Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ
реклама
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России На правах рукописи КЛИМЕНКО Вероника Викторовна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ МЕСТНО-РАСПРОСТРАНЕННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 – онкология 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Семиглазова Т.Ю. доктор медицинских наук проф. Имянитов Е.Н. Санкт-Петербург 2015 2 Оглавление ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ................................................................................... 9 Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................... 41 2.1 Характеристика больных ....................................................................... 41 2.2 Обследование больных ........................................................................... 43 2.2.1 Гистологическое исследование .................................................... 43 2.2.2 Иммуногистохимический анализ ................................................ 50 2.2.3 Молекулярно-генетическое тестирование ................................. 61 2.2.4 Оценка распространённости процесса ........................................ 68 2.3 Критерии эффективности лечения ........................................................ 73 2.4 Оценка осложнений лекарственной терапии ....................................... 74 2.4.1 Оценка систолиеской функции левого желудочка (измерение фракции выброса левого желудочка) ..................... 74 2.4.2 Оценка побочных явлений на фоне химиотерапии (СТС АЕ v3.0) ................................................................................ 75 2.5 Статистический анализ ........................................................................... 75 Глава 3 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОВЕДЁННОГО ПРЕДОПЕРАЦИОННОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЁННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ............... 75 3.1 Объективная и патоморфологическая оценка степени регресса опухоли молочной железы и лимфатических узлов ........................... 77 3.2 Предиктивное значение клинических и экспериментальных молекулярно-генетических и биологических маркеров чувствительности к антрациклиновым антибиотикам и таксанам... 82 3.3. Прогностическое значение молекулярно-генетических и биологических маркеров чувствительности к антрациклиновым антибиотикам и таксанам...................................................................... 98 3 Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................... 110 ВЫВОДЫ ..................................................... Ошибка! Закладка не определена. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................. 117 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................. 118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................. 120 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы За последнее десятилетие сохраняются высокие показатели заболеваемости и смертности больных местно-распространенными формами рака молочной железы (сT1-2N2-3M0, cT3N1-3M0, cT4N0-3M0). Главными целями предоперационной химиотерапии данной категории больных являются: увеличение количества органосохраняющих операций, ранняя оценка эффективности выбранного режима системного лечения, уточнение долгосрочного прогноза в зависимости от степени патоморфологического ответа опухоли на лечение. Выбор лекарственного лечения, которое ответило бы всем этим критериям, представляет одну из актуальных проблем терапии больных местно-распространенным раком молочной железы [Семиглазов В.Ф., 2013;Veronesi U., 2005]. Благодаря прогрессу молекулярно-генетических исследований всё больше признание получает представление о гетерогенности и патогенетическом многообразии РМЖ [Семиглазов В.Ф., 2013]. Все большую актуальность приобрело изучение мутации гена BRCA1, которая ассоциируется с высокой пенетрантностью [Imyanitov E.N., Hanson K.P., 2004] и наследственной предрасположенностью к трижды негативному фенотипу РМЖ, при котором терапевтические подходы по-прежнему не определены. Наиболее эффективными препаратами в лекарственном лечении РМЖ являются антрациклиновые антибиотики и таксаны. Антрациклины связывают ДНК топоизомеразу 2, включая и аденозинтрифосфатзависимый способ расхождения нитей ДНК, в результате чего происходит формирование реактивных кислородных соединений [Nakopoulou L., 2000]. В работах in vivo угнетение экспрессии ТОР2 приводило к значительному снижению чув- 5 ствительности опухоли к антрациклиновым антибиотикам [Binaschi и соавт, 2001; Bhargava R., 2005]. В литературе данных о прогностическом значении TOP2 статуса мало, результаты исследований разноречивы [Durbecq V., 2003; Järvinen T., 2003; Chien A.J., 2008]. Таксаны обратимо связывают β-тубулин, что приводит к блоку деполимеризации и стимуляции полимеризации тубулина из-за отсутствия гуанозинтрифосфата. В результате происходит остановка клеточного роста и индукция апоптоза [Castaneda C., Gomez H., 2009]. Механизмом развития резистентности к таксанам является повышение экспрессии белка β-III-тубулина (изотипа β-тубулина III класса) [Gradishar W., 2009]. Значимость этих маркёров при РМЖ активно исследуется и по сегодняшний день [Oakman и соавт., 2009; Brase и соавт., 2010; Arteaga и соавт., 2012]. Знание молекулярно-генетических характеристик опухоли может помочь не только в выборе цитостатика, но и избежать риска появления побочных эффектов от заведомо неэффективной терапии [Проценко С.А., 2007; 2012; Jain K., 2004]. Все выше изложенное и определило актуальность настоящего исследования, направленного на выявление молекулярно-генетических маркёров с целью персонализации терапии, то есть «правильного лечения для правильного больного». Цель исследования Улучшить результаты лечения больных местно-распространенным раком молочной железы. Задачи исследования 1.Оценить непосредственные результаты сравниваемых схем неоадъювантной терапии: а) объективный клинический ответ (физикальный метод, маммография, ультразвуковое исследование, маммосцинтиграфия); б) сте- 6 пень патоморфологического регресса первичной опухоли по Miller-Paine, степень регресса регионарных метастазов в лимфатических узлах 2. Проанализировать ежегодные показатели выживаемости без «событий» (EFS). 3. Определить чувствительность, специфичность, диагностическую точность метода полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном времени детекции экспрессии генов TOP2a и экспрессии генов TUBβIII. 4. Оценить предиктивную и прогностическую значимость молекулярных маркеров, клинических, морфологических и биологических особенностей местно-распространенного рака молочной железы. Научная новизна исследования На основании анализа базы данных НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, включающей сведения более чем о 2000 больных РМЖ, леченных с 2010 по 2014г, получена детальная информация о 141 пациента, получавшев после рандомизации неоадъювантную химиотерапию по схеме ТАС в сравнении со схемой ТС. С помощью иммуно - гистохимического определения (ИГХ) степени экспрессии рецепторов стероидных гормонов (RE, RP), HER2, Ki 67, гистологической степени злокачественности в материале, полученном при трепанбиопсии (т.е. до начала системного лечения) выделены пять биологических подтипов РМЖ: люминальный А, люминальный В (HER2 – негативный), люминальный В (HER2 – позитивный), HER2- позитивный (нелюминальный), трижды – негативный. Такое же иммуно-гистохимическое исследование проведено после завершения неоадъювантной химиотерапии и операции на материале остаточной (резидуальной) опухоли, если не достигнут полный патоморфологический регресс опухоли (pCR). В рамках рандомизированного исследования определены чувствительность, специфичность, диагностическая точность, предсказательная ценность 7 положительного и отрицательного результатов детекции высокой экспрессии гена TOP2, а также низкой экспрессии генов TUBβIII методом полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Выполнена оценка предиктивной и прогностической значимости высокой экспрессии гена TOP2, а также низкой экспрессии генов TUBβIII и мутации BRCA1. Практическая значимость работы Детекция высокой экспрессии гена TOP2, а также низкой экспрессии генов TUBβIII и мутации BRCA1 методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с учётом клинических, морфологических и биологических особенностей местно-распространённого РМЖ в клинической практике позволит: улучшить планирование лекарственной неоадъювантной терапии, индивидуализировать системное лечение, увеличить показатели выживаемости больных, сократить затраты на терапию за счет отказа от использования неэффективных дорогостоящих лекарственных средств. Основные положения, выносимые на защиту 1) Применение неоадъювантной цитотоксической химиотерапии по схеме ТАС (доцетаксел+адриабластин+циклофосфамид) чаще чем по схеме ТС (доцетаксел+циклофосфамид) приводит к объективному клиническому ответу и патоморфологическому полному ответу (pCR), особенно при HER2 позитивном и трижды-негативном подтипах РМЖ. 2) Целесообразно определение биологического подтипа рака молочной железы, а также маркеров чувствительности к лекарственной терапии, включающей антрациклиновые антибиотики и таксаны. 3) Выбор лекарственного лечения с учетом детекции высокой экспрессии гена TOP2 α, а также низкой экспрессии генов TUBβIII и мутации BRCA1 методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с учётом клинических, морфологических и биологических 8 особенностей местно-распространённого рака молочной железы позволит увеличить эффективность лечения. 9 ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ В динамике заболеваемость раком молочной железы по СанктПетербургу с 1970 по 2013г возрасла в разы. Абсолютное число новых случаев РМЖ возросло в 1,4 раза (с 1760 до 2384 тыс.), «грубые» показатели составили в 1990 г 64,2, а в 2013г 86,9% [Каприн А.Д. и соавт., 2014]. Рост абсолютных случаев РМЖ связан с ростом численности населения города, а рост «грубых» показателей связан с увеличением жизни человека [Мерабишвили В.М., 2013]. В 1990 г. абсолютное значение заболеваемости составляло 1760 случаев, а на 2013г этот показатель составил 2396. Ежегодно рак молочной железы (РМЖ) выявляется у 1,2 млн женщин и является лидирующим заболеванием в структуре онкологической заболеваемости на территории Российской Федерации [Пак Д.Д. и соавт., 2010]. В мире на долю местнораспространённого рака молочной железы приходится 300000–350000 новых больных [Hortobagyi и соавт., 2004]. Гетерогенность путей развития РМЖ включает в себя как особенности гормонального статуса, так и генетическую предрасположенность больных [Семиглазов В.Ф. и соавт., 2006]. Внедрение биохимии и молекулярной биологии в онкологию позволило исследователям и клиницистам иметь большее количество знаний о биологии опухоли, которая может помочь в выборе терапии и прогнозе РМЖ. Знание молекулярных маркеров позволяет выделить группу пациентов с повышенным риском, страдающих ранним РМЖ, но не подлежащих к профилактической химиотерапии, и провести оценку чувствительности к опреде- 10 лённому виду системной терапии с целью индивидуализации. Также значение молекулярных маркеров может использоваться для разработки новых современных препаратов, действующие как «мишень» на эти молекулы [Герштейн Е.С. и соавт., 2004]. Молекулярно-биологические маркеры, определяемые в опухолевой ткани, дают возможность охарактеризовать опухоль в отношении: чувствительности к эндокринотерапии и таргетной терапии, а также склонности к инвазии и метастазированию [Fisher B., 1989]. Развитие биологически направленной терапии рака молочной железы началось с момента открытия гормональных рецепторов в 70-х годах: вначале рецептоы эстрогенов (РЭ) и чуть позднее рецепторы прогестерона (РП) [Имянитов Е.Н., 2007]. Рецепторы эстрогенов и прогестерон – специфически связывающиеся белки, которые избирательно воздействуют на клетку. При наличии экспрессии рецепторов эстрогена, опухоль чувствительна к лечению, направленному на блокировку источника эстрогенов в организме, например, гормонотерапия антиэстрогенами или ингибиторами ароматазы, или овариэктомия. Рецепторы прогестерона говорят нам о функциональной активности рецепторов эстрогена. Методика по определению статуса стероидных гормонов – иммуногистохимический анализ, хотя метод и относительно субъективный, но его превосходство в том, что при окрашивании срезов можно чётко определить принадлежность рецепторов именно в опухолевых клетках, а также этот метод позволят проводить оценку на архивном материале – парафиновых блоках. Известен тот факт, что если опухоль экспрессирует хотя бы один из рецепторов стероидных гормонов, то предположительно эти больные имеют более благоприятное течение заболевания [McGuire W.L., 1978]. По данным T. Pankaj и соавт. (2010), наличие положительных рецепторов эстрогена является предсказывающим фактором и свидетельствует о медленном развитии опухоли, низкой степени её гистологической злокаче- 11 ственности и предсказывает эффективность применения эндокринотерапии. Варианты лечения для таких больных включают антиэстрогеновые препараты блокирующие опухолевый рост [Jensen E.V., Jordan V.C. , 1980]. Но вопреки всему имеется мнение, что существует резистентность к эндокринотерапии, даже если имеется экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона, поэтому гормональный статус не всегда является достаточным показателем гормоночувствительности РМЖ [McGuire W.L., 1978]. К значимому звену в регуляции роста опухоли относятся полипептидные факторы роста – белки и полипептиды, которые вырабатываются самой опухолью. В пролиферации злокачественных клеток принимают участие пептиды эпидермального фактора роста, соматостатин, инсулиноподобные факторы роста и др.[Lippman и соавт., 1988]. В исследованиях был доказан тот факт, что при наличии пептидов эпидермального фактора роста (ЭФР) и отсутствие рецепторов стероидных гормонов в опухоли молочной железы, возможен плохой прогноз заболевания [Герштейн Е.С. и соавт., 1994; Кушлинский Н.Е. и соавт., 1996; Герштейн Е.С. и соавт., 1998; Klijn и соавт., 1992]. Имеются и противоречащие данные о том, что наличие рецепторов эпидермального фактора роста (ЭФР) и рецепторов соматостатина предвещают хороший прогноз течения РМЖ [Foekens и соавт., 1991]. Но из-за противоречивости результатов, ни один из полипептидных факторов роста опухоли, характеризующих чувствительность РМЖ, не вошёл в рутинную клиническую практику, как исследование уровня рецепторов эстрогена и прогестеронов [Nicholson и соавт., 2001]. Семейство онкогенов группы c-erbB-тирозинкиназных рецепторов, к которым относятся четыре трансмембранных рецептора: РЭФР (ErbB-1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4), – являются важнейшими регуляторами системы передачи митогенного сигнала [Moghal и соавт., 1999; Hackel и соавт., 1999]. 12 Представитель семейства трансмембранных тирозинкиназ – HER2/neu, не имея собственного лиганда и не работая ни с одним из известных факторов роста, является ключевым звеном в передаче митогенных сигналов для всех ЭФР подобных пептидов [Moghal и соавт., 1999]. Воздействие на HER2 neu существенно может замедлить или даже остановить рост опухолевых клеток. С появлением антитела к HER2/neu – лекарственного таргетного препарата герцептина – в лечении РМЖ произошли поправки в тактике лечения больных [Kaptain и соавт., 2001; Schnitt S.J., 2001]. Если рассмотреть прогностическое значение гиперэкспрессии гена сerbB-2, то единого мнения о прогностической ценности HER2/neu пока нет [Berns и соавт., 1992; Kaptain и соавт., 2001]. Имеются данные, что опухоли с амплифицированным геном HER2 плохо поддаются эндокринотерапии, но чувствительны к последующей химиотерапии. Также принято считать, что пациенткам с наличием экспрессии HER2 следует назначать более интенсивные режимы химиотерапии [Hamilton A., Piccart M., 2000]. В злокачественной трансформации и биологическом поведении уже существующих опухолей ведущее значение отводится пролиферативной активности опухолевых клеток. Для определения пролиферации клеток злокачественных опухолей используется анализ экспрессии антигена Ki-67. Повышенная экспрессия Ki-67 коррелирует с плохим прогнозом течения заболевания. По данным многих исследований, высокий уровень экспрессии Ki67 ассоциирован с лучшим ответом на химиотерапию [Urruticoechea и соавт., 2005; Taneja и соавт., 2010]. Ki-67, определяемый при помощи иммуногистохимического исследования, направлен для подбора системной терапии. В настоящее время нет единого мнения по поводу прогностической роли Ki-67 при раке молочной железы [Yerushalmi и соавт., 2010]. 13 Индекс клеточной пролиферации Ki-67 используется как важнейший признак для определения подтипа рака молочной железы, в особенности разделения «Люминального А» и «Люминального В» подтипов [Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000]. Сравнительный анализ, проведенный Urruticoechea и соавт.(2005), включал результаты 18 клинических исследований, в которых принимало участие более 200 пациенток. В 17 из 18 исследований была выявлена статистически достоверная корреляция между экспрессией Ki-67 и прогнозом РМЖ, однако в данных исследованиях не было единого уровня Ki-67, таким образом, нет достоверных критериев отличия повышенного и низкого уровня антигена [Urruticoechea и соавт., 2005]. В исследовании American Society of Clinical Oncology (ASCO) Tumor Marker Guidelines Committee показали, что в настоящее время достоверных доказательств прогностической значимости определения Ki-67 в клинической практике недостаточно, чтобы рекомендовать рутинное определение Ki67 для прогноза пациенткам местно-распространённым РМЖ [Harris и соавт., 2007]. В литературе имеются данные о влиянии Ki-67 при назначении вида системной терапии. По результатам исследования, в группе пациенток с эстроген экспрессирующими опухолями и высоким индексом Ki-67 целесообразно добавление доцетаксела к эпирубицину и 5-фторурацилу в качестве адъювантной химиотерапии [Penault-Llorca и соавт., 2009]. Результаты были подтверждены в исследовании Cancer International Research Group 001 trial [Hugh и соавт., 2009]. Однако эти результаты не соответствуют данным International Breast Cancer Study Group Trials VIII and IX. В этих исследованиях была показана предиктивная роль высокого уровня экспрессии Ki-67 в группе с рецептор-позитивным РМЖ без признаков заболевания в лимфатических узлах по отношению к проведению адъювантной терапии с включением метотрексата, циклофосфамида и 5-фторурацила в дополнение к проводимой эндокринной терапии [Viale и соавт., 2009]. 14 Проведение дальнейших исследований необходимо для более направленного выделения групп пациенток с высокими показателями Ki-67, которые могут получить максимальную пользу от проведения химиотерапии. В возможности предсказать развитие метастазов РМЖ участвует и система активации плазминогена. Одним из свойств злокачественной клетки – это способность к метастазированию и инвазии, нарушая окружающую базальную мембрану и внеклеточный матрикс опухолевыми протеазами [DeVries и соавт., 1996]. Протеазы также принимают участие в неоангиогенезе, распространяя в опухоли новые сосуды [Mignatti P., Rifkin D.B., 1996]. Опубликованные результаты ряда ретроспективных исследований говорят о том, что экспрессия ФРЭС при раке молочной железы имеет значение в прогнозе заболевания и влияет на чувствительность к гормонотерапии и лекарственному лечению [Linderholm и соавт., 2000; Gasparini G., 2001]. Высокие значения экспрессии свидетельствуют о плохом прогнозе, как при раннем, так и при местно-распространённом РМЖ. Разработка новейших препаратов с антиангиогенными свойствами и оценка активности ФРЭСзависимого ангиогенеза может стать основой для направленного лечения [Harris A.L., 1998]. В настоящее время достаточно много изучается об онкогенах c-myc и int-2/bcl-I, суппрессорных белках – производных генов р53 и ретинобластомы, а также роли интегринов – белков, стабилизирующих межклеточные контакты и целостность ткани [Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., 2001; Foekens и соавт., 1991; Duffy M.J., 2001] (таблица 1.1). 15 Таблица 1.1 – Основные группы биологически значимых показателей [Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 1994] Биологическое значение Маркеры Показатели эндокринной гормонольной чувствительности Рецепторы стероидных гормоном: RE, RP, PA Показатели активности ауто/паракриновой регуляции пролиферации Факторы роста и их рецепторы: РЭФР и его лиганды: ЭФР, α-ТФР, амфирегуулин и др. HER/ neu и др. рецепторы семейства сerb Рецепторы ИФР-1 Рецепторы соматостатина Ферменты и белки, учавствующие в передаче митогенных сигналов: Рецепторныетирозинкиназы, МАПкиназы, ФИЗК, Akt-1, Crb2 и др. Показатели метастатической и инвазивной активности Компоненты системы активизации плазминогена: uPA, PAI-1, рецептор uPA, PAI-2, tPA Металлопротеазы и их ингибиторы Другие протеолитические ферменты (катепсин D Интегрины Показатели неоангиогенеза ФРЭС (VEGF) А и его рецепторы flt-1 и flk-1 VEGF C и его рецепторы flt-4 Другие ангиогенные факторы:ФРФ, тимидинфосфорилаза, ФНО, интнрлейкины и др. Регуляторы апоптоза Супрессорные гены и их продукты: p53, ген ретинобластомы Проапоптические факторы: bcl-2, Fas – рецептор и Fas - лиганд Показатели, не имеющие чётко выраженной биологической роли при РМЖ Белок pS2 Онкогены c-myc, int-2 и др. 16 Уникальное достижение в молекулярной биологии 90-х годов – открытие супрессорных генов BRCA1 и BRCA2. Частота развития наследственного РМЖ составляет от 5 до 20% [Easton и соавт., 2012]. Наследственный РМЖ связан с наличием нарушений в генах супрессорах высокой пенентрантности – BRCA1, BRCA2. По данным K. Offit, при наличии мутации в гене BRCA1 к 80 годам риск развития РМЖ достигает в 90%, при мутации гена BRCA2 в 80% [Metcalfe и соавт., 2008]. Особенностью наследственного рака является повышенный риск возникновения РМЖ в контрлатеральной молочной железе. Также характерен у женщин более молодого возраста (35–45 лет) [Соболевский В.А. и др., 2010]. По данным Е.Н. Имянитова (2010), наследственный РМЖ чаще имеет триждынегативный подтип опухоли, характеризуется высокой экспрессией Ki-67, высокой степенью злокачественности, негативным гормональным статусом опухоли, а также отсутствием экспрессии HER2. Наличие мутации в гене BRCA 1 имеет значение и в планировании проведения системного лечения. T. Byrski и соавторы (2010) полагают, что инактивация гена BRCA1 приводит к утрате чувствительности опухолевых клеток к препаратам таксанового ряда и поэтому клиническая эффективность таксанов, может быть подтверждена с помощью низкой экспрессии бетатубулина [Seve и соавт., 2010]. Немало важная роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологичных рекомбинаций пренадлежит генам BRCA1 и BRCA2. По данным литературных источников, ДНК-повреждающие агенты активно работают у наследственного BRCA ассоциированного рака молочной железы [Имянитов Е.Н., 2004; Портной С.М., 2005]. В исследованиях, проведённых при раке легкого, яичников и молочной железы, показана предиктивная значимость для терапии препаратами платины и антрациклинами при наличии гена BRCA1 [Taron М. et al., 2004; Quinn и соавт., 2007; Byrski и соавт., 2010]. 17 Предрасполагающие факторы, которые приводят к соматическим мутациям в эпителиальных клетках, условно можно разделить на активирующие и дезактивирующие события. Отличительной чертой генома опухолевой клетки РМЖ является хромосомальная нестабильность, которая выражается в анормальном количестве крупных хромосомных перестроек. Изменения в генах, ассоциированных с РМЖ, могут быть пусковым механизмом для соматической нестабильности, а далее приводить к мутации [Colleu-Durel и соавт., 2004; Imyanitov и соавт., 2004]. В 1990-х и начале 2000-х исследователи пытались создать карту специфических для РМЖ делеций, но воспроизвести новые гены РМЖ с помощью картирования делеций не удалось по причине потери гетерозиготности. Внутригенные соматические мутации являются относительно редкими событиями в геноме РМЖ, к наиболее часто встречающимся относится ген р53 (20–53%), PIK3CA (26%), CDH1 (21%). С помощью полногеномного секвенирования удалось выявить более 120 специфических для РМЖ раковых генов. В среднем, в каждой опухоли удается насчитать около сотни соматических драйвер-мутаций. Гены, контролирующие важнейшие клеточные функции, вовлеченные в неопластический процесс: адгезию, миграцию, апоптоз, трансформацию цитоскелета, пролиферацию и др., представлены в таблице 1.2. Результатов клинических исследований по изучению этой группы маркеров местнораспространённого РМЖ крайне недостаточно. Остаются неразрешенные вопросы о корреляции между их уровнем и эффективностью лечения, а также о возможности создания алгоритма тактики лекарственного лечения больных местнораспространённого рака молочной железы с учетом стандартных (стероидных гормонов и рецептора эпидермального фактора роста 2 типа) и экспериментальных маркеров. Знание экспрессии предективных маркёров даёт возможность определить течение заболевания от медленно развивающейся опухоли до высокоагрессивных опухолей с быстрым метастазированием [Liedtke C., 2008; Dignam J.J. 2009] с учётом различного отве- 18 та на системную терапию [Nielsen T.O., 2004; Nguyen P.L., 2008; Albain K.S., 2010; Nielsen и соавт., 2010; Wo J.Y., 2010; Aebi S., 2011; Tang G., 2011]. Таблица 1.2 – Молекулярно-генетические нарушения в опухолях молочной железы Типы генетических повреждений Гены и/или хромосомальные локусы Активирующие генетические события Амплификация генов, сопровож- 8q24: MYC; 11q13: CCND1, EMS1; 17q12–21: HER2, дающаяся увеличением их эксTOP2A; 20q13: AIB1 прессии Увеличение экспрессии генов BCL2, B94, Cathepsin D, CCNE, CD63, claudin-7, CRABP2, CTSD, GATA3, GZMH, hTERT, IGF1R, Ki67, lactoferrin, lipocalin 2, MDM2, MUC1, MYBL2, neurosin, PAI1, PAI2, POH1, PS2, Rantes, SIX1, MARCD2, STMY3, VEGF Увеличение копийности хромо1q (1q21, 1q32, 1q41), 8q (8q24), 11q (11q13), 16p сомных локусов (16p11), 17q (17q11. 2, 17q24), 20q (20q13) Генетические события с неясными последствиями Потери гетерозиготности (аллель- 1p (1p36. 3), 2q (2q22. 1), 3p (3p14. 2), 4q (4q35. 1), 6q ные имбалансы), которые могут (6q25. 1), 7q (7q31. 2), 8p (8p21. 3), 9p (9p21. 3), 13q отражать как делецию, так и ам(13q14), 16q (16q22. 