ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
МАКАРОВА АЛЁНА СЕРГЕЕВНА
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ
И РАЗРАБОТКА АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЭВКАЛИПТА
ПРУТОВИДНОГО, ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО И ЗВЕРОБОЯ
ПРОДЫРЯВЛЕННОГО
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание учёной степени
кандидата фармацевтических наук
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
доцент Хазиев Р. Ш.
Научный консультант:
доктор медицинских наук,
профессор Мусина Л.Т.
КАЗАНЬ-2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................... 7
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................. 16
ГЛАВА 1. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ
И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЫРЬЯ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО,
ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО И ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) .......................................................................................... 16
1.1. Характеристика эвкалипта прутовидного как источника
получения лекарственных препаратов ....................................................... 16
1.1.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика
эвкалипта прутовидного ..................................................................................... 16
1.1.2. Терпеноидные фенолальдегиды – биологически активные соединения
растений рода Eucalyptus.................................................................................... 17
1.1.3. Разработка отечественных препаратов на основе липофильного
комплекса эвкалипта прутовидного .................................................................. 23
1.1.4. Современное состояние исследований по стандартизации сырья и
препаратов эвкалипта прутовидного................................................................. 28
1.1.5. Опыт применения эвкалипта прутовидного и
фитопрепаратов на его основе ........................................................................... 31
1.2. Характеристика шалфея лекарственного как источника
получения лекарственных препаратов ....................................................... 32
1.2.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика
шалфея лекарственного ...................................................................................... 32
1.2.2. Химический состав ................................................................................... 33
1.2.3. Фармакологическая активность сырья шалфея лекарственного и
препаратов на его основе.................................................................................... 40
1.2.4. Оценка методов стандартизации листьев шалфея
лекарственного и фитопрепаратов на их основе ............................................. 43
1.3. Характеристика зверобоя продырявленного как источника
получения лекарственных препаратов ....................................................... 44
3
1.3.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика
зверобоя продырявленного ................................................................................ 45
1.3.2. Производные флороглюцина как основные БАВ,
отвечающие за антибактериальную активность сырья ................................... 46
1.3.3. Стандартизация травы зверобоя по содержанию
производных флороглюцина ............................................................................. 48
1.3.4. Разработка отечественных антимикробных препаратов из травы
зверобоя продырявленного ................................................................................ 49
Выводы к главе 1 ................................................................................................ 55
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................... 56
2.1. Объекты исследования ............................................................................. 56
2.2. Методы исследования ............................................................................... 57
2.2.1. Методы обнаружения и идентификации БАВ ....................................... 57
2.2.2. Методы количественного определения БАВ ......................................... 59
2.2.2.1. Методы количественного определения
терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного ........... 59
2.2.2.2. Метод количественного определения дитерпеновых
кислот в сырье и извлечениях шалфея лекарственного ................................. 62
2.2.2.3. Метод количественного определения гидроксикоричных
кислот .................................................................................................................. 64
2.2.3. Метод оценки антибактериальной активности извлечений из
сырья на культуре S.aureus ................................................................................ 65
2.2.4. Метод определения чувствительности штаммов S.aureus
к антибиотикам .................................................................................................... 67
ГЛАВА 3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ
И РАЗРАБОТКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА
ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО .......................................................................... 70
3.1. Совершенствование методов стандартизации листьев эвкалипта
прутовидного ...................................................................................................... 70
3.1.1. Оценка содержания фенолальдегидов в образцах листьев
4
эвкалипта прутовидного различными методами ............................................. 70
3.1.2. Разработка методики количественного анализа
терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного ........... 72
3.1.3. Разработка методик качественного анализа листьев
эвкалипта прутовидного ..................................................................................... 80
3.1.4. Изучение зависимости между содержанием
фенолальдегидов в извлечении из листьев эвкалипта прутовидного
и антибактериальной активностью ................................................................... 81
3.1.5. Основные показатели и нормы качества листьев эвкалипта
прутовидного ....................................................................................................... 82
3.2. Разработка технологии получения антибактериального
препарата из листьев эвкалипта прутовидного ......................................... 83
3.2.1. Изучение динамики высвобождения фенолальдегидов
из сырья ................................................................................................................ 83
3.2.2. Оценка антибактериальной активности препарата
из листьев эвкалипта прутовидного .................................................................. 87
3.2.3. Подходы к стандартизации антибактериального препарата
из листьев эвкалипта прутовидного .................................................................. 91
3.2.4. Основные показатели и нормы качества
антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного ............ 93
Выводы к главе 3 .............................................................................................. 95
ГЛАВА 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ
СТАНДАРТИЗАЦИИ И ТЕХНОЛОГИИ ИЗВЛЕЧЕНИЙ
ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ............................................................................. 96
4.1. Оценка
объективности
метода
количественного
определения
дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного ............................... 96
4.2. Изучение кинетики экстракции дитерпеновых кислот из сырья ............ 99
4.3. Математическая модель экстракции дитерпеновых кислот при
тонком измельчении ......................................................................................... 105
4.4. Совершенствование технологии извлечений из листьев
5
шалфея лекарственного .................................................................................... 115
4.5. Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях
шалфея лекарственного .................................................................................... 112
4.6. Основные показатели и нормы качества
листьев шалфея лекарственного ...................................................................... 119
Выводы к главе 4 ............................................................................................ 120
ГЛАВА 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ
И РАЗРАБОТКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА
ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО .................................................................... 121
5.1. Совершенствование
методов
стандартизации
травы
зверобоя
продырявленного............................................................................................... 121
5.1.1. Обнаружение и идентификация производных флороглюцина
в траве H. perforatum и H. maculatum .............................................................. 121
5.1.2. Оценка
антибактериальной
активности
извлечений
из
травы
H. perforatum и H. maculatum ........................................................................... 123
5.1.3. Разработка методики количественного определения суммы
производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного .................. 123
5.1.4. Разработка методик качественного анализа травы
зверобоя продырявленного .............................................................................. 126
5.1.5. Основные показатели и нормы качества травы зверобоя
продырявленного, применяемой для получения
антибактериальных препаратов ....................................................................... 127
5.2. Разработка технологии получения антибактериального
препарата из травы зверобоя продырявленного ...................................... 128
5.2.1. Технология антибактериального препарата из травы
зверобоя продырявленного .............................................................................. 128
5.2.2. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из травы
зверобоя продырявленного .............................................................................. 131
5.2.3. Основные показатели и нормы качества
антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного ........ 134
6
Выводы к главе 5 ............................................................................................ 140
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................... 141
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................... 144
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 145
ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................... 159
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Эфиромасличные и флавоноидсодержащие растения
составляют основной массив наиболее популярных и широко используемых
лекарственных растений (ЛР) как отечественной, так и мировой медицины.
Например, в Государственной Фармакопее (ГФ) ХI издания из 88 видов
лекарственного растительного сырья (ЛРС) по содержанию эфирного масла
стандартизуется 17 видов, а по содержанию флавоноидов 11 видов, т.е. в сумме
около трети. В Европейской фармакопее 27 видов ЛРС стандартизуются по
содержанию эфирного масла и 18 – по содержанию флавоноидов. С другой
стороны, интенсивное изучение химического состава этих ЛР приводит к
открытию в них новых групп природных соединений, ответственных за те или
иные виды биологической активности, которые ранее приписывались уже
известным соединениям этих растений (например, компонентам эфирного масла).
К таким ЛР, безусловно, можно отнести широко применяемые в медицинской
практике
эфиромасличные растения: виды
эвкалиптов (в РФ основной
используемый вид – Eucalyptus viminalis Labill.) и шалфей лекарственный
(Salvia officinalis L.). Открытие японскими учеными в начале 80-х годов прошлого
века в Eucalyptus globulus Labill., соединений, названных эуглобалями, дало
начало интенсивному изучению этой новой группы природных соединений из
класса терпеноидных фенолальдегидов. Эти соединения проявляют различные
виды биологической активности, в том числе и антибактериальную в отношении
грамположительной микрофлоры. Отечественными учеными на основе сырья
эвкалипта прутовидного был разработан эффективный антибактериальный
препарат «Эвкалимин» и предложена его стандартизация по сумме терпеноидных
фенолальдегидов. Вышедшие в последние годы нормативные документы (НД)
различных отечественных производителей наряду с традиционным определением
в
листьях
эвкалипта
прутовидного
эфирного
масла,
предлагают
его
стандартизацию по содержанию суммы фенолальдегидов. К сожалению,
8
предлагаемые методы определения этих соединений в сырье и препаратах
эвкалипта страдают неточностью и нуждаются в усовершенствовании.
В шалфее лекарственном были также открыты новые группы биологически
активных веществ (БАВ) – дитерпеновые кислоты и производные розмариновой
кислоты,
проявляющие
высокую
антиоксидантную
и
антибактериальную
активность. Отечественная промышленность выпускала антибактериальный
препарат из листьев шалфея «Сальвин», а в ВИЛАРе в 70–80 годах прошлого века
активно разрабатывался антибактериальный препарат «Донельвин» на основе
дитерпеновых соединений из корней шалфея лекарственного. К сожалению,
действующая НД на листья шалфея, как отечественная, так и зарубежная, не
предусматривают стандартизацию этого сырья по вышеописанным соединениям.
В
РФ
официнальными
продырявленный
(Hypericum
являются
два
perforatum
вида
L.)
зверобоя
и
–
зверобой
зверобой
пятнистый
(четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz.). Их действующим началом в
отечественной практике признаются флавоноиды, по содержанию которых и
осуществляется стандартизация сырья. С другой стороны, именно отечественным
ученым
принадлежит
гиперфорина
и
его
приоритет
открытия
производных
в
(особого
зверобое
класса
продырявленном
ацилфлороглюцинов),
проявляющих высокую антибактериальную активность. В СССР был разработан
препарат из травы зверобоя продырявленного – «Новоиманин», действующим
началом
которого
признавались
гиперфорин
и
его
производные,
но
стандартизация осуществлялась только по антибактериальному титру.
К сожалению, все упомянутые выше растительные антибактериальные
препараты в настоящее время на фармацевтическом рынке РФ отсутствуют, хотя
антибактериальный
препарат
из
листьев
эвкалипта
прутовидного
«Хлорофиллипт» и его аналоги представлены и занимают устойчивое положение.
Все это делает задачу поиска новых подходов к стандартизации указанных
видов сырья и разработке усовершенствованных антибактериальных препаратов
на их основе с чётко контролируемыми параметрами качества современной и
назревшей.
9
Степень разработанности темы. Поиск в химическом составе ЛРС
соединений с антибактериальной активностью занимает важное место в
современной науке, о чём свидетельствует большой объём публикаций в
специализированных
научных
журналах.
В
изучении
терпеноидных
фенолальдегидов листьев эвкалипта (основных носителей антибактериальной
активности сырья) выделяются группы японских исследователей (T.Masuda,
J.P. Sihgh, M. Мurata и др.). Изучением фенолальдегидов в СССР занималась
группа исследователей ВИЛАРа под руководством А.А. Савиной. Разработке
препаратов антимикробного действия на основе листьев эвкалипта посвящены
работы
Н.М. Крутиковой, В.Л. Надтока, И.Н. Зилфикарова.
Комплексный
препарат на основе листьев шалфея лекарственного был разработан научной
группой под руководством И.А. Дербенцевой; впервые было показано, что
ответственными за антимикробную активность сырья являются дитерпеновые
кислоты (кислота карнозоловая). Вопросами стандартизации листьев шалфея
лекарственного, а также разработке препаратов на их основе с контролируемыми
показателями качества активно занимаются в ЗАО «Вифитех» под руководством
И.Н. Зилфикарова. В результате исследования антимикробных веществ зверобоя
продырявленного группой научных сотрудников Института микробиологии АН
УССР В.Г. Дроботько, Б.Е. Айзенман, П.И. Киселем, М.О. Швейгер и С.И.
Зелепухой был изучен и внедрен в медицинскую практику антимикробный
препарат иманин (гиперфорин и его производные). Изучением антимикробных
свойств препаратов на основе листьев зверобоя продырявленного занимались
С.И. Зелепуха, Н.А. Дербенцева, А.С. Рабинович и другие. Однако, несмотря на
многолетний опыт исследований в области изучения описанных видов ЛРС,
задачи по стандартизации сырья и получению усовершенствованных препаратов
на его основе решены не в полной мере.
Цель и задачи исследования. Целью работы является совершенствование
методов определения
групп
соединений, обладающих
антибактериальной
активностью, в листьях эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и траве
10
зверобоя продырявленного и их выделения для получения антибактериальных
препаратов.
При достижении поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Провести аналитический обзор данных литературы по современному
состоянию исследований в области анализа листьев эвкалипта прутовидного,
шалфея
лекарственного
и
травы
зверобоя
продырявленного
и
методов
стандартизации лекарственных препаратов, разработанных на их основе.
2. Разработать методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного,
шалфея
лекарственного
определения основной
и
травы
группы
зверобоя
продырявленного
БАВ, отвечающей
с позиций
за антибактериальную
активность.
3. Оценить уровень антибактериальной активности извлечений из листьев
эвкалипта
прутовидного,
шалфея
лекарственного
и
травы
зверобоя
продырявленного в отношении грамположительных микроорганизмов (на
примере
S. aureus)
для
изучения
возможности
получения
новых
антибактериальных препаратов.
4. Разработать оптимальные условия экстракции БАВ, отвечающих за
антибактериальную активность, из изучаемых видов ЛРС.
5. Предложить
методы
анализа
полученных
препаратов
с
антибактериальной активностью.
6. Изучить возможность комплексной переработки ЛРС, обладающего
антибактериальным действием.
Научная новизна. Была показана возможность целевой экстракции
действующих веществ эвкалипта прутовидного (суммы фенолальдегидов),
шалфея
лекарственного
(суммы
дитерпеновых
кислот),
зверобоя
продырявленного липофильными растворителями.
Впервые для интерпретации экспериментальных данных, полученных при
экстракции дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного, была
сформулирована математическая модель взаимодействия целевых соединений с
11
внутриклеточными структурами сырья. В результате апробации модели показано,
что общая схема экстрагирования может быть сведена к рассмотрению
«свободной» и «связанной» фракций целевых соединений.
Впервые обоснована целесообразность проведения стандартизации листьев
шалфея
по
двум
группам
природных
соединений
–
дитерпеновым
и
гидроксикоричным кислотам.
На основании целевой экстракции действующих веществ разработаны
спектрофотометрические
методики
стандартизации
листьев
эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного.
Предложен рациональный способ получения антибактериального препарата
из листьев эвкалипта прутовидного на основе целевой экстракции терпеноидных
фенолальдегидов, активного в отношении грамположительных микроорганизмов,
в том числе и антибиотикорезистентных штаммов золотистого стафилококка.
Подана
заявка
на
заявки: 29.09.2014).
изобретение
Разработаны
(№ заявки
методы
2014139368/15,
стандартизации
дата
подачи
препарата
по
конкретной группе БАВ, отвечающей за антибактериальную активность –
фенолальдегидам.
Впервые в рамках изучения возможности комплексного использования травы
зверобоя продырявленного предложена схема переработки сырья, включающая в
себя две основные стадии: первая – получение антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного на основе целевой экстракции производных
гиперфорина; вторая – получение из оставшегося шрота настойки, содержащей
соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).
Теоретическая и практическая значимость. Предложены подходы к
стандартизации ЛРС эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного, зверобоя
продырявленного и препаратов на его основе по конкретной группе БАВ,
отвечающей за антибактериальную активность.
Разработанные методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного (по
терпеноидным фенолальдегидам), шалфея лекарственного (по дитерпеновым
кислотам) и травы зверобоя продырявленного (по производным гиперфорина)
12
используются в учебном процессе на кафедре фармакологии фармацевтического
факультета с курсами фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «КазГМУ» при
изучении подходов к стандартизации указанных ЛР (акт внедрения ГБОУ ВПО
«КазГМУ» от 20.02.2015), апробированы в процессе работы Казанского филиала
ФГБУ «Информационно-методического центра по экспертизе, учёту и анализу
обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (акт внедрения
от 20.02.2015) и предприятия ОАО «Татхимфармпрепараты» (акт внедрения от
26.02.2015). Разработаны проекты изменения к фармакопейным статьям (ФС) на
описанные виды сырья.
Предложен способ получения антибактериального препарата на основе
листьев эвкалипта прутовидного, показатели качества и методы их оценки.
Установлен уровень антибактериальной активности препарата, превосходящий
таковую у растительных препаратов – «Хлорофиллипта», «Галенофиллипта».
Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата на
основе листьев эвкалипта прутовидного» был отмечен Венчурным фондом
Республики Татарстан в рамках проводимого конкурса «50 инновационных идей
для Республики Татарстан» как перспективный для решения проблемы
эффективной
и
рациональной
заболеваний,
в
том
числе
антибактериальной
заболеваний,
терапии
инфекционных
индуцированных
микрофлорой,
резистентной к большинству часто применяемых антибактериальных препаратов.
Методология и методы исследования. Методология диссертационного
исследования построена на изучении и обобщении литературных данных по
совершенствованию методов стандартизации объектов исследования и разработке
антибактериальных препаратов на их основе, оценке степени разработанности и
актуальности
темы.
В
процессе
исследования
использованы
методы:
тонкослойная хроматография, УФ-спектрофотометрия, технологические методы,
микробиологичексий метод. Данные исследований обработаны математическим
методом (Microsoft Excel 2013).
Связь
исследования
с
планом
научно-исследовательских
работ.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом
13
научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «КазГМУ» Минздрава России:
«Исследования
в
области
совершенствования
контроля
качества
ЛРС,
содержащего БАВ различной природы, с учетом перехода их в используемые
лекарственные формы» (№ Государственной регистрации 01201174259) и
программы
«Совершенствование
методов
стандартизации
и
разработка
антимикробных препаратов эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и
зверобоя продырявленного» (№ Государственной регистрации 114120240054).
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследований по разработке методов стандартизации листьев
эвкалипта
прутовидного,
шалфея
лекарственного
и
травы
зверобоя
продырявленного по основным группам БАВ, отвечающих за антибактериальную
активность.
2. Математическая модель экстрагирования дитерпеновых кислот из листьев
шалфея лекарственного.
3. Экспериментальные данные по разработке препаратов на основе изучаемых
видов ЛРС при рассмотрении фенолальдегидов (листья эвкалипта прутовидного),
дитерпеновых и гидроксикоричных кислот (листья шалфея лекарственного) и
производных гиперфорина (трава зверобоя продырявленного) в качестве
основных веществ, ответственных за антибактериальную активность.
4. Методы, используемые для стандартизации антибактериальных препаратов из
листьев эвкалипта прутовидного и травы зверобоя продырявленного.
5. Результаты по оценке антибактериальной активности препарата из листьев
эвкалипта прутовидного в отношении штаммов S. aureus, в том числе
антибиотикоустойчивых.
6. Схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного.
Степень
достоверности
результатов
исследования.
Достоверность
полученных результатов определяется достаточным объёмом проведенных
исследований,
применяемыми
современными,
информативными
исследования, статистической достоверностью полученных данных.
методами
14
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 86-ой
Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл-корр. Академии
наук РТ, проф. И.Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012 г.); 87-ой Всероссийской
научно-практической конференции студентов и молодых учёных, посвящённой
155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013); 88-ой
Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных,
посвящённой 200-летию КГМУ (Казань, 26-27 марта 2014); Российской научнопрактической
конференции
«Актуальные
вопросы
повышения
качества
подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.); Российской
научно-практической конференции «Эффективная аптека – новые технологии и
возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и менеджеров аптек
и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014 г.); Российской научно-практической
конференции «Актуальные вопросы повышения качества дополнительного
профессионального образования фармацевтических кадров» » (Казань, 19 марта
2015 г.).
Научно-исследовательский
проект
«Разработка
антибактериального
препарата из листьев эвкалипта прутовидного» стал победителем конкурса
«50 инновационных идей для Республики Татарстан» (Казань, 2014), финалистом
«Молодёжного научно-инновационного конкурса» Фонда содействия развитию
малых форм предприятий в научно-технической сфере (Казань, 2014).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 16 печатных
работ, в том числе 4 работы в рецензируемых журналах из перечня ВАК
Минобрнауки РФ, 1 работа в журнале, входящем в базу данных «Scopus».
Личный вклад автора. Результаты, изложенные в диссертации, получены
на базе экспериментов, проводимых лично автором. В рамках работы проведены
исследования по разработке подходов к стандартизации листьев эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного. .
Разработаны проекты изменения к фармакопейным статьям на описанные виды
сырья.
Предложен
способ
получения
и
методы
стандартизации
антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного, проявляющего
15
антибактериальную
активность
в
отношении
грамположительных
микроорганизмов (на примере S. aureus), в том числе и антибиотикоустойчивых
штаммов по сравнению с имеющимися аналогами. Автором предложена схема
комплексной переработки травы зверобоя продырявленного, включающая в себя
получение препарата антибактериального действия и настойки.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на
158 страницах машинописного текста, содержит 43 таблицы и 34 рисунка.
Диссертация состоит из введения, основной части (обзор литературы, описание
объектов и методов исследования, 3-и главы экспериментальных исследований),
заключения, списка литературы, включающего в себя 129 источников, из которых
67 на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель
и задачи, отмечена научная новизна и практическая значимость работы, изложены
положения, выносимые на защиту. Глава 1 содержит систематизированный обзор
литературы по современным исследованиям ЛРС (эвкалипта прутовидного,
шалфея
лекарственного
и
зверобоя
продырявленного),
обладающего
антибактериальной активностью. Систематизированы данные литературы о
химическом составе, биологической активности и вопросам стандартизации
сырья. В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования.
Описаны методики обнаружения и идентификации, количественного анализа БАВ
эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного.
В главе 3-5 приводятся результаты собственных исследований по разработке
подходов к стандартизации ЛРС с позиций определения основной группы БАВ,
отвечающей за антибактериальную активность; разработке препаратов на основе
изучаемых видов ЛРС и методов их анализа; оценке уровня антибактериальной
активности извлечений из ЛРС; изучению возможности комплексной переработки
сырья.
В приложение вынесены материалы¸ подтверждающие практическую
значимость
диссертационного
исследования:
фармакопейным статьям на сырьё, акты внедрения.
проекты
изменения
к
16
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ И
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЫРЬЯ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО, ШАЛФЕЯ
ЛЕКАРСТВЕННОГО И ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Характеристика эвкалипта прутовидного как источника получения
лекарственных препаратов
В отечественной медицинской практике применяются три вида эвкалипта:
эвкалипт шариковый (голубой) – E. globulus, эвкалипт пепельный (серый) –
E. cinerea и эвкалипт прутовидный – E. viminalis, сем. Миртовые (Myrtaceae).
Согласно действующей НД качество листьев эвкалипта оценивается по
содержанию эфирного масла (ФС 15 Государственной Фармакопеи (ГФ) XI
издания).
Применение эвкалипта в медицинской практике как сырья для получения
галеновых препаратов в домашних условиях, так и в составе различных
очищенных экстракционных препаратов обусловлено главным образом наличием
у
сырья
антибактериальных
и
противовоспалительных
свойств
[12, 54, 99, 105, 107].
1.1.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика
эвкалипта прутовидного
Род Eucalyptus является весьма многочисленным и насчитывает более 800
видов. Родина эвкалиптов – Австралия, Тасмания, Новая Гвинея и ряд соседних
островов, где они составляют большую часть лесной растительности и придают
ей характерный внешний вид.
Некоторые виды эвкалипта культивируют в субтропических странах, в
бывших странах СНГ — на Черноморском побережье Кавказа, главным образом в
Абхазии и Аджарии, где температура зимой не опускается ниже -10 °С. Эвкалипт
17
прутовидный как самый морозоустойчивый вид широко культивируют в Западной
Грузии, на Черноморском побережье Краснодарского края, а также в
Ленкоранском районе Азербайджана [80].
Эвкалипт прутовидный достигает высоты 50 м. Молодые листья
расположены
супротивно,
сидячие
или
стеблеобъемлющие,
узко-
или
широколанцетовидные, блестящие, светло- или темно-зеленые, длиной 5 - 10 см,
шириной 1,5 - 3 см. Старые листья черешковые, светло-зеленые, ланцетовидные
или серповидные, длиной 11 - 18 см, шириной 1,5 - 2 см. Цветки собраны в
пазушные зонтики. Плоды – деревянистые коробочки, шаровидные или
кубарчатые, диаметром 5 - 8 мм.
1.1.2. Терпеноидные фенолальдегиды – биологически активные соединения
растений рода Eucalyptus
Долгое время эвкалипт был известен эфирным маслом (Oleum Eucalypthi),
получаемым из сырья путём промышленной переработки. Эфирное масло широко
востребовано и в настоящее время: применяется как в чистом виде, так и в составе
ряда комбинированных лекарственных препаратов (ЛП).
До последнего времени согласно отечественной НД (ФС 278 ГФ X издания
«Лист эвкалипта», ФС 15 ГФ XI издания ФС 51 ГФ X издания “Эвкалиптовое
масло», ФСП 42-0002503404 «Эвкалиптовое масло, для местного применения») и
Европейской Фармакопее содержание эфирного масла (а в самом масле цинеола)
считалось основным показателем для оценки качества сырья и препаратов.
Эфирное масло разных видов эвкалипта различается по химическому
составу и по количеству преобладающего компонента. В соответствии с этим
эфирные
масла
E. polybractea,
пиперитоновые
делятсяследующим
E. smithii),
(E. dives),
образом:
фелландреновые
геранилацетатные
цинеольные
(E. globulus,
(E. australiana var. «B»),
(E. macarthuri),
цитрально-
цитронеллальные (E. citriodora), лимоненово-цитральные (E. staigeriana). Чистые
формы встречаются редко [28].
18
В начале 80-х годов прошлого века в различных видах эвкалипта японскими
учёными был обнаружен новый класс природных соединений – терпеноидные
фенолальдегиды. В зарубежной литературе за этими соединениями закрепился
термин «formylated phloroglucinol compounds» (FPC). Эти соединения оказались
уникальными для эвкалиптов, в других растениях они не обнаружены. Первой
опубликованной работа стала статья [87], сообщившая об открытии в E. globulus
соединения, названного эуглобалем III. На сегодняшний день описано около 50
соединений этого класса, которые подразделяются на 3 подгруппы – эуглобали,
макрокарпали и сидероксилонали. Самой многочисленной является первая – на
сегодняшний день выделено из различных видов эвкалипта 31 соединение этой
подгруппы, характерное строение которых приведено на Рисунке 1.
CHO
HO
O
C
O
HO
O
OHC
OH
OHC
H
OH
Эуглобаль III
Эуглобаль G1
CHO
CHO
H
O
HO
O
HO
OHC
OH
C
O
OH
H
Эуглобаль G5
Рисунок 1. Структурные
Эуглобаль V
формулы
некоторых
эуглобалей,
выделенных
из
различных видов эвкалиптов
Для эуглобалей характерно наличие хроманового фрагмента в молекуле,
однако это правило не выполняется для двух эуглобалей – G5 и V. Разнообразие
19
структуры соединений этой подгруппы обусловлено тем, что фенолальдегидный
фрагмент молекулы соединяется с различными терпеновыми остатками –
монотерпеноидной или сесквитерпеноидной природы. По этому признаку
эуглобали подразделяются на монотерпеновые и сесквитерпеновые.
Первым обнаруженным соединением из подгруппы макрокарпалей был
макрокарпаль А, выделенный японскими учёными из E. macrocarpa [105]. Для
макрокарпалей (Рисунок 2) характерно отсутствие хроманового цикла в молекуле.
Терпеноидный
фрагмент
всегда
имеет
сесквитерпеновую
природу.
На
сегодняшний день известно 12 представителей этой подгруппы фенолальдегидов.
CHO
HO
CHO
OH
H
OH
HO
OH
O
O
OHC
OHC
H
OH
OH
Макрокарпаль А 9' β–изобутил
Макрокарпаль am-1(эвкалиптон)
Макрокарпаль В 9' α–изобутил
Рисунок 2. Структурные формулы некоторых макрокарпалей, выделенных из
различных видов эвкалиптов.
CHO
CHO
HO
HO
OH
CHO
HO
HO
O
OH
CHO
O
CHO
CHO
OH
OH
OHC
OHC
OH
Сидероксилональ А β –изопропил
OH
Сидероксилональ С
Сидероксилональ В α –изопропил
Рисунок 3. Структурные формулы сидероксилоналей, выделенных из различных
видов эвкалиптов
20
Соединения
ряда
сидероксилоналей
были
впервые
выделены
из
E. sideroxylon группой учёных под руководством Н. Satoh [123]. Для этих
соединений также характерно наличие хроманового цикла (Рисунок 3), однако в
отличие от эуглобалей у сидероксилоналей терпеновый фрагмент замещён на
второй фенолальдегидный цикл. На сегодняшний день описано лишь 4
соединения этой подгруппы.
Предшественниками терпеноидных фенолальдегидов эвкалиптов являются
соединения грандинол, выделенный из E. grandis и дженсенон – из E. jensenii
(Рисунок 4). Из E. apodophylla, были выделены аналоги этих соединений [70].
CHO
CHO
HO
HO
OH
OHC
C
OH
OH
C
OH
O
Грандинол
O
Дженсенон
Рисунок 4. Структурные
формулы
фенолальдегидов,
выделенных
из
E. apodophylla
Интерес к группе терпеноидных фенолальдегидов возрос после того, как
для них были описаны различные виды биологической активности (Таблица 1).
Таблица 1.
Биологическая
активность
фенолальдегидов
различных
видов
эвкалиптов и их активных компонентов
Биологическая
активность
Ингибирование ВИЧ
обратной
транскриптазы
Виды
E. globulus
Активные
компоненты
Макрокарпали А, В,
С, Е
Источник
[108]
21
Продолжение таблицы 1
Биологическая
Виды
активность
Ингибирование вируса E. amplifolia,
Эпштейна-Барра
E. blakelyi,
E. globulus,
E. incrassatа,
E. grandis,
E. tereticornis
Активные
компоненты
Эуглобали
Источник
Противоопухолевая
активность
E. globulus,
E. grandis
Эуглобали III и G1
[68]
Ингибирование роста
клеток HeLa
E. sideroxylon
Сидероксилонали А
иВ
[123]
Ингибирование
альдозоредуктозы
E. sideroxylon
E. macrocarpa
Сидероксилонали А
иВ
Макрокарпали
Макрокарпали
[121]
[99,107]
[86,106,122]
[99,105,107]
[106]
[65]
[123]
[97]
[122]
[91]
Ингибирование
глюкозилтрансферазы
E. amplifolia,
E. globulus
Антибактериальная
активность
E. macrocarpa
E. globulus,
E. periniana
E. sideroxylon
Макрокарпали A-G
Макрокарпали
Грандинол
СидероксилоналиА
Противогрибковая
активность
E. globulus,
?
[66]
Изучением фенолальдегидов в СССР впервые начала заниматься научная
группа учёных ВИЛАРа под руководством А.А. Савиной. В работе [52]
сообщается о выделении из листьев E. viminalis соединения названного авторами
эувималь-1 (Рисунок 5).
22
CHO
HO
OH
H
OH
OHC
H
OH
Рисунок 5. Структурная формула эувималя 1, выделенного из листьев E. viminalis
Изучение
фенолальдегидов
исследовательскими
группами
по
E. viminalis
проводились
различными
нескольким
направлениям
–
изучался
химический состав, разрабатывались способы получения препаратов на их основе,
исследовалась биологическая активность [13, 38, 41, 45, 46]. В ряде обзоров,
посвященных фенолальдегидам эвкалиптов, их наличие в E. viminalis является
общепризнанным.
Однако
доказательства
этого
суждения
всегда
имеют
косвенный характер. Например, в исследовательском отчете [125] на основании
молекулярных весов отдельных компонентов E. viminalis, полученных методом
ГЖХ-МС, утверждается, что они могут принадлежать макрокарпалям A, B, D, E,
F, H, am-1, I, J, а также моно- и сесквитерпеновым эуглобалям и
сидероксилоналям. В тоже время результаты ВЭЖХ с использованием в качестве
свидетелей макрокарпалей A, B, G, am-1, сидероксилоналей А и С, показали
отсутствие этих соединений в E. viminalis. В работе [101] сообщается о
присутствии в E. viminalis эуглобалей на основании данных ТСХ и ВЭЖХ-МС. В
обзоре [84] о наличии фенолальдегидов в E. viminalis сообщается на основании
единственной ссылки на работу А.А. Савиной и др. [52]. Однако эувималь-1 был
размещён в сводной таблице в колонке «эвкалиптон» (или макрокарпаль am-1),
хотя таковым по структуре не является. Следует отметить, что это единственная
ссылка в зарубежных публикациях на работу А.А. Савиной и др. Ни в одной
работе больше об эувимале не упоминается. По структуре он наиболее близок к
макрокарпалям А и В, но отличается от них стереохимией некоторых
заместителей. Таким образом, признаётся, что E. viminalis является источником
терпеноидных фенолальдегидов, однако вопрос о химической структуре
23
соединений, содержащихся в данном виде эвкалипта, остаётся до сих пор
открытым.
1.1.3. Разработка отечественных препаратов на основе липофильного
комплекса эвкалипта прутовидного
Одновременно с изучением химического состава листьев эвкалипта
прутовидного активно проводилась работа по получению препаратов на основе
липофильного комплекса E. viminalis. На сегодняшний день известны следующие
препараты
отечественного
прутовидного
–
производства
«Эвкалимин»,
на
основе
«Хлорофиллипт»,
листьев
эвкалипта
«Галенофиллипт»,
«Хлорофиллин ОЗ».
