Роль Fcγ-рецепторов в реализации биологического действия С

На правах рукописи
ТРУЛЁВ Андрей Сергеевич
Роль Fcγ-рецепторов в реализации биологического действия
С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
14.03.03 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2013
Работа выполнена в Отделе иммунологии и Отделе биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии
медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
доктор биологических наук, профессор
Назаров Пётр Григорьевич
Перевозчиков Андрей Петрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, профессор кафедры гистологии и общей биологии
Чумасов Евгений Иванович
доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский
институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской
академии медицинских наук, заведующий лабораторией общей патологии отдела
общей патологии и патологической физиологии
Кокряков Владимир Николаевич
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт цитологии Российской академии наук
Защита диссертации состоится " 12 " ноября 2013 г. в ______ часов на заседании
Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по
адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.
Автореферат разослан " _______ " _____________________ 2013 года
Учёный секретарь Специализированного Ученого Совета
доктор медицинских наук
2
Дыбан П.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. C-реактивный белок принадлежит к семейству пентраксинов, является белком острой фазы. Отличительная черта С-реактивного белка —
возможность быстрого, многократного увеличения его концентрации в крови при развитии воспаления любой природы и локализации. С-реактивный белок играет важную
роль в защите организма. В системе врожденного иммунитета пентраксины играют
роль растворимых распознающих белков, сходную с ролью иммуноглобулинов: Среактивный белок способен опсонизировать бактерии, а связываясь с компонентами
некротизированных или апоптотических клеток, способствуют их фагоцитозу и тем
самым препятствуют их накоплению в тканях и развитию аутоиммунных реакций (Du
Clos T.W., 1991). При системной красной волчанке имеется недостаточность продукции C-реактивного белка, а у мышей с нокаутом гена пентраксина (SAP) развивается
спонтанный аутоиммунный процесс против компонентов ядер клеток, что указывает
на возможную сдерживающую роль пентраксинов в предотвращении аутоиммунитета
(Du Clos T.W., Mold C., 2011). До сих пор не описан дефицит С-реактивного белка,
связанный с естественной делецией гена или его части. Отсутствие дефицита Среактивного белка и то, что белок филогенетически консервативен по первичной и
третичной структуре и лиганд-связывающей специфичности, указывает на то, что Среактивный белок был необходим для выживания (Назаров П.Г., 2010).
С-реактивный белок обладает не только защитными функциями во врожденном
иммунитете, но и участвует в патогенезе таких распространенных заболеваний человека, как сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и различные фибротические нарушения. На ранних этапах (острой фазе) воспаления С-реактивный белок провляет провоспалительную, на поздних – противовоспалительную активность.
Тучные клетки (ТК) являются мультифункциональными клетками иммунной системы и играют важную роль в защите организма, в частности, в таких процессах как
фиброз, ангиогенез, перестройка тканей и заживление ран, взаимодействия хозяинпаразит (Быков В.Л., 1999). По ряду признаков тучные клетки близки к базофилам
крови, например, они экспрессируют высокоаффинный рецептор к IgE и содержат в
гранулах вазоактивные вещества. Но, в отличие от базофилов и других клеток кровяного происхождения, они являются резидентами соединительной ткани и обычно не
обнаруживаются в кровяном русле, а располагаются, как правило, в соединительной
3
ткани. В ответ на различные стимулы запускается процесс дегрануляции ТК, что способствует запуску процессов воспаления.
Фибробласты (Фб), являются резидентными клетками соединительной ткани.
Они создают микроокружение для ТК, для их созревания и функционирования. ТК
находятся в постоянном контакте с Фб и компонентами межклеточного матрикса. Активация ТК необходима для запуска воспалительных реакций в соединительной ткани.