1, 16q24. 3), 17p (17p13. 3), 18p плификацию одного из аллелей (18p11. 32), 18q (18q21. 2), 19p (19p13), 21q (21q11. 1) Инактивирующие генетические события Делеции генетического материала 1p (1p31–35, 1p36), 6q (6q13–21, 6q21–23. 3, 6q25– 27), 8p (8p21, 8p22–23), 11q (11q22–23, 11q24–25), 13q (13q12–13, 13q14. 1), 16q (16q21–23. 3, 16q24. 3), 17p (17p13. 1, 17p13. 3), 22q (22q13) Внутригенные мутации p53, PIK3CA, CDH1 Метилирование промоторов, сопровождаемое снижением экспрессии соответствующих генов Снижение экспрессии генов APC, BCSG1, BRCA1, CCND2, CDH1, CDH13, DAPK, ER, FHIT, GPC3, GSTP1, HIN1, HOXA5, Maspin, NES1, NM23-H1, NOEY2, PR, Prostasin, INK4, CIP1, RAR-beta, RASSF1A, RFC, RIZ1, SOCS1, SRBC, SYK, TGFBR2, THBS, TIMP3, TMS1, TWIST, ZAC, 14-3-3sigma ATM, BAX, ITGA6, MGST1, OXTR, plakophilin 1, KIP1, RIG-like7-1, RB1, RBL2, SPARCL1, SPR1, TGFBR3, TFAP4, TNXA, 53BP2 19 К молекулярно-генетическим маркерам, влияющим на выбор лекарственных препаратов, можно отнести экспериментальные предиктивные маркеры –топоизомераза II альфа, бета-тубулин III класса, BRCA1 (breast cancer 1). Исследование экспрессии предективных маркёров осуществляется в лаборатории при помощи иммуногистохимической или полимеразной реакции (ПЦР) соответствующих транскриптов [Watters J. и соавт., 2003]. С внедрением определения молекулярно-генетических маркёров индивидуализация химиотерапии становится всё более распространённой [Gros и соавт., 1986; Cole и соавт., 1992]. Основными наиболее эффективными препаратами в лечении РМЖ, обладающими противоопухолевым действием, являются антрациклины и таксаны. Антрациклины – это одни из самых мощных групп противоопухолевых препаратов, применяющихся в лечении рака молочной железы. Однако они могут вызывать ряд токсических эффектов, в особенности кардиотоксичности (что может привести к сердечной недостаточности) [Castaneda C.A., Gomez H.L., 2009; Glynn и соавт., 2010]. Топоизомераза II альфа представляет собой гомодимерный фермент, который существует в двух изоформах в клетках человека: 170-кДа топоизомераза II альфа и 180-кД TOP2 бета (Wang J.C., 1996). Топоизомераза II альфа – сложный белок, необходимый для процесса репликации, является ключевым ферментом в метаболизме ДНК и главной целью антрациклинов [Evans А., 1999; Knoop и соавт., 2005]. Доксорубицин представляет собой ДНК агент, который ингибирует топоизомеразу II в ходе репликации ДНК, вызывая повреждение ДНК, в результате и происходит апоптоз клетки [Pommier и соавт., 2010]. На лабораторных животных в преклинических исследованиях было установлено, что уровень экспрессии top 2α является значимым фактором, устанавливающим чувствительность опухоли к доксорубицину [Binaschi M., 2001]. 20 По данным J. Coon (2002), в исследовании, в котором принимало участие 35 больных местно-распространённым раком молочной железы, амплификация гена была обнаружена в 6 случаях, а у 4 из них наблюдался pCR на фоне проведения химиотерапии с включением антрациклиновых антибиотиков и в двух случаях – частичный регресс опухоли. Ретроспективные исследования адъювантной химиотерапии показали, что химиотерапия на основе антрациклинов более эффективна у женщин с HER2-положительными опухолями молочной железы, возможно топоизомераза II-альфа является медиатором в этом процессе. Антрациклины способствуют цитотоксичности клетки, связывая топоизомеразу II и вызывая повреждение ДНК. Очень близко к гену HER2 расположен ген топоизомеразы II, который локализуется на хромосоме 17q12. Имеются данные, что гиперэкспрессия топоизомеразы коррелирует с повышенной чувствительностью к антрациклинам. Два исследования, представленных на 23 конференции по раку молочной железы в Сан-Антонио, изучали значение экспрессии топоизомеразы II и HER2 при лечении антрациклинами больных диссеминированным раком молочной железы. Доктор Isola и соавт. (2000) представила данные о лечении эпирубицином. В исследовании было включено 303 больных метастатическим раком молочной железы. Гиперэкспрессия в гене HER2, определяемая с помощью метода FISH (иммунофлюоресценция in citu), наблюдалась у 17 из 303 больных. Из них 43% имели амплификацию топоизомеразы II, у 41% ген топоизомераза II отсутствовал и только 16% больных имели нормальную экспрессию топоизомеразы II. Среди 124 больных HER2-отрицательных опухолей (FISH) только у 3-х наблюдалась делеция гена топоизомераза II и ни у одного не было отмечено амплификации. Но существуют и противоречащие данные, об отсутствии взаимосвязи амплификации гена топоизомераза II альфа и экспрессии HER2 [Mueller R., 2004]. При назначении антрациклинов хорошие результаты более ожидаемы, когда в опухоли имеется гиперэкспрессия маркера – топоизомераза II-альфа. 21 Похожие исследования проводились только на одной группе новообразований – опухолях молочной железы [Coon и соавт., 2002; Di Leo и соавт., 2002; MacGrogan и соавт., 2003; Park и соавт., 2003; Knoop и соавт., 2005; Tanner и соавт., 2006]. Значимое предиктивное значение высокой экспрессии top 2α и частоты объективных ответов на фоне лечения антрациклинами показало исследование рака молочной железы [MacGrogan G., 2003; Martin-Richard M.,2004]. К сожалению, некоторые опухоли обладают врождённой устойчивостью к химиотерапии, в то время как другие приобретают устойчивость к химиотерапии через наличие мутаций [Mao и соавт., 1999]. Отсутствие чувствительности к химиотерапии является основной проблемой для успешного лечения, как в качестве 1-й линии, так и при лечении рецидивов [Hannon G.J., 2002]. По данным W. В. Gradishar (2009), в основе механизма развития резистентности к антрациклинам лежит гиперэкспрессия белков, осуществляющих выведение препарата из опухолевой клетки, таких как Р-170 гликопротеин (P-gp) и белок множественной лекарственной резистентности 1 (MRP1). По причине гиперэкспрессии этих белков происходит усиленный выброс цитостатиков из клетки (таблица 1.3). Таблица 1.3. –Экспрессия HER2 и топоизомераза II альфа и эффективность эпирубицина Статус HER2 Статус топоизомеразы Частота объективного эффекта FISH - Все больные 53% FISH + Все больные 46% FISH + Амплифицирован 79% FISH + Не изменен 35% FISH + Делеция 17% 22 Это исследование показало, что экспрессия гена топоизомераза II альфа является предсказывающим эффективность химиотерапии антрациклинами фактором у женщин с HER2-экспрессирующими опухолями. Кроме того, высокая экспрессия топоизомераза II альфа коррелирует с большей частотой объективного ответа, более длительным безрецидивным промежутком и общей продолжительностью жизни. Исследование, проведённое в Rush University в Чикаго [Coon и соавт., 2000], выявило, что у больных местнораспространенным раком молочной железы, которые получили лечение доксорубицином и таксотером, ампфлификация гена топоизомераза II альфа была определена в опухолях у трех больных и у всех троих был достигнут полный регресс опухоли после индукционной химиотерапии с включением доксорубицина, в то время как только у 3 из 17 больных без ампфлификации гена топоизомеразы II в опухоли была достигнута полная регрессия опухоли. Полный регресс опухоли среди больных с HER2-положительным статусом опухоли молочной железы достигнут у 4 из 5 больных, в то время как у больных без гиперэкспрессии HER2 подобный результат был достигнут только у 2 из 15 больных. G. Ferrandina (2006) выявил ответственный белок за чувствительность к препаратам таксанового ряда – бета-тубулин III класса , состоящий из двух субъединиц – -тубулина и β-тубулина. Таким образом препараты таксанового ряда, связывают β-тубулин, стабилизируя гуанозндифосфат – связанную форму бета-тубулина III класса, что приводит к блокировки деполимеризации и стимуляции полимеризации тубулина из-за отсутствия гуанозинтрифосфата. В результате чего происходит остановка клеточного цикла и активация апоптоза [Castaneda C.A., Gomez H.L., 2009]. Исследования показали, что резистентность опухоли к препаратам, воздействующим на микротрубочки (таксанам), обусловлена гиперэкспрессией β-тубулина класса III [Kamath K., 2005; Seve P., 2005; Ferrandina G., 2006; Urano N., 2006]. 23 Rosell R. (2003), Dumontet C. (2005) предположил, что высокая экспрессия β-тубулина III класса, определённая ПЦР в реальном времени, обладает неблагоприятным прогностическим фактором у больных раком лёгкого. Гиперэкспрессия белка бета-тубулина III класса в опухоли продемонстрировало низкий эффект от лечения паклитакселом при раке яичника и лёгкого [Mozzetti S., 2005; Paradiso A., 2005; Ferrandina G., 2006; Seve P., 2005]. По данным литературы такая же корреляция наблюдается при химиотерапии доцетакселом РМЖ и рака желудка [Hasegawa S., 2003; Miyoshi Y., 2003; Urano N., 2006]. Dumonet и соавт. (2005) изучили прогностическую значимость экспрессии β-тубулина III класса в опухолях местно-распространённого и метастатического НМРЛ (n=91), получавшие таксаны. Пациенты у которых опухоль экспрессировала низкий уровень бета-тубулина III класса, имели более высокую частоту объективных ответов, более длительное время до прогрессирования и общую выживаемость (p<0,001; 0,004 и 0,002 соответственно). Исследования C. Burkhart (2001) и S. Mozzetti ( 2005) при раке яичников, НМРЛ и раке молочной железыпоказали, что высокий уровень экспрессии бета-тубулина III класса коррелирует с резистентностью опухоли к паклитакселу; а при раке поджелудочной железе к доцетакселу [Liu B., 2001]. Выявление биомаркеров на основе различных технологий, таких как иммуногистохимии, флуоресцентной гибридизации и хромогенных гибридизаций будут играть важную роль в дальнейшем развитии целевой терапии и могут служить ориентиром для назначения индивидуального лечения в онкологии [Проценко С.А., 2012]. Персонализированная медицина, направленная на поиск конкретного лекарственного препарата конкретному больному в соответствии с его генотипом, безусловно, перспективна [Jain K., 2009; Nair S., 2010; Arteaga и соавт., 2012]. В течение многих лет предпринимались различные способы классифицировать опухоли молочной железы. Попытки сгруппировать РМЖ, основываясь на клинико-морфологических характеристиках, оказывались неутеши- 24 тельными. Moll в 1982 г. впервые предложил разделить все карциномы на «люминальные» и «базальные», в зависимости какие цитокератины в них экспрессируются. Dairkee в1987 г. описал взаимосвязь между ранним рецидивом РМЖ и экспрессией базальных цитокератинов. В 1998 г. Мalzahn и соавт. описал, что базальный РМЖ, как правило, эстроген-негативен, низко дифференцированый и имеет плохой прогноз. Применение техники микрочипов для тотального скрининга транскрипционной активности генома раковой клетки позволило подойти к разгадке причин фенотипической гетерогенности опухолей молочной железы. В 2000 г. Перу и соавторы использовали микрочипы, содержащие гибридизационные пробы к 8102 мРНК, для получения индивидуальных экспрессионных профилей опухоли. Благодаря использованию кластерного анализа удалось выделить “внутреннюю панель”, состоящую из 465 генов, которые варьировали между образцами, определяя пять различных экспрессионных паттернов. Исходя из этого, было принято решение все карциномы разделить на несколько молекулярных подтипов: две группы с положительным статусом эстрогеновых рецепторов (ER), относящиеся к люминальным подтипам А и В; группу, экспрессирующую рецепторы HER2; группу, в которой экспрессия генов молочной железы остается в норме, и базальные или “трижды-негативные” опухоли [Sorlie и соавт., 2003; Hu и соавт., 2006; Perou и соавт., 2011]. Доказанность молекулярных подтипов было подтверждено в дальнейших исследованиях. РНК профайлинг карцином in situ, также продемонстрировал правомочность этой молекулярной классификации [van der Groep P., 2009]. Классификация экспрессий подтвердил тот факт, что разные подтипы РМЖ не просто имеют отличные друг от друга наборы молекулярных маркеров, но и характеризуются специфической биологией, прогнозом,а также предусматривают индивидуальный подбор терапии. Пациенты с люминальным А подтипом опухоли имеют самую длительную выживаемость; базальный и HER2-позитивный подтип РМЖ характеризуется плохим прогнозом и наименьшей выживаемостью; люминальный В подтип опухоли занимает 25 промежуточное место. Известно, что молекулярный подтип является независимым прогностическим признаком и с высокой точностью предсказывает эффективность терапии [Parker и соавт., 2009]. Знание принадлежности опухоли к определённому биологическому подтипу (люминальный А и В, HER2 экспрессирующий, базальноподобный) лежит в основе выбора лекарственной терапии (химиотерапии, эндокринотерапии, таргетной терапии), а молекулярно генетические характеристики позволяют дать более точный прогноз и уточнить выбор конкретного препарата [Семиглазов В.Ф., 2013; Cheang M., 2009] (таблица 1.4). Таблица 1.4. – Системное лечение, рекомендованное для подтипов РМЖ (St. Gallen, 2013) Подтип Тип терапии «Люминальный А»: - ER и/или PgR (+) (ASCO/CAP); - HER2 (-) (ASCO/CAP); - Ki 67<14% (получен при сравнении с данными генного анализа пролиферации как прогностического фактора); - низкая степень злокачественности «Люминальный В (HER2-негативный)»: - ER и/или PgR (+); HER2 (-); - Ki 67 >14% ; - высокая степень злокачественности «Люминальный В (HER2-позитивный»): - ER и/или PgR (+) ; HER2 (+) «HER2 позитивный (нелюминальный)»: - ER и PgR отсутств. - HER2 (+) Трижды негативный (дуктальный): ER и PgR отсутст. HER2 (-): HER2 0, HER2 1+, HER2 2+ и FISH (-) Одна эндокринотерапия (химиотерапия в редких случаях у женщин <50 лет при наличие множественных л/узлов). Эндокринотерапия +/- химиотерапия Химиотерапия + анти - HER2 терапия + эндокринотерапия) Химиотерапия + анти HER-2 терапия химиотерапия: - антрациклины; - таксаны; - алкилирующие агенты (циклофосфан; - не поддержано рутинное использование 26 цисплатина и карбоплатина) Люминальный А подтип диагностируется у 30-45% пациентов. Опухоль имеет высокую экспрессию эстрогеновых рецепторов (ESR1), XBP1, FOXA1, GATA3, TTF3, LIV3, HER4, PIK3RI, люминальные цитокератины (KRT8/ 18), также имеется экспрессия маркеров IHC: ER/PR+, HER2-, KRT8/18+ [Hoadley и соавт., 2007]. Также этот подтип имеет активированный эстрогеновый сигнальный путь и метаболизм жирных кислот. К клиникопатологическим и прогностическим особенностям относятся: эстрогензависимые опухоли; характерен более поздний возраст на момент диагноза, высокая степень дифференцировки, низкий пролиферативный индекс. Опухоли относящиеся к этому типу менее агрессивны, характеризуется лучшим прогнозом по сравнению с рецептор-негативными раками (Carey и соавт., 2006). Риск развития рецидивов в течение первых 2 лет у пациентов люимльного А подтипа снижен, а общая выживаемость увеличена. Отмечают высокую эффективность гормональной терапии (тамоксифен и ингибиторы ароматазы) и неоадъювантной химиотерапии (доксирубицин, паклитаксел, фторурацил, циклофосфамид). Также весомая доля BRCA2-ассоциированных раков относится к этому Люминальному А подтипу [Parker и соавт., 2009]. Молекулярно-генетические особенности люминального А подтипа: +1q, +16p, - 16q, LOH BRCA2, амплификация 11q13, высокий тотальный уровень метилирования генома и специфически метилированы гены RASSF1, GSTP1, MMP7, PEG10, APC [Melchor L., Benítez J.,2008]. По данным литературных источников Люминальный B подтип встречается в 14-18% случаев РМЖ. Кластер генов подтипа высоко экспрессирует в опухоли: ESR1, CCNB1, MKI67 (Ki-67), MYBL, CCNE1, ERBB2, GRB7, HRAS. Маркеры IHC экспрессируют: ER/PR+; HER+; Ki-67> 13%; активирован HER2 сигнальный путь и пролиферация [Cheang M.C., 2009]. Клинико- 27 патологические и прогностические особенности подтипа: эстроген- зависимый агрессивный рак, для которого характерен молодой возраст, низкая дифференцировка, высокий пролиферативный индекс, большой размер опухоли и поражение лимфатических узлов. Опухоли этого подтипа имеют значительно худший прогноз и большую вероятность рецидивов, чем другие рецептор-позитивные опухоли. В большинстве случаев они не чувствительны к тамоксифену и ингибиторам ароматазы, но обладают чувствительностью к терапии направленной на блок HER2 рецепторов - трастузумабу. Молекулярно-генетические особенности подтипа: имеется амплификация онкогена HER2 и генов 17q ампликона, а также амплификация высокого уровня 8p11p12, 8q21-q24, 20q13; гиперактивация ключевых промоторов клеточного цикла (например, cyclin E1) и клеточного роста (например, TOPOII) [Melchor L., Benítez J., 2008]. Наивысший тотальный уровень метилирования генома среди всех подтипов; специфически метилированы гены RASSF1, GSTP1, CHI3L2 [Holm и соавт., 2010]. Базальный, или «трижды негативный» подтип встречается в 27-39% случаев РМЖ. Гены кластеры, которые высоко экспрессируются в опухоли: онкогены NRAS, KRAS, C-KIT, кадхерин P (CDH3), ламинин альфа/гамма (LAMA5, LAMC1), MCM3/4/7, базальные цитокератины (KRT5/6/17); маркеры IHC: ER-/PR-; HER2-; CK5/6+, EFGR (HER1)+, cadherin-P+; виментин+; c-kit+ [Livasy и соавт., 2006; Nielsen и соавт., 2004]. Активированные пути – p21, р53, FAS сигнальные пути, фосфорилирование белков, стимуляция клеточного цикла и пролиферации, дедифференцировка [Hoadley и соавт., 2007]. Клинико-патологические и прогностические особенности: эстроген-негативные агрессивные опухоли, молодой возраст пациенток, протоковый или метапластический гистологический тип, низкая дифференцировка опухоли, высокий пролиферативный индекс, большой размер опухоли, поражение лимфатических узлов, ядерный плейоморфизм и некрозы. Базальные опухоли отличаются высокой агрессивностью, большой вероятностью развития местнораспространенных и 28 метастатических форм. У пациенток с базальным РМЖ очень плохие перспективы выздоровления независимо от поражения лимфатических узлов. Выживаемость в этой группе ниже, чем для любого другого молекулярном подтипа, включая HER2позитивный. Базальноподобный рак чувствителен к стандартным химиотерапевтическим схемам, включая антрациклин и таксансодержащие схемы. Наследственный BRCA1-ассоциированный РМЖ чаще относится к этому подтипу [Antoniou и соавт., 2003]. Нарушение репаративных систем делает злокачественные клетки уязвимыми для препаратов платины, ингибиторов топоизомеразы I и полиADP- рибополимераз (PARP) [Imyanitov E.N. 2009]. Молекулярно-генетические особенности: высокая частота соматических р53 мутаций, высокий уровень геномной нестабильности, LOH BRCA1; +3q, -3p, -4p, 4q, -5q; PTEN аберрации; инактивация RB; повышенная экспрессия теломеразы; низкий тотальный уровень метилирования генома; специфически метилированы гены ARHGDIB, GRB7, SEMA3B [Melchor и соавт., 2008; Holm и соавт., 2010]. HER2 (ERBB2) позитивный РМЖ встречается у 8-15% пациенток. Кластер генов, высоко экспрессирует в опухоли: ERBB2 (HER2), GRB7, HRAS, MEK1/MEK2, AKT1; IHC маркеры: ER-/PR-; HER2+; Ki-67> 13%; акивирован EGFR/HER2 сигнальный путь, пролиферация [Holm и соавт., 2010; Cheang и соавт., 2009]. Клинико-патологические и прогностические особенности подтипа – эстроген-независимые агрессивные опухоли с высоким пролиферативным индексом, характерна низкая дифференцировка, большой размер опухоли, вовлечение лимфатических узлов. Эффективно адъювантное назначение трастузумаба; не чувствительны к гормонотерапии. Высокая вероятность негативного исхода заболевания [Carey и соавт., 2006; Theillet C. 2010]. Молекулярно-генетические особенности: амплификация онкогена HER2 и генов 17q ампликона. +1q, -8p [Melchor L., Benítez J., 2008]. Кроме уменьшения стадии заболевания и выполнения органосохраняющей операции, целью предоперационной химиотерапии является оценка 29 лечебного патоморфоза проводимого лечения, с последующим подбором препаратов для проведения адъювантной терапии [Dowsett и соавт., 2011]. Выбор терапии для конкретного пациента рака молочной железы основан на средних результатах рандомизированных клинических испытаний [Jan Trоst Jоrgensen et al., 2006]. Выявление факторов, предсказывающих ответ на лечение (predictive factors) остаётся актуальным и по сегодняшний день [Семиглазов В.Ф., 2002]. В ежедневной лечебной практике наиболее часто применяемые режимы основаны на препаратах антрациклинового ряда: FAC (доксорубицин +циклофосфан + 5-фторурацил), FEC (эпирубицин +циклофосфан+ 5фторурацил), CMF (циклофосфан+метотрексат+5-фторурацил), АС (циклофосфан +доксорубицин), а также режимы включающие препараты таксанового ряда: ТАС (доцетаксел/паклитаксел + циклофосфан + адрабластин), ТС (доцетаксел/паклитаксел + циклофосфан), различные режимы монохимиотерапии доцетакселом/паклитакселом, таргетная терапия трастузумабом, гормонотерапия. Однако, несмотря на несомненный прогресс в лекарственной терапии местнораспространённого рака молочной железы, результаты лечения остаются недостаточными, а «золотой стандарт» химиотерапии отсутствует [Семиглазов В.Ф., 2013]. Современная предоперационная химиотерапия, имеет ряд существенных недостатков, одним из которых является эмпирический выбор ее назначения. Учитывая, что большинство цитостатиков снижает качество жизни больных, а их использование имеет низкий терапевтический эффект, отказ от заведомо неэффективного лечения может быть наилучшим терапевтическим решением [Akiyama S., 2005]. Также не стоит забывать о высокой стоимости современных онкологических препаратов. Разработка маркеров, которые помогут заранее предсказать ответ на химиотерапию поможет снизить частоту побочных эффектов и уменьшить затраты на терапию за счет более обоснованного использования препаратов [Robert и соавт., 2004; Chabner и соавт., 2005; Robert и соавт., 2005]. 30 Знание молекулярно-генетических характеристик опухоли может индивидуализировать выбор цитостатика и уменьшить риск появления побочных эффектов [Jain и соавт., 2004]. В неоадъювантном системном лечении прежде всего нуждаются больные с местно распространёнными (неоперабельными формами) опухолями (T3-4N1-2; T2-3N2-3; T4N0M0), а также воспалительные формы РМЖ, с целью перевода опухоли из неоперабельной в операбельную. Также кандидатами для проведения предоперационной системной химиотерапии являются пациентки с операбельным РМЖ категории T2-3N0-1M0,которым планируется выполнение радикальной мастэктомиии, но желающим сохранить молочную железу [Семиглазов В.Ф., 2011]. Применение предоперационной (первичной) химиотерапии позволяет распознать чувствительность к определённому препарату на начальном этапе, тем самым улучшить результаты лечения местно-распространённого рака молочной железы. Данные, полученные на большом количестве пациентов, подтверждают гипотезу о том, что первичная опухоль и микрометастазы имеют сходную чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Поэтому при неэффективности предоперационной системной терапии можно прогнозировать подобный ответ на лечение теми же препаратами в адъювантном режиме [Bonadonna и соавт., 2006; Kaufmann и соавт., 2007]. Данные, полученные в Объединённом Европейском испытании, продемонстрировало увеличение органосохраняющего лечения с 37% без предоперационного лечения до 65% после проведения 4 курсов неоадъювантной химиотерапии по схеме АТ (доксорубицин+паклитаксел) с последующим проведением 4 циклов химиотерапии по схеме CMF (р < 0,001) [Gianni и соавт., 2002]. Во Франции в Институте Кюри органосохраняющее лечение было выполнено у 77% и у 82% после проведения неоадъювантной химиотерапии [Scholl и соавт., 1994]. В исследование NSABP В-18 (National Surgical Breast and Bowel Project), сравнивающее неоадъювантную и адъювантную химиотерапии, бы- 31 ло включено 1523 больные. Первая группа получила 4 цикла химиотерапии по схеме АС (доксорубицин в дозе 60 мг/м2 и циклофосфамид в дозе 600 мг/м2 каждые 3 недели) предоперационно, 2-я группа получила химиотерапию по такой же схеме после операции [Fisher и соавт., 2002]. Данные этого исследования охватывает 16-летний период наблюдения [Rastogi и соавт., 2008]. У 80% больных, получавших предоперационную химиотерапию по схеме АС, наблюдался объективный ответ, а полный ответ наблюдался у 36% больных. Полный патоморфологический ответ (pCR) отмечен у 13% больных. Кроме того, у большего числа больных после неоадъювантной химотерапии выполнены органосохраняющие операции (68% против 60%; р=0,001). Но это не привело к увеличению безрецидивной и общей выживаемости [Wolmark N., 2001]. При более позднем анализе этого исследования было установлено, что у пациенток, получивших неоадъювантную химиотерапию, моложе 49 лет, достоверно лучше оказались показатели безрецидивной и общей выживаемости; у пациенток старше 50 лет выживаемость была хуже. По данному исследованию можно предположить, что проведение неоадъювантной химиотерапии может в какой-то степени определяться возрастом [Семиглазов В.В. и соавт., 2009]. В исследовании NSABP B-27 изучался главный вопрос: увеличится ли выживаемость, если добавить таксаны к схеме, включающей антрациклины, больных с операбельным РМЖ. Исследование включало 2411 больных которые получали 4 цикла неоадъювантной терапии по схеме АС, а затем были разделены на 3 группы в зависимости от последующего лечения: 1-я группа больных – без последующей терапии, 2-я группа далее получила 4 цикла химиотерапии доцетакселом неодъювантно (100 мг/м2 каждые 3 недели) и 3-я группа получила 4 цикла химиотерапии доцетакселом адъювантно. Последний анализ охватил 8,5 года наблюдения. Сравнение ответа опухоли на лечение во 2-й группе с 1-й и 3-й группами показало, что добавление доцетаксела улучшило показатели объективного ответа (91% против 86%; р<0,001), повысило частоту полного ответа (64% против 40%) и удвоило частоту полного 32 патоморфологического ответа (26% против 14%).