Воронина евгения игоревна - Института клинической и
реклама
ГБОУ ВПО «НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Минздрава РФ ФГБУН «ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН» На правах рукописи ВОРОНИНА ЕВГЕНИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМАХ ПРИ ПРОЯВЛЕНИИ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ В УСЛОВИЯХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ (экспериментально-клиническое исследование) 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 – патологическая анатомия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Агеева Т.А. доктор биологических наук, профессор Зенкова М.А. Новосибирск – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ: СОКРАЩЕНИЯ…………………………………………………………………........5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….. 7 ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………13 1.1. Основные механизмы канцерогенеза и опухолевой прогрессии злокачественных опухолей системы крови………………………………………..13 1.1.1. Роль пролиферативной активности опухолевых клеток в развитии опухолевой прогрессии……………………………………………………………..17 1.1.2. Роль нарушения механизмов апоптоза в опухолевой прогрессии……….22 1.1.3. Множественная лекарственная устойчивость и ее роль в опухолевой прогрессии злокачественных новообразований…………………………………..25 1.2. Роль химиотерапии в лечении гемобластозов……………………………….30 1.2.1. Токсическое поражение ткани печени при цитостатической терапии……32 1.3. Цитохром Р450 и его роль в биотрансформации ксенобиотиков………….36 1.4. Подходы к индивидуализации лечения пациентов со злокачественными новообразованиями……………………………………………………………........38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ………………………………………..........41 2.1. Экспериментальная часть работы …………………………………………….41 2.1.1. Лабораторные животные и используемые опухолевые модели…………..41 2.1.2. Описание исходного штамма лимфосаркомы LS………………………….42 2.2. Эксперимент №1…………………………………………………………..........42 2.3. Эксперимент №2………………………………………………………………..44 2.4. Клинический материал исследования ………………………………………..45 2.5. Материалы, использованные в работе……………………………………….46 2.5.1. Оборудование…………………………………………………………………46 2.5.2. Препараты и реактивы……………………………………………………….46 2.5.3. Олигонуклеотиды, использованные в работе…………………………......48 2.5.4. Буферы и растворы………………………………………………………….49 2.6. Использованные в работе методы…………………………………………….49 3 2.6.1. Получение первичной культуры клеток из опухолевого узла……………49 2.6.2. Выделение суммарной клеточной РНК…………………………………….50 2.6.3. Обратная транскрипция………………………………………………………51 2.6.4. Проведение ПЦР……………………………………………………………..51 2.6.5. Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли…………………..52 2.6.6. Морфологические методы, используемые в работе……………………….53 2.6.7. Статистический анализ…………………………………………………........55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…………56 3.1. Модель экспериментальной лимфомы мышей RLS. Оценка опухолевой прогрессии у экспериментальных животных в зависимости от количества курсов ПХТ…………………………………………………………………………………….56 3.2. Гистологическое строение перевиваемой лимфомы RLS и морфологические особенности ткани опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ…………………………………………………………………………………..58 3.3. Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью………………………………………………………65 3.4. Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ.....................67 3.5. Динамика уровня экспрессии Ki-67 в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения ПХТ…………………………………………70 3.6. Уровень некрозов и апоптозов в экспериментальной лимфоме RLS без лечения и после курсов ПХТ………………………………………………………..71 3.6.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных caspase 3 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ.................................................…………………75 3.7. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин опухолевых клеток экспериментальной лимфомы мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ………………………...........................................78 3.8. Структурные изменения ткани печени и результаты исследования индекса мечения окрашенных на цитохром P450 гепатоцитов у животных с RLS до 4 лечения и после проведения курсов ПХТ…………………….………………………………………………………………81 3.9. Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов….………………………..................89 3.9.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин клеток ткани опухоли пациентов с первично возникшей ДБККЛ и в группе пациентов с рецидивами ДББКЛ после проведения курсов ПХТ………………………………………………………………………………….96 ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………........100 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………108 ЛИТЕРАТУРА……………………………………………………………………..110 5 СОКРАЩЕНИЯ: ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ДБККЛ – диффузная В-крупноклеточная лимфома ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИМ – индекс мечения МЛУ – множественная лекарственная устойчивость мРНК – матричная РНК НХЛ – неходжкинская лимфома ОТ – обратная транскрипция ПААГ – полиакриламидный гель п.н. – пары нуклеотидов ПХТ – полихимиотерапия ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота СЭИ – синдром эндогенной интоксикации Трис – трис- (оксиметил)- аминометан CHOP – схема полихимиотерапии, содержащая циклофосфан, винкристин, доксорубицин, преднизолон CYP – цитохром P450 DEPC – диэтилпирокарбонат DMSO – диметилсульфоксид DTT – дитиотреитол EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота EGFR – рецептор эпидермального фактора роста ENETS – Европейское общество по изучению нейроэндокринных опухолей IMDM – среда для выращивания клеточных культур Дульбеко в модификации Искова LS – лимфосаркома LSM – среда для отделения лимфоцитов 6 MDR – множественная лекарственная устойчивость NADP-H – никотинамидадениндинуклеотидфосфат PBS – буфер фосфатный P-gp – Р-гликопротеин PSA – персульфат аммония RLS – резистентная лимфосаркома SDS – додецилсульфат натрия TEMED – тетраметилэтилендиамин Wt -p53 – «дикий тип» гена р53 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Основным методом лечения гемобластозов является многокурсовая полихимиотерапия, что определяет особую важность мониторирования и оценки изменяющихся под воздействием цитостатиков молекулярно-биологических характеристик именно данного вида опухолей и приближает к основной идее персонализированной медицины – индивидуализации подходов диагностики и лечения злокачественных опухолей (Jain K.K. 1998; Foussard C. et al., 2005; Bosly A. et al., 2008). Это делает необходимым понимание процессов опухолевой прогрессии, в том числе и в опухолях после химио-лучевого воздействия (Hanahan D. et al., 2000). Полученные сведения помогут оптимизировать схемы лечения каждого пациента индивидуально и сделают возможным проведение более успешной таргетной терапии данной группе онкологических больных (Miura K. et al., 2011). Существует ряд проблем, не позволяющих полноценно и эффективно использовать химиотерапию: это развитие опухолевой прогрессии в результате накопления мутаций и генетической нестабильности, отбор клонов с максимальными возможностями к пролиферации, развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (Блохин Д.Ю., 2009; Foulds L., 1969). Все эти качества опухолевой клетки направлены на выживание и рост опухоли и нередко в ней включается сразу несколько механизмов защиты от воздействия химиотерапии. Отдельные свойства опухоли прогрессируют независимо друг от друга, а непредсказуемость количества и качества вторичных мутаций делают эту прогрессию уникальной и индивидуальной для каждой опухоли, что требует определения исходного и меняющегося под воздействием лечения генотипа каждого злокачественного новообразования. В настоящее время существенным недостатком противоопухолевых препаратов является их токсическое воздействие на органы и ткани. Все цитостатики подвергаются биотрансформации в печени с помощью системы микросомальных оксигеназ и в результате образуются токсические метаболиты, 8 которые вызывают развитие гепатотоксичности и повреждение гепатоцитов. Это в свою очередь является фактором ограничивающим проведение многократных курсов полихимиотерапии (Казюлин А.Н., 2012; Donepudi I., 2012; Amacher D.E., 2013). В научной литературе приводится крайне мало данных об изменениях в ткани печени при проведении многократных курсов терапии цитостатиками, это обстоятельство делает необходимым изучение морфологических изменений ткани печени в условиях цитотоксической нагрузки, а так же изменений уровней ферментных систем, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков. Кроме того, большой проблемой является моделирование схем лечения опухолей в эксперименте на животных, приближающееся по продолжительности курсов полихимиотерапии исследование процессов, у пациентов, формирующихся что в существенно опухоли ограничивает под воздействием на очевидную химиотерапии. Степень разработанности темы исследования: Вышеизложенные обстоятельства указывают недостаточность данных по обсуждаемой проблеме опухолевой прогрессии под воздействием цитостатиков и необходимость уточнения существующих сведений, что и определило цель и задачи настоящего исследования. Цель исследования: патоморфологические особенности изучить проявлений молекулярно-клеточные опухолевой прогрессии и в злокачественных лимфомах в условиях полихимиотерапии: в эксперименте на резистентной лимфоме мышей RLS и в опухолевой ткани пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой. 9 Задачи исследования: 1. На экспериментальной модели лимфомы мышей RLS исследовать динамику роста опухоли и соотнести её с показателями уровней некрозов и апоптозов в ткани опухоли под воздействием курсов полихимиотерапии. 2. Исследовать экспрессию генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости и инициации программы апоптоза, в клетках опухоли мышей RLS без лечения и после проведения курсов полихимиотерапии. 3. Иммуногистохимическим методом изучить динамику изменения экспрессии Ki-67, р53, caspase 3, bcl2 и Р-гликопротеина в клетках опухоли RLS под воздействием курсов полихимиотерапии. 4. Провести патоморфологическое изучение структурных изменений в печени мышей с лимфомой RLS и изучить экспрессию цитохрома P450 в гепатоцитах в динамике курсов полихимиотерапии. 5. Исследовать особенности морфологические проявлений опухолевой и молекулярно-биологические прогрессии в диффузной В- крупноклеточной лимфоме у пациентов до и после проведения многократных курсов полихимиотерапии. Научная новизна исследования: Впервые разработана оптимальная доза имплантирования опухолевых клеток резистентной лимфомы мышей RLS, позволяющая провести четырехкратное введение комплекса цитостатиков, что сделало возможным изучить спектр молекулярно-биологических изменений, происходящих в изначально резистентной к химиотерапии опухоли RLS поэтапно, после каждого из 4-х курсов химиотерапии. Впервые в резистентной лимфоме RLS на фоне четырехкратного введения комплекса цитостатиков установлено изменение экспрессии ключевых генов, регулирующих апоптоз и участвующих в формировании МЛУ, что в 10 совокупности с данными о динамике экспрессии соответствующих белков позволило сделать вывод об особенностях опухолевой прогрессии изначально резистентной к цитостатикам опухоли RLS. Впервые в лимфоме RLS после четырехкратного воздействия цитостатиков установлено нарушение процессов апоптоза, которые характеризовались повышением количества клеток, экспрессирующих белок bcl-2, снижением количества р53-позитивных клеток при невысоком числе клеток, синтезирующих каспазу 3 в течение всех 4 курсов полихимиотерапии. Впервые показано, что пролиферативная активность опухолевых клеток RLS до лечения и на этапах полихимиотерапии нарастает в совокупности с увеличением количества опухолевых клеток, экспрессирующих Р-гликопротеин, участвующий в формировании множественной лекарственной устойчивости. Впервые у животных с лимфомой RLS исследована динамика нарастания структурных изменений в паренхиме печени на фоне воздействия опухолевого процесса и 4 курсов полихимиотерапии, а так же впервые на основании изменений количества гепатоцитов, экспрессирующих цитохром Р450, показано «истощение» системы микросомального окисления в зависимости от нагрузки цитостатиками и нарастания деструктивных изменений паренхимы печени. Впервые у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой на основании исследования уровней экспрессии ряда белков, характеризующих опухолевую прогрессию (Ki-67, bcl-2, р53, Р-гликопротеин), установлены изменения молекулярных характеристик опухолевых лимфомных клеток под воздействием многократных курсов полихимиотерапии в процессе лечения заболевания в сравнении с впервые диагностированной диффузной В- крупноклеточной лимфомой. Научно-практическая значимость работы: Полученные новые данные дополняют сведения о молекулярно-клеточных механизмах формирования опухолевой прогрессии и множественной лекарственной устойчивости в изначально резистентных к химиопрепаратам 11 опухолях под воздействием многократных курсов полихимиотерапии, что зачастую наблюдают в клинике у пациентов с агрессивными формами лимфом. Данное изменений исследование в печени продемонстрировало при проведении особенности многокурсовой структурных химиотерапии свидетельствующих об «истощении» системы цитохрома Р450 в течение курсов введения цитостатиков, что сопряжено с нарушениями метаболизма цитостатиков и, как следствие, снижению их воздействия на опухолевую ткань, что следует учитывать в процессе длительного лечения онкологических больных химиопрепаратами. Основные положения, выносимые на защиту: 1. На фоне многократных введений комплекса цитостатических препаратов животным с лимфомой RLS, которая характеризуется изначально лекарственнорезистентным фенотипом, продолжала нарастать степень злокачественности опухоли, как отражение опухолевой прогрессии. Это выражалось в нарушениях механизмов гибели опухолевых клеток апоптозом, усилении множественной лекарственной устойчивости, наращивании пролиферативной активности опухолевых клеток. В итоге наблюдали снижении чувствительности опухоли к цитостатикам и прогрессирующий рост опухолевого узла на фоне курсов химиотерапии. 2. В условиях влияния опухолевого процесса и проведения многокурсовой полихимиотерапии нарастают деструктивные изменения в паренхиме печени животных и происходит «истощение» синтеза цитохрома Р450 в гепатоцитах, что снижает чувствительность опухоли к цитостатикам и повышает токсическую нагрузку на организм. 3. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с диффузной В-крупноклеточной лимфомой в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в леченой опухоли в сравнении с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой происходит блок 12 процессов апоптоза и активация множественной лекарственной устойчивости, что способствует прогрессированию опухолевого процесса у пациентов, снижает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, способствует увеличению опухолевой массы, повышению токсической нагрузки. Апробация результатов исследования: материалы исследования были представлены на ежегодной конкурс - конференции «Авиценна» (Новосибирск 2010, 2012), на всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара 2011), на межвузовской научной студенческой конференции «Интеллектуальный потенциал Сибири» (Новосибирск 2012), первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине ХХI века» (Москва 2012), на научно-практической конференции патологоанатомов ДВФО посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.И. Зеленского «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Хабаровск 2012), на научнопрактической патологоанатомической конференции Южного Урала с участием патологоанатомов других регионов России и СНГ, посвященной 30-и летию основания Челябинского областного патологоанатомического бюро (Челябинск 2014). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и содержит 3 таблицы. Библиографический указатель содержит 185 источников, из которых 45 отечественных и 140 зарубежных работ. 13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Основные механизмы канцерогенеза и опухолевой прогрессии злокачественных опухолей системы крови В настоящее время в развитии злокачественных новообразований, в том числе и гемобластозов, общепризнанной является мутационная теория, согласно которой злокачественные опухоли возникают вследствие повреждений в генетическом аппарате клеток. Спектр этих повреждений в неоплазмах характеризуется большим разнообразием и чаще всего наблюдается сумма нескольких видов мутаций в специфических генах регулирующих клеточный цикл (Зильбер Л.А., 1968; Имянитов Е.Н. 2007; Santella R. 2002; Coleman W. 2006;). Эти новые знания и современные достижения в области молекулярной биологии и диагностики злокачественных новообразований стали возможны благодаря расшифровке генома человека. Расшифровка молекулярных механизмов канцерогенеза стала основой для разработки новых тактик лечения онкозаболевний и повышения его эффективности, что реализовалось в улучшение показателей выживаемости онкологических пациентов. Так, в опубликованном в 2008 году сообщении Американского общества клинической онкологии (ASCO), подводящем итоги успехов клинической онкологии, приводятся данные о том, что сегодня не менее 2/3 лиц со злокачественными новообразованиями живут не менее 5 лет от момента установления диагноза, тогда как в 1970-е годы этот показатель не превышал 50%. В настоящее время в США проживают не менее 12 млн. лиц с диагнозом злокачественной опухоли, в то время как в 1971 году таких пациентов было лишь 3 млн. (Winer E. et al., 2009). Новые знания в области фундаментальных наук, подкрепляемые современными достижениями молекулярной биологии, позволили получить в конце 20-го столетия беспрецедентно важную информацию о процессах канцерогенеза, участии в злокачественной трансформации клеток множества 14 клеточных сигнальных путей, механизмах выживания и приспосабливания неоплазированных клеток в условиях химиолучевого лечения, что в совокупности с современными методами диагностики злокачественных новообразований открывают новые перспективы и ставят новые задачи в клинической онкологии – максимально индивидуализировать лечение пациента. Одной из передовых областей в этом направлении является онкогематология, для которой молекулярные методы позволили охарактеризовать процессы онкогенеза, выявить основные типы генов, которые часто становятся мишенями для аберраций и приводят к появлению опухолевого клона. В последние годы достигнуты впечатляющие результаты в лечении прежде всего злокачественных неходжкинских лимфом. Неходжкинские злокачественных лимфомы лимфоидных (НХЛ) являются новообразований, гетерогенной заболеваемость группой которыми ежегодно неуклонно растет и широко распространена в группах населения разного возраста. Смертность в данной группе новообразований занимает шестое место среди онкологических заболеваний (Чиссов В.И., 2013). Каждая из неходжкинских лимфом имеет характерные клинические проявления, диагностические критерии и индивидуальное лечение. Одним из наиболее часто встречающихся нозологических вариантов злокачественных лимфом, является диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ), составляющая более 1/3 от всех В-клеточных НХЛ. И даже внутри этой нозологической единицы выделены различные варианты, которые представлены в классификации гистологических, ВОЗ и характеризуются иммуноморфологических, существенным генетических разнообразием характеристик и клинического течения (Swerdlow S. et al., 2008), в связи с чем данное заболевание требует особенно тщательного и обдуманного подхода в диагностике и лечении, который предусматривает как правильность определения морфологического варианта опухоли, выбор адекватных схем терапии с соблюдением и подбором доз, так и мониторирование эффективности лечения с целью выявления ответа опухоли на терапию, а так же максимально индивидуальный подход к каждому 15 пациенту с учетом молекулярно-биологических особенностей его варианта онкологического заболевания (Hans C.,2004). Например абберантные соматические гипермутации встречаются более чем в 50% ДБККЛ и определяются во многих генетических локусах и включают такие гены, как PIMI, PAX5, MYC (Pasqualucci L. et al., 2001). До 30 % случаев выявленных аномалий t(3q27) касаются гена BCL6 и является самой распространенной транслокацией в ДБККЛ (Hitoshi O., 2012), в 20-30 % случаев фолликулярных лимфом выявляется транслокация гена BCL2 (t (14;18)) (Xu Y., 2005; Кanungo A. et al., 2006; Yin C., 2013). Возникающая в результате генетических аномалий дисфункция в процессах клеточной пролиферации, неконтролируемому росту дифференцировки популяции и гибели опухолевых клеток. приводит На к основе сформированных молекулярных повреждений и их комбинаций существует несколько основных типов нарушений в клеточной физиологии, которые опосредуют злокачественный рост, но в то же время они могут являться основными направлениями поиска управления опухолевым процессом: нечувствительность к сигналам генов - супрессоров, которые ингибируют рост клеток, независимость от сигналов роста, возможность неограниченного деления (пролиферативная активность), ангиогенез, ускользание от клеточной гибели, инвазивный рост, способность к метастазированию, развитие множественной лекарственной устойчивости, нарушения в регуляции клеточного цикла (Hanahan D. et al., 2000). В результате накопления мутаций и генетической нестабильности, отбора клонов с максимальными возможностями к пролиферации, развивается так называемая опухолевая прогрессия, то есть прогрессирующие негативные изменения свойств опухоли по мере ее роста (Блохин Д.Ю.,2009; Foulds L., 1969;), направленные на выживание опухоли в организме опухоленосителя и даже получение преимуществ перед ним. Отдельные признаки опухоли, например, скорость роста или способность вызывать иммунный ответ и ответ на химио- и лучевую терапию, прогрессируют независимо друг от друга, а непредсказуемость 16 количества и качества вторичных мутаций делают эту прогрессию уникальной и индивидуальной для каждой опухоли, что требует определения исходного генотипа каждого злокачественного новообразования и на его основе поиска новых подходов в выборе оптимальных программ лечения. В современной онкоморфологии постоянно ведется поиск критериев, которые позволили бы верифицировать степень гистологической злокачественности опухолей и могли бы предсказывать клиническое течение онкологического заболевания. Основными критериями являются: пролиферативная активность опухолевых клеток, выраженность процессов ангиогенеза, нарушение процессов апоптоза, формирование множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Научных изысканий, посвященных вышеуказанным аспектам онкоморфологии очень много, однако подавляющее большинство из них посвящено оценке показателей пролиферации, апоптоза либо ангиогенеза на этапе диагностики опухолевого заболевания с целью определить прогноз его течения. Однако необходимо учитывать, что в процессе течения онкозаболевания в рецидивах опухоли и в ее метастазах молекулярно-биологические характеристики опухолевой ткани могут существенно изменяться, особенно если опухоль подвергалась химио-лучевому воздействию. Именно для гемобластозов (как для лейкозов, так и для НХЛ) основным методом лечения является многокурсовая полихимиотерапия (ПХТ), что определяет особую важность оценки изменяющихся под воздействием цитостатиков молекулярно-биологических характеристик именно данного вида опухолей. В литературе представлено крайне мало исследований в данном направлении, хотя именно мониторирование «портрета» опухоли в процессе ПХТ максимально приближает к идее индивидуализации лечения каждого пациента. Исходя из того, что в классическом канцерогенезе реализуется тезис «один больной - индивидуальная опухоль» в современной онкологии наступил период, когда необходимо понять вектор прогрессии огромного разнообразия опухолей, индуцированный химио-лучевым воздействием. 