В 1993 и 1995 гг. коллективом сотрудников ВИЛАРа были получены два
патента на способы получения препарата «Эвкалимин». Препарат представляет
собой очищенную сумму терпеноидных фенолальдегидов и тритерпеноидов,
выделенную из листьев эвкалипта прутовидного. За биологическую активность
ЛП признаны ответственными фенолальдегиды группы эуглобалей, однако их
природа не была расшифрована. Известно лишь, что фенолальдегиды, входящие в
состав «Эвкалимина», имеют брутто-формулу С23Н30О5 или С28Н38О5 и общий
фрагмент (Рисунок 6) [39, 46].
CHO
HO
R
O
C
O
OH
R1
R = H, C4H9 R1 = C4H9, H
Рисунок 6. Общий фрагмент химической структуры фенолальдегидов, входящих в
состав препарата «Эвкалимин»
Согласно ФС 42-3606-98 «Эвкалимин – Государственный стандартный
образец» должен содержать не менее 40% суммы фенолальдегидов. Важно, что
24
эвкалимин показал высокую антибактериальную активность в отношении
стафилококка, стрептококка, туберкулезных микобактерий, дифтерийных палочек
и других грамположительных микроорганизмов, в том числе с высокой степенью
антибиотикорезистентности [13, 54].
В
1990
году
препарат
«Эвкалимин»
был
зарегистрирован
в
Государственном Реестре лекарственных средств (ГРЛС) как антибактериальное
и противовоспалительное средство и стал выпускаться ПЭЗ ВИЛАРа в форме
0,25% и 1% спиртовых растворов. В 1997 году исследования по изучению
антибактериальной активности препарата «Эвкалимин» были обобщены в
кандидатской диссертации Н.М. Крутиковой «Эвкалимин – новый растительный
препарат антибактериального действия» [38].
На сегодняшний день в ГРЛС Российской Федерации сохраняется
регистрация субстанции и лекарственной формы (ЛФ) эвкалимина, однако уже
несколько лет он не выпускается [20].
В бывшем СССР помимо «Эвкалимина» был разработан и внедрен в
практику еще один антибактериальный препарат на основе листьев эвкалипта –
«Хлорофиллипт». Впервые хлорофиллипт был предложен в качестве ЛС в 1965 г.
сотрудниками Харьковского НИИ микробиологии, вакцин и сывороток им.
И.И Мечникова. В 1969 году им было выдано авторское свидетельство СССР
№ 240932 на способ получения хлорофиллипта из эвкалипта шарикового, в 1979
году – авторское свидетельство СССР №801341 на способ получения
хлорофиллипта из эвкалипта прутовидного. В описании к изобретению авторы
(В.Л. Надтока, Н.Г. Божко и А.А. Гришко) получают хлорофиллипт экстракцией
листьев эвкалипта 96% этанолом и последующей обработкой экстракта 4%
раствором сульфата меди (II). На завершающей стадии извлекают сумму
гидрофобных компонентов листьев эвкалипта бензолом. После отгонки бензола
получают субстанцию хлорофиллипта. Авторы считали основным действующим
началом своего препарата сумму медных аналогов хлорофиллов А и В. Работы по
исследованию химического состава хлорофиллипта с тех пор не проводились.
Несмотря на то, что общепризнана связь между содержанием фенолальдегидов и
25
биологической активностью листьев эвкалипта, действующими веществами
хлорофиллипта до сих пор признаются хлорофиллы [56].
В 2006-2008 гг. сотрудником ЗАО «Вифитех» И.Н. Зилфикаровым в ходе
ряда
исследований
была
усовершенствована
технология
получения
хлорофиллипта [28]. Автор справедливо предположил, что действующим началом
препарата являются не широко распространенные в растениях хлорофиллы А и В,
а фенолальдегиды. Им была предложена измененная технология получения
субстанции хлорофиллипта – «Хлорофиллипт, густой экстракт», разработаны
методы
его
предприятия
анализа,
представленные
(ФСП
42-8556-07
в
проекте
фармакопейной
«Хлорофиллипт,
экстракт
статьи
густой»).
Усовершенствованная методика позволила сократить на стадии очистки расход
меди сульфата (II) и заметно уменьшить используемые объёмы органического
растворителя. Явным преимуществом усовершенствованной технологии можно
также считать замену канцерогенного растворителя (бензола) на хлороформ.
Учитывая востребованность «Хлорофиллипта» на фармацевтическом рынке
ЛС, в РФ активно велась работа по получению его аналогов с сопоставимой
фармакологической
«Фармацевтическая
активностью.
фабрика
Эту
работу
проводили
Санкт-Петербурга»
на
(«Галенофарм»)
ОАО
в
сотрудничестве с учеными Санкт-Петербургской химико-фармацевтической
академии. В 2006 году ими был получен патент №2320360 «Способ получения
лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла» [46], а в
2007 году в ГРЛС зарегистрирован препарат «Галенофиллипт». Технология
«Галенофиллипта» отличается от технологии «Хлорофиллипта» тем, что удалось
отказаться от использования бензола на стадии очистки и уменьшить число
стадий производства препарата.
Таким образом, большинство препаратов на основе листьев эвкалипта
получают экстрагированием сырья бензолом или спиртом с добавлением в
последующем медных солей для получения устойчивых форм хлорофиллов.
Сравнительная
оценка
способов
прутовидного показана в Таблице 2.
получения
ЛП
из
листьев
эвкалипта
26
Очистка извлечения
Недостатки метода
96% спирт
обработка
экстракта
солью
двухвалентной меди (4% водный раствор),
извлечение суммы гидрофобных компонентов бензолом
96% спирт
обработка
экстракта
солью
двухвалентной меди (8% водный раствор),
извлечение суммы гидрофобных компонентов хлороформом
96% спирт
обработка экстракта солью меди (медь
двухлористая 2-водная или 5-10%
спиртовой раствор меди двухлористой 2водной) при мольном соотношении
хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте к соли меди 1: (3-4)
1. многостадийное производство (продолжительные химические, термические и механические воздействия
2. использование токсичного растворителя –
бензола
3. метод ориентирован на извлечение хлорофиллов
4. нахождение действующих веществ в препарате в форме медных солей
1. многостадийное производство (продолжительные химические, термические и механичексие воздействия
2. метод ориентирован на извлечение хлорофиллов
3. нахождение действующих веществ в препарате в форме медных солей
1. целевая экстракция хлорофиллов
2. нахождение действующих веществ в препарате в форме медных солей
Хлорофиллы
Экстрагент
Хлорофиллы
Фенолальдегиды
Авторское
свидетельство СССР
№ 801341
[47]
«Галенофиллипт»
«Хлорофиллипт
»
проект ФСП
[28]
«Хлорофиллипт»
Препарат
НД
Целевые
компоненты
Таблица 2. Сравнительная оценка способов получения лекарственных препаратов из листьев эвкалипта прутовидного
27
[45]
Фенолальдегиды
[46]
Фенолальдегиды
«Эвкалимин»
«Эвкалимин»
Препарат
НД
Целевые
компоненты
Продолжение таблицы 2
Экстрагент, режим экстракции
дихлорэтан, хлороформ
хлористый метилен
Очистка извлечения
или обработка упаренного извлечения гидроксидом
натрия, подкисление соляной кислотой (конц.),
очистка выпавшего осадка на окиси алюминия
при
10-17%-ном
насыщении
водой
в
соотношении полупродукт-сорбент 1:7 (элюент
– спирт этиловый), обработка элюата
0,1% раствором соляной кислоты, очистка выпавшего осадка водой
Недостатки метода
1. Многостадийность
производства
2. Использование хлорсодержащих агрессивных реактивов
С1 – С3 спирты, хлорсодержа- повторяет очистку «Эвкалимина», получаемого 1. Многостадийность
щие углеводороды в соотноше- по [45]
производства
нии сырьё – растворитель 1:7
2. Использование
(для сухого сырья) или С1 – С3
хлорсодержащих
спирты (для влажного сырья) в
агрессивных реактивов
соотношении 1:14
28
1.1.4. Современное состояние исследований по стандартизации сырья и
препаратов эвкалипта прутовидного
Открытие
терпеноидных
фенолальдегидов
как
носителей
фармакологической активности листьев эвкалипта нашло отражение в подходах к
стандартизации сырья и препаратов. В частности, вышедшие в последние годы
НД на листья эвкалипта прутовидного (ФСП 42-8000-06, ФСП 42-0039337502,
ФСП 42-2007-08 «Эвкалипта прутовидного листья») стандартизуют это сырьё
наряду с эфирным маслом и по сумме фенолальдегидов. Согласно ФСП 420039337502 «Эвкалипта прутовидного листья» методика количественного
определения этих соединений предусматривает извлечение их 95% этиловым
спиртом при комнатной температуре и спектрофотометрирование аликвоты (без
очистки) при 278 нм. Норма содержания фенолальдегидов – не менее 3%. Та же
самая методика и та же норма содержания фенолальдегидов была включена в
ФСП 42-2007-08 «Эвкалипта прутовидного листья» (ООО ПКФ «Фитофарм»). В
ФСП
42-8000-06
«Эвкалипта
«Красногорсклексредства»)
прутовидного
методика
листья»
количественного
(ОАО
определения
фенолальдегидов предусматривает трехкратную экстракцию сырья 70% этиловым
спиртом
при
кипячении
на
водяной
бане
с
последующим
спектрофотометрированием аликвоты (без очистки) при длине волны 278 нм.
Норма содержания фенолальдегидов – не менее 5%.
Препараты
из
листьев
эвкалипта
прутовидного
стандартизуются
различными методами.
«Галенофиллипт» согласно ФСП 42-8623-07 стандартизуется по сумме
фенолальдегидов. Для препарата предусмотрена качественная идентификация
фенолальдегидов (λmax = 278 нм ± 3 нм), а также медных аналогов хлорофилла,
пиненов и цинеола. При количественной стандартизации определяют содержание
фенолальдегидов и меди.
Для «Хлорофиллипта» в НД на субстанцию (ФС 42-1338-86) и ЛФ (ФС 421348-91 «Раствор хлорофиллпта спиртовой 1%.») предусмотрено качественное
29
определение хлорофиллов в пробирке в ультрафиолетовых лучах лампы
медицинской синей марки МДС 220-75, 1% спиртовый раствор должен быть
окрашен в рубиново–красный цвет. Количественная стандартизация проводится
по антибактериальной активности на культуре Staphylococcus aureus (S. aureus).
В
исследованиях
«Хлорофиллипта»
были
И.Н. Зилфикарова
методы
усовершенствованы
[30,
31,
стандартизации
32].
Предлагается
качественная стандартизация препарата по терпеноидным фенолальдегидам –
цветная реакция с ванилиновым реактивом, тонкослойная хроматография (ТСХ) в
сравнении с Государственным стандартым образцом (ГСО) эвкалимина и запись
УФ-спектра (λmax = 278 нм ± 3 нм). Количественная стандартизация проводится по
содержанию суммы фенолальдегидов, определяемых спектрофотометрированием
раствора при 278 нм с применением для расчетов удельного показателя
поглощения
эвкалимина
И.Н. Зилфикаровым
был
при
используемой
подготовлен
проект
длине
ФС
на
волны.
листья
Также
эвкалипта
прутовидного. Качественная идентификация предлагается та же самая, что и в
хлорофиллипте.
Методика
количественного
определения
фенолальдегидов
включает в себя основные операции, заложенные в технологии получения
хлорофиллипта (разработанной автором) и заключается в следующем: листья
эвкалипта исчерпывающе экстрагируются 90% этиловым спиртом, аликвота
спиртового извлечения упаривается до водного остатка, к которому добавляется
равный объем 2% раствора CuSO4 и фенолальдегиды извлекаются многократной
обработкой полученного раствора хлороформом в делительной воронке. Норма
содержания фенолальдегидов предлагается не менее 3% на сухую массу листьев.
К сожалению, предложенные И.Н. Зилфикаровым усовершенствованные
методы стандартизации сырья и препаратов эвкалипта почти не нашли отражения
в вышедших НД. В частности, в ФСП 42-8556-07 «Хлорофиллипт, экстракт
густой» (ЗАО «Вифитех») предусмотрена только качественная идентификация
фенолальдегидов по характеру УФ-спектра (λmax = 278 нм ± 3 нм), количественная
стандартизация проводится микробиологическим методом.
30
В НД на субстанцию эвкалимина (ФСП 42-0601642705 «Эвкалимин») и его
ЛФ
(ФС
42-3607-98
«Раствор
эвкалимина
спиртовой
0,25%
и
1%»
предусматривается качественная идентификация фенольных соединений по
цветной реакции с FeCl3 и запись УФ-спектра (λmax = 278 нм ± 3 нм).
Количественная
стандартизация
проводится
по
сумме
фенолальдегидов,
определяемых фотоэлектроколориметрией по измерению оптической плотности
продуктов реакции с FeCl3. В НД на ГСО эвкалимина (ФС 42-3606-98 «Эвкалимин
– Государственный стандартный образец») предлагается такая же качественная
идентификация,
а
вот
количественное
определение
проводится
УФ-
спектрофотометрией при 278 нм.
Также стандартизовать по содержанию фенолальдегидов стали в последние
годы и такую давно применяемую ЛФ листьев эвкалипта как настойка. Ранее
настойка
эвкалипта
либо
вообще
не
подвергалась
количественной
стандартизации, и качество ее оценивалось по показателю плотности и
содержанию спирта (ФС 42-741-87 «Настойка эвкалипта»), либо стандартизация
проводилась по содержанию суммы дубильных веществ (НД 42-7965-97
«Настойка эвкалипта»). При стандартизации настойки эвкалипта используются
разные подходы, в частности, в ФСП 000417-280211 ОАО «Флора Кавказа»
предлагает количественно оценивать содержание фенолальдегидов в настойке
спектрофотометрическим методом при длине волны 278 нм, только разбавляя
аликвоту препарата 95% спиртом. В ФСП 000743-290911 ООО «Камелия НПП»
методика количественного определения фенолальдегидов предполагает сложную
процедуру очистки от сопутствующих веществ путем сгущения настойки под
вакуумом, фильтрованием выпавшего осадка и извлечением фенолальдегидов из
фильтрата петролейным эфиром. После отгонки петролейного эфира остаток
растворяется в 96% спирте и раствор фотометрируется при длине волны 276 нм.
Подводя итог вышеизложенному, можно сказать, что отечественные ученые
и производители ЛС, признают терпеноидные фенолальдегиды одними из
основных действующих веществ сырья и препаратов эвкалипта прутовидного, что
нашло отражение в соответствующих ФСП. В то же время методики
31
количественного определения фенолальдегидов в препаратах и, особенно в сырье
эвкалипта
требуют
их
усовершенствования.
Экстракция
производится
спиртовыми растворами, которые извлекают большое количество веществ
фенольной природы (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные
вещества), очистка полученных растворов не производится и в этом случае
выбранная для измерений аналитическая длина волны (278 нм) не гарантирует
избирательного поглощения только терпеноидных фенолальдегидов.
1.1.5. Опыт применения эвкалипта прутовидного и фитопрепаратов на его
основе
Листья эвкалипта прутовидного широко применяются в медицине,
косметике и ветеринарии [7].
Получаемое из листьев эвкалипта прутовидного эфирное масло является не
только
хорошим
антисептическим
средством
в
рамках
монотерапии
инфекционно-воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей, но и
составной частью многих комплексных препаратов – «Каметон», «Ингалипт»,
«Эвкамон», бальзам «Золотая звезда», «Гэвкамен», «Доктор Мом Колд Раб»,
«Пиносол», «Септолете» и другие [56].
Одним из наиболее популярных ЛП на основе листьев эвкалипта
прутовидного с точки зрения соотношения цена/фармакологический эффект
остаётся «Хлорофиллипт» [116]. Его преимуществом является наличие двух ЛФ –
«Хлорофиллипта 1% раствор спиртовой для местного применения и приема
внутрь», «Хлорофиллипта 2% раствор для местного применения масляный».
Наличие ЛФ фитопрепарата с отсутствием в составе этилового спирта позволяет
использовать
«Хлорофиллипт»
у
детей
грудного
возраста.
Основными
показаниями для применения «Хлорофиллипта» являются: эрозия шейки матки,
ожоги и трофические язвы, кишечное носительство стафилококка, септические
состояния и пневмонии, перитонит и эмпиема.
32
Значительные исследования по применению в медицинской практике были
проведены
для
препаратов
из
листьев
эвкалипта
прутовидного
–
«Галенофиллипта» и «Эвкалимина» [13, 14, 47, 50, 54, 61]. Применение
«Эвкалимина» показано для лечения больных стоматологического профиля
(пародонтит, язвы, стоматиты, эрозии); при патологии ЛОР-органов (ларингит,
фаринголарингит,
ангины);
при
гнойно-хирургических
инфекциях,
послеоперационных инфекционных осложнениях (для ускорения очищения ран,
регенерации).
Исследования
по
ранозаживляющей
способности
«Галенофиллипта» показали, что применение препарата способствует более
быстрому освобождению от микробов глубоких слоёв раны и отграничению очага
воспаления грануляционной тканью. Применение «Галенофиллипта» для лечения
открытых ран показало, что его активные компоненты вызывают стимулирование
макрофагальной реакции на более ранних сроках, чем при применении
«Хлорофиллипта» [41].
1.2. Характеристика шалфея лекарственного как источника получения
лекарственных препаратов
1.2.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая характеристика
шалфея лекарственного
Род Шалфей (Salvia L.) – один из крупнейших родов сем. Lamiaceae,
включающий в себя около 900 видов, распространённых во всех частях света.
Центром видового многообразия представителей этого рода являются горные
области Мексики и Южной Америки (более 275 видов), Средиземноморья,
Восточной Азии. На территории России и сопредельных государств произрастает
около 80 видов рода Salvia [22, 118].
Согласно НД на территории СССР использовали в качестве ЛРС листья
шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) и траву шалфея эфиопского (Salvia
aethiopis) [44].
33
В настоящее время в РФ официально зарегистрировано сырьё шалфея
лекарственного (Salvia officinalis L., сем. Lamiaceae) (ФС 22 ГФ XI издания). В
Европейскую Фармакопею внесены листья шалфея кустарникового (Salvia
fructicosa Mill.) [88].
Дикорастущим S. officinalis встречается в странах Средиземноморья. Его
широкое использование определило необходимость культивирования в ряде
стран. Шалфей лекарственный культивируется в Западной Европе, в небольшом
количестве по всей Европе, на севере до Ирландии и юга Скандинавии, в США,
Канаде, на Мадагаскаре, Индии, Сирии, Шри-Ланка [76]. В РФ – на юге
европейской части России, на Северном Кавказе, в Краснодарском крае, Сибири,
в Ярославской области, Молдове [15]. Возможно его культивирование в
Татарстане, но зимой верхняя часть растения подмерзает [15,55].
S. officinalis – многолетний полукустарник высотой 25 – 50 см с
деревянистым корнем. Стебли жесткие, прямые, ветвистые, четырехгранные,
полые, коротко-курчаво опушенные, одревесневающие у основания. Листья
супротивные,
простые,
черешковые,
от
продолговато-овальных
до
ланцетовидных, при основании закругленные или клиновидные (иногда с двумя
маленькими лопастями) с притупленными или слегка острыми верхушками, по
краям мелкогородчатые, длиной 2-10 см и ширинoй 0,8 - 1,5 см серовато-зеленого
цвета, мягко опушенные кроющими и железистыми волосками. Поверхность
листьев мелкоморщинистая (мелкоячеистая), благодаря густой сети прожилок на
обеих сторонах. Цветки двуполые, зигоморфные длиной до 2 см, венчик
голубовато-фиолетовый или пурпурный, иногда белый. Плод – четырехгнездный
орешек, почти округлый диаметром 2,5 мм, бурого цвета [15].
1.2.2. Химический состав
S. officinalis является источником огромного числа химических соединений,
обладающих уникальным, разнообразным строением и широким спектром
биологической активности [2, 12, 17, 23, 35, 48].
34
Основным компонентом листьев шалфея лекарственного является эфирное
масло, в состав которого входят несколько десятков моно- и сесквитерпеноидов.
Содержание эфирного масла в сырье регламентируется ФС 22 ГФ XI издания и
должно составлять не менее 0,8%. В наибольших количествах в составе эфирного
масла обычно присутствуют 1,8-цинеол (до 15%), α- и β-туйоны (30−45%), α- и βпинены, камфора (до 25%), борнеол (5%) (Рисунок 7) [4,63].
H
CH 3 H
O
O
O
CH 3
OH
O
1,8-цинеол
α- туйон
β-туйон
камфора
борнеол
Рисунок 7. Основные монотерпены листьев S. officinalis
Однако состав эфирного масла варьирует и зависит от процесса
выращивания и возраста растения. Например, главными компонентами эфирного
масла шалфея, выращенного в Португалии [120] являются α-пинен (4,1–5,4%),
камфен (6,0–7,1%), β-пинен (9,3–14,5%), лимонен (2,0–2,3%), 1,8-цинеол (3,6–
5,6%), (–)-туйон (13,2–16,1%), (+)-изотуйон (6,6–7,4%), камфора (19,8–24,0%), αгумулен (5,1–6,8%) и маноол (4,2–7,7%). Эфирное масло шалфея, выращенного в
Иордании [63] содержит 28 идентифицированных соединений. Преобладающими
компонентами этого масла являются α-туйон (29,9%), β-туйон (13,7%), камфора
(15,74%) и 1,8-цинеол (12,31%). Помимо перечисленных выше компонентов
входят также ментол (1,6%), ментон (0,9 %), тимол (1,9%). Отличительной
особенностью этого масла по сравнению с другими образцами является более
высокое содержание β-туйона (13,7%) по отношению к α-туйону (29,9%).
В настоящее время наибольший интерес у исследователей вызывают
соединения S. officinalis дитерпеновой и фенольной природы (дитерпены,
тритерпены, танины, феноловые кислоты, флавоноиды и др.) [100, 103, 112].
Дитерпены рода Salvia делят на два подкласса. Первый содержит
моноциклические и бициклические дитерпены, в том числе лабданы, клероданы.
35
Второй – трициклические и тетрациклические дитерпены, в том числе пимараны,
абиетаны. Состав дитерпенов зависит от места произрастания шалфея. Клероданы
в основном представлены у американских видов, абиетаны у европейских и
евразийских [118]. Основные дитерпены, обнаруженные в листьях S.officinalis,
показаны в Таблице 3.
Таблица 3. Основные дитерпены, обнаруженные в листьях S.officinalis
Соединение
Структурная формула
Источник
Бициклические дитерпены (лабданы)
Маноол
[69,79]
OH
CH 2
Трициклические дитерпены
Абиетаны с ароматичексим циклом
Карнoзоловая кислота
OH
CH3
HO
CH3
HOOC
H3C
H
CH3
O CH3
12-метоксикарнозоловая
HO
кислота
[69,81]
CH 3
[69,81]
CH 3
H 3C
H
CH3
O CH3
7-β-гидрокси-6-оксо-
HO
карнозоловая кислота
CH 3
CH 3
H 3C
OH
H
CH3 O
[69]
36
Продолжение таблицы 3
Соединение
Структурная формула
O CH3
12-метоксикарнозол
Источник
[112]
HO
O
O
Карнозол
OH
[69,76,112]
OH
[112]
HO
O
O
Галдазол
HO
O
O
O
O
Изорозманол
OH
[69,112]
HO
OH
Розманол
OH
[69,112]
HO
O
O
H
OH
37
Продолжение таблицы 3
Соединение
Структурная формула
Источник
OH
7-этоксирозманол
CH 2OH
HO
O
O
[79]
H
OC 2H 5
O CH 3
7-метоксирозманол
[69]
O CH 3
O
O
H
O CH 3
Эпирозманол
OH
[69]
HO
O
O
OH
H
OH
6,7-диметокси-7эпирозманол
O CH 3
HO
O
O
O CH 3
H
O CH 3
Метилен хиноновые абиетаны
[69]
38
O CH3
12-метокси-абиета-
[79]
O
8,11,13-триен-20,11-олид
O
Продолжение таблицы 3
Соединение
Структурная формула
Источник
Парахиноновые абиетаны
Ройлеанон
OH
CH3
O
[76]
CH3
CH3
O
H3C
CH3
OH
7-α-гидрокси-ройлеанон
CH3
O
[76]
CH3
CH3
O
OH
H3C
CH3
Атунтзенсин
OH
[112]
O O
O
O
OH
Нор-абиетаны
39
Милтирон
O
[112]
O
Из
фенольных
соединений
в
CH3
листьях
S.
officinalis
обнаружены
гидроксибензойные и гидроксикоричные кислоты, а также их производные,
полифенольные соединения – олигомеры кофейной кислоты, фенольные
гликозиды (производные ацетофенона, лигнанов и др.), флавоноиды, кумарины и
дубильные
вещества
фармакологических
[22].
Наиболее
интересными
свойств
являются
олигомеры
с
точки
кофейной
зрения
кислоты,
обнаруженные методами ВЭЖХ, ЯМР и масс-спектроскопии (Таблица 4)
Таблица 4. Основные олигомеры кофейной кислоты, обнаруженные в составе
полифенольной фракции листьев шалфея лекарственного
Соединение
Структурная формула
Литературный
источник
Кислота
розмариновая
O
HO
O
O
OH
OH
[3,67]
OH
HO
Сальвианоловая
кислота I
[104]
40
Сальвианоловая
кислота К
OH
OH
HO
[104]
HO
OH
COOH
O
HO
COOH
O
O
Сальвианоловая
OH
O
кислота L
COOH
O
[104]
OH
HO
OH
O
HO
OH
O
OH
HO
COOH
Продолжение таблицы 4
Соединение
Структурная формула
Литературный
источник
Шалфейная
(сейджриновая)
HO
O
HO
O
OH
O
кислота
OH
[104]
OH
O
HO
OH
HO
OH
1.2.3. Фармакологическая активность сырья шалфея лекарственного и
препаратов на его основе
Шалфей лекарственный в официальной медицине известен прежде всего
своими противовоспалительными и антимикробными свойствами [21, 33, 37, 40,
43, 49, 62, 75, 98], которые делают эффективными полоскания полости рта, горла
для лечения воспалений, язв и т. д. [119]. Применение тёплого настоя шалфея для
41
полосканий
при
респираторных
острых
ангинах
заболеваниях,
и
хронических
стоматитах,
тонзиллитах,
гингивитах,
катарах
острых
верхних
дыхательных путей, при флюсе, сильной зубной боли в виде ингаляций, примочек
и влажных турунд является традиционным [60].
Листья S. officinalis входят в состав сборов («Грудной сбор № 3»,
«Элакосепт»), а их экстракты являются составной частью комплексных
препаратов («Пародонтоцид», «Стоматофит» и др.) [56].
Кроме того, шалфей лекарственный обладает вяжущим, желчегонным,
антиспастическим,
вазодилатирующим,
стимулирующим
и
тонизирующим
свойствами. Используется при лечении избыточной лактации, обильного ночного
потоотделения, чрезмерного слюнотечения (как при болезни Паркинсона),
профузного потоотделения (как при туберкулёзе), при женском бесплодии и
проблемах в менопаузу [25]. Препараты шалфея положительно влияют на
иммунную и ферментную систему человека [59].
В 1959 г. из листьев шалфея лекарственного на базе Института
микробиологии и вирусологии АН УССР научной группой под руководством
Н.А. Дербенцевой
названный
был
сальвином.
антимикробная
получен
Данной
активность
комплексный
научной
препарата
антимикробный
группой
было
проявляется
препарат,
доказано,
в
что
отношении
грамположительной, в том числе и антибиотикоустойчивой микрофлоры в
концентрации 4-8 мкг/мл и обусловлена наличием фракции органических
кислот [24]. При изучении химического состава антибиотика были установлены
два
основных
носителя
антимикробной
активности.
Одно
вещество
идентифицировано как карнозоловая кислота (названная также сальвином),
второе – монометиловый эфир карнозоловой кислоты.
В ФС 42-2352-85 сальвин описывается как зеленовато-жёлтая смолистая
масса, полученная экстрагированием сырья ацетоном, из которой готовят 1%
спиртовой раствор. Исследования отечественных учёных в области комплексной
промышленной переработки листьев шалфея лекарственного [42] позволили
42
разработать способ получения сальвина, основанный на извлечении липофильной
фракции действующих веществ 95% этиловым спиртом.
Препарат «Сальвин-ВИФ» − 1% раствор для местного применения
(спиртовой) применяют местно при хронических воспалительных заболеваниях
полости рта: катаральных и язвенно-некротических гингивитах, стоматитах, при
пародонтозе и др. Назначают препарат в виде 0,1% − 0,25% спиртового раствора
разведением (в 4 -10 раз) дистиллированной водой или изотоническим раствором
натрия хлорида. Применяют в виде смазываний, орошений, аппликаций, для
смачивания турунд, вводимых в десневые карманы (на 10 мин.) и т. д. [56].
Особый
интерес
к
листьям
шалфея
лекарственного
обусловлен
возможностью использовать составляющие дитерпеновой фракции (кислота
карнозоловая и её производные) и олигомеры кофейной кислоты (розмариновая
кислота
и
др.)
антиоксидантного
как
и
индивидуальные
антимикробного
ЛВ
действия.
противовоспалительного,
[100,128].
Особенностью
карнозоловой кислоты как антиоксиданта является то, что все промежуточные
формы
в
процессе
её
многочисленных
трансформаций
(карнозол,
дегидрокарнозоловая кислота, кетокарнозол, розмаридифенол, розмарихинон)
сохраняют антиоксидантную активность. На основании сравнительного анализа
химической структуры антиоксидантов было показано, что антиоксидантный
эффект карнозоловой кислоты является следствием наличия пирокатехоловой
структуры ароматического ядра с изопропиловой группой в о-положении [110]. В
ряде зарубежных работ [72, 96] доказано, что карнозоловая кислота и карнозол
обладают антибактериальной активностью в отношении S. aureus, B. cereus, E.
faecalis,
S. salivarius,
грамположительных
S. sanguinis,
бактерий.
В
S. mitis,
работе
S. mutans,
[96]
S. sobrinu
показана
и
др.
сравнительная
характеристика антибактериальной активности липофильной фракции листьев
розмарина лекарственного и стандартного раствора карнозоловой кислоты.
Результаты исследования дополнительно доказали липофильный характер
дитерпеновых кислот: минимальная подавляющая концентрация (МПК) для
43
липофильной фракции и стандартного раствора была равноценна и составила
0,156 мг/мл.
Антиоксидантный
потенциал
олигомеров
кофейной
кислоты
был
исследован в работе [128], где показано, что реализация радикал-утилизирующего
механизма антиоксидантной активности данных соединений приводит к ди-,
олиго- и полимеризации производных кофейной и дигидрокофейной кислот с
образованием большого разнообразия полифенольных соединений, которые
определяют фармакологические свойства листьев шалфея.
В исследовании зарубежных учёных проведена оценка водорастворимых
фракций
листьев
розмарина
лекарственного
и
стандартного
раствора
розмариновой кислоты. Показано, что МПК для водорастворимой фракции и
стандартного раствора была равноценна и составила 5,0 мг/мл, что в очередной
раз доказало гидрофильный характер гидроксикоричных кислот.
1.2.4. Оценка методов стандартизации листьев шалфея лекарственного и
фитопрепаратов на их основе
Приоритетным направлением в развитии подходов к стандартизации
эфиромасличных растений является установление норм содержания веществ,
которые отвечают за фармакологический эффект растения. Особенно актуален
этот вопрос в связи с признанием того факта, что в листьях шалфея
лекарственного преобладающими
группами
БАВ являются дитерпены и
гидроксикоричные кислоты.
Отечественная
НД
предполагает
стандартизацию
сырья
шалфея
лекарственного по эфирному маслу (ФС 22 ГФ XI издания). В 1991 году для
количественного определения камфоры и 1,8-цинеола в сырье и настоях шалфея
был предложен газохроматографический
метод
[58].
Стандартизация по
индивидуальным компонентам сырья не предусмотрена и зарубежной НД [88].
Исходя
отвечающих
из
необходимости
оценки
за
фармакологический
содержания
эффект
целевых
шалфея
веществ,
лекарственного,
44
отечественными учёными была предложена методика определения суммы
дитерпеновых кислот в листьях шалфея, основанная на экстракции этих
соединений из сырья ацетоном [29]. Карнозоловая кислота имеет характерную
полосу поглощения при длине волны 285 ± 3 нм. В работе было доказано, что
такую же полосу после предварительного выделения и очистки дитерпеновой
фракции удаётся обнаружить в листьях шалфея лекарственного и сальвине.
Стандартизация «Сальвина» проводится согласно ФС 42-2352-85 по титру
антимикробной активности. Ввиду очевидной обоснованности стандартизации
сальвина по карнозоловой кислоте и её производным были разработаны методы
качественного и количественного анализа сальвина по содержанию дитерпеновых
кислот, в основу которых была положена УФ-спектрофотомерия [28].
Спектрофотометрическое определение дитерпеновых соединений положено
в основу анализа разрабатываемых ЛФ на основе листьев шалфея лекарственного
[51].
Таким
образом,
отечественные
и
зарубежные
ученые
признают
дитерпеновые и гидроксикоричные кислоты одними из главных действующих
веществ сырья шалфея лекарственного, а также препаратов на его основе [35].
Количественная оценка данных БАВ согласно НД не осуществляется, но является
необходимой на стадии контроля качества сырья, используемого для получения
ЛП. Единственная известная методика количественной стандартизации листьев
шалфея лекарственного и апробированная в последующем на «Сальвине» [28]
позволяет извлекать помимо соединений дитерпеновой природы, полифенольные
БАВ
(извлечение
проводится
ацетоном).