Однако отличий выживаемости между группами не выявлено. Статистически достоверное снижение частоты местного рецидива заболевания, наблюдалось в обеих группах, получавших доцетаксел [Smith I.C., 2002]. В исследовании, проведённом A.U. Buzdar и соавт. (1999), все 174 больные были разделены на 2 группы, 1-я группа получала химиотерапию по схеме FAC, 2-я группа получала монохимиотерапию паклитакселом (250 мг/м2). Клинический ответ был сравнен между двумя группами, получавшими FAC и паклитаксел (70,7% против 80,2%; р=0,9). Полный потоморфологический ответ выявлен у 16,4% больных в группе FAC и у 8,1% получавших паклитаксел. Но 4-летняя безрецидивная выживаемость была одинакова в обеих группах. В двух исследованиях V. И Dieras соавт. (2004) оценивалась неоадъювантная терапия с использованием комбинации доксорубицина и таксанов. Параллельное исследование доксорубицина в сочетании с паклитакселом (АР) и химиотерапии по схеме АС показало хороший ответ (у 89% и 70% больных соответственно) для обеих схем, но для сравнения эффекта не было достаточно числа больных. T.R. Evans и соавт. (2005) сравнивали схему АС с комбинацией доксорубицин+доцетаксел (AD). Достоверных отличий по частоте полного клинического и патоморфологического ответа (24% против 21%; р=0,61) и частоте рецидивирования при наблюдении в течении 32 мес не показало. Результаты исследований NSABP B-18 и В-27 показали зависимость, заключающуюся в том, что у больных, у которых удалось достичь полного патоморфологического ответа, исход намного благоприятнее в сравнении с пациентками достигших частичный ответ. У больных с полным патоморфологическим ответом достоверно и значительно увеличивались показатели безрецидивной и общей выживаемости (р<0,0001). Исследование GEPAR-trio, включающее 2090 больных, основывалось на том, что первоночально пациентки получали 2 цикла неоадъювантной хи- 33 миотерапии по схеме ТАС (доцетаксел 75 мг/м2, доксорубицин 50 мг/м2 и циклофосфамид 500 мг/м2 каждые 3 недели). Далее после первой оценки эффекта на проведённое лечение больные на основании данных УЗИ были разделены в группы: отвечающие на лечение (уменьшение размера опухоли более чем на 50%) и не отвечающие (уменьшение менее на 50%), группа больных, у которых было прогрессирование процесса, исключалась из исследования. Исследование продолжалось в 2 частях, в одной оценивалось изменение терапии у больных, не ответивших на первую линию терапии, в другой – оптимальная продолжительность терапии у ответивших на первую линию терапии. В первой части 622 больных, не ответившие на первичное лечение (ТАСх2), рандомизированы на 2 группы: 1-я группа получала 4 цикла ТАС каждые 3 недели, 2-я группа получала схему NX (винорелбин 25 мг/м2 в 1-й 8-й день и капецитабин (Кселода) 1000 мг/м2 внутрь 2 раза в день с 1-го по 14-й день) [Vov Minckwitz и соавт., 2008]. Достоверных различий в показателях сонографического ответа для обеих схем не наблюдалось, что подтверждало не меньшую эффективность NX. Показатели полного патоморфологического ответа были низкими как для схемы NX, так и для схемы ТАС (6 и 5,3% соответственно). Во второй части испытания 1390 больных, ответивших на 2 цикла химиотерапии по схеме ТАС, продолжили получать 4 или 6 циклов химиотерапии по схеме ТАС (6–8 суммарно) [Vov Minckwitz и соавт., 2008]. При подведении результатов не было выявлено достоверных различий в показателях полного патоморфологического ответа (8 циклов – 23,5% против 6 циклов – 21,0%; р=0,68). Таким образом, чувствительность опухоли к химиотерапии не увеличивается от увеличения количества проведённых циклов химиотерапии. Одна из самых важных характеристик предоперационной химиотерапии – патоморфологический ответ опухоли (ypT0N0) на проведённое лечение. Полный патоморфологический ответ (ypT0N0) является «суррогатным» маркёром улучшения показателей выживаемости больных. 34 По данным Konga X., полный патоморфологический ответ (по Payne Miller V степень) ypT0N0, является благоприятным прогностическим фактором для прогнозирования безрецидивной выживаемости. Также работы L. Esserman, P. Cortazar, G. von Minckwits продемонстрировали те же результаты. Но стандарты по неоадъювантной химиотерапии до сих пор отсутствуют. Антрациклин содержащая комбинированная химиотерапия в качестве первичного системного лечения по данным литературы приводит к высокой частоте клинических частичных и полных ответов, хотя при патоморфологическом исследовании лишь небольшой процент достигает полный регресс опухоли (от 5 до 15%). Но, тем не менее, при комплексном подходе, включающем применение химиотерапии, оперативного лечения и лучевой терапии, удаётся достичь хороших результатов у 79% больных местно-распространённым раком молочной железы [Семиглазов В.В., Топузов Э.Э., 2009]. Принимая решение о выборе терапии, клиницисты нуждаются в информации о молекулярно-биологическом портрете данной опухоли. Таким образом, молекулярная классификация опухолей является мощным инструментом для выбора наиболее чувствительной неоадъювантной химиотерапии местно-распространённого РМЖ. Морфологическое исследование опухоли при раке молочной железы до середины 1960-х годов проводили с целью определения ее гистологического строения, а также состояния регионарных лимфатических узлов. Применение неоадъювантной ситемной терапии при местнораспространенном РМЖ привело к более подробному изучению характеристик опухоли: определение иммуногистохимических показателей и молекулярно-биологических маркеров, а также обязательное определение лечебного патоморфоза как показателя чувствительности опухоли к проведенному лечению Лечебный патоморфоз – это изменения клинических и морфологических характеристик опухоли под воздействием специфического лечения [Раппопорт Я.Л., 1962; Лушников Е.Ф., 1977; Краевский Н.А., 1976]. Оценками эффективности яв- 35 ляются: уменьшение размеров опухоли и пораженных ЛУ. Исследование патоморфологического ответа определяется изменениями опухоли на клеточном уровне и проявляется апоптозом и дистрофией клеток, а также формированием полей некроза и развитием очагов фиброза и склероза. Субъективный клинический эффект, оцениваемый физикально, зачастую имеет с преувеличение [Apple S.K., Suthar F., 2006]. При сравнении полученных данных при физикальном и инструментальном обследования (ультразвукового исследования, маммографии, магнитно-резонансной томографии, макро- и микроскопической оценок) установлено, что наиболее точным методом является микроскопическая оценка размеров опухоли. Применение других методик имеют склонность к переоценке результатов неоадъювантного лечения. Макроскопическая оценка размеров опухоли сравнима с микроскопической оценкой только в 19 % случаев, в 56 % наблюдений размеры остаточной опухоли преувеличены, а в 25 % – преуменьшены [Лисаева А.А. и соавт., 2011]. Множество классификаций лечебного патоморфоза в зависимости от степени морфологических изменений были изучены как отечественными, так и зарубежными авторами. В России основные положения изложены в работах Г.А. Лавниковой (1972), Е.Ф. Лушникова (1977), Н.А. Краевского (1977). В Великобритании патологоанатомы используют классификацию I.D. Miller и S. Payne (1999), а во Франции конкурируют классификации В. Chevallier (1993) и D.M. Sataloff (1995). Также известны работы S. Akashi-Tanaka et al. (1996), A.H. Honkoop et al. (1998), H.M. Kuerer et al. (1998), I.C. Smith et al. (2000). По данным этих авторов: при I степени изменения в общей структуре опухоли отметить не удается, прослеживаются лишь несвойственные данному новообразованию полиморфизм и дистрофия клеток, а также подавление митозов; ко II степени относят опухоли, в которых, несмотря на сохранение основной массы опухоли, отчетливо видны очаги регрессивных изменений различного характера при наличии выраженных дистрофических изменений в клетках; к III степени – опухоли, структура которых резко изменеа за счет фиброзного замещения, обширного некроза, выраженных в разных опухолях 36 в неодинаковой степени; на этом фоне определяют остатки опухоли в виде разрозненных групп паренхиматозных клеток, обычно с резкими дистрофическими изменениями; к IV степени патоморфологического ответа относят полное исчезновение элементов опухоли, но иногда могут определяться «следы» опухоли в виде гранулем вокруг роговых масс, очагов некроза, лишенных клеточных элементов, или «озер» слизи. По классификации Е.Ф. Лушникова определены 4 степени лечебного патоморфоза: I степень – изменения на субклеточном и молекулярном уровне, в тканях окружающих опухолевые комплексы, изменения не выражены; II степень – повреждение в основном паренхиматозных элементов опухоли (дистрофические и некробиотические изменения клеток опухоли, нарушения деления клеток с появлением гигантских форм), в строме опухоли – сосудистые изменения, активация клеток соединительной ткани; III степень – нарушение структуры опухоли в результате большой гибели опухолевых клеток (поля некроза, выраженные сосудистые расстройства, разрастание соединительной ткани), но сохраняются опухолевые клетки без повреждений, которые в дальнейшем могут приводить к развитию рецидива опухоли.; IV степень – замещение некротизированной опухолевой ткани соединительной тканью, кистообразование, в окружающих тканях – атрофические, дистрофические и склеротические изменения. В классификации I.D. Miller и S. Payne выделено 5 степеней патоморфологического ответа на лекарственное лечение. В этой классификации учитываются изменения в клеточности опухоли по сравнению с материалом, полученным при выполнении трепан-биопсии до начала лечения. Патоморфолог при оценке патоморфологического эффекта имеет возможность прицельно изучить структуру первичной опухоли и более точно подойти к оценке лечебного патоморфоза [Miller I.D. и соавт., 2002]. В. И Chevallier соавт. в своей классификации (1993) выделели 4 класса патоморфологических изменений, но, в отличие от других классификаций, классы пронумерованы в обратном порядке: класс 1 (Ch1) — полное исчез- 37 новение опухолевых клеток в ткани молочной железы и ЛУ; класс 2 (Ch2) — наличие рака in situ в молочной железе, в ЛУ опухолевые клетки не определяются; класс 3 (Ch3) — инфильтративный рак на фоне повреждения стромы (склероз, фиброз стромы); класс 4 (Сh4) — отсутствие изменений или незначительные изменения в опухоли [Chevallier B. и соавт., 1993]. По классификации D.M. Sataloff et al. (1995), полное исчезновение опухолевых клеток и рак in situ объединены в одну группу – полного или почти полного морфологического эффекта. В этой классификации проанализированы изменения, выявленные в ткани молочной железы и ЛУ. В работе проводили сравнение лечебных (клинических) изменений с морфологическими изменениями в опухоли и ЛУ, в классификации представлены данные клинического и морфологического эффектов [Sataloff D.M. и соавт., 1995]. В ткани молочной железы: 1) Т–А – полный или почти полный лечебный эффект, свидетельствующий о наличии минимальной остаточной опухоли (рассеянные опухолевые клетки на площади < 5 % ложа опухоли при обязательной оценке всей опухолевой поверхности или оценке > 15 полей зрения), но клетки могут быть рассеяны или сгруппированы; в ЛУ: отсутствие признаков метастатического поражения, выраженный лечебный эффект; 2) Т–В – лечебный эффект > 50 %; в ЛУ – отсутствие признаков метастатического поражения и лечебного эффекта; 3) Т–С – лечебный эффект < 50 % в л/у наличие признаков метастатического поражения лечебный эффект не выражен; 4) Т– D – отсутствие лечебного эффекта; метастазы в ЛУ без признаков лечебного патоморфоза. Сравнение классификаций D.M. Sataloff и B. Chevallier было проведено в работе F. Penault-Llorca et al. [Penault-Llorca F. И соавт, 2008] на 710 больных, получивших неоадъювантную полихимиотерапию по поводу местнораспространённого РМЖ. Внутри каждой классификации осуществляли сравнение отдаленных результатов между группой с полным и почти полным морфологическими эффектами (Ch 1 + 2 и Sa A) и группой с неполным морфологическим эффектом или с незначительными изменениями в опухоли (Сh 38 3 + 4 и Sа B + C + D). Продемонстрированы значительные различия в показателях общей (ОВ) и безрецидивной (БРВ) выживаемости. Однако при сравнении отдаленных показателей внутри группы больных (Ch 1 + 2 и Sa A), где был достигнут полный морфологический эффект (ypT0N0 – без опухолевых клеток в молочной железе и ЛУ), и группой, у которой был получен почти полный морфологический эффект (рак in situ в опухоли и ЛУ), значимых различий в показателях ОВ и БРВ не обнаружено. Таким образом, наличие рака in situ после неоадъювантного лечения при условии проведения адекватного адъювантного лечения не влияет на отдаленные результаты. Согласно классификации A.H. Honkoop et al. (1998) выделяют 3 варианта морфологического ответа: полный (ypT0N0) – при макро- и микроскопиче- ском изучении ткани молочной железы и ЛУ не выявлено признаков остаточной инвазивной опухоли; частичный - макроскопически опухоль не определяется, но при микроскопии обнаружены рассеянные фокусы клеток; диффузный – микроскопически опухоль не определяется, но имеется обширная инфильтрация ткани [Honkoop A.H. и соавт., 1997]. R. Burcombe и соавт. (2005) отказались от указанных выше классификаций, мотивируя это отсутствием общепринятой схемы, и предложили свой вариант оценки патоморфологического ответа опухоли: полный ответ – отсутствие остаточной инвазивной опухоли; частичный ответ – остаточная инвазивная опухоль с явлениями патоморфоза (увеличенные клетки с вакуолизированной цитоплазмой, увеличенные пористые ядра с выступающим эозинофильным ядрышком, увеличенные гиперхромные ядра с неровными контурами); стабилизация болезни – инвазивная опухоль без признаков морфологических изменений. Однако из этой классификации неясно, к какой группе следует отнести рак in situ. Таким образом, несмотря на сходства и различия в предложенных классификациях, одним из наиболее обсуждаемых вопросов остается определение полного лечебного патоморфоза (полное отсутствие опухолевых клеток или наличие рака in situ). Международной экспертной группой 39 (International Expert Panel) в 2006 г. было рекомендовано определять полный морфологический эффект как отсутствие инфильтративного рака и рака in situ как в опухоли, так и в ЛУ. W. Symmans и соавт. (2007), предложили искусственный критерий – RCB (Residual Cancer Burden — ложе остаточной опухоли), позволяющий предсказывать БРВ на основании измерения остаточной опухоли (двухмерные показатели с учетом возможной асимметрии опухоли), клеточности опухоли (по классификации Miller–Payne), наличия рака in situ, а также числа и размера пораженных ЛУ. Критерий RCB рассчитывается по формуле с помощью калькулятора (Residual Burden Calculator) на сайте M.D. Anderson Cancer Center, где также можно отнести полученный результат к одной из 3 групп (RCB I, II, III), каждая из которых соответствует низкому, промежуточному и высокому риску развития отдаленных метастазов [Kaufmann M. и соавт., 2006]. Объективный клинический ответ традиционно считается значимым фактором прогноза РМЖ, хотя в исследовании NSABP-B18, посвященном изучению неоадъювантной ХТ, было продемонстрировано, что объективный ответ предсказывает БРВ, но не ОВ [Fisher E.R. и соавт 1997; 2002]. В работе Н.А. Огнерубова (1992) получены результаты ОВ и БРВ в зависимости от патоморфоза. Полная регрессия опухоли (IV степень по Г.И. Лавниковой) сопровождалась максимальными показателями ОВ: 3-, 5-, 10- и 15-летняя выживаемость у пациенток этой группы составила 100; 92,3; 83,1 и 83,1 % соответственно, а при слабовыраженном патоморфозе ОВ на аналогичных сроках достигала 57,8; 42,3; 28,7 и 28,7 % соответственно. Аналогичная тенденция прослеживалась и в отношении бессобытийной выживаемости: при полном пато-морфозе показатели 3-, 5- и 10-летней выживаемости составили 85,6; 76,1 и 76,1 %, при слабом – 42,9; 33,7 и 28,7 %. Различия в показателях между полной регрессией опухоли и слабым, а также умеренным патоморфозом были статистически значимы. Медиана ОВ при отсутствии опухоли в препарате не определялась, при слабом патоморфозе она достигала всего 44,9 мес. Таким образом, несмотря на большое сходство пред- 40 ставленных классификаций, в патоморфологической оценке эффекта от лечения нет общепринятых международных стандартов. 41 Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Характеристика больных Материалом для настоящего исследования послужили данные архива медицинской документации (истории болезни и амбулаторные карты) больных, страдающих местно-распространённым раком молочной железы, включённые в рандомизированное исследование III фазы «Таксаны в комбинации с антрациклинами (ТАС) и без антрациклинов (ТС) в неоадъювантном лечении больных раком молочной железы», которые проходили лечение в ФГБУ НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздрава России с 2010 по 2014 г. Получена информация о 141 больной, получившей первую линию химиотерапии по поводу местно-распространённого рака молочной железы в стационаре за указанный период. Больные были рандомизированы в группы, получающие неоадъювантную химиотерапию по схемам ТАС или ТС 4-6 курсов. Возраст больных составил от 27 до 78 лет. Во всех случаях диагноз рак молочной железы был верифицирован гистологически. Все группы больных сопоставимы по клиническим, патоморфологическим и биологическим характеристикам (таблица 2.1, таблица 2.2). Таблица 2.1. – Распределение больных местно-распространенным РМЖ по молекулярно-генетическим подтипам, получивших неоадъювантную полихимиотерапию по схемам TAC/TC Биологический подтип Люминальный А Общая (n=141) n % 59 группа ТАС (n= 82) 95% ДИ 41,8 33,850,1 N % 32 39,0 ТС (n= 59) р 95% ДИ n % 95% ДИ 28,749,9 27 45,8 33,158,7 0,43 42 Люминальный 30 В HER2пози- 21 тивный Трижды31 негативный 21,3 14,928,5 14,9 9,521,3 22,0 15,529,2 19 23,2 13 15,9 18 22,0 14,633,0 8,724,6 13,631,6 11 18,6 9,729,7 13,6 6,023,6 22,0 12,333,7 8 13 0,51 0,70 0,99 Таблица 2.2 – Распределение больных местно-распространенным РМЖ по экспрессии молекулярно-генетических маркеров, получивших неоадъювантную полихимиотерапию по схемам TAC/TC Экспрессия молеку- Общая лярно-генетических (n=141) маркеров n % группа ТАС (n= 82) 95% ДИ N % ТС (n= 59) 95% ДИ р n % 95% ДИ 29,955,4 0,81 44,670,1 Экспрессия TUBIIIB: Высокая 61 Низкая 79 Экспрессия ТОРIIА: Высокая 73 Низкая 64 BRCA1- ассоцииро- 9 ванный РМЖ 43,6 35,4- 36 51,9 56,4 48,1- 45 64,6 44,4 33,755,5 55,6 44,566,3 25 42,4 34 57,6 53,3 44,8- 44 61,6 46,7 38,4- 35 55,2 6,4 2,9- 4 11,0 55,7 44,566,6 44,3 33,455,5 4,9 1,310,7 29 50,0 29 50,0 5 8,5 37,063,0 0,51 37,063,0 2,7- 0,39 17,1 Больные, включённые в исследование, согласно рандомизации в первой группе получали 4–8 циклов (в среднем 4-6 циклов) химиотерапии по схеме ТАС (доцетаксел 75 мг/м2, доксорубицин 60 мг/м2, циклофосфамид 600 мг/м2) 1 раз в 3 недели; во второй группе получали 4–8 циклов (в среднем 4-6 циклов) химиотерапии по схеме ТС (доцетаксел 75 мг/м2, циклофосфамид 600 мг/м2) 1 раз в 3 недели на фоне стандартной пре- и постмедикации дексаметазоном (суммарная доза 48 мг). При отсутствии объективного ответа (частичного или полного регресса) на фоне проведения химиотерапии по схеме ТС больные переводились в группу ТАС (cross-over). 43 2.2 Обследование больных 2.2.1 Гистологическое исследование У всех больных был морфологически доказанный рак молочной железы. Трепан-биопсия опухоли молочной железы выполнялась на этапе скрининга, а по завершению неоадъювантной химиотерапии проводилось исследование операционного материала. При мультифокальном или мультицентричном росте опухоли исследовали фрагменты всех макроскопически визуализируемых опухолевых узлов, в случае если опухолевый узел отчётливо не определялся, то брали не менее 2 фрагментов ткани из каждой области подозрительных на опухоль. Все края опухоли были исследованы на наличие инвазивного рака или рака in situ, если края резекции не маркированы то исследовали микроскопически ближний край резекции. Отмечалось расположение опухолевого узла в ткани молочной железы, её размеры, гистологический тип инвазивного рака, наличие дуктального или долькового рака in situ, инвазия в кожу или мышцу, размеры краёв резекции, поражение лимфатических узлов, лечебный потоморфоз на проведённое предоперационное лечение. Оценка материала Описывали молочную железу или сектор молочной железы с регионарными лимфатическими узлами или без них, также обязательно отмечали наличие фрагментов скелетной мышцы. Оценка обнаруженных опухолевых узлов Обнаружение более 1 опухолевого узла в исследуемом препарате свидетельствует о мультифокальном и мультицентричной форме РМЖ, что является неблагоприятным прогностическим фактором. К мультифокальному росту опухоли относят очаги инвазивного рака, расположенные на растоянии < 5 см друг от друга, а мультицентрическому – расположенные на расстоя- 44 нии > 5 см. В случае мультифокадьного роста участки инвазивного роста часто имеют схожее биологическое строение (RE, RP, HER2, Ki-67), а при мультицентрическом – они разничные. Стадирование опухоли pT осуществляли по размеру большего узла, при оценке поражения лимфоузлов N учитывали общее количество пораженых лимфатических узлов. Расположение опухолевого узла Оценка расоложения опухолевого узла осуществлялась при помощи разделения молочной железы на квадранты: верхний наружный, нижний наружный, верхний внутренний, нижний внутренний, центральная зона, сосок. Размер наибольшего опухолевого узла. При макроскопическом описании в обязательном порядке измеряли наибольший размер опухоли с точностью до миллиметров, который является важным прогностическим признаком. В случае мультифокального или мультицентричного роста, размеры узлов не суммировались. При наличии в опухолевом узле рака in situ, при установлении стадии заболевания учитывали размер инвазивного компонента. Если же достигался полный патоморфологический регресс опухоли, размер опухолевого узла не указывался, а стадию устанавливали рТ0 иди рТis (при наличии резидуального рака in situ). Оценка гистологической формы инвазивного рака При исследовании послеоперационного материала принципиальное значение имело выявление долькового и протокового рака in situ с микроинвазией. Наличие инвазии кожи и скелетной мышцы Распространение первичной опухоли на кожу описывали при изучении макропрепарата (опухоль врастает в дерму и эпидермис без изъязвления кожи (не влияет на рТ); опухоль врастает в эпидермис кожа с изъязвлением 45 (рТ4b), если нет прорастания опухоли в грудную клетку (рТ4с), отёчноинфильтративная форма (рТ4d); в случаях мультифокального роста, если один из узлов инвазивного рака врастает в кожу (рТb); наличие в лимфатических сосудах опухолевых эмболов, а также при клинически имеющихся признаках отёчно-инфильтративного рака (рТ4d). При наличии врастания в большую и малую грудные мышцы стадию не изменяли. Оценка краёв резекции После радикальной мастэктомии или органосохраняющей операции обязательно проводили оценку краёв репарата. Хирурги маркировали края резекции шовным материалом, расположенным на поверхности фрагмента молочной железы. При вырезке патологоанатом повторно маркировал края макропрепарата красителем. Позитивный край препарата – окрашивался красителем опухоли, поражённые края в обязательном порядке были отражены в заключении. В случае, когда удавалось получить перпендикулярные срезы в отношении к поверхности края препарата, в заключении указывалось расстояние от опухоли до ближайшего края препарата. Следует отметить, что протоковый рак in situ распространяется по протокам, поэтому при близком прилегании опухоли к негативному краю имеется риск наличия поражения в неудалённой ткани молочной железы. Поражение лимфатических узлов При описании лимфатических узлов указывали количество исследованных и количество поражённых лимфатических узлов. Поражённые лимфатические узлы подразделяли на: макрометастазы (очаг > 2 мм) и микрометастазы (0,2–2,0 мм или > 200 клеток). В случае обнаружения только микрометастазов, в категории N обозначали как pN1mi. 46 Оценка степени злокачественности опухоли по Ellison-Elston Степень злокачественности опухоли оценивалась по Ellison-Elston: G1 степень злокачественности – низкая, G2 степень злокачественности промежуточная – умеренная, G3 степень злокачественности – высокая (таблица 2.2). Таблица 2.2 – Оценка степени злокачественности опухоли по Ellison-Elston Признак Баллы Тубулярное строение: Большое количество (> 75%) Умеренное (10-75%) Мало или ни одного (< 10%) 1 2 3 Ядерный плеоморфизм: Слабо выраженный полиморфизм клеток Средне выраженный полиморфизм клеток Выраженный полиморфизм клеток 1 2 3 Подсчёт митозов: Зависит от микроскопа (Nikon Labophot) 1 балл (0-5 митозов) 2 балла (6-10 митозов) 3 балла (>11 митозов) 1 2 3 В зависимости от подсчёта баллов определялась степень злокачественности опухоли: 3–5 баллов: G1 степень злокачественности; 6–7 баллов: G2 степень злокачественности; 8–9 баллов: G3 степень злокачественности. Примеры опухолей разной гистологической степени злокачественности представлены на рисунках 2.1–2.3. 47 Рисунок 2.1 – Гистологическая степень злокачественности G1 (> 75% трубочек с просветом – 1 балл; мелкие круглые ядра с неразличимыми ядрышком – 1 балл, малое число митозов – 1 балл. Сумма баллов 3). Рисунок 2.2 – G2 степень злокачественности (отсутствие тубулярных структур – 3 балла; ядра среднего размерами с мелкими ядрышками – 2 балла; небольшое число митозов на 10 полей зрения -1 балл. Сумма 6 баллов) 48 Рисунок 2.3 – G3 степень злокачественности (отсутствие тубулярных структур – 3 балла, крупные ядра с крупными ядышками – 3 балла; большое число митозов – 3 балла. Сумма 9 баллов). Оценка степени патоморфологического регресса [Miller I., Payne S., 2002] Оценка степени патоморфологического регресса проводилась по классификации Miller I., Payne S., 2002. Примеры оценки в соответствии с этой классификацией представлены на рис. 2.4–2.8. Рисунок 2.4 – 1-я степень - малозаметные изменения отдельных опухолевых клеток без уменьшения их числа. 49 Рисунок 2.5 – 2-я степень – незначительное уменьшение количества инвазивных опухолевых клеток, но в целом клеточность остается высокой. Рисунок 2.6 – 3-я степень – сокращение числа опухолевых клеток вплоть до 90%. 