p Лекция 2. Ферментативная кинетика. Модуль 2. Метаболизм

p
Модуль 2. Метаболизм клетки
Лекция 2. Ферментативная кинетика.
Введение
Кинетика играет определяющую роль в регулировании процессов в организованных
биологических системах, которые протекают в них с определенной скоростью и в
определенной последовательности. Проблема кинетического поведения сложной системы
сводится к построению и анализу математической модели, в которой скорости изменения
концентраций различных составных компонентов были бы выражены через скорости
отдельных элементарных реакций, принимающих участие в их образовании и исчезновении.
Поэтому перед рассмотрением простых математических моделей описывающих протекание
биохимических реакций, мы с вами познакомимся с кинетикой химической и биохимической
реакций.
Часть А. Кинетика простой химической реакции
Замкнутая равновесная система - это простой пример химической модели. В такой системе
окончательный
химический
состав
полностью
определяется
количественным
и
качественным составом исходных компонентов; точнее любая компонента однозначно
определяется по всем остальным. Катализаторы не меняют состояния равновесия замкнутой
системы (определяемого константами равновесия), а влияют только на скорость протекания
процессов (рис.1).
Рис.1. Замкнутая равновесная система
Образование продукта (C) происходит быстро в начале реакции и замедляется ближе к концу
реакции (рис.2.).
٠1٠
C
Рис.2. Скорость протекания реакции
На графике накопления продукта (C) в смеси хорошо видно, что при одном и том же
интервале времени t изменение концентрации C в начале реакции больше, чем в конце
реакции. Таким образом, скорость химического превращения может постоянно меняться в
ходе реакции.
Чем больше концентрация молекул (А) или (B) в смеси, тем больше вероятность
столкновения между ними. Если обозначить буквами А и B (в квадратных скобках) молярные
концентрации этих веществ, то скорость реакции будет пропорциональна произведению этих
молярных концентраций:
v [моль/л.сек] = [А моль/л][Б моль/л]
(1)
Моль - это такое количество вещества, в котором содержится определенное
число частиц (молекул, атомов, ионов), равное постоянной Авогадро.
Постоянная Авогадро N A определяется как число атомов, содержащееся в 12 г
изотопа 12С и содержит 6,02 • 1023 частиц этого вещества.
Заметим, что в полученном нами выражении для скорости химической реакции размерности
левой и правой части не совпадают. Для того чтобы выровнять размерности в правой и левой
частях уравнения, вводят коэффициент пропорциональности. Обозначим его буквой k и
присвоим ему размерность "л/моль.сек". Тогда уравнение (1) примет такой вид:
v = k[А][Б]
(2)
Коэффициент k не зависит от концентраций [А] и [Б]. Эти концентрации (как и скорость)
могут изменяться в ходе реакции, но значение k сохраняется постоянным для данной реакции
в выбранных условиях. Поэтому коэффициент k называют константой скорости реакции.
Уравнение (2) называется кинетичесим уравнением для реакций типа А + B = C.
٠2٠
Некоторые реакция происходит в результате одновременного столкновения трех частиц.
Например, для реакции 2А + B = C кинетическое уравнение должно выглядеть так:
v = k[А][А][B] или v = k[А]2[B] (3)
В общем случае, для реакции
aA +bB + cC = dD + eE + fF + … (4)
кинетическое уравнение для скорости реакции записывается следующим образом:
v = k[A]a[B]b[C]c
(5)
Оно представляет собой произведение концентраций реагентов, каждая из которых взята в
степени, равной числу молей соответствующего вещества в полном уравнении реакции. Это
не что иное, как математическая запись закона действия масс.
При постоянной температуре скорость химической
пропорциональна произведению молярных концентраций реагентов.
реакции
прямо
Часть Б. Кинетика простых биохимических реакций.
В биологических объектах, биохимические реакции относятся к открытым системам, в
которых состояние термодинамического равновесия не достигается, так как количество
первоначального вещества (X) — предшественника не истощается вследствие того, что его
коцентрация поддерживается на постоянном уровне специальными механизмами (например
активные насосы, каналы) или поведением самого организма (например перемещение).
Однако, биологическая система может тем не менее достичь того состояния, при котором ее
химический состав больше не будет меняется; такое состояние называется стационарным
или установившимся (рис.3).
Рис.3. Открытая система в стационарном состоянии
٠3٠
Стационарное состояние существенно отличается от состояния равновесия тем, что на него
оказывают влияние катализаторы, поэтому концентрация компоненты A определяется
выражением
A = kxX (KAB KBC / ky + KAB/kBC + 1/kAB) (6), где
K — константа равновесия
k — константа скорости реакции
Необходимо отметить, что в отличие от равновесной системы в выражении присутствует
константа равновесия (K) и константа скорости реакции (k). Это означает, что равновесие
реакции зависит как от вида катализатора, так и от его количества. Следовательно,
характеристики биологических систем можно регулировать с помощью катализаторов, и
возможно, этот способ используется организмом для поддержания или изменения его
специфических
динамических
состояний.