Измерения,
проводимые
при
рекомендуемой авторами метода длине волны (285 нм) в случае неполноценной
очистки излечений могут быть завышены.
1.3. Характеристика зверобоя продырявленного как источника получения
лекарственных препаратов
45
В медицинской практике РФ применяется два вида рода Зверобой
(Hypericum L.) – зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой
пятнистый (четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz., (синоним Hypericum
quadrangulum L.) семейства Hypericaceae (Guttiferae).
В настоящее время трава обоих видов зверобоя используется равноценно
для приготовления настоев, производства настойки зверобоя, входит в виде
экстрактов в состав комплексных отечественных препаратов «Простанорм» и
«Сибектан», а также является составным компонентом ряда бальзамов и
эликсиров («Панта-Форте», «Эвалар», «Виватон», «Алтайский», «Демидовский»).
Кроме того, на российском рынке присутствует ряд препаратов на основе травы
зверобоя
продырявленного
«Негрустин»,
«Гелариум
зарубежных
Гиперикум»,
а
производителей
также
–
«Деприм»,
комплексные
препараты,
содержащие извлечения из зверобоя «Ново-Пассит», «Полигемостат» [56]. Стоит
отметить, что до выхода в свет ГФ ХI издания, узаконившей равноценное
использование обоих видов зверобоя, зверобой пятнистый рассматривался как
примесь к зверобою продырявленному и заготовкам не подлежал. Для сравнения
Европейская Фармакопея признаёт только зверобой продырявленный как
растение для заготовки ЛРС – травы зверобоя.
1.3.1. Ботанико-фармакогностическая и географическая
характеристика зверобоя продырявленного
Зверобой продырявленный [Нуреricum perforatum L., сем. Нурeriсасеае
(Guttiferaе) представляет собой многолетнее травянистое растение. H. perforatum
произрастает в светлых лиственных и смешанных лесах, среди кустарников, на
луговых
степях,
лугах,
каменистых
склонах.
Зверобой
продырявленный
распространён в лесной, лесостепной и степной зонах всей территории РФ, на
Кавказе, в горах Средней Азии и в Западной Сибири. Стебель прямой с двумя
гранями, наверху ветвистый, от 30 см, достигает иногда 1 м в высоту. Листья
овальные, эллиптические, продолговато яйцевидные или продолговатые, 0,7—
46
З см длиной и 0,3—1,5 см шириной. Они почти всегда туповатые, плоские по
краю более-менее завернутые вниз, с многочисленными просвечивающимися
светлыми и редкими черными точечными железками. Цветки многочисленные,
собранные в широко метельчатое, почти щитковидное соцветие (тирс) 7—11 см
длиной, 5—11 см шириной. Прицветники ланцетные, острые 0,5 см длиной.
Чашечка глубоко раздельная, 5 мм длиной, почти в 2—3 раза короче венчика.
Чашелистики ланцетные или узко ланцетные, острые или тонко заостренные, с
редкими железистыми черными, большей частью овальными точками, по краю
ровные или немного зубчатые. Лепестки продолговатые или продолговатоэллиптические, неравнобокие, 1,2—1,5 см длиной, 0,5—0,6 см шириной, по краям
и верхней части с многочисленными черными железками в виде черных точек и
черточек и на поверхности с многими желтыми светлыми точечными и в виде
тонких черточек и полосок железками или без черных точек. Тычинки
многочисленные в 3 пучках, завязь яйцевидная, 3—5 мм длиной. Корневища
короткое, вертикальное, корни слабоветвистые, неглубоко погруженные в почву.
Семена мелкие — 1 мм длиной, цилиндрические, коричневые, продольно мелко
ячеистые [15].
1.3.2. Производные флороглюцина как основные БАВ, отвечающие за
антибактериальную активность сырья
Химический состав рода Hypericum L. сложен и разнообразен по типу
структур БАВ. Ведущую роль в терапевтических свойствах зверобоя играют:
флавоноиды, конденсированные производные антрацена (гиперицин и др.),
пренилированные производные флороглюцина (гиперфорин и др.), дубильные
вещества конденсированного ряда (димерные и тримерные проантоцианидины).
Согласно НД (ФС 52 ГФ XI издания) трава зверобоя (смесь травы зверобоя
продырявленного и зверобоя пятнистого) стандартизуется по сумме флаваноидов
в пересчёте на рутин. С другой стороны Европейская Фармакопея предагает
47
стандартизовать траву зверобоя по содержанию суммы гиперицинов а пересчёте
на гиперицин (Европейская Фармакопея VII издания с. 1555):
Наиболее важным БАВ зверобоя продырявленного с точки зрения
оказываемого антимикробного эффекта является антибиотик гиперфорин,
представляющий собой фото- и термонестабильное бициклическое соединение.
При комнатной температуре в растворе гиперфории представляет собой смесь
таутомеров.
Открытие
гиперфорина
принадлежит
отечественным
ученым
[16].
Структура и абсолютная конфигурация этого соединения устанавливались в
течение десятилетия с момента его выделения [9, 16, 77, 126]. Позднее был
выделен аналог гиперфорина — адгиперфорин, содержащий дополнительную
метильную группу [109]. В последние годы из Н. perforatum выделены продукты
гетероциклизации
гиперфорина:
фурогиперфорин
[92],
пирано
гиперфорин и продукты их деградации (Рисунок 8).
HO
O
HO
O
O
O
O
гиперфорин
O
адгиперфорин
[9,
32 ] -
48
O
O
O
O
HO
H
O
O
O
фурогиперфорин
O
пирано[7.28-b]гиперфорин
Рисунок 8. Структурные формулы производных флороглюцина, выделенных из
различных видов зверобоя.
Гиперфорин и адгиперфорин содержатся главным образом в цветках и в
плодах Н. perforatum. Содержание гиперфорина в надземной части в течение
периода вегетации изменяется от 2,47 (фаза бутонизации) до 6,6 % (фаза
цветения), а к плодоношению его количество повышается [117].
Гиперфорин
проявляет
активность
в
отношении
S. aureus
[16].
Совокупность фармакологических свойств гиперфорина недостаточно изучена.
Ряд исследователей считают его главным (но не единственным) соединением
Н. perforatum, обладающим антидепрессантными свойствами [64, 71, 94].
Значительную антидепрессантную активность проявляют и конъюгаты
гиперфорина [115]. Гиперфорин проявлял также значительную цитотоксическую
активность и интенсивно исследуется как новый антинеопластический агент. Он
ингибирует пролиферацию опухолевых клеток и вызывает в них апоптоз и может
быть использован при лечении различных форм рака и предраковых состояний.
Установлено, что гиперфорин эффективен против лимфомы, лейкемии.
Гиперфорин и его производные обнаружены только у одного вида зверобоя
- H. perforatum. В работе [73], было показано, что гиперфорин отсутствует в
H. maculatum.
49
1.3.3. Стандартизация травы зверобоя по содержанию производных
флороглюцина.
Стандартизация
травы
зверобоя
по
содержанию
производных
флороглюцина (гиперфорина и др.) официальными НД пока не предусмотрена.
Однако на рынке предлагается достаточно большое количество экстрактов травы
зверобоя (предназначенных большей частью для производства биологически
активных добавок (БАД), стандартизованных по содержанию гиперфорина.
Стандартизация
осуществляется
методом
высокоэффективной
жидкостной
хроматографией с использованием УФ-детектирования в диапазоне длин волн
270-290 нм. Опубликовано большое количество работ, в которых описываются
условия таких определений [83, 93, 95, 129].
Общим недостатком этих определений гиперфорина в растительных
экстрактах, помимо дорогостоящего оборудования и расходных материалов,
используемых в этом методе, является очень высокая стоимость самого
гиперфорина, применяемого в качестве стандартного образца. Подводя итог
вышеизложенному,
можно
сказать,
что
cоединения,
ответственные
за
антимикробную активность – гиперфорин и его производные обнаружены только
в зверобое продырявленном. Вероятно, трава зверобоя пятнистого будет обладать
меньшей антибактериальной активностью и ее использование для производства
препаратов антибактериального действия будет малоэффективным.
1.3.4. Разработка отечественных антимикробных препаратов из травы
зверобоя продырявленного
В 1946 году под руководством В.Г.Дроботько в Институте микробиологии
АН УССР в процессе изучения антимикробнных свойств лекарственных растений
была установлена высокая антибактериальная активность эфирных, спиртовых,
ацетоновых и других экстрактов из зверобоя продырявленного в отношении
золотистого стафилококка и других бактерий [4]. Эти данные послужили
50
основанием для последующего детального изучения этого растения и получения
антимикробных препаратов, два из которых (иманин и новоиманин) впоследствии
были внедрены в медицинскую практику.
В
результате
исследования
антимикробных
веществ
зверобоя
продырявленного группой научных сотрудников Института микробиологии АН
УССР В.Г. Дроботько, Б.Е. Айзенман, П.И. Киселем, М.О. Швейгер и С.И.
Зелепухой был изучен и внедрен в медицинскую практику, где применялся около
20 лет, антимикробный препарат иманин (начальные буквы слов: Институт
микробиологии Академии наук и окончание – ин). Иманин в 1947-48 гг. выделен
П.И. Киселем путем экстракции растения водно-щелочным раствором.
Иманин получали из воздушно-сухой травы зверобоя продырявленного при
последовательном пятикратном кипячении ее с 0,5% раствором гидроксида
натрия в соотношении 1:10. Продолжительность каждого кипячения составляла
5 минут. Затем водно-щелочные растворы объединяли (кроме первой порции,
которую кипятили 10 минут и отбрасывали); после охлаждения подкисляли 10%
раствором хлористоводородной кислоты до слабокислой реакции. Выпадающий
при
этом
осадок
отстаивали,
водный
слой
декантировали,
осадок
центрифугировали, отмывали от следов кислоты и высушивали в тонком слое при
затемнении при 40–50 ˚С и измельчали на шаровой мельнице. Полученный
порошок темно-коричневого цвета и представлял собой иманин. Выход иманина
составлял 5–10% к весу воздушно-сухого растения. Иманин был плохо растворим
в воде, несколько лучше в спирте, эфире, ацетоне, глицерине. Полностью
растворялся в 0,1 н. растворе гидроксида натрия при нагревании.
Антибактериальная активность препарата была испытана на более чем 40
видах микроорганизмов [36]. Бактериостатические концентрации иманина для
разных видов микроорганизмов представлены в таблице 5.
Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения СССР иманин
был допущен для клинического изучения в качестве наружного средства. После
клинического испытания в 10 лечебных учреждениях иманин был разрешен к
51
внедрению
в
медицинскую
практику
и
выпускался
медицинской
промышленностью почти 20 лет.
Таблица 5. Чувствительность различных видов микроорганизмов к иманину [36]
Микроорганизмы
Staph. aureus 209
Streptococcus
Bact. diphteriae
Bact. mesentericus
Bact. megathericum
Bact. subtilis
Bact. mycoides
Bact. tetani
Clostridium welchii
Cl. sporogenes
Cl. histolyticus
Myc. tuberculosis
Haem. pertussis
Бактериостатическая активность
иманина (в разведении)
1:25 000 – 1:500 000
1:10 000 – 1:100 000
1:25 000 – 1:250 000
1:25 000 – 1:500 000
1:100 000
1:100 000
1:100 000
1:33 000
1:10 000
1:10 000
1:100 000
1:10 000 – 1:250 000
1:25 000 – 1:250 000
Одним из недостатков иманина была неустойчивость при хранении. При
хранении препарата при температуре 5–7 ˚С в герметической упаковке и в темной
посуде активность через 11 месяцев иногда снижалась до 2,5 раз, но поскольку
иманин применялся в довольно концентрированных (0,3–1%) растворах, препарат
не утрачивал лечебных свойств.
Основываясь
на
многочисленных
исследованиях
антимикробной
активности экстрактов из различных органов зверобоя продырявленного и на
получении из этого растения антибактериального препарата – иманина, были
предприняты попытки получить более высокоактивное и устойчивое при
хранении
антибактериальное
средство,
завершившееся
выделением
антимикробного препарата – новоиманина [5].
Новоиманин был получен путем экстракции травы зверобоя ацетоном с
последующим удалением из экстракта хлорофилла и других пигментов
активированным древесным углем. Для этого воздушно-сухую траву зверобоя 10–
52
12% влажности экстрагируют в течение 3–4 суток ацетоном в соотношении 1:8 к
весу
растения.
Экстракцию
осуществляют
при
комнатной
температуре.
Отфильтрованный от растительной массы ацетоновый экстракт зверобоя
представляет собой темно-зеленую жидкость с красной флуоресценцией. Для
очистки от пигментов ацетоновый экстракт взбалтывается с 8-кратным
количеством активированного древесного угля до приобретения им прозрачности
и ярко-желтого цвета. Уголь удаляют фильтрованием и ацетон отгоняют на
водяной бане. После отгонки ацетона в препарате остается около 10%
воднорастворимой темно-красной смолы, которая оседает на дне делительной
воронки (куда переносят препарат) и отделяется механически. Затем новоиманин
высушивают под вакуумом 2–3 часа при комнатной температуре и остаточном
давлении 20–30 мм рт. ст. до полного удаления остатков растворителя. Выход
препарата 3–4% к весу воздушно-сухого растения. По внешнему виду новоиманин
– это прозрачная смола красновато-желтого цвета с медовым запахом. Полностью
растворим в ацетоне, этиловом, метиловом и бутиловом спиртах, несколько
меньше – в других органических растворителях: бензоле, толуоле, ксилоле,
хлороформе, этилацетате, дихлорэтане и диэтиловом эфире.
Новоиманин после детального лабораторного и клинического изучения был
утвержден Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения СССР,
и, начиная с 1964 года, стал выпускаться Борщаговским заводом химикофармацевтических препаратов в виде 1%-ного спиртового раствора.
Антимикробные свойства новоиманина изучали многие авторы: результаты
их исследований суммированы С.И. Зелепухой в 1968 году (Таблица 6).
Содержание гиперфорина в новоиманине колеблется от 10 до 20%. Гиперфорин
подавляет рост золотистого стафилококка 209 в концентрации 0,1 – 1,0 мкг/мл.
Таблица 6. Антибактериальная активность новоиманина [26]
Микроорганизмы
Staph. aureus 209
St. haemplyticus
Str. faecalis
Str. pyogenes
Антибактериальная активность
(в мкг/мл)
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
53
Micr. catarrhalis
Cor. diphtheriae gravis
mitis
intermedius
Cor. michiganense
Bac. perfringens
Bac. megatherium
Bac. mycoides
Mycobacterim B5
Bac. histolyticus
Bac. sporogenes
Cor. insidiosum
Cor. sependonicum
Bac. mesentericus
Bac. subtilis
Act. griseus
Epidermophyton rubrum
E. coli
Bact. proteus vulgaris
Bact. dysenteriae Flexneri
Bact. typhi abdominalis
Bact. fluorescens
Bact. pyocyaneus
Bact. prodigiosum
Pen. chrisogenum
Fus. avenaceum
Candida albicans
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
0,1 – 10,0
0,1 – 10,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
2,0 – 4,0
40,0 – 100,0
200,0 – 400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
400,0
При дальнейшем изучении состава новоиманина, представляющего собой
сложную смесь веществ, было найдено, что главным компонентом этого
препарата, является индивидуальное вещество, выделенное Н.А. Дербенцевой,
названная гиперфорином, химическая структура которого была изучена и
установлена в Институте биоорганической химии Академии Наук СССР [36].
Однако в отсутствии антиокислителя под действием света и кислорода
воздуха активность его быстро снижается. Одновременно с потерей активности
происходит химическое разложение гиперфорина и на вторые сутки этот препарат
на хроматограмме представляет собой разложившуюся многокомпонентную
систему.
54
Снижение антибактериальной активности препаратов из зверобоя в
процессе их хранения наблюдалось различными авторами, однако в большинстве
случаев это явление никем не исследовалось и не получало научного
обоснования. Первые попытки дать объяснение потери антибактериальных
свойств препаратов из зверобоя продырявленного при хранении были сделаны
Н.А. Дербенцевой и А.С. Рабинович (1960) [25]. В процессе изучения различных
факторов на активность иманина и других препаратов из зверобоя было отмечено,
что на свету антибактериальное действие их снижается. Светочувствительность
препаратов, выделенных из зверобоя, выражающаяся в потере антибактериальной
активности, дала основание предполагать наличие в этом процессе явлений
фотосенсибилизирующего окисления, обусловленного присутствием красящих
веществ. В результате, проведенных авторами исследований, выяснилось, что у
неочищенного углем ацетонового экстракта зверобоя и иманина при освещении
солнечным и электрическим светом резко снижается антимикробная активность
(до 1000 раз). При солнечном освещении это снижение происходит очень быстро
в течение 1 часа; электрическое освещение действует медленнее и активность
падает в течение 3–9 часов. При этом раствор приобретает красный цвет.
Ацетоновый экстракт новоиманина, очищенный углем, при всех видах освещения
в течение этого времени сохранял свою антимикробную активность и не
приобретал красной окраски.
Для подтверждения того, что потеря активности освещаемых препаратов
связана с присутствием красящих веществ и окислительными процессами,
авторами был проведен ряд дополнительных исследований. Объектом служил
препарат новоиманина, очищенный в процессе получения углем от красящих
пигментов, поэтому устойчивый к действию света [25]. Опыты проводили в
присутствии кислорода воздуха и в атмосфере азота в течение 3 часов при
температуре 25 ˚С. Источником освещения служила электрическая лампа 300 Вт.
Контрольные опыты проводили без доступа света. В качестве сенсибилизаторов
были взяты сумма красящих веществ зверобоя, адсорбируемая углем в процессе
получения новоиманина, синтетические красители-сенсибилизаторы (бенгальский
55
розовый, эозин, метиленовый синий) и индивидуальные пигменты, обычно
извлекаемые из зверобоя углем при получении новоиманина – гиперицин,
хлорофилл, ксантофилл, красный пигмент и красная смола. Все сенсибилизаторы
в количестве 1% прибавляли к 1% спиртовому раствору новоиманина.
Предварительно они были испытаны на антимикробную активность к S. aureus
209: не подавляли роста бактерий даже в концентрации 1000 мкг/мл. В результате
было установлено, что новоиманин в присутствии фотосенсибилизаторов
синтетических или тех, которые входят в состав травы зверобоя, при освещении в
присутствии кислорода воздуха теряет свою антибактериальную активность. Из
компонентов зверобоя сенсибилизаторами, вызывающими потерю активности
новоиманина, являются гиперицин и хлорофилл; остальные выделенные
пигменты потерю активности не вызывали.
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1
1. Основными группами БАВ с точки зрения оказываемой анимикробной
активности
следует
считать:
у
эвкалипта
прутовидного – терпеноидные
фенолальдегиды, у шалфея лекарственного – дитерпеновые и гидроксикоричные
кислоты, у зверобоя продырявленного – гиперфорин и его производные.
2. Анализ литературы, посвящённый вопросам стандартизации листьев
эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного
показал, что для большинства из указанных видов сырья стандартизация по
целевым действующим веществам, отвечающим за фармакологический эффект,
не предусмотрена. В связи с этим разработка селективных методов определения
целевых
БАВ
растительного
сырья
является
актуальным
направлением
исследования.
3. Описанные в литературе виды биологической активности эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного указывают на
перспективность
исследований
по
отечественных препаратов на их основе.
созданию
новых
антибактериальных
56
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
Листья эвкалипта прутовидного (Folia Eucalypthi viminali).
В работе использовались высушенные листья эвкалипта прутовидного,
привезённые в разные годы из Сирии, Марокко (2007 – 2008 гг.), Абхазии (2007 –
2011
гг.),
и
фасованные
производителями:
ОАО
листья
эвкалипта,
выпускаемые
«Красногорсклексредства»
(серия
различными
20211),
ООО
«Фитофарм» (030911), ЗАО «Здоровье» (серия 020210, 020211, 051210). В объёме
исследований по разработке способа получения антибактериального препарата из
листьев эвкалипта прутовидного дополнительно проводили анализ сырья,
приобретённого на рынках г. Казани, г. Чебоксары (2012 – 2013 гг.), а также
образца ОАО «Татхимфармпрепараты».
Листья шалфея лекарственного (Folia Salviae oficinallis).
В работе использовались высушенные листья шалфея лекарственного,
культивируемого на базе Ботанического сада КГМУ (2012 – 2013 гг. заготовки), а
также фасованные измельчённые листья шалфея, выпускаемые различными
производителями:
ЗАО
«Красногорсклексредства»
«Ст-Медифарм»
(серия
(серия
141108),
ООО
030210,
050410),
«Фитофарм»
ОАО
(061109),
ЗАО «Здоровье» (серия 060708). ООО «Фитобот» (серия 11209).
Трава зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого (Herba Hiperici
perforati и Herba Hiperici maculati).
В работе использовались высушенная трава зверобоя продырявленного и
зверобоя пятнистого, заготовленные в июне – июле 2010 – 2011 гг. в Республике
Татарстан. Собранная трава представляла собой верхние части стеблей с
листьями, цветками и бутонами и недозрелыми плодами. Стебли полые,
цилиндрические, длиной до 30 см, с двумя (у зверобоя продырявленного) или
четырьмя (у зверобоя пятнистого) продольными ребрами. Цвет от зеленоватожелтого до серовато-зеленого, иногда розовато-фиолетовый. Листья супротивные,
сидячие, продолговатые или продолговато-овальные, цельнокрайние, голые до 3,5
57
см, шириной до 1,4 см. Цвет от серовато-зеленого до темно-зеленого, у зверобоя
продырявленного листья с многочисленными просвечивающими вместилищами в
виде светлых точек. Цветки желтые с черными точками, многочисленные,
собраны в щитовидную метелку. Чашелистики чашечки ланцетовидные, тонко
заостренные (у зверобоя продырявленного) или продолговато-овальные с
притупленной верхушкой (у зверобоя пятнистого).
В рамках микробиологических исследований антибактериального препарата
из листьев эвкалипта прутовидного анализировали заводские ЛФ, полученные на
их основе: Хлорофиллипта раствор спиртовой 1% и «Галенофиллипт».
«Хлорофиллипта раствор спиртовой 1%» (серия 221207; производитель –
корпорация «Артериум») представляет собой темно-зеленую жидкость со
своеобразным приятным запахом. Выпускается во флаконе из темного стекла
объемом 100 мл, упакованного в картонную пачку.
«Галенофиллипт» (серия 161109; производитель – ОАО «Фармацевтическая
фабрика Санкт-Петербурга») – жидкость зеленого цвета с характерным запахом,
упакованная во флакон из темного стекла объемом 100 мл. Флакон помещен в
картонную пачку.
2.2. Методы исследований
2.2.1. Методы обнаружения и идентификации БАВ
На различных этапах исследования для обнаружения и идентификации БАВ
использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрию в
УФ-свете.
ТСХ-анализ.
Для ТСХ-анализа извлечений из листьев эвкалипта прутовидного, травы
зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого использовали пластинки марки
«Сорбфил ПТСХ-АФ-А» (Россия) и различные системы хроматографирования:
хлороформ, хлороформ: этилацетат (9:1), гексан: ацетон (9:1; 1:1), гексан:
этилацетат (9:1; 1:1), гексан: хлороформ (9:1; 1:1), хлороформ: спирт (1:1; 1:2);
58
бензол: ацетон (4:1) для извлечений из листьев эвкалипта прутовидного;
гексан: этилацетат (9:1) для травы зверобоя продырявленного и зверобоя
пятнистого.
Пластинки
«Сорбфил
ПТСХ-АФ-А»
для
активации
предварительно
выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100 – 105°С в течение 1 ч.
Хроматографическую камеру насыщали парами растворителей в течение 1 ч.
Фронт прохождения растворителя составлял около 9 см.
Обнаружение пятен на хроматограммах проводили УФ-облучением (360
нм) – гиперфорин и его производные в траве зверобоя продырявленного и
зверобоя пятнистого; обработкой 0,5 % раствором 2,4-динитрофенилгидразина в
2М
растворе
хлористоводородной
кислоты
и
1%
водным
раствором
железоаммонийных квасцов (фенолальдегиды).
Приготовление раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М. растворе
хлористоводородной кислоты: 0,1 г 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в 20
мл 2 М раствора хлористоводородной кислоты (Европейская Фармакопея VII
издания с. 425). Раствор применяют свежеприготовленным.
Приготовление 1% раствора железоаммонийных квасцов (ЕФ VII издания
с. 419): 1 г железоаммонийных квасцов растворяют в 100 мл воды. Раствор
применяют свежеприготовленным.
Метод спектрофотометрии.
Использовали для качественной оценки содержания фенолальдегидов в
листьях эвкалипта прутовидного, дитерпеновых и гидроксикоричных кислот в
листьях шалфея лекарственного и производных гиперфорина в траве зверобоя
продырявленного и зверобоя пятнистого. Для этой цели изучали характеристики
спектров, записанных на спектрофотометре марки Lambda 25 в диапазоне длин
волн от 200 до 400 нм.
59
2.2.2. Методы количественного определения БАВ
Для оценки количественного содержания БАВ в листьях эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного использовали
УФ-спектрофотометрический метод.
2.2.2.1. Методы количественного определения терпеноидных
фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного
Количественное определение терпеноидных фенолальдегидов в листьях
эвкалипта
прутовидного
проводили
различными
предлагаемыми
производителями сырья методами (условно обозначим их как метод № 1, 2, 3)
Метод № 1 приведен в ФСП 42-0039337502 «Эвкалипта прутовидного
листья». (ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга») и в ФСП 422007-08 «Эвкалипта прутовидного листья» (ООО ПКФ «Фитофарм»):
Точную навеску (5,0 г) измельченного и просеянного сквозь сито с
диаметром отверстий 1 мм сырья экстрагируют перемешиванием 60 мл 95%
спирта на встряхивателе в течение 30 минут. После охлаждения надосадочную
часть извлечения фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 100 мл, к сырью прибавляют 40 мл 95% спирта и экстрагируют в
течение 15 минут. Извлечение фильтруют через тот же фильтр. 1 мл извлечения
помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем спиртом
этиловым 95% до метки, перемешивают (раствор А). 1,5 мл раствора А переносят
в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 95%, 1
мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной и доводят объем раствора
спиртом 95% до метки, перемешивают (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре в
максимуме поглощения при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
60
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл 0,01 М раствора
кислоты хлористоводородной помещают в мерную колбу вместимостью 25мл и
доводят объем спиртом 95% до метки.
Содержание суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин (х) в
процентах, вычисляют по формуле:
х
D 100  25  25 100
,
720  m 11,5  (100  W )
(1)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
720 – удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина в спиртовом растворе
при длине волны 278 нм;
m – масса навески, г;
W – потеря в массе при высушивании, %.
Метод № 2 приведен в ФСП 42-8000-06 «Эвкалипта прутовидного листья»
(ОАО «Красногорсклексредства»):
Аналитическую пробу листьев эвкалипта прутовидного измельчают до
размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.
Около 0,4 г (точная навеска) измельченных листьев помещают в
коническую колбу вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового
70%. Колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью ±0,01 г),
присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в
течение 30 минут. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, и
извлечение фильтруют через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 100
мл. Ватный тампон возвращают в колбу для экстрагирования, прибавляют 30 мл
спирта этилового 70%. Экстракцию повторяют дважды по 15 минут, фильтруя в
ту же мерную колбу. Содержимое мерной колбы доводят до метки спиртом
этиловым 70% и перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора А,
прибавляют 0,25 мл 1% раствора кислоты хлористоводородной, доводят спиртом
этиловым 70% до метки и перемешивают (раствор В).
61
Измеряют оптическую плотность раствора В на спектрофотометре при
длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют спирт этиловый 70%.
Содержание суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин и
абсолютно сухое сырье в процентах (х) вычисляют по формуле:
x 
D 100  50 100
720  m 1 (100  W )
(2)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
720 – удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина в спиртовом растворе
при длине волны 278 нм;
m – масса навески, г;
W – потеря в массе при высушивании, %.
Метод № 3 описан в диссертации И.Н. Зилфикарова «Новые подходы в
разработке и стандартизации фитопрепаратов из эфирномасличного сырья» и
предложен для оценки качества сырья эвкалипта прутовидного в рамках проекта
ФСП [28].
Около 1,0 г (навеска) листьев, измельченных до размера частиц не более 0,5
мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют
30 мл спирта этилового 90% и перемешивают на магнитной мешалке при кипении
с обратным холодильником в течение 1 ч. После охлаждения надосадочную часть
извлечения фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью
100 мл, к сырью прибавляют 30 мл спирта этилового 90% и экстрагирование
повторяют. Извлечение фильтруют через тот же фильтр, колбу с сырьем и фильтр
промывают 20 мл спирта этилового 90%, объем в мерной колбе доводят до метки
тем же растворителем и перемешивают (раствор А).
20 мл раствора А помещают в круглодонную колбу и упаривают на водяной
бане под вакуумом до 4 − 5 мл, к охлажденному остатку прибавляют 5 мл
раствора меди сульфата 2%, 10 мл хлороформа и перемешивают.
Полученную смесь количественно с помощью 10 мл хлороформа переносят
в делительную воронку, затем после полного разделения слоев сливают
62
хлороформный слой в сухую колбу. Водную фазу экстрагируют хлороформом
еще 2 раза порциями по 10 мл. Объединенное хлороформное извлечение
фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу со шлифом вместимостью
100 мл, колбу и фильтр промывают 10 мл хлороформа. Объем в мерной колбе
доводят до метки хлороформом и перемешивают (раствор Б).
УФ спектр поглощения раствора Б, измеренный относительно хлороформа в
интервале длин волн от 240 до 320 нм, должен иметь максимум при 278 нм.
Содержание суммы эуглобалей в листьях эвкалипта (х) рассчитывают либо по
ГСО эвкалимина, либо по удельному показателю поглощения, рассчитанному в
условиях методики анализа и равному 417:
x 
D  100  100  100
417  m  20  (100  W )
(3)
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора;
417 – удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина в спиртовом растворе
при длине волны 278 нм;
m – масса навески, г;
W – потеря в массе при высушивании, %.
2.2.2.2. Метод количественного определения дитерпеновых кислот в сырье и
извлечениях шалфея лекарственного
В
рамках
изучения
предлагаемых
на
сегодняшний
день
методов
стандартизации листьев шалфея лекарственного количественное определение
дитерпеновых кислот в сырье и извлечениях на их основе проводили по методике,
предложенной проф. И.Н. Зилфикаровым [29]:
Аналитическую пробу растительного сырья около 2 г (точная навеска)
помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 30 мл ацетона, соединяют с
обратным холодильником и экстрагируют при температуре кипения растворителя
в течение 30 минут. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр,
фильтр присоединяют к навеске сырья, которую экстрагируют повторно 30 мл
63
ацетона. Профильтрованное ацетоновое извлечение упаривают досуха, остаток
обрабатывают 10 мл 5% раствора аммиака. Водно-аммиачный раствор фильтруют
через бумажный фильтр. Операцию повторяют ещё раз с целью избежать потери
определяемых веществ. К фильтрату прибавляют при перемешивании 20 мл
разведённой соляной кислоты. Выпавший осадок количественно собирают на
фильтр Шотта с диаметром пор 16 мкм, промывают 10 мл воды. Затем осадок
количественно с помощью спирта 95% переносят в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят объём раствора до метки. Полученный раствор разбавляют
спиртом 95% в 10 раз и измеряют оптическую плотность при длине волны 285 нм.
В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 95%.
Содержание суммы дитерпеновых кислот в листьях шалфея в пересчёте на
карнозоловую кислоту и абсолютно сухое сырьё в процентах (х) рассчитывают по
формуле:
х
D  100  100  10
40,92  а  (100  W )  1
(4)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
40,92 – удельный показатель поглощения карнозоловой кислоты при длине волны
285 нм;
а – навеска сырья, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в %
Для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и водных
извлечениях из листьев шалфея методика была видоизменена на стадии
пробоподготовки аналитического раствора. Для спиртового извлечения аликвота
отгонялась досуха под вакуумом, далее поступали также как в методике со стадии
обработки водно-аммиачным раствором. Для водных настоев аликвотную часть
объёмом, равным половине от общего объёма водного извлечения, подкисляли
уксусной кислотой до pH = 3,5, помещали в делительную воронку вместимостью
250 мл и экстрагировали хлороформом 4 раза порциями по 10 мл, затем водную
фазу отбрасывали. Объединённое хлороформное извлечение упаривают до сухого
64
остатка под вакуумом. Далее поступали как в методике со стадии обработки
водно-аммиачным раствором.
2.2.2.3. Метод количественного определения гидроксикоричных кислот
Для оценки содержания гидрокискоричных кислот в листьях шалфея
лекарственного использовали метод, предложенный в ЕФ VII издания (с.1228) на
«Розмарина лекарственного листья» [88]:
0,2 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом
вместимостью 200 мл. Затем прибавляют 80 мл 50 % этилового спирта и проводят
экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут.
Полученное извлечение охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в
мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки 50 % этиловым спиртом.
Затем 1 мл извлечения переносят в мерную колбу на 10 мл, добавляют
последовательно следующие реактивы: 2 мл 0,5 М раствора хлористоводородной
кислоты, 2 мл раствора, полученного растворением 10 г натрия нитрита и 10 г
натрия молибдата в 100 мл воды, 2 мл 8,5 % раствора гидроксида натрия и
доводят объем раствора до метки водой очищенной.
Параллельно готовят раствор сравнения: 1 мл извлечения переносят в
мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора до метки водой
очищенной. Оптическую плотность сравнивают при длине волны 505 нм.