50 Рисунок 2.7 – 4-я степень – выраженное (явное) исчезновение инвазивных клеток. Определяются лишь широко рассеянные небольшие гнезда клеток. Рисунок 2.8 – 5-я степень – нет определяемых инвазивных клеток в секционных срезах из места расположения первичной опухоли или может присутствовать протоковая карцинома in situ. 2.2.2 Иммуногистохимический анализ Экспрессия ER и PR выполнялась полуколичественным иммуногистохимическим методом. Гиперэкспрессия белка HER2/neu определяется иммуногистохимическим методом [Zabrecky и соавт., 1991]. Иммуногистохимическое исследование определения первичных антител к рецепторам эстрогена и прогестерона Her-2 и KI-67 проводилось в па- 51 рафиновых срезах толщиной 3 мкм. Осуществляли прогревание в термостате при температуре 60 0С в течение 30–60 минут. Далее проводили депарафинизацию в кислоте (3 минуты 2), абсолютном спирте (3 минуты 2), 960 этиловом спирте (3 минуты 2) с последующим блокированием эндогенной пероксидазой в 3% перекиси на воде, после чего промывали в дистиллированной воде (3 минуты). Восстановление активности антигенов проводили путём кипячения в ЭДТА буфере (pH 9,0) в водяной бане (Рт – линк DAKO). Стёкла со срезами помещали в контейнер с буфером, прогретый предварительно до температуры 850 С, далее включали нагрев. Демаскировка проводилась для определения рецепторов эстрогена и прогестерона, а также Ki -67 в Трис-эдта буфере рН 9,0, а для HER-2 – в цитратном буфере pH 6,0 при температуре 96–980 С в течение 30 мин. Стёкла переносили в дистиллированную воду на 1–2 минуты, промывали в TBS и оставляли в TBS до нанесения первых антител. Инкубация с первичными антителами (30 минут при комнатной температуре), разведенными Antibody diluents (DAKO). Для определения рецепторов эстрогена использовали NCL-L-ER-6F11-антитело в разведении 1:50 (LEICA); рецепторов прогестерона – NCL-L-PGR-312-антитело в разведении 1:50 (LEICA); Ki-67 – использовали SP6-антитело в разведении 1:100 (Neo Markers); HER-2 – использовали cerbB-2 oncoprotein-антитело в ра4ведении 1:400 (DAKO). Инкубация с Envision mouse/rabbit (30 минут при комнатной температуре), после чего промывали в TBS (2 раза по 5 мин). Реакция с DAB (3–5 мин под контролем микроскопа при комнатной температуре). Рабочий раствор DAB готовили путём добавления к 1 мл буфера 1 капли концентрированного хромогена по инструкции. Далее смывали хромоген дистиллированной водой в течение 3 минут, после чего докрашивали ядра гематоксилином в течение 2-х минут и подсинивали в проточной воде под контролем микроскопа. Обезвоживали и заключали в бальзам. 52 Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эстрогенов Полуколичественную оценку иммуногистохимического определения рецепторов стероидных гормонов проводили по D.C. Allred и соавт. (1998) (таблица 2.3), примеры представлена на рисунках 2.9–2.10. Таблица 2.3 – Полуколичественная оценка иммуногистохимического определения рецепторов стероидных гормонов [D.C. Allred и соавт., 1998] А. Доля положительно окрашенных клеток Баллы 0 0 >0 и <1/10 1 ≥1/10 и < 1/3 2 ≥1/3 и <1/100 3 ≥1/100 и 2/3 4 ≥2/3 и ≤1 5 Б. Интенсивность окраски Негативна 0 Слабая 1 Промежуточная 2 Сильная 3 В. Общая оценка Интегральный показатель степени экспрессии рецепторов стеридных гормонов определяет сумма баллов, отражающих долю окрашенных клеток и интенсивность окраски. Положительнорецепторными опухоли считаются при сумме баллов 3 и более. 53 Рисунок 2.9 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эстрогенов – 0 баллов (отсутствие коричневого ядерного окрашивания). Рисунок 2.10 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эстрогенов – 8 баллов (коричневые ядра более 2/3 опухолевых клеток). Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов прогестерона На рисунках 2.11 и 2.12 представлены варианты иммуногистохимического анализа уровня рецепторов прогестерона – 0 баллов (отсутствие коричневого ядерного окрашивания) и 8 баллов (коричневые ядра более 2/3 опухолевых клеток). 54 Рисунок 2.11 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов прогестерона – 0 баллов (отсутствие коричневого ядерного окрашивания) Рисунок 2.12 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов прогестерона – 8 баллов (коричневые ядра более 2/3 опухолевых клеток). Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2) Рак молочной железы, в котором выявляется экспрессия HER2, должен отвечать всем пороговым критериям для оценки интенсивности и типа окрашивания мембран клетки (3+ по шкале от 0 до 3+) и процента позитивных опухолевых клеток. Окрашивание должно быть локализовано на мембране и полностью повторять её контур. Иммунное окрашивание может быть пред- 55 ставлено и в цитоплазме, однако такой вид реакции не учитывается при оценке HER2-статуса опухоли (таблица 2.4, рисунки 2.13–2.18). Таблица 2.4 – Критерии оценки интенсивности и типа иммунного окрашивания мембраны опухолевых клеток рака молочной железы Характер окрашивания Оценка в баллах (указывается в заключении) Оценка HER2-статуса Отсутствие мембранного окрашивания или наличие слабого окрашивания менее 10% опухолевых клеток 0 негативный Слабое мембранное окрашивание более 10% опухолевых клеток +1 негативный Умеренное мембранное окрашивание более 10% опухолевых клеток или сильное мембранное окрашивание менее 10% опухолевых клеток +2 неопределённый (рекомендуется провести гибрибридизацию in situ Сильное полное окрашивание мембран более 30% опухолевых клеток +3 позитивный Рисунок 2.13 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2 [0] отсутствует мембранное окрашивание опухолевых клеток). 56 Рисунок 2.14 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2 [1+]: слабое неполное мембранное окрашивание опухолевых клеток 10% и более). Рисунок 2.15 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2 [2+]: очерченное неполное мембранное окрашивание слабое и умеренное болеее 10% опухолевых клеток или полное интенсивное мембранное окрашивание ≤10%). 57 Рисунок 2.16 – Иммуногистохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2 [3+]: выраженное полное мембранное окрашиdание >10% опухолевых клеток). При так называемой «серой зоне», когда оценка HER2 составяла +2 , проводили дополнительный подсчёт числа копий. Амплификация гена HER2 проводилась при помощи метода флюоресцентной гибридизации in situ (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH), который используется с 1991 года и позволяет проводить количественный анализ в ткани опухоли (рисунки 2.17– 2.18). Рисунок 2.17 – Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) при HER2 2+ . Амплификация гена HER2 отсутствует. 58 Рисунок 2.18 – Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) при HER2 2+ . Амплификация гена HER2 присутствует. Иммуногистохимический анализ уровня KI-67 Патоморфологическая оценка опухоли проводилась согласно критериям классификации ВОЗ (2012). При подсчете количества окрашенных визуализирующим агентом ядер клеток опухоли учитывается процентное соотношение окрашенных и неокрашенных ядер клеток на 100 учтенных клеток в 10-ти репрезентативных полях зрения при увеличении 40. Результат индекса пролиферативной активности выдаётся с указанием индекса пролиферативной активности (процент клеток, в которых определяется экспрессия антител к Ki-67). Примеры патоморфологической оценки опухолей представлены на рисунках 2.19–2. 20). Рисунок 2.19 – Иммуногистохимический анализ уровня уровень). Ki-67 (Ki-67 8%: низкий 59 Рисунок 2.20 – Иммуногистохимический анализ уровня Ki-67 (Ki-67 90%: высокий). Определение пролиферативной активности Митотическая активность оценивалась в инвазивном компоненте опухоли при выявлении четкой картины метафазы, анафазы и телофазы. Однако выявление митозов при исследовании операционного и биопсийного материала в значительной степени зависит от стандартизации преаналитического этапа, особенно на этапе фиксации материала. Так, задержка времени фиксации материала на 30 мин приводит к уменьшению числа выявляемых митозов почти на 20 %, а задержка более чем на 1 час – на 50 % [Филатов А.В., 2009]. Подсчёт митотической активности на гистологических срезах рака молочной железы проводился в 10 полях зрения [Омельчук Н.Н., Волкова Л.В., 2014]. Рисунок 2.21 – Митозы в опухоли (70 на 10 полей зрения) указаны стрелками. Окраска гематоксилин и эозином, х40. 60 Рисунок 2.22 – Митозы в опухоли (10 на 10 полей зрения) указаны стрелками. Окраска гематоксилин и эозином, х40. Рисунок 2.23 – Митозы в опухоли (0 на 10 полей зрения). Окраска гематоксилин и эозином, х40.) Биологические подтипы РМЖ [Tang P., 2009] Согласно иммуногистохимическим характеристикам все больные были распределены на подтипы (таблица 2.5.). 61 Таблица 2.5 – Биологические иммуно-гистохимические подтипы РМЖ Подтип Люминальный А Люминальный В Трижды негативный/базальноподобный HER2+ (гиперэкспрессиющий) Основная характеристика по данным ИГХ- исследования Положительные рецепторы эстрогенов (ER) и рецепторы прогестерона (PR) (по Allred); гиперэкспрессия HER2 отсутствует; низкая (G1) и умеренная (G2) степень злокачественности по Ellis-Elston или Ki 67<20% HER2 - негативный: положительные ER и PR; гиперэкспрессия HER2 отсутствует; высокая степень злокачественности (G3) или Ki 67<20% HER2 – позитивный: положительные ER и PR; гиперэкспрессия HER2. Отсутствие ER, PR (2 и менее баллов по Allred), отсутствие гиперэкспрессии HER2 Гиперэкспрессия HER2 и отсутствие определяемых гормональных рецепторов (ER-/PR-) 2.2.3 Молекулярно-генетическое тестирование Молекулярно-генетическое исследование детекции экспрессии генов топоизомеразы II альфа и бета-тубулины III класса проводилась методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием TaqMan-проб. Уровень мутации генов основывался на пороговых значениях гена-рефери, разработанных лабораторией молекулярной онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова» Минздрава России. Из 141 больной, получающей предоперационную химиотерапию, высокая экспрессия бета-тубулинов III класса установлена у 62 человек (44,3%, 95% ДИ 36,1–52,6), низкая экспрессия бета-тубулинов III класса – у 78 человек (55,7%, 95% ДИ 47,4–63,9) (р=0,70); высокая экспрессия топоизомеразы II альфа – у 73 человек ( 53,3%, 95% ДИ 44,8–61,6), низкая экспрессия топоизомеразы II альфа – у 64 человек (46,7%, 95% ДИ 38,4–55,2) (р=0,51). Анализ мутаций гена BRCA1 выполнялся методом аллель- специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентного красителя SYBR Green I и термоциклета Bio-Rad. 62 BRCA мутация была обнаружена у 9 человек (6,4%, 95% ДИ 2,9–11,0) (р=0,39). Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови Геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов, использовалась при выявлении наследственных мутаций. Выделение из периферической крови лейкоцитов ДНК проводилось посредством модифицированного соль- хлороформного метода. Гипоосмотический лизис эритроцитов достигался после 3-кратного разведения 5 мл крови дистиллированной водой, далее охлажденной до +4 оС. При помощи центрифугирования отделяли лейкоциты, а полученный осадок переводили в суспензию в 1 мл раствора Трис-HCl (pH = 8,3), 1 mM ЭДТА. С целью разрушения цитоплазматической мембраны клеток к суспензии добавляли Тритон Х-100 в конечной концентрации 1%, а ядра выделяли центрифугированием. Далее осадок вновь ресуспендировали в 1 мл Трис-HCl (pH = 8,3) и лизировали при помощи добавления лаурилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Протеолиз белков и деградация комплексов «белок – ДНК» осуществлялись при помощи инкубации пробы в присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60 оС в течение 12 часов, далее к лизату добавляли раствор NaCl до конечной концентрации 1,5 М и равный объем хлороформа. В течение 30 минут при медленном покачивании с целью удаления из раствора ДНК нерастворимых компонентов клеточного лизата – белков и липидов проводилась экстракция. После чего раствор центрифугировали в течение 15 минут, что приводило к образованию в пробирке трех четко различимых фаз. Верхняя водная фаза содержала растворенную ДНК и неорганические соли, промежуточная и нижняя, хлороформные, - гидрофобные компоненты. Для осаждения ДНК к осторожно отобранной верхней фазе добавляли равный объем изопропанола и оставляли на 20 минут при температуре -20 оС. Осадок собирали центрифугированием в течение 5 минут при 15000 g. Для выделения чистого препарата ДНК промывали в 1 мл 70% эта- 63 нола, после чего отбирали спирт, высушивали осадок и растворяли его в 0,5 мл стерильной воды. Тестирование наследственных мутаций BRCA1 (5382insC, 185delAG, 4153delA) Определение наследственных мутаций производилась при помощи аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе BioRad CFX96 Real-time PCR Detection System (рисунок 2.24). Рисунок 2.24 – Прибор BioRad CFX96 Real-time PCR Detection System В состав реакционной смеси объемом 20 мкл входили: 1 ед. акт. “hotstart” Taq-полимеразы “Thermostar”, однократный ПЦР буфер, примерно 50 нг ДНК, 2,0 mМ MgCl2, SYBR green I в концентрации 0,2х (исходный раствор 10 000x; Molecular Probes), по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтри- 64 фосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ) и 100 нМ каждого праймера. Последовательности праймеров представлены в таблице Реакция начиналась с активации Taq-полимеразы (95 оС, 10 мин.). Последующие 40 циклов ПЦР состояли из фаз денатурации (95 оС, 15 с), отжига (60 оС – 65 оС, 30 с) и элонгации (72 оС, 30 с). Для оценки специфичности реакции амплификации оценивалась температура плавления ПЦР-продукта. Пример детекции мутации BRCA1 5382insC представлен на рисунке 2.25. Рисунок 2.25 – Пример детекции мутации BRCA1 5382insC: в случае нормальной гомозиготы (A) наблюдается четкое различие в кинетике амплификации между парами праймеров, специфичными к нормальной (WT) и мутантной (Mut) последовательностям; в случае гетерозиготы (B) амплификация фрагментов мутантного и нормального аллелей идет с равной эффективностью; ниже (С) представлены пики плавления образца с мутацией (температура плавления специфического продукта 82,5 ± 0,3ºC). 65 Последовательность праймеров, использованных для аллель- специфической ПЦР, отражена в таблице 2.6. Таблица 2.6 – Последовательности праймеров, использованных для аллельспецифической ПЦР Мутация Праймер BRCA1 5382insC common 5’-AGAACCTGTGTGAAAGTATCTAGCACTG-3’ wt 5’-AAGCGAGCAAGAGAATTCCAG-3’ mut 5’-AGCGAGCAAGAGAATTCCCA-3’ common 5’–GACTGCAAATACAAACACCCA - 3’ wt 5’-AGCCCGTTCCTCTTTCTTC – 3’ mut 5’-AGCCCGTTCCTCTTTCTCA – 3’ common 5’-CAGTTAAGGAAATCAGCAATTACAATAGC -3’ wt 5’-GCTATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCC -3’ Mut 5’-ATGCTATGCAGAAAATCTTAGTGTCC -3’ BRCA1 4153delA BRCA1 185delAG Последовательность Длина фрагмента 168 п.о. 134 п.о. 173 п.о. Источником мРНК служили архивные патоморфологические образцы опухолевой ткани. Выделение мРНК проводилось по изложенной ранее методике [Imyanitov et al., 2006]. С помощью ксилола архивные срезы депарафинизировали, регидратировали путем последовательной инкубации в 96% и 70% этаноле и лизировали на протяжении 16 часов при 60 0C. Состав лизирующего буфера включал 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 мM EDTA, 2% SDS, и 500 мкг/мл протеиназы К. Экстракция производилась кислым фенолом (pH 4.0) и хлороформом. Затем мРНК осаждали изопропанолом в присутствии гликогена и промывали 70% этанолом, далее растворяли в воде. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реакции обратной транскрипции использовали полученный раствор РНК. Обратная транскрипция проводится в объеме 20 мкл. В реакции использовали всю РНК, выделенную из 2–3 парафиновых срезов (10–30 мкм), растворенную в 10 мкл воды. В состав реакционной смеси входили также 10х буфер для обратной транскриптазы (2.0 мкл), обратная 66 транскриптаза M-MulV (Sibenzyme) (150.000 U/ml) (1.0 мкл), смесь dNTP (10мМ каждого) (1.0 мкл), случайные гексапраймеры (конц. 10 ое/мл) (1.0 мкл), ингибитор РНКаз (5 U/мкл) (1.0 мкл). Температурный режим обратной транскрипции: 20 °С – 5 мин, 38 °С – 30 мин, 95 °С – 5 мин. Определение экспрессии мРНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени Последовательности кДНК гена-мишени и гена-рефери (SDHA) амплифицировали при помощи специфических праймеров в присутствии TaqManзондов (рисунок 2.26, таблица 2.7). ПЦР в режиме реального времени проводилась на оборудовании BioRad CFX96 Real-time PCR Detection System. Мультиплексная ПЦР ставилась в объеме 20 мкл, где содержалось 1 мкл раствора кДНК, 2.0 ед. акт. фермента ДНК-полимеразы Thermostar, 1кратный ПЦР-буфер, 2.5 мМ MgCl2, по 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, по 300 нМ прямого и обратного праймеров SDHA, 300 нМ TaqMan-зонда SDHA-P, 600 нМ прямого, обратного праймеров и TaqManзонда, комплементарных гену-мишени. Использовались следующие условия ПЦР-амплификации: денатурация в течение 20 сек при 95˚С, отжиг и синтез в течение 1 мин при 60˚С, 45 циклов. Относительная экспрессия каждого гена определялась как показатель «∆ Ct» (delta Ct Ct=Cycle threshold) (∆Сt=Ct (ген-мишень) – Ct (ген-рефери, SDHA). Пороговые значения для разграничения высокого и низкого уровня экспрессии были определены как 20-й и 80-й процентили относительной экспрессии каждого гена в выборке из 50 опухолей разных локализаций (РТК, РЛ, РМЖ, РЖ). Случаи с показателем экспрессии ниже 20 процентиля относились к категории «низкой», а выше 80 процентиля – к категории «высокой» экспрессии. Промежуточные значения оценивались как «средняя» экспрессия. 67 Таблица 2.7 – Последовательности праймеров, используемых для определения экспрессии изучаемых генов Праймер 5’-3'-последовательность SDHA-F CCACTCGCTATTGCACACC SDHA-R CACTCCCCGTTCTCCATCA SDHA-P JOE-ACGGTCTCTGCGATATGATACCA-BHQ TUBB3-F CTTTGGACATCTCTTCAGGC TUBB3-R ACCACATCCAGGACCGAATC TUBB3-P FAM-ACAATTTCATCTTTGGTCAGAGTGG-BHQ Top2a-F TCACAATTGATCCGGAAAACAA Top2a-R CTAGAAGTTAGGAGCTGTCCA Top2a-P FAM-GCTGGGACATACATCTTTTCAACT-BHQ Размер фрагмента, п.о. 102 120 127 Рисунок 2.26 – Примеры образцов с высокой (A) и низкой (B) экспрессией бета-тубулинов III класса 68 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови пациенток проводилось посредством модифицированного соль-хлороформного метода (Mullenbach и соавт., 1989). Генотипирование каждого образца требовало постановки двух ПЦР реакций одновременно в разных пробирках. В первой пробирке добавлялся общий праймер и праймер, специфичный к аллелю дикого типа, во второй добавлялся общий праймер и праймер, специфичный мутантному аллелю. Определение генотипа было основано на разнице пороговых циклов. 2.2.4 Оценка распространённости процесса С целью определения распространенности опухолевого процесса и для оценки ответа опухоли на проводимую неоадъювантную полихимиотерапию проводили ультразвуковое исследование, маммоцинтиграфия, маммография, КТ органов грудной клетки, брюшной полости, малого таза по показаниям, консультацию гинеколога с последующим УЗИ малого таза или МРТ малого таза по показаниям, МРТ головного мозга по показаниям. Ультразвуковое исследование Ультразвуковое исследование проводили на аппаратe фирмы HITACHI «HI VISION 900» c использованием линейного датчика частотой 13 МГц. Согласно общепринятому описанию молочную железу разделяли на четыре квадранта. Основными признаками рака молочной железы являлись: гипоэхогенная ткань с нечеткими контурами с асимметричной акустической тенью, а также гиперэхогенным ободком вокруг. Поражение подмышечных лимфатических узлов включало: размер более 10 мм в наименьшем диаметре, с изменённой формой и конфигурацией, изменение УЗИ сигнала от корти- 69 кального слоя или его расширение, а также исчезновение «жировых ворот» лиматического узла. Соноэластография После получения информации в В-режиме использовалась опция цветового и/или энергетического допплеровского картирования. Рамка устанавливалась на объект исследования с захватом окружающих тканей не менее 1 см. После обследования образования в В и ЦДК режимах активировалась опция – T-Elasto. Компрессия тканей молочной железы выполнялась датчиком. Контроль правильности выполнения данной манипуляции осуществлялся с помощью шкалы компрессии, показания которой не должны были превышать 4. При цветовом и/или энергетическом допплеровском картировании эластограмму оценивали с помощью системы анализа цветовой шкалы, разработанной Itoh и соавт. (2006) (рисунки 2.27–2.28): – 1 эластотипу соответствует зеленый цвет на ультразвуковом изображении; – 2 эластотипу – зеленый цвет с синими фрагментами (свойственен фиброаденомам); – 3 эластотипу – синий цвет в центре, а по краю – зеленый (требуется подтверждение диагноза); – 4 эластотипу – синий цвет (опухолевый очаг); – 5 эластотипу – синий цвет узла и окружающих его тканей (рак молочной железы). 70 Рисунок 2.27 – Соноэластография узловой формы рака левой молочной железы. Коэффициент жесткости StR 9,21 Рисунок 2.28 – Соноэластография отёчно-инфильтративной формы рака левой молочной железы Коэффициент жесткости StR 22,15 Маммография Маммография проводилась в краниокаудальной и медиолатеральной плоскостях, а при необходимости снимки выполнялись и в латеромедиальных косых плоскостях. Характеристики опухолей молочной железы описывались согласно рекомендациям системы BI-RADS. Наличие двух и более узловых опухолевых образований различной формы и структуры, расположенных в разных квадрантах молочной железы, а также выявление отдельных дополнитель- 71 ных и сгруппированных скоплений микрокальцинатов злокачественного типа (более 15 микрокальцинатов на 1 см2) расценивались как мультицентричная форма рака молочной железы. Пример маммографии отёчно-инфильтративной формы рака левой молочной железы представлен на рисунке 2.29. Рисунок 2.29 – Маммография отёчно-инфильтративной формы рака левой молочной железы Позитивная сцинтиграфия молочных желёз и зон регионарного лимфооттока Позитивная сцинтиграфия молочных желёз и зон регионарного лимфооттока осуществлялась в планарном и томографическом режимах на эмиссионном компьютерном томографе «Forte (Philips)», с двумя прямоугольными детекторами, снабженными низкоэнергетическими, высокочувствительными коллиматорами. Все больные подписывали информированное согласие на проведение процедуры с лучевой нагрузкой. Исследование в планарном режиме выполнялось через 10–15 мин после введения 740-860 МБк отечественного туморотропного препарата «99mTc-технетрил» (Диамед, Москва) в вену. Приготовление туморотропного РФП «99mTc-технетрил» осуществлялось согласно инструкции от производителя. Одновременная визуализация обеих молочных желёз в боковых проекциях проводилась в положении лежа на животе. Между молочными железами помещалась специальная подушка 72 со свинцовым вкладышем, а детекторы гамма-камеры, снабженные параллельными высокоразрешающими коллиматорами для энергии 140 КэВ, располагались в боковых проекциях (под углом 90 и 270 градусов) в соприкосновении с обеими МЖ. При невозможности выполнения исследования в положении на животе выполнялась поочерёдная визуализация правой и левой молочной железы в положении на боку. У всех больных выполнялась однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) с величиной шага томографического исследования 3–6 градусов, временем экспозиции кадра 30–60 секунд и углом вращения 180 градусов для каждого детектора. Визуализация аксиллярной области в планарном режиме проводилась в боковой (с поднятыми вверх руками) и в передних проекциях (руки за головой) через 10–15 мин после введения препарата. Пример маммосцинтиграфииграфии местно-распространённого рака левой молочной железы представлен на рисунке 2.30. Рисунок 2.30 – Маммосцинтиграфия: очаг гиперфиксации в левой молочной железе 2,5 см в левой подмышечной 1,0 1,5 см. Коэффициент накопления РФП 1,9. Обработка полученных результатов обследования осуществлялась с помощью Hanning-фильтра. Параметры фильтра подбирались индивидуально. Толщина восстановленных поперечных срезов колебалась от 2 до 4 пикселов. Оценку полученных изображений проводили по следующим критериями: наличие или отсутствие участков гиперфиксации туморотропного РФП в молочной железе и аксиллярной области, по форме (правильная, неправильная), по характеру границ (четкие, нечеткие), по интенсивности и равно- 73 мерности распределения РФП в очагах патологической гиперфиксации. У всех больных с гиперфиксацией РФП в молочной железе рассчитывался показатель интенсивности гиперфиксации РФП, который рассчитывался как отношение удельного числа импульсов в области максимальной гиперфиксации РФП к удельному числу импульсов в прилегающих участках неизмененной ткани молочной железы. Наличие очага патологической гиперфиксации РФП в проекции подмышечной области рассматривалось в качестве основного сцинтиграфического признака поражения подмышечных лимфатических узлов, как при планарном, так и при ОФЭКТ исследовании. Также учитывалась симметричность накопления РФП в подмышечной области с обеих сторон. При активном поглощении РФП в потовых железах очаги гиперфиксации РФП рассматривались как случаи физиологического накопления. При обнаружении сцинтиграфических признаков поражения подмышечных лимфатических узлов изменения характеризовались как вовлечение единичных лимфатических узлов или их множественное поражение. 2.3 Критерии эффективности лечения Оценка эффективности лечения проводилась по четырём основным критериям: частота объективных эффектов, частота клинических эффектов, патоморфологический регресс опухоли в молочной железе и лимфатическом узле и время до прогрессирования. Оценка эффекта проводилась по измеримым очагам путем вычисления изменения суммы их максимальных размеров. Исчезновение всех очагов расценивали как полный регресс, уменьшение суммы максимальных размеров очагов на 30% относительно измерения перед началом лечения – как частичный регресс. Увеличение суммы максимальных размеров на 20% и более в процессе лечения или перед ним считалось прогрессированием процесса. Стабилизация определялась как недостаточное уменьшение опухоли для ча- 74 стичного регресса или недостаточное увеличение относительно прогрессирования заболевания. Оценка эффекта от проводимого лечения проводилась каждые 2 цикла в соответствии с критериями RECIST 1.1 при помощи тех же методик, что и перед его началом лечения. Время до прогрессирования определялось от даты начала химиотерапии до даты, когда было документально зарегистрировано прогрессирование заболевания. 2.4 Оценка осложнений лекарственной терапии 2.4.1 Оценка систолиеской функции левого желудочка (измерение фракции выброса левого желудочка) В отделении общей терапии и фунциональной диагностики Института проводили оценку систолиеской функции левого желудочка (измерение фракции выброса левого желудочка) на ультразвуковой установке экспертного класса «Vivid 7 PRO», General Eltctric, США по стандартизированной методике методом Teicholz в парастернальном продольном сечении (референсные значения N>60%) и модифицированным методом Sympson в верхушечном четырёхкамерном сечении (референсеые значения N>55%). Расчёт фракции выброса (Ejection fraction- EF). Расчёт показателя фракции выброса и процента фракции выброса производили с помощью расчёта объёмов по фомуле Teichgolz: EF=EVD-ASV/ADV, где EVD – конечный диастолический объём, AVS – конечный систолический объём, ADV – конечный диастолический объём. В норме данный показатель равен 0,60 и более. Процент фракции выброса равен произведению фракции выброса на 100%. В норме процент фракции выброса, рассчитанный с применением данного метода, составляет 60%: %EF=EF 100%. 