17 1.1.1. Роль пролиферативной активности опухолевых клеток в развитии опухолевой прогрессии Опухолевые клетки обладают неограниченной, бесконтрольной пролиферацией и отсутствием баланса между ростом и гибелью, вызванными грубыми поломками в процессе прохождения по клеточному циклу, за счет чего и имеют преимущество перед нормальными клетками организма. Определение пролиферативной активности ткани опухоли является одной из наиболее важных характеристик ее фенотипа, которая определяет прогноз скорости роста опухоли в дальнейшем, ее ответ на лечение, способность к метастазированию и исход заболевания, а соответственно отражает индивидуальные свойства злокачественного новообразования любой локализации. В процессе роста и клеточного деления в опухолевых клетках могут появляться так называемые атипические митозы, в основе развития которых лежат повреждения митотического аппарата и которые характеризуются неравномерным распределением генетического материала между клетками анеуплоидией (от греч. an - не, eu - правильное, ploon - складываю), в результате чего появляются гигантские клетки в которых цитотомия может отсутствовать. Атипические митозы характерны для злокачественных опухолей и облученных тканей – чем выше уровень их пролиферации и чем значительнее степень анеуплоидии, тем соответственно, более агрессивной и прогностически неблагоприятной является опухоль (Weinberg, R., 2006). Для закономерной последовательности смены периодов клеточного цикла и для определения завершения прохождения каждой его фазы существуют контрольные точки. Если клетка проходит контрольную точку, то она может двигаться по клеточному циклу дальше, если же какие-либо обстоятельства, например повреждение ДНК, мешают клетке пройти через контрольную точку, то она останавливается и другой фазы клеточного цикла не наступит до тех пор, пока не будут устранены причины, не позволявшие клетке пройти через контрольную точку либо она подвергнется апоптозу (Nurse P.M., 2002; Bronchud 18 M.H. et al., 2004; Doonan J.H. et al., 2009). Существует несколько контрольных точек клеточного цикла: точка в G1фазе, где проверяется интактность ДНК перед вхождением в S-фазу, контрольная точка в S-фазе, в которой проверяется правильность репликации ДНК, контрольная точка в G2-фазе, где оцениваются повреждения, пропущенные при прохождении предыдущих сверочных точек, либо полученные на последующих стадиях клеточного цикла. В G2-фазе проверяется полнота репликации ДНК, и клетки, в которых ДНК недореплицирована, не входят в митоз (Фаллер Д. М., 2006; Афанасьев Ю.И., 2012; Tyson J. J., 2008). Таким образом, клеточный цикл – исключительно сложно регулируемый многоступенчатый и многократно дублируемый процесс, кодируемый каскадом генов-регуляторов и обеспечивающий гомеостаз организма (Ченцов Ю.С.. 2004; Alberts B., 2008; Tyson J. J., 2008; Frasca D., 2009). Нарушение нормальной регуляции клеточного цикла является причиной появления большинства опухолей (Stewart Z., 2003). Для опухолевых клеток характерны множественные изменения компонентов контрольных точек клеточного цикла. При инактивации контрольных точек клеточного цикла наблюдается дисфункция некоторых транскрипционных факторов, многие из которых являются онкосупрессорами и протоонкогенами, например самые известные из них – p53, с-Myc, K-ras – их мутации или неправильная регуляция очень часто встречаются в различных злокачественных опухолях. Известно, что мутации антионкогена p53 выявляются в 50% новообразований самых разных локализаций (Mitselou A., 2003; Salaverria I., 2011; Leventaki V., 2013). Мутации гена c-Myc были обнаружены у пациентов с лимфомой Беркитта, 8 хромосома опухолевых клеток которых имеет характерную транслокацию t (8;14) (Simonsson T.. 2002), позже его аномалии выявлены в различных видах рака легкого, яичников, нейробластоме, миеломе и многих других (Кабилова Т.О., 2008; Ruddell A., 2003; Schwab M., 2004; Gomez-Curet I. et al., 2006). K-ras в свою очередь, является геном, кодирующим один из белков, 19 играющих важную роль в сигнальной системе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) – сложного сигнального каскада, принимающего участие в развитии и прогрессировании рака, мутации которого выявлены при колоректальных раках, опухолях поджелудочной железы и легких ( Janssen K.P., 2003; Luan H. et al., 2010; Belyaeva V. et al., 2012; Court H. et al., 2013). Одним из критериев оценки пролиферативного потенциала опухоли, является определение числа делящихся клеток. С помощью большого количества маркеров пролиферативной активности проведено множество исследований активности пролиферации клеток опухоли в самых разных типах злокачественных новообразований и показано, что наиболее оптимальным, специфичным и удобным в ежедневной патоморфологической практике является иммуноморфологическое выявление ядерного белка Ki-67, который присутствует на всех стадиях клеточного цикла кроме G0, с определением индекса мечения ядер опухолевых клеток с помощью моноклонального антитела Ki-67 (клон MIB1) (Ковригина А., 2006; Dabbs J., 2010). Индекс мечения антителом к белку Ki-67 – надежный прогностический маркер для злокачественных опухолей различных локализаций, коррелирующий с гистологической степенью дифференцировки и клиническим течением, что продемонстрировано для глиальных опухолей головного мозга (Louis D.N. et al., 2007; Pouratian N.et al., 2008; Karim K.A. et al., 2012), опухолей молочной железы (Archer C.D. et al., 2003; Yerushalmi R. et al., 2010; Inwald E.C. et al., 2013), толстого кишечника (Takano Y.et al., 1996; Kim N.K. et al., 2001; Andrade N.R. et al., 2011), легких (Erler B.S. et al., 2011; Sofocleous C.T. et al., 2013) и множества других неоплазм. Например, для опухолей молочной железы в исследовании Penault-Llorca F., (2003) было показано, что пациентки, у которых Ki-67 экспрессируют более 50% клеток, имеют высокий риск развития рецидива заболевания. В исследовании Aas T. с соавт. (2003) было отмечено, что в случаях, когда высокий митотический индекс и показатель Ki-67 в раке молочной железы ассоциированы с мутацией 20 гена р53, вероятность хорошего эффекта неоадъювантной химиотерапии крайне низка, а отдаленные результаты лечения значительно ухудшаются. Показано, что определение индекса мечения маркера Ki-67 так же целесообразно для НХЛ, характеризующихся диффузной пролиферацией опухолевых лимфоидных клеток (Chang C., 2004; Szczuraszek K. et al., 2008). Broyde A. С. с соавт. (2009) в своем исследовании, выполненном на материале образцов ткани опухоли от 319 пациентов с впервые диагностированными НХЛ, показали, что уровень маркера пролиферации Ki-67 в среднем составляет 26,6% у пациентов с индолентными лимфомами, 67,2% - для агрессивных лимфом и 97,6% - для крайне агрессивных форм лимфом. При этом у разных подтипов НХЛ внутри группы индекс пролиферации также различался: среди индолентных лимфом фолликулярная лимфома имела индекс пролиферации в среднем 32,12%, MALT-лимфома (mucosa-associated lymphoid tissue) - 13,2%, а лимфоплазмоцитарная лимфома - 12,5%, в то время как агрессивная ДБККЛ 67,5%. Авторы заключают, что для большинства подтипов лимфом Ki-67 является предиктором исхода заболевания, ответа на лечение и прогноза выживания, а так же может помочь при проведении и оценке результата таргетной терапии у каждого пациента индивидуально. Для нейроэндокринных опухолей легкого Европейское общество по изучению нейроэндокринных опухолей (ENETS) в дополнение к классификации ВОЗ разработало систему определения степени их злокачественности (Grade) по количеству митозов: менее 2, от 2 до 20 и более 20 – G1, G2 и G3 соответственно, что в совокупности с уровнем экспрессии Кi-67 позволяет установить степень злокачественности и является важным прогностическим показателем течения нейроэндокринных опухолей легкого (Rindi G. et al., 2006). Для глиальных опухолей центральной нервной системы так же разработана подобная система Grade, основанная на определении уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67 - пограничным значением между доброкачественными и злокачественными глиальными опухолями признано значение всего в 5% позитивных клеток (Neder L. et al., 2001; Louis D.N. et al., 2007). 21 В литературе стали появляться очень редкие сообщения об изменении уровня пролиферации опухоли под воздействием лечения. Крайне интересные данные представили ученые из университета Тоттори (Япония) Okamoto Y. и Andocs G. (2011), которые в эксперименте на мышиной колоректальной карциноме показали изменение уровня экспрессии опухолевыми клетками Ki-67 после воздействия гипертермии. Онкотермия вызывала существенный регресс опухоли и через 5 дней после воздействия снижение в 10 раз пролиферативной активности в сохранившихся опухолевых клетках, однако через 25 дней уровень пролиферации в опухолевой ткани восстанавливался до исходного уровня. Данное экспериментальное исследование демонстрирует, что злокачественная опухоль, подвергшаяся лечебному воздействию, через какое-то время восстанавливает пролиферативный режим в переживших негативное воздействие субклонах клеток, которые, по-видимому, в дальнейшем будут отличаться большей устойчивостью. На клиническом материале Андрианов А.В (2008) оценивал состояние пролиферации в образцах остеосарком у детей и показал значительное уменьшение этого параметра на фоне химиотерапии. Определяя выраженность пролиферации в подгруппах детей с летальным исходом и у выживших, был выявлен достоверно более низкий исходный индекс пролиферации Ki-67 у выживших детей. В подгруппе детей с метастазами опухоли определено значимое преобладание индекса пролиферации как до, так и после химиотерапии, напротив - в подгруппе детей без метастазов пролиферация была низкой как до, так и после проведения лечения остеосаркомы. В ходе работы были установлены значительные различия длительности выживаемости детей в зависимости от различной степени пролиферации опухоли – автор отметил, что время бессобытийной выживаемости при высоком уровне индекса пролиферации было ниже, чем у детей с исходно низким уровнем пролиферации опухоли. Таким образом, в большом количестве работ, представленных в литературе, показано, что оценка пролиферативной активности опухоли с помощью маркера Ki-67 является одним из наиболее востребованных критериев в морфологии для 22 определения степени злокачественности новообразования исходно и может служить дополнением для определения прогноза течения заболевания и проведения дополнительного адъювантного лечения. Исходя из накопленных знаний о влиянии активности пролиферативных процессов в злокачественных новообразованиях на прогноз течения болезни, в настоящий момент представляется важным установить динамику изменения данного показателя на фоне противоопухолевого лечения. Исследований, посвященных изменению уровней экспрессии маркера Ki-67 в опухолях гемопоэтической природы и солидных опухолях после воздействия химио-лучевого лечения, встречается в литературе немного, хотя этот аспект представляет большой интерес, поскольку может отражать дальнейший потенциал опухоли, а примеров оценки данного показателя в опухолях с изначально резистентным фенотипом встречено не было. 1.1.2. Роль нарушения механизмов апоптоза в опухолевой прогрессии В нормальных тканях человеческого организма существует определенный баланс между клеточной пролиферацией и гибелью клеток. Одним из вариантов клеточной смерти является апоптоз – генетически запрограммированная гибель клетки. Апоптоз может быть проявлением нормальных процессов, таких как эмбриогенез, атрофия, клеточная пролиферация, инволюция (Манских В.Н., 2007) и лежит в основе многих патологических состояний, в том числе и опухолей самых разных локализаций (Ковынев И.Б., 2008; Кондратовский П.М., 2011; Chen G., 2009; Rudner J., 2013). В связи с этим в последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и клеточную пролиферацию при злокачественных новообразованиях. Процесс апоптоза можно условно разделить на три фазы: сигнальную, эффекторную и деградационную. Сигнальная фаза – запуск апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Существует большое количество факторов которые инициируют апоптоз, но, несмотря на их разнообразие, выделяются два основных пути 23 передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь. Далее наступает эффекторная фаза во время которой происходит формирование из разнородных эффекторных сигналов единого пути апоптоза, и запуск каскада сложных биохимических реакций. На этой стадии специализированные белки либо реализуют сигнал к апоптозу путём активации исполнительной программы (её эффекторами являются цистеиновые протеазы – каспазы и эндонуклеазы), либо блокируют потенциально летальный сигнал. Существует два варианта реализации этой стадии: путём прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз минуя геном клетки и опосредованная через геном передача сигнала на эффекторные каспазы и эндонуклеазы, одной из основных функций которых является упорядоченная рестрикция связей ДНК и разрушение клеточных структур (Archer С., 2000; Bröker L.E.et al., 2005; Alberts B. at al., 2008; Munoz-Pinedo С. 2012). Таким образом, эффекторные каспазы (например 3, 6, 7) можно назвать основными исполнителями апоптоза. Например, каспаза-8 (инициаторная каспаза) активирует путем протеолиза прокаспазу-3 и образуется каспаза-3 – она способна в дальнейшем к самостоятельной активации, а так же активирует ряд других протеаз семейства каспаз, после чего процесс, запущенный программой клеточной смерти, оказывается уже необратимым так как активируется необратимая фрагментация ДНК. Следовательно, каспаза-3 отвечает за ключевые события в процессах апоптоза (Varghese J., 2003) (рис.1). Другой их важной функцией является инактивация белков, блокирующих апоптоз, в том числе и антиапоптозных белков семейства Bcl-2 (Youle R., 2008; Song Y., 2009). В результате происходит последняя фаза (деградация), непосредственными исполнителями которой являются Ca2+- и Mg2+-зависимые эндонуклеазы (катализируют распад нуклеиновых кислот) и эффекторные каспазы (подвергают протеолитическому расщеплению белки, в том числе белки цитоскелета, ядра, регуляторные белки и ферменты). В итоге происходит гибель клетки путем ее фрагментации на отдельные апоптотические тельца, которые 24 утилизируются макрофагами (Манских В. Н., 2007; Анисимов В. Н., 2008; Vaux D.L., 2002; Banfalvi G. et al., 2009) (рис. 1). Ведущая роль в запуске процессов апоптоза и регуляции клеточного деления принадлежит «дикому» (Wt – wild type) типу гена-онкосупрессора p53 и кодируемого им ядерному белку р53, о чем говорит тот факт, что примерно в 50% всех исследованных злокачественных опухолях человека обнаружены мутации на 17 хромосоме, где локализуется антионкоген р53 (Копнин Б.П., 2008; Zhang G.J.,1998; Soussi T., 2000; Llanos M. et al., 2001). Мутации гена p53 часты в опухолях головного мозга (Bogler O. et al., 1995; Birner P., 2002), опухолях молочной железы (Thor A.D. et al., 1992; Esteva F. et al., 2004; Goradini D. et al., 2004), саркомах (Schneider-Stock R. et al., 1997; LópezTerrada D. et al., 2009;), опухолях легкого (Junker K. et al., 2001; Campling B.G. et al., 2003), а также разных вариантах гемобластозов (Yan C. et al., 1999; Hiraga J. et al., 2006; Chatzitolios A. et al., 2010). Поскольку мутация p53 – частое событие в канцерогенезе, представляет интерес оценить возможные изменения показателей апоптозной программы в опухолевой ткани в условиях повторяющейся цитостатической нагрузки, особенно в опухолях с изначально резистентным фенотипом. 25 Рис.1. Реализация программы апоптоза 1.1.3. Множественная лекарственная устойчивость и ее роль в опухолевой прогрессии злокачественных новообразований Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это невосприимчивость клеток или организма к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия. Причем у опухолевых клеток снижение чувствительности к химическим агентам происходит до такой степени, что они сохраняют способность к пролиферации при воздействии на них препарата в критической или даже более высокой концентрации, т.е. это своего рода механизм приспособления клеток опухоли к изменяющимся условиям их существования (Блохин Д.Ю. 2009). Данный феномен имеет важное клиническое значение, так как является серьезным препятствием на пути успешного лечения злокачественных новообразований (Ставровская А.А., 2000; Штиль А.А., 2003). В отношении гемобластозов этот феномен изучен достаточно подробно и сделан вывод, что он является основной причиной неудач в лечении и прогрессирования заболевания. 26 Существует несколько механизмов формирования данного феномена, все они могут быть следствием самых разных причин: от ограничения накопления химиопрепаратов в клетке и до отмены программы клеточной гибели, индуцируемой лекарственным веществом, а часто бывает, что в клетке включается сразу несколько механизмов МЛУ (Hegewisch-Becker S.,1996; Shtil A.A., 2002; Shah N.P., 2003). В данное время наиболее хорошо изучены такие механизмы как: активация ферментов системы глутатиона, активация трансмембранных транспортных белков, которые выводят токсические вещества из клетки (например, р-гликопротеин), изменения в системе генов и белков, которые осуществляют контроль за апоптозом и клеточной пролиферацией, усиление репарации лекарственно - индуцированного повреждения ДНК, повреждение лекарственных мишеней (топоизомераза II) (Goldstein L.J. et al., 1989; Filipits M., 2004; Baguley B.C, 2010). Существует взаимосвязь между количественными изменениями опухолевой клеточной популяции и изменениями их биологических свойств. В активно размножающейся опухолевой ткани всегда имеется некоторое количество лекарственно-устойчивых клеточных линий, соответственно по мере гибели опухолевых клеток, например под влиянием химиотерапевтических препаратов или лучевой терапии, нарушается соотношение между количеством лекарственночувствительных и лекарственно-устойчивых клеток в пользу последних. В результате такой клональной селекции формируется поликлоновая опухоль, в которой будут доминировать наиболее агрессивные клеточные клоны, устойчивые к лечению. Установлено, что цитотоксическое действие большинства противоопухолевых препаратов реализуется путем индукции апоптоза и ключевая роль в этом процессе, принадлежит белковым продуктам генов р53 и bcl-2 (Allouche M., 1997; Kojima Y. et al., 2006). Установлено, что экспрессия wtр53 повышает чувствительность к химиотерапии, поскольку ускоряет вхождение клеток в апоптоз, а вот мутантный р53 проявляет свойства онкогена, поскольку он не обладает способностью останавливать деление клетки с 27 поврежденной ДНК и индуцировать её апоптоз, в результате чего в клетках начинается репликация этой поврежденной ДНК. Все это в дальнейшем приведет к нестабильности генома и повысит вероятность закрепления вторичных мутаций и злокачественной трансформации клеток. Следовательно, белковый продукт гена супрессора р53 является важным компонентом клеточного цикла, снижение функции которого или его мутации приведут к выживанию опухолевых клеток, которые должны погибнуть в процессе проведения терапии (Чумаков П. М., 2000; Jeffrey P. 1994; Kotala V. et al., 2001; Levine A., 2006; Selivanova G., 2007). Белки семейства Bcl так же играют важную роль в регуляции апоптоза, индуцированного различными физиологическими, химиотерапевтическим и лучевыми воздействиями. Некоторые из этих белков (BCD-XL, Bag, Bcl-2) препятствуют развитию апоптоза, тогда как другие (Bcl-xS, Bax, Bad, Bak, Bid) наоборот, обладают проапоптотическим действием. Гиперэкспрессия белков bс12 делает клетки опухоли нечувствительными к проапоптотическим стимулам и, следовательно, ассоциирована такая гиперэкспрэкспрессия с устойчивостью опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов и лучевой терапии. Ген bcl-2 работает как супрессор апоптоза, препятствует гибели клеток путем апоптоза под действием химиопрепаратов, предотвращает протеолитический процессинг и активацию каспаз в ответ на повреждение ДНК, которое индуцируется цитостатиками (Фаллер Д.М., 2006; Alberts B., 2008). Повышенная экспрессия Вс1-2 наблюдается при некоторых видах лимфом (ДВККЛ, мантийноклеточная, фолликулярная) (Reed J.C., 2008; Abbott D.R., 2009), а также при нейробластомах (Wang D. et al., 2009) опухолях предстательной железы (DiPaola R.S., 1999; Lee E.C., 2004) и др. В исследованиях показано, что при гиперэкспрессии bcl-2 опухолевые клетки могут приобретать лекарственную устойчивость к различным химиотерапевтическим препаратам (Zhong C. et al., 2001; Monti E., 2006), что может рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак при ряде новообразований, но ингибирование функций этого гена повышает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, что делает ген bcl-2 28 мишенью для воздействия химиопрепаратов. Таким образом, получается, что как анти-, так и проапоптотические белки могут влиять на развитие лекарственной резистентности опухолевых клеток. Еще одним из основных механизмов МЛУ является снижение накопления лекарственных препаратов в опухолевых клетках, обусловленное активным выведением веществ в межклеточную среду (Baguley B.C., 2010). Такой транспорт осуществляется группой трансмембранных белков АВС-транспортеров, которые связывают АТФ и используют энергию ее гидролиза для переноса молекул через клеточные мембраны (Stavrovskaya A.A., 2008). Одним из таких белков плазматической мембраны является Р- гликопротеин (P-gp), кодируемый геном MDR1, принадлежащим к семейству генов MDR. Он локализован в 7 хромосоме, молекула этого белка состоит из 1280 аминокислотных остатков и имеет внутрии внеклеточный компонент, каждый из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков и два сайта связывания АТФ. Благодаря этому механизму P-gp обеспечивает выброс веществ за пределы клетки и соответственно ее выживание в присутствии токсичных для нее веществ, различных по структуре и биологическому действию (Komdeur R. et al., 2002). Семейство MDR включает два гена человека ( MDR1 и MDR2) и три гена грызунов ( mdr1 , mdr2 , mdr3), но лишь один ген человека (MDR1) и два гена грызунов имеют отношение к МЛУ. В норме в организме наблюдаются высокие уровни экспрессии мРНК и белка P-gp в печени, почках, надпочечниках, поджелудочной железе, тонком и толстом кишечнике, яичниках и яичках, эндотелии капилляров головного мозга (Staud F. et al., 2010). К развитию МЛУ может приводить как изменение экспрессии гена MDR1, так и увеличение дозы гена - амплификация участка генома, содержащего ген MDR1. Еще одной характеристикой MDR1- опосредованного механизма является наличие многообразия его субстратов, которые различаются по структуре и функции: от малых молекул (катионы и аминокислоты), до макромолекул (полисахариды, белки). МЛУ может развиваться в клетках различного тканевого происхождения и в 29 ответ на действие самых разных веществ: химиопрепараты, различные типы излучений (Пасюков В.В., 2007; Matsunaga S., 2006). В активации МЛУ участвуют многочисленные механизмы проведения внутриклеточных сигналов. Эта своего рода защитная система жизненно необходима для опухолевой клетки и поэтому ее регуляция неоднократно дублируется через разные механизмы и, соответственно, возможны обходные пути проведения этих сигналов, если тот или иной механизм не функционирует. Такая взаимозаменяемость механизмов надежно обеспечивает развитие МЛУ при воздействии различных веществ (Schinkel A.,1998; Schumacher M., 2004; Loo T., 2005). Поэтому применение высокодозных цитостатических режимов лечения для повышения его эффективности, может индуцировать развитие МЛУ в выживших клетках, а снижение доз (чтобы избежать развития МЛУ) – заведомо будет неэффективно (Marie J.P., 2001). В экспериментальном исследовании Шкляева О.