Под действием медиаторов ТК повышается проницаемость локальных сосудов, что
приводит к увеличению температуры локуса воспаления, покраснению и отёку, что
вместе с болью (которая инициируется, в том числе в результате активности тучных
клеток) и является четырьмя основными признаками воспаления (Krishnaswamy,
2010). При воспалении ТК повышают количество контактов с Фб. ТК продуцируют
большое количество биологически активных веществ, которые играют как про-, так и
противовоспалительную роль. Большинство цитокинов, синтезируемых ТК, оказывает
комплексное воздействие на Фб: влияют на их пролиферативную активность, на экспрессию рецепторов гистамина, серотонина, TNF, а также на выброс фибробластами
хемокинов CCL8, CCL13, CXCL4 и CXCL6 (Müller et al., 2011).
В настоящее время достаточно хорошо изучена провоспалительная активность
ТК на стадии инициации воспаления, и репаративная активность фибробластов на
продуктивной стадии воспаления. В то же время данных о кооперации этих клеток в
острой фазе воспаления, в том числе о роли в этом взаимодействии белков острой фазы крайне мало. Остается спорным и вопрос о клеточном рецепторе, через который
реализуется действие С-реактивного белка на клетки соединительной ткани. Изучению данной проблемы и посвящена наша работа.
Цель работы. Изучить влияние С-реактивного белка на взаимодействие
иммунокомпетентых клеток (тучных клеток, моноцитов) с фибробластами и
эндотелиальными клетками, а также оценить роль Fcγ-рецепторов в реализации
действия С-реактивного белка на клетки.
Решались следующие задачи:
1. Исследовать экспрессию Fcγ-рецепторов на тучных клетках линии НМС-1, моноцитоподобных клетках линий ТНР-1 и U-937, фибробластах, эндотелиальных клетках
EA.hy926, клетках карционмы толстой кишки линии COLO320HSR.
4
2. Определить рецепторы для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1 и эндотелиальных клетках EA.hy926.
3. Изучить способность С-реактивного белка вызывать выход гистамина из тучных
клеток линии HMC-1.
4. Определить влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток и моноцитов
к клеткам эндотелия и фибробластам.
5. Изучить роль Fcγ-рецепторов в активации NF-κB-сигнального пути при действии
С-реактивного белка на клетки.
Научная новизна работы. Показано, что рецепторами для С-реактивного белка
на тучных клетках НМС-1, а также на эндотелиальных клетках EA.hy926, служат рецепторы иммуноглобулина класса IgG. Основной рецептор для CRP — низкоаффинный FcγRII. Кроме того, впервые показано, что, действуя на Fcγ-рецепторы тучных
клеток, С-реактивный белок вызывает изменение их адгезивных свойств. Впервые показано, что пентраксины С-реактивный белок и сывороточный Р-компонент амилоида
способствуют прикреплению тучных клеток и моноцитов к матриксу соединительной
ткани. Установлено, что высокоаффинный рецептор FcγRI также является рецептором
для CRP на тучных клетках. Но в отличие от FcγRII, конститутивно экспрессированного на их поверхности, экспрессия FcγRI требует индукции и может быть индуцирована IFNγ. Воздействие С-реактивного белка на тучные клетки через FcγRI приводит к
активации тучных клеток и выбросу гистамина.
Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Исследование направлено на изучение неаллергических механизмов активации тучных клеток
человека, в частности, на оценку роли Fcγ-рецепторов во влиянии белка острой фазы
воспаления — CRP. Получены новые данные о значении Fcγ-рецепторов в активации
тучных клеток. Расшифрованы механизмы вовлечения CRP в патофизиологические
процессы. В частности, показано, что влияние С-реактивного белка на тучные клетки
вызывает их активацию, проявляющуюся выбросом медиаторов и усилением контактов с окружающей тканью – с фибробластами и белками межклеточного матрикса. Это
углубляет теоретические знания о тучных клетках, их роли в процессах иммунорегуляции. Результаты работы способствуют углублению представлений о механизмах
участия тучных клеток в патофизиологических процессах, важны для развития представлений об аллергии и воспалительных процессах.
5
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1.