75 Стадирование заболевания в исследовании определялось по международной классификации по системе TNM (7 Edition AJCC, 2006). В критерии местно-распространённого рака молочной железы входили опухоли T1-4N03M0. 2.4.2 Оценка побочных явлений на фоне химиотерапии (СТС АЕ v3.0) Оценка побочных явлений на фоне химиотерапии производилась в соответствии с критериями, разработанными Национальным противораковым институтом США – СТС АЕ v3.0 [Trotti A., Colevas A., Setser A. et al., 2003]. Каждые три недели производились клинический осмотр с определением общего статуса больного по шкале ECOG, мониторинг биохимических показателей в сыворотке крови, электрокардиография, общий анализ мочи. Отслеживание побочных эффектов химиотерапии, их коррекция и наблюдение за динамикой осуществлялись постоянно на протяжении всего курса лечения и в течение 30 дней после его окончания. Возникшие на фоне химиотерапии осложнения купировались медикаментозно. При нежелательных явлений 3–4 степени терапия прерывалась и возобновлялась только после восстановления показателей до 1 ст., далее химиотерапия проводилась с редукцией доз препаратов на 25%. Уменьшение дозы цитостатика производилась в зависимости от характера нежелательного явления. Модификация доз цитостатиков производилась в соответствии со стандартными рекомендациями, предусматривающими редуцирование дозы, увеличение интервалов между циклами. 2.5 Статистический анализ Результаты динамического наблюдения за пациентами, получившими предоперационную химиотерапию, были введены в созданную в пакете Microsoft Office Excel базу данных и анализировались с применением пакета прикладных программ для статистического анализа STATISTICA v. 10 и 76 встроенных функций пакета Microsoft Office Excel. Большинство изучаемых показателей являлось качественными, измеренными по номинальной или порядковой шкалам. Для таких переменных проводилась точечная и интервальная оценка распределения частот, при этом в качестве интервальной оценки строился 95% доверительный интервал, который вычислялся с помощью углового преобразования Фишера. В качестве статистического критерия для проверки гипотезы о значимости различий частот в независимых группах использовался критерий χ2. При анализе многопольных таблиц его применение считалось корректным, если в таблице ожидаемых частот доля ячеек с частотами, меньшими 5, не превышала 25%, в противном случае проводились попарные сравнения частот критерием χ2 (при необходимости – с поправкой Йетса), или с помощью точного критерия Фишера. Количественные переменные, измеренные по непрерывной шкале, представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения () – при отсутствии значимых отличий от нормального закона (критерий Шапиро–Уилка); медианой (Ме), нижним (Q1) и верхним (Q3) квартилями – в противном случае; соответственно, статистические сравнения выполнялись с помощью критерия Стьюдента или Манна–Уитни. Для анализа выживаемости больных использовался метод КапланаМейера, при этом сравнение выживаемости в группах пациентов осуществлялось лог-ранговым критерием. Как и в большинстве исследований, касающихся оценке эффективности неоадъювантного системного лечения, в работе представлены результаты анализа бессобытийной выживаемости (event free survival) [EFS]. К событиям относятся: местный и регионарный рецидив, отдалённые метастазы, возникновение метахронного рака противоположной железы, возникновение первичных опухолей другой локализации, смерть от РМЖ, смерть от любых причин. При проведении статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы принимался равным 0,05. 77 Глава 3 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОВЕДЁННОГО ПРЕДОПЕРАЦИОННОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЁННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 3.1 Объективная и патоморфологическая оценка степени регресса опухоли молочной железы и лимфатических узлов Основная цель рандомизированного исследования III фазы «Таксаны в комбинации с антрациклинами (ТАС) и без антрациклиновых антибиотиков (ТС) в неоадъювантном лечении больных местно-распространенным раком молочной железы» – изучение непосредственных результатов неоадъювантной химиотерапии РМЖ (объективного ответа, степени патоморфологического регресса опухоли и регионарных метастазов, в том числе частоты патоморфологического полного ответа ypT0N0). Анализ частоты объективных ответов опухоли на проведенное химиотерапевтическое лечение (таблица 3.1) показал статистически значимое преимущество схемы ТАС перед схемой ТС (частота частичных регрессов составила 82,9 против 67,8% соответственно, р<0,05). Таблица 3.1 – Клинический ответ опухоли на неоадъювантную химиотерапию (TAC vs ТC) у больных местно-распространенным РМЖ, оценённый после проведения 2-х циклов химиотерапии Объективный ответ после 2-х циклов прогрессирование стабилизация частичный регресс Общая группа (n=141) ТАС (n=82) ТС (n=59) с антрациклинами без антрациклинов р n 1,4 95% ДИ n % 95% ДИ n % 2 22,0 0 0,0 1,2-1,2 2 3,4 31 76,6 15,5-29,2 14 17,1 9,7-26,1 17 28,8 17,9-41,2 0,09 0,1-4,1 108 76,6 69,2-83,2 95% ДИ 0,3-9,6 0,17 0,04 78 На расунке 3.1. представлена частота клинического ответа (%) в зависимости от проведённой схемы химиотерапи 100 90 TAC TC cross over 80 Регресс опухоли (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 Рисунок 3.1 – Частота клинического ответа (%) в зависимости от схемы химиотерапи Из таблицы 3.2 видно, что полный патоморфологический регресс первичной опухоли и регионарных метастазов (суррогатного маркёра улучшения показателей выживаемости) не выявил достоверных различий между таксансодержащей химиотерапией с антрациклинами и без антрациклиновых антибиотиков, что обусловлено переводом больных после стабилизации на 2 циклах химиотерапии по схеме ТС. Табл. 3.2 – Частота патоморфологического регресса ( ypT0N0) опухоли после неоадъювантной химиотерапии (TAC vs TC) у больных местнораспространенным РМЖ Показатель Общая (n = 114) ТС (n = 41) ТАС и cross over (n = 73) р 79 n % 95% ДИ n % 95% ДИ n % 95% ДИ pCR с учетом 17 14,9 8,9-22,1 7 17,1 7,0-30,4 10 13,7 6,7-22,7 0,24 cross-over 4+5 степень 37 26,2 19,3-33,9 12 23,5 12,8-36,3 25 27,8 18,9-37,6 0,58 регресса + pN0 Оценена чувствительность к неоадъювантной химиотерапии люминального А, люминального В, трижды негативного и HER2-позитивного подтипов (частота pСR при этих подтипах равнялась 8,5%, 6,7%, 23,8% и 25,8% соответственно (p<0,05). В результате проведенной предоперационной таксан-содержащей химиотерапии удалось перевести все условно-неоперабельные опухоли в операбельные, выполнив органосохраняющие операции у 7,1% больных (таблица 3.3). Таблица 3.3 – Частота хирургических вмешательств после неоадъювантной химиотерапии (TAC против ТС) у больных местно-распространенным РМЖ Общая группа Вид ТАС (n=74) ТС (n=67) (n=141) хирургического р вмешательства n % 95% ДИ n % 95% ДИ n % 95% ДИ Органосохраня10 7,1 3,4-11,9 6 8,1 3,0-15,5 4 6,0 1,6-13,0 ющая операция >0,05 Радикальная 131 92,9 88,1-96,6 68 91,9 84,5-97,0 63 94,0 87,0-98,4 мастэктомия Определение чувствительности к предоперационной химиотерапии в зависимости от принадлежности к определённому подтипу представляет несомненный интерес. В нашем исследовании в группе больных с люминальным А подтипом значимый лекарственный патоморфоз (4–5 степень по Miller-Payne) был достигнут у 11 больных, что составило 18,6%; в группе люминального В – у 5 больных, что составило 16,7%; в группе HER 2 – позитивного РМЖ – у 9 человек и в группе базального (трижды негативного) – у 12 человек, что составило 38,7% (p=0,54). Как и ожидалось, частота значимого патоморфологического ответа опухоли (4–5 степень по Miller-Payne) на антрациклин- и таксан-содержащюю полихимиотерапию была выше в группе трижды нега- 80 тивного и HER2 позитивного РМЖ, по сравнению с люминальными подтипами А и В (таблица 3.4). Таблица 3.4 –Достижение значимого и полного патоморфологического ответа опухоли в зависимости от биологического подтипа опухоли Патоморфоз Люминальный А Люминальный В n % 95% ДИ n % 95% ДИ n Трижды негативный HER2 позитивный % 95% ДИ n % 95% ДИ 4+5 степень 11 18,6 9,7-29,7 5 16,7 5,4-32,6 9 42,9 21,8-65,4 12 38,7 22,0-57,0 1+2+3 степень 48 81,4 70,3-90,3 25 83,3 67,4-94,6 12 57,1 34,6-78,2 19 61,3 43,0-78,0 Также отмечено 4-кратное увеличение ypT0N0 в группе больных с трижды негативным подтипом опухоли, при сравнении с люминальным В подтипом. Частота ypT0N0 при сравнении всех подтипов равнялась 8,5%, 6,7%, 23,8% и 25,8% (таблица 3.5). Таблица 3.5 – Достижение полного патоморфологического ответа опухоли в зависимости от биологического подтипа опухоли HER2 Пато- Люминальный А Люминальный В позитивный морфоз n % 95% ДИ n % 95% ДИ n % 95% ДИ 5 5 степень 8,5 2,7-17,0 2 6,7 0,5-18,8 5 23,8 7,7-45,3 Трижды негативный n % 95% ДИ 8 25,8 11,7-43,1 1+2+3+4 54 91,5 82,9-97,3 28 93,3 81,2-99,5 16 76,2 54,7-92,3 23 74,2 56,9-88,3 степень В зависимости от степени злокачественности опухоли значимый патоморфологический ответ (4–5 степень по Miller-Payne) был достигнут со степенью G1+G2 – у 10 человек (13,7%, 95% ДИ 6,7–22,6); G3 – у 6 человек (12,8%, 95% ДИ 4,7–24,0) (р=0,88) (рисунок 3.2). 81 % 50 45 40 35 Люминальный А 30 Люминальный В 25 HER2+ 20 Трижды негативный 15 10 5 0 5 степень по Miller-Payne Рисунок 3.2 – Частота 4+5 степень патоморфологического ответа (%) в зависимости от биологического подтипа опухоли. По результатам проведённого лечения в группе получающих химиотерапию по схеме ТАС при степени злокачественности G1+G2 значимый патоморфологический ответ (4–5 степень по Miller-Payne) был достигнут у 7 человек (17,1%, 95% ДИ 7,0–30,4), при G3 – у 4 человек (14,3%, 95% ДИ 3,7–30,2); по схеме ТС при степени злокачественности G1+G2 – у 3 человек (9,4%, 95% ДИ 1,7–22,3), при G3 – у 2 человек (10,5%, 95% ДИ 0,8–29,3) (р=0,34) (рисунок 3.3). 82 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 90,6 85,7 82,9 89,5 5+4 степень 3+2+1 степень 17,1 14,3 G1+G2 G3 ТАС 10,5 9,4 G1+G2 G3 ТС Рисунок 3.3 – Степень патоморфологического ответа в зависимости от степени злокачественности опухоли В результате изучения влияния степени злокачественности на ответ предоперационной химиотерапии можно сказать, что схема, включающая антрациклины и таксаны, при высокой степени злокачечественности G3 более эффективна. 3.2 Предиктивное значение клинических и экспериментальных молекулярно-генетических и биологических маркеров чувствительности к антрациклиновым антибиотикам и таксанам Из общей группы 141 больной мутация BRCA1 выявлена у 6,4% больных, из них: трижды негативный подтип – у 6 человек (20,0%, 95% ДИ 7,5– 36,7) и у 3 (3,4%, 95% ДИ 0,6–8,4) – люминальный А подтип РМЖ. Наследственный BRCA1-ассоциированный РМЖ наиболее часто встречался при трижды негативном подтипе опухоли. При оценке распределения пациентов с наличием BRCA-мутации в зависимости от возраста установлено, что в группе до 35 лет было 2 пациентки (14,3%, 95% ДИ 0,9–37,1), от 35–54 лет – 6 пациенток (7,3%, 95% ДИ 2,7–14,0), от 55 и старше – 1 пациентка (2,2%, 95% ДИ 0,0–8,7) (2 = 2,89; р=0,34). Для наличия BRCA-мутации более характерен пременопаузальный возраст. 83 Установлена высокая эффективность неоадъювантной таксан- содержащей химиотерапии у больных BRCA1-ассоциированным РМЖ: объективный ответ наблюдался у 8 больных (88,9%), полный патоморфологический ответ (ypT0N0) – у 4 (44,4%), прогрессирование процесса – не было. В группе пациентов с наличием BRCA-мутации, получающих химиотерапию по схеме ТС (n=5), ypT0N0 достигнут у 2-х больных (40,0%, 95% 0,1–97,0); в группе ТАС (n=4) ypT0N0 – у 2-х больных (50,0%, 95% 8,2–91,8), а значимый патоморфологический ответ – у 3 человек (75%, 95% ДИ 0,1– 72,5). Перехода из группы ТС в ТАС (cross-over) не было. По степени клинического ответа в группе получающих химиотерапию по схеме ТС стабилизация процесса отмечена у 1 человека (20%, 95% ДИ 6,0–85,2), частичный регресс – у 4-х человек (80%, 95% ДИ 14,8–94,0), полного регресса не установлено. В группе получающих химиотерапию по схеме ТАС частичный регресс наблюдался у 2-х человек (50%, 95% ДИ 8,2–91,8), полный регресс – у 2-х человек (50%, 95% ДИ 8,2–91,8), стабилизации и прогрессирования заболевания не отмечалось. Таким образом, можно отметить, что при наличии BRCA-мутации подтверждена высокая эффективность на химиотерапию, включающую таксаны и антрациклины (рисунок 3.4). % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100,0 94,7 94,5 80,0 мутация BRCA: обнаружены не обнаружены 20,0 0,0 прогрессирование 5,3 5,5 стабилизация частичный регресс полный регресс Рисунок 3.4 – Распределение BRCA-мутации в зависимости от клинического эффекта предоперационной химиотерапии 84 Предиктивное значение экспрессии мРНК гена бета-тубулинов III класса, как маркера чувствительности опухоли к таксанам, изучено у 141 больных местно-распространенным РМЖ. В зависимости от экспрессии бетатубулинов III класса в опухоли были сформированы 2 подгруппы больных: с низкой – 78 (55,7%) и с высокой экспрессией – 62 (44,3%) больных. В каждой из групп оценивался полный патоморфологический ответ (5 степень) и значимый патоморфологический ответ опухоли по Miller-Payne (4+5 степень) как критерии эффективности таксан-содержащей химиотерапии. В группе больных с низкой экспрессией бета-тубулинов III класса 5 степень патоморфологического ответа была достигнута – у 18 человек (23,1%, 95% ДИ 14,3–33,2); значимая степень патоморфологического ответа была достигнута – у 31 человека (39,7 %, 95% ДИ 29,1–50,9) (рисунок 3.5). % 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 39,7 5 ст. 4+5 ст. 23,1 8,1 1,6 высокая экспрессия низкая экспрессия TUBβ III Рисунок 3.5 – Распределение значимого и полного патоморфологического регресса в самой опухоли и л/у в завиимости от экспрессии бета-тубулинов III класса Полный патоморфологический ответ (ypT0N0) в группе больных с низкой экспрессией бета-тубулинов III класса в опухоли достигался достоверно чаще. В группе больных, получающих режим химиотерапии по схеме ТАС+cross over (n=90), с низкой экспрессией бета-тубулинов III класса (n=48) ypT0N0 был отмечен у 10 больных (20,8%; 95% ДИ 10,4–33,7), а в группе высокой экспрессии бета-тубулинов III класса ypT0N0 был отмечен 85 у 1 больной (2,4%, 95% ДИ 0,0–9,6) (р<0,005). В группе больных, получающих химиотерапию по схеме ТС (n=51), с низкой экспрессией бетатубулинов III класса (n=30) ypT0N0 был отмечен у 8 больных (26,7 %; 95% ДИ 12,1–44,4), а в группе высокой экспрессии бета-тубулинов III класса ypT0N0 – 1 больной был у одной пациентки (р<0,005) (рисунок 3.6). Таким образом, по данным исследования, низкая экспрессия мРНК гена бета-тубулина III класса в ткани РМЖ является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (ypT0N0) на таксан-cодержащую химиотерапию. % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 88,9 66,7 68,4 TUBβ III 56,9 33,3 высокие 43,1 низкие 31,6 11,1 прогрессирование стабилизация частичный регресс полный регресс Рисунок 3.6 – Распределение экспрессии бета-тубулина III класса в зависимости от клинического регресса опухоли Предиктивное значение топоизомеразы II альфа, как маркера чувствительности опухоли к антрациклиновым антибиотикам, изучено в группе больных, получавших режим химиотерапии по схеме ТАС и cross over (n=90), с низкой экспрессией топоизомеразы II альфа (n=38) ypT0N0 не был отмечен, а в группе с высокой экспрессии топоизомеразы II альфа ypT0N0 был отмечен у 11 больных (22,4%, 95% ДИ 11,8–35,4) (р=0,019). В группе больных, получающих химиотерапию по схеме ТС (n=51), с низкой экспрессией топоизомеразы II альфа (n=26) ypT0N0 был отмечен у 1 больной (3,8 %; 86 95% ДИ 0,0–15,1), а в группе высокой экспрессии топоизомеразы II альфа ypT0N0 был у 7 больных (29,2, 95% ДИ 12,3–49,7) (p=0,015). В группе больных с низкой экспрессией топоизомеразы II альфа 5 степень патоморфологического ответа была достигнута у 18 человек (24,7 %, 95% ДИ 15,4–35,3); значимая степень патоморфологического ответа была достигнута у 33 человек (45,2 %, 95% ДИ 33,8–56,8) (р < 0,001) (рисунок 3.7). % 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 45,2 5 ст. 4+5 ст. 24,7 1,6 высокие 3,1 низкие ТОР2α Рисунок 3.7 – Распределение клинического регресса опухоли в зависимости от экспрессии топоизомеразы II альфа Таким образом, по данным исследования, высокая экспрессия топоизомеразы II альфа в ткани РМЖ является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (ypT0N0) на антрациклин-cодержащую химиотерапию. Изучение сочетания высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в отношении достижения значимого патоморфологического ответа показало, что в группе ТАС+cross over (n=90) он был достигнут у 20 больных из 90 (64,5%, 95% ДИ 46,4–80,7), в группе получающих химиотерапию по схеме ТС (n= 51) – у 9 человек из 51 (56,3%, 95% ДИ 30,0–80,7) (р=0,58) (рисунок 3.8). 4+5 степень патоморфологического ответа (%) 87 70 64,5 56,3 60 ТАС+cross over 50 TC 40 30 20 7,1 10 5,9 0 низкий уровень экспресси TUBβ III и высокий уровень экспрессии TOP2α др. сочетания Cочетание TUBβ III и TOP2α Рисунок 3.8 – Степень значимого патоморфологического ответа в зависимости от сочетания высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и низкой экспрессии бетатубулинов III класса Сочетание высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в отношении достижения ypT0N0 показало, что в группе ТАС и cross over (n=90) 5 степень патоморфологического ответа достигнута у 10 больных из 90 (32,3%, 95% ДИ 16,7–50,2) в группе получающих химиотерапию по схеме ТС (n= 51) – у 7 человек из 51 (43,8%, 95% ДИ 19,3-70,0) (р=0,44) (рисунок 3.9). Сочетание высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в отношении достижения ypT0N0 является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (ypT0N0) на таксанcодержащую химиотерапию. 5 сепень патоморфологического ответа (%) 88 50 43,8 45 40 32,3 ТАС+cross over 35 TC 30 25 20 15 10 1,8 5 2,9 0 низкий уровень экспрессии TUBβ III др. сочетания и высокий уровень экспрессии TOP2α Сочетание TUBβ III и TOP2α Рисунок 3.9 – Зависимость высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в отношении достижения ypT0N0 в группах получающих химиотерапию по схемам TAC+cross over и ТС Морфологические аспекты местно-распространённого рака молочной железы Было проведено исследование морфологических особенностей первичного очага и регионального метастатического компонента при местнораспространённом РМЖ у 35 пациенток. При этом учитывали число митозов клеток, долю тубулярных и протоковоподобных структур, клеточный полиморфизм. При изучении гистологической характеристики было установлено, что в 85 % наблюдений это был инфильтрирующий протоковый рак. Медуллярный и инфильтрирующий дольковый раки встречались значительно реже. Морфологически в ткани молочной железы и пораженнх аксиллярных лимфатических неоадъювантной химиотерапии узлах после проведения наблюдались единичные тубулярные и протоковоподобные структуры, преобладал солидный тип строения, нарастал клеточный полиморфизм, количество митозов: более 10, но менее 20 митозов 89 в 10 полях зрения отмечалось у 15 пациенток (10,4 %); более 20 митозов в 10 полях зрения – у 20 (14,1 %). Все это является свидетельством опухолевой прогрессии. Также было отмечено, что метастазы в подмышечных лимфоузлах значительно менее подверглись терапевтическому воздействию. Зафиксировано большое количество митозов в поражённых лимфатических узлах, что говорит об меньшем эффекте лечебного патоморфоза даже I степени и устойчивости к химиотерапии регионарных лимфатических узлов. Смена фенотипа – интересное, но не требующее доказательств. У 14 человек (9%) из 141 больной стероидный рецепторный статус опухоли изменился. Так, изменения с негативного RE на позитивный RE отмечены у 8 человек (57%) и с позитивного RE на негативный RE – у 6 человек (42%); с негативного RP на позитивный RP – у 6 человек (42%) и с позитивного RP на негативный RP не наблюдалось; у 8 человек RP не изменились. Статус HER2 с негативного на позитивный был изменён у 1 пациентки (7%). Уровень Ki67 имел тенденцию к снижению. После проведения НПХТ мы обнаружили у пациентов изменение гормонального статуса с позитивного на негативный и с негативного на позитивный. Изменение HER2с негативного на позитивный встречалось редко. Уровень Ki 67 имел тенденцию к снижению после проведения НПХТ. Определение чувствительности, специфичности, общей точности изучаемых методов В таблице 3.6 отражены точечные и интервальные оценки диагностической эффективности разных уровней экспрессии маркеров бета-тубулинов III класса, топоизомеразы II альфа и их сочетаний в прогнозировании полного патоморфологического ответа; данные для расчета этих показателей представлены в 4-польных таблицах 3.6–3.11. 90 Таблица 3.6 – Чувствительность, специфичность, диагностическая точность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результата низкой экспресси бета-тубулинов III класса, высокой топоизомеразы II альфа и их сочетания в прогнозировании ypT0N0 (полного патоморфологического ответа) Диагностические показатели Чувствительность Специфичность Низкая экспрессия TUBIIIB (%, 95%ДИ) Высокая экспрессия ТОРIIА (%, 95%ДИ) TUBIIIB + ТОРIIА (%, 95%ДИ) р 94,7 [73,9–99,1] 94,7 [73,9–99,1] 89,5 [66,8–98,4] р1,3=1,0 р2,3= 1,0 р1,2= 1,0 74,6 [65,7–82,1] р1,3=0,000 1 р2,3= 0,0007 р1,2=0,64 50,4 [41,2–59,6] 53,4 [44,0–62,6] Диагностическая точность 56,4 [47,8–64,8] 59,1 [50,4–67,4] 76,6 [68,7–83,4] р1,3=0,000 4 р2,3= 0,0019 р1,2=0,65 Предсказательная ценность положительного результата 23,1 [14,3–34,0] 24,7 [15,3–36,1] 36,2 [22,7–51,5] р1,3=0,11 р2,3= 0,18 р1,2=0,82 Предсказательная ценность отрицательного результата 98,4 [91,3–99,7] 98,4 [91,6–99,7] 97,8 [92,2–99,7] р1,3=0,79 р2,3= 0,77 р1,2=0,98 91 Различия в группах при ypT0N0 в зависимости от низкой и высокой экспрессии топоизомеразы II альфа высоко значимы (р<0,001). Чувствительность, специфичность, общая точность высокой экспрессии топоизомеразы II альфа составили 94,7%, 53,4%, 59,1% соответственно (таблица 3.6). Высокая экспрессия маркера топоизомеразы II альфа при достижении полного лекарственного патоморфологического ответа насчитывала: истинно положительных результатов 18, ложно положительных 55; ложно отрицательных 1 и истинно отрицательных 63 (табл. 3.7). Таблица 3.7 –Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного патоморфоза в зависимости от высокой экспрессии топоизомеразы II альфа ТОРIIА высокие др. Всего Лекарственный патоморфологический ответ 5 степени есть нет 18 (ИП) 55 (ЛП) 1 (ЛО) 63 (ИО) 19 118 Всего 73 64 137 Низкая экспрессия маркера топоизомеразы II альфа при достижении полного лекарственного патоморфологического ответа насчитывала: истинно положительных результатов 1, ложно положительных 63; ложно отрицательных 19 и истинно отрицательных 55 (таблица 3.8). Таблица 3.8 – Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного патоморфоза в зависимости от низкой экспрессии топоизомеразы II альфа ТОРIIА низкие др. Всего Лекарственный патоморфологический ответ 5 степени есть нет 1 (ИП) 63 (ЛП) 18 (ЛО) 55 (ИО) 19 118 Всего 64 73 137 92 Различия в группах при ypT0N0 низкой и высокой экспрессии бетатубулинов III класса высоко значимы (р<0,001). Чувствительность, специфичность, общая точность низкой экспрессии бета-тубулинов III класса составили 94,7%, 50,4%, 56,4% соответственно (таблица 3.6). У 18 из 19 человек с 5 ст. патоморфологического ответа определялся низкий уровень бета-тубулинов III класса, что определило высокий уровень чувствительности (ДИ 29,1–50,9). ИО и ЛП результаты распределились практически поровну, что обусловило значение специфичности 50,4% (ДИ) (таблица 3.9). Низкая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса при достижении полного лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 18, ложно положительных 60; ложно отрицательных 1 и истинно отрицательных 61. Таблица 3.9 – Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного патоморфоза в зависимости от низкой экспрессии бета-тубулинов III класса TUBIIIB Лекарственный патоморфологический ответ 5 степени есть нет Всего низкая экспрессия 18 (ИП) 60 (ЛП) 78 др. Всего 1 (ЛО) 19 61 (ИО) 121 62 140 Высокая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса при достижении полного лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 1, ложно положительных 61; ложно отрицательных 18, истинно отрицательных 60 (таблица 3.10). Таблица 3.10 – Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного патоморфоза в зависимости от низкой экспрессии бета-тубулинов III класса TUBIIIB Лекарственный патоморфологический Всего 93 ответ 5 степени есть нет высокая экспрессия 1 (ИП) 61 (ЛП) 62 др. 18 (ЛО) 60 (ИО) 78 всего 19 121 140 Важно, что вероятность полного патоморфологического ответа (ypT0N0) при низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в комбинации с высокой экспрессией топоизомеразы II альфа оказалась значимо выше: чувствительность – 89,5%, специфичность – 74,6%, общая точность – 76,6%, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов 36,2% и 97,8% соответственно (таблица 3.6). Низкая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса в сочетании с высокой экспрессией топоизомеразы II альфа при достижении полного лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 17, ложно положительных 30; ложно отрицательных 2 и истинно отрицательных 88 (таблица 3.11). Таблица 3.11 – Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного патоморфоза в зависимости от низкой экспрессии бета-тубулинов III класса и вывысокой экспрессии топоизомеразы II альфа Уровни экспрессии маркеров Лечебный патоморфологический ответ 5 степени Всего есть нет низкая экспрессия TUBIIIB и высокая экспрессия ТОРIIА 17 (ИП) 30 (ЛП) 47 др. сочетания 2 (ЛО) 88 (ИО) 90 Всего 19 118 137 Результаты вычисления диагностической эффективности разных уровней экспрессии маркеров бета-тубулинов III класса, топоизомеразы II альфа и 94 их сочетаний в достижении значимого патоморфологического ответа отражены в таблице 3.12; данные для расчета этих показателей представлены в 4польных таблицах 3.12–3.16. Таблица 3.12 – Чувствительность, специфичность, диагностическая точность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результата низкой экспресси бета-тубулинов III класса, высокой экспрессии топоизомеразы II альфа и их сочетания в достижении клинически значимого патоморфологического ответа 4+5 степени) TUBIIIB + ТОРIIА Низкая экспрессия Высокая экспрессия TUBIIIB ТОРIIА %, 95%ДИ %, 95%ДИ %, 95%ДИ Чувствительность 86,1 [70,5–95,3] 94,3 [80,8–99,1] 82,9 [66,3–93,4] р1,3=0,70 р2,3= 0,13 р1,2=0,25 Специфичность 54,8 [44,7–64,6] 60,8 [50,6–70,3] 82,4 [73,6–89,2] р1,3< 0,0001 р2,3= 0,0006 р1,2=0,38 Диагностическая точность 62,9 [54,3–70,9] 69,3 [60,9–76,9] 82,5 [75,1–88,4] р1,3= 0,003 р2,3= 0,010 р1,2=0,25 Предсказательная ценность положительного результата 39,7 [28,8–51,5] 45,2 [33,5–57,3] 61,7 [46,4–75,5] р1,3=0,017 р2,3= 0,078 р1,2=0,50 Предсказательная ценность отрицательного результата 91,9 [82,2–97,3] 96,9 [89,1–99,5] 93,3 [86,0– 97,5] р1,3=0,37 р2,3= 0,98 р1,2=0,23 Диагностические показатели р Различия в группах при значимом патоморфологическом ответе (Payne Miller 4 и 5 степени) в зависимости от низкой и высокой экспрессии топоизомеразы II альфа высоко значимы (р<0,001). Чувствительность, специфичность, общая точность высокой экспрессии топоизомеразы II альфа составили 94,3%, 60,8%, 69,3% соответственно (табл. 3.12). Высокая экспрессия маркера топоизомеразы II альфа при достижении значимого лекарственного патоморфологического ответа насчитывала: ис- 95 тинно положительных результатов 33, ложно положительных 40; ложно отрицательных 2 и истинно отрицательных 62 (таблица 3.13). Таблица 3.13– Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного и значимого патоморфологического ответа в зависимости от высокой экспрессии топоизомеразы II альфа ТОРIIА Патоморфологический ответ опухоли 4 и 5 степени есть нет всего высокая экспрессия 33 (ИП) 40 (ЛП) 73 др. 2 (ЛО) 62 (ИО) 64 35 102 137 всего Низкая экспрессия маркера топоизомеразы II альфа при достижении значимого лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 2, ложно положительных 62; ложно отрицательных 33 и истинно отрицательных 40 (таблица 3.14). Таблица 3.14 –Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного и значимого патоморфологического ответа в зависимости от низкой экспрессии топоизомеразы II альфа ТОРIIА Патоморфологический ответ опухоли 4 и 5 степени есть нет всего низкая экспрессия 2 (ИП) 62 (ЛП) 64 др. 33 (ЛО) 40 (ИО) 73 35 102 137 всего Различия в группах с значимым патоморфологическим ответом опухоли (Payne Miller 4 и 5 степени) при низкой и высокой экспрессии бетатубулинов III класса высоко значимы (р<0,001). Чувствительность, специфичность, общая точность низкой экспрессии бета-тубулинов III класса составили 86,1%, 54,8%, 62,9 % соответственно (таблица 3.12). 