А. (2009) изучала изменяющиеся свойства клеток перевиваемых опухолей и показала, что они касаются в большей мере механизмов формирования МЛУ. Был проведен поиск молекулярно-генетических различий между двумя субштаммами экспериментальной лимфосаркомы LS и RLS, которые характеризовались разной чувствительностью к апоптогенному действию циклофосфамида: LS была чувствительна к действию данного цитостатика, а опухоль RLS проявляла к нему устойчивость. Поиск различий проводили при помощи исследования профиля экспрессии генов (методом ОТ-ПЦР), которые вносят существенный вклад в формирование опухоли с фенотипом МЛУ - mdr1a, mdr1b, p53 и bcl-2. Было показано, что в клетках опухоли RLS по сравнению с LS экспрессия мРНК гена mdr1b была в 2,5 раза выше, bcl-2- в 6,7 раз выше, а экспрессия mdr1a и p53 была ниже в 4 и 2 раза, соответственно. Для дальнейшего «искусственного усиления» лекарственной устойчивости лимфосаркомы RLS клетки опухоли культивировали в присутствии повышающейся концентрации винбластина и в последствии так же исследовали профиль её экспрессии генов. Оказалось, что уровень экспрессии mdr1a и p53 вырос в 3 и 2 раза, соответственно, по сравнению с клетками линии RLS, экспрессия гена mdr1b повысилась в 4 раза, а уровень bcl-2 снизился в 10 30 раз, до его уровня в клетках линии LS. Таким образом, было показано наращивание клетками опухоли RLS уровня МЛУ, что может соответствовать статусу опухоли, наблюдаемой у пациентов после проведения нескольких курсов ПХТ. Из всего сказанного выше можно сделать вывод, что на сегодняшний день не представляется возможным однозначно предсказать: совокупность каких факторов определит развитие резистентности опухоли и неэффективность конкретного лечебного режима в отношении конкретной опухоли (Захаров О.Д. и др., 2006). Блокирование какого-либо одного механизма может оказаться заведомо недостаточным. Получается, что чем больше механизмов смерти удастся активировать в опухолевых клетках, тем вероятнее, что результат лечения будет положительным. А для этого необходимо определять особенности фенотипа множественной лекарственной устойчивости в каждой опухоли индивидуально. 1.2. Роль химиотерапии в лечении гемобластозов В настоящее гемобластозами время вообще полихимиотерапия и основным ДВККЛ (ПХТ) в методом частности, короткими лечения пациентов является интенсивными с программная курсами продолжительностью от 2 до 6 месяцев. Такой стратифицированный подход к терапии привел к интенсификации лечения и значительному росту выживаемости у этой группы больных. В ПХТ-схемах используют сочетания цитостатиков с антиметаболитами, противоопухолевыми антибиотиками, стероидными гормонами (Тюляндин С.А., 2003; Гершанович М.Л., 2004; Бобкова М.М., 2009; Gillian M., 2010). Данные группы препаратов имеют различные механизмы действия и токсический профиль, все это дает возможность суммировать различное терапевтическое воздействие на опухоль. Но существует серьезное препятствие, ограничивающее применение цитостатиков для улучшения результатов лечения – это их высокая токсичность, которая воздействует как на опухолевую ткань, так и на организм опухоленосителя. Все это необходимо 31 учитывать при проведении ПХТ, так как лечение гемобластозов требует проведения многократных курсов терапии цитостатиками. В качестве терапии первой линии при лечении НХЛ чаще всего используют схему СНОР, которая включает в себя циклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон (Foussard C. et al., 2005; Bosly A., et al., 2008). Циклофосфан – N-бис-(b -Хлорэтил)-N -О-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты, является алкилирующим цитостатическим препаратом с характерным химическим строением: его молекула имеет две фосфамидные связи и одну фосфорноэфирную связь. Циклофосфамид метаболизируется в основном в печени под действием микросомальной оксидазной системы, образуя алкилирующие метаболиты(4-ОН циклофосфамид и алкофосфамид), часть которых подвергается дальнейшей трансформации до неактивных метаболитов, часть транспортируется в клетки, где под влиянием фосфатаз превращается в метаболиты, обладающие цитотоксическим действием. Предполагается, что механизм действия включает образование поперечных сшивок между нитями ДНК и РНК, а также ингибирование синтеза белка, нарушаются матричные функцией молекул ДНК в процессах репликации и транскрипции, что приведет к митотическим блокам и гибели клеток, циклофосфан блокирует клетки в премитотической стадии. Активация препарата происходит при энзимном окислении в печени с участием микросомальных оксидаз и образованием активных метаболитов (акролеин, фосфорамид мустард), которые и обеспечивают цитотоксический эффект. Винкристин относится к группе винкаалкалоидов и содержится в растении барвинок розовый. Связываясь с белком-тубулином, приводит к нарушению микротубулярного аппарата клеток и к разрыву митотического веретена. Подавляет митоз в метафазе. Винкристин селективно блокирует репарационный механизм ДНК в опухолевых клетках, а также блокирует синтез РНК путем блокировки действия ДНК-зависимой синтетазы РНК. Доксорубицин – является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда, выделенным из культуры Streptomyces peucetius var. 32 caesius. Оказывает антимитотическое и антипролиферативное действие. Механизм действия заключается во взаимодействии с ДНК – подавляет процессы ее репарации, ингибировании топоизомеразы II, ДНК- и РНК- полимераз, образовании свободных радикалов и прямом воздействии на мембраны клеток, что приводит к подавлению репликации ДНК и синтеза нуклеиновых кислот, а также прямому цитотоксическому действию. Клетки чувствительны к препарату в S- и G2-фазах митотического цикла. Преднизолон – нестероидное противовоспалительное средство, дополняет схему ПХТ, применяется для снижения побочных эффектов химиопрепаратов. Как уже было сказано выше, схема СНОР является «золотым стандартом» при лечении НХЛ и главным достижением последнего времени явилась ее модификация при помощи добавления моноклональных анти-CD20 антител ритуксимаба (Miura K. et al., 2011), что позволило существенно улучшить результаты лечения больных с НХЛ. Но, несмотря на разработанные схемы иммунохимиотерпии имеется ряд факторов, которые ограничивают проведение высокодозной ПХТ – это выраженная токсичность препаратов с развитием висцеропатий, перекрестная устойчивость клеток опухоли к препаратам с разными механизмами действия, развитие резистентной опухолевой популяции и развитие множественной лекарственной устойчивости, недостаточная разработанность критериев выбора адекватной по объему терапии. Все это приводит к значительным трудностям при попытках выработки стандартных принципов лечения НХЛ и необходимости, наряду с использованием общих алгоритмов, вносить изменения в терапевтическую стратегию и индивидуализировать лечение в зависимости от молекулярно-биологических особенностей конкретной опухоли. 1.2.1. Токсическое поражение ткани печени при цитостатической терапии В настоящее время существенным недостатком противоопухолевых препаратов является их токсическое воздействие на органы и ткани, и зачастую, 33 побочные эффекты являются фактором, ограничивающим их применение у онкологических пациентов. Введение цитостатиков осуществляется на изначально неблагоприятном фоне течения онкологического процесса: известно, что рост опухоли сопровождается нарушениями всех видов обмена в организме и повышением уровня токсических метаболитов в крови, а введение цитостатиков ещё усугубляет интоксикацию, развивается так называемый «синдром эндогенной интоксикации» (Лосева М.И. и др., 2005). Клинически уделяют наибольшее значение развитию осложнений в костном мозге, миокарде и печени, так как именно структурно-функциональные нарушения в этих органах нередко являются причиной развития осложнений лечения и летального исхода у пациентов в период проведения многокурсовой ПХТ. Все цитостатические препараты подвергаются биотрансформации в печени с помощью системы микросомальных оксигеназ и в результате образуются токсические метаболиты, которые и вызывают повреждение гепатоцитов и развитие гепатотоксичности (Казюлин А.Н., 2012; Donepudi I., 2012; Amacher D.E., 2013). Гепатотоксичность – это свойство химических веществ, действуя на организм немеханическим путем, вызывать структурно-функциональные нарушения печени (Куценко С.А., 2004). При лечении противоопухолевыми препаратами гепатотоксичность определяется у всех пациентов без исключения. Поражение печени можно свести к нескольким основным патофизиологическим механизмам: повреждение гепатоцитов лекарственными препаратами, которые связываясь с внутриклеточными белками приводят к снижению количества АТФ и как следствие, происходит нарушение энергетического обмена в гепатоците. Активация цитотоксических Т-лимфоцитов, в результате, продукты связывания лекарственных препаратов с цитохромом Р450 действуют как иммуногены, тем самым стимулируя иммунный ответ. Следующий механизм – повреждение транспортных белков цитоплазматической мембраны гепатоцита, что нарушает экскрецию билирубина и развивается холестаз. Так же имеет значение 34 повреждение митохондрий гепатоцитов, за счёт активации перекисного окисления липидов. И апоптоз гепатоцитов – в результате действия ФНОкоторый выделяется при повреждении тканей и активирует Fas-рецептор который запускает активацию внутриклеточных каспаз, вызывающих апоптоз (Paul D., 2001). Все лекарственно-индуцированные поражения печени можно разделить на острые, подострые и хронические. К острым относят дистрофию и некроз гепатоцитов, к подострым – подострый некроз печени и синдром Бадда-Киари. К хроническим поражениям – хронический холестаз, хронический гепатит, жировой гепатоз, стеатогепатит, фиброз и цирроз печени (Серов В.В., 1989; Kaplowitz N., 1996). Основными морфологическими проявлениями острых поражений ткани печени при терапии цитостатиками являются белковая (баллонная и гидропическая) и жировая дистрофии гепатоцитов, а так же центролобулярные некрозы паренхимы печени. Часто такие структурные нарушения встречаются одновременно. Поражение именно центролобулярных отделов дольки печени связано с наибольшим содержанием в них структур системы микросомального окисления, где и происходит биотрансформация лекарственных препаратов (Буеверов А.О., 2001; Молодых О.П., 2007; Frank N. A., 2007) При проведении эксперимента на животных, не имевших опухоли, Гольдберг Е.Д. с соавторами (1998) установили, что для развития острых токсических повреждений достаточно даже однократного введения цитостатиков (вводили фарморубицин либо платидиам): на 2-е сутки регистрировали возникновение мелкокапельной жировой дистрофии и моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов, которые к 10-м суткам нарастали в 35 раз после введения фарморубицина и в 24 раза – после введения платидиама. Далее в эксперименте было отмечено, что морфологические проявления острого токсического гепатита сохранялись до 90-го дня после введения платидиама, до 180 дней при введении фарморубицина, что говорит о длительности периода восстановления клеток печени в этих условиях. 35 Описания развития подострых изменений в печени при проведении цитостатической терапии в литературе не было встречено. Однако, эти изменения описаны при применении анаболических стероидов, цинкофена, изониазида и др. (Leitner J. M., 2010; Mengoli M. et al, 2011). К хроническим поражениям печени при применении противоопухолевой терапии, как уже было сказано выше, относят хронический гепатит, жировой гепатоз, стеатогепатит, патологические фиброз процессы и цирроз развиваются печени. при Наиболее длительном часто эти применении цитостатиков. Хронический лекарственный гепатит характеризуется появлением жировой дистрофии, некрозами единичных гепатоцитов, умеренной лимфомакрофагальной инфильтрацией портальных трактов с их фиброзированием. Жировой стеатоз характеризуется появлением жировой дистрофии в гепатоцитах. Прогрессирование данных патологических изменений приводит к нарастанию фиброза в печени, который, в свою очередь, может закончиться формированием цирроза (Серов В.В., 1989; Wang C., 2005; Wieskowska A., 2007). В исследовании Агеевой Т.А. (2002) в эксперименте на мышах, которым перевивали лимфосаркому LS и далее проводили двукратное введение комплекса цитостатиков по схеме СНОР, на светооптическом и электронномикроскопических уровнях было показано, что метастазирование опухолевых клеток в печень сопровождалось деструктивными нарушениями её паренхимы, а на фоне введения цитостатиков масштабы структурных изменений существенно возрастали: увеличение доли альтеративных изменений (суммарно некроза и дистрофий) произошло как за счет прироста на 25% объема дистрофий, так и за счет увеличения в 1,9 раза объема некрозов. В литературе представлены в основном исследования с однократным введением цитостатиков, а ситуация в клинике требует многократного проведения курсов ПХТ, но таких работ встречается крайне мало. Кроме того, представлены исследования токсических свойств цитостатиков в основном на безопухолевых животных. Всё это обуславливает необходимость более пристального изучения патоморфологических изменений в ткани печени при многократном введении 36 комплекса химиопрепаратов в условиях опухолевого процесса. 1.3. Цитохром Р450 и его роль в биотрансформации ксенобиотиков Цитохром Р450 (CYP, цитохром P450-зависимая монооксигеназа) – общее название ферментов семейства P450. Цитохром P450, связанный с монооксидом углерода, имеет максимум поглощения света при длине волны 450 нм, что определило его название. Относится к классу гемопротеинов, семейству изоферментов, зачастую обладают малой субстратной специфичностью. P450 могут проявлять как монооксигеназную, так и оксигеназную активность, поэтому иногда относятся к оксидазам со смешанной функцией (Danielson P.B., 2002). Оксигеназные реакции, катализируемые цитохромом Р450, весьма разнообразны. Одна из самых распространённых реакций окисления ксенобиотиков – это окислительное деалкилирование, другой распространённый тип реакций – гидроксилирование циклических соединений (ароматических, предельных и гетероциклических углеводородов). Цитохром P450 способен окислять химические соединения, как попадающие в организм извне (лекарственные вещества, яды, токсины, пищевые добавки, атмосферные загрязнения), так и образующиеся в клетке (холестерин, билирубин, тироксин, жирные кислоты, простагландины, стероидные гормоны). Он является ключевым звеном в процессах детоксикации и выведения из организма вредных веществ, универсальным биологическим катализатором. Образованные в процессе окисления соединения становятся более гидрофильны, чем исходные, что облегчает их последующий метаболизм и удаление экскреторными органами. Удаление из организма этих веществ возможно благодаря наличию множественных изоформ цитохрома Р450. В результате работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей генома были идентифицированы 48 форм цитохрома Р450 (Lee S., 2010). Но, несмотря на разнообразие цитохромов в организме человека, метаболизм лекарственных средств происходит с участием преимущественно ограниченного их количества и 37 наиболее распространенными представителями являются: CYP 1А2, CYP 2С9, CYP 2С19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP 3A4 (Montellano O., 2005). Максимальная концентрация цитохрома Р450 обнаруживается в печени, так же он определяется в других органах: надпочечники, тонкий кишечник, головной мозг (Пономаренко Т.М. и др., 2012; Dutheil F.et al., 2008). Процессы биотрансформации ксенобиотиков с помощью цитохромов включают ряд последовательных стадий, первая стадия - окислительного метаболизма, которая определяет пути биотрансформации ксенобиотиков в организме. Второй стадией биотрансформации ксенобиотиков являются реакции конъюгации, в ходе которых происходит связывание продуктов предыдущей реакции с эндогенными конъюгирующими агентами, что приводит к изменению их физико-химических свойств и ограничивающее дальнейшие превращения продуктов метаболизма в организме, полученные конъюгаты быстро экскретируются. Однако, выполняя эти важные для организма функции, цитохром Р450 может самоинактивироваться – защищая организм от вредных соединений, он погибает сам. Несмотря на то, что цитохром определяется в различных органах, биотрансформация большинства ксенобиотиков осуществляется в печени – основная метаболизирующая система расположена в микросомальном аппарате гепатоцитов (в гладкой эндоплазматической сети) на билиарном полюсе гепатоцита. Как уже было сказано выше, в первую фазу лекарства подвергаются гидроксилированию или окислению, которые обеспечивают усиление их поляризации, а далее во вторую фазу происходит биотрансформация, которой подвергаются лекарства или их метаболиты, которая состоит в их конъюгации с мелкими эндогенными молекулами. Таким образом, цитохром Р450 играет основную роль в процессах биологической трансформации ксенобиотиков и, соответственно, в эру развития и внедрения персонализированной медицины, прогноз эффективности действия лекарственных препаратов и скорость их метаболизма у каждого отдельного пациента, не может быть оценен без определения генетических и молекулярных особенностей уровней цитохрома Р450 в организме пациента. При этом остаются 38 не в полной мере освещенными аспекты динамики морфологических реакций в гепатоцитах в соотношении с динамикой активности цитохрома P450. 1.4. Подходы к индивидуализации лечения пациентов со злокачественными новообразованиями При правильном подходе к лечению онкологических заболеваний должны быть соблюдены два основных принципа: комплексный подход к лечению и индивидуальный подход к каждому пациенту и его заболеванию. Персонализированная медицина достаточно новое направление и этот термин появился впервые в монографии Jain K.K. (1998), в которой говорится об использовании направленных на конкретного пациента методов лечебнодиагностического воздействия. Концепция целевой диагностики и лечения больного в соответствии с результатами исследования его генетического профиля была развита Jain K.K. далее в серии работ (2000, 2002; 2003, 2009). Соответственно, целью персонализированной медицины злокачественных опухолей является понимание специфических молекулярных характеристик онкологического процесса каждого пациента индивидуально, но до сих пор стандартные схемы клинических исследований основаны на тестировании лекарственного препарата на разнородной группе пациентов, тогда как персонализированная медицина подразумевает назначение «конкретного лекарства - конкретному больному». Основы персонализированной медицины включают несколько подходов, в том числе определение генотипа по единичным заменам нуклеотидов в геноме, исследование экспрессии генов с помощью биологических микрочипов, а также протеиномику. Важную роль в персонализированной медицине, развивающейся на основе интеграции диагностики и лечения, играет молекулярная диагностика (Ginsburg G. S., 2001; Vizirianakis I.S., 2002; Jain K.K. 2009). Индивидуализация лечения подразумевает на основе определения генотипа пациента идентификацию предрасположенности к той или иной болезни, профилактические меры, выбор фармакотерапии и индивидуальный подбор схем 39 лечения, в том числе и исходя из индивидуальных особенностей метаболизма. Главным преимуществом персонализированной медицины является эффективное и специфическое для пациента терапевтическое воздействие на заболевание, которое снизит риск побочных воздействий лекарственных препаратов вследствие применения неэффективных лекарств, возможность профилактировать заболевание, зная о генетических особенностях (Moch H. et al., 2012). Хотя разные виды злокачественных опухолей могут иметь одинаковые механизмы возникновения, в том числе включающие мутации в генах, участвующих в трансформации клеток (например р53, ras, bcl-2 и др.), они могут сопровождаться дополнительными случайными мутациями в самых разных генах. Эти мутации ведут к экспрессии антигенов, формируя особенный "молекулярный отпечаток", который является уникальной характеристикой опухоли конкретного больного. Поскольку мутации возникают случайно, "антигенный портрет" опухоли одного больного никогда не будет повторяться опухолью любого другого пациента (Jain K.K., 2002). Принципы индивидуализации лечения онкобольных ранее других были продемонстрированы на примере рака молочной железы, который сегодня рассматривают не как одну болезнь, а как целую группу заболеваний, каждое из которых имеет собственные молекулярные особенности и течение. В настоящее время определяют молекулярные характеристики опухолевых клеток каждой женщины, оценивая экспрессию ими ER- и PR-рецепторов, активность пролиферации по Ki67 и наличие гиперэкспрессии мембранного рецептора HER2neu, отражающего амплификацию гена cerbB2. Полученные молекулярные характеристики становятся основой для прогнозирования течения заболевания и выбора дальнейшего лечения после хирургического удаления опухоли (Slamon D. 1987; Aas T. et al., 2003; Penault-Llorca F., 2003). Лечение гемобластозов предполагает повторяющиеся курсы ПХТ, в результате чего на фоне гибели опухолевых клеток будут идти одновременно два параллельных процесса: 1) выжившие клетки будут формировать вторичные мутации и 2) будет увеличиваться доля лекарственно устойчивых клеток. Это 40 обстоятельство делает актуальным не только оценивать первичный «антигенный портрет» опухоли, но и оценивать и прогнозировать его изменения в ходе дальнейшего течения гемобластозов, характеризующихся неоднократными рецидивами. Таким образом, быстрое и перспективное развитие достаточно молодого направления – персонализированной медицины, в последнее десятилетие диктует необходимость дальнейших исследований механизмов развития и прогрессии злокачественных опухолей, их молекулярно-генетических особенностей, а так же усовершенствование и разработку в соответствии с этим новых фармакологических препаратов и схем лечения с учетом закономерностей метаболизма химиотерапевтических веществ. Все эти позиции являются актуальными для всех злокачественных опухолевых процессов, но имеют первоочередную важность в лечении гемобластозов. 41 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2.1. Экспериментальная часть работы Экспериментальная часть работы была проведена с целью изучения опухолевой прогрессии и ее особенностей в опухоли RLS, проявляющей изначально резистентный фенотип и возможность проведения многократных курсов введения комплекса цитостатиков. 2.1.1. Лабораторные животные и используемые опухолевые модели В данной работе были использованы 14-16-недельные мыши-самцы линии CBA/LacSto (далее в тексте СВА) выведенные в виварии Института цитологии и генетики СО РАН (ИЦГ СО РАН). Животных содержали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в соответствии с правилами принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург,1986). Животных содержали при температуре окружающей среды равной 20-22оС, влажности не более 50%, объеме воздухообмена (вытяжкаприток) 8:10, в освещенном помещении при обычном световом режиме (деньночь), в стандартных пластиковых боксах с подстилкой из мелких древесных опилок по 6-11 особей в боксе. Животные получали стандартный пищевой рацион и имели свободный доступ к воде и пище. В эксперименте использовали перевиваемую резистентную лимфосаркому RLS, полученную из исходной линии опухоли LS, штамм данной опухоли постоянно поддерживается в виварии ИЦГ СО РАН путем животных. пассирования на 42 2.1.2. Описание исходного штамма лимфосаркомы LS С целью изучения феномена множественной лекарственной устойчивости в лаборатории нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН совместно с сотрудниками лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦГ СО РАН была разработана модель опухоли, показывающая фенотип множественной лекарственной устойчивости лимфосаркома RLS. Данный субштамм RLS был получен из опухоли LS, а опухоль LS в свою очередь была получена у мышей линии СВА путем однократной инъекции нитрозометилмочевины и проявляла высокую чувствительность к действию циклофосфана, который является основным компонентом многих схем ПХТ и эффект которого опосредуется запуском в опухолевых клетках апоптоза, путем многократного перевивания рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана при постепенном их повышении (от 10 до 200 мг/кг) и характеризовался пониженной чувствительностью к действию циклофосфана (Каледин В.