Очевидно,
что
если
количество
и
вид
катализаторов определяются наследственно, то и изменения наследственных факторов
сказывается количественно на функциональном состоянии организма.
Например: Превращения салидрозида в золотом корне (Rhodiola rosea L.) зависит от
активности экспрессии гена TryDC, кодирующих ключевой фермент биосинтеза tyrosine
decarboxylase.
(1)
(2)
(3)
(4)
Tyrosine → Tyramine → 4-hydroxy-phenylacetaldehyde → Tyrosol → Salidroside
(1) - tyrosine decarboxylase
(2) - tyramine oxydase
(3) - aryl alcohol dehydrogenase
(4) - вероятно за счет работы УДФ-глюкозапирофосфорилаза (еще не подтверждено).
Установлено, что уровень экспрессии гена различен у растений вида R.rosea разных
популяций.
Стабильность открытой системы зависит от присутствия в ней катализаторов и поэтому
превращение A ↔ B ↔ C не всегда единственно возможное. В присутствии других
٠4٠
катализаторов реакция может идти так как показано на рис. 4.
Рис. 4. Зависимость стационарного состояния открытой системы от катализаторов
Число возможных реакций зависит от термодинамических свойств вещества A, а какая
именно реакция осуществится зависит от катализатора.
Например: Превращения розина в золотом корне (Rhodiola rosea L.) зависит от активности
ферментов, которые присоединяют молекулы arabinose или arabinofuranose.
Rosin → Rosavin (1)
→ Rosarin (2)
(1)- присоединение arabinose
(2) - присоединение arabinofuranose
При наборе различных ферментов стационарное состояние в системе никогда не
установиться, так как относительное количество катализаторов будет все время меняться и
поэтому, константы входящие в выражение для концентраций не будут постоянными. Однако
известно, что организм способен обеспечить сохранение постоянных условий в течение
времени, значительно превышающего период полусуществования некоторых ферментов.
Следовательно, необходимо предположить, что ферменты вырабатываются в организме с
такой же скоростью, с какой убывает их количество.
Ферменты ― это органические соединения, обычно белковой природы, которое
ускоряет или вызывает путем каталитического действия изменения субстрата, к
которому оно специфично.
Рис. 5. Структура амилазы.
٠5٠
Амилаза — фермент расщепляющий
крахмал до олигосахаридов. В истории амилаза
стала первым открытым ферментом. Именно
амилаза приводит к появлению сладковатого
вкуса при длительном пережёвывании крахмалсодержащих продуктов (например, из риса или
картофеля), но без добавления сахара. Амилаза
присутствует в слюне (птиалин), где начинает
процесс пищеварения.
Особенности ферментов как биологических катализаторов
1. Высокая эффективность действия. Ферменты могут ускорять реакцию в 108-1012 раз.
2. Высокая избирательность ферментов к субстратам (субстратная специфичность) и к
типу катализируемой реакции (специфичность действия).
3. Высокая чувствительность ферментов к неспецифическим физико-химическим
факторам среды - температуре, рН, ионной силе раствора и т.д.
4. Высокая чувствительность к химическим реагентам.
5. Высокая и избирательная чувствительность к физико-химическим воздействиям тех
или иных химических веществ, которые благодаря этому могут взаимодействовать с
ферментом, улучшая или затрудняя его работу.
Наиболее простым выражением механизма ферментативной реакции является реакция, в
которой субстрат необратимо превращается в продукт одним из ферментов (теория
Михаэлиса-Ментен). Эта реакция может быть схематически представлена в виде двух
стадий:
k1
k2
E + S ↔ ES → E +P (7), где
S — субстрат,
k-1
E — фермент,
SE — фермент-субстратный комплекс,
P — продукт.
Субстратом (S) называют вещество, химические превращения которого в продукт (Р)
катализирует фермент (Е). Тот участок поверхности молекулы фермента, который
непосредственно взаимодействует с молекулой субстрата, называется активным центром
фермента.
Активный центр фермента образован на уровне третичной структуры белка-фермента. В его
пределах различают адсорбционный участок и каталитический участок. Вне активного
центра фермента встречаются особые функциональные участки; каждый из них обозначают
термином аллостерический центр.
٠6٠
Адсорбционный центр - это участок активного центра молекулы фермента, на котором
происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. Главная функция адсорбционного
центра - связывание молекулы субстрата и передача этой молекулы каталитическому центру
в наиболее удобном положении для каталитического центра. Связывание субстрата с
адсорбционным центром происходит за счет слабых типов связей и потому является
обратимой. По мере формирования этих связей происходит конформационная перестройка
адсорбционного центра, которая приводит к более тесному сближению субстрата и активного
центра фермента. Структура адсорбционного центра определяет субстратную специфичность
фермента.