96 Низкая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса при достижении значимого лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 31, ложно положительных 47 (таблица 3.15). Таблица 3.15– Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного и значимого патоморфологического ответа в зависимости от низкой экспрессии бета-тубулинов III класса TUBIIIB Лечебный патоморфологический ответ 4 и 5 степени Всего есть нет низкая экспрессия 31 (ИП) 47 (ЛП) 79 др. 5 (ЛО) 57 (ИО) 61 36 104 140 всего Высокая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса при достижении значимого лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 5, ложно положительных 57; ложно отрицательных 31 и истинно отрицательных 47 (таблица 3.16). Таблица 3.16 –Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного и значимого патоморфологического ответа в зависимости от высокой экспрессии бета-тубулинов III класса TUBIIIB Лечебный патоморфологический ответ 4 и 5 степени Всего есть нет высокая экспрессия 5 (ИП) 57 (ЛП) 61 др. 31 (ЛО) 47 (ИО) 79 36 104 140 всего Значения чувствительности, специфичности, общей точности, предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов выявлены при диагностике клинически значимого патоморфологического ответа (4+5 степени) при низкой экспрессии бета-тубулинов III класса в комбинации с 97 высокой экспрессией топоизомераза II альфа: 82,9%, 82,4 %, 82,5%, 61,7% и 93,3%, соответственно (таблица 3.12). При этом значения специфичности, общей точности и предсказательной ценности положительного результата комбинации маркеров этих уровней в достижении значимого патоморфологического ответа были значимо выше, чем при диагностике по каждому из этих маркеров соответствующего уровня экспрессии в отдельности. Значения чувствительности и предсказательной ценности отрицательного результата 3х диагностических методов, представленных в таблице 3.12, статистически не различались. Низкая экспрессия маркера бета-тубулинов III класса в сочетании с высокой экспрессией топоизомеразы II альфа при достижении значимого лекарственного патоморфоза насчитывала: истинно положительных результатов 29, ложно положительных 18; ложно отрицательных 6 и истинно отрицательных 84 (таблица 3.17). Таблица 3.17 –Распределение истинно положительных, ложно положительных; ложно отрицательных и истинно отрицательных результатов при достижении полного и значимого патоморфологического ответа в зависимости от низкой экспрессии бета-тубулинов III класса и высокой экспрессии топоизомераза II альфа Уровни экспрессии маркеров Лечебный патоморфологический ответ 4 и 5 степени Всего есть нет низкая экспрессия TUBIIIB и высокая экспрессия ТОРIIА 29 (ИП) 18 (ЛП) 47 др. сочетания 6 (ЛО) 84 (ИО) 90 35 102 137 всего 98 3.3. Прогностическое значение молекулярно-генетических и биологических маркеров чувствительности к антрациклиновым антибиотикам и таксанам Доказано, что наиболее важный критерий оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии – полный патоморфологический регресс опухоли (ypT0N0). Данный критерий рассматривается как суррогатный маркер увеличения показателей выживаемости больных местно-распространенным РМЖ (для люминального В без экспрессии HER2, трижды негативного и HER2-позитивного). В нашем исследовании отмечена тенденция к увеличению показателей 2-летней бессобытивной выживаемости у больных, достигших ypT0N0: 70,6% (95% ДИ 45,4–90,4) в сравнении с больными с остаточной опухолью 67% (95% ДИ 57,3–761) (рисунок 3.10). ypT0N0 Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.10 – 2-х Остаточная опухоль 2,7 года 0,85 0,78 0.9642, 0.4668 - 1.9916 0.9215 летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от полного патоморфоза в опухоли до начала химиотерапии (метод Kaplan-Meyer, р=0,58) в общей группе больных (n=141). Анализ 2-летней бессобытийной выживаемости (n=141) так же показал, что отсутствие экспрессии рецептора прогестерона (рисунок 3.11), как и мо- 99 лодой возраст больных (до 35 лет) (рисунок 3.12), являются важными факторами неблагоприятного прогноза у больных местно-распространенным РМЖ. В других возрастных категориях значимых различий в показателях 2-летней бессобытивной выживаемости выявлено не было. Также не зарегистрированы различия по показателям 2-летней бессобытийной выживаемости в зависимости от биологического подтипа (рисунок 3.13). RP позитивные Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.11 0,85 – 2-х RP негативные 2,7 года 0,73 1.6611,0.9651 - 2.8590 0.0670 летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от экспрессии рецепторов прогестерона (метод Kaplan-Meyer) в общей группе больных (n=141). 100 35 лет и старше Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.12 До 35 лет 2,7 года 0,81 0,56 1.8676, 1.0274 3.3950 0.0405 – 2-летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от возраста больных (метод Kaplan-Meyer) в общей группе больных (n=141). 101 Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) Complete Censored Cumulative Proportion Surviving 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 время (дни) Рисунок 3.13 – 2- летняя бессобытийная люминальный А люминальный В HER2 триждынегативный выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от биологического подтипа (метод Kaplan-Meyer) в общей группе больных (n=141). Что касается экспериментальных молекулярно-генетических маркеров, то у больных местно-распространенным РМЖ, находившихся под наблюдением 2 и более года (n=141), с низким уровнем экспрессии гена бетатубулина III класса опухоли, отмечается явная тенденция к улучшению показателей бессобытийной 2-летней выживаемости по сравнению с больными, у которых экспрессия гена бета-тубулина III класса была высокой (80,3 против 51,9%, р<0,01) (рисунок 3.14). 102 Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.14 – Экспрессия TUB IIIB низЭкспрессия TUB IIIB выкая сокая 2,7 года 0,90 0,65 2.71, 1.54 - 4.78 0.0006 2-х летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от экспрессии TUBβIII (метод Kaplan-Meyer, р=0,0013) в общей группе больных (n=114). У больных местно-распространенным РМЖ с высоким уровнем экспрессии гена TOP2α в опухоли до начала лечения показатели бессобытийной 2летней выживаемости были так же значимо выше (рисунок 3.15). 103 Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.15 Экспрессия TOP IIА высоЭкспрессия TOP IIА низкая кая 2,7 года 0,97 0,58 3.93, 2,04 - 7,62 0,0001 – 2-х летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от экспрессии TOP2α (метод Kaplan-Meyer, р<0,0001) в общей группе больных (n=114). При анализе частоты возникновения рецидивов так же были обнаружены достоверные отличия 2-летной бессобытийной выживаемости между больными с низкой (G1+G2) и с высокой (G3) степенью злокачественности (рисунок 3.16). 104 Медиана наблюдения EFS, % RR %, 95% ДИ p Рисунок 3.16 1+2 ст. злокачественности 3 ст. злокачественности 2,7 года 0,86 0,65 2.3298, 1.3198 - 4.1127 0.0035 – 2-летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от степени злокачественности опухоли (метод Kaplan-Meyer, р=0,028) в общей группе больных (n=114). У больных местно-распространенным РМЖ с высоким уровнем экспрессии гена топоизомераза II альфа и низкой экспрессией бета-тубулинов III класса в опухоли до начала лечения (рисунок 3.17 и таблица 3.25) показатели безрецидивной 2-летней выживаемости были значимо выше. 105 Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) Complete Censored 1,0 Cumulative Proportion Surviving 0,9 0,8 р = 0,0022 0,7 0,6 0,5 0,4 низкая экспрессия TUBβ III и высокая экспрессия TOP2α 0,3 др. сочетания 0,2 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Время (дни) Рисунок 3.17 – 2-летняя бессобытийная выживаемость больных местно- распространенным РМЖ в зависимости от высокой экспрессии TOP2α и низкой экспрессии бета-тубулинов III класса (метод Kaplan-Meyer, р=0,00022) в общей группе Таким образом, при выборе предоперационной лекарственной терапии местно-распространенного РМЖ наравне с имеющимися стандартами следует использовать оценку экспрессии генов топоизомеразы II альфа и бетатубулинов III класса, а так же мутацию гена BRCA1 в качестве прогностических и предиктивных маркеров. В целом в результате проведенной научно-исследовательской работы на большом клиническом материале достигнута цель исследования и выполнены поставленные задачи, на основе полученных результатов сформулированы следующие выводы. 106 Клинический случай Пациентка С., 1959 г.р. Обратилась в НИИ онкологии 06.02.2012г, когда самостоятельно обнаружила увеличенный лиматический узел в левой подмышечной области. Наследственность Са желудка (у отца). Б2 Р1 А 1. Возраст первых родов 22 года. β-tubulin – высокий, top2a – низкий. Из обследований: ПЭТ от 17.01.1012 ПЭТ признаки гиперметаболизма глюкозы очагово характера в проекции левой молочной железы и левой подмышечной области. SUV 9,0. При дообследовании был установлен диагноз: рак левой молочной железы (с) T1N2M0, (р) T0N1M0. Гистологическое заключение от 18.01.2012 № 14179 Инвазивны рак RE 0б, RP 0б, HER2 +2. Fish отриц. С 01.03.2012 по 31.05.2012 получила 6 циклов предоперационной химиотерапии по схеме ТАС. По данным маммосцинтиграфии от 09.02.2012 (до начала лечения) очаг гиперфиксации в левой молочной железе 1,5 см в левой подмышечной 5,6х3,5 см. Коэффициент накопления РФП 1,6 (рисунок 3.18 А), после лечения по данным маммосцинтиграфия от 18.06.2012 сцинтиграфическая картина частичного регресса очага в левой подмышечной области. Коэффициент накопления РФП 1 (рисунок 3.18 Б). По результатам маммографии от 10.02.2012 до начала лечения: в левой молочной железе в нижне-наружном квадранте узел размерами 18х14.11,8. В подмышечной клетчатке слева лимфатические узлы 54 6 61 мм (рисунок 3.19 А), после лечения по данным маммографии от 20.06.2012 в подмышечной клетчатке определяется плотный увеличенный л/у 27,6 20 мм (рис 3.19 Б). По результатам УЗИ молочных желёз от 06.02.2012 (до лечения) коэффициент жёсткости составил 9,21 (рисунок 3.20 А), после лечения УЗИ молочных желез от 20.06.2012 коэффициент жёсткости составил 5,93 (рисунок 3.20 Б). 107 А. До лечения. Б. После лечения. Рисунок 3.18 –Мамммосцинтиграфия молочных желёз до лечения А, после лечения Б от пациентки С. А. До лечения. Маммосцинтиграфия от 09.02.2012 (до начала лечения) очаг гиперфиксации в левой молочной железе 1,5 см в левой подмышечной 5,6х3,5 см. Коэффициент накопления РФП 1,6. Б. После лечения. Маммосцинтиграфия от 18.06.2012 (после лечения) сцинтиграфическая картина частичного регресса очага в левой подмышечной области. Коэффициент накопления РФП 1. А. До лечения. Б. После лечения. Рисунок 3.19 – Маммография пациентки С. до лечения А, после лечения Б : 108 А Маммография от 10.02.2012 (до начала лечения): в левой молочной железе в нижненаружном квадранте узел размерами 18х14.11,8. В подмышечной клетчатке слева лимфатические узлы 54 6 61 мм. Б: Маммография от 20.06.2012 (после окончания лечения): в подмышечной клетчатке определяется плотный увеличенный л/у 27,6 20 мм. А. До лечения. Б. После лечения. Рисунок 3.20 А. (до лечения): УЗИ молочных желёз от 06.02.2012 коэффициент жёсткости составил 9,21 Б. (после лечения): УЗИ молочных желез от 20.06.2012 коэффициент жёсткости составил 5,93 109 03.07.2012 выполнена операция в объёме мастэктомии по Пэйти слева и профилактическая мастэктомия по Пэйти справа. По результатам послеоперационного гистологического заключения от 11.07.2012 №311761: Остаточная опухоль молочной железы не обнаружена. Фокусы склерозируещего аденоза. Депозиты инвазивной протоковой бластомы в 2 из 4 л/у. 3 кусочка подмышечной клетчатки без депозитов. (р) T0N1M0. ИГХ №311761 ОТ 03.07.2012: RE 4б, RP 0б, HER2neu 0 (негат.) (рисунок 3.21). А. (до лечения) Б. (после лечения) Рисунок 3.21 – Гистологическое заключение пациентки С. А. (до лечения): Гистологическое заключение от 18.01.2012 № 14179 Инвазивны рак Б. (после лечения): Остаточная опухоль молочной железы не обнаружена. Фокусы склерозируещего аденоза В адъювантном режиме больная получила: 4 цикла МХТ Капецитабином (1500 мг/м2), лучевую терапию на подмышечную-надподключичную зоны. При последнем контрольном осмотре от 06.04.2015 данных за рецидив не получено. 110 Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ В структуре онкологической заболеваемости женщин экономически развитых стран рак молочной железы находится на первом месте. В структуре онкологической заболеваемости женского населения России РМЖ занимает первое место 20,1%. Удельный вес РМЖ в структуре смертности женщин от злокачественных новообразований составляет 17,41% [Чиссов В.И. и др., 2011, Мерабишвили В.М., 2011]. Рост смертности не уступает темпам роста заболеваемости. Поэтому любые аспекты проблемы лечения РМЖ сохраняют актуальность. Современные подходы к лечению местно-распространённого рака молочной железы включают неоадъювантную системную терапию, хирургическое лечение, а также дополнительное использование лучевой терапии, с последующей адъювантной химиотерапией и гормонотерапии, если имеется чувствительность. Предоперационная химиотерапия, позволяющая за короткий срок продемонстрировать свою эффективность – достижение полного патоморфологического ответа (pCR), является моделью для подбора адъювантной системной терапии. Безусловно, что первоначальная химиотерапия с последующим хирургическим удалением опухоли и регионарных лимфатических узлов является основным компонентом лечения местно- распространённых форм РМЖ. Многолетние наблюдения продемонстрировали, что у значительной части (от 30 до 80%) больных неоперабельными формами РМЖ довольно рано развиваются отдаленные метастазы опухоли независимо от характера местного лечения. Быстрое течение местно-распространённого РМЖ может объясняться существованием скрытых гематогенных микрометастазов уже к моменту 111 установления первичного диагноза РМЖ. Поэтому значительная часть больных РМЖ имеют системное заболевание, потенциально излечимое только с помощью эффективной системной терапии, дополняющей локальное хирургическое и лучевое лечение [Семиглазов В.Ф., 2005]. Основная цель изучения предоперационной химиотерапии заключается в том, чтобы найти потенциально значимые «суррогатные» маркеры, для подбора системной терапии с целью улучшения показателей выживаемости. Основной целью рандомизированного исследования III фазы «Таксаны в комбинации с антрациклинами (ТАС) и (ТС) в неоадъювантном лечении больных местно-распространённым раком молочной железы», заключалось в оценке частоты клинических ответов и достежении значимого и полного патоморфологического регресса опухоли и регионарных метастазов. В период с 2010 г. по 2014 г. в клиническое рандомизированное исследование по изучению корреляции между уровнем молекулярных маркеров (стандартных и экспериментальных) и эффективностью предоперационной химиотерапии больных местно-распространённым РМЖ было включено 141 больная. Больные получали предоперационную химиотерапию: ТАС (доцетаксел+доксорубицин+циклофосфан) и ТС (доцетаксел+циклофосфан) в стандартных дозировках. Важнейшие биологические отличия между различными подтипами РМЖ, заключающиеся в экспрессии биомаркеров: рецепторов эстрогенов и прогестерона, HER2, ki 67 в клинической практике позволяют индивидуализировать лечение. В целом, больные с опухолями, экспрессирующими РЭ и РП, являются кандидатами для антиэстрогенной терапии, в то время как больные с опухолями, экспрессирующими HER2, являются кандидатами для анти-HER2-терапии. Больные с опухолями не экспрессирующими указанные три маркера – так называемые “трижды-негативные” или базально-подобный РМЖ, являются кандидатами для химиотерапии. С появлением экспериментальных маркеров (TUBβIII, ТОР2α, мутация в гене BRCA1) появилась воз- 112 можность предварительно спрогнозировать эффективность предоперационной химиотерапии. Анализ частоты объективных ответов опухоли на проведённое предоперационное лечение показал статистически достоверное преимущество схеме ТАС против ТС (частота объективных ответов равнялась составила 82,9 против 67,8% соответственно, р<0,05). Резистентность к препаратам таксанового ряда, воздействующих на микротрубочки, обусловлена гиперэкспрессией β-тубулина класса III (Kamath K., 2005). По данным исследования, предиктивное значение низкой экспрессии мРНК гена β-тубулина класса III в ткани РМЖ является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (pCR) на таксан-cодержащую химиотерапию низкой (26,7 %; 95% ДИ 12,144,4). Полный патоморфологический ответ (pCR) в группе больных с низкой экспрессией TUBβIII в опухоли достигался достоверно чаще. В группе больных получающих режим химиотерапии по схеме ТАС+cross over (n=90) с низкой экспрессией TUBβIII (n=48) pCR был отмечен – у 10 больных (20,8%; 95% ДИ 10,4-33,7), а в группе высокой экспрессии TUBβIII pCR был отмечен – у 1 больной (2,4%, 95% ДИ 0,0-9,6) (р<0,005). В группе больных получающих химиотерапию по схеме ТС (n=51) с низкой экспрессией TUBβIII (n=30) pCR был отмечен – у 8 больных (26,7 %; 95% ДИ 12,1-44,4), а в группе высокой экспрессии TUBβIII pCR – 1 больной был ни у одной пациентки (р<0,005). Таким образом, по данным исследования, низкая экспрессия мРНК гена β-тубулина класса III в ткани РМЖ является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (pCR) на таксан-cодержащую химиотерапию. Эффективность антрациклиновых антибиотиков, более вероятна при активации мишени для препаратов этой группы – топоизомераза II- ТОР2α [Coon J., 2002; Di Leo A., 2002; MacGrogan G., 2003]. 113 Предиктивное значение ТОР2α, как маркера чувствительности опухоли к антрациклиновым антибиотикам, изучено в группе больных получающие режим химиотерапии по схеме ТАС+cross over (n=90) с низкой экспрессией ТОР2α (n=38) pCR не был отмечен, а в группе с высокой экспрессии ТОР2α pCR был отмечен – у 11 больных (22,4%, 95% ДИ 11,8-35,4) (р<0,019). В группе больных получающих химиотерапию по схеме ТС (n=51) с низкой экспрессией ТОР2α (n=26) pCR был отмечен - у 1 больной (3,8 %; 95% ДИ 0,0-15,1), а в группе высокой экспрессии ТОР2α pCR был – у 7 больных (29,2, 95% ДИ 12,3-49,7) (p<0,015). В группе больных с низкой экспрессией ТОР2α 5 степень патоморфологического ответа была достигнута – у 18 человек (24,7 %, 95% ДИ 15,435,3); значимая степень патоморфологического ответа была достигнута – у 33 человека (45,2 %, 95% ДИ 33,8-56,8) (р< 0,001). Таким образом, по данным исследования, высокая экспрессия ТОР2α в ткани РМЖ является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (pCR) на антрациклин -cодержащую химиотерапию. Изучение сочетания высокой экспрессии ТОР2α и низкой экспрессии TUBβIII в отношении достижения значимого патоморфологического ответа показало, в группе ТАС+cross over (n=90) – у 20 больных (64,5%, 95% ДИ 46,4-80,7) в группе получающих химиотерапию по схеме ТС (n= 51) – у 9 человек (56,3%, 95% ДИ 30,0-80,7) (р<0,58). Сочетание высокой экспрессии ТОР2α и низкой экспрессии TUBβIII в отношении достижения pCR является достоверным предиктивным признаком достижения полного патоморфологического ответа (pCR) на таксан-cодержащую химиотерапию Наличие BRCA 1 мутации выявлено у 9 из 141 человек, что составило около у 6,4% больных: у 5 (55%) больных диагностирован трижды негативный подтип и у 4 (45%) - люминальный А подтип РМЖ. Установлена высокая эффективность неоадъювантной таксан-содержащей химиотерапии у больных BRCA1-ассоциированным РМЖ: объективный ответ наблюдался у 8 больных (88,9%), полный патоморфологический ответ (pCR) – у 4 (44,4%). 114 В зависимости от степени злокачественности опухоли значимый патоморфологический ответ (4-5 степень по Miller-Payne) был достигнут со степенью G1+G2 – у 10 человек (13,7%, 95% ДИ 6,7-22,6); G3 – у 6 человек (12,8%, 95% ДИ 4,7-24,0) (р<0,88). Зависимость степени злокачественности опухоли на значимый (4-5 степень по Miller-Payne)и полный патоморфологический , можно сказать, что схема включающая антрациклины и таксаны при высокой степени злокачечественности G3 более эффективней . Полный патоморфологический регресс опухоли (pCR – 0N0M0), рассматривается как суррогатный маркер увеличения показателей выживаемости больных местно-распространенным РМЖ (для люминального В без экспрессии HER2, трижды негативного и HER2-позитивного). В нашем исследовании отмечена тенденция к увеличению показателей 2-х летней безрецидивной выживаемости у больных достигших pCR 70,6% (95% ДИ 45,4-90,4) в сравнении с больными с остаточной опухолью 67% (95% ДИ 57,3-761). Анализ 2-летней безрецидивной выживаемости так же показал, что отсутствие экспрессии рецептора прогестерона, как и молодой возраст больных (до 35 лет) являются важными факторами неблагоприятного прогноза у больных местно-распространенным РМЖ. В других возрастных категориях значимых различий в показателях 2-летней безрецидивной выживаемости выявлено не было. Также не зарегистрированы различия по показателям 2летней безрецидивной выживаемости в зависимости от биологического подтипа. Что касается экспериментальных молекулярно-генетических маркеров, то у больных местно-распространенным РМЖ, находившихся под наблюдением 2 и более года, с низким уровнем экспрессии гена TUBβIII опухоли отмечается явная тенденция к улучшению показателей безрецидивной 2-летней выживаемости по сравнению с больными, у которых экспрессия TUBβIII была высокой (80,3 против 51,9%, р<0.05). гена 115 У больных местно-распространенным РМЖ с высоким уровнем экспрессии гена TOP2α в опухоли до начала лечения показатели безрецидивной 2-летней выживаемости были так же значимо выше. На основании собственных результатов и литературного обзора нами разработан алгоритм выбора лекарственной терапии больных местнораспространённым РМЖ. ВЫВОДЫ 1. Низкий уровень экспрессии TUBβIII определяет группу больных РМЖ с повышенной чувствительностью к таксан-содержащей химиотерапии с частотой полных патоморфологических ответов (pCR) 24,1% против отсутствия ответов при высоком уровне экспрессии данного маркера соответственно. Чувствительность, специфичность, общая точность метода, предсказательная ценность положительного и предсказательная ценность отрицательного результата полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном времени детекции низкой экспрессии TUBβIII составили 94,7%, 50,4%, 56,4%, 23,1% и 98,4% соответственно. 2. У больных местно-распространенным РМЖ с низким уровнем экспрессии гена TUBβIII опухоли до начала химиотерапии отмечается явная тенденция к улучшению показателей бессобытийной (EFS) 2-летней выживаемости по сравнению с больными, у которых экспрессия гена TUBβIII была высокой (80,3% против 51,9%, р<0,05). 3. В группе больных с низкой экспрессией ТОР2α полный патоморфологический ответ (pCR) на полихимиотерапию с включением антрациклиновых антибиотиков был достигнут у 1 больной (1,6%), тогда как в группе высокой экспрессии – у 18 больных (24%). Чувствительность, специфичность, общая точность, предсказательная ценность положительного и предсказательная ценность отрицательного результата метода полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном 116 времени детекции высокой экспрессии TOP2α составили 94,7%, 53,4%, 59,1%, 24,7% и 98,4% соответственно. 4. У больных местно-распространенным РМЖ с высоким уровнем экспрессии гена TOP2α опухоли до начала химиотерапии показатели бессобытийной (EFS) 2-летней выживаемости значимо выше, по сравнению с больными РМЖ с низкой экспрессией гена TOP2α (87,1 против 43,1% соответственно, р<0,05). 5. Вероятность полного патоморфологического ответа (pCR) и значимого патоморфологического ответа на предоперационную таксан- содержащую химиотерапию значимо повышается при низкой экспрессии TUBβIII в комбинации с высокой экспрессией TOP2α: чувствительность метода составила 89,5% и 82,9%; специфичность – 74,6% и 82,4%; общая точность – 76,6% и 82,5% соответственно. 6. Мутация в гене BRCA1является предиктивным маркером высокой чувствительности к неоадъювантной химиотерапии (полный патоморфологический ответ (зарегистрирован у 44,4% больных), но не прогнозирует улучшение показателей бессобытийной выживаемости. 