крови с лекарственным препаратом и контролю приливают по 125 мкл Р3 (объем Р3 равен половине объема сыворотки крови, без учета объема лекарственного препарата), тщательно перемешивают пипетированием и центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин (или 30 мин при 1500 об/мин). В лунки планшета раскапывают по 100 мкл рабочего раствора Р1 и по 100 мкл надосадочной жидкости исследуемых проб и контроля. Надосадочную жидкость отбирают осторожно, чтобы не зацепить осадок, осевший на дне и стенках пробирок. Исследования также проводят в дублях. Планшет накрывают крышкой, выдерживают 30 мин при комнатной температуре (20-22° С). Проводят измерение оптической плотности на планшетном иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Разность оптической плотности опыта и контроля оценивают так же, как и в предыдущем исследовании. Получение взвеси мононуклеаров ( лимфоцитов): В пробирку, где помещена кровь с гепарином , добавляют рабочий раствор Р1 в соотношении 2:1 (2 части крови + 1 часть раствора Р1) и тщательно, чтобы не вызывать пенообразования, перемешивают пипетированием. В новую центрифужную пробирку помещают 500 мкл Р5 и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают смесь крови с Р1. Соотношение градиента и крови 1:2 или 1:3. (500 мкл Р5+ 1-1,5 мл смеси кровь/раствор Р1). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. Осторожно отбирают интерфазный слой, содержащий лимфоциты (на 98%), отмывают один раз центрифугированием в большом объеме (≈ 3-4 мл) раствора Р1 в течение 2 мин. при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят раствором Р1 до рабочей взвеси (2 млн/мл. или 12-18 клеток в 1 большом квадрате камеры Горяева). Ход реакции ”активного” розеткообразования 1-я пробирка – контроль: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл раствора Р1; 2-я и последующие (при необходимости) пробирки: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл раствора лекарственного препарата. Пробирки инкубируют в течение 60мин. в термостате при 37° С. Приливают 50 мкл рабочей взвеси эритроцитов барана, опять помещают на 10 мин. в термостат. Немедленно осаждают центрифугированием в течение 2 мин. при 1500 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость, добавляют 50 мкл рабочего раствора Р6 и из осадка, осторожно пипетируя его, готовят мазок ( на 3-4 кв.см.). Высушивают при комнатной температуре, окрашивают краской Романовского-Гимза. Смывают краску дистиллированной водой, снова сушат и считают количество образованных розеток на 100 лимфоцитов. За розетку принимают мононуклеар (лимфоцит), четко присоединивший к себе 3 и более эритроцитов барана. Рассчитывают индекс нагрузки: количество розеток после инкубации с препаратом делят на количество розеток в контроле. В норме индекс нагрузки не превышает 1,0. Показатель индекса нагрузки от 1.0 до 1.5 может свидетельствовать о возможном развитии сенсибилизации (аллергии) к препарату; свыше 1.5 – о наличии аллергической реакции. Можно рассчитывать и в процентах, принимая показатель контроля за 100%. В этом случае интерпретация ведется следующим образом: увеличение розеток до 10% - может свидетельствовать о возможном развитии аллергической реакции к препарату при последующем применении его в лечении; свыше 10 % - о наличии аллергической реакции. Ход реакции “спонтанного” розеткообразования 1-я пробирка – контроль: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл рабочего раствора Р1. 2-я и последующие пробирки: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл раствора лекарственного препарата. Пробирки инкубируют в течение 60 мин в термостате, при 37° С, затем добавляют 50 мкл рабочей взвеси эритроцитов барана. Помещают на 5 мин. в термостат, осаждают центрифугированием в течение 2 мин. и оставляют на 40-60 мин. в холодильнике. Осторожно отбирают надосадочную жидкость, приливают 50 мкл рабочего раствора Р6 и из осадка готовят мазок. Высушивают при комнатной температуре, окрашивают краской Романовского-Гимза в течение 5-7 мин. Отмывают от краски дистиллированной водой и считают количество образованных розеток на 100 лимфоцитов. При этом уменьшение количества Е-розеткообразующих лимфоцитов по сравнению с контрольным показателем расценивается как наличие гиперчувствительности к тестируемому препарату. Увеличение уровня Е-РОК или отсутствие изменений в их числе, констатируется как отсутствие гиперчувствительности к препарату. Рассчитывают индекс нагрузки (ИН): количество розеток после инкубации с препаратом делят на количество розеток в контроле. Интерпретацию результатов ведут от 1.0: если ИН <1.0 - 0.04, то это является свидетельством наличия гиперчувствительности; ИН > 1.0 + 0.04 – свидетельство отрицательной чувствительности; Требования безопасности 1. Набор предназначен только для диагностики іn vіtro. 2. Средствами индивидуальной защиты при работе с наборами являются резиновые перчатки. 3. Обеззараживание сывороток проводить согласно приказу МЗ СССР N408 от 29.12.89 г. «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране». Условия транспортирования и хранения 1 Наборы транспортируют всеми видами закрытого транспорта при температуре от +4 до +10°C. 2 Наборы должны храниться при температуре от +2 до +8°C. Не допускается замораживание! ЛИТЕРАТУРА: 1. И.А. Тузанкина, О.Г. Огурцова, Т.Ю. Азовская, В.Н. Шершнев - Лабораторные методы диагностики иммунной недостаточности у детей,- Методические рекомендации для врачей, иммунологов, студентов и интернов, 2002 г. 2. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике.М.:Наука, 1991. 3. Новиков П.Д., Новиков Д.К. Механизмы аллергии на лекарства-гаптены. Иммунопатология, аллергол., инфектол., 2000; 4:48-64. 4.Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., Новиков П.Д. – Лекарственная аллергия, - Москва, 2001. 5. Паттерсон Р и др. – Аллергические болезни: диагностика и лечение – ГЭОТАР Медицина, 2000. 6. Mauri-Hellweg D., Bettens F., Mauri D., Brander C., Hunziker T., Pichler W.J. Activation of drug-specific CD4+ T cells in individuals allergic to sulfonamides, phenytoin, and carbamazepine. J. Immunol. 1995 Jul 1; 155(1): 462. 355008, Россия, г. Ставрополь, ул. Гражданская, 9, тел/факс для справок и заявок 8 (8652) 28-34-60