И. и др., 2006). Известно, что генотипически профиль данных опухолей (LS и RLS) отличался: так опухоль LS характеризовалась высоким уровнем генов mdr1a и p53, тогда как в опухоли RLS повышался уровень экспрессии генов mdr1b и bcl-2, а уровень mdr1a и p53 был снижен, то есть в случае опухоли RLS фенотип МЛУ поддерживается за счет блокирования основных путей апоптоза в результате гиперэкспрессии гена bcl-2 и гиперэкспрессии гена множественной лекарственной устойчивости mdr1b. 2.2. Эксперимент №1 В первом этапе эксперимента целью было изучить выживаемость животных с перевитой опухолью RLS, без воздействия ПХТ, причем разным группам животных перевивали различное количество опухолевых клеток, полученных предварительно из асцитической жидкости. Асцитическая жидкость: опухолевые клетки RLS в концентрации 5 × 104 клеток/мл в 0,3 мл физиологического раствора были пересажены внутрибрюшинно экспериментальным животным. На десятый день развития опухоли физиологический раствор (0,5мл) был введен 43 внутрибрюшинно животным и собран вместе с асцитом (0,5-0,8 мл) с помощью шприца. Далее полученную асцитную жидкость разбавляли до 5 мл PBS-буфером (фосфатный солевой буфер) и центрифугировали с 3 мл среды Lymphocyte Separation Medium (LSM) при 1500 об/мин в течение 15 минут, фракцию мононуклеарных клеток, находящуюся на границе раздела LSM и супернатанта, переносили в чистую пробирку с 5-7 мл фосфатного буфера PBS, суспендировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Получившийся клеточный осадок подсчитывали с помощью камеры Горяева и перевивали нужное количество экспериментальным животным. Животные были поделены на четыре группы, по 5 мышей в каждой. Далее им была перевита внутримышечно мышиная лимфосаркома RLS В первой группе животных перевили суспензию клеток опухоли RLS в физиологическом растворе 100 тыс. кл/мл, объемом 0,1 мл, во второй группе была перевита опухоль в объеме 80 тыс. кл/мл, третей группе по 50 тыс. кл/мл, а четвертой по 20 тыс кл/мл, во всех группах опухоль трансплантировали внутримышечно в правое бедро для формирования и роста солидной опухоли. Для оценки динамики роста опухолевого узла через день измеряли пораженную лапу штангенциркулем. Объем опухоли определяли перемножением трех взаимно перпендикулярных размеров опухоли (см3). В результате на 7 сутки был отмечен рост опухоли у животных из первой группы, а к 9-ым суткам, был отмечен рост опухоли во всех группах. У животных с перевитой опухолью в количестве 100 тыс клеток средняя продолжительность жизни составила 26,8 сут, 80 тыс клеток - 25,5 сут, в группе с перевитой опухолью в количестве 50 тысяч опухолевых клеток – 28,8 сут, а в группе 20 тысяч клеток – 32,4 сут. Падеж животных в группе 100 тыс начинался с 23 сут (роста опухоли), максимально жили животные до 28 суток. В группе 80 тыс клеток падеж с 23 суток, максимальная продолжительность жизни составила до 31-их суток, в группе 50 тыс клеток падеж начиная с 24 суток , максимальная продолжительность жизни достигала 34-х суток, а в группе 20 тыс клеток гибель животных начиная с 31-ых суток, максимальная продолжительность жизни до 34 суток. Оказалось что перевитая опухоль в количестве 20 тыс кл/мл растет 44 медленнее, чем если перевивать 100 тыс кл/мл. В данном эксперименте мы смогли добиться продолжительности жизни животных до 34 суток. Продолжительность эксперимента соответственно составила 34 дня. 2.3. Эксперимент №2 Целью второго этапа явилось проведение животным с перевитой опухолью RLS многократных курсов химиотерапии, что бы изучить влияние многокурсовой ПХТ на опухоль и на организм животного. Мышей делили на две группы, в первой группе 80 животных, во второй 20. Животным в первой и во второй группе внутримышечно в правую заднюю лапу (бедренную часть) трансплантировали суспензию клеток опухоли RLS в физиологическом растворе (2х105 кл/мл), объемом 0,1 мл для роста и формирования солидной опухоли. На 7-ые сутки роста опухоли первой группе животных вводили комбинацию цитостатиков, аналогичную схеме CHOP для лечения гемобластозов, второй группе лекарственные препараты не вводили (контроль). Препараты вводили в дозировках, соответствующих 1/5 ЛД50: циклофосфан – 50 мг/кг массы тела, доксорубицин – 4мг/кг и винкристин – 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену, преднизолон – 5 мг/кг - в/б. На 7-ые сутки после проведения первого курса ПХТ (что составляет 14-е сутки роста опухоли) часть животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Далее животное препарировали, отделяли верхний пласт опухолевой ткани и помещали его в физиологический раствор для приготовления первичной культуры. Оставшимся животным из первой группы проводили второй курс химиотерапии на 7-е сутки после его проведения (21-е сутки роста опухоли), часть животных выводили из эксперимента для последующего приготовления первичной культуры, оставшимся животным по той же схеме через каждые 7 суток проводили последовательно третий и четвертый курсы ПХТ. Забор материала для гистологического исследования проводили на 1-е, 3-и, 7-е сутки после каждого курса ПХТ, после проведения 4-ого курса ПХТ забор материала производили только на 1-е сутки. Забор материала для проведения молекулярно- 45 биологического исследования производили на 7-е сутки после проведения очередного курса ПХТ, после проведения 4-ого курса химиотерапии материал забран на 1-ые сутки. Во второй экспериментальной группе наблюдали развитие и прогрессирование опухолевого процесса без лечения, таким образом, используя эту группу в качестве контроля эффективности ПХТ, забор материала для морфологического и молекулярно-биологического исследования проводили на тех же сроках, что и в первой группе. В результате продолжительность эксперимента составила 30 суток, в данной работе нам удалось провести максимально 4-е курса ПХТ, из-за гибели животных с перевитой опухолью RLS в результате ее быстрого роста и метастазирования. Все экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с Методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987) и с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001). Протокол экспериментов был согласован с Локальным независимым этическим комитетом по экспертизе диссертационных исследований. 2.4. Клинический материал исследования Лимфатические узлы с опухолевым ростом НХЛ выбрали из архивного материала от пациентов Городского гематологического центра МБУЗ НСО ГКБ №2 г. Новосибирска (гл. врач Шпагина Л.А.). В исследование были отобраны гистологические блоки лимфатических узлов случаев неспецифицированного варианта нодальной диффузной Вкрупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) (WHO classification lymphoid tumor, 2008), относящейся к НХЛ с агрессивным характером течения. Были сформированы 2 группы пациентов: 1 группа - операционнобиопсийный материал лимфатических узлов 30 пациентов с первично выявленной ДВККЛ (средний возраст пациентов составил 52,3±3,7) и 2 группа - 46 гистологические материалы лимфатических узлов с рецидивом ДВККЛ - по аутопсийному материалу от 20 пациентов с ДВККЛ, перенесших от 16 до 24 курсов ПХТ суммарно и умерших в стационаре при очередном рецидиве данного заболевания (средний возраст пациентов 57,1±2,9). 2.5. Материалы, использованные в работе 2.5.1. Оборудование В работе для приготовления гистологических препаратов использовали аппарат для проводки TP 1020 («Leica», Германия), заливочную станцию EG 1160 («Leica», Германия), ротационный микротом RM 2235(«Leica», Германия), аппарат окрашивания микропрепаратов Auto Stainer XL («Leica», Германия). Для иммуногистохимического окрашивания использовали PT Link модуль (Dako, Дания). Изучали гистологические срезы в световом микроскопе Axiostar plus («Zeiss», Германия) и Leica DM 2500, оснащенного камерой («Leica» DFC 295, Германия). Для проведения молекулярно-биологических исследований в работе использовали многоканальный спектрофотометр Multiscan RC («Labsystems», Финляндия), амплификатор PCRExpress («Hybaid», США), спектрофотометр BioMate 3 («Thermo», США), культуральный пластик («Costar» CША), центрифугу «MiniSpin Plus Eppendorf» («Eppendorf», Германия). Обрабатывали полученные в эксперименте данные с помощью следующего специального программного обеспечения: Statistica MS Excel, OriginPro 7.5, VideoTesT Morphology 5, Gel-Pro Analyzer 4.0. 2.5.2. Препараты и реактивы В работе были использованы: TEMED, EDTA, DEPC, DTT, акриламид, N,Nметиленбисакриламид, бромфеноловый синий, фикол, ксиленцианол, среда IMDM, раствор трипанового синего, PSA, агарозу, LSM, PBS, бромистый этидий («Fluka», Швейцария), доксорубицин (флакон 10 мг, «ЛЭНС», Россия), винкристин (флакон 0,5 мг 2мл, «ЛЭНС», Россия), циклофосфан (флакон 200 мг, 47 «ЛЭНС» Россия), преднизолон (флакон 25 мг/мл, «Никомед», Россия), 0,9% физиологический раствор. Для проведения гистологического и иммуногистохимического исследований использовали: 10% раствор нейтрального формалина, эозин, гематоксилин, антитела к Ki-67 (клон SP6), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience» USA; Ki-67 (клон MIB1), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; антитела к BCL-2 (клон SP66), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; BCL-2 (клон 124), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; Cytochrome P450 (2D6), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия; Caspase 3 (клон ab4051), rabbit polyclonal, «Thermo Scientific», USA; р53 (клон SP5), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; р53 (клон DO-7), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Все антитела разводились согласно указаниям фирмы-производителя. Полимерная система детекции EnVisionTM FLEX Systems («DAKO», Дания). Использованные в работе ферменты ДНКполимераза Taq и ревертаза M-MLV – произведены биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. в лаборатории 48 2.5.3.Олигонуклеотиды, использованные в работе Использованные синтезированы в в работе технологической олигодезоксирибонуклеотиды лаборатории ИХБФМ СО были РАН по стандартному фосфитамидному методу и выделены с помощью обращенофазовой ВЭЖХ. При проведении реакции обратной транскрипции использованы рандомизированные гексапраймеры. были Последовательности специфических праймеров к генам p53, mdr1a, mdr1b, bcl-2 и β-актину для проведения ПЦР выбирались с использованием программы OLIGOS ( таблица 1). Таблица 1 Последовательность праймеров для проведения ОТ-ПЦР Название Последовательность 5,____ 3, гена Положение в Длина кДНК ПЦРпродукта mdr1a-F GCAGGTTGGCTAGACAGGTTGT mdr1a-R GAGCGCCACTCCATGGATAA mdr1b-F CTGCTGTTGGCGTATTTGGG mdr1b-R TGGCAGAATACTGGCTTCTGCT p53-F GAACCGCCGACCTATCCTTAC p53-R GTTTGGGCTTTCCTCCTTGAT bcl-2-F TCGCAGAGATGTCCAGTCAGC bcl-2-R CATCCCAGCCTCCGTTATCC β-актин-F AGCCATGTACGTAGCCATCCA β-актин-R TCTCCGGAGTCCATCACAATG 259-328 69 п.н. 201-370 170 п.н. 840-1251 412 п.н. 1523-1777 255 п.н. 469-550 81 п.н. Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью электрофореза в 15%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотидов в геле осуществляли с помощью окраски «Stain-All». 49 2.5.4. Буферы и растворы В работе были использованы следующие буферы и растворы: ТВЕ (0,089 М Трис-борат, pH 8,3; 2 мМ Na2EDTA). ТЕ-буфер (10мМ Трис-HCl, pH 8,0; 1мМ EDTA). PBS ( 2,7 мМ Na2HPO4, pH 7,4; 140 мМ NaCl). ОТ-буфер (50 мМ Трис-Hcl, pH 8,3; 75 мМ KCl; 3 мМ MgCl2). ПЦР-буфер (10 мМ Трис-Hcl, pH 8,3; 50 мМ KCl; 0,5 мМ MgCl2). Раствор бромистого этидия (0,002%-ый бромистый этидий в воде). Раствор F (15%-ый Ficoll-400 в воде; 0,025%-ый бромфеноловый синий; 0,025%-ый ксиленцианол). Раствор G глицерин; (50%-ый 0,05%-ый бромфеноловый синий; 0,05%-ый ксиленцианол). Для приготовления всех буферов, растворов, реакционных смесей использовали очищенную на установке MilliQ («MilliPore», CША) воду. Все буферы были подвергнуты стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр 0,22 мкм («MilliPore», CША). 2.6. Использованные в работе методы 2.6.1.Получение первичной культуры клеток из опухолевого узла. Для получения первичной культуры клеток, на определенных сроках роста перевитой в мышцы правого бедра опухоли, животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Мышей препарировали, отделяли пласт опухолевой ткани, затем его помещали в стерильный физиологический раствор (10мл) и хранили в емкости со льдом. Далее ткань опухоли подвергали гомогенизации и двукратной фильтрации, что бы приготовить суспензию опухолевых клеток. Полученную суспензию из клеток опухоли наслаивали на 3 мл среды LSM, далее ее центрифугировали в течение 15 минут при скорости 1500 об/мин. Фракцию клеток, которая находилась на границе раздела cупернатанта и LSM переносили в чистую пробирку с 5 мл фосфатного буфера PBS, суспендировали, центрифугировали 5 минут при скорости 1000 об/мин. Полученный клеточный осадок помещали в питательную 50 среду IMDM, которая содержит 1%-ый раствор антибиотика и антимикотика, 10%-ую бычью сыворотку. Далее клетки культивировали при температуре 37оС в атмосфере 5%-ого СО2, растущую культуру клеток для поддержания экспоненциального роста пересевали каждые 3 дня. 2.6.2. Выделение суммарной клеточной РНК Суммарная клеточная РНК была выделена из культивируемых опухолевых клеток с помощью SDS/фенольной экстракции согласно методике, описанной в литературе (Chattopadhyay N. et al., 1993). Для предотвращения развития деградации РНК все манипуляции проводили во льду. Клетки в количестве 5х106 осаждали с помощью центрифугирования на скорости 2000 об/мин в течении 5 минут. Полученный супернатант убирали, к клеточному осадку добавляли 100 мкл ТЕ-буфера и раствор SDS до конечной концентрации 0,5%. Затем в эту смесь добавляли 2 объема фенола, уравновешенного водой, и ацетата натрия (рН 4,5) до конечной концентрации 0,3 М. Полученную водную фазу отделяли от органической с помощъю центрифугирования на скорости 10000 об/мин, 10 минут и остатки белков экстрагировали последовательно равным объемом смеси фенол/ хлороформ (v/v; 1/1) и хлороформа. Далее осаждали РНК из водной фазы 3-мя объемами 96%-ого этанола в течение 20 часов при -20оС., а затем осадок РНК отделяли центрифугированием (13000 об/мин, 4оС, 15 минут), промывали 80%-ым этанолом, высушивали и растворяли в Н2О milliQ и хранили при -20оС. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм. Сохранность полученной РНК проверяли при помощи проведения электрофореза в 1%-ом агарозном геле в буфере ТВЕ при напряжении электрического поля 20 В/см. К пробам добавляли одну пятую от объема пробы раствора G непосредственно перед нанесением на гель. Затем гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали при визуализации в УФ свете. 51 2.6.3. Обратная транскрипция С помощью метода обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) проводили определение уровней мРНК генов mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53, β-актина в клетках первичной культуры опухоли RLS в группах без лечения и после проведения нескольких курсов ПХТ. Для синтеза кДНК использовали полученную суммарную РНК клеток опухоли RLS. кДНК получали с помощью реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей ОТ-буфер, 2 мкг суммарной клеточной РНК, 0,01 М DTT, 12 пмолей гексануклеотидного праймера, 0,5 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 20 ед. обратной транскриптазы М-MLV. Реакцию синтеза кДНК проводили в течение часа при температуре 37оС, полученные при этом образцы были использованы для проведения ПЦР, либо их хранили при температуре -20оС. 2.6.4. Проведение ПЦР Последовательности олигонуклеотидов которые использовались как праймеры для проведения ПЦР приведены в таблице 1. ПЦР проводилась в реакционной смеси объемом 20 мкл, которая содержала 1 мкл кДНК, 2 ед. Taqполимеразы, 6 пмолей специфических праймеров, 0,05 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов для генов mdr1b, bcl-2, p53 и 0,2 мМ для гена mdr1a. Что бы получить специфические продукты данных генов использовали для гена mdr1b- 24 цикла амплификации, для mdr1a- 26 циклов, для генов р53 и bcl-231 цикл амплификации. Праймеры β-актина были добавлены в реакционную смесь для генов р53 и bcl-2 после шестого цикла, а для mdr1a после третьего и для mdr1b после первого цикла. Амплификацию проводили по следующей схеме: 1цикл, денатурация – 95оС в течение 5 минут; плавление праймеров – 57оС, 1 минута; элонгация – 72 оС, 1 минута. Последующие циклы амплификации проводили при следующих условиях: 94 оС, 1минута; 57 оС, 1 минута; 72 оС, 1минута. 52 Отсутствие загрязнений при проведении ПЦР контролировали с помощью замены одной кДНК пробы на чистую дистиллированную воду. Далее полученные продукты ПЦР разделяли с помощью электофореза в 8%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях при соотношении акриламид/N,N-метиленбисакриламид = 20/1 в буфере ТВЕ при напряженности электрического поля 30-45 В/см. Перед тем как нанести пробы на гель к ним добавляли одну пятую от объема самой пробы раствора F. Полученное положение продуктов в геле определяли путем окрашивания их раствором бромистого этидия при визуализации в УФ свете. Далее полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (программа Gel-Pro Analyzer 4.0). Что бы определить уровни экспрессии мРНК интегральную оптическую плотность полос, соответствующих ген-специфическим ПЦРпродуктам, нормализовали на оптическую плотность продукта β-актина. 2.6.5. Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли Динамику роста перевитой опухоли оценивали, проводя ежедневные замеры пораженной конечности при помощи штангенциркуля. Затем полученные три взаимно перпендикулярные размера перемножали и получали объем опухоли. Регулярно проводили взвешивание животных, чтобы оценить токсическое действие опухоли и химиотерапии на организм животных. 53 2.6.6. Морфологические методы, используемые в работе Гистологическое исследование: Для проведения гистологического исследования архивный материал лимфатических узлов пациентов с опухолью перезаливали в парафин Leica, пропитывали в парафине в течение 1 часа при 56оС, формировали новые блоки, из которых на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной до 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Дополнительно на предметные стекла, покрытые адгезивом, помещали срезы для дальнейшего иммуногистохимического исследования. Ткань опухоли и органы экспериментальных животных фиксировали в 10% забуференном формалине (Biovitrum, Россия) в течение 3-6 дней, далее для гистологической проводки вырезали фрагменты опухоли и органов толщиной 3-5 мм. Затем производили обезвоживание материала в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, заключали в парафин. Далее на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной около 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Иммуноморфологическое исследование: Процедуру иммуногистохимического исследования, адаптированную для данной лаборатории, выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах по иммуногистохимическим исследованиям (Buchwalow I., 2010; Dabbs J., 2010; Петров С.В., 2012), рекомендациями фирм-производителей антител. Перед проведением иммуногистохимического исследования приготовленные срезы депарафинизировали и производили демаскировку антигенов тканей в PT Link модуле (Dako, Дания) в цитратном буфере (pH 9,0) при температуре 95 в течение 60 мин. Затем блокировали эндогенную пероксидазу 3%-м раствором Н2О2, проводили протеиновый блок сывороткой. Далее инкубировали полученные срезы опухоли RLS мышей с антителами к Ki-67 (клон SP6), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; антитела к BCL-2 (клон 54 SP66), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; Cytochrome P450 (2D6), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия; Caspase 3 (клон ab4051), rabbit polyclonal, «Thermo Scientific», USA; р53 (клон SP5), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; Pglycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Для окрашивания лимфатических узлов пациентов с ДВККЛ использовали антитела: Ki-67 (клон MIB1) mouse monoclonal, «DAKO» Дания; BCL-2 (клон 124), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; р53 (клон DO-7), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Все антитела разводили и инкубировали по времени согласно указаниям фирм-производителей. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой. Последним этапом докрашивали ядра клеток гематоксилином. Оценка полученного иммуногистохимического исследования проводилась полуколичественным методом. При исследовании препаратов окрашенных антителами рассчитывали индекс мечения (ИМ) – отношение числа позитивно окрашенных клеточных структур на 100 опухолевых клеток. Для белков Ki-67, p53 – ИМ рассчитывали по позитивно окрашенным ядрам, для белков bcl-2, CYP P450 – по позитивно окрашенной цитоплазме, caspase 3 давала позитивное ядерно-цитоплазматическое окрашивание, P-гликопротеин – позитивное мембранно-цитоплазматическое окрашивание. Морфометрическое исследование проводили, используя основные принципы стереологии и морфометрии (Автандилов Г.Г., 1990). На световом уровне необходимые стереометрические параметры тканей считали при увеличении микроскопа 100, 400, 1000 раз с использованием закрытой тестовой системы из 100 точек, сетку накладывали случайным образом и подсчитывали по 60-100 полей зрения. При морфометрическом исследовании ткани опухоли подсчитывали численную плотность митозов, апоптозов, (Nai), объемную плотность некрозов (Vv). В ткани печени подсчитывали численную плотность (Nai) дистрофий, некрозов, двуядерных гепатоцитов. 55 2.6.7. Статистический анализ Полученные цифровые данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием прикладных программ OriginPro 5.5., Microsoft Office Excel 2010 и пакета статистических программ Statistica v. 7.0 (StatSoft Inc., USA). Показатели исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения значений применяли t-критерий Стьюдента и дисперсионный анализ с использованием метода множественных сравнений. Результаты представлены в виде M±m, где M– средняя арифметическая величина, m – стандартная ошибка средней (Гланц С., 1999; Банержи А., 2007). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р< 0,05). 56 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Модель экспериментальной лимфосаркомы мышей RLS. Оценка опухолевой прогрессии у экспериментальных животных в зависимости от количества курсов ПХТ Для проведения эксперимента в качестве опухолевой модели использовали лимфому мышей RLS, изначально обладающую устойчивостью к циклофосфану, которая была получена из лимфосаркомы LS путем многократных перевивок рецидивов этой опухоли (Каледин В.И., 2006), более подробно модель опухоли описана в главе 2.1.1. По морфологическим характеристикам и особенностям течения опухоль RLS соответствует агрессивным В-клеточным лимфоидным опухолям, к которым относится ДВККЛ у людей, а также опухолям, которые уже подвергались воздействию цитостатиков. Целью первого этапа эксперимента было изучение и оценка продолжительности жизни животных с перевитой опухолью RLS без воздействия ПХТ в условиях имплантирования различного количества опухолевых клеток. При проведении первого этапа эксперимента животных поделили на четыре группы: животным первой группы перевили опухолевые клетки в количестве 100 тыс. клеток, второй группе - 80 тыс. клеток опухоли, третьей группе - 50 тыс. клеток и четвертой группе 30 тыс. опухолевых клеток. В месте трансплантации клеток опухоли RLS в мышцы правого бедра визуально было отмечено формирование солидного опухолевого узла: на 7-е сутки после трансплантации у животных первой группы, и на 9-е сутки в остальных экспериментальных группах (рис.2). У животных с опухолью, перевитой в количестве 100 тысяч клеток, средняя продолжительность жизни составила 25,5 суток, в количестве 80 тысяч клеток – 26,8 суток, в группе с опухолью, перевитой в количестве 50 тысяч клеток, – 28,8 суток, а в количестве 30 тысяч клеток – 32,4 суток. Гибель животных из первой группы начиналась с 23-х суток роста опухоли в бедре и максимальная продолжительность жизни мышей в данной группе составила 28 суток, при этом 57 опухолевый узел достигал максимальных размеров 2,4 см3. Во второй группе (перевито 80 тысяч клеток) гибель животных отмечали также с 23-х суток после перевивки опухоли, но максимальная продолжительность жизни животных достигала 31-х суток, а опухолевый узел достигал максимальных размеров 3 см3. При трансплантации опухолевых клеток в количестве 50 тысяч клеток гибель мышей начиналась несколько позже – с 24-х суток, максимальная продолжительность жизни увеличилась до 34-х суток, а максимальные размеры опухолевого узла достигли 2,9 см3. В группе мышей с перевитыми 30 тысячами клеток опухоли RLS гибель животных начиналась еще позже – с 31-х суток, максимальная продолжительность жизни удлинилась до 34-х дней опухолевый узел рос медленнее и достигал максимальных средних размеров 2,1 см3. Таким образом, опухоль RLS, перевитая в количестве 30 тысяч клеток/мл, росла относительно медленно, что обеспечивало максимальную продолжительность жизни животных и стало основанием для выбора именно этой дозы для дальнейшего исследования. Установленная динамика роста опухоли предполагала возможность проведения несколько курсов введения комплекса цитостатиков на мышах-опухоленосителях, что максимально приближенно к клинической картине у пациентов с гемобластозами. 