Кафедра фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии Заведующий кафедрой доктор медицинских наук профессор М.Н. Ивашев _________________________ «_____» _______________2009г. ОТЧЕТ О ВЛИЯНИИ КУРСОВОГО ВВЕДЕНИЯ АЛФЛУТОПА И ГЛЮКОЗАМИНА НА ПОЛОВУЮ АКТИВНОСТЬ КРЫС Пятигорск 2009 Исполнители: руководитель работы доктор биологических наук профессор кафедры фармакологии А.В. Сергиенко исполнитель аспирант кафедры фармакологии И.А. Савенко 2 Содержание: ВВЕДЕНИЕ 4 АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 4 Цель работы 6 Задачи исследования 6 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 7 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 7 ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ 7 СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ И ДОЗЫ 7 МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛОВОЙ АКТИВНОСТИ КРЫС-САМЦОВ 8 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ 9 ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 10 ВЛИЯНИЕ КУРСОВОГО ВВЕДЕНИЯ АЛФЛУТОПА ГЛЮКОЗАМИНА НА СЕКСУАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КРЫС И 10 ВЫВОДЫ 12 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 13 3 ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Длительное введение алфлутопа и глюкозаминогликана применяется в клинической практике при воспалительно-дегенеративных заболеваниях костно-мышечной системы. Алфлутоп – комплексный препарат, предназначенный для длительной фармакотерапии воспалительно-дегенеративных заболеваний костно- мышечной системы. Препарат комплексный, в состав его входят экстракт из 4 видов морских рыб, что объясняет его уникальный эффект за счет комплекса биологически активных веществ животного происхождения и олигоэлементов. Состав экстракта 1 ампула содержит биоактивный концентрат морских организмов 10mg: - Гликозаминогликаны – гиалуроновая кислотата, хондроитин–6- сульфат, хондроитин-4-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат. - Аминокислоты и низкомолекулярные пептиды. - Микроэлементы - Na, K, Fe, Са, Mg, Cu, Zn. - Стабилизаторы и консерванты. и глюкозамин – биологически активные соединения Алфлутоп проявляет следующие виды фармакологической активности, установленные в условиях клинического и доклинического (экспериментального) исследования: • стимулирует активность хондроцитов и регулирует их пролиферацию; • стимулирует биосинтез гиалуроновой кислоты и коллагена II типа; • подавляет активность гиалуронидазы и других ферментов, принимающих участие в разрушении межклеточного матрикса; • тормозит биосинтез медиаторов воспаления, включая провоспалительные цитокины; 4 • оказывает антиоксидантное действие за счет стимуляции активности супероксидисмутазы Рациональный комплекс, применяемый в практической медицине, это комбинирование алфлутопа и глюкозамина (стопартроза) в виде сульфата, либо гидрохлорида. Показания к применению глюкозамина сульфата следующие: • профилактика дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов у лиц старше 40 лет, • пациентам с факторами риска: с интенсивными, длительными физическими нагрузками. • дегенеративно-дистрофические заболевания суставов и позвоночника в составе комплексной терапии. • пациентам, длительно принимающих НПВС по поводу заболеваний суставов. Гликозаминокгликаны представляют собой повторяющиеся соединения 2 молекул- сахара и аминосахаров: хондроитин-сульфат (глюкуроновая кислоты + N-ацетилгалактозамин) и кератан-сульфат ( галактозы + N- ацетиглюкозамин). Поскольку гликозаминогликаны – компонент, входящий в состав соединительной, эпителиальной и нервной ткани. Это крупная молекула, способная одна удержать несколько тысяч молекул воды рядом с собой. В организме человека в среднем содержится 15 г гиалуроновой кислоты, принимает самое активное участие не только в увлажнении, но и в процессах заживления, повышает иммунитет и снимает воспаление. С возрастом количество гликозаминогликан) в гиалуроновой тканях кислоты