Содержание гидроксикоричных кислот (х), в пересчете на кислоту розмариновую,
вычисляют по формуле:
х
D  2,5
а
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
а – навеска сырья, в граммах.
(5)
65
2.2.3. Метод оценки антибактериальной активности извлечений из сырья на
культуре S.aureus
Антибактериальную активность определяли методом двукратных серийных
разведений в мясо-пептоном бульоне (МПБ) (pH 7,0) с музейными микробами:
S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р и штаммами, полученными из носоглотки от
здоровых
носителей
определению
в соответствии
чувствительности
с «Методическими
микроорганизмов
к
указаниями по
антибактериальным
препаратам» (МУК 4.2.1980-04 Минздрава России (2004 г.).
В опыте использовали суточные культуры, выращенные на мясо-пептонном
агаре (МПА).
Культуры, используемые в опыте, выращивали в термостате при
температуре 37ºС в течение 18−24 ч. Из суточной культуры готовили взвесь с
0,9% раствором натрия хлорида. Микробную взвесь стандартизовали по
оптическому
стандарту
мутности,
соответствующему
5 МЕ
(ГИСК
им. Л.А Тарасевича). Затем 0,2 мл взвеси переносили во флакон с 200 мл 0,9 %
раствора натрия хлорида и взбалтывали. В 1 мл полученной после разведения
микробной взвеси содержалось 25000 микробных клеток.
Исследования антибактериальной активности извлечений из растительного
сырья проводили следующим образом. В каждую пробирку разливали по 2 мл
МПБ. В первую пробирку помещали по 2 мл рабочего раствора извлечений,
принимая его за 100 % концентрацию. Затем делали последовательные
двукратные разведения исследуемого извлечения. Из последней пробирки
каждого ряда удаляли по 2 мл смеси извлечения со средой. Во все пробирки
вносили по 0,2 мл взвеси анализируемых тест-микробов в определённой
концентрации.
Параллельно с опытным ставили контроль стерильности питательной среды
(пробирка со средой), контроль стерильности препарата (пробирка с рабочим
раствором извлечения) и контроль роста культуры (пробирка с микробной
взвесью в МПБ).
66
Учёт результатов антибактериальной активности извлечений проводили
после
инкубации
в
термостате
при
температуре
37°С
через
сутки.
Антибактериальную активность препаратов оценивали визуально, сравнивая
прозрачность в каждой опытной пробирке с контролем стерильности питательной
среды в проходящем свете. За МПК принимали последнюю пробирку с видимой
задержкой роста микроба (Рисунок 9).
При
исследовании
различных
извлечений
часть
образцов
была
первоначально мутной, что не позволяло нам оценивать результат визуально. В
этой связи антибактериальную активность данных извлечений определяли путём
пересева на чашки Петри методом репликаций из каждой пробирки и
инкубировали в термостате в течение 18 − 24 часов. По истечении времени
фиксировали рост микроорганизмов на секторах чашки Петри (Рисунок 10).
МПК –3
пробирка
Рисунок 9. Визуальная оценка уровня антибактериальной активности в методе
двухкратных серийных разведений
Отсутствие
роста
Присутствие
роста
Рисунок 10. Оценка уровня антибактериальной активности методом репликаций
на чашках Петри с МПА
67
Оценка антибактериальной активности каждого образца извлечений
проводилась в трёх повторностях.
2.2.4. Метод определения чувствительности штаммов S.aureus к
антибиотикам
Изучение
антибиотикограммы
штаммов
проводили
S. aureus
дискодифузионным методом на среде Мюллер-Хинтона согласно "Методическим
указаниям
по
определению
чувствительности
микроорганизмов
к
антибактериальным препаратам" (МУК 4.2.1980-04 Минздрава России (2004 г.).
Согласно
рекомендуемому
перечню
антибактериальных
препаратов
для
определения чувствительности S. aureus использовали следующие диски с
антибиотиками:
Бензилпенициллин,
Гентамицин,
Эритромицин,
Ципрофлоксацин, Линкомицин, Оксациллин, Ванкомицин.
Чувствительность штаммов S. аureus к антибиотикам определялась в
соответствии с требованиями, предъявляемыми к постановке метода определения
чувствительности:
- состав питательного агара, pH среды, хранение чашек с агаром
- толщина слоя среды
- оптическая плотность микробной взвеси
- условия хранения дисков с антибиотиками
- расположение дисков
- температура и длительность инкубации
- учёт и интерпретация результатов
Состав питательного агара, pH среды, хранение чашек с агаром. Для опыта в
соответствии с НД использовали среду Мюллера-Хинтона (МУК 4.2.1980-04
Минздрава России (2004 г.). Агар разливали по чашкам слоем толщиной 4 мм.
Чашки оставляли при комнатной температуре для застывания. Использовали
чашки в этот же день либо хранившиеся в запаянных полиэтиленовых пакетах в
холодильнике при 4 − 8°С в течение 5 суток. Уделяли внимание равномерности
68
слоя агара по всей поверхности чашки Петри, чашки с неровным слоем агара
выбраковывались.
Оптическая
плотность
микробной
взвеси.
Суспензия
S. аureus
стандартизовалась при визуальном контроле с помощью стандарта мутности 0,5
по МакФарланду (1,5* 108) КОЕ/мл).
Приготовление стандарта 0,5 по Макфарланду: К 0,5 мл раствора бария
хлорида в концентрации 0,048 моль/л (1,175 % раствор BaCl 2 x 2 H2O) медленно
при тщательном перемешивании добавляют 99,5 мл раствора H2SO4 в
концентрации 0,18 моль/л (1 %) до получения гомогенной суспензии.
Полученную суспензию разливали по 4−6 мл в пробирки с герметично
закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и
используемые для приготовления бактериальной суспензии.
Хранили пробирки с суспензией в темном месте при комнатной
температуре.
Перед использованием пробирки тщательно встряхивали и оценивали
однородность суспензии.
Приготовление инокулюма из агаровой культуры. Для приготовления
инокулюма использовали чистую суточную культуру S. аureus, выросшую на
МПА. Отбирали несколько однотипных, четко изолированных колоний. Петлей
переносили незначительное количество материала с верхушек колоний в
пробирку со стерильным изотоническим раствором натрия хлорида, доводили
оптическую плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда.
Инокулюм использовали в течение 15 минут после приготовления.
Инокуляция приготовленной суспензии. Стандартный инокулюм наносили
пипеткой на поверхность чашки Петри со средой Мюллера-Хинтона в объеме
1 − 2 мл, равномерно распределяли по поверхности покачиванием, после чего
удаляли избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивали при
комнатной температуре в течение 10 − 15 минут.
Аппликация дисков и инкубация. Не позднее, чем через 15 минут после
инокуляции на поверхность агара наносили диски с антибиотиками. Аппликацию
69
дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Соблюдали расстояние от
диска до края чашки и между дисками, которое должно быть 15 − 20 мм. Таким
образом, на одну чашку (диаметр 100 мм) помещали не более 6 дисков с
антибиотиками. Диски равномерно контактировали с поверхностью агара, с этой
целью их аккуратно прижимали пинцетом.
Температура
и
длительность
инкубации.
Непосредственно
после
аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и
инкубировали при температуре 35°С в течение 24 часов.
Учёт результатов антибиотикограммы. После окончания инкубации чашки
помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на
них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста
измеряли с обратной стороны чашки, не открывая её, с точностью до 1 мм.
При измерении зон задержки роста ориентировались только на зону
полного подавления видимого роста. Исключения составили случаи учета
результатов определения чувствительности S. аureus к оксациллину, когда
учитывались и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны
подавления роста (Рисунок 11).
Рисунок 11. Изучение антибиотикограммы штаммов S. аureus дискодифузионным
методом на агаре Мюллера-Хинтона
70
ГЛАВА 3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ И
РАЗРАБОТКА АНТИМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА ЭВКАЛИПТА
ПРУТОВИДНОГО
3.1. Совершенствование методов стандартизации листьев эвкалипта
прутовидного
Как уже отмечалось в обзоре литературы (глава 1.1.4) существует несколько
методов определения содержания суммы фенолальдегидов в листьях эвкалипта
прутовидного. Эти методы принципиально не отличаются и сводятся к
экстракции фенолальдегидов 70% или 95% этиловым спиртом, после чего раствор
фотометрируется при длине волны 278 нм. Однако отсутствие стадии очистки
извлечения предполагает содержание других фенолов (флавоноиды, танины,
фенолкарбоновые кислоты), присутствующих в химическом составе листьев
эвкалипта и поглощающих свет при длине волны 278 нм.
3.1.1. Оценка содержания фенолальдегидов в образцах листьев эвкалипта
прутовидного различными методами
В рамках исследований, направленных на сравнение существующих
методов количественного определения фенолальдегидов в листьях эвкалипта
прутовидного, оценку содержания фенолальдегидов проводили тремя методами,
подробно описанными в главе 2.2.2.1. Единственное отличие первых двух
методик заключается в процедуре экстракции. Третья методика в отличие от двух
других предполагает процедуру очистки фенолальдегндов от примесей. Для
каждого образца сырья определяли содержание фенолальдегидов в % с учётом
доверительного интервала (Таблица 7).
Полученные результаты показали, что при использовании метода № 2
содержание фенолальдегидов оказывается примерно в полтора раза больше, чем
при использовании методов № 1 и 3, которые продемонстрировали для каждого
образца сопоставимые результаты.
71
Таблица 7.
Содержание
фенолальдегидов
в
образцах
листьев
эвкалипта
прутовидного
Образец листьев
прутовидного
эвкалипта
1. Сирия, 2007 г.
2. Марокко, 2008 г.
3. Абхазия, 2008 г.
4. Абхазия, 2009 г.
5. Абхазия, 2010 г.
6. Абхазия, 2011 г. (образец 1)
7. Абхазия, 2011 г. (образец 2)
8. ЗАО «Здоровье», серия
020210, 2010 г.
9. ЗАО «Здоровье», серия
0151210, 2010 г.
10. ЗАО «Здоровье», серия
020211, 2011 г.
Метод № 1
норма, не
менее 3%
2,9 ± 0,2
4,6 ± 0,4
7,4 ± 0,6
7,3 ± 0,5
6,1 ± 0,4
9,6 ± 0,9
9,0 ± 0,9
6,9 ± 0,6
Метод № 2
норма, не
менее 5%
5,4 ± 0,4
7,4 ± 0,7
12,5 ± 1,2
12,3 ± 1,0
9,8 ± 0,7
15,7 ± 1,3
14,6 ± 1,0
10,5 ± 0,9
Метод № 3
норма, не
менее 3%
3,2 ± 0,2
3,7 ± 0,2
8,3 ± 0,7
8,0 ± 0,6
7,3 ± 0,4
11,4 ± 1,1
10,9 ± 0,9
6,5 ± 0,5
6,5 ± 0,7
9,6 ± 0,8
5,9 ± 0,5
6,1 ± 0,5
9,5 ± 1,0
5,9 ± 0,5
Однако причина таких существенных различий результатов методов № 1 и 2
и методов № 2 и 3 представляется разной. При сравнении результатов первой
пары методов количественного определения фенолальдегидов разницу можно
объяснить неполнотой экстракции БАВ (фенолальдегидов и других фенольных
соединений) при использовании метода № 1. При сравнении второй пары методов
несоответствие результатов может быть связано с применяемой в методе № 3
процедурой очистки извлечения от сопутствующих фенольных соединений.
Однако во всех случаях полученные результаты в разы выше минимального
установленного содержания (до трех раз). Это косвенно говорит о неточности
установленного нижнего предела существующих методик. Если для методов № 1
и № 2 завышенные результаты легко объяснить влиянием на измеряемую
оптическую плотность присутствующих в извлечениях других фенольных
соединений (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), то
для метода № 3 сомнительным является использование в качестве удельного
72
показателя поглощения ГСО эвкалимина (417), существенно отличающегося от
принятого в ФС 42-3606-98 значения (720). Этот удельный показатель
поглощения используется в методах № 1 и 2. Кроме того несмотря на то, что при
разработке метода № 3 [28] предполагается, что сумма хлорофиллов не является
действующим началом хлорофиллипта и листьев эвкалипта прутовидного, автор
методики тем не менее воспроизводит основные этапы технологии получения
хлорофиллипта, направленные именно на максимальное извлечение суммы
хлорофиллов.
3.1.2. Разработка методики количественного анализа терпеноидных
фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного
Причиной,
по
которой
методы
количественного
определения
фенолальдегидов дают завышенные результаты, может быть присутствие в
извлечениях других фенольных соединений. Для проверки этого предположения
был
записан
УФ-спектр
спиртового
извлечения
из
листьев
эвкалипта
прутовидного, приготовленного способом, описанным в методе № 2. При этом, а
также во время последующих исследований использовались заготовленные в
Абхазии в 2011 году образцы листьев эвкалипта прутовидного с наибольшим (по
сравнению с другими объектами, перечисленными в Таблице 7) содержанием
феноальдегидов.
УФ-спектр полученного спиртового экстракта (Рисунок 12) имел в
измеряемом диапазоне длин волн точку перегиба, четко выраженный максимум
отсутствовал.
Это
подтверждает
сформулированное
предположение
поглощении света в этой области спектра сопутствующими веществами.
о
73
Оптическая плотность
3
2,5
2
1,5
1
0,5
344
335
326
317
308
299
290
281
272
263
254
245
236
227
218
209
200
0
Длина волны, нм
Рисунок 12. УФ-спектр поглощения этанольного экстракта из листьев эвкалипта
прутовидного
Терпеноидные фенольдегиды являются липофильными соединениями и, по
мнению ряда авторов, лучше всего экстрагируются не этиловым спиртом, а
петролейным эфиром с небольшими добавками (до 20%) ацетона [38]. Поскольку
сопутствующие вещества фенольной природы (флавоноиды, фенолкарбоновые
кислоты,
дубильные
вещества),
искажающие
результаты
определения
фенолальдегидов, имеют гидрофильную природу, для сравнения использовали
избирательную экстракцию фенолальдегидов гидрофобным растворителем –
гексаном. Так как гексановый экстракт не подвергается никакой очистке,
нахождение в нем других фенольных соединений будет приводить к неверным
(завышенным)
количественного
результатам,
определения
поэтому
на
терпеноидных
стадии
разработки
фенолальдегидов
методики
в
листьях
эвкалипта прутовидного большое внимание уделялось доказательству отсутствия
в извлечении подобных соединений.
Прежде всего, анализ литературных данных показал, что даже наиболее
липофильные пренилированные флавоноидные агликоны типа ксантогумола и
изоксантогумола не экстрагируется такими липофильными растворителями как
гексан или сжиженный СО2 [1], не говоря уже о других более гидрофильных
флавоноидах и гидроксикоричных кислотах.
74
Для исключения возможности попадания примесей фенольной природы в
гексановое
извлечение
полученный
экстракт
подробно
исследовался
на
отсутствие других фенолов методом ТСХ.
Были
проведены
исследования
по
выбору
оптимальной
системы
хроматографирования и проявителя, позволяющих однозначно идентифицировать
фенолальдегиды.
Использовали
следующие
системы:
хлороформ,
хлороформ : этилацетат (9:1), гексан : ацетон (9:1; 1:1), гексан : этилацетат (9:1;
1:1), гексан : хлороформ (9:1; 1:1), хлороформ : спирт (1:1; 1:2); бензол : ацетон
(4:1). Было установлено, что наилучшего разделения удаётся достичь при
использовании хроматографической системы хлороформ : спирт (1:1). В качестве
проявителей использовали: 0,5% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М
растворе хлористоводородной кислоты, 0,5% раствор 2,4-динитрофенилгидразина
в
0,5 М
спиртовом
растворе
гидроксида
калия,
1%
водный
раствор
железоаммонийных квасцов, 1% раствор ванилина в 50% растворе фосфорной
кислоты. Наилучшей проявляющей способностью обладали 0,5% раствор 2,4динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной кислоты и
1% водный раствор железоаммонийных квасцов.
Фенолальдегиды обнаруживаются на хроматограмме испытуемого раствора
в виде пятен оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин) и тёмно-фиолетового цвета
(железоаммонийный квасцы) с величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7, совпадающих по
расположению с пятнами на хроматограмме раствора ГСО эвкалимина [28].
Других окрашенных пятен на хроматограмме не наблюдалось. Хроматограмма
гексанового извлечения из листьев эвкалипта прутовидного представлена на
Рисунке 13.
Об отсутствии флавоноидов и гидроксикоричных кислот (как наиболее
распространенных в растениях фенолов) свидетельствует УФ-спектр гексанового
экстракта (Рисунок 14), не имеющий «плеч» в диапазоне длин волн 320-360 нм, в
районе которых имеют максимумы поглощения указанные соединения. В свою
очередь УФ-спектр гексанового экстракта имеет отчетливый максимум при
75
278 ± 3 нм, характерный для фенолальдегидов эвкалипта. Данная длина волны
была выбрана в качестве аналитической.
Rf ~0.7
Rf ~0.6
Rf ~0.4
1
2
Рисунок 13. ТСХ гексанового извлечения из листьев эвкалипта прутовидного. 1 –
проявлено 2,4-динитрофенилгидразином; 2 – проявлено железоаммонийными
квасцами
Оптическая плотность
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
347,5
341
334,5
328
321,5
315
308,5
302
295,5
289
282,5
276
269,5
263
256,5
250
0
Длина волны, нм
Рисунок 14. УФ-спектр поглощения гексанового экстракта из листьев эвкалипта
прутовидного.
Известно, что фенольные гидроксилы, находящиеся по соседству с
карбонильной группой, могут образовывать комплексы с хлоридом алюминия,
которые вызывают батохромный сдвиг максимумов поглощения в УФ-спектре. В
частности, эта реакция широко используется в анализе флавоноидов (Рисунок 15).
76
OH
HO
O
OH
O
O
Al
Cl
Cl
Рисунок 15. Комплекс флавоноидов с хлоридом алюминия.
Мы предположили, что фенолальдегиды эвкалипта могут образовывать
подобные комплексы с хлоридом алюминия (Рисунок 16).
Cl
O
Al
HO
CH
H
Cl
O
OH
HC
H
O
O
Al
Cl
Cl
Рисунок 16. Комплекс фенолальдегидов эвкалипта с алюминия хлоридом.
Для проверки этого предположения гексановый экстракт листьев эвкалипта
прутовидного упаривали под вакуумом досуха, остаток растворяли в 95%
этиловом спирте и записывали УФ-спектры самого спиртового раствора и
раствора после добавления 3% спиртового раствора хлорида алюминия
(Рисунок 17).
Батохромный сдвиг максимума поглощения является дополнительным
доказательством перехода в гексановый экстракт фенолальдегидов эвкалипта.
77
Этанольный раствор
Оптическая плотность
0,9
0,8
Этанольный раствор +
раствор хлорида
алюминия
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
347,5
341
334,5
328
321,5
315
308,5
302
295,5
289
282,5
276
269,5
263
256,5
250
0
Длина волны, нм
Рисунок 17. УФ-спектр поглощения этанольного раствора E. viminalis.
Комплекс подобной структуры, по-видимому, образуется и с сульфатом
меди (II). УФ-спектры спиртового раствора и раствора после довабления 2%
спиртового раствора сульфата меди показаны на Рисунке 18. В этом случае
батохромный сдвиг отсутствует, однако значение оптической плотности раствора
после добавления реактива в точке максимума выше, чем у спиртового раствора
без добавления сульфата меди.
0,9
Оптическая плотность
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Длина волны
0
240
260
280
300
320
340
360
Рисунок 18. УФ-спектр поглощения этанольного раствора E. viminalis. Сплошная
линия – этанольный раствор; пунктирная линия – этанольный раствор после
добавления сульфата меди (II).
78
УФ-спектры гексанового и спиртового растворов (без хлорида алюминия),
оказались одинаковыми как по характеру кривой, так и по показателю
поглощения в точке максимума. Это позволило нам использовать удельный
показатель поглощения эвкалимина в спирте для нашей методики.
На дальнейших этапах разработки методики были определены условия
исчерпывающей экстракции терпеноидных фенолальдегидов по соотношению
сырья и экстрагента и продолжительности нагревания (Таблица 8).
Таблица 8. Зависимость
выхода
фенолальдегидов
листьев
эвкалипта
прутовидного в гексан от параметров экстракции
Соотношение сырье (г) –
экстрагент (мл)
Время
экстракции, мин
1:100
1:100
1:100
1:200
1:200
1:200
30
60
90
30
60
90
Полученные
результаты
показали,
Содержание суммы
фенолальдегидов в пересчете
на эвкалимин, %
3,99 ± 0,03
4,98 ± 0,05
5,25 ± 0,12
4,07 ± 0,09
5,58 ± 0,13
5,57 ± 0,03
что
условиями
исчерпывающей
экстракции фенолальдегидов из листьев эвкалипта прутовидного является часовая
экстракция кипящим гексаном при соотношении сырья и растворителя 1:200.
На основании вышеизложенного предлагается методика количественного
определения терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного.
Методика количественного определения суммы терпеноидных
фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера 1 мм. Около 1 г сырья
(точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 500 мл,
прибавляют 200 мл гексана. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и
нагревают на водяной бане при умеренном кипении гексана в течение 60 мин.
Затем колбу охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 200 мл, доводя объем раствора до метки гексаном.
79
1 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу вместимостью
50 мл и доводят объем раствора до метки гексаном. Измерение оптической
плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве
раствора сравнения гексан. Содержание суммы терпеноидных фенолальдегидов в
пересчете на эвкалимин и абсолютно сухое сырье в процентах (х) вычисляют по
формуле:
х 
D  200  50  100
,
720  m  1  (100  W )
(6)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
720 – удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании, %
Для определения метрологических характеристик разработанной методики
провели 10 параллельных определений (Таблица 9).
Таблица 9. Метрологические
характеристики
метода
определения
фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного
f
9
хср.
5,58
S2
0,0354
Полученные
воспроизводимости
S
0,1881
результаты
методики,
P
0,95
свидетельствуют
ошибка
∆х
0,13
t (0,95; 9)
2,26
об
ε, %
±2,33
удовлетворительной
единичного
определения
не
превышает ± 2,33%.
Разработанная методика была апробирована на различных образцах листьев
эвкалипта прутовидного. Результаты приведены в Таблице 10.
Таблица 10. Содержание фенолальдегидов в различных образцах листьев
эвкалипта прутовидного
Образец листьев эвкалипта прутовидного
1. Абхазия, 2011 г.
2. Московский рынок г. Казани, 2012 г.
Содержание
феноладьдегидов, %
5,58± 0,13
5,18 ± 0,1
80
3. ООО «Фитофарм», серия 030911, 2011 г.
1,77 ± 0,1
Продолжение таблицы 10
Образец листьев эвкалипта прутовидного
Содержание
феноладьдегидов, %
4. ОАО «Красногорсклексредства», серия 20211, 2011
2,15 ± 0,1
г.
5. ОАО «Татхимфармпрепараты», 2012 г.
3,14 ± 0,1
6. Ново-Савиновский рынок г. Казани, ноябрь 2013
5,09 ± 0,1
7. г. Чебоксары, 2013
3,41± 0,1
8. ООО «Доктор Баня» (г. Новосибирск), 2013 г.
5,06 ± 0,1
На основании полученных результатов нами было установлено, что
содержание суммы терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта
прутовидного в пересчете на эвкалимин и абсолютно сухое сырье должно
составлять не менее 1,5 %.
3.1.3. Разработка методик качественного анализа листьев эвкалипта
прутовидного
В
процессе
разработки
методики
количественного
определения
фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного были использованы подходы
для идентификации фенолальдегидов в гексановом извлечении из сырья (ТСХанализ, запись УФ-спектра). Подобные подходы могут быть применимы для
определения подлинности и доброкачественности сырья и введены в проект
новых НД на листья эвкалипта прутовидного в раздел «Качественные реакции».
Методика обнаружения и идентификации фенолальдегидов в листьях
эвкалипта прутовидного
1. На линию старта хроматографической пластинки марки Сорбфил
ПТСХ АФ-А размером 10х15 см, наносят 0,05 мл раствора гексанового экстракта,
приготовленного в соответствии с методикой количественного определения.
81
Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин,
затем помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью
хлороформ : спирт (1:1), и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей дойдёт до края пластинки, ее вынимают из
камеры, высушивают на воздухе в течение 20 минут, затем обрабатывают 0,5%
раствором 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной
кислоты и 1% водным раствором железоаммонийных квасцов.
Фенолальдегиды обнаруживаются на хроматограмме испытуемого раствора
в виде пятен пятна оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин) и тёмно-фиолетового
(железоаммонийные квасцы) цвета с величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7.
Примечание:
1. Подготовка
пластинок.
Пластинки
«Сорбфил
ПТСХ-АФ-А»
для
активации предварительно выдерживают в сушильном шкафу при температуре
100-105°С в течение 1 ч. Хроматографическую камеру насыщали парами
растворителей в течение 1 ч.
2. Приготовление раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М. растворе
хлористоводородной кислоты: 0,1 г 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в 20
мл 2 М раствора хлористоводородной кислоты (Европейская Фармакопея VII
издания с. 425). Раствор применяют свежеприготовленным.
3. Приготовление 1% раствора железоаммонийных квасцов (Европейская
Фармакопея VII издания с. 419): 1 г железоаммонийных квасцов растворяют в 100
мл воды. Раствор применяют свежеприготовленным.
2. УФ-спектр
соответствии
с
раствора
методикой
гексанового
извлечения,
количественного
приготовленного
определения,
должен
иметь
отчётливый максимум поглощения при 278 ± 3 нм.
3.1.4. Изучение зависимости между содержанием фенолальдегидов в
извлечении из листьев эвкалипта прутовидного и антибактериальной
активностью
в
82
Для установления зависимости между содержанием фенолальдегидов,
определенных по разработанной нами методике количественного определения, и
уровнем антимикробной активности были проведены микробиологические
испытания на музейном штамме S. aureus АТСС 6538-Р. С этой целью гексан из
полученных извлечений отгонялся досуха под вакуумом, остаток растворялся в 50
мл 95%этанолового спирта. Результаты по оценке антибактериальной активности
извлечения из листьев эвкалипта прутовидного приведены в Таблице 11.
Таблица 11. Антибактериальная активность извлечения из листьев эвкалипта
прутовидного (на культуре S. aureus ATTC 6538-P)
Извлечение
Концентрация
фенолальдегидов
в извлечении, .%
Максимальное разбавление
МПК
извлечения,
фенолальдегиинактивирующее
дов, мкг/мл
размножение стафилококков
1:256
4,4
Спиртовой
0,11 ± 0,02
экстракт (1:50),
полученный
после удаления
гексана
Испытуемый раствор показал высокий уровень антимикробной активности,
что подтверждает избирательность экстракции действующих веществ эвкалипта
прутовидного – терпеноидных фенолальдегидов гексаном.
3.1.5. Основные показатели и нормы качества листьев эвкалипта
прутовидного
В Таблице 12 представлены основные показатели и нормы качества листьев
эвкалипта прутовидного, которые могут быть внесены в проект новой НД на
сырьё.
Таблица 12. Основные
показатели
и
нормы
качества
листьев
прутовидного
Разделы ФС
Внешние признаки
Метод анализа
Нормы
Оставлен без изменений (ст. 15 ГФ XI)
эвкалипта
83
Фенолальдегиды
ТСХ
На хроматограмме испытуемого
раствора должны наблюдаться пятна
оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин в 2 М растворе хлористо-
Продолжение таблицы 12
Фенолальдегиды
ТСХ
водородной кислоты и тёмнофиолетового цвета (1% раствор
железоаммонийных квасцов), принадлежащие фенолальдегидам с Rf
около 0,4; 0,6 и 0,7
Спектрофотометрия УФ-спектр раствора гексанового
извлечения, приготовленного по
разделу «Количественное определение», должен иметь отчётливый
максимум
поглощения
при
278 ± 3нм
Числовые
показатели
Количественное
определение
Эфирное масло, %
Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы
фенолальдегидов
Метод 1 ГФ XI
Не менее 1,0
Сумма
Спектрофотометрия Не менее 1,5
фенолальдегидов, %
3.2. Разработка технологии получения антибактериального препарата из
листьев эвкалипта прутовидного
3.2.1. Изучение динамики высвобождения фенолальдегидов из сырья
Ранее в разделе 3.1.2 было показано, что терпеноидные фенолальдегиды
избирательно экстрагируются неполярными растворителями типа гексана.
Взяв за основу селективность гексана в вопросе избирательной экстракции
терпеноидных фенолальдегидов, изучали динамику высвобождения действующих
веществ из сырья. Учитывая экономический аспект произвели замену гексана,
который использовался для количественного определения, на более доступный
84
петролейный эфир 40/70, который по экстрагирующей активности не уступал
гексану. Навеска сырья экстрагировалась в колбе на водяной бане при кипении
растворителя. В результате было установлено, что исчерпывающая экстракция
достигается при соотношении сырья и растворителя 1:200. Однако для
промышленного производства такие соотношения не подходят, ввиду чрезмерных
материальных
затрат.
Было
решено
изучить
динамику
экстракции
фенолальдегидов меньшими объемами петролейного эфира. Мы использовали
соотношение 1:50, время экстракции 30 и 60 минут. Проводили четырёхкратные
экстракции, после каждой экстракции в полученных извлечениях оценивали
содержание фенолальдегидов (х) в пересчете на эвкалимин и абсолютно сухое
сырьё в процентах, по формуле:
x 
D  50  100  100
,
720  m  1  (100  W )
(7)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
720 – удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании, %
Динамика
высвобождения
фенолальдегидов
наглядно
Рисунке 19.
x, %
3
1.5
0
1
2
3
4
показана
на
85
Рисунок 19. Гистограмма высвобождения фенолальдегидов из листьев эвкалипта
прутовидного при экстракции петролейным эфиром 40/70. Черные столбцы –
результаты последовательных экстракций при t = 1 час; серые столбцы –
результаты последовательных экстракций при t = 30 мин.
Из результатов видно, что основная часть фенолальдегидов высвобождается
в течение первых двух экстракций. Двукратная экстракция (по 30 минут каждая)
суммарно извлекает фенолальдегидов почти столько же сколько по 1 часу каждая:
89 ± 3,86 % и 93,63 ± 0,39% соответственно.
Содержание фенолальдегидов в извлечениях, полученных двухкратной
экстракцией при соотношении сырья и экстрагента 1:50 в течение 30 минут и 1 ч
показано в Таблице 13.
Таблице 13. Содержание фенолальдегидов в извлечениях из листьев эвкалипта
прутовидного при экстракции петролейным эфиром 40/70, %
Количество
извлечённых
фенолальдегидов
(% от массы сырья)
4,62 ± 0,2
Х
Концентрация
фенолальдегидов
в извлечениях, %
30 мин.
Степень извлечения
фенолальдегидов при
двукратной экстракции
(% от суммы в сырье)
89 ± 3,86
1 час
93,63 ± 0,39
4,85 ± 0,2
0.05 ± 0,002
Время
экстракции
0,05 ± 0,004
С целью сократить объёмы растворителя, расходуемые для извлечения
фенолальдегидов использовали экстрагирование в аппарате Сокслета. Навеску
экстрагировали петролейным эфиром 40/70 в соотношении 1:50, через 10, 15 и 20
сливов растворителя отбирались пробы для анализа. Результаты приведены в
Таблице 14.
Таблица 14. Выход фенолальдегидов из листьев эвкалипта прутовидного при
экстракции петролейным эфиром 40/70 в аппарате Сокслета
Количество сливов экстрагента
Выход фенолальдегидов (% от всей
суммы в сырье)
10
73,6 ± 3,8
15
74,1± 3,76
20
66,5± 2,63
86
Результаты показали, что достичь степени извлечения, которая получается
при кипячении сырья с растворителем в экстракционной колбе, в аппарате
Сокслета не удается. К тому же к 20 сливу уровень фенолальдегидов начинает
снижаться, что вероятно обусловлено термической деструкцией этих соединений,
поскольку 20 сливов – это несколько часов экстракции, в течение которых
фенолальдегиды подвергаются термическому воздействию.
Таким
образом,
наиболее
оптимальным
(с
точки
зрения
выхода
фенолальдегидов и экономичности режима экстракции) был принят вариант
двукратной экстракции сырья в соотношении 1:50 в экстракционной колбе общей
продолжительностью 1 час, который позволяет извлечь около 90% всех
фенолальдегидов.
Вышеизложенное позволило нам предложить технологию получения
антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного.
Технология получения антибактериального препарата из листьев
эвкалипта прутовидного:
20,0 г измельченных листьев эвкалипта прутовидного (размер частиц не
более 1 мм) помещают в стеклянную колбу, заливают 1:50 (1000 мл)
петролейного эфира с температурой кипения 40–70 ºС и экстрагируют при
температуре
кипения
растворителя
в
течение
30
минут
с
обратным
холодильником. После охлаждения раствор отфильтровывают в другую колбу, к
сырью, оставшемуся в колбе, приливают 1000 мл петролейного эфира с
температурой кипения 40–70 ºС и повторно экстрагируют 30 минут в тех же
условиях. После охлаждения профильтровывают через тот же фильтр в колбу с
первой порцией экстракта. Полученное извлечение упаривают до сухого остатка.
Сухой остаток растворяют в 100 мл 95% этилового спирта и отфильтровывают.
Предлагаемая новая технологическая схема (Рисунок 20) значительно
минимизирует число стадий производства препарата, как следствие повышает
сохранность действующих веществ на выходе, исключает использование
растворителей с высокой степенью токсичности, обеспечивает устойчивость в
87
процессе хранения в связи с отсутствием чувствительных к действию света
хлорофиллов.