58 Рис. 2. Динамика роста опухолевого узла мышей после имплантации 30, 50, 80 и 100 тысяч клеток RLS на особь. 3.2. Гистологическое строение перевиваемой лимфосаркомы RLS и морфологические особенности ткани опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ Макроскопически опухолевый узел в бедре был округло-овальной формы, бело-розового цвета, имел достаточно четкие границы с окружающей тканью, по мере увеличения объема опухоли отмечали появление кровоизлияний (рис.3, рис.4). Микроскопически ткань опухолевого узла была построена из крайне полиморфных крупных атипичных лимфоидных клеток с узким ободком цитоплазмы имеющих фенотип В-лимфоцитов. Ядра клеток преимущественно округлой формы с равномерным распределением хроматина, большим 59 количеством патологических митозов в них, встречалось большое количество клеток в состоянии апоптотического распада (рис.3, рис.5, рис.6). Опухоль росла инвазивно и разрушала окружающие мышцы бедра (рис.6), наблюдали метастазы опухолевых клеток в печень, почки и легкие, ткани передней брюшной стенки, у одного животного метастазы выявлены в перикарде (рис.9, рис.10, рис.11). Большое количество метастазов во внутренних органах свидетельствует об агрессивности течения данной разновидности экспериментальной лимфомы и быстрой генерализации заболевания путем гематогенного метастазирования. 60 Рис.3. Внешний вид животного с ростом опухоли RLS в бедре правой задней лапы (23-е сутки роста опухоли). Рис.4. Макроскопический вид конечности с ростом опухоли RLS и конечности без опухоли (23-е сутки роста опухоли). 61 Рис.5. Гистологическое строение опухоли RLS (окр. гематоксилином и эозином, ув. 200). Рис.6. Инвазивный рост опухоли RLS в мышцы бедра (окр. гематоксилином и эозином, ув.100). 62 Рис.7. Большое количество фигур патологических митозов в ядрах опухолевых клеток (окр. гематоксилином и эозином, ув.1000). Рис.8. Опухолевые клетки в состоянии апоптотического распада (окр. гематоксилином и эозином, ув.1000). 63 Рис.9. Метастазы опухоли RLS в печени (окр. гематоксилином и эозином, ув.200). Рис.10. Метастазы опухоли RLS в почке (окр. гематоксилином и эозином, ув.400). 64 Рис.11. Метастазы опухоли RLS в сосудах легкого (окр. гематоксилином и эозином, ув.400). Рис.12. Фрагмент ткани опухоли RLS с обширными очагами некроза (окр. гематоксилином и эозином, ув.100). 65 3.3. Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью Для оценки влияния противоопухолевой терапии проводили повторяющиеся курсы ПХТ по схеме CHOP на уже обоснованно подобранной дозе опухолевых клеток, с учетом продолжительности ранее установленной (первый этап жизни животных-опухоленосителей. эксперимента) Опухоль была сформирована путем перевивки опухолевых клеток в правую бедренную мышцу животного, динамику роста лимфосаркомы RLS у животных контрольной группы (без введения цитостатиков) и в группе животных с проведением ПХТ отслеживали путем измерения пораженной конечности штангенциркулем (рис.13). Забор материала для гистологического исследования проводили на 7-е сутки после проведения каждого из трех курсов ПХТ и на 1-е сутки после проведения 4ого курса ПХТ. 4,5 4 Объем опухоли,см3 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 7 сут ПХТ 9 сут 11 сут 14 сут 16 сут 18 сут 21 сут 23 сут 25 сут 28 сут ПХ ПХТ ПХТ Время после перевивки опухоли, сутки RLS RLS+ПХТ Рис.13. Динамика роста опухоли RLS у животных без лечения и у животных с опухолью RLS, получивших 4 курса ПХТ по схеме CHOP. 66 У всех животных на 7-е сутки после трансплантации опухолевых клеток в бедре формировался солидный опухолевый узел, достигавший среднего объема около 0,16 см3, далее размеры узла поступательно увеличивались, несмотря на повторяющиеся курсы ПХТ (рис.13). В сравнении с динамикой роста опухоли у контрольных животных было получено, что повторяющиеся курсы введения цитостатиков оказывали лишь «сдерживающий» эффект на лимфому RLS, но не позволили её элиминировать. Проводя измерения размеров опухоли через день, не было отмечено уменьшения ее размеров ни на одном из 4-х курсов ПХТ (рис.13). У животных с перевитой опухолью в группе контроля (опухоль без воздействия ПХТ) начало гибели животных отмечали на 18-е сутки после трансплантации опухолевых клеток и их средняя продолжительность жизни составила 26,6 суток. В группе животных-опухоленосителей с проведением 4-х последовательных курсов ПХТ с интервалом в 7 дней гибель животных начиналась к 25-м суткам после трансплантации опухоли и их средняя продолжительность жизни составила 28 суток. Максимальный размер опухолевого узла составлял 4±0,26 см в группе животных с опухолью без лечения и 1,6±0,15 см в группе животных получавших лечение цитостатиками. Таким образом, полученные данные о прогрессирующем на фоне введений комплекса цитостатиков росте опухоли RLS потребовали уточнения механизмов прогрессирования опухолевого процесса в изначально резистентной опухоли. 67 3.4. Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ После проведения каждого курса ПХТ в ткани опухоли RLS определяли уровень экспрессии генов, которые участвуют в формировании МЛУ: mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53. Уровень экспрессии этих генов определяли с помощью метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), в качестве внутреннего стандарта использовали ген актин. Из опухолевых клеток первичных культур (глава 2.4.1.) была выделена суммарная РНК с помощью стандартной SDS/фенольной экстракции (глава 2.4.2.). Затем проводили синтез кДНК в буфере с использованием суммарной клеточной РНК, рандомизированного гексануклеотидного праймера и обратной транскриптазы M-MLV (глава 2.4.3.). Для проведения ПЦР с помощью программы OLIGOS были подобраны последовательности специфических праймеров к генам mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53 и актину, которые приведены в таблице 1 (глава 2.4.4). Линейный участок кривой накопления продукта амплификации соответствовал 22-25 циклам для актина, 24 циклам для mdr1b, 26 циклам для mdr1a, 31 циклу для bcl-2 и p53, количество ген-специфического продукта нормировали на количество актинспецифического продукта. Получившиеся данные и количественная обработка результатов ОТ-ПЦР представлены на рисунке 14. В результате было установлено, что по сравнению с опухолью без лечения, после воздействия четырех курсов ПХТ в клетках опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdr1b (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), уровень экспрессии гена mdr1a снижался в 1,2 раза, а экспрессия гена р53 различалась по курсам ПХТ и к 4 курсу произошло снижение показателя почти в 2 раза. 68 bcl-2/ -актин bcl-2 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТ3 ПХТ4 Рис.14. Уровни экспрессии генов mdr1a, mdr1b, bcl-2 и p53 в клетках опухоли RLS без лечения и в опухоли RLS после проведения четырех курсов ПХТ. 69 В исследовании Сеньковой А.В. (2010) на примере леченной курсами ПХТ опухоли RLS40, при оценки экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, на фоне введения цитостатиков отмечали прирост экспрессии уровней гена mdr1b (в 2,8 раза) и bcl-2 (в 2 раза) после 3 курса ПХТ; уровень экспрессии гена р53 снижался после 1-го и 2-го курсов ПХТ в 4,4 раза, а после 3-го курса отмечали его повышение, уровень экспрессии Полученные данные демонстрируют гена mdr1a не изменялась. меняющиеся под воздействием повторяющихся введений комплекса цитостатиков биологические характеристики опухоли RLS40, отражающие процессы опухолевой прогрессии с дополнительной индукцией процессов МЛУ, несмотря на то, что лимфосаркома мышей RLS40 была выращена на очень высоких дозах цитостатиков и изначально имела резистентный фенотип. В нашем эксперименте с лимфосаркомой RLS так же наблюдали на фоне 4кратного введения комплекса цитостатиков повышение уровня экспрессии гена mdr1b, но в меньшей степени. Следовательно МЛУ продолжает нарастать как в опухоли RLS, так и в опухоли RLS40 с селекцией еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток. При этом в изначально более резистентной к цитостатикам опухоли RLS40 на фоне курсов ПХТ наращивание лекарственной устойчивости идет интенсивнее за счет активации гена mdr1b. Однако опухоль RLS, являющаяся изначально фенотипически более «благоприятной» и имеющая меньший прирост экспрессии гена mdr1b на фоне 4 курсов ПХТ, продемонстрировала более интенсивный рост опухоли с меньшим эффектом от введения цитостатиков - по-видимому за счет интенсификации пролиферативного режима и, следовательно, возможного формирования вторичных мутаций в геноме. Выявленные прогрессии молекулярно-биологические изначально фенотипически особенности различающихся опухолевой резистентных к цитостатикам, но имеющих идентичное микроскопическое строение на световом уровне экспериментальных лимфосарком RLS и RLS40, свидетельствуют о том, что в клинической онкологии индивидуальные молекулярные характеристики 70 микроскопически однотипных опухолей могут в итоге определять прогноз болезни и эффективность лечения у каждого пациента. Данное обстоятельство диктует необходимость дальнейшего детального изучения механизмов опухолевой прогрессии для индивидуализации и повышения эффективности программ лечения онкобольных. Полученные результаты динамики экспрессии генов, участвующих в фомировании МЛУ, вызвали интерес сравнить эти данные с уровнем кодируемых этими генами белков, что потребовало проведения иммуногистохимического исследования ткани опухоли RLS экспериментальных животных. 3.5. Результаты исследования индекса мечения окрашенных Ki-67 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения ПХТ Для определения уровня экспрессии белка Ki-67 и изменения уровня его активности в клетках опухоли экспериментальной лимфосаркомы животных RLS без лечения и после проведения нескольких курсов химиотерапии, было проведено иммуногистохимическое исследование ткани опухоли с последующим расчетом ИМ окрашенных ядер клеток. Оказалось, что проведение 4 курсов ПХТ сопровождалось увеличением экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках RLS: до проведения ПХТ индекс мечения составил 34,0 ± 0,95, после проведения 1 курса ПХТ он возрос на 17,6 % и составил 40,0± 1,37, затем продолжал повышаться и к 4 курсу ПХТ возрос до 51,0±1,13% (рис.15). Даже на фоне нескольких курсов ПХТ изначально резистентная к цитостатикам лимфома RLS продемонстрировала опухолевую прогрессию за счет интенсификации пролиферативного режима, что предполагает возможное формирование вторичных мутаций выживание опухолевых клеток (Payne S.R., 2005). генома, обеспечивающих 71 60 50 40 % 30 20 10 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Рис.15. Индекс мечения маркера пролиферативной активности Ki-67 в клетках экспериментальной лимфосаркомы мышей RLS без лечения и в опухоли RLS после проведения 4-х курсов ПХТ 3.6. Уровень некрозов и апоптозов в экспериментальной лимфоме RLS без лечения и после курсов ПХТ В опухолевой ткани без лечения и после проведения курсов ПХТ наблюдали гибель опухолевых клеток путем некроза и апоптоза (рис.8, рис. 12). Появление некрозов в ткани опухоли могло носить ишемический характер, так как опухолевый узел активно рос и опережал рост сосудов, необходимых для его питания (Струков А.И., 1995), что и обусловливало развитие очагов ишемии, кровоизлияний и некрозов, которые имели место в RLS. В контрольной группе животных с перевитой опухолью RLS, но без проведения химиотерапии появление некрозов было зафиксировано к 7-м суткам роста опухоли, когда объемная плотность некрозов составила 2,5%, к 14-м суткам доля некрозов в опухоли увеличилась до 9% (рис. 16). В динамике роста опухоли RLS на фоне проведения курсов ПХТ объемная плотность некрозов также нарастала (рис. 16). Появление некрозов отмечали на 3и сутки после первого курса ПХТ - доля их была невелика и составила в среднем около 1%. После 2 курса ПХТ некрозы были зафиксированы уже через 1 сутки (8,7±1,92), к 3-м суткам объемная плотность некрозов составляла уже 18,0±3,41, достигнув показателя 22,0±3,95 к 7-м суткам. 72 Третье введение комплекса цитостатиков сразу индуцировало некротические процессы, которые занимали примерно 20% ткани опухоли и этот показатель существенно не изменялся через 3 и 7 суток после 3 курсов ПХТ и был на таком же уровне уже через 1 сутки после 4 курса ПХТ (рис.16). Таким образом, наблюдали нарастание объемной плотности некрозов опухоли во всех экспериментальных группах, но в группе контроля без введения цитостатиков увеличение этого показателя было менее выражено. Увеличение объемной плотности некрозов развивалось по мере увеличения размеров опухолевого узла (рис. 13), что предполагает нарушения трофики в опухолевой ткани, однако в развитии некротических изменений играла роль и химиотерапия, поскольку с каждым курсом введения цитостатиков некрозы развивались на более ранних сроках. При оценке выраженности процессов апоптоза в опухолевой ткани было установлено (рис.17): в опухоли до лечения на 7-е сутки роста RLS численная плотность апоптозов составляла 1,2±0,10, а к 14 суткам отмечали снижение показателя до 0,96±0,10 (на 20%). В опухоли животных после проведения курсов ПХТ отмечали сначала возрастание показателя численной плотности клеток опухоли в состоянии апоптоза - так к 7 суткам после 1-го курса ПХТ он повысился почти в 2 раза (1,01±0,1) по сравнению с 1 сутками и далее наблюдали незначительное увеличение численной плотности апоптозов в опухоли с каждым последующим курсом химиотерапии. После 3 курса ПХТ уровень апоптозов составил через 1-и сутки 1,2±0,09, через 3-е и 7-мь суток показатель оставался на этом же уровне, а через 1 стуки после проведения 4 курса ПХТ имел максимальное значение 1,3±0,1 (рис.17). Таким образом, четырехкратное введение комплекса цитостатиков сопровождалось нарастанием объемной плотности некрозов в опухоли RLS, однако этот показатель не превышал значения 20%. Численная плотность апоптозов в опухоли также нарастала незначительно на фоне нестабильной 73 динамики экспрессии гена р53. При этом отмечали возрастание пролиферативной активности опухоли и прогрессирующий рост размеров опухолевого узла. В связи с отмеченными сложными особенностями молекулярных характеристик опухоли RLS в динамике 4 курсов ПХТ было целесообразным оценить уровень экспрессии каспаз в клетках лимфосаркомы RLS до лечения и после введения комплекса цитостатиков. 74 Vv,% . 50 40 1 сутки 30 20 3 сутки 10 7сутки 14 сутки 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Периоды наблюдения (сутки) Рис.16. Объемная плотность некрозов в опухоли RLS при проведении четырех курсов ПХТ и в опухоли без лечения. Nai 1,5 1сутки 1 3 сутки 7 сутки 0,5 14 сутки 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Периоды наблюдения (сутки) Рис.17. Численная плотность апоптозов в опухоли RLS при проведении четырех курсов ПХТ и в опухоли без лечения. 75 3.6.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных caspase 3 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ Известно, что caspase 3 играет ключевую роль в реализации программы апоптоза – ее синтез и активация приводят к неизбежному уходу клетки в состояние апоптоза (Alberts B. at al., 2008). В опухоли животных RLS иммуногистохимическим методом оценивали ИМ - отношение числа позитивно окрашенной цитоплазмы опухолевых клеток на 100 опухолевых клеток (рис. 18, рис. 19). В результате исследования было отмечено незначительное изменение уровня экспрессии caspase 3 на фоне 4-х курсов ПХТ. В группе контроля (животные с опухолью без ПХТ) 12,6±0,32% опухолевых клеток экспрессировали данный белок, что отражает имеющийся уровень спонтанного апоптоза в опухоли в результате грубых генетических аномалий и ишемии. В группе животных после проведения 1 курса ПХТ ИМ возрос незначительно – на 7,1 % и составил 13,5±0,32%, после проведения 2-го курса ПХТ уровень положительно окрашенных клеток составлял 15,7±0,35%. Далее, после проведения 3-го и 4-го курсов ПХТ уровень экспрессии опухолевыми клетками каспазы 3 существенно не менялся и составил 16,0±0,32% и 15,8±0,33% соответственно. Таким образом, было установлено, что при имеющемся в опухоли RLS без лечения невысоком уровне экспрессии каспазы 3 повторяющиеся курсы введения комплекса цитостатиков против ожидаемого приводили к несущественному увеличению экспрессии эффекторной каспазы. Это обстоятельство в совокупности с выявленным повышением экспрессии антиапоптотического гена bcl-2 (в 1,3 раза) и снижение уровня экспрессии гена р53 (почти в 2 раза к 4-му курсу ПХТ) свидетельствует о том, что в опухоли RLS цитостатики индуцируют апоптотическую гибель опухолевых лимфоидных клеток очень незначительно. Из полученных результатов можно предположить, что изначально резистентная к цитостатикам опухоль RLS прогрессирует по крайне 76 неблагоприятному сценарию: процессы апоптоза, которые должны индуцироваться введением комплекса цитостатиков, нарушены, параллельно отмечено повышение пролиферативной активности клеток RLS. По-видимому, на фоне курсов ПХТ происходит клональная селекция клеток, имеющих механизмы выживания, и накопление дополнительных генетических мутаций, что в итоге обусловливает развитие преимущественно спонтанного, а не лекарственноиндуцированного апоптоза и некроза, либо запуск апоптоза происходит через так называемый митохондриальный путь, а не путем активации каспазы 3. И как следствие у животных-опухоленосителей получили прогрессию онкологического процесса на фоне ПХТ: не происходило уменьшение размеров опухолевого узла, имело место метастазирование опухоли. 77 18 16 14 12 % 10 8 6 4 2 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Рис.18. Экспрессия caspase 3 в клетках опухоли экспериментальных животных с опухолью без воздействия ПХТ и в группах животных с опухолью, после повторных курсов ПХТ. Рис.19. Индекс мечения caspase 3 в опухолевых клетках лимфомы RLS без воздействия ПХТ (иммуногистохимическая пероксидазной метки, ув.1000). окраска с использованием 78 3.7. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Ргликопротеин опухолевых клеток экспериментальной лимфомы мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ Для определения уровня экспрессии белка P-гликопротеина в клетках экспериментальной лимфосаркомы животных RLS без лечения и после 4-х курсов ПХТ по иммуногистохимическим препаратам ткани опухоли рассчитывали ИМ. В результате были получены следующие показатели: в контрольной группе животных без ПХТ 31,1±1,37% опухолевых клеток экспрессировали данный белок (рис.20), что в совокупности с изначально высоким уровнем экспрессии гена mdr1b в RLS свидетельствует об изначально имеющейся индукции процессов МЛУ в данной агрессивной лимфоидной опухоли. У животных, получивших 4-х кратное введение цитостатиков, уровень положительно окрашенных на Р-гликопротеин опухолевых клеток поступательно увеличивался: составил 49,0±1,10% после проведения 1-го курса ПХТ, 56,2±1,15% – после 2-го курса ПХТ, а после 3-го и 4-го курса - 62,0±1,17% и 64,7±1,05% соответственно (рис.20, рис.21, рис.22). 70 60 50 % 40 30 20 10 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Рис.20. Индекс мечения белка множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в клетках опухоли экспериментальной лимфосаркомы мышей RLS, без лечения и после проведения нескольких курсов ПХТ. 79 Рис.21. Индекс мечения белка множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в опухоли животных RLS без лечения (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). Рис.22. Индекс мечения белка множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в опухоли животных RLS после проведения ПХТ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.200). 80 Аналогично полученным результатам нарастания уровня экспрессии белка Р-гликопротеина в опухолевых клетках пациентов с ДВККЛ после полученных курсов лечения цитостатиками, у экспериментальных животных так же наблюдали значительное нарастание экспрессии данного белка в динамике ПХТ, что может подтверждать высказанное предположение о проявлении в клетках опухоли RLS эволюционно выработанного механизма, защищающего от повреждающих агентов посредством «выбрасывания» цитостатиков из опухолевых клеток, и, как следствие, – зарегистрированное отсутствие существенной редукции опухоли и вероятное усиление токсического повреждения органов и тканей. В результате исследования молекулярных и структурных характеристик ткани опухоли RLS были получены данные, свидетельствующие о том, что в динамике курсов ПХТ в опухоли происходит непрерывный процесс опухолевой прогрессии, отражающий приспособление неоплазированных клеток к воздействию цитостатиков, меняющий «молекулярный портрет» новообразования в процессе лечения цитостатиками. Процесс этот индуцируется не только в первично возникших опухолях, но и продолжается в опухолях, подвергавшихся воздействию цитостатиков ранее, что получили на примере изначально устойчивой к циклофосфану экспериментальной опухоли RLS. Это обстоятельство, наряду с определением индивидуальных особенностей опухоли на этапе диагностики, необходимо учитывать в процессе лечения пациентов, что также будет являться компонентом персонализации лечения онкозаболевания. В связи с вышесказанным представляет интерес оценить структурнофункциональные изменения в органах-мишенях на фоне злокачественности опухоли, индукции процессов МЛУ и повышения снижения ее чувствительности к цитостатикам. Особый интерес представляет реакция печени в этих условиях, поскольку именно в печени происходит метаболизм химических веществ. 81 3.8. Структурные изменения ткани печени и результаты исследования индекса мечения окрашенных на цитохром P450 гепатоцитов у животных с RLS до лечения и после проведения курсов ПХТ На данном этапе экспериментальной работы целью явилось изучение структурных изменений в ткани печени у экспериментальных животных после проведения нескольких курсов ПХТ и в группе животных с перевитой опухолью, но без воздействия ПХТ. При проведении эксперимента забор ткани печени производили на 1-е, 3-и, 7-е сутки после введения химиопрепаратов, а после введения 4-ого курса ПХТ - только через 1-е сутки по причине начавшегося падежа животных. Морфологические изменения в печени у животных с перевитой в бедро лимфосаркомой RLS были представлены нарушением балочного строения ткани, внутридольковыми очагами некроза разного размера (от моноцеллюлярных до массивных очаговых). Дистрофия гепатоцитов имела характер белковой вакуольной или гидропической: клетки увеличены в размерах, ядро свободно расположено в цитозоле, цитоплазма бледно-розовая (рис.23). В синусоидах встречались лимфоциты, единичные нейтрофилы, макрофаги. У большей части животных в ткани печени, преимущественно периваскулярно вокруг центральной вены, обнаруживали метастазы ткани опухоли (рис. 9). У животных с опухолью RLS без лечения отмечали альтеративные изменения ткани печени, представленные как некрозом, так и дистрофией гепатоцитов, что было обусловлено опухолевой интоксикацией, а также метастазированием ткани опухоли в печень и сдавливанием и/или заполнением синусоидов опухолевыми клетками. Это приводило к нарушению микроциркуляции и, соответственно, питания гепатоцитов, что было показано электронномикроскопически в работе Агеевой Т.