сокращается, (несульфатированный вызывая недомогания и физическое старение. В возрасте 50 лет люди имеют в 2 раза меньше гиалуроновой кислоты, чем в молодости. Снижение гиалуроновой кислоты считают одним из основных факторов старения всего организма в целом и таких его признаков, как уменьшение подвижности суставов, изменение внешнего вида кожи, различных заболеваний сердечно-сосудистой системы и 5 возрастных изменений зрения. Практически все гликозаминогликаны ковалентно связаны с белком в молекуле протеогликанов. Гликозаминогликаны как основные скрепляющие вещества связаны с компонентами, входящими в структуру костей, межклеточного матрикса, соединительной ткани. Они служат смягчающим и смазочным материалом для разного рода тканей. Столь разносторонняя биологическая активность гликозаминогликанов в сочетании с алфлутопом способна обеспечить биостимулярующую активность на лабораторных животных, установленных в предыдущих экспериментальных исследованиях. В литературе имеются сведения о стимулирующем влиянии морепродуктов на половую активность у людей (устрицы, морской конек и др.) Экспериментально обоснованного рандомизированного фармакологического исследования по влиянию комплекса алфлутоп и глюкозамина сульфата на половую активность крыс-самцов не проводилось. В этом заключается теоретическая и практическая значимость проведенного исследования. Цель работы Фармакологическое исследование комплекса алфлутоп и глюкозамина сульфат по влиянию на половую активность крыс-самцов. Задачи исследования Для достижения поставленной цели в работе определены задачи: 1. Определить на крысах-самцах влияние курсового введения в течение 4х недель алфлутопа и глюкозамина сульфата на половое поведение крыс-самцов; 2. Исследовать на крысах действие алфлутопа и глюкозамина на половые охоты и половые контакты крыс-самцов; 3. Сравнить полученные результаты с контрольной группой животных, получавших физиологический раствор. 6 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В эксперименте использовали зарегистрированные препараты: - Алфлутоп, состав препарата: 1 ампула содержит биоактивный концентрат морских организмов 10 mg, фенол макс 0,005 g. вода для инъекций до 1 ml., производства «Биотехнос С.А.», г. Бухарест, Румыния. Серия № 08,02,0113; - Глюкозамина сульфат (биологически активная добавка к пище стопартроз) в виде порошка. В эксперименте использовались: раствор физиологический (0,9% раствор натрия хлорида), раствор Рингера-Локка для теплокровных животных 1 , и другие биохимические реактивы для растворения препаратов. ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ Эксперименты проводили in vivo на белых половозрелых крысах самцах линии Wistar, массой 240±20г (24 животных), и крысы-самки возрастом 2 месяца, весом 175±5,0г из одного помета. Животные не участвовали ранее в эксперименте, прошли 2-х недельный карантин [8]. Животные выращены в питомнике ПятГФА, (г. Пятигорск), содержались на стандартном режиме вивария: температура окружающего воздуха 22±2 0С, 12-часовой синхронизированный световой режим, комбинированный корм и вода ad libitum [10, 9]. СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ И ДОЗЫ Согласно аннотации на препарат, алфлутоп следует человеку вводить по 1 ампуле в день (10мг). Учитывая среднюю массу человека 70кг, это составляет 0,14мг на 1кг. При переносе доз с человека на белых крыс и обратно используется коэффициент межвидового переноса доз, который составляет 5,9 в случае 1 состав: натрия хлорида 8,0 г, калия хлорида 0,2 г, натрия гидрокарбоната 0,1 г, глюкозы 1,0 г, воды дистиллированной до 1000 мл 7 использования в эксперименте крыс. Стандартная экстрополяция (коэффициент) дозировок лекарственных средств с человека на животных представлена в руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, изданному в г.Москве в 2000г. под редакцией профессора В.П.