Петролейный
эфир 40/70
Измельчённые листья
эвкалипта прутовидного
Экстракция Т-Ж
Вытяжка
Вакуум-выпарка
95%спирт
Отгон
петролейного
эфира 40/70
Сухой остаток
Растворение
Спиртовый раствор
(фенолальдегиды)
Рисунок 20. Технологическая схема получения антибактериального препарата на
основе листьев эвкалипта прутовидного.
3.2.2. Оценка антибактериальной активности препарата из листьев
эвкалипта прутовидного
Количественную оценку антимикробного действия полученного препарата
из листьев эвкалипта прутовидного (условно названного «Флорофелиптом»)
проводили в сравнении с препаратами «Хлорофиллипт (1% раствор спиртовый) и
«Галенофиллипт» (препарат «Эвкалимин» на рынке в настоящее время
отсутствует) методом двукратных серийных разведений в МПБ (pH 7,0) с
88
музейными микробами: S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р и штаммами,
полученными из носоглотки от здоровых носителей.
Антибактериальная активность препарата в отношении музейного штамма
S. aureus АТСС 6538-Р показала, что в разведении 1:2560 (3,9 мкг/мл) препарат
способен
оказывать
бактериостатическое
действие
на
микроорганизм.
Сравнительную оценку антибактериальной активности «Флорофелипта» с
«Хлорофиллиптом» и «Галенофиллиптом» проводили с точки зрения их
бактерицидного действия на клетку ввиду того, что суммарные эсктракционные
препараты были мутными. Полученные результаты представлены в Таблице 15.
Таблица 15. Антибактериальная активность препаратов из листьев эвкалипта
прутовидного на музейном штамме S. aureus АТСС 6538-Р
Препарат
Максимальное разбавление
извлечения, оказывающее
бактерицидное действие
1:1280
1:512
1:256
«Флорофелипт»
«Хлорфиллипт
«Галенофиллипт»
МПК препарата,
мкг/мл
7,8
19,5
39,06
Оценку антибактериальной активности проводили, сравнивая показатели
МПК препаратов, оказывающей бактерицидное действие на клетку S. аureus, так
как оценка антибактериальной активности путём сравнения МПК действующих
веществ
(терпеноидных
понятным
причинам
фенолальдегидов)
(все
известные
является
методы
нецелесообразной
количественной
по
оценки
терпеноидных фенолальдегидов в препаратах эвкалипта дают завышенные
результаты).
Таким образом, оценить МПК суммы терпеноидных фенолальдегидов в
отношении музейного штамма S. aureus АТСС 6538-Р мы смогли только для
«Флорофелипта», которая составила 0,72 мкг/мл.
Полученные результаты показали, что антибактериальная активность
препарата на основе листьев эвкалипта прутовидного на музейном штамме
89
S. аureus в 2,5 раза выше, чем у «Хлорофиллипта» и в 5 раз выше, чем у
«Галенофиллипта».
В работе Н.М. Крутиковой, С.А. Вичкановой [13] при сравнительном
изучении в опытах in vitro антимикробной активности «Хлорофиллипта» в
отношении штаммов стафилококка с различной степенью лекарственной
резистентности было показано, что МПК препарата колебалась в пределах от 15,6
до 31,2 мкг/мл. Для образца «Хлорофиллипта», анализируемого нами в рамках
данного исследования, МПК составило 19,5 мкг/мл, что вписывается в пределы,
показанные в иных исследованиях.
Также проводили сравнительное изучение антибактериальной активности
«Флорофелипта»
и
его
аналогов
в
отношении
клинических
штаммов
стафилококков с использованием 24 штаммов патогенных микроорганизмов вида
S. aureus. На Рисунке 21 показана чувствительность исследуемых штаммов
стафилококка
к
антибиотикам:
79%
штаммов
были
резистентны
к
бензилпенициллину, а 13% к эритромицину. Все остальные штаммы были
чувствительны к используемым в опыте антибиотикам. Было установлено, что
«Флорофелипт»
обладает
высокой
бактериостатической
и
бактерицидной
активностью в отношении исследуемых клинических штаммов. Максимальное
разбавление «Флорофелипта», оказывающее бактериостатическое действие
составило от 1/2560 до 1/640 (от 3,9 до 15,6 мкг/мл), а бактерицидное – 1/1280 до
1/640 (от 7,8 до 15,6 мкг/мл) Для сравнения антибактериальная активность
«Хлорофиллипта» и «Галенофиллипта» с точки зрения бактерицидного действия
на стафилококковую клетку составили от 1/512 до 1/128 (от 19,5 до 78,13 мкг/мл)
для
«Хлорофиллипта»
и
1/256-1/64
«Галенофиллипта» соответственно.
(от
39,06
до
156,25
мкг/мл)
для
90
Ванкомицин
Оксациллин
Линкомицин
Гентамицин
Ципрофлоксацин
Эритромицин
Бензилпенициллин
0
20
40
60
100%
80
Рисунок 21. Чувствительность к антибиотикам штаммов S. aureus, выделенных со
слизистой дыхательных путей больных (нос, зев, мокрота) (% чувствительных
штаммов)
В
связи
с
метициллинрезистентных
проводили
широким
(MRSA)
антибактериальную
распространением
штаммов
в
стационарах
золотистого
стафилококка,
оценку препаратов из листьев
эвкалипта
прутовидного на штаммах MRSA. Так как среди исследуемых нами клинических
штаммов S. aureus не было обнаружено образцов, устойчивых к оксациллину, мы
посчитали целесообразным провести оценку антибактериальной активности
препаратов на музейном штамме MRSA 205-Р. Оценку антибактериальной
активности
«Флорофелипта»
в
сравнении
с
«Хлорофиллиптом»
и
«Галенофиллиптом» проводили с точки зрения их бактерицидного действия на
культуру золотистого стафилококка (Таблица 16).
Таблица 16. Антибактериальная активность препаратов из листьев эвкалипта
прутовидного на музейном штамме S. aureus MRSA 205-Р
Препарат
«Флорофелипт»
«Хлорофиллипт
«Галенофиллипт»
Максимальное разбавление
извлечения, оказывающее
бактерицидное действие
1:640
1:64
1:64
МИК препарата,
мкг/мл
15,63
156,25
156,25
91
МПК суммы терпеноидных фенолальдегидов в отношении MRSA 205-Р для
«Флорофелипта» составила 1,44 мкг/мл.
Полученные результаты показали, что антибактериальная активность
«Флорофелипта» в отношении клинических штаммов золотистого стафилококка
также в 2,5 раза превосходила активность «Хлорофиллипта» и была выше в 5 раз,
чем у «Галенофиллипта». Для музейного штамма, устойчивого к метициллину,
разница активность отличалась 10 раз.
Результаты
по
антибактериальной
активности
«Флорофелипта»
в
отношении музейного штамма MRSA указывают на возможность широкого
применения
препарата
для
лечения
заболеваний,
вызванных
антибиотикоустойчивыми грамположительными микроорганизмами.
3.2.3. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из листьев
эвкалипта прутовидного
Полученный
с
помощью
селективной
экстракции
фенолальдегидов
«Флорофелипт» должен проходить этапы стандартизации как в качественном, так
и в количественном отношении по терпеноидным фенолальдегидам, как
основным
соединениям,
отвечающим
за
его
фармакологический
(антибактериальный) эффект.
С этой целью основное внимание было уделено разработке анализа
препарата по разделам «Подлинность» и «Количественное определение».
Для раздела «Подлинность» использовали экспериментальные данные,
полученные при анализе листьев эвкалипта прутовидного на содержание
терпеноидных фенолальдегидов (см. раздел 3.1.3). Записанный УФ-спектр
«Флорофелипта», полученный путём экстракции петролейным эфиром 40/70,
имел четко выраженный максимум поглощения при длине волны 278 ± 3 нм,
совпадающий с УФ-спектром гесанового извлечения, приготовленного для
количественного анализа сырья эвкалипта прутовидного.
92
Учитывая природу действующих веществ антибактериального препарата
посчитали
целесообразным
проводить
качественную
идентификацию
терпеноидных фенолальдегидов методом ТСХ-анализа. Для установления
оптимальных условий хроматографирования использовали экспериментальные
данные по обнаружению терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта
прутовидного (см. раздел 3.1.2). Было установлено, что наилучшего разделения
удаётся
достичь
при
использовании
хроматографической
системы
хлороформ : спирт (1:1). В качестве проявителей использовали: 0,5% раствор 2,4динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной кислоты и 1%
водный раствор железоаммонийных квасцов.
Фенолальдегиды обнаруживаются на хроматограмме в виде пятен
оранжевого
(2,4-динитрофенилгидразин)
и
тёмно-фиолетового
цвета
(железоаммонийный квасцы) с величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7, совпадающих по
расположению с пятнами на хроматограмме раствора ГСО эвкалимина [24].
Других окрашенных пятен на хроматограмме не наблюдалось.
В основу метода количественной стандартизации был положен УФспектрофометрический метод определения терпеноидных фенолальдегидов в
листьях эвкалипта прутовидного, описанный в разделе 3.1.2. Полученные
экспериментальные
данные
при
анализе
сырья
эвкалипта
прутовидного
позволили предложить методику количественного определения фенолальдегидов
в разработанном антибактериальном препарате.
Методика количественного определения фенолальдегидов в
антибактериальном препарате из листьев эвкалипта прутовидного:
1 мл препарата переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят
объем раствора до метки 95% этиловым спиртом. Измерение оптической
плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве
раствора сравнения 95% этиловый спирт. Содержание суммы производных
терпеноидных фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин в процентах (х)
вычисляют по формуле:
93
x 
D 100 100
,
720
(7)
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора; 720 – удельный показатель
поглощения ГСО эвкалимина;
В
таблице 17
представлены
результаты
разработанной
методики
количественного определения терпеноидных фенолальдегидов в препарате.
Определение
проводилось
10
раз,
результаты
обрабатывались
методом
вариационной статистики с применением коэффициента Стьюдента.
Таблица 17. Результаты количественного определения суммы фенолальдегидов в
антибактериальном
препарате
из
листьев
эвкалипта
прутовидного.
Метрологические характеристики .
f
Х
S2
S
P
t (0,95; 9)
∆x
ε, %
9
0,92
0,00022
0,0149
0,95
2,26
0,01
±1,09
Полученные
результаты
свидетельствуют
об
удовлетворительной
воспроизводимости методики, ошибка метода не превышает 1,09%. Установлена
норма содержания суммы фенолальдегидов в препарате на основе листьев
эвкалипта прутовидного, которая составляет не менее 0,9%
3.2.4. Основные показатели и нормы качества лантибактериального
препарата из листьев эвкалипта прутовидного
Результаты
экспериментальных
исследований
по
разработке
технологического процесса экстракционного препарата из листьев эвкалипта
прутовидного и оценки показателей его качества должны быть отражены в НД на
препарат. Основные показатели и нормы качества препарата из листьев эвкалипта
прутовидного представлены в Таблице 18.
Таблица 18. Основные показатели и нормы качества препарата из листьев
эвкалипта прутовидного
Показатель
Метод анализа
Нормы
94
качества
Описание
Подлинность
Фенолальдегиды
Визуальный
ТСХ
УФ-спектрофотометрия
Прозрачная жидкость бледно-желтого
цвета, без запаха.
На хроматограмме испытуемого раствора
должны
наблюдаться
пятна
оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин
в 2 М растворе хлористоводородной
кислоты и тёмно-фиолетового цвета
(1% раствор железоаммонийных квасцов), принадлежащие фенолальдегидам
с Rf около 0,4; 0,6 и 0,7
УФ-спектр поглощения раствора препарата, приготовленного по разделу «Количественное определение», в области
от 230 до 280 нм должен иметь
максимум поглощения при 278 ± 3нм
Продолжение таблицы 18
Антибактериальн Микробиологическ Препарат должен подавлять рост тест
ая активность
ий метод
культуры S. aureus АТСС 6538-Р в
концентрации не менее 7,8 мкг/мл
Количественное
УФ-спектрофотоНе менее 0,9
определение
метрия
Сумма
фенолальдегидов, %
95
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 3
1. Разработаны методики качественного анализа листьев эвкалипта прутовидного,
основанные на обнаружении фенолальдегидов как основной группы БАВ,
проявляющей антибактериальную активность, с использованием ТСХ-анализа и
УФ-спектрофотометрического метода.
2. Разработана методика количественного определения суммы фенолальдегидов в
листьях
эвкалипта
спектрофотометрии.
прутовидного
Ошибка
с
использованием
единичного
определения
метода
УФ-
содержания
феноальдегидов не превышает ± 2,33%. В качестве нижнего предела содержания
суммы фенолальдегидов в листьях эвкалита прутовидного рекомендован
показатель «не менее 1,5%».
3. Предложен способ получения антибактериального препарата из листьев
эвкалипта
прутовидного – «Флорофелипта»,
основанный
на
избирательной
экстракции фенолальдегидов петролейным эфиром 40/70.
4. Разаработаны
методики
качественного
и
количественного
анализа
«Флорофелипта» по сумме терпеноидных фенолальдегидов с использованием
ТСХ и УФ-спектрофотометрического метода.
5. «Флорофелипт» оказывает бактерицидное действие в отношении музейного
штамма S. аureus.при МПК равном 7,8 мкг/мл, клинических, в том числе и
антибиотикоустойчивых штаммов S. аureus, при МПК – от 7,8 до 15,6 мкг/мл и в
отношении MRSA при МПК – 15,6 мкг/мл. Антибактериальная активность
«Флорофелипта» превышает в разы таковую у существующих аналогов.
96
ГЛАВА 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ И
ТЕХНОЛОГИИ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО
4.1.Оценка объективности метода количественного определения
дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного
Для
оценки
объективности
метода
количественного
определения
дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного, подробно описанного в
разделе
2.2.2.2,
сравнивались
УФ- спектры
неочищенного
(первичного)
ацетонового извлечения (Рисунок 22) и спиртового раствора, очищенного в
соответствии с рассматриваемой методикой (Рисунок 23).
Использование
фенольных
в
соединений
необходисмости
методике
ацетона,
извлекающего
листьев
шалфея
лекарственного,
применения
многостадийной
очистки
весь
комплекс
приводит
извлечения,
к
что
значительно осложнает всю процедуру оценки содержания дитерпеновых кислот.
На УФ-спектре ацетонового извлечения четко выражен пик на 330 нм,
характерный для гидроксикоричных кислот (в частности для розмариновой
кислоты) [114]. В очищенном спиртовом растворе высота этого пика
уменьшилась, однако он по-прежнему выражен, следовательно, часть этих
соединений осталась в растворе после очистки.
Поскольку второй основной максимум гидроксикоричных кислот находится
в районе 280 ± 5 нм, то эти соединения вносят свой вклад в оптическую плотность
раствора, измеряемого при аналитической длине волны. Поэтому результаты,
полученные в соответствии с методикой и принимаемые за содержание
дитерпеновых кислот, оказываются несколько выше истинных.
Дитерпены шалфея являются липофильными соединениями и хорошо
растворяются в неполярных растворителях типа петролейного эфира [90].
Для оценки экстрагируемости карнозоловой кислоты и ее производных из
листьев шалфея в петролейный эфир, был записан УФ-спектр соответствующего
извлечения, представленный на Рисунке 24.
97
Рисунок 22. УФ-спектры ацетонового (неочищенного)
извлечения из листьев шалфея лекарственного
Рисунок 23.
УФ-спектры
спиртового
извлечения из листьев шалфея лекарственног
(очищенного)
Оптическая плотность
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
250
300
350
400
450
Длина500
волны
Рисунок 24. УФ-спектр извлечения из листьев S. officinalis, полученного при экстракции петролейным эфиром 40/70.
98
Полученный спектр имел чёткий максимум при длине волны 285 ± 3нм и
полностью совпал с УФ-спектром карнозоловой кислоты, приведенным в
литературных источниках [111].
Сравнением УФ-спектров извлечений, полученных разными способами,
удалось
продемонстрировать
избирательность
петролейного
эфира
как
растворителя. Спектр извлечения, полученного при использовании петролейного
эфира 40/70 в качестве экстрагента (Рисунок 24) не имеет максимумов
поглощения в районе 330 нм. Дополнительно для подтверждения избирательной
экстракции дитерпеновых кислот гексаном записывали УФ-спектр ацетонового
экстракта,
полученного
экстракциипетролейным
экстракцией
эфиром,
то
жома
есть
листьев
шалфея
освобожденного
по
после
нашему
предположению от дитерпеновых кислот (Рисунок 25). На УФ-спектре четко
видны основные максимумы в районе 280 и 330 нм, которые характерны для
гидроксикоричных кислот.
Оптическая плотность
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
230
Рисунок 25. УФ-спектры
280
извлечений
Длина волны
380
330
из
листьев
шалфея
лекарственного,
полученных экстракцией жома после обработки петролейным эфиром 40/70.
Сплошная линия – ацетоновое (неочищенное) извлечение; пунктирная линия –
спиртовый (очищенный) раствор.
Результаты исследования показали, что петролейный эфир является
хорошим экстрагентом для извлечения дитерпеновых кислот листьев шалфея
лекарственного с точки зрения его селективности. В тоже время установлено, что
дитерпеновые
кислоты
являются
БАВ
с
доказанной
антибактериальной
99
активностью (см. раздел 1.2.3.), что диктует необходимость стандартизации
сырья, используемого для получения препаратов с антимикробным действием, по
данной группе БАВ. Для упрощения методики количественного определения
дитерпеновых кислот в сырье предлагается разработать соответствующий подход,
основанный на применении петролейного эфира 40/70 в качестве растворителя. С
целью выбора наиболее оптимального с точки зрения временных и материальных
затрат метода, в первую очередь, необходимо изучить кинетику экстракции
целевых извлекаемых веществ, определить основные механизмы, управляющие
массопереносом в сырье.
4.2. Изучение кинетики экстракции дитерпеновых кислот из сырья
Основное внимание в запланированной серии экспериментов уделялось
изучению взаимодействия целевых веществ с внутренними структурами сырья,
так как развитая поверхность внутриклеточных мембран потенциально может
удерживать
значительную
часть
целевых
соединений.
Такая
ситуация
свойственна многим объектам растительного сырья (листья подорожника
большого, корневища и корни марены красильной и др.) и приводит в результате
к
необходимости
использовать
методики,
основанные
на
многократной
экстракции.
При проведении экспериментов использовалось упакованное в фильтрпакеты сырье производителя ЗАО «Ст-Медифарм» (серия 050410), которое
согласно инструкции, представляет собой частицы измельчённых листьев,
проходящих через сито с размером отверстий 2 мм (Рисунок 26а). Однако на
основе проведенных ранее исследований [53], показавших, что темпы экстракции
существенно зависят как от среднего размера частиц, так и от размаха их
характерных размеров, было решено дополнительно измельчить сырье с целью
уменьшения времени диффузионного переноса веществ в частицах сырья и
обеспечения
дисперсионной
однородности
навести.
Микроскопические
наблюдения (Рисунок 26б) измельченного на электрической мельнице сырья и
100
использованного в итоге в опытах показали, что характерный размер частиц стал
менее 200 мкм.
а
б
Рисунок 26. Частицы листьев шалфея лекарственного (а) – сырье из фильтрпакетов; (б) – сырье, дополнительно измельченное на электромельнице.
Теоретические результаты, описанные в работе [53], показали, что
используемый на практике способ отделения надосадочной жидкости от сырья
(фильтрование через бумажный фильтр) в случае больших значений гидромодуля
L (отношения массы навески к объему используемого растворителя) может
приводить к значительным ошибкам при определении истинной концентрации.
Связано это с удерживанием сырьем некоторого объема растворителя (эффекты
смачиваемости), также свой вклад может вносить и его интенсивное испарение,
вызванное кипением. Поэтому для оценки соответствующих погрешностей и их
последующего контроля для рассматриваемого объекта были измерены Vvap –
объем растворителя, испаряющегося в обратный холодильник и Vadg –объём
растворителя, впитываемый единицей массы сырья.
Для определения количества Vadg растворителя, впитываемого сырьем в
результате их взаимодействия (при экстракции и последующем процеживании)
101
были заготовлены пять точных навесок массы 1 г и пять порций растворителя
объемом 15 мл. После процеживания первой порции петролейного эфира через
первую
навеску,
был
измерен
объем
извлечения.
Далее
к
смоченной
растворителем навеске добавлялась очередная (сухая) навеска и образовывалась
смесь (мокрых и сухих частиц) большей массы. Через объединенную навеску
процеживалась следующая порция растворителя, и измерялся новый объем
извлечения. Окончательно, в результате фильтрования всех заготовленных
порций
петролейного
эфира
при
последовательном
увеличении
массы
обрабатываемой навески, был определен впитываемый частицами сырья объем
растворителя для пяти точных навесок разной массы, от 1 до 5 г (Рисунок 27).
Vadg, мл/г
6
4
2
0
2
4
m0, г
Рисунок 27. Удельный объем растворителя, впитываемый сырьем при различных
массах навески. Маркеры – экспериментальные значения, сплошная линия –
среднее значение.
Исследования показали, что в обратный холодильник испаряется лишь Vvap
= 1 - 2 мл растворителя, что значительно меньше обычно используемых объемов
V, и поэтому можно считать, что испарение не влияет на кинетику процесса.
Далее отметим, что по окончании экстракции объем Vvap успевает стекать из
холодильника обратно в колбу и, следовательно, являясь частью объема V – Vadgmb
извлечения (mb – масса навески), учитывается при определении концентрации
раствора. Поэтому при наличии обратного холодильника эффектами, связанными
с испарением экстрагента, можно пренебречь на всех стадиях эксперимента,
полагая Vvap = 0.
102
Однако объем Vadg, удерживаемый сырьем после слива экстракта из колбы,
может при некоторых соотношениях L оказаться существенным. В результате
проведения описанных выше экспериментов было установлено, что Vadg = 6.3 мл/г
для
рассматриваемой
системы
петролейный
эфир
–
листья
шалфея
лекарственного при заданной степени измельчения сырья. Такая погрешность в
определении объема извлечения может приводить к значительным ошибкам при
вычислении массы экстрагируемых веществ уже при соотношениях L = 1:50 г/мл.
Определение ограничений на используемые отношения L позволило
перейти к непосредственно экстракции. При этом рассматривались следующие
отношения L массы навески (в г) к объему растворителя (в мл): 1:50, 1:100, 1:150
и 1:200.
x, %
2
1
0
0
40
80
t, мин
Рисунок 28. Динамика экстракции дитерпеновых кислот при значении L =1:100.
Круги – экспериментальные данные, квадраты – средние значения для заданного
времени, сплошная линия – среднее значение (x = 2,4%) по всем экспериментам
(при t ≥ 20 мин).
При изучении динамики перехода дитерпеновых кислот в растворитель
определение их в растворе проводили сразу после закипания растворителя (0 мин)
и через 5, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 мин после фиксирования момента закипания
экстрагента. Аликвотная часть извлечения фотометрировалась при длине волны
285 нм, выбранной в качестве аналитической, для расчетов использовался
103
удельный показатель поглощения карнозоловой кислоты, равный 40,92 (см. глава
2.2.2.2). Результаты показаны на Рисунке 28, 29.
x, %
2.2
1.1
0
1:50
1:100
1:150
1:200
L, г/мл
Рисунок 29. Динамика экстракции дитерпеновых кислот при различных значениях
L. Серые столбцы – t = 20 мин, черные столбцы – t = 60 мин.
Интересной особенностью, наблюдаемой на Рисунке 26, как и в работах [53,
78], является значительный (более 85% от максимального для заданных условий
значения) выход целевых веществ в раствор уже к начальному моменту времени.
Далее, кривая выхода (КВ) экстракта растёт в течение 10-20 мин, достигает своего
максимального значения и сохраняет его до конца экстракции, t ≤ 120 мин. Таким
образом, значительная часть дитерпеновых кислот (~2,1% от массы навески)
выделяется в кипящий растворитель практически мгновенно, а существенного
увеличения выхода целевых веществ за разумное время, t  120 мин, добиться не
удается (Рисунки 28, 29).
Такое поведение КВ (с учетом данных для различных значений L,
Рисунок 29)
можно
объяснить
равенством
химических
потенциалов,
растворенных (жидкая фаза) и нерастворенных (твердая фаза) целевых веществ. В
силу постоянства давления и температуры процесса, это приводит к зависимости
концентрации насыщения в растворе от массовой концентрации неизвлеченных
из растительного материала веществ.
104
На следующем этапе была изучена динамика извлечения дитерпеновых
кислот из сырья при многократной экстракции. С этой целью проводили
трёхкратную экстракцию, варьируя параметр L. Время каждой экстракции
составляло 20 мин. Результаты представлены на Рисунке 30, где C – средняя
плотность дитерпеновых кислот в растворе, омывающем сырье. Как и ожидалось,
наибольший выход x = 2.94% целевых веществ был достигнут при наименьшем
соотношении L = 1: 200 г/мл
x, %
2.7
1.8
0.9
0
1:50
1:100
1:150
1:200
1:400
L, г/мл
а
б
Рисунок 30. Трехкратная экстракция при различных значениях L. Черные
столбцы – результаты последовательных повторностей экстракции при одном и
том же L; серые столбцы – суммарное извлечение для соответствующего
соотношения за две экстракции; белые столбцы (заливка) – извлечение для
соответствующего соотношения L за третью экстракцию. Время каждой
экстракции t = 20 мин.
Наблюдаемую динамику, а также данные, показанные на Рисунках 28, 29
можно
объяснить
наличием
“свободной”
фракции
целевых
соединений,
характеризуемой слабым взаимодействием с сырьем. В каждой следующей
повторности экстракции удаётся извлечь свободную фракцию действующих
веществ из листьев шалфея.
В силу возрастания C (Рисунок 30 б) при возрастании L можно с
уверенностью утверждать, что при возможном существовании концентрации
насыщения для смеси петролейный эфир – дитерпеновые кислоты она не
105
достигается в исследуемом диапазоне значений L. В связи с этим адсорбционные
эффекты остаются единственным механизмом, объясняющим наблюдаемую
динамику экстракции. Учет этих эффектов для рассматриваемого растительного
материала необходим, так как около трети запасенных веществ существенным
образом взаимодействуют со структурой сырья.
На стадии третьей экстракции, начиная с соотношения 1:200 наблюдается
высокая погрешность измерения оптической плотности (Рисунок 30). С другой
стороны, именно двухкратная экстракция при L 1:200 обеспечивает наибольший
выход соединений (y0 = 2,94 %,). Поэтому этот режим экстракции можно считать
оптимальным для методики количественного определения с точки зрения
полноты извлечения и достоверности результатов.
4.3. Математическая модель экстракции дитерпеновых кислот при тонком
измельчении
Полученные экспериментальные результаты, на основе которых была
сформулирована гипотеза о существовании “свободной” и “связанной” фракций
целевых соединений, могут быть описаны в рамках предлагаемой далее модели
экстракции и свойств сырья. Будем считать, что растворитель в состоянии
кипения можно рассматривать в гомогенном приближении, а в силу высокой
степени
измельчения
молотые
частицы
представим
как
системы
с
сосредоточенным параметром и для описания их текущего состояния достаточно
определить единственную характеристику – среднюю массовую концентрацию
y(t) дитерпеновых кислот в сырье в заданный момент времени t экстракции.
Начальное значение y0 этого параметра – исходные запасы – представляет
наибольший интерес с точки зрения методик количественного определения
целевых соединений в сырье.
В силу закона сохранения массы величины x, y и y0 связаны соотношением
y  x  y0 .
(8)
106
Равенство
химических
потенциалов
при
постоянных
давлении
и
температуре эквивалентно существованию зависимости между равновесной
концентрацией C* раствора и текущим значением y; C* = f(y). В этих обозначениях
динамика экстракции может быть описана обыкновенным дифференциальным
уравнением
dy

  J , J   C*  C  ,
dt
a
L
(9)
где J – массовый поток дитерпеновых кислот из частиц сырья,
приходящийся на единицу объема растворителя, определяемый разностью
равновесной концентрации C* и текущей концентрации C раствора, a –
характерный размер частиц, β – коэффициент массоотдачи с поверхности сырья.
Выражая y из (8) и подставляя его в (9), учитывая, также что C = xL,
окончательно получим уравнение
L
dx 
  f ( y0  x)  xL 
dt a
(10)
для определения текущей массовой концентрации x извлеченных веществ.
На основе экспериментальных данных целевые вещества в сырье можно
условно разделить на две части: “свободный” экстракт (выделяющийся, за первые
минуты экстракции) и “связанный” экстракт (для извлечения которого
необходимы порции чистого растворителя). Аналогичные подходы к описанию
(использующие ту же концепцию) взаимодействия целевых веществ с сырьем
изложены в работах [78, 85].
Так
как
фракция
свободных
веществ
экстрагируется
практически
мгновенно, перейдем к описанию экстракции связанной фракции целевых
соединений. Рассмотрим случай, когда функция f может рассматриваться в
линейном приближении, что, например, соответствует случаю практически
полного
истощения
сырья.
Предположим,
что
в
результате
некоторых
предварительных процедур из сырья уже извлечена массовая концентрация x0
веществ, и текущие начальные запасы равны y0 – x0. Считая величину y0 – x0
достаточно малой, рассмотрим линейное приближение функции f(y) = Ky в
107
окрестности нуля, где K – постоянная, определяющая силу взаимодействия сырья
и вещества при заданных давлении и температуре.
Таким образом, учитывая предварительное извлечение фракции свободных
соединений и пренебрегая количеством вещества, выделившегося за время
нагревания
растворителя,
решение
уравнения
(10)
в
случае
линейного
приближения функции f можно получить в явном виде
x
1
K


1  e  ,     1 t  0 .

y0  x0 1  L / K
L
a
(11)
x/(y0-x0)
0.05
0.15
0.75
0.3
0.5
0.5
0.25
0
0.4
0.8
t/a
Рисунок 31. Кинетика выхода связанной части целевых веществ в раствор при
различных значениях отношения L / K (числа у кривых).
На Рисунке 31 изображены зависимости x от t при различных значениях
отношения L / K (числа у кривых), из которых видно, что для наискорейшего и
одновременно наиболее полного извлечения остатка связанной части экстракта
достаточно выполнение условия L << K, что согласуется с экспериментальными
наблюдениями (Рисунок 30).
Однако с практической точки зрения наибольший интерес вызывает
равновесный случай, соответствующий большим значениям τ и описываемый
следующим соотношением
C* 
L
( y0  x0 ) ,
1 L / K
(12)
108
эквивалентным закону сохранения массы (8). Эту зависимость, справедливую при
x0 ≈ y0, можно использовать для одновременного определения обоих неизвестных
параметров модели: K и y0. Для этого можно поступать следующим образом. Так
как при идентификации параметров K и y0 модели (11) на основе выражения (12)
необходимо максимальное предварительное истощение сырья, x0 ≈ y0, то
использовать необходимо данные “последних” (второй и третьей) повторностей
многократной экстракции при минимально возможных соотношениях L (в данном
случае это были бы 1:200 и 1:150). Последующая минимизация функции
I ( y0 , K )    y0  x0j  x j  L j x j / K 
2
(13)
j
позволяет определить неизвестные параметры y0 и K модели, исходя из
наилучшего согласования теории и экспериментальных данных. В выражении
(12) индекс j пробегает все наборы (Lj, xj, x0j) экспериментальных данных,
используемых при апробации модели. Однако применение предложенной
процедуры для исследуемого сырья ограничено количеством повторностей
экстракции, позволяющих достоверно определить извлеченную массу x целевых
соединений. Таким образом, в данной работе (на основании комментариев к
Рисунку 30) считается целесообразным остановиться на следующей ниже
методике количественного определения.
Методика количественного определения суммы дитерпеновых кислот в листьях
шалфея лекарственного
Аналитическую пробу измельчённого сырья около 1 гр (точная навеска)
помещают в колбу вместимостью 500 мл, заливают 200 мл петролейного эфира
40/70 и экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 20 мин.
Затем колбу охлаждают и фильтруют раствор через бумажный фильтр в
мерную колбу вместимостью 500 мл. Процедуру экстракции повторяют второй
раз при аналогичном режиме. Извлечение фильтруют в ту же мерную колбу
вместимостью 500 мл, доводят объем раствора до метки петролейным эфиром.
Измерение оптической плотности раствора проводят при длине волны 285
нм, используя в качестве раствора сравнения петролейный эфир 40/70.
109
Содержание суммы дитерпеновых кислот в листьях шалфея в пересчёте на
карнозоловую кислоту и абсолютно сухое сырьё в процентах (х) рассчитывают по
формуле:
х
D  500  100
40,92  а  (100  W )
(14)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
40,92 – удельный показатель поглощения карнозоловой кислоты при длине волны
285 нм;
а– навеска сырья, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в %.
Для определения метрологических характеристик разработанной методики
провели 10 параллельных определений (Таблица 19).
Таблица 20. Метрологические характеристики метода определения дитерпеновых
кислот в листьях шалфея лекарственного
f
х ср.
S2
S
P
t (0,95; 9)
∆x
ε, %
9
2,94
0,0096
0,0979
0,95
2,26
0,07
±2,38
Полученные
результаты
свидетельствуют
об
удовлетворительной
воспроизводимости методики, ошибка единичного определения не превышает
± 2,38 %.
Разработанная методика была апробирована на различных образцах листьев
шалфея лекарственного. Результаты приведены в Таблице 21.
Таблица 21. Содержание дитерпеновых кислот в различных образцах листьев
шалфея лекарственного
Образец листьев шалфея лекарственного
1. Ботанический сад, 2013 г.
2. ЗАО «Ст-Медифарм» (серия 050410)
3. Ботанический сад, 2012 г.