7. Применение неоадъювантной цитотоксической химиотерапии по схеме ТАС чаще чем по схеме ТС приводит к объективному клиническому ответу на лечение (82,9% против 67,8%, p=0,05); особенно при триждынегативном и HER2 позитивном подтипе РМЖ. 8. Наименьшая частота патоморфологического полного регресса опухоли (pCR) в ответ на неоадъювантную таксан содержащую химиотерапию наблюдались при люминальном А и люминальном В подтипах РМЖ (8,5% и 6,7%). Наиболее высокая частота pCR в ответ на такое же лечение наблюдались при трижды-негативном и HER2 позитивном РМЖ (23,8 и 25,8%). 117 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Детекция высокой экспрессии гена TOP2, а также низкой экспрессии генов TUBβIII и мутации BRCA1 методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с учётом клинических, морфологических и биологических особенностей местно-распространённого РМЖ в клинической практике позволит: улучшить планирование лекарственной неоадъювантной терапии, индивидуализировать системное лечение, увеличить показатели выживаемости больных, сократить затраты на терапию за счет отказа от использования неэффективных дорогостоящих лекарственных средств. 118 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДИ – доверительный иртервал ИГХ – иммуногистохимический анализ ОВ – общая выживаемость ОО – объективный ответ ОФЭКТ – однофотонная эмиссионная компьютерная томография ПЦР – полимеразная цепная реакция РМЖ – рак молочной железы СМЖ – сцинтиграфия молочных желез СЭГ – соноэластография ADC – конъюгат антитела и цитостатического агента AKT – серин-протеиновая киназа c-KIT – рецептор фактора стволовых клеток FGFR – рецептор фактора роста фибробластов HDAC – гистоновые деацетилазы HER2 – рецептор эпидермального фактора роста 2 типа IAP – ингибитор апоптоза протеинов IGF – инсулиноподобный фактор роста MAPK – митоген-активируемая протеинкиназа mTOR – мишень рапамицина у млекопитающих Mut – праймер, специфичный к мутированному аллелю PARP – поли(аденозин дифосфат рибоза) полимераза pCR (pT0/is pN0 M0) – полный патоморфологический ответ PI3K – фосфатидилинозитол 3-кизаза PR – рецепторы прогестерона RR – (Relative Risk) – относительный риск SRC – связанная с мембраной нерецепторная тирозинкиназа 119 StR – коэффициент жесткости TOP2α – топоизомераза IIα TUBβIII – β-тубулины класса III VEGF – фактор роста эндотелия сосудов Wt – праймер, специфичный к нормальному аллелю 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. HER2-позитивный рак молочной железы: стандартное и двойное таргетное лечение / В.Ф. Семиглазов, А.А. Божок, Т.Ю. Семиглазова, А.Г. Васильев, А.Г. Манихас, В.В. Семиглазов, А.А. Бессонов, К.С. Николаев // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – С. 341–346. 2. Биологически направленная (таргетная) терапия в лечении диссеминированного HER-2-позитивного рака молочной железы с метастазами в головной мозг (клинические случаи) / Т.Ю. Семиглазова, Д.Х. Латипова, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович // Вопр. онкологии. – 2011. – Т. 57, № 3. – С. 401–402. 3. Биологическое обоснование планирования лечения рака молочной железы / В.Ф. Семиглазов, В. Семиглазов, Р. Палтуев, Т. Семиглазова, Г. Дашян // Врач. – 2012. – № 11. – С. 2–4. 4. Волченко Н.Н. Комплекс морфологических и прогностических факторов при раке молочной железы : пособие для врачей / Н.Н. Волченко, Г.А. Франк ; Моск. науч.-исслед. онкол. ин-т им. П. А. Герцена. − М., 2000. – 19 с. 5. Гершанович, М.Л. Современные возможности лечения диссеминированного рака молочной железы, резистентного к антрациклинам и доцетакселу / М.Л. Гершанович, Т.Ю. Семиглазова // Гормонозависимые опухоли : материалы IX Всероссийской конференции онкологов России. – СПб., 2002. – С. 121–124. 6. Герштейн, Е.С. Клиническое значение исследования рецепторов эпидермального фактора роста при раке молочной железы / Е.С. Герштейн, Л.С. Бассалык, В.П. Летягин // Вопр. онкологии – 1994. – Т. 40(7–12). – С. 266–275. 121 7. Герштейн, Е.С. Тканевые маркёры как факторы прогноза при раке молочной железы / Е.С. Герштейн, Н.Е. Кушлинский // Практическая онкология / под ред. С.А. Тюляндина, В.М. Моисеенко. – СПб. : Центр ТОММ, 2004. – С. 41–50. 8. Злокачественные нообразования в России в 2012году (заболеваемость и смертность) / Ред. А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. – М., 2014 – 250с. 9. Значение нанотехнологий в создании новых противоопухолевых препаратов / В.Ф. Семиглазов, P.M. Палтуев, А.С. Ремизов, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян, А.А. Бессонов, К.Д. Пеньков, А.Г. Васильев, Т.Ю. Семиглазова, В.В. Коларькова // Вопр. онкол. - 2011. - Т. 57, № 5. - С. 636–640. 10. Значение молекулярных маркеров при выборе неоадъювантной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, П.В. Криворотько, В.В. Клименко, В.Г. Иванов, С.М. Новиков, М.Л. Гершанович, Е.Н. Имянитов, В.Ф. Семиглазов // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 17. – Приложение : материалы конференции (Санкт-Петербург, 2013). − С. 57. 11. Значение молекулярных маркеров при выборе неоадъювантной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Клименко, П.В. Криворотько, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, Е.Н. Имянитов, В.Ф. Семиглазов // Фарматека. – 2013. – № 17. – С. 57–64. 12. Значение радионуклидных методов в диагностике и определении степени распространенности рака молочной железы / С.Н. Новиков, С.В. Канаев, В.Ф. Семиглазов, П.В. Криворотько, П.И. Криживицкий, Т.Ю. Семиглазова, Е.А.Туркевич, Ю.Ф. Негусторов // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – Приложение : материалы VIII Съезда онкологов. – С. 311. 13. Иммуногистохимические методы : руководство / ed. by George L. Ku- mar, Lars Rudbeck / пер. с англ. под ред. Г.А. Франка, П.Г. Малькова. – М., 2011, – 224 с. 122 14. Имянитов, Е.Н. Молекулярная онкология: клинические аспекты / Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон. — СПб., 2007. – 211 с. 15. Имянитов, Е.Н. Применение молекулярно-генетического анализа для выбора противоопухолевой терапии / Е.Н. Имянитов, В.М. Моисеенко // Вопр. онкологии. – 2008. – Т. 54, № 2. – С. 121–132. 16. Индивидуализация адъювантной терапии рака молочной железы / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, Р.М. Палтуев, Г.А. Дашян, А.Г. Манихас, К.Д. Пеньков, Т.Ю. Семиглазова, Т.Т. Табагуа, А.Г. Васильев, В.В. Коларькова, П.В. Криворотько, И.В. Никитина // Фарматека. – 2011. – №7 (220). – С. 8–13. 17. Индивидуализация адъювантной терапии рака молочной железы / В.Ф.Семиглазов, В.В. Семиглазов, Р.М. Палтуев, Г.А. Дашян, А.Г. Манихас, К.Д. Пеньков, Т.Ю. Семиглазова, Т.Т. Табагуа, А.Г. Васильев, В.В. Коларькова, П.В. Криворотько, И.В. Никитина // Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы : материалы VIII Международной ежегодной конференции. – СПб., 2011. –С. 134–144. 18. Инновационные таргетные препараты при метастатическом раке молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, П.В. Криворотько, Р.М. Палтуев, Д.Х. Латипова, М.Л. Гершанович // Онкология : Журнал им. П.А. Герцена. – 2012. – № 2. – С. 94–99. 19. К вопросу о возможности применения маммосцинтиграфии для контроля эффективности неоадъювантнойполихимиотерапии больных раком молочной железы / С.В. Канаев, П.В. Криворотько, С.Н. Новиков, В.Ф. Семиглазов, Т.Ю. Семиглазова, Е.А. Туркевич, Л.А. Жукова, В.Ф. Климашевский, А.О. Иванцов, Р.В. Донских, В.В. Клименко, Ж.В. Брянцева // Вопр. онкологии. – 2013. – № 1.– С. 52–58. 20. К вопросу об интерпретации результатов сцинтиграфии с Тс- 99m Технетрилом у больных РМЖ / П.В. Криворотько, С.М. Новиков, С.В. Канаев, В.Ф. Семиглазов, П.И. Крыжевицкий, О.В. Зотова, Л.А. Жукова, 123 Т.Ю. Семиглазова, Ж.В. Брянцева // Эффективная фармакотерапия. – 2013. – Т. 6 :Онкология, гематология и радиология. – № 1. – С. 24–32. 21. Кардиоваскулярная токсичность противоопухолевой терапии / С.Ф. Вершинина, М.Л. Гершанович, Д.Х. Латипова, Е.В. Махнова, Т.Ю. Семиглазова, А.Н. Стуков, А.А. Тарасенкова, В.В. Тихонова, Л.В. Филатова // Токсикологический вестник. – 2010. – Т. 105, № 6.– С. 40–43. 22. Качество жизни – важный критерий эффективности таргетной те- рапии метастатического поражения скелета при раке молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, П.В. Криворотько, В.В. Коларькова, В.Ф. Семиглазов // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2013. – № 1–2. – С. 17–22. 23. Клинико-морфологические особенности и лечение долькового рака молочной железы / Т.Т. Табагуа, В.В. Семиглазов, Е.А. Бусько, Т.Ю. Семиглазова, В.В. Воротников // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – С. 386–389. 24. Комбинированное использование сцинтиграфии с 99 mTc-Технет- рилом и эхографии в диагностике метастатического поражения лимфатических узлов у больных раком молочной железы / С.В. Канаев, С.Н. Новиков, П.В. Криворотько, В.Ф. Семиглазов, П.И. Крживицкий, Л.А. Жукова, И.И. Семенов, Т.Ю. Семиглазова, Ю.Ф. Негусторов // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – С. 328–334. 25. Критерии оценки эффективности и токсичности предоперацион- ной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы (РМЖ) / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Клименко, П.В. Криворотько, Л.В. Филатова, С.Н. Новиков, Е.А. Бусько, В.А. Чубенко, Ф.В. Моисеенко, В.В. Семиглазов, В.Г. Иванов, Г.А. Дашян, Е.А. Туркевич, Р.В. Донских, В.Ф. Семиглазов, Е.Н. Имянитов, М.Л. Гершанович // Материалы XVIII Российского онкологического конгресса. – М., 2014. – С. 180–181. 26. Кушлинский, Н.Е. Биохимические критерии прогноза и гормоночувствительности рака молочной железы: сравнительный анализ клиническо- 124 го значения исследования рецепторов стероидных гормонов и рецепторов эпидермального фактора роста в опухолях/ Н.Е.Кушлинский, Е.С. Герштейн // Маммология. – 1996. – № 3. – С. 15–25. 27. Кушлинский, Н.Е. Современные возможности молекулярно- биохимических методов оценки биологического «поведения» рака молочной железы / Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн // Вестн. РАМН. – 2001. – № 9. – С. 65–70. 28. Маммосцинтиграфия как маркер эффективности неоадъювантно- го лечения рака молочной железы для различных биологических подтипов рака молочной железы / Ж.В. Брянцева, С.В. Канаев, С.Н. Новиков, В.Ф. Семиглазов, П.В. Криворотько, Т.Ю. Семиглазова, Л.А. Жукова, Е.С. Труфанова, В.В. Клименко // Материалы конгресса российской ассоциации радиологов. – СПб., 2014. – С. 75–76. 29. Маркёры эффективности предоперационной таксансодержащей химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы / Т. Ю. Семиглазова, В. В. Клименко, Л. В. Филатова, В. А. Чубенко, П. В. Криворотько, В. Г. Иванов, Е. А. Туркевич, А. О. Иванцов, С. Н. Новиков, В. В. Семиглазов, Р. В. Донских, Ф. В. Моисеенко, Е. А. Бусько, Ж. В. Брянцева, М. А. Осипов, М. Л. Гершанович, Е. Н. Имянитов, В. Ф. Семиглазов // Вопр. онкологии. − 2013. – Т. 59, № 3. − С. 363–367. 30. Мерабишвили В.М. Онкологическая служба Санкт-Петербурга оперативная отчётность за 2010 год, углублённая разработка базы данных регистра по международным стандартам). Ежегодник Популяционного ракового регистра (№17) / под ред. Ю.А. Щербука, А.М. Беляева. – СПб., 2011 – 336 с. 31. Методические аспекты радионуклидной диагностики рака молочной железы с помощью 99m П.В. Криворотько, Семиглазов, В.Ф. Тс-Технетрила/ С.В. Канаев, С.Н. Новиков, П.И. Крживицкий, О.В. Зотова, Л.А. Жукова, Т.Ю. Семиглазова // Вопр. онкологии. – 2012. – Т. 58, № 6. – С. 768–772. 125 32. Молекулярные маркёры эффективности предоперационной хи- миотерапии местно-распространённого рака молочной железы / Т. Ю. Семиглазова, В. В. Клименко, Л. В. Филатова, П. В. Криворотько, В. А. Чубенко, В. Г. Иванов, Е. А. Туркевич, А. О. Иванцов, С. Н. Новиков, В. В. Семиглазов, Л. И. Мельник, Р. В. Донских, М. Л. Гершанович, Е. Н. Имянитов, В. Ф. Семиглазов // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – Приложение : материалы VIII Съезда онкологов и радиологов (СПб., 2013). − С. 67. 33. Мутация 5382insC в гене BRCA1 – новый маркёр эффективности таксансодержащейнеоадъювантной химиотерапии местно-распространённого рака молочной железы?/ Т. Ю. Семиглазова, В. В. Клименко, Л. В. Филатова, В. А. Чубенко, П. В. Криворотько, В. Г. Иванов, Е. А. Туркевич, А. О. Иванцов, С. Н. Новиков, В. В. Семиглазов, Р. В. Донских, Е. А. Бусько, Ж. В. Брянцева, М. А. Осипов, М. Л. Гершанович, Е. Н. Имянитов, В. Ф. Семиглазов // Вопр. онкологии. – 2013. – Т. 59, № 3. – Приложение : материалы VIII Съезда онкологов и радиологов (Санкт-Петербург, 2013). − С. 123. 34. Нанотехнологии в онкологии / В.Ф.Семиглазов, P.M.Палтуев, А.С.Ремизов, В.В.Семиглазов, Г.А. Дашян, А.А.Бессонов, К.Д.Пеньков, А.Г.Васильев, И.А.Гречухина, Т.Ю.Семиглазова, В.В. Коларькова // Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы : материалы VIII Междунар. ежегодной конференции. – СПб., 2011. – С. 36–42. 35. Неоадъювантная системная терапия рака молочной железы. Руководство для врачей / В.Ф. Семиглазов, А.Г. Манихас, Т.Ю. Семиглазова, А.А. Бессонов, В.В. Семиглазов. – СПб. : Аграф +, 2012. – 112 с. 36. Неоадъювантнаятаргетная терапия рака молочной железы / В.Ф. Семиглазов, Т.Ю. Семиглазова, А.А. Божок, А.Г. Манихас, А.Г. Васильев, В.В. Семиглазов, И.В. Никитина, К.С. Николаев. // Эффективная фармакотерапия. – 2013. – Т. 6 : Онкология, гематология и радиология. – № 1. – С. 12–18. 37. лезы / Неоадъювантная терапия гормонозависимого рака молочной жеВ.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, А.Г. Манихас, Г.А. Дашян, 126 В.Г. Иванов, Т.Ю.Семиглазова, Р.М. Палтуев // Злокачественные опухоли. – 2012. – Т. 2, № 2. – С. 6–11. 38. Новое в таргетной терапии HER2-позитивного рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова,И.В. Никитина, П.В. Криворотько, В.В. Клименко, М.А. Осипов, М.Л. Гершанович // Эффективная фармакотерапия. – 2013. – Т. 6 :Онкология, гематология и радиология. – № 1. – С. 6–12. 39. Новые подходы и новые препараты в таргетной терапии рака мо- лочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, Д.Х. Латипова, М.Л. Гершанович, В.А. Чубенко, В.С. Лукьянчикова, Г.А. Дашян, Р.М. Палтуев // Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы :материалы VIII международной ежегодной конференции. – СПб., 2011. – С. 188–199. 40. Новые таргетные препараты в лечении рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович, В.А. Чубенко, Д.Х. Латипова, В.С. Лукьянчикова, Г.А. Дашян, Р.М. Палтуев // Вопр. онкологии. – 2011. – Т. 57, № 5. – С. 592–600. 41. Новый подход к преодолению резистентности к гормонотерапии рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, П.В. Криворотько, В.В. Клименко, М.Л. Гершанович, В.Ф. Семиглазов // Фарматека. – 2012. – № 18. – С. 50–55. 42. Огнерубов, Н.А. Неоадъювантная терапия местно-распростра- ненного рака молочной железы : автореф. дис. д-ра мед. наук : 14.00.14 / Огнерубов Николай Александрович. – М., 1992. – 44 с. 43. Омельчук Н.Н., Волкова Л.В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЛИФЕРА- ТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ // Успехи современного естествознания. – 2014. – № 10 . – С. 15-15. 44. Оптимизация предоперационной химиотерапии местно- распространённого рака молочной железы на основе молекулярно-генетических маркёров / В.В. Клименко, М.А. Осипов, М.М. Крамчанинов, 127 В.А. Клюге // Материалы IV Международного молодёжного медицинского Конгресса. – СПб., 2013. – С. 57. 45. Опухолевые маркеры при раке молочной железы / В.Ф. Се- миглазов, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян, А.А. Бессонов, Р.М. Палтуев, Т.Ю. Семиглазова, А. Васильев, А.Г. Манихас // Врач. – 2011. – № 12. – C. 2– 7. 46. Опухоли репродуктивной системы / В.Ф. Семиглазов, Р.М. Палтуев, Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян, А.Г. Манихас. – М. : Рекламно-издательская группа МегаПро, 2013. – 236 с. 47. Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. Руко- водство : в 2 т. / под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянникова. – М. : Медицина, 1993. – Т. 1. – С. 130–158. 48. Предоперационная (неоадъювантная) эндокринотерапия рака мо- лочной железы / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян, В.Г. Иванов, А.Е. Клетсель, Е.К. Жильцова, Р.В. Донских, Т.Ю. Семиглазова, Д.Е. Мацко, Ж.В. Брянцева, И.В. Никитина, Д.Е. Щедрин, Л.М. Берштейн // Эффективная фармакотерапия. – 2013. – Т. 6 : Онкология, гематология и радиология. – № 1. – С. 18–24. 49. Прогностическое значение определения рецепторов эпидермального фактора роста у больных раком молочной железы I–II стадии: результаты шестилетнего наблюдения / Е.С. Герштейн, М.А. Муавия, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Вопр. онкологии. – 1998. – Т. 44(4) – С. 383–389. 50. Ранний рак молочной железы: прогностическое значение биоло- гических подтипов (Анализкумулятивной базы данных ФГБУ «НИИ Онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития) / В.Ф. Семиглазов, Р.М. Палтуев, В.В. Семиглазов, А.Г. Манихас, К.Д. Пеньков, К.Ю. Зернов, И.В. Никитина, А.А. Божок, Д.Е. Щедрин, Т.Ю. Семиглазова, А.М. Ермаченкова, И.А. Гречухина, Г.А. Дашян // Злокачественные опухоли. – 2012. – Т. 2, № 2. – С. 12–18. 128 51. Рекомендации международной группы экспертов по неоадъ- ювантной (первичной) системной терапии операбельного рака молочной железы / M. Kaufman, G.N. Hortobagyi, A. Goldhirsch [et al.] // J. Clin. Oncol. (Русское издание). – 2007. – Т. 1, № 1. – С. 68–76. 52. Роль молекулярных маркеров в оценке результатов исследования «Таксаны в комбинации с антрациклинами (ТАС) и без антрациклинов (ТС) в неоадъювантном лечении больных местно-распространенным раком молочной железы»/ Т.Ю. Семиглазова, В.В. Клименко, Л.В. Филатова, П.В. Криворотько, В.Г. Иванов, Е.А. Туркевич, А.О. Иванцов, С.Н. Новиков, В.В. Семиглазов, Р.В. Донских, Е.А. Бусько, Ж.В.Брянцева, М.А. Осипов, М.Л. Гершанович, Е.Н. Имянитов, В.Ф. Семиглазов// Материалы III конференции Общества специалистов по опухолям органов репродуктивной системы. – М., 2013. – С. 64–65. 53. Семиглазов, В.Ф. Неинвазивные и инвазивные опухоли молочной железы / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, А.Е. Клецель. – СПб., 2006. – 211 с. 54. Семиглазов, В.Ф. Обоснование показаний к различным видам те- рапии ранних стадий рака молочной железы (по материалам Сан-Галлена, 2009) / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян. – М., 2009. – 62с. 55. Семиглазова, Т.Ю.Комбинированная химиотерапия гемцитаби- ном (Гемзаром) и цисплатином при диссеминированном раке молочной железы, прогрессирующем после лечения антрациклинами, доцетакселом и капецитабином / Т.Ю. Семиглазова, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович // Вопр. онкологии. – 2005. – Т. 51, № 1. – С. 66–70. 56. Семиглазова, Т.Ю. Кселода в лечении диссеминированного рака молочной железы после исчерпанного применения антрациклинов и таксанов / Т.Ю. Семиглазова // Вопр. онкологии. – 2004. – Т. 50, № 1. – С. 105–106. 57. Семиглазова, Т.Ю. Лечение больных HER2-позитивным раком молочной железы с метастазами в головной мозг: новые перспективы лечения / Т.Ю. Семиглазова // Химиотерапия и таргетная терапия рака молочной 129 железы / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, А.Г. Манихас.– М. : МЕДпрессинформ, 2012. – 350 с. 58. Семиглазова, Т.Ю. Метастатический рак молочной железы: ин- новационные таргетные препараты 2012 года / Т.Ю. Семиглазова // Материалы II конференции Общества специалистов по опухолям органов репродуктивной системы. – М., 2012. – С. 77. 59. Семиглазова, Т.Ю. Протективное влияние Афинитора на костную ткань у больных раком молочной железы / Т.Ю. Семиглазова // Материалы Национальной научно-практической конференции «Проблемы терапии гормоночувствительного рака молочной железы у пациенток в постменопаузе». – М., 2012. – С. 21–25. 60. Стратегия лечения рака молочной железы, основанная на выде- лении биологических подтипов / В.Ф. Семиглазов, В.В. Семиглазов, Г.А. Дашян, Т. Семиглазова, А. Манихас // Врач. – 2011. – № 12. – C. 28–34. 61. Таксотер в неоадъювантном лечении рака молочной железы / В.В. Семиглазов, Р.В. Донских, Т.Ю. Семиглазова, А.А. Божок, Д.Е. Мацко// Вопр. онкологии. - 2011. - Т. 57, № 5.-С. 645–650. 62. Таргетная терапия Her2 позитивного рака молочной железы с ме- тастазами в головной мозг: новые перспективы лечения / Т.Ю. Семиглазова, Д.Х. Латипова, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович // Фарматека. – 2010. – № 17. – C. 19–24. 63. Таргетная терапия в лечении местно-распространенного и диссе- минированного рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2 / Т.Ю. Семиглазова, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович, А.А. Божок, А.Г. Манихас, В.В. Семиглазов, Д.Е. Мацко, И.И. Семенов, В.Г. Иванов, О.И. Понамарева, Г.А. Дашян, Р.М. Палтуев, П.В. Криворотько, Р.В. Донских, К.Ю. Зернов, Н.Ю. Бараш, Е.К. Жильцова, Е.В. Ткаченко, А.Г. Васильев, Д.Х. Латипова, А.А. Тарасенкова, В.С. Лукьянчикова, Д.Е. Щедрин, А.М. Ермаченкова, А.А. Бессонов // Вопр. онкологии. – 2011. – Т. 57, № 6. – С. 789–790. 130 64. Таргетная терапия после прогрессирования HER2-позитивного рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова,В.А. Чубенко, Н.В. Брежнев, Ф.В. Моисеенко, Д.Х. Латипова, М.Л. Гершанович // Фарматека. – 2011. – № 17. – C. 10–14. 65. Таргетная терапия рака молочной железы (новые направления) / В.Ф. Семиглазов, Г.А. Дашян, В.В. Семиглазов, P.M. Палтуев, А.Г. Манихас, А.А. Бессонов, А.М. Ермаченкова, Д.Е. Щедрин, Т.Т. Табагуа, И.А. Гречухина, П.В. Криворотько, Р.В. Донских, Т.Ю. Семиглазова, В.В. Коларькова // Фарматека. – 2011. – № 7 (220). – С. 14–20. 66. Таргетная терапия рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова, В.В. Семиглазов, Л.В. Филатова, М.Л. Гершанович, В.А. Чубенко, Д.Х. Латипова, В.С. Лукьянчикова, Г.А. Дашян, Р.М. Палтуев // МедлайнЭкспресс-2011. – Т. 208, № 2–3. – С. 66–72. 67. 14-3-3zeta overexpression defines high risk for breast cancer recur- rence and promotes cancer cell survival / C.L. Neal, J. Yao, W. Yang [et al.] // Cancer Res. – 2009. – Vol. 69(8). – P. 3425–3432. 68. 18F-FDG PET of locally invasive breast cancer and association of es- trogen receptor status with standardized uptake value: microarray and immunohistochemical analysis / J.R. Osborne, E. Port, M. Gonen [et al.] // J. Nucl. Med. – 2010. – Vol. 51(4). – P. 543–549. 69. A combined proteome and ultrastructural localization analysis of 14- 3-3 proteins in transformed human amnion (AMA) cells: definition of a framework to study isoformspecific differences / J.M. Moreira, T. Shen, G. Ohlsson [et al.] // Mol. Cell Proteomics. – 2008. – Vol. 7(7). – P. 1225–1240. 70. A comparison of PAM50 intrinsic subtyping with immunohistochem- istry and clinical prognostic factor in tamoxifen-treated estrogen receptor – positive brest cancer / T.O. Nielsen, J.S. Parker, S. Leung [et al.] // Clin. Res. – 2010. – Vol. 16. – P. 5222–5232. 131 71. A novel p53 target gene, S100A9, induces p53-dependent cellular apoptosis and mediates the p53 apoptosis pathway / C. Li, H. Chen, F. Ding [et al.] // Biochem. J. – 2009. – Vol. 422(2). – P. 363–372. 72. Aka, J.A. Comparison of Functional Proteomic Analyses of Human Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7 / J.A. Aka, S.X. Lin // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(2). – P. e31532. 73. Alkaline single cell gel electrophoresis (comet assay): a simple tech- nique to show genomic instability in sporadic breast cancer / S. Colleu-Durel [et al.] // Europ. J. Cancer. – 2004. – Vol. 40. – P. 445–451. 74. Allred D.C. Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis //Mod. Path. 1998. -Vol. 11.-P. 155-168. 75. Alo, P.L. Fatty acid synthase (FAS) predictive strength in poorly dif- ferentiated early breast carcinomas / P.L. Alo, P. Visca, G. Trombetta // Tumori. – 1999. – Vol. 85(1). – P. 35–40. 76. American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommenda- tions for the use of tumor markers in breast cancer / L. Harris, H. Fritsche, R. Mennel [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2007. – Vol. 25 (33). – Р. 5287–5312. 77. Amplification and overexpression of topoisomerase II alpha predict response to anthracycline-based therapy in locally advanced breast cancer / J.S. Coon, E. Marcus, S. Gupta-Burt [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2002 Apr. – Vol. 8(4). – P. 1061–1067. 78. Amplification of topoisomerase II alpha is a strong predictor of re- sponse to epirubicin-based chemotheropy in HER-2/neu positive metastatic breast cancer : Program and abstracts of the 23rd Annual San Antonio Breast Cancer Symposium; December 6-9, 2000; San Antonio, Texas. Abstract 21 / J.J. Isola, M. Tanner, K. Holli [et al.] // Breast Cancer Res. Treat. – 2000. – Vol. 64. – P. 31 79. Anthracyclines: selected new developments / M. Binaschi, M. Bigioni, A. Cipollone [et al.] // Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. – 2001. – Vol. 1, № 2. – P. 113–130. 132 80. Antitumor effect of a selective COX-2 inhibitor, celecoxib, may be at- tributed to angiogenesis inhibition through modulating the PTEN/PI3K/Akt/ HIF-1 pathway in an H22 murine hepatocarcinoma model / W. Sui, Y. Zhang, Z. Wang [et al.] // Oncol. Rep. – 2014. – Vol. 31(5). – P. 2252–2260. 81. Apple, S.K. How do we measure a residual tumor size in histopathol- ogy (the gold standard) after neoadjuvant chemotherapy? / S.K. Apple, F. Suthar // Breast. – 2006. – Vol. 15(1). – P. 370–376. 82. Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case Series unselected for family history: a combined analysis of 22 studies / A. Antoniou [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 2003. – Vol. 72. – P. 1117–1130. 83. Basal-like breast cancer defined by five biomarkers has superior prognostic value than triple- negative phenotype / M.C. Cheang, D. Voduc, C. Bajdik [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2008. – Vol. 14. – P. 1368–1376. 84. Breast cancer subtypes and response to docetaxel in node-positive breast cancer: use of an immunohistochemical definition in the BCIRG 001 trial / J. Hugh, J. Hanson, M.C. Cheang [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27 (8). – Р. 1168–1176. 85. Bühler, H. Transfection of keratin 18 gene in human breast cancer cells causes induction of adhesion proteins and dramatic regression of malignancy in vitro and in vivo / H. Bühler, G. Schaller // Mol. Cancer Res. – 2005. – Vol. 3(7). – P. 365–71. 