Фисенко, страница 105 [10, 4]. В этом случае экспериментальная доза препарата составляет 0,84мг/кг веса крысы. Для достижения этой дозировки ампулу 1мл с содержанием 10мг экстракта растворяли в 10мл воды. Этого раствора вводили 0,8мл на 100г веса тела крысы. Глюкозамина сульфат вводили в виде раствора, приготовленного ex tempore. Согласно аннотации, порошка глюкозамина следует принимать в дозе 1200 мг. На 1 кг человек получает 17,14 мг. С учетом коэффициента межвидового переноса доз с организма человека на организм крысы доза составляет 101,14 мг/кг/сут. Крыса на каждые 100г веса получала 10,11мг глюкозамина сульфата. Для этого 1 саше глюкозамина сульфата (1200 мг) растворяли в 60 мл теплой воды и вводили этого раствора крысам по 0,5 мл на 100 г веса. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛОВОЙ АКТИВНОСТИ КРЫССАМЦОВ Для проведения опыта была использована установка, состоящая из общей открытой площадки 60х45 см, в углах которой находились отсеки (домики) для крыс, вход в которые прикрыт шторками. В один домик помещался самец, а в другой самка. Для приближения к самке самцу было необходимо проделать некоторую работу: отодвинуть шторку, пройти расстояние по открытой площадке и пробраться в отсек (домик) самки. В ходе эксперимента отмечались следующие параметры: время первого выхода и количество выходов самца из своего домика, количество и время первого подхода к самке, количество охот и половых контактов. Количество охот 8 определялось по тактильным контактам: обнюхивание, касание языком (облизывание самки), контакт лапками. При переносе таких параметров с организма крыс на организм человека охота определяет либидо с характерными жестами: объятие, поцелуй. Половые контакты оценивались как продуктивное состоявшееся сексуальное действие. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ В таблицах и рисунках диссертации данные представлены в виде средних арифметических и ошибки среднеквадратичного отклонения. Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых рядов. Результаты опытов сравнивали с исходными показателями, с животными, получившими воду [1]. Расчёты результатов проводились в пакете компьютерной программы Microsoft Excel 2000 [2]. Изменения исследуемых показателей считались статистически значимыми при p<0,05 [3,4,4]. 9 ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЛИЯНИЕ КУРСОВОГО ВВЕДЕНИЯ АЛФЛУТОПА И ГЛЮКОЗАМИНА НА СЕКСУАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КРЫС Проводилось определение половой активности крыс самцов при курсовом применении алфлутопа и глюкозамина в течение 4 недель, (группа состояла из 6 животных). Перед проведением эксперимента крысы-самцы опытной группы, и контрольной группы, были изолированы от самок в течение 1 месяца. Самки участвовали в эксперименте интактные. Для приведения крыс-самок к единому гормональному статусу использовались в эксперименте молодые 2-месячные самки из одного помета, весом 170-180г, не участвовавшие ранее в эксперименте. Время эксперимента составляло 15 минут, что при экстраполяции с организма крысы на организм человека составляет ориентировочно 10 часов. Результаты представлены в таблицах. См. Таблица1, Таблица 2. Таблица1 СЕКСУАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КРЫС- САМЦОВ, НЕ ПОЛУЧАВШИХ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА (КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА) Параметр количество Латентное время Выход самца из домика Подход к самке Половые охоты (либидо) Половые контакты (секс) 2,5+0,086 9,25+0,265 10+0,205 3,75+0,037 1′05′′+0,087 1′40′′+0,089 3′20′′+0,017 5′25′′+0,028 Таблица 2 ВЛИЯНИЕ АЛФЛУТОПА И ГЛЮКОЗАМИНА НА СЕКСУАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КРЫС- САМЦОВ (ОПЫТНАЯ ГРУППА) Параметр Выход самца из домика Подход к самке Половые охоты (либидо) Половые контакты (секс) количество 3,25+0,089 +30% 10,5+0,171 +13,51% 14,25+0,067 +42,5% 5,25+0,086 +40,0% Латентное время 0′50′′+0,095 -23,08% 1′30′′+0,065 -10,0% 2′15′′+0,076 -32,5% 2′45′′+0,068 -49,23% 10 Сравнительная характеристика сексуальной