4. ОАО «Красногорсклексредства»
141108)
5. «Здоровье» (серия 060708)
(серия
Содержание дитерпеновых
кислот , %
3,57 ± 0,1
2,94± 0,07
3,02 ± 0,09
3,0 ± 0,07
2,20 ± 0,06
110
Продолжение таблицы 21
Образец листьев шалфея лекарственного
6. «Фитобот» (серия 11209)
Содержание дитерпеновых
кислот, %
2,81± 0,07
7. «Фитофарм» (серия 061109)
2,10 ± 0,06
На основании полученных результатов нами было установлено, что
содержание суммы дитерпеновых кислот в листьях шалфея лекарственного в
пересчёте на карнозоловую кислоту и абсолютно сухое сырье должно составлять
не менее 2,0 %.
4.4. Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея
лекарственного
В настоящее время листья шалфея используются в форме спиртовых
(«Сальвин–ВИФ») и водных (настой) извлечений. Учитывая кислотный характер
действующих веществ листьев шалфея и их способность образовывать соли, мы
предположили возможность совершенствования технологии экстракционных
препаратов шалфея исходя из этой особенности. Для спиртовых извлечений
использовали предварительное подкисление сырья для перевода солевых форм в
свободные (лучше растворимые в органических растворителях). Спиртовые
извлечения были получены методом двукратной экстракции нагреванием на
водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин:
Около 10 г листьев шалфея лекарственного помещали в коническую колбу
со
шлифом вместимостью 250
мл, смачивали 1% раствором кислоты
хлористоводородной. Прибавляли 100 мл спирта этилового 95% и проводили
экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. После
охлаждения надосадочную жидкость фильтровали через бумажный фильтр в
цилиндр. К сырью прибавляли 50 мл спирта этилового 95% и повторяли
экстрагирование при таком же режиме. Полученное извлечение фильтровали в
цилиндр. Колбу с отработанным сырьём и фильтр промывали небольшим
111
количеством экстрагента. Объединённые спиртовые извлечения упаривали под
вакуумом до 100 мл.
Во всех извлечениях проводили оценку содержания дитерпеновых кислот
по методу, описанному в разделе 2.2.2.2. Суммарное содержание дитерпеновых
кислот в сырье, определённое в эксперименте, составило 6,38 ± 0,69%.
Результаты
по
оценке
антибактериальной
активности
спиртовых
извлечений на музейном штамме S. aureus АТСС 6538-Р сведены в Таблице 22.
Таблица 22. Антибактериальная активность спиртовых извлечений из листьев
Спирт
53,96±3,6
3,4±0,22
0,23±0,02
1:256
этиловый 95%
Спирт
86,09±5,84 5,50±0,23
0,37±0,02
1:512
этиловый 95%*
* − сырьё смочено 1% раствором хлористоводородной кислоты
МПК препарата, мкг/мл
Maксимальное разбавление извлечения, инактивирую-щее размножение
S. aureus
Концентрация дитерпеновых кислот в извлечениях, %
Количество извлечённых
дитерпеновых кислот в %
от массы сырья
Экстрагент
Степень экстракции,%
шалфея лекарственного
39,06
19,53
Результаты показали, что предварительное смачивание сырья 1% раствором
хлористоводородной
кислоты
повышает
антибактериальную
активность
извлечения в два раза, что может служить подтверждением предположения о
присутствии дитерпеновых кислот в листьях шалфея в том числе в солевых
формах.
По аналогии со спиртовыми извлечениями было решено использовать
принцип перевода солевых форм дитерпеновых килот в кислотную форму при
получении настоев. С этой целью экстрагирование проводили 1% раствором
натрия гидрокарбоната.
112
Для приготовления водных извлечений из листьев шалфея использовали
технологию ГФ XI издания. Согласно ФС «Настои и отвары» при отсутствии
указания соотношения сырья и экстрагента используют соотношение 1:10.
Согласно инструкции производитель (ЗАО «Ст-Медифарм») рекомендует
готовить настои из листьев шалфея при соотношении 1:33. В связи с этим было
решено получить извлечения, варьируя параметром «гидромодуль экстракции» в
ряду от 1:10 до 1:33.
Результаты показали, что при изменении гидромодуля в ряду от 1:10 до 1:33
степень экстракции дитерпеновых кислот возрастает, а их концентрация в
извлечениях снижается вследствие разбавления. Существенный рост наблюдается
при переходе гидромодуля от 1:10 к 1:20 (Таблица 23).
Таблица 23. Содержание дитерпеновых кислот в водных извлечениях из листьев
шалфея
Экстрагент
Гидромоду
ль
Степень
экстракции, %
Кол-во
Концентрация
извлечённых дитерпеновых
дитерпеновых
кислот в
кислот в % от извлечениях, %
массы сырья
0,62 ± 0,09
0,06 ± 0,009
Вода
1:10
9,72 ± 1,15
очищенная
1% раствор
1:10
33,49 ± 2,29
2,15 ± 0,15
0,21 ± 0,02
NaHCO3
Вода
1:20
19,77 ± 1,43
1,25 ± 0,1
0,06 ± 0,004
очищенная
1% раствор
1:20
69,23 ± 5,47
4,34 ± 0,32
0,22 ± 0,01
NaHCO3
Вода
1:33
24,24 ± 2,22
1,55 ± 0,1
0,05 ± 0,004
очищенная
1% раствор
1:33
75,39 ± 8,80
4,82 ± 0,59
0,14 ± 0,02
NaHCO3
Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены параметры оптимальной
технологии настоя из листьев шалфея.
Используя для экстракции 1% раствор натрия гидрокарбоната, удаётся
извлечь около 70% всех дитерпеновых кислот.
113
Таким образом, наиболее оптимальной технологией получения настоя из
листьев шалфея можно считать экстракцию 1% раствором натрия гидрокарбоната
настаиванием на кипящей водяной бане в течение 15 мин при соотношении сырья
и экстрагента 1:20. Настои, полученные с использованием данного соотношения,
были подвергнуты микробиологическому испытанию (Таблица 24).
Таблица 24. Антибактериальная активность водных извлечений из листьев
МИК препарата, мкг/мл
Max разбавление извлечения, инактивирующее размножение S. aureus
Концентрация дитерпеновых кислот в извлечениях, %
Количество извлечённых
дитерпеновых кислот в % от
массы сырья
Степень экстракции,%
Экстрагент
шалфея лекарственного
Вода
19,77 ± 1,43
1,25 ± 0,1 0,06 ± 0,004
1:64
156,25
очищенная
1% раствор 69,23 ± 5,47 4,34 ± 0,32 0,22 ± 0,01
1:256
39,06
NaHCO3
Результаты показали, что настой, полученный экстракцией 1% раствором
натрия гидрокарбоната имеет сходную антибактериальную активность в
отношении S. aureus со спиртовым извлечением из листьев шалфея (1:10).
Как отмечалось, для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и
водных
извлечениях
мы
использовали
методику,
предложенную
И.Н. Зилфикаровым с соавторами (см. раздел 2.2.2.2). Однако, как отмечалось
выше, данная методика определяет, скорее всего, суммарное содержание
дитерпеновых и гидроксикоричных кислот. Поскольку нами было показано, что
дитерпеновые кислоты можно избирательно извлечь из сырья петролейным
эфиром, мы провели изучение антибактериальной активности спиртовых
извлечений, полученных из сырья, до и после экстракции его этим растворителем
(Таблица 25). Технология извлечений представлена ниже.
114
Технология получения спиртового извлечения, полученного растворением
сухого остатка после отгонки петролейного эфира
Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) экстрагируют в аппарате
Сокслета в течение 3 ч 200 мл петролейного эфира 40/70. После охлаждения
раствор фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр. Затем извлечение
упаривают под вакуумом до сухого остатка и растворяют в 10 мл 95% этилового
спирта (дитерпеновые кислоты).
Технология получения спиртового извлечения из листьев шалфея
лекарственного, обработанных петролейным эфиром
Около 10 г шрота (точная навеска), полученного после обработки
петролейным эфиром 40/70 после количественного определения дитерпеновых
кислот в сырье, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл,
смачивают 1% раствором кислоты хлористоводородной (15-20 мл). Затем
прибавляют 100 мл спирта этилового 95% и проводят экстракцию на водяной
бане с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения
надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр в цилиндр.
К шроту прибавляют 50 мл 95% спирта этилового и повторяют
экстрагирование при таком же режиме. Полученное извлечение фильтруют в
цилиндр. Колбу с отработанным сырьём и фильтр промывают небольшим
количеством экстрагента. Объединённые спиртовые извлечения упаривают под
вакуумом до 100 мл.
Таблица 25. Антибактериальная активность извлечений из листьев шалфея
лекарственного на культурах S. aureus
Спиртовый раствор
(1:10), полученный
БАВ, отвечающие за
антибактериальную
активность
из листьев шалфея Сумма
дитерпенонеобработанных
вых и гидроксипетролейным эфиром коричных кислот
Максимальное разбавление
извлечения, инактивирующее
размножение S. aureus
ATTC 6538-P
MRSA 205-Р
1:256
1: 64
115
Продолжение таблицы 25
Спиртовый раствор
(1:10), полученный
из листьев шалфея
обработанных петролейным эфиром
растворением сухого
отстатка
после
отгонки петролейного эфира
Результаты
БАВ, отвечающие за
антибактериальную
активность
Максимальное разбавление
извлечения, инактивирующее
размножение S. aureus
ATTC 6538-P
MRSA 205-Р
Гидроксикоричные
кислоты
1:64
1: 64
Дитерпеновые
кислоты
1:32
1:16
показали,
что
антибактериальная
активность
спиртового
раствора, полученного из петролейного экстракта шалфея (содержавшего только
дитерпеновые кислоты без примеси других фенольных соединений) в сравнении с
суммарным спиртовым экстрактом была в 8 раза ниже. Эти результаты
свидетельствуют о наличии антибактериальной активности не только у
дитерпеновых кислот, но и у других фенольных соединений (прежде всего
гидроксикоричных кислот), которые остаются в сырье после экстракции его
петролейным эфиром. Так как две группы целевых веществ являются
ответственными
за
антибактериальную
активность
листьев
шалфея,
стандартизацию сырья необходимо проводить по двум группам указанных БАВ.
4.5. Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
лекарственного
Как уже отмечалось в разделе 1.2.4 приоритетным направлением в развитии
подходов к стандартизации эфиромасличных растений является установление
норм содержания веществ, которые отвечают за фармакологический эффект
растения.
116
В разделе 4.1 было установлено, что помимо дитерпеновых кислот в
листьях шалфея лекарственного ответственными за антибактериальный эффект
сырья являются соединения полифенольного ряда (гидроксикоричные кислоты).
Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
рационально
использовать
унифицированный
метод
определения
гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи, описанный в разделе 2.2.2.3.
Записанный спектр извлечения, полученного по методике, имеет чётко
выраженный пик при 330 нм, который является характеристичным для
гидроксикоричных кислот (Рисунок 32).
Оптическая плотность
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
500.00
550.00
600.00
Длина волны
Рисунок 32. Спектр извлечения из листьев S. officinalis, полученного при
экстракции 50% этиловым спиртом
Для проверки воспроизводимости методики мы провели серию опытов как с
нативным (необработанным) сырьём, так и с жомом после его обработки
петролейным эфиром 40/70. Полученные результаты представлены в Таблице 27.
Таблица 27. Содержание
гидроксикоричных
кислот
в
листьях
шалфея
лекарственного, %
Листья шалфея
необработанные петролейным эфиром
обработанные петролейным эфиром листья
Содержание гидроксикоричных
кислот, %
4,38±0,29
4,39±0,19
117
Результаты показали, что содержание гидроксикоричных кислот как в
нативном сырье, так и в жоме равноценно. В этой связи более целесообразным
является определение гидроксикоричных кислот в необработанном петролейным
эфиром (нативном) сырье.
Дополнительно изучали динамику перехода гидроксикоричных кислот в
растворитель. Определение их в растворе проводили через 5, 10, 20, 30, 40, 60 и
120 мин после фиксирования момента закипания экстрагента (Рисунок 33).
Показано, что более 90% действующих веществ выходит в раствор уже по
истечению 20 – 30 мин, что позволяет говорить об исчерпывающей экстракции
гидроксикоричных кислот за заданное в методике время.
Рисунок 33. Динамика экстракции гидроксикоричных кислот при значении L=
1:400. Круги – экспериментальные данные, сплошная линия – среднее значение (x
= 4,38%)
Таким
образом,
методика
определения
гидроксикоричных
кислот,
описанная в Европейской Фармакопее, предлагается нами для оценки их
содержания в листьях шалфея лекарственного. Считаем, что предлагаемая
методика может быть включена в НД на сырьё шалфея лекарственного с целью
стандартизации листьев по второй группе действующих веществ, отвечающих за
фармакологическую активность сырья.
118
Для определения метрологических характеристик разработанной методики
провели 10 параллельных определений (Таблица 28).
Таблица 28. Метрологические характеристики метода определения дитерпеновых
кислот в листьях шалфея лекарственного
9
S2
S
P
t (0,95; 9)
∆x
ε, %
0,0342
0,1849
0,95
2,26
0,13
±2,97
х ср.
f
4,38
Полученные
результаты
свидетельствуют
об
удовлетворительной
воспроизводимости методики, ошибка единичного определения не превышает
± 2,97 %.
Разработанная методика была апробирована на различных образцах листьев
шалфея лекарственного. Результаты приведены в Таблице 29.
Таблица 29. Содержание гидроксикоричных кислот в различных образцах листьев
шалфея лекарственного
Образец листьев шалфея лекарственного
1. Ботанический сад, 2013 г.
2. ЗАО «Ст-Медифарм» (серия 050410)
3. Ботанический сад, 2012 г.
Содержание
дитерпеновых кислот , %
2,25 ± 0,11
4,38± 0,13
2,5 ± 0,09
4. ОАО «Красногорсклексредства» (серия 141108)
5. «Здоровье» (серия 060708)
4,0 ± 0,15
3,8 ± 0,1
На основании полученных результатов нами было установлено, что
содержание суммы гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного в
пересчёте на розмариновую кислоту и абсолютно сухое сырье должно составлять
не менее 2,0 %.
Стандартизацию листьев шалфея лекарственного по сумме дитерпеновых и
гидроксикоричных кислот предлагается проводить прежде всего для сырья,
предназначенного для получения антимикробных препаратов.
119
4.6. Основные показатели и нормы качества листьев шалфея лекарственного
В Таблице 30 представлены основные показатели и нормы качества листьев
шалфея лекарственного, которые могут быть внесены в проект новой НД на
сырьё.
Таблица 30.Основные
показатели
и
нормы
качества
листьев
шалфея
лекарственного
Разделы ФС
Внешние признаки
Числовые
показатели
Количественное
определение
Эфирное масло, %
Метод анализа
Нормы
Оставлен без изменений (ст. 22 ГФ XI)
Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы
дитерпеновых кислот и суммой гидроксикоричных кислот
Метод 1 ГФ XI
Не менее 0,8
Сумма дитерпено- Спектрофотометрия
вых кислот, %
Сумма
Спектрофотометрия
гидроксикоричных
кислот, %
Не менее 2,0
Не менее 2,0
120
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 4
1. Обоснована необходимость стандартизации листьев шалфея лекарственного по
двум группам природных соединений – дитерпеновым и гидроксикоричным
кислотам, ответственным за антибактериальную активность сырья.
2. Предложенная математическая модель экстрагирования дитерпеновых кислот
из листьев шалфея лекарственного объясняет закономерности экстракции
липофильных
соединений
из
растительного
материала
присутствием
«свободных» и «связанных» со внутренними структурами фракций сырья.
3. Разработана методика количественного определения дитерпеновых кислот в
листьях
шалфея
лекарственного
с
использованием
метода
УФ -
спектрофотометрии. Ошибка единичного определения содержания дитерпеновых
кислот в листьях шалфея лекарственного не превышает ± 2,47 %. В качестве
нижнего предела содержания дитерпеновых кислот в сырье рекомендован
показатель «не менее 2,0%»
4. Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
рационально
использовать
унифицированный
метод
определения
гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи. Ошибка единичного
определения
содержания
гидроксикоричных
кислот
в
листьях
шалфея
лекарственного не превышает ± 2,97 %. В качестве нижнего предела содержания
суммы
гидрокискоричных
кислот
в
сырье
рекомендован
показатель
«не менее 2,0%»
5. Для достижения высокой антибактериальной активности спиртовых извлечений
из листьев шалфея лекарственного необходимо извлекать действующие вещества
кислого характера в свободной форме, для водных извлечений – в форме солей.
121
ГЛАВА 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ И
РАЗРАБОТКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ТРАВЫ
ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО
5.1. Совершенствование методов стандартизации травы зверобоя
продырявленного
5.1.1. Обнаружение и идентификация производных флороглюцина
в траве H. perforatum и H. maculatum
Анализ литературных источников показал, что гиперфорин и его
производные
обнаружены
продырявленном.
только
Поскольку
в
именно
одном
виде
гиперфорин
зверобоя
является
–
зверобое
соединением,
ответственным за антибактериальную активность препаратов зверобоя, то
зверобой продырявленной и зверобой пятнистый должны различаться по степени
антибактериальной активности. Для проверки этого предположения мы провели
качественное определение гиперфорина в сырье двух видов зверобоя –
H. perforatum и H. maculatum.
Для качественного обнаружения гиперфорина использовали ТСХ на
пластинках марки Сорбфил ПТСХ-АФ-А в системе гексан- этилацетат 9:1.
Гиперфорин обнаруживали в виде пятен с Rf около 0,45 по интенсивной синефиолетовой флюоресценции в УФ-свете при 360 нм (Рисунок 34). Гиперфорин
был обнаружен только в извлечении из травы H. рerforatum
Для дополнительного подтверждения наличия гиперфорина в извлечении из
H. perforatum и отсутствия его в H. maculatum, нами были записаны УФ-спектры
гексановых извлечений для двух видов зверобоя.
122
Рисунок 34. ТСХ гексановых извлечений из травы H. perforatum и H.
maculatum.
Известно, что гиперфорин, имеет четко выраженную полосу поглощения
при длине волны 278 нм [7]. Полученные УФ-спектры стали еще одним
подтверждением, того что H. perforatum и H. maculatum отличаются по
содержанию гиперфорина (Рисунок 35). УФ-спектр извлечения из H. perforatum
имел четко выраженный максимум при 278 нм, тогда как у H. maculatum он
Оптическая плотность
практически отсутствовал.
0,5
H. maculatum
0,45
H. perforatum
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
450
436
423
409
396
382
369
355
342
328
315
301
288
274
261
247
234
220
0
Длина волны, нм
Рисунок 35. УФ-спектры гексановых извлечений из травы H. perforatum и
H. maculatum.
123
5.1.2. Оценка антибактериальной активности извлечений из травы
H. perforatum и H. maculatum
Для дополнительного подтверждения отсутствия гиперфорина в траве
H. maculatum
провели
оценку
антибактериальной
активности
гексановых
извлечений из двух видов зверобоя. С этой гексан отгонялся досуха под
вакуумом, остаток растворялся в 25 мл 95% этилового спирта. Оценку
антибактериальной активности проводили методом, описанными в главе 2.2.2.3.
Результаты по оценке антибактериальной активности извлечений из травы
H. perforatum и H. maculatum на музейном штамме S. aureus АТСС 6538-Р
показаны в Таблице 31.
Таблица 31. Антибактериальная активность извлечений из травы зверобоя
продырявленного и травы зверобоя пятнистого (на культуре S. aureus ATTC
6538-P)
Спиртовой экстракт (1:5), полу- Максимальное разбавление извлечения,
ченный после удаления гексана
иннактивирующее размножение S. aureus
Трава зверобоя продырявленного
1:512
Трава зверобоя пятнистого
1:128
Антибактериальная активность зверобоя продырявленного была в 4 раза
выше зверобоя пятнистого. Таким образом, была подтверждена неравнозначность
этих видов сырья в плане антимикробной активности.
5.1.3. Разработка методики количественного определения суммы
производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного
На следующем этапе работы проводились исследования по разработке
метода количественного определения суммы производных гиперфорина в траве
зверобоя продырявленного. Недостатки метода количественного определения
суммы производных гиперфорина, предложенного в зарубежной литературе
описаны в разделе 1.3.3 обзора литературы.
124
Нами был выбран спектрофотометрический метод, основанный на
избирательной экстракции гиперфорина и его производных гексаном, измерении
оптической плотности полученного раствора при длине волны 278 нм и
использовании для расчетов молярного показателя поглощения гиперфорина при
этой длине волны. Были определены условия исчерпывающей экстракции
гиперфорина и его производных, оптимизированные по соотношению сырья и
экстрагента и продолжительности нагревания (Таблица 32).
Полученные
результаты
показали,
что
условиями
исчерпывающей
экстракции производных гиперфорина из травы зверобоя продырявленного
является экстракция кипящим гексаном при соотношения сырья и растворителя
1:100 в течение 30 мин.
Таблица 32. Зависимость выхода гиперфорина и его производных от параметров
экстракции
Соотношение сырье Время экстракции, мин
(г) – экстрагент (мл)
1:100
1:100
30 (при комнатной Т)
60 (при комнатной Т)
Содержание суммы производных гиперфорина в пересчете
на гиперфорин, %
0,97 ± 0,04
1,13 ± 0,01
1:100
1:100
1:100
30 (при кипячении Т)
60 (при кипячении Т)
90 (при кипячении Т)
1,28 ± 0,02
1,29 ± 0,09
1,25 ± 0,04
1:200
30 (при кипячении Т)
1,28 ± 0,04
1:200
60 (при кипячении Т)
1,29 ± 0,04
Таким
образом,
все
вышеизложенное
позволило
нам
предложить
следующую методику количественного определения:
Методика количественного определения суммы производных гиперфорина в
траве зверобоя продырявленного.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера 1 мм. Около 1 г сырья
(точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл,
прибавляют 100 мл гексана. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и
125
нагревают на водяной бане при умеренном кипении гексана в течение 30 мин.
Затем колбу охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 100 мл, доводя объем раствора до метки гексаном.
5 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 25
мл и доводят объем раствора до метки гексаном. Измерение оптической
плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве
раствора сравнения гексан. Содержание суммы производных гиперфорина в
пересчете на гиперфорин и абсолютно сухое сырье в процентах (х) вычисляют по
формуле:
х 
D  536  0,0006  100 100  100  25
8200  m  5  (100  W )
(15)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
536 – молекулярный вес гиперфорина;
8200 – показатель поглощения 6∙10-4 М раствора гиперфорина при 278 нм;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании, %;
Для определения метрологических характеристик разработанной методики
провели 10 параллельных определений (Таблица 33)
Таблица 33. Метрологические характеристики метода определения производных
гиперфорина в траве зверобоя продырявленного
хср
1,28
f
9
Полученные
S2
0,0008
S
0,03
результаты
P
0,95
t (0,95; 9)
2,26
свидетельствуют
об
∆х
0,02
ε, %
1,53
удовлетворительной
воспроизводимости методики, ошибка единичного определения не превышает
± 1,53%.
С
помощью
разработанной
методики
количественного
определения
гиперфорина в траве зверобоя продырявленного изучили распределение
производных гиперфорина в различных частях зверобоя продырявленного
(Таблица 34).
126
Таблица 34. Содержание производных гиперфорина в различных частях зверобоя
продырявленного
Трава
1,28 ± 0,02
Листья
1,33 ± 0,08
Цветки
2,82 ± 0,16
Результаты показали, что производные гиперфорина накапливаются
преимущественно в цветках зверобоя продырявленного. Для травы зверобоя
продырявленного определена норма содержания «не менее 1,0%»
5.1.4. Разработка методик качественного анализа травы зверобоя
продырявленного
В процессе разработки методов качественного анализа определения
производных гиперфорина в траве зверобоя продырявленного были использованы
подходы, использумые для идентификации гиперфорина в гексановом извлечении
из травы зверобоя продырявленного (ТСХ-анализ, запись УФ-спектра). Такие
подходы
могут
быть
применимы
для
определения
подлинности
и
доброкачественности сырья и введены в проект новых НД на траву зверобоя
продырявленного в раздел «Качественные реакции».
Методики обнаружения и идентификации гиперфорина в траве зверобоя
продырявленного
1. На линию старта хроматографической пластинки марки Сорбфил ПТСХАФ-А размером 10х15 см, предварительно выдержанной в сушильном шкафу при
температуре 100-105°С в течение 1 ч, наносят 0,05 мл раствора гексанового
экстракта, приготовленного в соответствии с методикой количественного
определения. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в
течение 15 мин, затем помещают в камеру, предварительно насыщенную в
течение 1 ч смесью гексан- этилацетат (9:1) и хроматографируют восходящим
способом.
127
После того как фронт растворителей пройдет расстояние около 8 см,
пластинку вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей и
просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм.
Производные гиперфорина обнаруживаются на хроматограмме испутуемого
раствора в виде пятна с интенсивно-синей флуоресценцией с Rf около 0,45
(гиперфорин). Возможно присутствие других зон.
Примечание:
1. Подготовка
пластинок.
Пластинки
«Сорбфил
ПТСХ-АФ-А»
для
активации предварительно выдерживают в сушильном шкафу при температуре
100-105°С в течение 1 ч. Хроматографическую камеру насыщали парами
растворителей в течение 1 ч.
2. УФ-спектр
соответствии
с
раствора
методикой
гексанового
извлечения,
количественного
приготовленного
определения,
должен
в
иметь
отчётливый максимум поглощения при длине волны 278 ± 3 нм
5.1.5. Основные показатели и нормы качества травы зверобоя
продырявленного, применяемой для получения антибактериальных
препаратов
В
результате
проведённых
исследований
предлагаем
проводить
стандартизацию травы зверобоя, используемой для получения антимикробных
препаратов, по сумме производных гиперфорина.
В таблице 35 представлены основные показатели и нормы качества травы
зверобоя продырявленного, которые могут быть внесены в проект новой НД на
сырьё.
Таблица 35. Основные
показатели
и
нормы
качества
продырявленного
Разделы ФС
Внешние признаки
Метод анализа
Нормы
Оставлен без изменений (ст. 52 ГФ XI)
травы
зверобоя
128
Продолжение таблицы 35
Разделы ФС
Гиперфорин
Числовые
показатели
Количественное
определение
Сумма
производных
гиперфорина,%
в пересчёте на
гиперфорин
Метод анализа
ТСХ
Нормы
На хроматограмме испытуемого
раствора должно наблюдаться пятна
пятно с интенсивно-синей флуоресценцией (УФ-свет)) с Rf около 0,45
(гиперфорин). Возможно присутствие других зон.
Спектрофотометрия УФ-спектр раствора гексанового
извлечения, приготовленного по
разделу «Количественное определение», должен иметь отчётливый
максимум поглощения при 278 ± 3нм
Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы
производных гиперфорина
Спектрофотометрия Не менее 1,0
5.2. Разработка технологии получения антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного
5.2.1. Технология антибактериального препарата из травы зверобоя
продырявленного
Ранее при разработке метода количественного определения производных
гиперфорина в траве зверобоя продырявленного (см. раздел 5.1.3) была показана
возможность их экстрагирования из сырья гексаном при кипячении на водяной
бане. Эти данные были использованы при разработке способа получения
антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного.
129
С
учетом
экономического
аспекта
при
предполагаемом
переводе
лабораторного варианта получения препарата в производственный масштаб
гексан был заменен на более доступный и одновременно близкий по
растворяющей способности к нему – петролейный эфир 40/70. Саму экстракцию с
учетом этих же соображений было решено проводить в аппарате Сокслета, вместо
экстракции в колбе с обратным холодильником. Его преимуществами (по
сравнению с экстракцией на водяной бане) является возможность проводить
многократную экстракцию в рамках непрерывного процесса экстрагирования за
счёт повторного использования относительно небольшого объёма растворителя.
При этом ЛРС постоянно омывается чистым растворителем, а само сырьё
непосредственно находится в экстракторе и постоянно нагревается парами
кипящего растворителя, что заметно увеличивает эффективность экстракции.
Навеску сырья, измельченную до размера частиц 1 мм, помещали в патрон
из фильтровальной бумаги и экстрагировали в аппарате Сокслета петролейным
эфиром в соотношении сырье – растворитель 1:100 при умеренном кипении
растворителя. Через каждые 5 сливов отбирали аликвотную часть извлечения и
оценивали содержание производных гиперфорина (x) пересчете на гиперфорин и
абсолютно сухое сырье в процентах, по формуле:
х 
D  536  0,0006 100 100  25
8200  m  5  (100  W )
(16)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
536 – молекулярный вес гиперфорина;
8200 – показатель поглощения 6∙10-4 М раствора гиперфорина при 278 нм;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании, %;
В результате проведенных исследований было установлено, что в
указанных условиях исчерпывающая экстракция производных гиперфорина
достигается за 10 сливов (примерно в течение 3-х часов экстракции) (Таблица 36)
130
Таблица 36.Содержание производных гиперфорина в извлечении из травы
зверобоя продырявленного при экстракции петролейным эфиром 40/70, %
Вариант
экстракции
Степень извлечения
производных
гиперфорина (% от
суммы в сырье)
Экстракция
в аппарате
Сокслета
96,35 ± 2,98
Количество
извлечённых
производных
гиперфорина
(% от массы сырья)
1,23 ± 0,03
Концентрация
производных
гиперфорина в
извлечении, %
0,01 ± 0,003
Вышеизложенное позволило нам предложить технологию получения
антибактериального
препарата
из
травы
зверобоя
продырявленного
в
лабораторном масштабе (Рисунок 36).
Технология получения антибактериального препарата из травы зверобоя
продырявленного
Около 5 г измельчённой до размера частиц 1 мм травы зверобоя
продырявленного помещают в патрон из фильтровальной бумаги и опускают в
экстарктор аппарата Сокслета. В колбу-приёмник объёмом 1000 мл прибавляют
500 мл петролейного эфира 40/70. Систему присоединяют к обратному
холодильнику и
нагревают
на
водяной
бане при
умеренном
кипении
петролейного эфира около 3 часов (10 сливов экстрагента).
Полученный в аппарате Сокслета экстракт упаривают под вакуумом до
сухого остатка. Полученный сухой остаток растворяют в 25 мл 95% этилового
спирта при нагревании.
Предлагаемая технологическая схема антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного в условиях отсутствия готовой лекарственной
формы с доказанным антибактериальным эффектом позволяет получить препарат,
оказывающий бактериостатическое действие в отношении S. aureus АТСС 6538- Р
в разведении 1:512 (19,5 мкг/мл).
131
Петролейный
эфир 40/70
Измельчённая трава
зверобоя продырявленного
Экстракция Т-Ж
Вытяжка
Отгон
петролейного
эфира 40/70
Вакуум-выпарка
95%спирт
Сухой остаток
Растворение
Спиртовый раствор
(производные гиперфорина)
Рисунок 36. Технологическая схема получения антибактериального препарата на
основе листьев эвкалипта прутовидного.
МПК производных гиперфорина в отношении указанного штамма составила
3,9 мкг/мл. Получение препарата сводится к простой технологии с минимальными
временными затратами и использованием менее токсичного растворителя как при
получении «Новоиманина» (ацетона). Также схема получения обеспечивает
устойчивость в процессе хранения в связи с отсутствием чувствительных к
действию света хлорофиллов и гиперицинов в экстракте.
5.2.2. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из травы
зверобоя продырявленного
Полученный
с
помощью
селективной
экстракции
производных
гиперфорина антибактериальный препарат из травы зверобоя продырявленного
должен проходить этапы стандартизации как в качественном, так и в
количественном отношении по производным гиперфорина, как основным
132
соединениям, отвечающим за его фармакологический (антибактериальный)
эффект.
С этой целью основное внимание было уделено разработке анализа
препарата по разделам «Подлинность» и «Количественное определение».
Для раздела «Подлинность» использовали экспериментальные данные,
полученные при анализе травы зверобоя продырявленного на содержание
производных гиперфорина (см. раздел 5.1.1). Записанный УФ-спектр препарата,
полученный путём экстракции петролейным эфиром 40/70, имел четко
выраженный максимум поглощения при длине волны 278 ± 3 нм, совпадающий с
УФ-спектром гесанового извлечения, приготовленного для количественного
анализа сырья зверобоя продырявленного.
Для установления подлинности антибактериального препарата посчитали
целесообразным
проводить
качественную
идентификацию
производных
гиперфорина методом ТСХ-анализа. Для установления оптимальных условий
хроматографирования использовали экспериментальные данные по обнаружению
производных гиперфорина в траве звнробоя продырявленного (см. раздел 5.1.1).
Было
установлено,
что
наилучшего
разделения
удаётся
достичь
при
использовании хроматографической системы гексан :этилацетат(1:1). Гиперфорин
в препарате обнаруживали в виде пятен с Rf около 0,45 по интенсивной синефиолетовой флюоресценции в УФ-свете при 360 нм. Возможно присутствие
других зон на хроматограмме.
В основу метода количественной стандартизации был положен УФспектрофометрический метод определения производных гиперфорина в траве
зверобоя
продырявленного,
описанный
в
разделе
5.1.3.
Полученные
экспериментальные данные при анализе сырья травы зверобоя продырявленного
позволили предложить методику количественного определения производных
гиперфорина в разработанном антибактериальном препарате.
133
Методика количественного определения производных гиперфорина в
антибактериальном препарате из травы зверобоя продырявленного
1 мл препарата переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят
объем раствора до метки 95% этиловым спиртом. Измерение оптической
плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве
раствора сравнения 95% этиловый спирт. Содержание суммы производных
гиперфорина в пересчете на гиперфорин в процентах (Х) вычисляют по формуле
X 
D  536  0,0006 100 100 100
8200 1
(17)
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
536 – молекулярный вес гиперфорина;
8200 – показатель поглощения 6∙10-4 М раствора гиперфорина при 278 нм;
В
таблице 38
количественного
Определение
представлены
определения
проводилось
10
результаты
производных
раз,
разработанной
гиперфорина
результаты
в
методики
препарате.