86. Carper, S.W. cDNA sequence of a human heat shock protein HSP27 / S.W. Carper, T.A. Rocheleau, F.K. Storm // Nucleic Acids Res. – 1990. – Vol. 18 (21). – P. 6457. 87. Castaneda, C.A. Prolonged Disease Control in a Patient WithAn- thracycline- and Taxane-Resistant Breast Cancer / C.A. Castaneda, H.L. Gomez // Clin. Breast Cancer. – 2009. – Vol. 9 (4). – P. B1-E3. 133 88. Cell biological prognostic factors in breast cancer: a review / J.A. Foekens, H.A.Peters, H. Portengen [et al.] // J. Clin. Immunoassay. – 1991. – Vol. 14. – P. 184–196. 89. Cellular functions of 14-3-3 zeta in apoptosis and cell adhesion em- phasize its oncogenic character / M. Niemantsverdriet, K. Wagner, M. Visser, C. Backendorf // Oncogene. – 2008. – Vol. 27(9). – P. 1315–1319. 90. Chien, A.J. Cellular mechanisms of resistance to anthracyclines and taxanes in cancer: Intrinsic and acquired / A.J. Chien, M.M. Moasser // SeminOncol. – 2008. – Vol. 35(Suppl. 2). – P. S1–14. 91. Cianfrocca, M. New Molecular Classifications of Breast Cancer / M. Cianfrocca, W. Gradishar // CA: A Cancer Journal for Clinicians. – 2009. – Vol. 59, № 5. – P. 303. 92. CK8/18 expression, the basal phenotype, and family history in identi- fying BRCA1-associated breast cancer in the Ontario site of the breast cancer family registry / A.M. Mulligan, D. Pinnaduwage, A.L. Bane [et al.] // Cancer. – 2011. – Vol. 117(7). – P. 1350–1359. 93. Class III beta-tubulin overexpression is a marker of poor clinical out- come in advanced ovarian cancer patients / G. Ferrandina, G.F. Zannoni, E. Martinelli [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2006 May 1. – Vol. 12(9). – P. 2774– 2779. 94. Classical and novel prognostic markers for breast cancer and their clinical significance / T. Pankaj, M. Dejan, K. Fumitake [et al.] // Clin. Med. Insights Oncol. — 2010. – P. 15–34. 95. Clinical significance of class III beta-tubulin expression and its predic- tive value for resistance to docetaxel-based chemotherapy in gastric cancer / N. Urano, Y. Fujiwara, Y. Dokiet al.] // Int. J. Oncol. – 2006 Feb. – Vol. 28(2). – P. 375–381. 96. Comparison of apolipoprotein D determination methods in breast can- cer / H. Søiland, I. Skaland, E.A. Janssen [et al.] // Anticancer Res. – 2008. – Vol. 28(2B). – P. 1151–1160. 134 97. Comparison of the prognostic significance of Chevallier and Sataloff's pathologic classifications after neoadjuvant chemotherapy of operable breast cancer / F. Penault-Llorca, C. Abrial, I. Raoelfils [et al.] // Hum. Pathol. – 2008. – Vol. 39. – P. 1221–1228. 98. Comparison of topoisomerase II alpha gene status between primary breast cancer and corresponding distant metastatic sites / V. Durbecq, A. Leo, F. Cardoso [et al.] // Breast Cancer Res. Treat. – 2003. –Vol. 77. – P. 199–20430. 99. Correlation between topoisomerase-IIalpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer / V. Durbecq, C. Desmed, M. Paesmans[et al.] // Int. J. Oncol. – 2004. – Vol. 25. – P. 1473–1479. 100. CTCAE v3.0: development of a comprehensive grading system for the adverse effects of cancer treatment / Trotti A, Colevas AD, Setser A [et al.] // Semin Radiat Oncol. 2003 Jul;13(3):176-81. 101. Desai, K.V. S100A6 as a biomarker in human breast cancer / K.V. Desai // Proc. Am. Assoc. Cancer Res. – 2005. – Vol. 46. – P. 448. 102. DeVries, T.J. The plasminogen activation system in tumour invasion and metastasis / T.J. DeVries, G.N. vanMuijen, D.J. Ruiter // Pathol. Res. Pract. – 1996. – Vol. 192. – P. 718–733. 103. DNA topoisomerase II alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer / L. Nakopoulou, A.C. Lazaris, N. Kavantzas [et al.] // Pathobiology. – 2000. – Vol. 68. – P. 137–143. 104. DNA topoisomerase IIalpha expression and the response to primary chemotherapy in breast cancer / G. MacGrogan, P. Rudolph, Id. I.Mascarel [et al.] // Br. J. Cancer. – 2003 Aug 18. – Vol. 89(4). – P. 666–671. 105. Downregulation of Hsp27 (HSPB1) in MCF-7 human breast cancer cells induces upregulation of PTEN / N. Cayado-Gutiérrez, V.L. Moncalero, E.M. Rosales [et al.] // Cell Stress Chaperones. – 2013. – Vol. 18(2). – P. 243–249. 106. Dual role of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in human breast cancer / E. Verjans, E. Noetzel, N. Bektas [et al.] // BMC Cancer. – 2009. – Vol. 9. – P. 230. 135 107. Duffy, M.J. Biochemical markers in breast cancer: which ones are clinically useful? / M.J. Duffy // Clin. Biochem. – 2001. – Vol. 34(5). – P. 347– 352. 108. Effect of preoperative chemotherapy on localregional disease in women with operable breast cancer: findings from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-18 / B. Fisher, A.Brown, E. Mamounas [et al.] // J. Clin. Oncol. – 1997. – Vol. 15. – P. 2483–2493. 109. Effects of chemotherapy on pathologic and biologic characteristics of locally advanced breast cancer / A.H. Honkoop, H.M. Pinedo, J.S. De Jong [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. – 1997. – Vol. 107. – P. 211–218. 110. EGFR associated expression profiles vary with breast tumor subtype / K.A. Hoadley, V.J.Weigman, C. Fan [et al.] // BMC Genomics. – 2007. – Vol. 8. – P. 258. 111. Elevated keratin 18 protein expression indicates a favorable prognosis in patients with breast cancer / Schaller G., Fuchs I., Pritze W. [et al.] // Clin. Cancer Res. – 1996. – Vol. 2. – P. 1879–1885. 112. Epidermal growth factor recep-tors: critical mediators of multiple receptor pathways / P.O.Hackel, E.Zwick,N. Prenzel, A. Ullrich // Current Opinion on Cell Biology. – 1999. – Vol. 11. – P. 184–189. 113. ERBB2 and TOP2A in breast cancer: a comprehensive analysis of gene amplification, RNA levels, and protein expression and their influence on prognosis and prediction / J. Brase, M. Schmidt, T. Fischbach [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2010. – Vol. 16, № 8. – P. 2391–2401. 114. Evaluation of chemotherapy efficacy in patients with breast cancer by tumor visualization with 99mTc-MIBI/ S.N. Novikov, S.V. Kanaev, T.Y. Semiglazova, P.V. Krivorotko, V.F. Semiglazov, L.A. Jukova // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. – 2012. – Vol. 39 (Sumpl. 2). – P. 1130. – S610. 115. Evaluation of ER, PgR, Her-2 and Ki-67 as predictors of response to neoadjuvant anthracycline chemotherapy for operable breast cancer / R.J. Bur- 136 combe, A. Makris, P.I. Richman [et al.] // Br. J. Cancer. – 2005. – Vol. 92(1). – P. 147–155. 116. Evolution of chemotherapy efficacy in patients with advanced breast cancer: high accuracy of breast scintigraphy / S.N. Novikov, S.V. Kanaev, P.V. Krivorotko, T.Y. Semiglazova, V.F. Semiglazov, L.A. Jukova, E.A. Turkevich // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. – 2013. – Vol.40. – Suppl. 2. – P235. – S357. 117. Expression of class III beta-tubulin is predictive of patient outcome in patients with non-small cell lung cancer receiving vinorelbine-based chemotherapy / P. Seve, S. Isaac, O. Tredan [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2005 Aug 1. – Vol. 11(15). – P. 5481–5486. 118. Expression of cyclooxygenase-2 in invasive breast carcinomas and its prognostic impact / H.P. Dhakal, B. Naume, M. Synnestvedt [et al.] // Histol. Histopathol. – 2012. – Vol. 27(10). – P. 1315–1325. 119. Factors influencing time to seeking medical advice and start of treatment in breast cancer (BC) patients – an International survey / J. Jassem, V. Ozmen, F. Bacanu [et al.] // Cancer Res. – 2012. – Vol. 72 (Suppl. 24). – P5-0202. – S. 427–428. 120. Fatty acid synthase expression in Barrett's esophagus: implications for carcinogenesis / N. Ishimura, Y. Amano, A.A. Sanchez-Siles [et al.] // J. Clin. Gastroenterol. – 2011. – Vol. 45(8). – P. 665–672. 121. Fatty acid synthase phosphorylation: a novel therapeutic target in HER-2 overexpressing breast cancer cells / J. Quanri, L.X. Yuan, D. Boulbes [et al.] // Breast Cancer Res. – 2010. – Vol. 12(6). – P. R96. 122. Fisher, E.R. Pathobiology of preoperative chemotherapy: findings from the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel (NSABP) protocol B-18/ Fisher E.R., Wang J., Bryant J. // Cancer. – 2002. – Vol. 95. – P. 681–695. 123. Fisher, E.R.Pathobiology of preoperative chemotherapy: findings from the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel (NSABP) protocol B-18 / E.R. Fisher, J. Wang, J. Bryant // Cancer. – 2002. – № 95. – Р. 681–695. 137 124. Gasparini, G. Clinical significance of determination of surrogate markers of an-giogenesis in breast cancer / G. Gasparini // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2001. – Vol. 37(2). – P. 97–114. 125. Global gene expression profiling unveils, S100A8/A9 as candidate markers in H-ras-mediated human breast epithelial cell invasion / A. Moon, H.Y. Yong, J.I. Song [et al.] // Mol. Cancer Res. – 2008. – Vol. 6(10). – P. 1544– 1553. 126. Gradishar, W. Management of advanced breast cancer with the epothiloneВ analog, Ixabepilone / W. Gradishar // Drug Des. Devel. Ther. – 2009. – Vol. 3. – P. 163–171. 127. Growth regulatory peptide production by human breast carcinoma cells / M.E. Lippman,R.B. Dickson, E.P. Gelmann [et al.] // J. Steroid Biochem. – 1988. – Vol. 30. – P. 53–61. 128. Hamilton, A. The contribution of molecular markers to the prediction of response in the treatment ofbreast cancer: a review of the literature on HER-2, p53 and BCL-2 / A. Hamilton, M. Piccart // Ann. Oncol. – 2000. – Vol. 11(6). – P. 647–663. 129. Harris, A.L. Anti-angiogenesis therapy and strategies for integrating it with ad-juvant therapy / A.L. Harris // Recent Results Cancer Res. – 1998. – Vol. 152. – P. 341–352. 130. Hazard of recurrence and adjuvant treatment effects over time in lymph node-negative brest cancer / J.J. Digman, V. Dukic, S.T. Anderson [et al.] // Breast Cancer Res. Treat. – 2009. – Vol. 116. – P. 595–602. 131. HER 2/neu and Topoisomerase II alpha Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Breast Carcinomas / R. Bhargava, P. Lal, B. Chen [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. – 2005. – Vol. 123. – P. 889–895. 132. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in node-positive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 138 5-fluorouracil / A. Di Leo, D. Gancberg, D. Larsimont [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2002a. – Vol. 8(5). – P. 1107–1116. 133. High levels of Hsp90 cochaperone p23 promote tumor progression and poor prognosis in breast cancer by increasing lymph node metastases and drug resistance / N.E. Simpson, W.M. Lambert, R. Watkins [et al.] // Cancer Res. – 2010. – Vol. 70(21). – P. 8446–1856. 134. Hortobagyi, G.N. Locally advanced breast cancer / G.N.Hortobagyi, S.E. Singletary, T.A. Buchholz // In: Advanced therapy of breast disease. – Sec. ed. – London : BC Decker Inc Hamilton, 2004.– P. 498–508. 135. Hsp-27 expression in invasive ductal breast carcinoma / J. Grzegrzolka, K. Kurnol, P. Piotrow [et al.] // Folia Histochem. Cytobiol. – 2012. – Vol. 50(4). – P. 527–533. 136. Hypoxia activates the cyclooxygenase-2–prostaglandin E synthase axis / J.J. Lee, M. Natsuizaka, S. Ohashi [et al.] // Carcinogenesis. – 2010. – Vol. 31(3). – P. 427–434. 137. IGF-I, IGFBP-3 and breast cancer risk in women: The European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) / S. Rinaldi, P.H. Peeters, F. Berrino [et al.] // Endocr. Relat. Cancer. – 2006. – Vol. 13(2). – P. 593–605. 138. Imatinib reverses doxorubicin resistance by affecting activation of STAT3-dependent NF-κB and HSP27/p38/AKT pathways and by inhibiting ABCB1/ J.T. Sims, S.S. Ganguly, Bennett H. [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8(1). – P. e55509. 139. Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma / T.O. Nielsen, F.D. Hsu, K. Jensen [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2004. – Vol. 10, № 16. – P. 5367–5374. 140. Imyanitov, E.N. Breast cancer therapy for BRCA1 carriers: moving towards platinum standard? / E.N. Imyanitov // Hered Cancer Clin. Pract. – 2009. – Vol. 7, №1. – P. 8. 141. Imyanitov,E.N.Mechanisms of breast cancer / E.N.Imyanitov, K.P. Hanson // Drug Discov. Today. – 2004. –Vol. 1. Mech. –P. 235–245. 139 142. Inflammatory breast cancer. Pilot study of intensive induction chemotherapy (FEC-HD) results in a high histologic response rate / B. Chevallier, H. Roche, J.P. Olivier [et al.] // Am. J. Clin. Oncol. – 1993. – Vol. 16. – P. 223– 228. 143. International Ki-67 in Breast Cancer Working Group. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group / M. Dowsett, T.O. Nielsen, R. A'Hern [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. – 2011. – Vol. 103 (22). – Р. 1656–1664. 144. Järvinen, T.A.H. HER-2/neu and Topoisomerase IIá – simultaneous drug targets in cancer / T.A.H. Järvinen, E.T. Liu // Comb. Chem. High Throughput Screen 6. – 2003. – P. 79–99. 145. Jensen, E.V. The estrogen receptor: a model for molecular medicine / E.V. Jensen, V.C. Jordan // Clin. Cancer Res. – 2003. – Vol. 9. – P. 1980. 146. Kaptain, S.Her-2/neu and breast cancer / S. Kaptain, L.K. Tan, B. Chen // Diagn. Mol. Pathol. – 2001. – Vol. 10(3). – P. 139–152. 147. Keratin 18 attenuates estrogen receptor alpha-mediated signaling by sequestering LRP16 in cytoplasm / Y. Meng, Z. Wu, X. Yin [et al.] // BMC Cell Biol. – 2009. – Vol. (10). – P. 96. 148. Ki67 expression and docetaxel efficacy in patients with estrogen receptor-positive breast cancer / F. Penault-Llorca,F. Andre, C. Sagan [et al.] // J Clin Oncol. – 2009. – Vol. 27 (17). – Р. 2809–281. 149. Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential / R. Yerushalmi, R. Woods, P.M. Ravdin [et al.] // Lancet Oncol. – 2010. – Vol. 11 (2). – Р. 174–183. 150. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer / M.C. Cheang, S.K. Chia, D. Voduc [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. – 2009. – Vol. 101. – P. 736–750. 151. Loss of Tsc1/Tsc2 activates mTOR and disrupts PI3K-Akt signaling through downregulation of PDGFR / H. Zhang, G. Cicchetti, H. Onda [et al.] // J. Clin. Invest. – 2003. – Vol. 112(8). – P. 1223–1233. 140 152. McGuire, W.L. Hormone receptors: their role in predicting prognosis and re-sponse to endocrine therapy / W.L. McGuire // Semin. Oncol. – 1978. – Vol. 5. – P. 428–433. 153. Measurement of residual breast cancer burden to predict survival after neoadjuvant chemotherapy / Symmans W.F., Peintinger F., Hatzis C. [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2007. – Vol. 25. – P. 4414–4422. 154. Melchor, L. An integrative hypothesis about the origin and development of sporadic and familial breast cancer subtypes / L. Melchor, J. Benítez // Carcinogenesis. – 2008. – Vol. 29. – P. 1475–1482. 155. Mignatti, P. Plasminogen activators and matrix metalloproteinases in angiogenesis / P. Mignatti, D.B. Rifkin // Enzyme Protein. – 1996. – Vol. 49. – P. 117–137. 156. Miller, I.D. A new gistological grading system to assess response of breast cancer to primary chemotherapy / I.D. Miller, S. Payne, K.N. Ogston // Int. J. Oncol. – 2002. – Vol. 20(4). – P. 791–796. 157. Moghal, N. Multiple positive and negative regulators of signal-ing by the EGF-receptor / N. Moghal, P.W. Sternberg // Current Opinion on Cell Biology. – 1999. – Vol. 11. – P. 190–196. 158. Molecular identification of cytosolic prostaglandin E2 synthase that is functionally coupled with cyclooxygenase-1 in immediate prostaglandin E2 biosynthesis / Tanioka T., Nakatani Y., Semmyo N. [et al.] // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275 (42). – P. 32775–32782. 159. Molecular profile of ductal carcinoma in situ of the breast in BRCA1 and BRCA2 germline mutation carriers / P. van der Groep, P.J. van Diest, F.H. Menko[et al.] // J. Clin. Pathol. – 2009. – Vol. 62, № 10. – P. 926–930. 160. Molecular subtypes of breast cancer are associated with characteristic DNA methylation patterns / K. Holm, C. Hegardt, J. Staaf [et al.] // Breast Cancer Res. – 2010. – Vol. 12, № 3. – P. 36. 141 161. Mueller, R. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples, genes, chromosomes / R. Mueller // Cancer. – 2004. – Vol. 39. – P. 288–297. 162. Neoadjuvant chemotherapy in breast cancer: Significantly enhanced response with docetaxel / I.С.Smith, S.D.Heys, A. W. Hutcheon [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2002. – Vol. 20. – P. 1456–1466. 163. Nicholson, R.I. EGFR and cancer prognosis / R.I. Nicholson, J.M. Gee, M.E. Harper // Europ. J. Cancer. – 2001. – Vol. 37 (Suppl. 4). – P. 9–15. 164. Overexpression of 14-3-3gamma causes polyploidization in H322 lung cancer cells / W. Qi, X. Liu, W. Chen [et al.] // Mol. Carcinog. – 2007. – Vol. 46(10). – P. 847–856. 165. p53 and vascular-endothelial-growth-factor (VEGF) expression predicts outcome in 833 patients with primary breast carcinoma / B. Linderholm, B. Lindh, B. Tavelin [et al.] // Int. J. Cancer. – 2000. – Vol. 89(1). – P. 51–62. 166. Park, K. Topoisomerase II-alpha (topoII) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy / K. Park, J. Kim, S. Lim, S. Han // Eur. J. Cancer. – 2003 Mar. – Vol. 39(5). – P. 631–634. 167. Pathologic complete response rates in young women with BRCA1positive breast cancers after neoadjuvant chemotherapy / T. Byrski, J. Gronwald, T. Huzarski [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2010. – Vol. 28. – P. 375–379. 168. Pathologic response to induction chemotherapy in locally advanced carcinoma of the breast: a determinant of outcome / D.M. Sataloff, B.A. Mason, A.J. Prestipino [et al.] // J. Am. Coll. Surg. – 1995. – Vol. 180. – P. 297–306. 169. Perou, C. Molecular classification of breast cancer and its emerging clinical relevance. T7ze / C. Perou // Breast. – 2011. – March. – Vol. 20 (suppl. 1). P. S2-S3. – ISSN 0906-9776. 170. Phenotypic evaluation of the basal" like subtype of invasive breast carcinoma / C.A. Livasy, G. Karaca, R. Nanda [et al.] // Mod. Pathol. – 2006. – Vol. 19. – P. 264–271. 142 171. Pilot and feasibility study: comparative proteomic analysis by 2-DE MALDI TOF/ TOF MS reveals 14-3-3 proteins as putative biomarkers of response to neoadjuvant chemotherapy in ER-positive breast cancer / V.C. Hodgkinson, V. Agarwal, D. EL Fadl [et al.] // J. Proteomics. – 2012. – Vol. 75(9). – P. 2745– 2752. 172. Predictive value of tumor Ki-67 expression in two randomized trials of adjuvant chemoendocrine therapy for node-negative breast cancer / G. Viale, M.M. Regan, M.G. Mastropasqua[et al.] // J. Natl. Cancer Inst. – 2009. – Vol. 100 (3). –Р. 207–212. 173. Prevalence of amplification of the oncogenes c-myc, HER2/neu and int-2 in one thousand human breast tu-mors: correlation with steroid receptors / P.M.J.J. Berns, J.G.M. Klijn, I.L. Van Staveren [et al.] // Europ. J. Cancer. – 1992. – Vol. 28. – P. 697–700. 174. Primary versus adjuvant chemotherapy in premenopausal patients with tumor considered too large for breast conservingsurgery: preliminary results of a randomized trial / S.M. Scholl, A. Fouquet, B. Asselain [et al.] // Europ. J. Cancer. – 1994. – Vol. 30A. – P. 645–652. 175. Prognostic and predictive value of the 21-ggene recurrence score assay in postmenopausal women with node-positive, oestrogen- receptor-positive brestcanceron chemotherapy: a retrospective analysis of a randomized trial / K.S. Albain, W.E. Barlow, S. Shak [et al.] // Lancet Oncol. – 2010. – Vol. 11. – P. 55–65. 176. Protein kinase A-mediated 14-3-3 association impedes human dapper1 to promote disheveled degradation / H. Chen, L. Liu, B. Ma [et al.] // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286(17). – P. 14870–80. 177. Psoriasin (S100A7) expression and invasive breast cancer / S. AlHaddad, Z. Zhang, E. Leygue [et al.] // Am. J. Pathol. – 1999. – Vol. 155(6). – P. 2057–2066. 143 178. Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study / L.A. Carey, C.M. Perou, C.A. Livasy [et al.] // JAMA. – 2006. – Vol. 295. – P. 2492–2502. 179. Radhakrishnan, V.M. 14-3-3gamma induces oncogenic transformation by stimulating MAP kinase and PI3K signaling / V.M. Radhakrishnan, J.D. Martinez // PLoS One. – 2010. – Vol. 5(7). – P. e11433. 180. Randomized Trial of Dose-Dense Versus Conventionally Scheduled and Sequential Versus Concurrent Combination Chemotherapy as Postoperative Adjuvant Treatment of Node-Positive Primary Brest Cancer: First Report of Intergroup Trial C9741; Cancer and Leukemia Group B Trial 9741 / M.L. Citron, D.A. Berry, C. Cirrincione [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2003. – Vol. 21. – P. 1431– 1439. 181. Recommendations from an international expert panel on the use of neoadjuvant (primary) systemic treatment of operable breast cancer: an update / M. Kaufmann, G.N. Hortobagyi, A. Goldhirsch [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2006. – Vol. 24. – P. 1940–1949. 182. Regulation of TSC2 by 14-3-3 binding / Y. Li, K. Inoki, R. Yeung K.L. Guan // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277(47). – P. 44593–44596. 183. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets / T. Sorlie, R. Tibshirani, J. Parker [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100. – P. 8418–8423. 184. Role of TRAP1 and estrogen receptor alpha in patients with ovarian cancer – a study of the OVCAD consortium / S. Aust, A. Bachmayr-Heyda, P. Pateisky [et al.] // Mol. Cancer. – 2012. – Vol. 11. – P. 69. 185. Schnitt, S.J. Breast cancer in the 21st century: neu opportunities and neuchal-lenges / S.J. Schnitt // Mod. Pathol. – 2001. –Vol. 14(3). – P. 213–218. 186. Searching for cancer"associated gene polymorphisms: promises and obstacles / E.N. Imyanitov [et al.] // Cancer Lett. – 2004. – Vol. 204. – P. 3–14. 144 187. Seve, P. The role of beta III tubulin in predicting chemoresistance in non-small cell lung cancer / P. Seve, T. Reiman, C. Dumontet // Lung Cancer. – 2010. – Vol. 67. – P. 136–143. 188. Significant allelic loss of ANX7 region (10q21) in hormone receptor negative breast carcinomas / X. Leighton, V. Srikantan, H.B. Pollard [et al.] // Cancer Lett. – 2004. – Vol. 210(2). – P. 239–244. 189. Silencing of the annexin II gene downregulates the levels of S100A10, c-Myc, and plasmin and inhibits breast cancer cell proliferation and invasion / J. Zhang, B. Guo, Y. Zhang [et al.] // Saudi Med. J. – 2010. – Vol. 31(4). – P. 374– 381. 190. Silencing of the annexin II gene downregulates the levels of S100A10, c-Myc, and plasmin and inhibits breast cancer cell proliferation and invasion / J. Zhang, B. Guo, Y. Zhang [et al.] // Saudi Med. J. – 2010. – Vol. 31(4). – P. 374– 81. 191. Sirt2 interacts with 14-3-3 beta/gamma and downregulates the activity of p53/ Y.H. Jin, Y.J. Kim, D.W. Kim [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2008. – Vol. 368(3). – P. 690–695. 192. Sirt2 interacts with 14-3-3 beta/gamma and downregulates the activity of p53 / Y.H. Jin, Y.J. Kim, D.W. Kim [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2008. – Vol. 368(3). – P. 690–695. 193. Stressinduced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation / T.H. Wang, A. Chao, C.L. Tsai [et al.] // Mol. Cell Proteomics. – 2010. – Vol. 9(9). – P. 1873–1884. 194. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes / J.S. Parker, M. Mullins, M.C. Cheang [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27. – P. 1160–1167. 195. Synergistic up-regulation of prostaglandin E synthase expression in breast cancer cells by 17 beta-estradiol and proinflammatory cytokines / J. Frasor, A.E. Weaver, M. Pradhan, K. Mehta // Endocrinology. – 2008. – Vol. 149(12). – P. 6272–6279. 145 196. The clinical significance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in human breast cancer: a review on 5232 patients / J.G. Klijn, P.M. Berns, P.I. Schmitz [et al.] // Endocrin. Rev. – 1992. – Vol. 13. – P. 3–17. 197. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms / Z.Hu, C.Fan, D.S. Oh [et al.] // BMC Genomics. – 2006. – Vol. 7. – P. 96. 198. The prognostic potential of keratin 18 in breast cancer associated with tumor dedifferentiation, and the loss of estrogen and progesterone receptors / S.A. Ha, Y.S. Lee, H.K. Kim [et al.] // Cancer Biomark. – 2011. – Vol. 10(5). – P. 219–231. 199. The role of S100 genes in breast cancer progression / E. Mc Kiernan, E.W. McDermott, D. Evoy [et al.] // Tumour Biol. – 2011. – Vol. 32(3). – P. 441– 50. 200. The role of topoisomerase II alpha and HER-2 in predicting sensitivity to anthracyclines in breast cancer patients / C. Oakman, E. Moretti, F. Galardi [et al.] // Cancer Treat. Rev. – 2009. – Vol. 35, № 8. – P. 662–667. 201. Theillet, C. What do we learn from HER2 positive breast cancer genomic profiles? / C. Theillet // Breast Cancer Res. – 2010. – Vol. 12, № 3. – P. 107. 202. TRAP1 and the proteasome regulatory particle TBP7/Rpt3 interact in the endoplasmic reticulum and control cellular ubiquitination of specific mitochondrial proteins / M.R. Amoroso, D.S. Matassa, G. Laudiero [et al.] // Cell Death. Differ. – 2012. – Vol. 19(4). – P. 592–604. 203. Tumor STAT1 transcription factor activity enhances breast tumor growth and immune suppression mediated by myeloid-derived suppressor cells / L.M. Hix, J. Karavitis, M.W. Khan [et al.] // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288(17). – P. 11676–11688. 204. Upregulated HSP27 in human breast cancer cells reduces Herceptin susceptibility by increasing Her-2 protein stability / S.H. Kang, K.W.Kang, K.H. Kim [et al.] // BMC Cancer. – 2008. – Vol. 8. – P. 286. 146 205. Urruticoechea, A.Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer / A. Urruticoechea, I.E. Smith, M. Dowsett // J. Clin. Oncol 2005. – Vol. 23(28). – P. 7212–7220. 206. UVB-induced COX-2 expression requires histone H3 phosphorylation at Ser10 and Ser28 / Y.S. Keum, H.G. Kim, A.M. Bode [et al.] // Oncogene. – 2013. – Vol. 32(4). – P. 444–452. 207. Vasseur, S. DJ-1/PARK7 is an important mediator of hypoxia-induced cellular responses / S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – Vol. 106(4). – P. 1111–1116. 208. Walker, L.C. Cytokeratin KRT8/18 expression differentiates distinct subtypes of grade 3 invasive ductal carcinoma of the breast / L.C. Walker, G.C. Harris, A.J. Holloway // Cancer Genet. Cytogenet. – 2007. – Vol. 178(2). – P. 94–103. 209. Zelco, I.N. Superoxide dismutase multigene family: A comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution and expression / I.N. Zelco, T.J. Mariani, R.J. Folz // Free Radic Biol. Med. – 2002. – Vol. 33(3). – P. 337–349.