А. (2002) на примере печени животных с перевиваемой лимфосаркомой LS. Так же альтеративные изменения развивались опосредованным воздействием растущей опухоли на организм опухоленосителя через синдром эндогенной интоксикации, что доказано клиниколабораторными методами (Лосева М.И. и др., 1999; 2005). 82 Рис.23. Дистрофические и некротические изменения в паренхиме печени на фоне введения цитостатиков (окр. гематоксилином и эозином, ув.400). В группе животных, которым провели четыре последовательных курса ПХТ, отмечали поступательное нарастание деструктивных изменений в ткани печени. Так после проведения 4-го курса ПХТ объемная плотность некрозов гепатоцитов увеличилась в 1,6 раза по сравнению с показателем после 1 курса ПХТ и почти в 3,5 раза - по сравнению показателем в группе животных с лимфосаркомой RLS без лечения (таблица 2). Доля дистрофических изменений гепатоцитов так же нарастала: на 1-е сутки после проведения 1 курса ПХТ показатель составил 23,0±0,55, а на этот же срок после проведения 4-го курса химиотерапии - 34,84±0,85, т.е. произошло увеличение объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии в 1,5 раза. Количество двуядерных гепатоцитов, которые отражают регенераторный потенциал печени, снижалось от курса к курсу проведения химиотерапии, что свидетельствует о снижении активности репаративных процессов в органе на 83 фоне нарастания лекарственной устойчивости опухоли и нарушения синтеза ДНК в гепатоцитах цитостатиками (табл. 2). Таким образом, можно сделать вывод, что каждое последующее введение комплекса цитостатиков и усиление их токсических эффектов, а так же истощение регенераторного потенциала печени, прогрессирующий рост опухоли и её гематогенное метастазирование в печень, на фоне синдрома эндогенной интоксикации и тканевой гипоксии приводило к прогрессирующим значительным деструктивным изменениям ткани органа (таблица 2). Также изменение метаболизма цитостатиков и их распределения могло происходить за счет гиперэкспрессии белкового продукта гена MDR1 трансмембранного белка Р-гликопротеина, который обладает функцией выведения ксенобиотиков из клетки во внеклеточную среду. Таким образом, активация данного механизма могла привести к циркуляции кровотоке высоких концентраций химиопрепаратов, а, в системном соответственно, повреждению токсическими веществами органов и тканей. Кроме того, развитие злокачественного опухолевого процесса сопровождается развитием тканевой гипоксии, в результате которой замедляется биотрансформация ксенобиотиков, а также повышается выраженность их токсических эффектов и снижается терапевтическая эффективность. Ключевую роль в трансформации ксенобиотиков играет система Р450-зависимых монооксигеназ, изучение показателей активности которых в клинике, позволит учитывать особенности трансформации экзогенных субстратов организмом каждого пациента индивидуально. Цитохром Р450 (2D6) определяется на мембране цитоплазматического ретикулума гепатоцитов и служит для ускорения окислительного метаболизма ксенобиотиков широкого спектра. Для определения уровня экспрессии протеина P450 и изменения уровня его активности в клетках печени мышей с опухолью RLS без лечения и после проведения курсов химиотерапии цитостатиками, было проведено иммуногистохимическое исследование ткани печени с последующим расчетом 84 ИМ - отношения числа позитивно окрашенной цитоплазмы клеток на 100 опухолевых клеток. Иммуногистохимическое исследование установило, что у животных с RLS до лечения цитохром Р450-позитивные клетки в печени определялись преимущественно в центральных отделах дольки в виде очаговых скоплений (рис.24), ИМ составил около 20% (19,9±1,36) (рис.26.). Далее на фоне последовательных курсов ПХТ он начинал снижаться от курса к курсу. После 1-го курса ПХТ ИМ составил 11,0±0,86, после второго курса - 7,0±0,56. После третьего и четвертого курсов введения цитостатиков уровень экспрессии цитохрома P450 продолжал снижаться и составил 2,0±0,25% и 1,7±0,16% соответственно (рис.24, рис.25, рис.26, рис. 27). Таким образом, уровень цитохрома Р450 в итоге снизился почти в 11 раз после проведения четвертого курса ПХТ по сравнению с опухолевыми животными, которые не получали цитостатики. Такое существенное снижение уровня экспрессии цитохрома P450 может быть обусловлено уменьшением объема нормальной паренхимы печени в результате нарастания с каждым курсом ПХТ объема некротических изменений, снижением белково-синтетической функции гепатоцитов в клетках в состоянии дистрофии, а так же истощением ферментных систем в условиях опухолевой интоксикации и при воздействии многократных курсов ПХТ. Исследование Хлопушиной Т.Г. (1996) состояния микросомальных монооксигеназ в гомогенатах печени в динамике опухолевого роста у мышей с гепатомой Н-2-73 показало, что развитие опухоли в печени приводит к прогрессирующему подавлению биотрансформирующей и детоксицирующей функции печени у мышей. Так же было показано, что даже однократное введение фторофура интактным мышам вызывало снижение содержания цитохрома Р450. Имеющиеся в литературе и полученные в нашем исследовани данные о снижении уровня цитохрома Р450 в гепатоцитах на фоне проведения нескольких курсов ПХТ и под влиянием роста опухоли определяет необходимость дальнейшего развития этого направления исследований для совершенствования 85 терапевтической тактики, снижения побочных эффектов препаратов, повышения эффективности лечения онкозаболеваний в соответствии с позициями нового направления – персонализированной медицины. 86 Таблица 2 Результаты морфометрии гистологических срезов печени мышей с лимфомой RLS при проведении четырех курсов ПХТ (M±m) МЫШИ С RLS + 1 КУРС ПХТ RLS БЕЗ ЛЕЧЕНИЯ 1 сутки 3сутки 17,3±0,75 23,0±0,55 24,0±0,62 Дистрофия гепатоцитов (Vv) Некроз 6,2±0,56 гепатоцитов (Vv) Двуядерные 2,2±0,16 гепатоциты (Na) RLS + 2 КУРС ПХТ RLS + 3 КУРС ПХТ 7сутки 23,6±0,65 1 сутки 3сутки 7сутки а b 26,0±0,66 25,6±0,66 27,2±0,7c 1 сутки 3сутки 7сутки a b 30,6±0,69 32,7±0,70 31,4±0,81c RLS + 4 КУРС ПХТ 1 сутки 34,8±0,85a* 13,2±0,20 13,2±0,22 15,2±0,24 15,4±0,26a 18,2±0,39b 18,1±0,43c 18,2±0,43a 20,6±0,44b 22,0±0,48c 21,6±0,50a* 1,3±0,10 1,6±0,11 1,4±0,09 1,6±0,09a 1,5±0,09 1,4±0,09 1,2±0,08 1,2±0,08b 1,0±0,08 1,1±0,08a* Примечание: достоверные отличия параметров (p ≤0,05); * - достоверные отличия показателей животных после 4-х курсов ПХТ от группы животных с опухолью без лечения, a – достоверные отличия между показателями на 1сутки после ПХТ, b – достоверные отличия между показателями на 3 сутки после ПХТ, c – достоверные отличия между показателями на 7 сутки после ПХТ. Рис.24. Индекс мечения опухолью RLS цитохрома P450 в гепатоцитах у животных с без ПХТ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.200). Рис.25. Снижение индекса мечения цитохрома P450 в гепатоцитах у животных с опухолью RLS после проведения 1 курса ПХТ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). 88 % 25 20 15 10 5 0 RLS 1ПХТ 2ПХТ 3ПХТ 4ПХТ Рис.26. Индекс мечения цитохрома Р450 в гепатоцитах у животных с экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ Рис.27. Низкий индекс мечения цитохрома P450 в гепатоцитах у животных с опухолью RLS после проведения 4-х курсов ПХТ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). 89 Полученные данные об изменении основных биологических характеристик клеток опухоли мышей RLS под воздействием повторяющихся курсов введения комплекса цитостатиков вызвали интерес соотнести с происходящими изменениями в злокачественных формах НХЛ у пациентов с первично выявленной ДВККЛ и у пациентов с рецидивом данного заболевания на фоне многократных курсов ПХТ. 3.9. Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов С целью оценки молекулярных характеристик диффузной В- крупноклеточной лимфомы у пациентов до лечения и после проведения курсов ПХТ по поводу рецидивов заболевания, выполняли оценку гистологических препаратов патоморфологическую операционно-биопсийного материала лимфатических узлов 30 пациентов с первично выявленной ДВККЛ (средний возраст пациентов составил 52,3±3,7) и лимфатических узлов по секционному материалу от 20 пациентов с ДВККЛ, перенесших от 16 до 24 курсов ПХТ суммарно и умерших при очередном рецидиве данного заболевания (средний возраст пациентов 57,1±2,9). В исследование были выбраны случаи неспецифицированного варианта ДВККЛ (по ВОЗ классификации – Diffuse large B-cell lymphoma, not otherwise specified (DLBCL), NOS, ICD-O code 9680/3) (Swerdlow S., 2008) с первично нодальным поражением. Микроскопически ДВККЛ была представлена диффузным ростом в лимфатических узлах опухолевых лимфоидных клеток, стирающих рисунок их строения. Опухолевые клетки крупного размера (в 3-4 раза больше размера малого лимфоцита), имеют морфологию центробластов и иммунобластов. 90 Центробласты – крупные клетки с просветленными округло-овальными ядрами, ровным либо изрезанным контуром ядер, наличием 2-4 ядрышек, расположенных близко к ядерной мембране; ободок цитоплазмы узкий. Иммунобласты – крупные клетки с просветленными округлыми ядрами, ровным контуром ядер, наличием одного более крупного ядрышка, расположенного центрально; цитоплазма хорошо выражена, часто эксцентрично расположена относительно ядра. В наших наблюдениях как у первичных больных с ДВККЛ, так и у умерших от ДВККЛ преобладали опухоли центробластного типа строения (24 и 17 пациентов соответственно), у остальных в опухолевом инфильтрате была большей доля иммунобластов, но примесь центробластов присутствовала. Опухолевые клетки стирали рисунок строения лимфатических узлов, инвазировали капсулу и прилежащую клетчатку. В опухолевых лимфоидных клетках часто встречали митозы, были клетки в состоянии апоптотического распада. Существенных морфологических различий на светооптическом уровне в первичной ДВККЛ и рецидивной ДВККЛ после многократных курсов ПХТ отмечено не было. Обращало внимание, что некрозы в опухоли в обеих группах встречались редко в виде очень небольших очагов – в первично выявленной ДВККЛ у 1 пациента (3,3%), а в рецидивных ДВККЛ умерших пациентов в 3 случаях (15%), хотя пациенты умерли на фоне получаемой программной цитостатической терапии и можно было бы ожидать более существенных деструктивных процессов в опухолевой ткани. У пациентов с ДВККЛ, получивших многокурсовое ПХТ-лечение и умерших при очередном рецидиве заболевания, на аутопсии в разном сочетании выявляли распространенный инвазивно-диссеминированный рост опухоли в нескольких прилежащих группах тканях лимфатических (особенно узлов, опухолевые забрюшинной инфильтраты клетчатке, в средостении), паренхиматозных органах (прежде всего - печени, почках, легких, селезенке), очаговое поражение костного мозга. Такая распространенность процесса на момент смерти свидетельствовала о крайней агрессивности ДВККЛ, которая на 91 фоне ПХТ демонстрировала прогрессирование, а, значит, низкую чувствительность к лечению. Оценивая индекс мечения (ИМ) окрашенных ядер антителами к Ki-67 было выявлено, что в группе пациентов с первично диагностированной ДВККЛ уровень пролиферативной активности опухолевых клеток, изначально был высоким и составил 56,3 ± 1,5% (табл.3), что отражает высокую агрессивность данного варианта НХЛ. В опухоли онкобольных, перенесших многокурсовую ПХТ и умерших при очередном рецидиве болезни, уровень пролиферативной активности опухолевых клеток снижался в 1,5 раза (табл.3), несмотря на очевидное прогрессирование заболевания с вовлечением в опухолевый процесс мультилокализаций (нескольких групп полостных и периферических лимфатических узлов, селезенки, печени, костного мозга, инфильтрацией паренхиматозных органов и перифокальных тканей) (рис. 28, рис.29). Уровень индекса мечения онкопротеина BCL2, ингибирующего каспазы и тем самым подавляющего апоптоз, был изначально достаточно высоким у пациентов с первично возникшей опухолью - 47,4±2,4 %, а у пациентов с рецидивами после полученного цитостатического лечения отмечали дополнительное нарастание этого показателя в 1,7 раза (табл.3, рис. 30, рис.31). Уровень онкосупрессора p53 так же повышался у пациентов перенесших рецидивы заболевания и многократные курсы ПХТ - показатель увеличился в 2,3 раза, по сравнению с аналогичным показателем в группе больных с первично возникшей опухолью (рис.32, рис. 33, табл. 3). 92 Таблица 3 Сравнительная характеристика экспрессии иммуногистохимических маркеров в ткани опухоли пациентов с впервые выявленной ДВККЛ и у умерших больных с рецидивом ДВККЛ после проведения полихимиотерапии Пациенты с первично выявленной Пациенты с рецидивом опухоли опухолью (n=30) после ПХТ (n=20) Ki-67 BCL-2 р53 Ki-67 BCL-2 p53 56,3±1,5 47,4±2,4 23,4±1,4 37,6±1,2 a 80,1±0,9 a 53,2±1,1 a Примечание: буквой «a» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров пациентов с рецидивом заболевания (p ≤0,05). 93 Рис. 28. Высокий индекс мечения маркера пролиферации Ki-67 в ткани ДВККЛ у пациентов с первично диагностированной опухолью (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.200). Рис. 29. Снижение индекса мечения маркера пролиферации Ki-67 в ткани опухоли у пациентов, перенесших многокурсовую ПХТ с рецидивом ДВККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). 94 Рис. 30. Снижение индекса мечения регулятора апоптоза BCL2 в ткани опухоли у пациентов с первично диагностированной ДВККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). Рис. 31. Высокий индекс мечения регулятора апоптоза BCL2 в ткани опухоли пациентов перенесших многокурсовую ПХТ с рецидивом ДВККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). 95 Рис. 32. Снижение индекса мечения онкосупрессора p53 в ткани опухоли у пациентов с первично диагностированной ДВККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.200). Рис. 33. Высокий индекс мечения онкосупрессора p53 в ткани опухоли у пациентов перенесших многокурсовую ПХТ с рецидивом ДВККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.400). 96 3.9.1. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Ргликопротеин клеток ткани опухоли пациентов с первично возникшей ДБККЛ и в группе пациентов с рецидивами ДББКЛ после проведения курсов ПХТ Для определения количества опухолевых клеток экспрессирующих белок Pгликопротеин, который является продуктом гена MDR1, у пациентов с ДБККЛ до лечения и умерших при рецидиве заболевания после проведения нескольких курсов химиотерапии, было проведено иммуногистохимическое исследование ткани опухоли с последующим расчетом ИМ - отношения числа позитивно окрашенных мембран клеток на 100 опухолевых клеток. В результате были получены следующие показатели: 22,1 ±0,58% опухолевых клеток пациентов с впервые выявленной ДБККЛ экспрессировали данный белок, т.е. были Р-гликопротеин позитивными. У пациентов с рецидивами, получивших терапию цитостатиками, ИМ Р-гликопротеина возрос в 1,7 раза и составил 36,6±1,1% (рис.34, рис.35, рис.36). 40 30 % 20 10 0 Пациенты с первично возникшей ДБККЛ Пациенты с рецидивами ДБККЛ после ПХТ Рис. 34. Процентное содержание клеток опухоли экспрессирующих белок множественной лекарственной устойчивости p-гликопротеин у пациентов с впервые выявленной ДБККЛ и в группе пациентов с рецидивами ДББКЛ, после проведения курсов ПХТ. 97 Рис. 35. Низкий индекс мечения белка множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в ткани опухоли пациентов с впервые возникшей ДБККЛ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.200). Рис. 36. Высокий индекс мечения белка множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина в ткани опухоли пациентов после проведения нескольких курсов ПХТ (иммуногистохимическая окраска с использованием пероксидазной метки, ув.1000). 98 Таким образом, наблюдали динамику значительного нарастания экспрессии белка Р-гликопротеина в опухолевых клетках пациентов после проведения нескольких курсов лечения цитостатиками, что может свидетельствовать о проявлении опухолевыми клетками эволюционно выработанного механизма защиты от повреждающих агентов, в данном случае - это воздействие комплекса химиотерапевтических препаратов - ПХТ. В результате цитостатики «выбрасываются» из опухолевых клеток, тем самым снижается эффективность лечения и усиливается токсическая нагрузка на органы и ткани, в особенности на органы-мишени, осуществляющие метаболизм ксенобиотиков - печень и почки, выводящие токсические соединения из организма (Pajeva I., et al., 2005). Количество клеток экспрессирующих маркер пролиферации Ki-67 снижалось после проведения очередного курса химиотерапии. В сообщении японских исследователей Okamoto et al. (2011) приводятся данные об изменении экспрессии Ki-67 в ткани перевитой опухоли у мышей под воздействием гипертермии: авторы получили снижение уровня данного показателя в опухолевой ткани в 10 раз, однако через 25 дней отмечали восстановление экспрессии Ki-67 до исходного уровня. Учитывая, что у умерших пациентов данный показатель оценивали непосредственно на этапе лечения ДВККЛ цитостатиками, можно предположить, что снижение уровня экспрессии Ki-67 отражает долю «выживших» на курсах ПХТ пролиферирующих опухолевых клеток, являющихся наиболее устойчивыми к антибластомным средствам. Можно предполагать, что показатель пролиферации Ki-67 будет возрастать через какой-то срок после окончания ПХТ. Полученные данные свидетельствуют о том, что проведение противоопухолевого лечения комплексом цитостатиков изменяет молекулярный «портрет» ДВККЛ – опухолевая ткань приобретает негативные характеристики, отражающие опухолевую прогрессию. Происходит блокирование процессов апоптоза и активация МЛУ, что даже при снижении уровня пролиферативной активности способствует прогрессированию опухолевого заболевания у пациентов, развитию нечувствительности к ПХТ, увеличению опухолевой массы, 99 повышению токсической нагрузки, что в результате и приводит к смерти пациентов при очередном рецидиве ДВККЛ. 100 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на то, что число онкологических заболеваний в мире постоянно растет, в настоящее время достигнуты значительные успехи в терапии злокачественных новообразований, прежде всего благодаря раскрытию новых молекулярных механизмов канцерогенеза (Winer E. et al., 2009). На основе новых знаний о молекулярно-биологических характеристиках опухолей происходит усовершенствование методов лечения, например разработан новый класс лекарственных средств - таргетные препараты, которые в данный момент являются «золотым стандартом» в лечении большого количества злокачественных опухолей и целенаправленно действуют строго на определённый сигнальный путь или рецептор поверхности клетки, участвующий в развитии и росте опухоли. По механизму действия они чаще всего являются моноклональными антителами и искусственно синтезируются для связи со строго определённым антигеном (Giaccone G., 2007). Наиболее успешными примерами применения таргетных препаратов в онкологии является использование герцептина при раке молочной железы (Baselga J.,2002; Morioka E., 2012; De Boer R., 2014), иматиниба (гливека) в лечении хронического миелолейкоза и гастроинтестинальных стромальных опухолей (Barnes T., 2011; Chomel J., 2011), ритуксимаба (мабтера) в лечении неходжкинских злокачественных лимфом (Lugtenburg P., 2008; Ziepert M., 2010). Наиболее передовой в области химиотерапевтического лечения злокачественных опухолей является онкогематология, для которой молекулярногенетические характеристики легли в основу классификации новообразований системы крови (WHO, 2008). Современные фундаментальные знания молекулярных механизмов канцерогенеза и разработанные на их основе химиотерапевтические тактики лечения онкогематологический показателей выживаемости заболеваний реализовались онкологических пациентов в - улучшение удлинению безрецидивного периода течения болезни, увеличению продолжительности их жизни (Лосева М.И. и др., 2005). 101 Однако необходимо отметить, что, несмотря на впечатляющие успехи молекулярной биологии, в настоящий момент наступил момент стагнации в дальнейшем улучшении результатов лечения онкобольных, так как управлять поведением опухоли после нескольких рецидивов и многократных курсов химиотерапии оказалось очень сложно, а иногда и невозможно. В клинике существует серьезное препятствие, ограничивающее эффективность применение основных схем ПХТ цитостатиками даже в комбинации с таргетными препаратами - это их высокая токсичность, которая воздействует как на опухолевую ткань, так и на организм опухоленосителя, и нарастающая лекарственная устойчивость опухолевых клеток. Именно снижение эффективности цитостатического лечения заставляет в клинической практике интенсифицировать лечение, переводя пациентов на высокодозные курсы ПХТ и вводя дополнительные цитостатики (Гершанович М.Л., 2004; Bosly A., et al., 2008). В литературе широко охарактеризованы экспериментальные данные о токсичности химиопрепаратов и их влияние на организм опухоленосителя, но в основном они касаются проведения монорежимов терапии и не всегда учитывают степень агрессивности опухоли, уровень её резистентности к химиопрепаратам и комбинацию молекулярно-биологических характеристик, отражающих опухолевую прогрессию (Гольдберг Е.Д., 1999, 2000). Это делает необходимым проведение экспериментальных исследований на опухолевых моделях, позволяющих провести многократные курсы ПХТ и максимально приблизиться к ситуации в клинике. Вышесказанное определило научный интерес выполненного диссертационного исследования – оценить влияние многократных курсов ПХТ на процессы опухолевой прогрессии в эксперименте на перевиваемой лимфоме RLS мышей и в опухолевой ткани пациентов с диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомой. Для того, чтобы поэтапно от курса к курсу ПХТ проследить изменение молекулярных характеристик опухолевых клеток, в экспериментальной части 102 исследования была выбрана опухолевая модель злокачественной лимфомы мышей RLS, для которой была подобрана доза перевивки опухолевых клеток, позволяющая провести максимально возможное количество курсов ПХТ в экспериментальных условиях – 4 курса с интервалом в 7 дней. В научной литературе описания моделей с возможным четырехкратным введением комплекса цитостатиков не было встречено. В исследовании Агеевой Т.А. (2002) на перевиваемой лимфоме LS выполняли 2 курса ПХТ, в работе Сеньковой А.В. (2010) на перевиваемой лимфоме RLS40 выполняли 3 курса ПХТ. Использованная в данном исследовании экспериментальная лимфома RLS (зарегистрирована как «резистентная лимфосаркома») получена путем многократных перевивок клеток экспериментальной лимфомы LS с воздействием низких доз циклофосфана, который является одним из основных препаратов в базовых схемах лечения гемобластозов, и характеризуется сформированным резистентным фенотипом к цитостатикам (Каледин В.И., 2006). Для химиотерапии выбрана комбинация цитостатиков, входящих в базовую схему лечения НХЛ – CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон). В эксперименте с перевитой в заднюю лапу дозой в 30 тыс. клеток на особь лимфомой RLS опухоль вела себя крайне агрессивно: даже на фоне проведения 4 курсов ПХТ показывала прогрессирующее увеличение размеров солидного узла от курса к курсу и появление метастазов в печени, легких, почках, на передней брюшной стенке, а также характеризовалась патоморфологическими и молекулярными изменениями, которые отражали приспособление опухолевых клеток к химиотерапевтическому воздействию, способствуя их выживанию. В изначально резистентной к цитостатикам лимфоме RLS на фоне четырехкратного введения комплекса цитостатиков от курса к курсу очень незначительно нарастала объемная плотность некрозов (максимально до 20%) и численная плотность апоптозов (максимально до 1,3%). Происходило это на фоне нестабильной динамики экспрессии гена р53 в процессе курсов ПХТ, который в итоге снизил свое значение в 1,8 раза в опухолевых клетках животных после 4 курса ПХТ, что в совокупности с низким уровнем экспрессии эффекторной 103 каспазы 3 говорит о сформировавшихся нарушениях функции гена р53, которые способствовали прогрессированию опухоли. Известно, что цитостатики, вызывая летальные повреждения в клетках, способствуют индукции апоптотической смерти опухолевых клеток через активацию wtp53 (Манских В. Н., 2007; Allouche M., 1997; Kojima Y. et al., 2006; Alberts B., 2008). В нашем исследовании как в лимфоидной опухоли пациентов, так и в клетках экспериментальной лимфоме RLS, под воздействием повторяющихся введений комплекса цитостатиков в опухоли формировались клоны, которые были либо способны избегать апоптоза за счет гиперэкспрессии bcl-2, либо имел место мутантный р53, либо сочетание двух компонентов, но в итоге проапоптотическое действие цитостатиков ( Kotala V. et al., 2001; Banfalvi G. et al., 2009) снижалось. При этом необходимо отметить, что и масштабы некрозов в опухолевой лимфоидной ткани как людей, так и животных были невелики. Общепризнанно, что некрозы в опухоли формируются за счет трофических нарушений в быстро растущих опухолях, эффект этот в гемопоэтических опухолях, как производных крови, минимален, поскольку они в этом смысле обладают большим своеобразием – невысокой зависимостью от стромы (Гольдберг Е.