Расчеты Рассчитайте активность ЛДГ в пробе, используя 1. Калибратор ЛДГ (E/л; мккат/л) = Скал. x ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА–L Liquid 100 (LDH-L L 100) Кат. № 10010031 Хранить при (+2 – +8) °С Метод Жидкий реагент для определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке или плазме, метод рекомендованный Международной федерацией клинической химии (IFCC). Принцип реакции Лактатдегидрогеназа катализирует превращение L-лактата в пируват с одновременным восстановлением НАД+ в НАДН. Изменение поглощения за время превращения НАД в НАДH прямо пропорционально активности ЛДГ. Лактат + НАД+ ЛДГ 4х20 мл 406 ммоль/л 62,5 ммоль/л 1 х20 мл 50 ммоль/л Состав смеси R1+R2 N-Метил D-глюкамин (рН 9,4) L-лактат НАД+ 325 ммоль/л 50 ммоль/л 10 ммоль/л Приготовление и стабильность рабочих реагентов Двухреагентный метод – старт субстратом Реагенты R1 и R2 жидкие готовые к использованию. Реагенты стабильны до достижения указанного срока годности, если хранятся при (+2 – +8) °С. После вскрытия, реагенты стабильны до указанного срока годности, если хранятся при (+2 – +8) °C, в тщательно закрытых флаконах, избегая испарения или контаминации реагентов, в защищенном от света месте, особенно реагент 2. Монореагентный метод – старт образцом Смешать 4 части раствора реагента 1 (R1) с 1 частью раствора реагента 2 (R2), тщательно перемешать. Готовый рабочий раствор стабилен: 4 часа при 20–25 °С при хранении в защищенном от света месте. 24 часа при 2–8 °С при хранении в защищенном от света месте. Образцы Сыворотка, гепаринизированная плазма (Li,Na, NH4+). Избегать гемолиза! Стабильность ЛДГ в cывороткe и плазмe 3 дня при 4–8 °С Калибровка Для калибровки рекомендуется использовать Лионорм Калибратор, Кат. № 10003200 Контроль качества Для проведения контроля качества рекомендуется контрольная сыворотка: Лионорм ГУМ Н, Кат. № 10003204 Лионорм ГУМ П, Кат. № 10003206 Анализ Длина волны: Hg 365 нм, 340 нм или Hg 334 нм Оптический путь: 1 см Температура: 37 °С Объемное соотношение Сыворотка, плазма / реакционная смесь 1/ 63,5 при работе двухреагентным методом Сыворотка, плазма / реакционная смесь 1/ 51 при работе монореагентным методом Объемы образца и реагентов могут быть изменены при сохранении соотношения реагент/образец Двухреагентный метод – старт субстратом Бланк по реагенту Калибратор Образец Реагент 1 1,000 мл 1,000 мл 1,000 мл Образец – – 0,020 мл – 0,020 мл – 0,020 мл – – 0,250 мл 0,250 мл Дистил. вода Смешать, инкубировать 1–5 мин. (при 37 °C). Добавить: Реагент 2 0,250 мл Смешать, через 1 мин. измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Измерить поглощение точно через 1, 2 и 3 минуты. Рассчитать среднее изменение поглощения в минуту (∆А). Монореагентный метод – старт образцом Рабочий реагент Бланк по реагенту Калибратор Образец 1,000 мл 1,000 мл 1,000 мл Образец – – 0,020 мл Калибратор – 0,020 мл – 0,020 мл – – Дистил. вода Скал. – активность ЛДГ в калибраторе 2. Факторы: ЛДГ = Ф x ∆A/мин Ф – фактор пересчета, см. нижеследующую таблицу Факторы Старт пробой Старт субстратом 37 °C Длина волны 37 °C E/л мккат/л E/л мккат/л 334 nm 8250 137,5 10275 171,25 340 nm 8095 134,9 10080 168,00 365 nm 15000 250,0 18675 311,25 Коэффициент пересчета 1 кат/л = 1 моль/л. сек 1 мккат/л = 60 Е/л Нормальные величины ЛДГ сыворотка, плазма Пируват + НАДH + H+ Реагенты R1 Реагент 1, буфер N-Метил D-глюкамин (рН 9,4) L-лактат R2 Реагент 2, субстрат НАД+ Калибратор ∆Aобр. – ∆Aбланк ∆Aкал. – ∆Aбланк Смешать, через 1 мин. измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Измерить поглощение точно через 1, 2 и 3 минуты. Рассчитать среднее изменение поглощения в минуту (∆А). Протоколы для использования на автоматических анализаторах могут быть получены по запросу. E/л мккат/л мужчины 37 °С < 248 < 4,13 женщины < 247 < 4,12 Приведенные диапазоны величин следует рассматривать как ориентировочные. Каждой лаборатории необходимо определять свои диапазоны. Рабочие характеристики Линейность: до 1500 E/ л (25 мккат/л) Чувствительность: 4,2 E/л (0,07 мккат/л) Нижний предел определения: 13,2 E/л (0,22 мккат/л) Диапазон измерений: 13,2 – 1500 E/л (0,22 – 25 мккат/л) Воспроизводимость (при 37 °C) Внутрисерийная (число измерений n =20) Среднеарифметическое значение CV (%) SD E/л мккат/л E/л мккат/л Образец 1 147 2,45 2,4 0,04 1,51 Образец 2 250 4,16 2,4 0,04 0,90 Образец 3 450 7,49 2,4 0,04 0,52 Межсерийная (число измерений n =10) Среднеарифметическое значение CV (%) SD E/л мккат/л E/л мккат/л Образец 1 146 2,43 3,6 0,06 2,37 Образец 2 251 4,18 4,2 0,07 1,57 Образец 3 451 7,51 7,8 0,13 1,74 Точность Аналитическое смещение В (bias): + 2,7 % (256,8 E/л), (4,28 мккат/л) Сравнение методов Сравнение было проведено на 49 образцах с использованием реагентов Pliva-Lachema Диагностика ЛДГ-L Liquid (у) и имеющихся в продаже реагентов с коммерчески доступной методикой (х). Результаты: y = 0,008x - 0,064 мккат/л r = 1,000 Специфичность/Влияющие вещества: Не влияют на результаты анализа: Аскорбиновая кислота до 1,7 ммоль/л, билирубин до 684 мкмоль/л, триглицериды до 22 ммоль/л. Гемоглобин до 0,5 г /л. Примечание 1. Если изменение поглощения в минуту (∆А/мин) превышает 0,150 при 334 (340) нм или 0,080 при 365 нм, разбавить 0,1 мл образца 1,0 мл физраствора (0,9 % NaCl) и повторить анализ, используя данное разведение. Полученный результат умножить на 11. 2. Реагенты содержат в качестве консерванта азид натрия (0,95 г/л). Не глотать! Избегать контакта с кожей и слизистыми. Меры предосторожности Набор реагентов предназначен для in vitro диагностики профессионально обученным лаборантом. Набор реагентов не относится к категории опасных. Первая помощь При приеме внутрь следует прополоскать рот водой, выпить 0,5 л воды и вызвать рвоту. При попадании в глаза быстро промыть их проточной водой. При попадании на кожу необходимо промыть теплой водой с мылом. Во всех серьезных случаях обратиться к врачу. Утилизация использованных материалов Все образцы теста должны рассматриваться как потенциально инфицированные и вместе с остальными реагентами должны быть уничтожены в соответствии с существующими в каждой стране правилами для данного вида материалов. Бумажная упаковка и другое (бумага, стекло, пластик) должны быть рассортированы для выброса с мусором или отправления на переработку. Литература 1. Thomas L. Clinical laboratory diagnostics. 1st ed. Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft; 1998. 89-94. 2. Moss DW, Henderson AR. Clinical enzymology In: Burtis CA, Ashwood ER, editors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1999. 617-721. 3. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G et al. IFCC primary reference procedure for the measurement of catalytic concentrations of enzymes at 37 °C. Part 3: Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase. Clin. Chem. Lab Med 2002, 40:643-48. Дата проведения последнего контроля: 16. 12. 2005 B/PI/187/05/B