обрабатывались
методом
вариационной статистики с применением коэффициента Стьюдента.
Таблица 37.Результаты
гиперфорина
в
количественного
антибактериальном
определения
препарате
суммы
из
производных
травы
зверобоя
продырявленного. Метрологические характеристики .
f
Х
S2
S
P
t (0,95; 9)
∆x
ε, %
9
0,2
0,000056
0,0075
0,95
2,26
0,01
±1,16
Полученные
результаты
свидетельствуют
об
удовлетворительной
воспроизводимости методики, ошибка метода не превышает 1,16%. Установлена
норма содержания суммы производных гиперфорина в препарате из травы
зверобоя продырявленного, которая составляет не менее 0,2%.
134
5.2.3. Основные показатели и нормы качества антибактериального
препарата из травы зверобоя продырявленного
Результаты
экспериментальных
исследований
по
разработке
технологического процесса экстракционного препарата из травы зверобоя
продырявленного и оценки показателей его качества должны быть отражены в НД
на препарат. Основные показатели и нормы качества препарата из травы зверобоя
продырявленого представлены в Таблице 38.
Таблица 38. Основные показатели и нормы качества препарата из травы зверобоя
продырявленного
Показатель
качества
Описание
Метод анализа
Визуальный
Нормы
Прозрачная жидкость бледно-желтого
цвета, без запаха.
Подлинность
ТСХ
На
хроматограмме
испытуемого
Гиперфорин
раствора должно наблюдаться пятно с
интенсивно-синей
флуорес-ценцией
(УФ-свет при 360 нм) с Rf около 0,45.
Возможно присутствие других зон.
УФ-спектрофотоУФ-спектр поглощения раствора препаметрия
рата, приготовленного по разделу «Количественное определение», в области
от 230 до 280 нм должен иметь
максимум поглощения при 278 ± 3нм
Антибактериальн Микробиологическ Препарат должен подавлять рост тест
ая активность
ий метод
культуры S. aureus АТСС 6538-Р в
концентрации не менее 19,5 мкг/мл
Количественное
УФ-спектрофотоНе менее 0,2
определение
метрия
Сумма
производных
гиперфорина,%
в пересчёте на
гиперфорин
135
5.3.Исследование возможности комплексного использования травы зверобоя
продырявленного.
Проблема комплексной переработки растительного сырья актуальна, так как
часто в шроте после получения препаратов остаются ценные БАВ. Учитывая
богатый химический состав травы зверобоя, мы исследовали возможность
комлексного использования сырья в рамках получения антибактериального
препарата на его основе. Исходя из того, что экстракция петролейным эфиром
40/70 производных гиперфорина из травы зверобоя продырявленного довольно
избирательна и другие группы БАВ зверобоя, такие как флавоноиды и дубильные
вещества, не растворяются в нем, мы предположили, что шрот можно
использовать для получения настойки зверобоя, в которой эти соединения
являются активным началом. Отсутствие флавоноидов и дубильных веществ в
петролейном экстракте было подтверждено методом ТСХ при проявлении
хроматограмм растворами алюминия хлорида (флавоноиды) и железоаммонийных
квасцов
(дубильные
вещества).
Характерных
пятен
на
хроматограммах
обнаружено не было.
Настойку зверобоя (1:5) готовили на 40% этиловом спирте по известной
технологии (ФС 42-1889-95 «Зверобоя настойка) методом перколяции из травы
зверобоя
продырявленного
с
содержанием
флавоноидов
3,58 ± 0,11 %.
Перколяцию осуществляли до получения заданного объёма настойки. Для
очистки от сопутствующих веществ настойку отстаивали при температуре +5-8°С
в течение 2 суток.
Было приготовлено по четыре образца настойки из необработанной травы
зверобоя и из высушенного в течение суток шрота травы зверобоя, оставшегося
после получения антибактериального препарата.
Каждый полученный образец настойки представлял собой жидкость краснобурого цвета, соответствующую по внешнему виду описанию в ФС. Оценку
качества полученных настоек проводили прежде всего по показателям
«Количественное определение» и «Сухой остаток» (Таблица 39). Сумму
136
флавоноидов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии в
пересчёте на рутин, при длине волны равной 412 нм, с использованием ГСО
рутина.
Таблица 39. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом
перколяции при настаивании в течение 24 часов
Настойка (1:5, 40%
Содержание флавоноидов, %
Сухой остаток, %
спирт) из травы
(не менее 0,2 %)
(не менее 2,8 %)
зверобоя
продырявленного
необработанной
0,16±0,01
3, 54±0,04
петролейным эфиром
обработанной
0,19±0,01
4,34±0,05
петролейным эфиром
Полученные образцы настойки соответствовали требованиям ФС 42-188995 по показателю «Сухой остаток», но не удовлетворяли по показателю
«Количественное определение».
В этой связи мы увеличили время настаивания при получении настойки до
7 суток, по аналогии с технологией получения настойки эвкалипта. Также было
приготовлено по четыре образца препаратов.
При данном режиме экстракции содержание флавоноидов увеличилось до
нормируемых
значений
при
использовании
шрота
после
получения
антибактериального препарата из травы зверобоя. Такая же картина наблюдалась
и при получении настойки при недельном настаивании из необработанного сырья
(Таблица 40).
Таблица 40.Показатели
качества
настойки
зверобоя,
полученной
методом
перколяции 40% этанолом при настаивании в течение 7 суток
Настойка (1:5, 40% спирт) из
травы зверобоя продырявленного
необработанной
петролейной эфиром
обработанной петролейным
эфиром
Содержание флавоноидов, %
(не менее 0,2 %)
Сухой остаток, %
(не менее 2,8 %)
0,27± 0,01
3,47 ± 0,03
0,39± 0,01
4, 41± 0,04
137
Таким образом, можно предположить, что несоответствие по показателю
«Содержание флавоноидов» при 24-часовом настаивании связано не с исходным
сырьем, а с технологией получения самой настойки, которая нуждается в
критическом осмыслении и усовершенствовании.
Помимо метода перколяции при получении настойки мы опробовали и
метод дробной мацерации. Полученные результаты приведены в Таблице 41.
Таблица 41.Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом дробной
мацерации 40 % этанолом
Настойка (1:5, 40% спирт) из
травы зверобоя продырявленного
необработанной
петролейной эфиром
обработанной петролейным
эфиром
Содержание флавоноидов, %
(не менее 0,2 %)
Сухой остаток, %
(не менее 2,8 %)
0,29± 0,01
3,26 ± 0,03
0,34± 0,01
3, 41± 0,02
Полученные методом дробной мацерации настойки соответствовали
требованиям НД. С помощью данного способа было достигнуто сокращение
времени получения настойки до четырёх суток (вместо 7 суток при
перколировании).
В работах В.А. Куркина с соавторами по усовершенствованию технологии
получения настойки зверобоя [39], предлагается заменить 40% этанол на 70%, как
экстрагент, лучше растворяющий флавоноиды. Нами в лабораторных условиях
был получен ряд образцов настоек травы зверобоя, экстрагентом для которых
служил 70% этиловый спирт. Все образцы настоек были получены в соотношении
сырье–экстрагент 1:5 методами дробной мацерации и перколяции. Образцы были
приготовлены из травы зверобоя продырявленного и шрота травы зверобоя
продырявленного, оставшегося после получения антибактериального препарата.
Полученные результаты приведены в таблицах 42 и 43.
138
Таблица 42. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом
перколяции 70% этанолом при настаивании в течение 7 суток
Настойка (1:5, 40% спирт) из
травы зверобоя продырявленного
необработанной
петролейной эфиром
обработанной петролейным
эфиром
Содержание флавоноидов, %
(не менее 0,2 %)
Сухой остаток, %
(не менее 2,8 %)
0,33± 0,01
3,59 ± 0,02
0,40± 0,01
4,05± 0,04
Таблица 43. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом
дробной мацерации 70 % этанолом
Настойка (1:5, 40% спирт) из
травы зверобоя продырявленного
необработанной
петролейной эфиром
обработанной петролейным
эфиром
Содержание флавоноидов, %
(не менее 0,2 %)
Сухой остаток, %
(не менее 2,8 %)
0,31± 0,01
3,90 ± 0,02
0,45± 0,01
3,96± 0,04
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать
заключение, что использование 70% этанола позволяет получать настойки с более
высоким содержанием флавоноидов.
Можно констатировать, что при получении антибактериального препарата
из травы зверобоя предложенным нами способом экстракции петролейным
эфиром, возможно дальнейшее использование отработанного шрота для
получения настойки зверобоя. Схема комплексной переработки травы зверобоя
продырявленого показана на Рисунке 34. Отметим также, что использование
шрота травы зверобоя, оставшегося после обработки петролейным эфиром, для
получения настойки, позволяет получать препарат с более высоким содержанием
действующих веществ в сравнении с настойкой, приготовленной по той же
технологии из травы зверобоя, необработанной петролейным эфиром.
139
Измельчённая
трава зверобоя
продырявленного
Экстракция петролейным
эфиром 40/70
Вытяжка
Шрот
Экстракция
70% этиловым спиртом
Вакуум-выпарка
Сухой остаток
Настойка
(флавоноиды,
дубильные
вещества)
Растворение в спирте этиловом 95%
Спиртовый раствор
(производные гиперфорина)
Рисунок 34. Схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного
при получении антибактериального препарата
140
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5
1. Доказано, что производные гиперфорина содержатся только в одном
официнальном виде зверобоя –зверобое продырявленном
2. Разработаны
методики
качественного
анализа
травы
зверобоя
продырявленного, основанные на обнаружении производных гиперфорина как
основной
группы
БАВ,
проявляющей
антибактериальную
активность,
с
использованием ТСХ-анализа и УФ-спектрофотометрического метода
3. Разработана методика количественного определения производных гиперфорина
в
траве
зверобоя
продырявленного
с
использованием
метода
УФ-
спектрофотометрии. Ошибка единичного определения содержания производных
гиперфорина не превышает ± 1,53%. В качестве нижнего предела содержания
суммы
производных
гиперфорина
в
траве
зверобоя
продырявленного
рекомендован показатель «не менее 1,0%.»
3. Предложен способ получения антибактериального препарата из травы зверобоя
продырявленного, основанный на избирательной экстракции производных
гиперфорина петролейным эфиром 40/70
4. Разработаны
методики
качественного
и
количественного
анализа
антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного по сумме
производных
гиперфорина
с
использованием
ТСХ
и
УФ-
спектрофотометрического метода.
5. Антибактериальный препарат из травы зверобоя продырявленного оказывает
бактериостатичексое действие в отношении музейного штамма S. аureus.при
МПК равном 19,5 мкг/мл.
6. Предложена схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного,
включающая в себя две основные стадии: первая – получение антибактериального
препарата из травы зверобоя продырявленного на основе целевой экстракции
производных гиперфорина; вторая – получение из оставшегося шрота настойки,
содержащей соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).
141
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итоги выполненного исследования (выводы)
1. Предложены подходы к стандартизации сырья и препаратов эвкалипта
прутовидного,
шалфея
лекарственного
и
зверобоя
продырявленного,
заключающиеся в их анализе по основным группам БАВ, отвечающим за
антибактериальную активность.
2. Разработаны методики качественного анализа листьев эвкалипта прутовидного
и травы зверобоя продырявленного, основанные на обнаружении терпеноидных
фенолальдегидов и производных гиперфорина соответственно, с использованием
ТСХ-анализа и УФ-спектрофотометрического метода.
3. С
помощью
дитерпеновых
закономерности
материала
предложенной
кислот
из
листьев
экстракции
присутствием
математической
шалфея
липофильных
«свободных»
модели
лекарственного
соединений
и
экстрагирования
«связанных»
из
со
объяснены
растительного
внутренними
структурами фракций сырья.
3. Разработаны
методики
количественного
определения
терпеноидных
феноальдегидов (листья эвкалипта прутовидного), дитерпеновых кислот (листья
шалфея
лекарственного),
производных
гиперфорина
(трава
зверобоя
продырявленного) с использованием метода УФ-спектрофотометрии. Ошибка
единичного определения содержания действующих веществ в сырье не
превышает ± 2,33%; ±2,47% и ± 1,53% соответственно.
4. Обоснована необходимость стандартизации листьев шалфея лекарственного по
двум группам природных соединений – дитерпеновым и гидроксикоричным
кислотам, ответственным за антибактериальную активность сырья.
5. Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
предложено
использовать
унифицированный
метод
определения
гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи.
6. Предложены способы получения антибактериальных препаратов на основе
листьев
эвкалипта
прутовидного
(«Флорофелипт»)
и
травы
зверобоя
продырявленного, заключающиеся в использовании оптимального экстрагента –
142
петролейного эфира 40/70, позволяющего исчерпывающе извлекать основные
БАВ, отвечающие за антибактериальную активность.
7. Разработаны
методики
качественного
и
количественного
анализа
«Флорофелипта» и антибактериального препарата на основе травы зверобоя
продырявленного с использованием ТСХ и УФ-спектрофотометрического метода.
8. Микробиологические исследования показали высокую антибактериальную
активность
«Флорофелипта»
в
отношении
S. аureus,
в
том
числе
и
антибиотикоустойчивых штаммов, по сравнению с существующими аналогами.
9. Предложены технологические подходы к получению препаратов с высоким
уровнем антибактериальной активности из листьев шалфея лекарственного,
заключающиеся в извлечении БАВ кислого характера в свободной форме (для
спиртовых извлечений), в форме солей (для водных извлечений).
10. Предложена
схема
комплексной
переработки
травы
зверобоя
продырявленного, включающая в себя две основные стадии: первая – получение
антибактериального препарата на основе целевой экстракции производных
гиперфорина; вторая – получение из оставшегося шрота настойки, содержащей
соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).
Практические
позволяют
рекомендации.
усовершенствовать
Результаты
методики
диссертационной
анализа
листьев
работы
эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного и могут быть
использованы
в
учебных
процессах
по
курсам
«Фармакогнозия»
и
«Фармацевтическая химия», а также в центрах сертификации и контроля качества
ЛС и на фармацевтических предприятиях. Предложенные технологические схемы
получения препаратов из ЛРС могут быть использованы на фармацевтических
предприятиях в рамках получения лекарственных препаратов антибактериального
действия.
Перспективы
дальнейшей
разработки
темы
диссертационного
исследования имеют важное научно-практическое значение для фармакогнозии и
фармацевтической химии с целью дальнейшего изучения растений, обладающих
антибактериальной активностью, разработке препаратов на их основе и
143
современных подходов к стандартизации, заключающихся в анализе препаратов
по
основным
группам
соединений,
(антибактериальный) эффект.
отвечающим
за
фармакологический
144
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БАВ – биологически активные вещества
БАД – биологически активная добавка
ГРЛС – Государственный реестр лекарственных средств
ГСО – Госудаственный стандартный образец
ГФ – Государственная Фармакопея
КВ – кривая выхода
ЛП – лекарственный препарат
ЛР – лекарственное растение
ЛРС – лекарственное растительное сырье
ЛФ – лекарственная форма
МПА – мясо-пептонный агар
МПБ – мясо-пептонный бульон
МПК – минимальная подавляющая концентрация
НД – нормативная документация
ТСХ – тонкослойная хроматография
ФС – Фармакопейная статья
ФСП – Фармакопейная статья предприятия
145
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алексеева,
М.А.
Исследование
биологически
активных
флавоноидных
компонентов хмеля обыкновенного Humulus lupulus: дис. … кандидата фармац.
наук; 15.00.02/М.А. Алексеева. – ГУ НИИ питания РАМН. – М., 2005. – 104 с.
2. Алимходжаева, Н. З. Фармакогностическое изучение шалфея бухарского/Н. З.
Алимходжаева//Вопросы фармакологии и фармации: Сб. науч. тр., вып. IV. –
Ташкент: Ташкентский ГМУ, 1976. – С. 77 – 78.
3. Алимхождаева, Н. З. Фармакогностическое изучение 3-х видов шалфея,
произрастающих в Узбекистане: автореф. дис. … канд. фармац. наук; 15.00.02/
Н.З. Алимходжаева. – Львов, 1974. – 17 с.
4. Антимикробные вещества высших растений/В.Г. Дроботько [и др.]// Киев:
Издательство АН УССР, 1958. – 240 с.
5. Антимiкробнi речовини звiробою звiчайного/ Н.А. Дербенцева [и др.]//
Мiкробiол. журн. – 1959. – № 5. – С. 25
6. Байкова, Е. В. Компонентный состав эфирных масел некоторых видов рода
Salvia L., выращенных в условиях Новосибирска / Е. В. Байкова, Е. А. Королюк,
А. В. Ткачев // Химия растительных ресурсов. – 2002. – № 1. – С. 37 – 42
7. Балаев, Т.А. Технология Галенофиллипта – нового противомикробного
препарата, содержащего эуглобали и феофитианы меди/ Т..А. Балаев, Б.Л.
Молдавер // Здоровье – основа человеческого потенциала – проблемы и пути
решения. – 2010. - №1. – С.396 –406
8. Быстров, Н.С. Химия гиперфорина. IX. Структура гиперфорина / Н.С.Быстров,
Ш. Р. Групта, В. Н. Добрынин, М. Н. Колосов, Б. К.Чернов // Биоорганическая
химия. – 1978. – Т. 4. – №7. – С. 948 – 955.
9. Быстров, Н.С. Химия гиперфорина. VI. Общая химическая характеристика /
Н.С. Быстров, В. Н. Добрынин, М.Н. Колосов, Б. К.Чернов // Биоорганическая
химия. – 1978. – Т. 4. – №6. – С. 791 – 797.
146
10. Быстров, Н.С. Химия гиперфорина. VII. Строение тетракарбонильной системы
/ Н. С. Быстров, В. Н. Добрынин, М. Н. Колосов, С. А. Поправко, Б.К.Чернов //
Биоорганическая химия. – 1978. – Т. 4. – №6. – С. 798 – 804.
11. Быстров, Н.С. Химия гиперфорина. VIII. Дифференцировка боковых цепей /
Н. С. Быстров, В. Н. Добрынин, М. Н. Колосов, Б. К. Чернов // Биоорганическая
химия. – 1978. – Т. 4. – №7. – С. 943 – 946.
12. Вичканова, С. А. К вопросу об изучении антимикробных свойств эфирных
масел
/
С.
А.
Вичканова,
Л.
В.
Макарова,
М.
А.
Рубинчик,
В. В. Адгина//Лекарственные растения: Сб. науч. тр. − М.: ВИЛР, 1971. – том 14. −
С. 221 – 230.
13. Вичканова, С.А. Новые аспекты применения эвкалимина/ С.А. Вичканова,
Н.М. Крутикова //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической
химии. – 2012. – №1. – С.214. – 220.
14. Галенофиллипт: новое качество известного препарата/ Т.А. Балаев [и
др.] // Российская оториноларингология. – 2010. – № 6 . – С.101-106.
15. Гаммерман, А.Ф. Лекарственные растения / А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев,
А.А. Ященко-Хмелевский. – М.; Высшая школа, 1990 – 544 с.
16. Гиперфорин – антибиотик из Hypericum perforatum L. / А.И. Гуревич [и др.] //
Антибиотики. – 1971. – №16. – С. 510 – 513.
17. Глауров, А. Г. Роль бальнео- и грязелечения, проводимого во внекурортных
условиях,
в
вертеброгенными
повышении
формами
эффективности
реабилитации
пояснично-крестцового
больных
радикулита
с
/
А. Г. Глауров, В. В. Могильников // Неврология и психиатрия: Республиканский
межведомственный сборник. – М., 1987. – С. 59 – 61.
18. Государственная Фармакопея СССР. – X изд. - Вып. 1. – М.: Медицина. –1968.
– 1079 с.
19. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа.
Лекарственное растительное сырье // МЗ СССР. – 11-е изд. – М.: Медицина, 1989.
– 400 с.
147
20. Государственный реестр лекарственных средств. – [Электронный ресурс]. –
Электрон. дан. – Режим доступа: http://minzdrav.tatarstan.ru.
21. Губанов, И.А. Лекарственные растения: справочник / И.А. Губанов. – М:
Издательство МГУ,1993. – 272 с.
22. Губанова, Е. А. Фенольные соединения некоторых видов рода Salvia
(Lamiaceae) флоры России и их биологическая активность/Е. А. Губанова, О. И.
Попова//Растительные ресурсы. – 2009. – том 45. – вып. 3 – С. 137 – 160.
23. Действие эфирных масел на культуру золотистого стафилококка/Э. Н. Шляхов
[и др.] // Здравоохранение, Кишенёв. – 1979. − № 5. – С. 37 – 40.
24. Дербенцева, Н. А. Антибиотики из лекарственных растений – зверобоя и
шалфея / Н. А. Дербенцева // Материалы Всесоюзной научной конференции по
фармакологическому и клиническому изучению лекарственных препаратов из
растений. – М.: ВИЛАР, 1972. – С. 246 – 247.
25. Дербенцева Н.А., Рабинович А.С., Зелепуха С.И. До питания про властивостi
антiмикробних речовин звiробою звiчайного (Hypericum perforatum Z.). – Доп. АН
УРСР, 1960
26. Зелепуха, С.И. Антимикробные свойства новоиманина / С.И. Зелепуха,
П.Я. Починок // В кн.: Антимикробные свойства растений, употребляемых в
пищу. − Киев, Наукова думка, 1973 – 193 с.
27. Зилфикаров, И.Н. Дитерпены и полифенолы шалфея лекарственного:
перспективы медицинского применения (обзор литературы) / И. Н. Зилфикаров /
/Вестник Санкт-Петербургского университета. – 2007. – вып. 3. – С.149 – 157
28. Зилфикаров, И.Н.
Новые
подходы
в
разработке
и
стандартизации
фитопрепаратов из эфиромасличного сырья: дис. … д-ра фармац. наук; 15.00.02/
И.Н. Зилфикаров. – Пятигорск, 2008. – 290 с.
29. Зилфикаров, И.Н. Определение дитерпеновых кислот в сырье и препаратах
шалфея лекарственного / И. Н. Зилфикаров, А. В. Жилин//Фармация. – 2007. – №
2. – С. 7–9.
30. Зилфикаров,
И.Н.
Совершенствование
стандартизации
сырья
и
фитопрепаратов эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis L., сем. Myrtaceae) /
148
И.Н. Зилфикаров
//
Разработка,
исследование
и
маркетинг
новой
фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2007. – Вып. 62. – С. 57 –
59.
31. Зилфикаров, И.Н. Совершенствование технологии и методик стандартизации
препаратов эвкалипта прутовидного // И.Н.Зилфикаров// Известия высших
учебных заведений. Сев.-Кавк. регион. Серия –Естественные науки. – 2007. – № 3.
– С. 60-62.
32. Зилфикаров, И.Н. Химический анализ и стандартизация препаратов Eucalyptus
viminalis/И.Н. Зилфикаров, В.А. Челомбитько // Материалы 7- го Междунар.
симпозиума по химии природных соединений (16-18 октября 2007), Ташкент,
Узбекистан). – С. 344.
33. Ибрагимов, Г. Г. Сравнительная оценка эффективности антимикробного
действия некоторых эфирных масел, полученных из флоры Азербайджана. −
Автореф. дис. канд. фарм. наук/Г. Г. Ибрагимов; АГМУ. – Баку. – 1971. – 31 с.
34. Изучение состава биологически активных веществ сухих экстрактов эхинацеи
узколистной и шалфея лекарственного/В.М. Косман [и др.] //Химия растительного
сырья. – 2012. – № 1. – С. 153– 160.
35. Изучение состава эфирного масла Salvia sclarea (Lamiaceae) и продуктов его
переработки: использование мацерационного способа получения липофильных
веществ/Д. Ф. Шепель, В. П. Посторонка, Ф. Г. Шепель, Ф. З. Макаев//
Растительные ресурсы. – 2009. – том 45. – вып. 2 – С. 137 – 141.
36. Иманин – новый растительный антибиотик/В.Г. Дроботько [и др.] // Киев:
Издательство АН УССР, 1954. –76 с.
37. Калышбаева, Г.Б. Исследование биологически активных веществ в видах рода
шалфея (Salvia L., Lamiaceae) в условиях Южно-Казахстанской области /
Г.Б. Кылышбаева,
Г.Т. Бозшатаева,
Г.С. Оспанова//Международный
журнал
прикладных и фундаментальных исследований. – 2013. –№ 10-1. – С. 76 – 77.
38. Крутикова, Н.М.
Эвкалимин
–
новый
растительный
препарат
антибактериального действия: автореф. дис. … канд. биол. наук.: 14.00.25. – М.,
1997. – 27 с.
149
39.Куркин, В.А. Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных средства
/ В.А. Куркин, О.Е. Правдивцева – Самара: ГОУ ВПО «СамГМУ»; ООО «Офорт»
. – . 2008. – 127 с.
40. Лавренов, В.К. Полная энциклопедия лекарственных растений, в 2-х т./ В.К.
Лавренов, Г.В. Лавренов. – 1999. – Т. 2. № 2 – 267 с.
41. Новый природный антисептик галенофиллипт для лечения стафилококковой
локализованной инфекции в кожномышечной ране у белых мышей / Г.Е.
Афиногенов
[и
др.]
//
Клиническая
микробиология
и
антимикробная
химиотерапия. – 2010. – №2. – С. 170-176
42. Обоснование технологии фитопрепаратов при комплексной промышленной
переработке листьев шалфея лекарственного/ И.Н. Зилфикаров [и др.] //
Фармацевтические технологии и упаковка. − № 2. – 2006 – С. 43 – 45.
43. Оценка противовоспалительного действия лекарственных препаратов на
основе шалфея / К.Л.Крышень [и др.]// Цитокины и воспаление. – 2009. – Том 8. –
№ 4 – С. 67– 71.
44. Пат. 115585 РФ МКИ А 61 К35/78 Микстура по прописи М.Н.Здренко /
М.Н. Здренко (РФ). – № 576575; заявл. 21.0.92; опубл. 05.10.55. – 2 с.
[Электронный ресурс]. – Электрон, дан. – Режим доступа: http://www.fips.ru.
45. Пат. 1438042 РФ МКИ А 61 К35/78 Способ получения вещества «эвкалимин»,
обладающего антимикробной и противовирусной активностью. /Т.А. Сокольская,
В.И. Глызин, Г.Ф. Прибылова, Л.Ф. Либизова, Л.Д. Шипулина, С.А. Вичканова,
Н.М. Крутикова, В.В. Вандышев (РФ). – № 4072541/14; заявл. 18.04.86; опубл.
07.07.93. –. 3 с. [Электронный ресурс]. - Электрон, дан. – Режим доступа:
http://www.fips.ru.
46. Пат. 2032414 РФ МКИ А 61 К35/78 Способ получения препарата
эвкалимин/Т.А. Сокольская,
В.И. Глызин,
Г.Ф. Прибылова,
Л.Ф. Либизова,
Л.Д. Шипулина, С.А. Вичканова, Н.М. Крутикова, В.В. Вандышев (РФ). – №
5055699/14; заявл. 21.0.92; опубл. 10.04.95. –. 6 с. [Электронный ресурс]. –
Электрон, дан. – Режим доступа: http://www.fips.ru.
150
47. Пат. 2320360 РФ МКИ А 61 К36/61, К33/34, К31/00. Способ получения
лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла./ ОАО
«Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга» (РФ). – № 2006122903/15; заявл.
27.06.06; опубл. 27.03.08. –. 20 с. [Электронный ресурс]. – Электрон. дан. – Режим
доступа: http://www.fips.ru.
48. Патудин, А. В. Содержание ройлеанонов в корнях некоторых видов шалфея и
динамика накопления их в течение вегетационного периода / А. В. Патудин, А. С.
Романова// Химико-фармацевтический журнал. − 1977. − № 1. – С. 90 – 94.
49. Пискорская, Н. М. Циркуляция S. aureus и антимикробная активность
эфирных масел, изготавливаемых в Молдавии / Н. М. Пискорская, Е. В.
Груз//Эпидемиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций: Сб.
науч. тр. – Кишинёв, 1981. – С. 81 – 88.
50. Применение
антисептика
растительного
происхождения
в
лечении
воспалительных заболевании шейки матки / Т.А. Балаев [и др.] // Акушерство и
гинекология. – 2011 – № 2. – С. 102 – 105
51. Разработка технологии и анализа стоматологического спрея на основе
экстракта шалфея лекарственного/ О.М. Маркова [и др.] // Электронный научнообразовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке – 2011 – Том 13.–
№ 12. – С.589– 590.
52. Савина, А.А. Строение нового фенолальдегида из листьев Eucalyptus
viminalis/А.А. Савина,
В.Ф. Захаров,
Н.С. Цыбулько//
Химия
природных
соединений. – 1991. – № 6. – С. 789 – 795.
53. Саламатин, А.А. Кинетика экстракции биологически активных веществ из
растительного сырья кипящим растворителем/А.А. Саламатин, Р.Ш. Хазиев,
А.С. Макарова, С.А. Иванова // Теорет. основы хим. технологии – 2015. – Том 49,
№ 2 – С. 200 – 206.
54. Сёмкина, О.А. Фитопрепарат антимикробного и противовоспалительного
действия – эвкалимин / О.А. Семкина [и др.] // Химико-фармацевтический
журнал. – 2006. – №8. – С.52. – 56
151
55. Соболева, Л. С. Зелёная аптека Татарии/ Л. С. Соболева, И. Л. Крылова. –
Казань: Татар. кн. изд-во, 1990. – С. 120.
56. Справочник
Видаль
2015.
Лекарственные
препараты
в
России.
–
[Электронный ресурс]. – Электрон. дан. – Режим доступа: http://www.vidal.ru.
57. Сур, С. В. Состав эфирных масел лекарственных растений / С. В. Сур //
Растительные ресурсы. – 1993. – Т. 29. – Вып. 1. – С. 98–117
58. Сур, С.В. Газохроматографическое определение камфоры и 1,8-цинеола в
растительном сырье и настоях шалфея/С. В. Сур//Химико-фармацевтический
журнал. – 1991. − № 4. – С. 58 − 60.
59. Ткачук, В. Г. Влияние эфирного масла шалфея мускатного на показатели
кроветворной,
иммунной
и
ферментной
систем
/
В. Г. Ткачук,
В. В. Шаповал//Врачебное дело, Киев. – 1987. − № 5. – С. 83 – 84.
60. Турова, А. Д. Лекарственные растения СССР и их применение/ А.Д. Турова,
Э. Н. Сапожникова. – Москва: Медицина, 1982. – С. 235–236.
61. Хаджиева, З.Д.
Изучение
антимикробной
активности
лекарственных
препаратов с фитоэкстрактом / З.Д. Хаджиева, Е.А. Теунова, И.С. Крахмалев //
Фундаментальные исследования. – 2010. – №11. – С. 152 –154.
62. Хазиев, Р.Ш. Получение извлечений из листьев шалфея лекарственного,
оптимизированных по содержанию дитерпеновых кислот и изучение их
антибактериальной активности/Р.Ш. Хазиев, А.С. Макарова, Л.Т. Мусина//
Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. − 2013. − №2.
− С.35-37.
63. Amr, S. The investigation of the sage (Salvia officinalis L.) originating of Jordan /
S. Amr, S. Dordevic // Facta Universitatis. – 2000. – Vol. 1, № 5. – P. 103–108
64. Antidepressant activity of Hypericum perforatum and hyperforin: the neglected
possibility / Sh. S. Chatterjee [et al.]/ Pharmacopsychiatry. . – 1998. – № 31. – P. 7 –
15
65. Antimicrobial
compounds
from
Eucalyptus
perriniana
/R. Nakayama
al.]//Agricultural and Biological Chemistry. – 1990. – Vol. 54, № 1. – Р. 231– 232.
[et
152
66. Antimicrobial evaluation of some plants used in Mexican traditional medicine for
the treatment of infectious diseases/V. Navarro [et al.]//Journal Ethnopharmacology. –
1996. – Vol. 53, № 3. – Р. 143– 147.
67. Аntioxidative phenolic compounds from Sage (Salvia officinalis)/. Wang M [et al] //
Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 1998. – Vol. 46, № 12. – P. 4869 – 4873
68. Anti-tumor-promoting activities of euglobals from Eucalyptus plants/ M. Takasaki
[et al.] // Biological Pharmaceutical Bulletin. – 1995. – Vol. 18, № 3– Р. 435 – 438.
69. Antiviral diterpenes from Salvia officinalis/ M. Tada [et al.]//Phytochemistry. –
1997. – Vol. 35, № 2. – Р. 1307 – 539
70. Apodophyllone
and
isotorquatone,
two
arenic
ketones
from
Eucalyptus
apodophylla/ С. Menut [et al.]//Phytochemistry – 1999. – Vol. 51, № 8. – Р. 975 – 978.
71. Barnes, J John`s wort (Hypericum perforatum): a review of its chemistry,
pharmacology and clinical propernis//J. Barnes, L. A Anderson, J. D Phillipson//
Journal of Pharmacy and Pharmacology. – 2001. – Vol. 53, № 5. – P. 583 – 600
72. Bernardesa, W. A. Antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis against оral
рathogens: relevance of carnosic acid and carnosol/ W. A. Bernardesa, R. Lucarinia,
M.G. Tozattia// Chemistry & Biodiversity. – 2010. – Vol. 7, № 7 – Р.1835-1840.