Каталитический центр - это область активного центра фермента, которая участвует в
химических преобразованиях субстрата. Формируется он за счет радикалов двух, иногда трех
аминокислот, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но
пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи.
Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, в результате
присоединения
к
какого
определенного
низкомолекулярного
(а
ино-гда
-
и
высокомолекулярного) вещества изменяется третичная структура белковой молекулы.
Вследствие этого изменяется конфигурация активного центра, сопро-вождающаяся либо
увеличением, либо понижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в
основе да называемой аллостерической регуля-ции каталитической активности ферментов.
Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих,
помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофактор, кофермент),
присутствие которого является абсолютно необходимым для каталитической активности.
Кофакторы могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с
полипептидной цепью. Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.
Классификация ферментов
I класс - оксидоредуктазы
К данному классу относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные
реакции. При окислении может происходить либо отнятие водорода от окисляемого
٠7٠
вещества, либо присоединение кислорода к окисляемому веществу. В зависимости от
способа окисления различают следующие подклассы оксидоредуктаз:
II класс - трансферазы
Катализируют реакции переноса химических групп с молекулы одного вещества на молекулу
другого вещества.
III класс - гидролазы
Катализируют реакции разрушения химических связей с участием воды.
IV класс - лиазы
Катализируют реакции разрушения химических связей без участия воды.
V класс - изомеразы
Катализируют реакции изомерных превращений.
VI класс - лигазы (сингазы, синтетазы)
Катализируют реакции синтеза.
Основные этапы ферментативного катализа
Различают три основных этапа ферментативного катализа.
1 этап.
Ориентировочная сорбция субстрата на активном центре фермента с образованием
обратимого
E-S
комплекса
(фермент-субстратного).
На
этом
этапе
происходит
взаимодействие адсорбционного центра фермента с молекулой субстрата. При этом и
٠8٠
субстрат подвергается конформационной перестройке. Все это происходит за счет
возникновения слабых типов связей между субстратом и адсорбционным центром фермента.
В результате этого молекула субстрата подается на каталитический центр в наиболее удобном
для него положении. Этот этап является легко обратимым, потому что здесь участвуют
только слабые типы связей.
2 этап.
Химические превращения молекулы субстрата в составе фермент-субстратного комплекса с
образованием комплекса фермента с химически преобразованным субстратом. На этом этапе
разрываются одни ковалентные связи и возникают новые. Поэтому этот этап протекает
значительно медленнее, чем 1-й и 3-й этапы. Именно скорость второго этапа определяет
скорость всей ферментативной реакции в целом.
3 этап.
Десорбция готового продукта из его комплекса с ферментом. Этот этап протекает легче, чем
2-й. Он, как и 2-й этап, тоже необратим.
Кинетика ферментативных реакций
Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести
уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса–Ментен, выражающее
количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной
реакции:
(8),
где
v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S],
KS– константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л (которую можно
представить как отношение k–1/k+1),
Vmax– максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.
٠9٠
Из уравнения (8) следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении KS
скорость реакции является максимальной, т.е. v = Vmax. При низкой концентрации субстрата,
напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в
каждый данный момент.
Следует указать, что уравнение Михаэлиса–Ментен в его классическом виде не учитывает
влияние на скорость ферментативного процесса продуктов реакции, например в реакции
(9)
и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки
усовершенствовать его. Так, было предложено уравнение Бриггса-Холдейна:
(10)
где Кm представляет
собой константу Михаэлиса,
являющуюся
экспериментально
определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:
(11)
Отношение k–1/k+1 представляет собой константу диссоциации ферментсубстратного
комплекса KS, тогда:
(12)
Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше константы
диссоциации фермент-субстратного комплекса KS на величину k+2/k+1.
Для определения численного значения Кm обычно находят ту концентрацию субстрата, при
которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной Vmax, т.е.
v = 1/2 Vmaх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:
٠ 10 ٠
(13)
так как
Рис.6. Кривая уравнения Михаэли-са-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей
катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.
разделив обе части уравнения на Vmах, получим
(15)
Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при
которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной.
Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми-хаэлиса–Ментен,
обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой
фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации
субстрата (кинетическая кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер
наподобие кривой насыщения гемоглобина кислородом (рис.7).
Рис. 7. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом.
٠ 11 ٠
Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре
повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное
взаимодействие, как и в случае присоединения кислорода к 4 субъединицам гемоглобина.
Для оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину
максимальной, в условиях сигмоидного характера кинетической кривой обычно применяют
преобразованное уравнение Хилла:
(16),
где
где К' – константа ассоциации; n – число субстратсвязывающих центров.
٠ 12 ٠