Д., 1999, 2000). Было отмечено увеличение количества опухолевых клеток RLS, экспрессирующих маркер пролиферации Ki-67, было отмечено даже на фоне 4 курсов химиотерапии и это сопровождалось интенсивным ростом опухолевого узла у животных, что подтверждает предположение о том, что между курсами введения цитостатиков опухоль способна не только восстанавливать пролиферативный режим, но и наращивать его. Одновременно в изначально резистентной лимфоме RLS животных в динамике ПХТ происходило повышение уровня экспрессии Р-гликопротеина в клетках по сравнению с опухолью RLS без лечения, что отражает продолжающийся процесс активации лекарственной устойчивости, как одного из компонентов опухолевой прогрессии, несмотря на то, что опухоль RLS и так исходно характеризовалась индукцией процессов МЛУ. 104 Для оценки в клетках опухоли RLS уровней экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ и регуляции апоптоза и имеющих значение для развития опухолевой прогрессии, использовали метод ОТ-ПЦР, в результате получили показатели, свидетельствующие о дополнительно нарастающей индукции процессов МЛУ в изначально резистентной к цитостатикам опухоли RLS и нарушениях в регуляции процесса апоптоза в них: происходило увеличение уровня экспрессии гена mdr1b в 1,8 раза, bcl-2 в 1,3 раза, а уровень экспрессии гена mdr1a снижался в 1,2 раза, а гена р53 снижался в 2 раза. Полученные значения, в совокупности с уровнями экспрессии кодируемых этими генами белков, свидетельствуют о продолжающихся в исходно резистентной опухоли процессах селекции еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток. Феномен МЛУ – универсальный механизм невосприимчивости клеток или организма к разного рода химическим агентам с разным механизмом действия, направленный на выживание клеток, который может развиваться в ответ на действие самых разных веществ: химиопрепараты, различные типы излучений (Пасюков В.В., 2007; Matsunaga S., 2006; Stavrovskaya A.A., 2008; Baguley B.C., 2010). Например, в исследованиях показано, что регистрируемая гиперэкспрессия гена bcl-2 в опухолевых клетках сопряжена с приобретением ими лекарственной устойчивости к различным химиотерапевтическим препаратам (Zhong C. et al., 2001; Monti E., 2006), экспрессия wtр53 повышает чувствительность к химиотерапии, поскольку ускоряет вхождение клеток в апоптоз, а мутантного р53 – делает невозможным реализацию программы апоптоза и ведет к закреплению вторичных мутаций (Чумаков П. М., 2000; Kotala V. et al., 2001; Levine A., 2006; Selivanova G., 2007). Полученные нами данные соотносятся с данными литературы и свидетельствуют о том, что в процессе неоднократного воздействия цитостатиков происходит выживание и идет процесс снижения дифференцировки злокачественных клеток даже в исходно агрессивных опухолях. Наращивание агрессивности опухоли RLS через индукцию процессов МЛУ 105 предполагает усиление токсического воздействия на органы и ткани в условиях повторяющихся курсов ПХТ. Особый интерес представило оценить структурнофункциональное состояние печени – как органа, в микросомальной системе окисления которого происходит активный метаболизм цитостатиков (Казюлин А.Н., 2012; Donepudi I., 2012; Amacher D.E., 2013), что определило соответствующую задачу исследования. Было установлено, что проведение 4 курсов ПХТ сопровождалось нарастанием деструктивных изменений в ткани печени животных с лимфомой RLS: объемная плотность некрозов гепатоцитов увеличивалась по сравнению с показателем в группе опухолевых животных без лечения, доля дистрофических изменений гепатоцитов так же возрастала, а процессы регенерации замедлялись от курса к курсу (глава 3, таблица 2), что показывает на фоне метаболизма цитостатиков прогрессирующее нарастание деструктивных изменений в паренхиме печени на фоне метаболизма цитостатиков. Иммуногистохимическое выявление уровня экспрессии цитохрома Р450 показало поступательное снижение этого показателя в 11 раз после проведения 4 курса ПХТ животным с опухолью RLS, что свидетельствует об истощении ферментных систем, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков. Следовательно, повторяющаяся химиотерапевтическая нагрузка с истощением ферментных систем печени и активацией процессов МЛУ через повышение экспрессии Р-гликопротеина, в совокупности, действительно, существенно увеличивает токсичность цитостатической терапии по мере увеличения числа курсов, способствуя структурным нарушениям в органах. В клинической части исследования оценивали изменения молекулярных характеристик, отражающих опухолевую прогрессию, в опухолевых лимфоидных клетках НХЛ пациентов после воздействия многократных курсов ПХТ, в сравнении со статусом первично диагностированной НХЛ. Для исследования был выбран вариант агрессивной НХЛ - диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома, составляющая более 1/3 от всех НХЛ (Swerdlow S.H. et al., 2008). 106 Оценивая иммуногистохимическим методом экспрессию в клетках ДВККЛ белков bcl-2, р-53, Ki-67 и Р-гликопротеина получили, что в леченной цитостатиками ДВККЛ, пациентов получивших от 16 до 24 курсов ПХТ суммарно и умерших в стационаре при очередном рецидиве данного заболевания, в сравнении с первичными ДВККЛ происходит блок процессов апоптоза. Была зарегистрирована гиперэкспрессия как bcl-2 так и р53 (в 1,7 раза и 2,3 раза), что даже при снижении на фоне введения цитостатиков в 1,5 раза экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в совокупности сопровождалось прогрессированием опухолевого процесса у пациентов, приведшее к их смерти. Полученные данные означают, что введение цитостатиков не сопровождалось существенной индукцией процессов апоптоза, а повышение уровня р53 у пациентов было за счет, вероятнее всего, мутантного р53, гиперэкспрессия которого наблюдается при разных опухолях и считается прогностически неблагоприятным признаком (Campling B.G. et al., 2003; Esteva F. et al., 2004; Goradini D. et al., 2004; LópezTerrada D. et al., 2009; Chatzitolios A. et al., 2010). Кроме того, хотя у пациентов с рецидивом ДВККЛ умерших на фоне курсовой ПХТ, отмечено снижение на 50% экспрессии маркера пролиферации Ki67, необходимо учитывать, что эти данные получены на опухоли непосредственно в период введения цитостатиков и по прошествии какого-то времени можно было бы ожидать увеличение данного показателя в переживших очередной курс ПХТ клонах опухолевых клеток. Аналогичную закономерность наблюдали японские исследователи, подвергая экспериментальную колоректальную карциному гипертермическому воздействию – снизившийся в 10 раз уровень экспрессии Ki67 через 25 дней вернулся к исходному уровню (Okamoto Y. et al., 2011). Параллельно в рецидивной ДВККЛ после курсов ПХТ отмечали нарастание в рецидивной ДВККЛ после курсов ПХТ экспрессии Р-гликопротеина в 1,7 раза, что отражает активацию процессов МЛУ и обусловленное этим снижение чувствительности опухолевых клеток к цитостатическому лечению, повышение токсической нагрузки на организм пациента, объясняет в совокупности с вышеуказанными данными прогрессирование болезни у пациентов. В литературе 107 представлено очень много работ по прогрессированию МЛУ в разных опухолях, отражающей негативный прогноз течения болезни для пациента (Блохин Д.Ю. 2009; Shah N.P., 2003; Filipits M., 2004; Baguley B.C, 2010). В результате проведенного данного клинико-экспериментального исследования на примере экспериментальной лимфомы мышей RLS, имеющей первично резистентный к цитостатикам статус, и агрессивной НХЛ пациентов (диффузной В-крупноклеточной лимфомы) наблюдали наращивание степени злокачественности данных лимфоидных опухолей под воздействием курсов химиотерапии, что является отражением цитостатически-индуцированной опухолевой прогрессии. Можно сделать заключение, что клональная селекция более устойчивых злокачественных клеток продолжается под воздействием химиотерапевтического лечения даже в изначально агрессивных и резистентных к лечению опухолях. Хотя происходит это, по-видимому, в каждой опухоли индивидуально, и процесс проявляется в самых разнообразных сочетаниях и комбинациях, однако общий вектор молекулярных событий направлен на выживание опухолевых клеток через блок процесса апоптоза, индукцию механизмов МЛУ с сохранением активно пролиферирующего пула клеток. Становится очевидным, что индивидуальный подход в лечении должен реализовываться не только на этапе диагностики онкозаболевания с определением исходного «молекулярного портрета» опухоли, но и требует мониторирования изменений молекулярных характеристик злокачественных клеток в процессе лечения. Сведения о закономерностях опухолевой прогрессии НХЛ необходимы для развития персонализированного подхода к диагностике и лечению пациентов, направленного на разработку новых схем лечения и оптимизацию существующих, повышение эффективности лечения онкологических больных. 108 ВЫВОДЫ 1. На модели резистентной к цитостатикам лимфомы RLS мышей показано, что опухолевый узел на фоне проведения 4 курсов полихимиотерапии рос медленнее по сравнению с группой животных с опухолью RLS не получавших ПХТ, при этом регрессии опухолевого узла не было отмечено ни на одном курсе химиотерапии. Прогрессирующее увеличение размеров опухолевого узла от курса к курсу сопровождалось следующими молекулярно-клеточными и патоморфологическими изменениями, в совокупности отражающими приспособление опухолевых клеток к химиотерапевтическому воздействию: а) численная незначительно, плотность что экспрессирующих в апоптозов совокупности каспазу 3, с отражает опухолевых невысоким клеток нарастала количеством сформировавшееся клеток, нарушение проапоптотической функции гена р53; б) в опухоли на фоне введения комплекса цитостатиков происходило нарастание объемной плотности некрозов, достигающее максимальных значений после 4 курса полихимиотерапии (20%); в) проведение полихимиотерапии сопровождалось постепенным увеличением количества Ki-67-позитивных клеток RLS в сравнении с показателем в опухоли до лечения, что коррелировало с интенсивным ростом опухоли на фоне химиотерапии. 2. В опухоли RLS при проведении химиотерапии происходила селекция еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток, что проявлялось в повышении экспрессии генов mdr1b и bcl-2, а экспрессия гена р53 была нестабильной и снижалась 1,8 раза после последнего курса химиотерапии, что подтверждает сформировавшийся блок процесса апоптоза в опухоли. 3. Количество Р-гликопротеин экспрессирующих клеток в резистентной лимфоме RLS нарастало в динамике полихимиотерапии, что наряду с увеличением экспрессии гена mdr1b подтверждает усиление МЛУ, как одного из компонентов опухолевой прогрессии. 109 4. На фоне 4 курсов полихимиотерапии в ткани печени животных с лимфомой RLS по сравнению с показателями у животных-опухоленосителей без лечения отмечали нарастание деструктивных изменений (суммарно объемной плотности некрозов и дистрофий гепатоцитов), поступательное уменьшение в 2 раза доли двуядерных гепатоцитов и существенное снижение количества гепатоцитов, содержащих цитохром Р450 (в 11 раз), что в совокупности свидетельствует об истощении ферментных систем на фоне метаболизма цитостатиков и нарастании деструктивных изменений в гепатоцитах. 5. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с ДВККЛ в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик опухолевых лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в опухоли после лечения по сравнению с первичными ДВККЛ происходит нарушение процессов апоптоза и усиление множественной лекарственной устойчивости, что проявляется увеличением количества клеток, экспрессирующих белки bcl-2 и р53, нарастанием количества Р-гликопротеин экспрессирующих клеток. Эти молекулярные изменения, даже на фоне снижения количества Ki-67-позитивных клеток, способствуют снижению чувствительности опухолевых клеток к полихимиотерапии, повышению общей токсической нагрузки и прогрессированию заболевания. 110 ЛИТЕРАТУРА 1. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфометрия: руководство/ Г.Г. Автандилов – М.: Медицина, 1990. – 384 с. 2. Агеева, Т.А. Патоморфологические аспекты постцитостатических поражений печени и желудка при гемобластозах: автореф. дис. …д.мед.наук: 14.00.15 / Агеева Татьяна Августовна. – Новосибирск, 2002. – 42 с. 3. Андрианов, А.В., Значение маркеров прогрессии при остеосаркомах у детей / А.В. Андрианов, А.В. Моргун, Т.Е.Таранушенко // Сибирский онкологический журнал. – 2008. – №5. – С. 37-40. 4. Анисимов, В. Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения / В.Н. Анисимов. – 2-ое изд., перераб. и доп. – СПб.: Наука, 2008. – Т. 1. – 481 с. 5. Афанасьев, Ю.И. Гистология, эмбриология, цитология / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др. – 6-е изд., перераб. и доп. – М.: ГЭОТАРМедиа, 2012.– С.93-101. 6. Банержи, А. Медицинская статистика понятным языком: вводный курс / Банержи А., перевод с англ. под ред. В.П. Леонова. –М.: Практическая медицина, 2007–287 с. 7. Блохин, Д.Ю. Механизмы формирования лекарственной устойчивости опухолевых клеток / Д.Ю. Блохин // Клиническая онкогематология. – 2009. – Т.2. – №1. – С. 167-175. 8. Блохин, Д.Ю. «Постгеномный взгляд» на проблемы онкогенеза / Д.Ю. Блохин // Клиническая онкогематология. – 2009. – том 2. – №3. – С.277-282. 9. Бобкова, М.М. Эффективность применения интенсивной полихимиотерапии в лечении молодых больных с диффузной В-крупноклеточной лимфомой из клеток герминального центра / М.М. Бобкова, С.В. Семочкин, В.Л. Иванова и др. // Онкогематология. – 2009. – С.4-11. 10. Буеверов, А. О. Лекарственные поражения печени / А.О. Буеверов // РМЖ. – 2001. – Т. 9. – № 13–14. 111 11. Гершанович, М.Л. Основные принципы лечения неходжкинских лимфом / М.Л. Гершанович // Практическая онкология. – 2004. –Т.5. –С.185-193. 12. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. –Пер.с англ. – М., Практика,1999. – 459с. 13. Гольдберг, Е.Д. Морфология печени в ранние и отдаленные сроки после введения противоопухолевых препаратов / Е.Д. Гольдберг, Т.И. Фомина, Т.В. Ветошкина и др. // Бюлл. экспер. биол.и медицины. –1998. –Т.126. – №11. –С.561565. 14. Гольдберг, Е.Д. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелодепрессиях / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.В. Жданов // Томск: STT, 1999. – 147 с. 15. Гольдберг, Е.Д. Механизмы локальной регуляции кроветворения / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, Е.Ю. Шерстобоев // Томск: STT, 2000. – 147 с. 16. Захаров, О.Д. Маркеры множественной лекарственной устойчивости при острых миелоидных лейкозах / О.Д. Захаров, Е.Ю. Рыбалкин, М.А.Волкова // Онкогематология. –2006. – №1-2. 17. Зильбер, Л.А. Вирусно-генетическая теория происхождения злокачественных опухолей / Л.А. Зильбер – М.: Медицина, 1968. – 197 с. 18. Имянитов, Е.Н. Молекулярная онкология: клинические аспекты / Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон . – С.-Петербург, Изд. Дом МАПО, 2007. – 212 с. 19. Кабилова, Т.О. Онкогены семеиства myc как терапевтические мишени / Т.О. Кабилова, Е.Л. Черноловская // Бюллетень Сибирской медицины. – 2008. – С.11-26. 20. Казюлин, А.Н. Лекарственная гепатотоксичность при проведении противоопухолевой химиотерапии онкологических заболеваний и возможности ее коррекции / А.Н. Казюлин, Л.З. Вельшер, Н.Н. Данилевская и др. // Фарматека. – 2012. – №8. – С.37-44. 21. Каледин, В.И. Изучение эффективности моно- и полихимиотерапии на модели перевиваемой мышиной лимфосаркомы, нечувствительной к индукции 112 апоптоза / В.И. Каледин, Н.А. Попова, Е.М. Андреева // Вопросы онкологии. – 2006. – Т.52. – №1. – С.70-73. 22. Ковригина, А.М. Морфоиммуногистохимическая диагностика как основа диагноза лимфомы / А.М. Ковригина // Вместе против рака. Врачам всех специальностей. –2006. – №2. 23. Ковынев, И.Б. Апоптоз и механизмы опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом / И.Б. Ковынев, Т.И. Поспелова Т.И., Т.А. Агеева и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2008. – Т.7. – Приложение 3. – С. 26-32. 24. Кондратовский, П.М. Нарушения в системе белка р53 и их влияние на патогенез хронических лимфопролиферативных заболеваний / П.М. Кондратовский, А.И. Дубиков, А.Ю. Дорошевская // Онкогематология. –2011. – №3.– С.65-74. 25. Копнин, Б.П. Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухольсупрессирующих и онкогенных активностей / Б.П. Копнин, П.Б. Копнин, Н.В. Хромова и др. // Клиническая онкогематология. –2008. –Т.1. –№1. –С.2-9. 26. Куценко, С.А. Основы токсикологии: учебное пособие / С.А. Куценко. – С.-Петербург: Фолиант. – 2004. –720 с. 27. Лосева, М.И. Печень при гемобластозах / М.И. Лосева, Т.И. Поспелова. – Новосибирск: Наука, 1999. – 414 с. 28. Лосева, М.И. Отдаленные последствия противоопухолевой терапии гемобластозов / М.И Лосева., Т.И., Поспелова Г.С Солдатова и др.: под ред. профессора Лосевой М.И. – Новосибирск: ИПП «Art-avenue», 2005. –364с. 29. Манских, В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение/ В. Н. Манских // Цитология. –2007. –Т. 49. – №11. – С.909-915. 30. Молодых, О.П. Внутриклеточная реорганизация гепатоцитов при воздействии доксорубицина / О.П. Молодых, Е.Л.Лушникова, М.Г. Клинникова и др. // Бюлл.экспер.биол. и медицины. – 2007. – Т.144. – №10. – С.464-472. 31. Пасюков, В.В. Перекрестная устойчивость опухолевых клеток к повреждающим факторам на модели полученных радио- и химиорезистентных 113 лимфобластоидных сублиний: автореф. дис. …канд. биол. наук / Пасюков В.В. – Минск, 2007. 32. Петров, С.В. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / С.В. Петров, Н.Т. Райхлин . – 4-е изд., перераб. и доп. – Казань, 2012. – 624 с. 33. Пономаренко, Т.М. Система цитохрома Р450 в лёгких: роль в патогенезе заболеваний и фармакокинетике лекарственных средств / Т.М. Пономаренко, Д.А. Сычёв, А.О. Чикало и др. // Фармакокинетика и Фармакодинамика. – 2012. –№1. – С. 25-28. 34. Сенькова, А.В. Структурные изменения в опухоли и печени мышей при нарастании множественной лекарственной устойчивости перевиваемой лимфосаркомы RLS40 в условиях полихимиотерапии: автореф. Дис. … канд. мед. наук:14.03.02,03.03.04 / Сенькова Александра Васильевна. – Новосибирск, 2010. – 23 с. 35. Серов, В.В. Морфологическая диагностика заболеваний печени / В.В. Серов, К. Лапиш. –М.: Медицина, – 1989. –363 с. 36. Ставровская, А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / А.А. Ставровская // Биохимия. –2000. – Т. 65. № 1. – С. 112-126. 37. Струков, А.И. Патологическая анатомия / А.И. Струков, В.В. Серов. – М.: Медицина, 1995. – 688 с. 38. Тюляндин, С.А. Ред. русского перевода Клинические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и наблюдению при первичнодиагностированной крупноклеточной неходжкинской лимфоме / С.А. Тюляндин, Н.И. Переводчикова, Д.А. Носов // Минимальные клинические рекомендации Европейского общества медицинской онкологии (ESMO), М.: РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. –2003. – С.2527. 39. Фаллер Д.М. Молекулярная биология клетки: руководство для врачей / Д.М. Фаллер, Д. Шилдс. – пер. с англ. М.: Издательство БИНОМ, 2006. – С.126144. 114 40. Хлопушина, Т.Г. Влияние наследственных и средовых факторов на метаболизирующую активность системы цитохрома Р-450 и формирование эффектов лекарственных средств: автореф. дис. …док. биол. наук:14.00.25/ Хлопушина Татьяна Григорьевна. – Москва, 1996. – С. 41. 41. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию / Ю.С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: ИКЦ Академкнига, 2004. – с. 390-434. 42. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / В.И. Чиссов, В.В. Старинский , Г.В. Петрова // ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2013. – 289 с. 43. Чумаков, П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью / П.М. Чумаков // Биохимия. – 2000. – Т. 65. – № 1. – С. 34-47. 44. Шкляева, О.А. Противоопухолевая и антиметастатическая активность siРНК, РНКазы А и ДНКазы I –препаратов, способных специфически и неспецифически вызывать деградацию нуклеиновых кислот: автореф. дис. …канд.биол.наук: 03.00.04 / Шкляева Ольга Александровна. – Новосибирск, 2009. –20 с. 45. Штиль, А.А. Развитие множественной лекарственной устойчивости как срочный ответ клетки на экзогенные воздействия / А.А. Штиль // Биол. Мембраны. –2003. –20(3). – С. 236-243. 46. Aas, T. Predictive value of tumor cell proliferation in locally advanced breast cancer treated with neoadjuvant chemotherapy / Т. Aas , S. Geisler, G.E. Eide et al. // Eur. J. Cancer 2003. –Vol.39. –№3. – P.438-446. 47. Abbott, D.R. Apoptosis of t(14;18)-positive lymphoma cells by a Bcl-2 interacting small molecule / D. R. Abbott, R.T. Abbott, S.D. Jensons et al. // Journal of Hematopathology. –2009. –Vol. 2. – P.113-119. 48. Alberts, B. Molecular biology of the cell / B. Alberts. – 5th edition. – Garland science, 2008. – 1601 p. 49. Allouche, M. Influence of the Bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells / M. Allouche, A. Bettaieb, C. Vindis et al. // Oncogene. 1997– Vol. 14. – №15. – P. 1837-1845. 115 50. Amacher, D.E. Development of Blood Biomarkers for Drug-Induced Liver Injury: An Evaluation of Their Potential for Risk Assessment and Diagnostics / D.E. Amacher, S.J. Schomaker , J. Aubrecht et al. // Molecular Diagnosis & Therapy. – 2013. – Vol.17. – P.343-354. 51. Andrade, N.R. Imunoexpression of Ki-67 and p53 in Rectal Cancer Tissue After Treatment with Neoadjuvant Chemoradiation / N. R. Andrade, C.T. Fujiyama Oshima, T.S. Gomes T.S. et al. // Journal of Gastrointestinal Cancer. –2011. – Vol. 42 (1) – P.34-39. 52. Archer, C. Apoptosis Pathways / C. Archer, P. Trott, M. Dowsett // Principles of Molecular Oncology. – 2000. – P. – 237-255. 53. Archer, C. Early changes in apoptosis and proliferation following primary chemotherapy for breast cancer / C. Archer, M. Parton, I.E. Smith // Br. J. Cancer. – 2003. – Vol.89 (6). –P. 1035-1041. 54. Baguley, B.C. Multidrug Resistance in Cancer / B.C. Baguley // Methods in Molecular Biology. –2010. – Vol. 596. – P. 1-14. 55. Banfalvi, G. Apoptotic chromatin changes / G. Banfalvi // Springer science + Business media B. V., 2009. – 412 p. 56. Barnes, T. Practical management of imatinib in gastrointestinal stromal tumors / T. Barnes, D. Reinke // Clin. J. Oncol. Nurs. – 2011. – Vol. 15(5). P. –533545. 57. Baselga, J. Combined anti - EOF receptor and anti - HER2 receptor therapy in breast cancer: a promising strategy ready for clinical testing / J. Baselga // Ann. Oncol. – 2002. –Vol.13. – Р.8-9. 58. Belyaeva, A.V. Age-related and clinicopathological features of colorectal cancer associated with K-ras gene status / A.V. Belyaeva, G.A. Yanus, E.N. Suspitsyn et al. // Advances in Gerontology. –2012. –Vol.2. –Issue 4. – P. 306-311. 59. Birner , P. Prognostic relevance of p53 protein expression in glioblastoma / P. Birner, M. Piribauer, I. Fischer et al. // Oncol. Reports. –2002. – V.9. – P.703-707. 60. Bogler, O. The p53 gene and its role in human brain tumors / O. Bogler, H.J. Huang, P. Kleihues et al. // Glia. – 1995. V.15. – P. 308-327. 