73. Between species diversity of Hypericum perforatum and H. maculatum by the
contents of bioactive compounds/ Е. Bagdonaite [et al.] //5th international conference
«Research and conservation of biological diversity in Baltic region»., Daugavpils, (22 –
24 April, 2009). – p.11
74. Bisset, N.G. Herbal drugs and phytopharmaceuticals: a handbook for practice on a
scientific basis / N.G Bisset, М. Wichtl. – Stuttgart: Medpharm Scientific Publishers,
1994. – 566 с.
75. Brantner, A. Antibacterial activity of plant extracts used externally in traditional
medicine/ А. Brantner, Е. Grein//Journal of Ethnopharmacology – 1994. – Vol. 4, № 1.
– P. 35 – 40
76. Brieskom, С.Н.The Structure of сarnosol/С.Н. Brieskom//Journal of Organic
Chemistry. – 1997. – Vol. 29, № 8. – Р. 2293 – 2297.
153
77. Brondz, I. n-Alkanols of Hypericum perforatum / I. Brondz, N. Greibrokk, A. J.
Aasen//Journal of Natural Products. – 1983. – Vol. 46, № 6. – P. 940 – 941
78. Bucic-Kojic, A. Temperature-dependent kinetics of grape seed phenolic compounds
extraction: Experiment and model/ А. Bucic-Kojic, Н. Sovova, М. Planinic, S Tomas S.
// Food Chemistry. –2013/ –Vol. 136, № 3-4 – Р. 1136
79. Carnosic acid 12-methyl ether-γ-lactone, a ferruginol-type diterpene from Salvia
officinalis/ Z. Djarmati [et al.] // Phytochemistry. – 1992. – Vol. 31, № 4. – Р. 1307 –
1309
80. Coppen, John J.W. Eucalyptus: The Genus Eucalyptus / John J.W. Coppen – CRC
Press, 2002. – 450 р.
81. Cytostatic and antibacterial activity of some compounds isolated from several
Lamiaceae species from the Canary islands / V. Darias [et al.]//Planta Medica. – 1990. –
Vol. 56, № 1. – P. 70 – 72
82. Daniela, B. Salvia officinalis L. Botanica charakteristika, obsahove latky, pouzitie,
pestovanie / B. Danela //Cesk. Farm. – 1993. – Vol. 42, №3. – P.111 – 116.
83. Determination of napthodianthrones and phloroglucinols from Hypericum
perforatum extracts by liquid chromatography / tandem mass spectrometry / А. Tolonen
[et al.]//Rapid Communications in Mass Spectrometry. – 2002. – № 16. – P. 396 – 402
84. Distribution of foliar formylated phloroglucinol derivatives amongst Eucalyptus
species /B.M. Eschler [et al.]//Biochemical Systematics and Ecology. – 2000. – Vol. 28,
№ 8. – Р. 813– 824.
85. Egorov, A.G. Forward and inverse problems of supercritical extraction of oil from
polydisperse packed bed of ground plant material/ A.G. Egorov, A. A. Salamatin,
R.N. Maksudov // Theor. Found. Chem. Eng. –2014 / –Vol. 48, № 1 – Р. 39
86. Eucalyptone from Eucalyptus globulus / К. Osawa [et al.]//Phytochemistry. – 1995.
– Vol. 40, № 1. – Р. 183 – 184.
87. Euglobal III, a novel granulation inhibiting agent from Eucalyptus globulus Labill. /
T. Sawada [et al.] // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 1982. – Vol. 28, № 8. –
Р. 2546 – 2548.
154
88. European Pharmacopoeia – 7 th edition. – Council of Europe Strasbourg. –2005. –
1297 p.
89. Farcasanu, С. Ethanol еxtracts оf Salvia оfficinalis еxhibit аntifungal рroperties
аgainst Saccharomyces сerevisiae сells / Ileana C. Farcasanu, Eliza Oprea // Analele
Universitа Nii din Bucuresti – Chimie, Anul XV (serienouа).- Vol. I.- P. 51 – 55.
90. Firas Abbas, Al-Bayati. Antimicrobial activity of carnosic acid isolated from
Rosmarinus officinalis L. leaves//Al-Bayati Firas Abbas// Tikrit Journal of Pure
Science. – 2011. – Vol. 16, № 4 – Р. 6 – 11.
91. Five phloroglucinol-monoterpene adducts from Eucalyptus grandis/ К. Umehara [et
al.] // Phytochemistry – 1998. – Vol. 49, № 6. – Р.1699 – 1704.
92. Furohyperforin, a prenylated phloroglucinol from St. John's wort (Hypericum
perforatum) // L.J. Verotta [et al.]//Journal of Natural Products. – 1999. – Vol. 62, № 5.
– P. 770 – 772
93. Ganzera, M. Hypericum perforatum - chemical profiling and quantitative results of
St. John's Wort produces by an improved high performance liquid chromatography
method / М. Ganzera, J. Znao, I. A. Khan//Journal of Pharmaceutical Scieces. – 2002. –
Vol. 91, № 3. – P. 623 – 630
94. Hyperforin represents the neurotransmitter reuptake inhibiting constituent of
Hypericum extract / W. E Muller [et al.] // Pharmacopsychiatry. – 1998. – № 31. – P. 16
– 21
95. Identification by high performance liquid chromatography – diode array detection –
mass spectrometry and quantification by high performance liquid chromatography – UV
absorbance detection of active constituents of Hypericum perforatum/ М. Brolis [et al.]
// Journal of Chromatography. – 1998. – Vol. 825, № 1. – P. 9 – 16
96. In vitro antimicrobial and antioxidant activity of commercial Rosemary еxtract
formulations/ A. Klanc Nik [et al.]// Journal of Food Protection. – 2009. – Vol. 72, № 8.
– P. 1744 – 1752
97. Inhibitors of skin-tumour promotion 13. Inhibitory effects of euglobals and their
related compounds on Epstein-Barr virus activation and on two-stage carcinogenesis of
155
mouse skin tumour / M. Takasaki [et al.] // Biological Pharmaceutical Bulletin. – 1995.
– Vol. 18, № 2– Р. 288 – 294.
98. Inhibitory effect of edible plant extracts on 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetateinduced ear oedema in mice/ К. Yasukawa [et al/]//Phytotherapy Research. – 1994. –
Vol. 7, № 2. – P. 185 – 189
99. Isolation and characterization of macrocarpals B-G, antibacterial compounds from
Eucalyptus
macrocarpa./Y. Yamakoshi
[et
al.]//Bioscience,
Biotechnology
and
Biochemistry. – 1992. – Vol. 56, № 10. – Р. 1570 – 1576.
100. Isolation and structural elucidation of two new glycosides from sage (Salvia
officinalis)/М. Wang M [et al] // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2000. –
Vol. 48, № 2. – P. 235 – 238
101. Konoshima, T., Takasaki M. Chemistry and bioactivity of the non-volatile
constituents of eucalyptus/Т. Konoshima, М. Takasaki//In: Eucalyptus: The Genus
Eucalyptus. –London, 2002. – 450 р.
102. Lo, A. H. Carnosol, an antioxidant rosemary, suppresses inducible nitric oxide
synthase through down-regulating nuclear factor-B in mouse macrophages/A. H. Lo, Y.
Ch. Liang, Sh. Y. Lin-Shiau // Carcinogenesis. − 2002.− Vol. 23.− № 6. – P. 983−991
103. Lu, Y. Polyphenolics of Salvia – a review/ Y. Lu, L.Y.Foo // Phytochemistry. –
2002. – Vol. 59, № 2. – Р. 117 – 140
104. Lu, Y. Rosmarinic acid derivatives from Salvia officinalis / Y. Lu, L.Y. Foo //
Phytochemistry. – 1999. – Vol. 51, № 1. – Р. 91 – 94
105. Macrocarpal A, a novel antibacterial compound from Eucalyptus macrocarpa /
M. Murata [et al.]//Agricultural and Biological Chemistry. – 1990. – Vol. 56, № 12. – Р.
3221– 3226.
106. Macrocarpals H, I and J from the leaves of Eucalyptus globulus/ К. Osawa [et al.]
//Journal of National Products– 1996. – Vol. 59. – Р. 823 – 827.
107. Macrocarpals, antibacterial compounds from Eucalyptus, inhibit aldose reductase/
M. Murata [et al.] // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. – 1992. – Vol. 56, №
12. – Р. 2062– 2063.
156
108. Macrocarpals:
HIV-reverse
transcriptase
inhibitors
of
Eucalyptus
globulus/M. Nishizawan [et al.] // – 1992. – Vol. 33, № 21. – Р. 2983 – 2986.
109. Maisenbacher, P. Adhyperforin: a homologue of hyperforin from Hypericum
perforatum /. Р. Maisenbacher, К. Kovar//Planta medica. – 1992. – Vol. 58, № 3. –
P. 291 – 293
110. Masuda, T. Recovery mechanism of the antioxidant activity from carnosic acid
quinone, an oxidized sage and rosemary antioxidant//Journal of Agricultural and Food
Chemistry. – 2002. – Vol. 50, № 21. – P. 5863 – 5869
111. Michael, A. Quntitative determination of phenolic diterpenes in rosemary extracts.
Aspects of accurate quantification/А.Michael, Thorsen, Katja S. Hildebrandt///Journal
of Chromatography – 2003. – Vol. 995, № 1–2 – Р. 119 – 125.
112. Miura, K. Antioxidant activity of chemical components from sage (Salvia
officinalis L.) and thyme (Thymus vulgaris L.) measured by the oil stability index
method / К. Miura, Н. Kikuzaki, N. Nakatani // Journal of Agricultural and Food
Chemistry. – 2005. – Vol. 50, № 7. – P. 1845 – 1851
113. Miura, K. Apianane terpenoids from Salvia officinalis/ К. Miura, Н. Kikuzaki, N.
Nakatani // Phytochemistry. – 2001. – Vol. 58, № 8. – Р. 1171 – 1175
114. Moreno, S. Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to
their polyphenоl composition/S. Moreno, T. Scheyer, Catalina S.//Free Radical
Research. – 2006. – Vol. 40, № 2. – Р. 223 –231
115. Muruganandam, A. V. Antidepressant activity of hyperforin conjugates of St.
John's wort, Hypericum perforatum L. an experimental study /А. V. Muruganandam, S.
K. Bhattacharya, S. Ghosal//Journal of Experimential Biology. – 2001. – Vol. 39, № 12.
– P. 1303 – 1304
116. Pharmacoeconomic analysis of antibacterial medicines used in dentistry/
М.М. Boyko [et al.] // Kлiнiчна фармацiя. – 2014. – том 18, № 1. – С. 59 – 64.
117. Quantitative changes of dianthrones, hyperforin and flavonoids content in the
flower ontogenesis of Hypericum perforatum // D. Tekelova [et al.] // Planta Medica. –
2000. – Vol. 66, № 8. – P. 778 – 780
157
118. Rahman, Atta-ur Studies in natural products chemistry / Atta-ur Rahman. – Vol. –
Pakistan: 2014. – 415 с.
119. Sa, C.M. Sage tea drinking improves lipid profilic and antioxidant defences in
humans/ C.M. Sa, A.A. Ramos, M.F. Azevedo //International Journal of Molecular
Sciences. -2009. – № 10. – Р. 3937–3950
120. Santos-Gomes, P. C. Essential oil produced by in vitro shoots of sage (Salvia
officinalis L.) /P. C. Santos-Gomes, M. Fernandes-Ferreira//Journal of Agricultural and
Food Chemistry – 2003. – Vol. 51, № 8 –P. 2260 – 2266
121. Singh, I. P. Potent attachment-inhibiting and -promoting substances for the blue
mussel, Mytilus edulis galloprovincialis, from two species of Eucalyptus / I.P. Singh,
К. Takahashi, Н. Н. Etoh // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. – 1996. –
Vol. 60, № 12. – Р. 1522 – 1523.
122. Singh, I.P. New macrocarpal-am-1 from Eucalyptus amplifolia/ I.P. Singh,
Н. Etoh//Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. – 1995. – Vol. 59, № 12. – Р.
2330 – 2332.
123. Structures of sideroxilonalis from Eucaliptus sideroxilon/Н. Satoh [et al.] //
Chemical Phisics Letters. – 1992. –. № 21. – 1917 – 1920.
124. Tada,
M.
A-quinone
methide
from
Salvia
officinalis/М.
Tada//
M. –
Phytochemistry. – 1994. – Vol. 45, № 7. – Р. 117 – 140
125. The potential of bioactive constituents of Eucalyptus foliage as non-wood products
from plantations: Joint Venture Agroforestry Program. – Australia: Rural Industries
Research and Development Corporation. – November 2004.
126. The relative stereochemistry of hyperforin – an antibiotic from Hypericum
perforatum L. / I. Brondz [et al.]//Tetrahedron Letters – 1982. – Vol. 23, № 12. – P.
1299 – 1300
127. Topical anti-inflammatory activity of Salvia officinalis L. leaves the relevance of
ursolic acid // Journal Ethnopharmacology. – 2001. – Vol. 75 № 2-3– P. 125 – 132.
128. Wolf-Bors, Ch. M. Antioxidant mechanisms of polyphenolic caffeic acid
oligomers, constituents of Salvia officinalis/ Ch. M. Wolf-Bors, K. Stettmaier, Y. Lu, L.
Y. Foo//Biological Research − 2004.− Vol. 37.− № 2. – P. 1099 – 1104;
158
129. Yanyan Cuy and Ang CY. Super critical fluid extraction and high performance
liquid chromatographic determination of phloroglucinols in St. John's Wort {Hypericum
perforatum) / Cuy Yanyan, CY Ang//Journal of Agricultural and Food Chemistry. –
2002. – Vol. 50, № 10. – P. 2755 – 2759
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
1
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГФ ХI, вып. 2, ст. 15
Листья эвкалипта прутовидного
ИЗМЕНЕНИЕ №____
Срок введения изменения с___________________
Старая редакция
Новая редакция
Качественные реакции.
На линию старта хроматографической
пластинки
ПТСХ АФ-А
марки
Сорбфил
размером 10х15
см,
наносят 0,05 мл раствора гексанового
экстракта,
приготовленного
соответствии
с
методикой
в
коли-
чественного определения. Пластинку
с нанесенными пробами высушивают
на воздухе в течение 5 мин, затем
помещают в камеру, предварительно
насыщенную в течение 1 ч смесью
хлороформ : спирт (1:1), и хроматографируют восходящим способом.
Когда
дойдёт
до
фронт
края
растворителей
пластинки,
ее
вынимают из камеры, высушивают на
воздухе в течение 20 минут, затем
обрабатывают 0,5% раствором 2,4-
2
динитрофенилгидразина
в
2М
растворе хлористоводородной кислоты и 1% водным раствором железоаммонийных квасцов.
Фенолальдегиды
обнаружи-
ваются на хроматограмме испытуемого раствора в виде пятен пятна
оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин) и тёмно-фиолетового (железоаммонийные
квасцы)
цвета
с
величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7.
Примечание:
1. Подготовка пластинок. Пластинки
«Сорбфил
ПТСХ-АФ-А»
для
активации предварительно выдерживают
в
сушильном
шкафу
при
температуре 100-105°С в течение 1 ч.
Хроматографическую камеру насыщают
парами
растворителей
в
течение 1 ч.
2. Приготовление раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе
хлористоводородной кислоты: 0,1 г
2,4-динитрофенилгидразина
ряют
в
20
мл
2
М
раствораствора
хлористоводородной кислоты. Раствор применяют свежеприготовленным.
3. Приготовление
1%
раствора
железоаммонийных квасцов:1 г желе-
3
зоаммонийных квасцов растворяют в
100 мл воды. Раствор применяют
свежеприготовленным.
2. УФ-спектр раствора гексанового
извлечения, приготовленного в соответствии с методикой количественного
определения,
должен
иметь
отчётливый максимум поглощения
при 278 ± 3 нм.
Числовые показатели.
Числовые показатели.
Цельное сырье. Эфирного масла не
Цельное сырье. Эфирного масла не
менее 1%; влажность не более 14%;
менее 1%; суммы фенолальдегидов в
золы
5%;
пересчёте на эвкалимин не менее
потемневших и побуревших листьев
1,5%, влажность не более 14%; золы
не более 3%; других частей эвкалипта
общей не более 5%; потемневших и
(веточек, бутонов, плодов) не более
побуревших листьев не более 3%;
2%; органической примеси не более
других частей эвкалипта (веточек,
0,5%; минеральной примеси не более
бутонов,
0,5%
органической примеси не более 0,5%;
общей
не
более
плодов)
не
более
2%;
минеральной примеси не более 0,5%.
Измельченное сырье. Эфирного масла
Измельчённое сырьё. Эфирного масла
не менее 0,8%; влажность не более
не
14%; золы общей не более 5%;
альдегидов в пересчёте на эвкалимин
потемневших и побуревших кусочков
менее 1,5%, влажность не более 14%,
листьев не более 3%; других частей
золы
эвкалипта (бутонов, плодов, кусочков
потемневших и побуревших кусочков
веточек) не более 2%; частиц, не
листьев не более 3%; других частей
проходящих
с
эвкалипта (бутонов, плодов, кусочков
отверстиями 5 мм, не более 5%;
веточек) не более 2%; частиц, не
частиц, не проходящих сквозь сито с
проходящих сквозь сито с отверсти-
сквозь
сито
менее
0,8%,
общей
не
суммы
более
фенол-
5%;
4
отверстиями 0,5 мм, не более 10%;
ями 5 мм, не более 5%; частиц, не
органической примеси не более 0,5%;
проходящих
минеральной примеси не более 0,5%.
отверстиями 0,5 мм, не более 10%;
Количественное определение.
органической примеси не более 0,5%;
Эфирное масло.
минеральной примеси не более 0,5%.
Аналитическую
измельчают
проходящих
до
пробу
сырья
размера
частиц,
сквозь
отверстиями
диаметром
Содержание
эфирного
сито
2
с
сквозь
сито
с
Количественное определение.
Эфирное масло.
Аналитическую
до
пробу
сырья
размера
частиц,
мм.
измельчают
масла
проходящих
определяют в 10 г измельченного
отверстиями
диаметром
сырья методами 1 или 2 (ГФ XI, вып.
Содержание
эфирного
1, с. 290). Время перегонки 1 ч.
определяют в 10 г измельченного
сквозь
сито
2
с
мм.
масла
сырья методами 1 или 2 (ГФ XI, вып.
1, с. 290). Время перегонки 1 ч.
Сумма фенолальдегидов.
Аналитическую
пробу
сырья
измельчают до размера 1 мм. Около 1
г сырья (точная навеска) помещают в
колбу со шлифом вместимостью 500
мл, прибавляют 200 мл гексана.
Колбу присоединяют к обратному
холодильнику
и
нагревают
на
водяной бане при умеренном кипении
гексана в течение 60 мин. Затем колбу
охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 200 мл, доводя объем
раствора до метки гексаном.
1 мл полученного извлечения
5
переносят
в
мерную
колбу
вместимостью 50 мл и доводят объем
раствора
до
Измерение
метки
гексаном.
оптической
плотности
раствора проводят при длине волны
278 нм, используя в качестве раствора
сравнения гексан.
Содержание
терпеноидных
суммы
фенолальдегидов
в
пересчете на эвкалимин и абсолютно
сухое
сырье
в
процентах
(х)
вычисляют по формуле:
где
х 
D  200  50  100
720  m  1  (100  W )
D
–
оптическая
плотность
испытуемого раствора;
720
–
удельный
показатель
поглощения ГСО эвкалимина;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании
,
6
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГФ ХI, вып. 2, ст. 22
Листья шалфея лекарственного
ИЗМЕНЕНИЕ №____
Срок введения изменения с___________________
Старая редакция
Новая редакция
Числовые показатели.
Числовые показатели.
Эфирного масла не менее 0,8%;
Эфирного масла не менее 0,8%;
влажность не более 14%; золы общей
суммы
не
пересчёте на карнозоловую кислоту
более
12%;
потемневших
и
дитерпеновых
менее
2%;
суммы
кислот
в
побуревших листьев не более 5%;
не
других частей растения (цыетков и
коричных кислот в пересчёте на
кусочков стеблей) не более 13%;
розмариновую
частиц, не проходящих сквозь сито с
2,0%; влажность не более 14%; золы
отверстиями 0,5 мм, не более 10%;
общей не более 12%; потемневших и
органической примеси не более 3%;
побуревших листьев не более 5%;
минеральной примеси не более 0,5%
других частей растения (цыетков и
кислоту
гидроксине
менее
кусочков стеблей) не более 13%;
частиц, не проходящих сквозь сито с
отверстиями 0,5 мм, не более 10%;
органической примеси не более 3%;
минеральной примеси не более 0,5%
Количественное определение.
Количественное определение.
Эфирное масло.
Эфирное масло.
Аналитическую пробу сырья измель-
Аналитическую пробу сырья измель-
7
чают до размера частиц, проходящих
чают до размера частиц, проходящих
сквозь сито с отверстиями диаметром
сквозь сито с отверстиями диаметром
2 мм.
2 мм.
Содержание
эфирного
масла
Содержание
эфирного
масла
определяют в 10 г измельченного
определяют в 10 г измельченного
сырья методами 1 или 2 (ГФ XI, вып.
сырья методами 1 или 2 (ГФ XI, вып.
1, с. 290). Время перегонки 1 ч.
1, с. 290). Время перегонки 1 ч.
Сумма дитерпеновых кислот.
Аналитическую
измельчённого
пробу
сырья
около
1
г
(точная навеска) помещают в колбу
вместимостью 500 мл, заливают 200
мл
петролейного
эфира
40/70
и
экстрагируют на кипящей водяной
бане в течение 20 мин.
Затем
колбу
охлаждают
и
фильтруют раствор через бумажный
фильтр
в
мерную
колбу
вместимостью 500 мл. Процедуру
экстракции повторяют второй раз при
аналогичном
режиме.
Извлечение
фильтруют в ту же мерную колбу
вместимостью 500 мл, доводят объем
раствора
до
метки
петролейным
эфиром.
Измерение
оптической
плотности раствора проводят при
длине волны 285 нм, используя в
качестве
раствора
петролейный эфир 40/70.
сравнения
8
Содержание суммы дитерпеновых кислот в листьях шалфея в
пересчёте на карнозоловую кислоту и
абсолютно сухое сырьё в процентах
(х) рассчитывают по формуле:
где
х
D  500  100
40,92  а  (100  W )
D
–
оптическая
плотность
испытуемого раствора;
–
40,92
удельный
показатель
поглощения карнозоловой кислоты
при длине волны 285 нм;
а– навеска сырья, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании
сырья, в %.
Гидроксикоричные кислоты.
0,2
г
измельченного
сырья
(точная навеска) помещают в колбу
со шлифом вместимостью 200 мл.
Затем
прибавляют
этилового
спирта
экстракцию
на
80
и
мл
50 %
проводят
водяной
бане
с
обратным холодильником в течение
30 минут. Полученное извлечение
охлаждают
и
фильтруют
через
бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 100 мл, доводят до
метки 50 % этиловым спиртом. Затем
1 мл извлечения переносят в мерную
колбу на 10 мл, добавляют последо-
9
вательно следующие реактивы: 2 мл
0,5 М раствора хлористоводородной
кислоты, 2 мл раствора, полученного
растворением 10 г натрия нитрита и
10 г натрия молибдата в 100 мл воды,
2 мл 8,5 % раствора гидроксида
натрия и доводят объем раствора до
метки водой очищенной.
Параллельно готовят раствор
сравнения: 1 мл извлечения переносят
в мерную колбу вместимостью 10 мл
и доводят объем раствора до метки
водой
очищенной.
Оптическую
плотность сравнивают при длине
волны
505
нм.
гидроксикоричных
Содержание
кислот
(х),
в
пересчете на кислоту розмариновую,
вычисляют по формуле:
х
где
D
–
D  2,5
а
оптическая
плотность
0
испытуемого раствора;
0
а – навеска сырья, в граммах.
10
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГФ ХI, вып. 2, ст. 52
Трава зверобоя продырявленного
ИЗМЕНЕНИЕ №____
Срок введения изменения с___________________
Старая редакция
Новая редакция
Качественные реакции.
1. На
линию
старта
хроматогра-
фической пластинки марки «Сорбфил
ПТСХ-АФ-А» размером 10х15 см,
предварительно
выдержанной
в
сушильном шкафу при температуре
100-105°С в течение 1 ч, наносят 0,05
мл раствора гексанового экстракта,
приготовленного в соответствии с
методикой количественного определения. Пластинку с нанесенными
пробами высушивают на воздухе в
течение 15 мин, затем помещают в
камеру, предварительно насыщенную
в
течение
этилацетат
1
ч
(9:1)
смесью
и
гексан-
хроматогра-
фировают восходящим способом.
После
растворителей
того
как
пройдет
фронт
расстояние
11
около 8 см, пластинку вынимают из
камеры, сушат до удаления следов
растворителей и просматривают в
УФ-свете при длине волны 360 нм.
Производные
гиперфорина
обнаруживаются на хроматограмме
испутуемого раствора в виде пятна с
интенсивно-синей флуоресценцией с
Rf около 0,45 (гиперфорин). Возможно присутствие других зон.
Примечание:
1. Подготовка пластинок. Пластинки
«Сорбфил ПТСХ-АФ-А» для активации предварительно выдерживают в
сушильном шкафу при температуре
100-105°С в течение 1 ч. Хроматографическую
камеру
насыщали
парами растворителей в течение 1 ч.
2. УФ-спектр раствора гексанового
извлечения,
приготовленного
соответствии
с
чественного
методикой
определения,
в
колидолжен
иметь отчётливый максимум поглощения при длине волны 278 ± 3 нм
Числовые показатели.
Числовые показатели.
Цельное сырьё. Суммы флавоноидов
Цельное сырьё. Суммы флавоноидов
в пересчете на рутин не менее 1,5%,
в пересчете на рутин не менее 1,5%,
влажность не более 13%; золы общей
суммы производных гиперфорина в
не более 8%; золы, нерастворимой в
пересчёте на гиперфорин не менее
10% растворе хлористоводородной
1%, влажность не более 13%; зол
12
кислоты не более 1%, стеблей (в том
общей
не
более
числе отделенных при анализе) не
нерастворимой
более 50%, органической примеси не
хлористоводородной
более 1%, минеральной примеси не
более 1%, стеблей (в том числе
более 1%.
отделенных при анализе) не более
в
8%;
10%
золы,
растворе
кислоты
не
50%, органической примеси не более
не более 1%; минеральной примеси
не более 1%.
Измельчённое
Суммы
Измельчённое сырьё. Суммы флаво-
флавоноидов в пересчете на рутин не
ноидов в пересчете на рутин не менее
менее 1,5%, влажность не более 13%;
1,5%, суммы производных гиперфо-
золы общей не более 8%; золы,
рина в пересчёте на гиперфорин не
нерастворимой в 10% растворе хло-
менее 1%, влажность более 13%; золы
ристоводородной кислоты не более
общей не более 8%; золы, нераство-
1%; стеблей не более 50%; частиц, не
римой в 10% растворе хлористоводо-
проходящих
с
родной кислоты не более 1%; стеблей
отверстиями диаметром 7 мм, не
не более 50%; частиц, не проходящих
более
сквозь сито с отверстиями диаметром
10%;
сырьё.
сквозь
частиц,
сито
проходящих
сквозь сито с отверстиями размером
7
0,310 мм, не более 10%; органической
проходящих
примеси не более 1%; минеральной
отверстиями размером 0,310 мм, не
примеси не более 1%.
более 10%; органической примеси не
мм,
не
более
10%;
сквозь
частиц,
сито
с
более 1%; минеральной примеси не
более 1%.
Количественное определение.
Количественное определение.
Флавоноиды.
Флавоноиды.
Аналитическую
измельчают
проходящих
до
пробу
сырья
размера
частиц,
сквозь
сито
отверстиями диаметром 1 мм. Около
с
Аналитическую
измельчают
проходящих
до
пробу
сырья
размера
частиц,
сквозь
сито
отверстиями диаметром 1 мм. Около
с
13
1 г (точная навеска) измельченного
1 г (точная навеска) измельченного
сырья помещают в колбу со шлифом
сырья помещают в колбу со шлифом
вместимостью 150 мл, прибавляют
вместимостью 150 мл, прибавляют
30 мл
30 мл
50 %
спирта.
присоединяют
к
холодильнику
и
Колбу
обратному
нагревают
на
50 %
спирта.
присоединяют
к
холодильнику
и
Колбу
обратному
нагревают
на
кипящей водяной бане в течение
кипящей водяной бане в течение
30 мин, периодически встряхивая для
30 мин, периодически встряхивая для
смывания частиц сырья со стенок.
смывания частиц сырья со стенок.
Горячее извлечение фильтруют через
Горячее извлечение фильтруют через
вату в мерную колбу вместимостью
вату в мерную колбу вместимостью
100 мл так, чтобы частицы сырья не
100 мл так, чтобы частицы сырья не
попадали на фильтр. Вату помещают
попадали на фильтр. Вату помещают
в
в
колбу
для
прибавляют
экстрагирования
30 мл
50 %
и
спирта.
колбу
для
прибавляют
экстрагирования
30 мл
50 %
и
спирта.
Экстракцию повторяют еще дважды в
Экстракцию повторяют еще дважды в
описанных выше условиях, фильтруя
описанных выше условиях, фильтруя
извлечение в ту же мерную колбу.
извлечение в ту же мерную колбу.
После охлаждения объем извлечения
После охлаждения объем извлечения
доводят 50 % спиртом до метки и
доводят 50 % спиртом до метки и
перемешивают (раствор А).
перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью
25 мл
помещают
1
мл
раствора
В мерную колбу вместимостью
25 мл помещают 1 мл раствора алю-
алюминия хлорида в 95% спирте и
миния хлорида в 95% спирте и
доводят объем раствора 95% спиртом
доводят объем раствора 95% спиртом
до метки; через 40 мин измеряют
до метки; через 40 мин измеряют
оптическую плотность раствора на
оптическую плотность раствора на
спектрофотометре при длине волны
спектрофотометре при длине волны
415 нм в кювете с толщиной слоя 10
415 нм в кювете с толщиной слоя 10
мм. В качестве раствора сравнения
мм. В качестве раствора сравнения
14
используют следующий раствор: 1 мл
используют следующий раствор: 1 мл
раствора А помещают в мерную
раствора А помещают в мерную
колбу
колбу
вместимостью
25
мл
вместимостью
25
мл
прибавляют 1 каплю разведенной
прибавляют 1 каплю разведенной
уксусной кислоты и доводят объем
уксусной кислоты и доводят объем
раствора 95% спиртом до метки.
раствора 95% спиртом до метки.
Содержание суммы флавоноидов в
Содержание суммы флавоноидов в
пересчётена рутин в процентах (Х)
пересчётена рутин в процентах (Х)
вычисляют по формуле:
вычисляют по формуле:
Х=
где
D  m o  100 100  100
, где
Do  m  100  (100 - W)
D – оптическая
испытуемого
ческая
раствора;
плотность
Х=
D  m o  100 100  100
, где
Do  m  100  (100 - W)
плотность
где
Dо – опти-
испытуемого
раствора
ГСО
ческая
D – оптическая
раствора;
плотность
плотность
Dо – опти-
раствора
ГСО
рутина; m – масса сырья, в граммах;
рутина; m – масса сырья, в граммах;
mо – масса ГСО рутина, в граммах;
mо – масса ГСО рутина, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании
W – потеря в массе при высушивании
сырья, в процентах
сырья, в процентах
Примечание
Приготовление
Примечание
Приготовление
раствора
Государственного
раствора
Государственного
стандартного
образца
стандартного
образца
(ГСО)
(ГСО)
рутина. Около 0,05 г (точная навеска)
рутина. Около 0,05 г (точная навеска)
ГСО
ГСО
рутина,
предварительно
рутина,
предварительно
высушенного при температуре 130-
высушенного при температуре 130-
135 оС в 85 мл 95% спирта в мерной
135 оС в 85 мл 95% спирта в мерной
колбе вместимостью 100 мл при
колбе вместимостью 100 мл при
нагревании
нагревании
на
водяной
бане,
на
водяной
бане,
охлаждают, количественно переносят
охлаждают, количественно переносят
в мерную колбу вместимостью 100
в мерную колбу вместимостью 100
15
мл, доводят объем раствора тем же
мл, доводят объем раствора тем же
спиртом до метки и перемешивают.
спиртом до метки и перемешивают.
Производные гиперфорина.
Аналитическую пробу сырья
измельчают до размера 1 мм. Около 1
г сырья (точная навеска) помещают в
колбу со шлифом вместимостью 250
мл, прибавляют 100 мл гексана.
Колбу присоединяют к обратному
холодильнику
и
нагревают
на
водяной бане при умеренном кипении
гексана в течение 30 мин. Затем колбу
охлаждают
и
фильтруют
через
бумажный фильтр в мерную колбу
вместимостью 100 мл, доводя объем
раствора до метки гексаном.
5 мл полученного извлечения
переносят
в
мерную
колбу
вместимостью 25 мл и доводят объем
раствора
до
Измерение
метки
гексаном.
оптической
плотности
раствора проводят при длине волны
278 нм, используя в качестве раствора
сравнения гексан. Содержание суммы
производных
пересчете
гиперфорина
на
гиперфорин
в
и
абсолютно сухое сырье в процентах
(х) вычисляют по формуле:
16
х 
D  536  0,0006  100  100  100  25
8200  m  5  (100  W )
где D – оптическая плотность испытуемого раствора;
536 – молекулярный вес гиперфорина;
8200 – показатель поглощения 6∙10-4
М раствора гиперфорина при 278 нм;
m – масса сырья в граммах;
W – потеря в массе при высушивании, %;
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
13
2
3
13