активности опытной и контрольной группы животных продемонстрировала, что по количеству параметров сексуальной активности курсовое введение алфлутопа и гликозамина сульфата увеличивает количество действий сексуального характера и снижает латентный период практически всех параметров. Продолжительность времени от начала эксперимента до проявления какоголибо вида действия достоверно уменьшается. Так, время от начала эксперимента до выхода самца, получившего курс алфлутопа и глюкозамина из камеры на 23,08% меньше, чем в контрольной группе. Подход к самке наступал на 10 секунд раньше, чем в контроле, и этот показатель на 10%. Демонстрация либидо (половые охоты) наступали в опытной группе через 2 минуты 15 секунд, тогда как в контрольной группе через 3 минуты 20 секунд, что различалось в 1,5 раза (на 32,5%). Время от начала эксперимента до первого сексуального контакта опытной группы составляло 2 минут 45 секунд, тогда как в контрольной группе через 5 минут 25 секунд, это различалось в 1,97 раза, т.е. достоверно на 49,23%. Таблица 3 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЕКСУАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ, ПОЛУЧИВШИХ КУРС АЛФЛУТОПА И ГЛЮКОЗАМИНА И КОНТРОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ (КРЫСЫ- САМЦЫ, N=6) параметр количество %к kк контролю контролю Выход самца из 30% 1,3 домика Подход к самке 13,51% 1,135 Половые охоты 42,5% 1,425 (либидо) Половые 40,0% 1,4 контакты (секс) Примечание: контроль принят за 100 %. Латентное время % к контролю k к контролю -23,08% 0,77 -10,0% -32,5% 0,90 0,68 -49,23% 0,51 11 Из результатов, представленных в таблицах следует, что курсовое введение алфлутопа совместно с глюкозамином существенно влияет на сексуальное поведение животных, производя стимулирующий эффект. Отмечено, что животные из опытной группы, относительно контрольной группы животных проявляли повышенный интерес к самкам. Самцы опытной группы более охотно шли на контакт в сравнении в контролем. Таким образом, в результате проведенной серии эксперимента следует отметить стимулирующее действие биологически активных компонентов, входящих в алфлутоп и глюкозамин на половую активность крыс-самцов. ВЫВОДЫ 1. Курсовое 4х недельное введение алфлутопа совместно с глюкозамина сульфатом (стопартрозом) крысам-самцам оказало стимулирующее влияние на половое поведение крыс-самцов; 2. Курсовое введение алфлутопа и гликозамина сульфата увеличивает количество действий сексуального характера и снижает латентный период практически всех параметров: подход к самке на 10%, демонстрация либидо (половые охоты) наступали на 32,5% раньше, чем в контроле; 3. Время от начала эксперимента до первого сексуального контакта опытной группы наступало раньше на 49,23%. раньше, чем в контроле. 12 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Стрелков Р.Б. Статистические таблицы для ускоренной оценки фармакологического эффекта. // Фармакология и токсикология. - 1986.№4-С.100-104. 2. Макарова, Н.В. Статистика в Excel / Макарова Н.В., Трофимец В.Я. – М.: Финансы и статистика, 2002. – 368 с. 3. Боровиков, В.П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков – СПб.: Питер, 2001. – 239 с. 4. Платонов, А.Е. Статистический анализ данных в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов – М.: Изд-во РАМН, 2000. – 354 с. 5. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии. / Л.Н.Сернов, В.В.Гацура, - М.,2000. – С.318-319. 6. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / Реброва О.Ю. – М.: МедиаСфера, 2003. – 312 с. 7. Горбунов, Н.С. Сухожильный остов мужского полового члена / Н.С. Горбунов, П.А. Самотесов, Е.О. Помилуйкова // Морфология. 2002. т. 121. №2-3. С.42. 8. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии. / Сернов Л.Н., Гацура В.В., - М.,2000. –351с. 9. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – Москва. - 2005г. – 458c. 10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией В.П. Фисенко. – Москва. 2000г. – 398c. 13