116 61. Bosly, A. Achievement of optimal average relative dose intensity and correlation with survival in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with CHOP / A. Bosly, D. Bron, A.Van Hoof et al. // Annals of Hematology. – 2008. –Vol. 87. – Issue 4. – P. 277-283. 62. Bronchud, M. H. Cyclin-Dependent Kinases and Their Regulators as Potential Targets for Anticancer Therapeutics / M. H. Bronchud, L. Brizuela, J. Gyuris et al. // Principles of Molecular Oncology. –2004. –P. 359-410. 63. Bröker, L.E. Cell death independent of caspases: a review / L.E. Bröker, F.E.A. Kruyt, G. Giaccone // Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. – 2005. –11(9). – P.3155–3162. 64. Broyde, A. Role and prognostic significance of the Ki-67 index in nonHodgkin's lymphoma / A. Broyde, O. Boycov, Y. Strenov //Am. J. Hematol. – 2009. – Vol. – 84. – P. 338-344. 65. Buchwalow, I. Immunohistochemistry. Basics and methods / I. Buchwalow, W. Bocker. –2010. – 150 p. 66. Campling, B.G. Clinical implication of p53 mutation in lung cancer / B.G. Campling, W.S. El-Deiry // Molecular Biotechnology. – 2003 –.Vol. 24. – Issue 2. – P. 141-156. 67. Chang, C.C. Immunohistochemical expression patterns of germinal center and activation B-cell markers correlate with prognosis in diffuse large B-cell lymphoma / С. C. Chang, S. McClintock S., R. Cleveland et al. // Am. J. Surg. Pathol. – 2004. –Vol. 28. – P.464-70. 68. Сhattopadhyay, N. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues / N. Сhattopadhyay, R. Kher, M. Godbole // Biotechniques. – 1993. – Vol. 15. – №1. – Р. 24-26. 69. Chatzitolios, A. Prognostic significance of CD95, P53, and BCL2 expression in extranodal non-Hodgkin’s lymphoma / A. Chatzitolios, I.Venizelos, G.Tripsiannis et al. // Annals of Hematology. – 2010. – Vol. 89. –Issue 9. – P. 889-896. 70. Chen, G. G., Apoptosis in carcinogenesis and chemotherapy / G. G.Chen, P. B. S. Lai // Apoptosis in cancer. – Springer, 2009. – 384 p. 117 71. Chomel, J.C. Chronic myeloid leukemia stem cells in the era of targeted therapies: resistance, persistence and long-term dormancy / J.C. Chomel, A.G. Turhan // Oncotarget. – 2011. – Vol. 2(9). – P.713-727. 72. Coleman, W.B. Molecular mechanisms of human carcinogenesis / W.B. Coleman, G.J.Tsongalis // Cancer: Cell Structures, Carcinogens and Genomic Instability Experientia Supplementum – 2006. – P. 321-349. 73. Court, H. The Biology of K-Ras Signaling Pathways in Pancreatic Cancer / H. Court, M.R.Philips, D. Bar-Sagi // Molecular Genetics of Pancreatic Cancer . –2013. – P.83-115. 74. Dabbs, D.G. Diagnostic immunohistochemistry: theranostic and genomic applications. – 3rd ed. – 2010. – Vol. 941. – P.167-169. 75. Danielson, P.B. The cytochrome P450 superfamily: biochemistry, evolution and drug metabolism in humans / P.B Danielson // Curr. Drug Metab. – 2002. – Т.3. – №6. – P. 561-597. 76. De Boer, R. Systemic treatment of HER2+ metastatic breast cancer: clinical conundrums and future perspectives / R. De Boer, J. Beith, J. Chirgwin //Asia Pac. J. Clin. Oncol. – 2014. – P.15-25. 77. DiPaola, R.S. Overcoming bcl-2 and p53-mediated resistance in prostate cancer / R.S. DiPaola, J. Aisner // Semin Oncology. –1999. –26. – P.112-118. 78. Donepudi, I. Drug-Induced Liver Injury / I. Donepudi, H.Massoumi, T.S. Dharmarajan et al. // Geriatric Gastroenterology. – 2012. –P.409-420. 79. Doonan, J.H. Functional Evolution of Cyclin-Dependent Kinases / J. H. Doonan, D. Kitsios // Molecular Biotechnology. –2009. –Vol. 42. – Issue 1. – P. 14-29. 80. Dutheil, F. Xenobiotic metabolizing enzymes in the central nervous system: Contribution of cytochrome P450 enzymes in normal and pathological human brain / F. Dutheil, P. Beaune, M.A. Loriot // Biochimie. –2008. –Vol.90. – P.426-436. 81. Erler, B.S. CD117, Ki-67, and p53 predict survival in neuroendocrine carcinomas, but not within the subgroup of small cell lung carcinoma / B.S. Erler, M.M. Presby, M. Finch M. et al. // Tumor Biology.– 2011. –Vol.32 (1). P.107-111. 82. Esteva, F. Prognostic markers in early breast cancer / F. Esteva, G. 118 Hortobagyi // Breast Cancer Res. –2004. –Vol.6. – №3. – P.109-118. 83. Filipits, M. Mechanisms of cancer: multidrug resistance / M. Filipits // Drug Discovery Today: Disease Mechanisms. – 2004. – Vol.1. – №2. – P. 229-234. 84. Foulds, L. Neoplastic Development / Foulds, L. // Vol. 1. Academic Press, New York. – 1969. 85. Foussard, C. Long-term follow-up of a randomized trial of fludarabinemitoxantrone, compared with cyclophosphamide, doxorubicin, vindesine, prednisone (CHVP), as first-line treatment of elderly patients with advanced, low-grade nonHodgkin,s lymphoma before the era of monoclonal antibodies / С. Foussard , P. Colombat, H. Maisonneuve // Annals of Oncology. –2005. –Vol.16. –P.466-472. 86. Frank, N. A. Acute and Chronic Liver Diseases Induced by Drugs or Xenobiotics / N.A. Frank , M.A. Carey, J.B. Carey // Liver Immunology. – 2007. – P.375-388. 87. Frasca, D.Transcription Factors in Mature B-Cells During Aging / D. Frasca, R.L. Riley, B.B. Blomberg // Handbook on Immunosenescence. – 2009. – P.381-391. 88. Giaccone, G. Targeted Therapies in Oncology / G. Giaccone // Taylor&Francis . – 2007. – 424 р. 89. Gillian, M.K. Rituximab / M.K. Gillian // Drugs. – 2010. –Vol.70 –P. 14451476. 90. Ginsburg, G. S. Personalized medicine: Revolutionizing drug discovery and patient care / G.S. Ginsburg, J.J. McCarthy // Trends Biotechnol. – 2001. – Vol.19. – P.491-496. 91. Goldstein, L.J. Expression of a multidrug resistance gene in human cancers / L.J. Goldstein, H. Galski, A. Fojo et al. // J.Nat. Cancer Inst. 1989. — Vol. 81. – P. 116124. 92. Gomez-Curet, I. c-Myc inhibition negatively impacts lymphoma growth / I. Gomez-Curet, R.S. Perkins, R.Bennett et al. // J. Pediatr. Surg. – 2006. –V. 41. – P.207211. 93. Goradini, D. Biomolecular prognostic factors in breast cancer / D. Goradini, M. Diadone // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. –2004. –Vol.16., №1. –P.49-55. 119 94. Hanahan, D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. – 2000. –Vol.100. – P.57-70. 95. Hans, C.P. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray / C.P. Hans, D.D. Weisenburger, T.C. Creiner // Blood. – 2004. – Vol.103. –P.275-282. 96. Hegewisch-Becker, S. The MDR phenotype in hematologic malignancies: prognostic relevance and future perspectives / S. Hegewisch-Becker, D.K. Hossfeld // Ann. Hematol. –1996. –Vol. 72. – P. 105-117. 97. Hiraga, J. Promoter Hypermethylation of the DNA-Repair Gene O 6 – Methylguanine – DNA Methyltransferase and p53 Mutation in Diffuse Large B-cell Lymphoma / J. Hiraga, T. Kinoshita, T. Ohno et al. // International Journal of Hematology. – 2006. – Vol. 84. – Issue 3. – P.248-255. 98. Hitoshi, O. BCL6 Translocations in B-Cell Tumors /O. Hitoshi // Encyclopedia of Cancer. – 2012. – P.364-368. 99. Inwald, E.C. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry / E.C. Inwald, M. KlinkhammerSchalke, F. Hofstädter // Breast Cancer Research and Treatment . – 2013. –Vol. 139 (2). – P. 539-552. 100. Jain, K.K. Personalized Medicine / K.K. Jain // Decision Resources Inc. Waltham. – MA. – USA. – 1998. 101. Jain, K.K. From molecular diagnostics to personalized medicine / K.K. Jain // Exp. Rev. Mol. Diagn. – 2002. –Vol. 2. – P. 299-301 / The IBC Workshop. London. and Clinical Oncology. –2000. – Vol. 126. – Issue 4. – P.238-245. 102. Jain, K.K. Personalized Medicine / K.K. Jain // Jain PharmaBiotech Publications. Basel, Switzerland. – 2003. – Vol. 4 (6). – P.548–558. 103. Jain, K.K. Personalized Therapy for Cancer / K.K. Jain // Textbook of Personalized Medicine. – 2009. – P. 165-254. 104. Janssen, K.P. Murine models of colorectal cancer: studying the role of oncogenic K-ras / K.P. Janssen // Cellular and Molecular Life Sciences. – 2003. – Vol.60. – Issue 3. – P. 495-506. 120 105. Jeffrey, P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations / P. Jeffrey, N. Pavletich // Journal: Science. – 1994. – Vol. 265. – №5170. – P.346-355. 106. Junker, K. p53 tumour-suppressor gene in non-small-cell lung cancer with neoadjuvant therapy / K. Junker, T. Wiethege, K.M. Müller // J. Cancer Res. Clin. Oncol. – 2001. – 126 (4). P. –238-245. 107. Kanungo, A. Lymphoid neoplasms associated with concurrent t(14;18) and 8q24/c-MYC translocation generally have a poor prognosis / A. Kanungo, L.J. Medeiros, L.V. Abruzzo et al. // Mod Pathol. – 2006. –№ 19. – P.25-33. 108. Kaplowitz , N. Drug metabolism and hepatotoxicity / In: Kaplowitz N., ed. Liver and Biliary Diseases / Kaplowitz. – 2-nd ed. Williams and Wilkins, 1996. – P. 103-120. 109. Karim, K.A. Temozolomide and radiotherapy in newly diagnosed glioblastoma patients: O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promotor methylation status and Ki-67 as biomarkers for survival and response to treatment / K.A. Karim, M.M. Mahdy, M.M.A.Wahab et al. // The Chinese-German Journal of Clinical Oncology. – 2012. –Vol.11 (3). – P. 168-176. 110. Kim, N.K. p53, BCL-2, and Ki-67 Expression According to Tumor Response After Concurrent Chemoradiotherapy for Advanced Rectal Cancer / N.K. Kim, J.K. Park, K.Y. Lee et al. // Annals of Surgical Oncology. – 2001. – Vol. 8 (5). – P. 418-424. 111. Kojima, Y. Fas and Fas ligand expression on germinal center type-diffuse large B-cell lymphoma is associated with the clinical outcome / Y. Kojima, H. Tsurumi, N. Goto et al. // Eur. J. Haematol. –2006. – Vol. 76. – №6. – P. 465-472. 112. Komdeur, R. Expression of multidrug resistance proteins, P-gp, MRP1 and LRP, in soft tissue sarcomas analysed according to their histological type and grade / R. Komdeur, B.E.C. Plaat , W.T.A. Graaf // European Journal of Cancer – 2002. –№39 – Р. 909-916. 113. Kotala, V. Potent induction of wild-type p53-dependent transcription in tumour cells by a synthetic inhibitor of cyclin-dependent kinases / V. Kotala, S. 121 Uldrijan, M. Horky et al. // Cellular and Molecular Life Sciences. –2001. – Vol.58. – Issue 9. – P. 1333-1339. 114. Lee, E.C. Programmed cell death and survival pathways in prostate cancer cells / E.C. Lee, M. Tenniswood // Arch Androl. – 2004. –Vol.50. – P. 27–32. 115. Lee, S. Cytochrome P450 networks in chemical space / S. Lee, D. Kim // Archives of Pharmacal Research. – 2010. – Vol.33. – P.1361-1374. 116. Leitner, J. M. Hepatotoxicity of antibacterials: Pathomechanisms and clinical / J.M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer // Infection. –2010. –№ 38. –P. 3– 11. 117. Leventaki, V. Lymphoid Malignancies: Molecular Diagnostics / V. Leventaki, F.Vega // Molecular Genetic Pathology. – 2013. – P. 887-928. 118. Levine, A.J. The P53 pathway: what questions remain to be explored? / A.J. Levine, W. Hu, Z. Feng // Journal Cell Death and Differentiation – cell death differentiation. –2006. –Vol. 13. – №.6. – P.1027-1036. 119. Llanos, M. Prognostic significance of Ki-67 nuclear proliferative antigen, bcl-2 protein, and p53 expression in follicular and diffuse large B-cell lymphoma / M. Llanos, H. Alvarez-Arguelles, R. Aleman // Med Oncolоgy. – 2001. –Vol. 18. – P.1522. 120. Loo, T.W. Recent progress in understanding the mechanism of Pglycoprotein-mediated drug efflux / T.W. Loo, D. M. Clarke // J. Membr. Biol. – 2005. –Vol. 206. – P.173-185. 121. López-Terrada D. Genetics and Molecular Biology of Bone and Soft Tissue Tumors / D. López-Terrada, J.M. Hicks // Bone Pathology. – 2009. – P. 91-124. 122. Louis, D.N. WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System / D.N. Louis, H. Ohgaki, O.D.Wiestler et al. – 3rd Edition. –2007. –P.13-50. 123. Luan, H. Study of the correlation of EGFR and K-RAS gene mutations with its protein expression in non-small cell lung cancer / H. Luan, L.Sun, N. Dong et al. // Clinical Oncology and Cancer Research. – 2010. – Vol.7. – Issue 2. – P. 97-102. 122 124. Lugtenburg, P. Treatment of diffuse large B-cell lymphoma in the elderly: strategies integrating oncogeriatric themes / P. Lugtenburg, P. Sonneveld // Curr. Oncol. Rep. – 2008 Vol.10(5). – P.412-9. 125. Marie, J.P. Drug resistance in hematologic malignancies / J.P. Marie // Curr. Opin. Oncol. 2001. – Vol. 13. – P. 463-469. 126. Matsunaga, S. Indomethacin overcomes doxorubicin resistance with inhibiting multi-drug resistance protein 1 (MRP1) / S. Matsunaga, T. Asano, A. Tsutsuda-Asano et al. // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. – 2006. –Vol.58. – Issue 3. – P.348-353. 127. Mengoli, M. Drug-induced hepatotoxicity: clinical and biochemical features of 26 patients and a review of the literature / M. Mengoli, D. Parmeggiani, M.C. Mengoli // Recent. Prog. Med. –2011. –102 (6). – P. 253–260. 128. Mitselou, A. Immunohistochemical study of apoptosis - related bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki-67, PCNA), tumor suppression genes (p53, pRb), the oncogene c-erb-B2, sex steroid hormone receptors and other clinicopathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium / A. Mitselou, E. Ioachim, E. Kitsou // In vivo. – 2003. – 17. – P.469–478. 129. Miura, K. An effective salvage treatment using ifosfamide, etoposide, cytarabine, dexamethasone, and rituximab (R-IVAD) for patients with relapsed or refractory aggressive B-cell lymphoma / K. Miura, K.Takei, S. Kobayashi // International Journal of Hematology. – 2011. – Vol.94. – P.90-96. 130. Moch, H. Personalized cancer medicine and the future of pathology / H. Moch, P.R. Blank, M. Dietel et al. // Virchows Archiv. – 2012. – Vol. 460. – Issue 1. – P. 3-8. 131. Montellano, O. Cytochrome P450: structure, mechanism, and biochemistry/ O. Montellano, R. Paul. –3rd edition. –2005. – New York, Kluwer Academic/Plenum Publishers. 132. Monti, E. Molecular Determinants of Intrinsic Multidrug Resistance in Cancer Cells and Tumors / E. Monti // Cancer Drug Resistance Cancer Drug Discovery and Development. – 2006. – P. 241-260. 123 133. Morioka, E. Recurrent breast cancer obtained long-term survival with local treatment (surgery and stereotactic body radiotherapy) and systemic therapy / E. Morioka, Y. Ohno, M. Noguchi // Gan To Kagaku Ryoho. 2012. – 39(12). – Р. 19421944. 134. Munoz-Pinedo, С. Signaling Pathways that Regulate Life and Cell Death: Evolution of Apoptosis in the Context of Self-Defense / C. Munoz-Pinedo // Advances in Experimental Medicine and Biology. – 2012. –Vol.738. – P. 124-143. 135. Neder, L. MIB-1 labeling index in astrocytic tumors- a clinicopathologic study / L.Neder, B.O. Colli, H.R. Machado et al. // Clin.Neuropathol. 2001. – № 23. – P.262-270. 136. Nurse, P.M. Nobel lecture: Cyclin Dependent Kinases and Cell Cycle Control Bioscience Reports / P.M. Nurse. – 2002. – Vol. 22. – Issue 5-6. – P. 487-499. 137.Okamoto, Y. Oncothermia research and veterinary application in Japan, Tottori University / Y. Okamoto, G. Andocs, K. Kinya // Oncothermia Toyama city. – 2011. 138. Pajeva, I. Molecular Modeling of P-Glycoprotein and Related Drugs / I. Pajeva, G. Globisch, R. Fleischer R. // Medicinal Chemistry Research. – 2005. –Vol.14. – Issue 2. – P. 106-117. 139. Pasqualucci, L. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas / L. Pasqualucci, P. Neumeister, T. Goossens // Nature. – 2001. – P. 341-346. 140. Paul, D. Hepatotoxicity of chemotherapy / D. Paul // The Oncologist. – 2001. – № 6. – Р. 162-176. 141. Payne, S.R. Tumor suppressor genetics / S.R. Payne, C.J. Kemp // Carcinogenesis. – 2005. –26(12). –P. 2031–2045. 142. Penault-Llorca, F. Induction chemotherapy for breast carcinoma: predictive markers and relation with outcome / F. Penault-Llorca, A. Cayre, M.F. Bouchet // Int. J. Oncol. – 2003. – №22 (6). – P.1319–1325. 124 143. Pouratian, N. Low-grade gliomas in older patients: a retrospective analysis of prognostic factors / N. Pouratian, M. Mut, J. Jagannathan et al. // Journal of NeuroOncology. – 2008. – Vol. 90(3). – P. 341-350. 144. Reed, J.C. BCL-2-family proteins and hematologic malignancies: history and future prospects / J.C. Reed // Blood. –2008. –Vol.111. – P. 3322-3330. 145. Rindi ,G. TNM staging of foregut neuroendocrine tumors: a consensus proposal including agrading system / G. Rindi, G. Kloppel, H. Alhman // Virchows Arch. – 2006. – Vol. 449. – P. 395-340. 146. Ruddell, A. B lymphocyte-specific c-Myc expression stimulates early and functional expansion of the vasculature and lymphatics during lymphomagenesis / A. Ruddell, P. Mezquita, K.A. Brandvold et al. // Am. J. Pathol. – 2003. – Vol. 163. – P. 2233—2245. 147. Rudner, J. Apoptosis InTech, Chapters published / J. Rudner. – 2013. – 202 p. 148. Salaverria, I. Molecular mechanisms in malignant lymphomas network project of the Deutsche Krebshilfe; German high-grade lymphoma study group; BerlinFrankfurt-Munster-NHL trial group. Translocations activating IRF4 identify a subtype of germinal center-derived B-cell lymphoma affecting predominantly children and young adults / I. Salaverria, C. Philipp, I. Oschlies et al. // Blood. – 2011. – 118 (1). – P.139-147. 149. Santella, R.M. Mechanisms and Biological Markers of Carcinogenesis / R.M. Santella // Cancer Precursors. – 2002. – P. 7-19. 150. Schinkel, A.H. Pharmacological insights from P-glycoprotein knockout mice / A.H. Schinkel // Int J Clin Pharmacol Ther. –1998 –Vol. 36.–P.9-13. 151. Schneider-Stock, R. p53 gene mutations in soft-tissue sarcomas-correlations with p53 immunohistochemistry and DNA ploidy / R.Schneider-Stock, Radig K., O.Yoshinao // Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. – 1997. –Vol. 123. – Issue 4. – P. 211-218. 125 152. Schumacher, M.A. Structural mechanism of the simultaneous binding of two drugs to a multidrug-binding protein / M. A. Schumacher, M.C. Miller, R.G. Brennan // EMBO J. –2004. – Vol. 23. – P.2923-2930. 153. Schwab, M. MycN in neuronal tumours / M. Schwab // Cancer Lett. 2004. – Vol. 204(2). – P.179-187. 154. Selivanova, G. Reactivation of mutant p53: molecular mechanisms and therapeutic potential / G. Selivanova, K. Wiman // Journal Oncogene. –2007. – Vol. 26. – №15. – P.2243-2254. 155. Shah, N.P. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias / N.P.Shah, C.L.Sawyers // Oncogene. – 2003. – Vol. 22. – P. 7389-7395. 156. Shtil ,A.A. Emergence of multidrug resistance in leukemia cells during chemotherapy: mechanisms and prevention / A.A. Shtil // J.Hematother. Stem Cell Res. –2002. – Vol. 11. – P. 231-241. 157. Simonsson, T. c-Myc Suppression in Burkitt's lymphoma cells / T. Simonsson, M. Henriksson // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2002. – Vol. 290. – P. 11-15. 158. Slamon ,D.J. Human breast cancer. Correlanion of replase and survival with amplification of HER2/neu oncogene / D.J. Slamon, G.M. Clark, S.G. Wong et al. // Science. – 1987.–Vol.235. – P.177–182. 159. Sofocleous ,C.T. Ki-67 is an Independent Predictive Biomarker of Cancer Specific and Local Recurrence-Free Survival After Lung Tumor Ablation / C.T. Sofocleous, S.K. Garg, P. Cohen et al. // Annals of Surgical Oncology. – 2013. – Vol. 20 (3). – P. 676-683. 160. Song, Y. Expression profile of CD10, Bcl-6, CD138, Bcl-2 and MUM1 and their prognostic value in 136 patients with diffuse large B-cell lymphoma / Y. Song, Z. Cao, Q. Su et al. // The Chinese-German Journal of Clinical Oncology. –2009. – Vol. 8. – Issue 10. – P. 585-591. 126 161. Soussi, T. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis / T. Soussi, K. Dehouche, C. Béroud Hum. Mutat. – 2000. – Vol.15. –P. 105–113. 162. Staud, F. Expression and Function of P-Glycoprotein in Normal Tissues: Effect on Pharmacokinetics / F. Staud, M. Ceckova, S. Micuda et al. // Methods in Molecular Biology. – 2010. – Vol. 596. – P.199-222. 163. Stavrovskaya, A.A. Transport proteins of the ABC family and multidrug resistance of tumor cells / A.A. Stavrovskaya, T.P. Stromskaya // Biochemistry. – 2008. –Vol. 73(5). – P. 592-604. 164. Stewart, Z.A., Westfall M.D., Pietenpol J.A. Cell-cycle dysregulation and anticancer therapy RENDS in Pharmacological Sciences. – 2003 – Vol.24. –No.3. –P. 139. 165. Swerdlow, S. WHO Classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues / S. Swerdlow, E. Campo, N. Harris et al. // I. ARC, Lyon. –2008. –P.233-237. 166. Szczuraszek, K. Prognostic Significance of Ki-67 Antigen Expression in Non-Hodgkin's Lymphomas / K. Szczuraszek, G.Mazur, M. Jelen et al. // Anticancer Res. 2008. – Vol. 28. – P. 1113-1118. 167. Takano, Y. Apoptosis of colon cancer: Comparison with Ki-67 proliferative activity and expression of p53 / Y. Takano, M. Saegusa, M. Ikenaga // Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. – 1996. – Vol.122 (3). – P. 166-170. 168. Thor, A.D. Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein: an independent marker of prognosis in breast cancers / A.D. Thor // J. Natl. Cancer Inst. 1992. – № 84. – P.845-855. 169. Tyson ,J.J. Temporal Organization of the Cell Cycle Current Biology / J.J.Tyson, B. Novak // –. 2008. – Vol. 18. – Issue 17. – P. 759-768. 170. Varghese, J. Caspase-3 activation is an early event and initiates apoptotic damage in a human leukemia cell line / J. Varghese, N.S. Khandre, A. Sarin // Apoptosis. –2003. –Vol.8. – Issue 4. – P.363-370. 171. Vaux, D. L. Apoptosis Timeline / D.L. Vaux // Cell Death and Differentiation. – 2002. – Vol.9. – P. 349–354. 127 172. Vizirianakis, I.S. Pharmaceutical education in the wake of genomic technologies for drug development and personalized medicine / I.S. Vizirianakis // Eur. J. Pharm. Sci. – 2002. – Vol. 15. – P. 243-250. 173. Wang, C. High prevalence of significant fibrosis in patients with immunotolerance to chronic hepatitis B infection / C. Wang, H. Deubner, M. Shuhart et al. // Hepatology. – 2005. – Vol.42. –P.573. 174. Wang, D. VEGF and Bcl-2 Interact Via MAPKs Signaling Pathway in the Response to Hypoxia in Neuroblastoma / D.Wang, Q. Weng, L. Zhang L. et al. // Cellular and Molecular Neurobiology. – 2009. – Vol. 29 (3). – P. 391-401. 175. Weinberg, R. The Biology of Cancer / R. Weinberg // Cellular Oncogenesis, Garland Science. – 2006. – P. 91–118. 176. Wieskowska, A. Noninvasive diagnosis and monitoring of nonalcoholic steatohepatitis: present and future / A. Wieskowska, A.J. McCullough, A.E. Feldstein // Hepatology. –2007. – Vol. 46. – P.582-589. 177. Winer, E. Clinical Cancer Advances 2008: Major Research Advances in Cancer Treatment, Prevention, and Screening – A Report From the American Society of Clinical Oncology / E. Winer, G. Gralow, L. Diller et al. // J.Clin. Onc. –2009. – Vol.27. – №5. –P. 812-826. 178. Xu, Y. The t(14;18) in diffuse large B-cell lymphoma correlation with germinal center-associated markers and clinical features / Y. Xu, R.W.McKenna, J.E. Doolittle et al. // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. – 2005. – Vol. 13(2). P. 116123. 179. Yan, C. P53 gene mutations in non-Hodgkin’s lymphoma / C.Yan, X. Zhifu, L. Huiyu, et al. // Journal of Tongji Medical University. – 1999. – Vol. 19. – Issue 1. – P.27-30. 180. Yerushalmi, R. Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential / R. Yerushalmi, R. Woods, P.M. Ravdin // Lancet Oncol. – 2010. – Vol. 11 (2). – Р. 174–183. 128 181. Yin, C.C. Molecular Detection of t(14;18)(q32;q21) in Follicular Lymphoma / C.C.Yin, R. Luthra // Hematological Malignancies Methods in Molecular Biology. – 2013. – P. 203-209. 182. Youle, R.J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death / R.J. Youle, A.Strasse // Nature Reviews Molecular Cell Biology. – 2008. – Vol. 9. – P. 47-59. 183. Zhang, G.J. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression, histological grade and prognosis in invasive breast cancers / G.J. Zhang, I. Kimijima, R. Abe // Anticancer Res. – 1998. – Vol.18. – P. 1989–1998. 184. Zhong, C. Expression of multidrug-associated protein, P-glycoprotein, P53 and Bcl-2 proteins in bladder cancer and clinical implication / C. Zhong, Z. Yongxing, Z. Xu // Journal of Tongji Medical University. – 2001. – Vol. 21(1). – P. 56-58. 185. Ziepert, M. Standard International prognostic index remains a valid predictor of outcome for patients with aggressive CD20+ B-cell lymphoma in the rituximab era / M. Ziepert, D. Hasenclever, E. Kuhnt // J. Clin. Oncol. – 2010. – Vol. 28(14). – P. 2373-2380.