Экспрессия Fcγ-рецепторов необходима для взаимодействия С-реактивного
белка с клетами организма.
2.
При действии С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки усилива-
ется их адгезия к другим клеткам и компонентам межклеточного матрикса.
3.
Для индукции выброса гистамина из тучных клеток человека линии НМС-1
под действием С-реактивного белка необходима экспрессия FcγRI.
Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 23 печатных работ, в
том числе 5 статей, из которых 3 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на
Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (С.-Петербург, 2007, 2009, 2011), 7-й английской школе иммунологов им.
Дж. Хэмфри (Москва, 2007), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии,
иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), 6-й Международной научнопрактической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии
(Москва, 2008), 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Китай, Харбин, 2008), Всероссийской научной конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (С.-Петербург, 2010), заседании Российского
научного общества иммунологов (РНОИ) (С.-Петербург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология – практическому здравоохранению» (Москва, 2012), XI и XII Международных конгрессах «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2012, 2013), I, II и IV Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (С.-Петербург, 2007,
2009, 2013).
Объем и структура диссертации. Объем – 140 стр. текста, включая 5 таблиц и
47 рисунков. Список литературы состоит из 189 наименований.
6
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена с использованием клеток перевиваемых линий и первичных
фибробластов, выделенных из кожи человека.
Тучные клетки (ТК) линии НМС-1, выделенные от больного тучноклеточной
лейкемией, получены от проф. J.H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA). По
многим свойствам клетки этой суспензионной линии соответствует соединительнотканным ТК: экспрессируют kit-рецептор, продуцируют гистамин, гепарин, хондроитинсульфат, триптазу, обладают поверхностными антигенами обычных ТК человека,
за исключением отсутствия на клетках НМС-1 рецепторов к IgE (Butterfield et al., 1988;
Li et al., 1995). Их культивировали в среде Iscove с необходимыми добавками.
Фибробласты (Фб) кожи человека культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % ЭТС, L-глутамина и гентамицина. Линия клеток THP-1, выделенная от
пациента с промоноцитарной лейкемией, получена от проф. M. De Ley (Университет г.
Левена, Бельгия). Клетки экспрессируют β2-интегрины (Hmama et al., 1999; Ronald et
al., 2001), рецептор фракталкина (Umehara et al., 2001; Ronald et al., 2001), рецептор
ламинина, Fc-рецепторы, молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса
(Montuori et al., 1999).
Клеточная линия U-937, выделенная от больного гистиоцитарной лимфомой в
период бластного криза, получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).
Экспрессирует маркеры, характерные для моноцитов. Способна дифференцироваться
в макрофаги (Старикова Э.А., 2006).
EA.hy926 — линия клеток эндотелия человека, полученная гибридизацией клеток эндотелия пупочной вены (HUVEC) c клетками карциномы легкого человека А549 (Edjell et al., 1983), предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной
Калифорнии, США). По морфологии, фенотипу и функциям сходна с нормальными
эндотелиальными клетками человека: спонтанно экспрессирует фактор фон Виллебранда, ингибитор активатора плазминогена (PAI-1), тканевой фактор и тромбомодулин. После активации клетки экспрессируют адгезионные молекулы (Е-селектин,
ICAM-1 и VCAM-1) и хемокины IL-8 и МСР-1 (Mutin et al., 1998).
Линия клеток карциномы толстого кишечника человека COLO320HSR получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург): не экспрессирует CD64 и
CD32 (Орлов и др., 2002). Использована для сравнения.
7
Все клеточные культуры инкубировали при 37 С в атмосфере с 5 % СО2 и
100 % влажностью. Отсутствие инфицированности контролировалось. Во всех экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 98 %.
Проточную цитометрию использовали для оценки экпрессии клетками поверхностных молекул (цитофлюориметры Navios или Epics Altra Cell Sorter, BeckmanCoulter) с использованием меченых флюорохромами антител. Для каждого из моноклональных антител использовали изотипические контроли. Окраску поверхностных антигенов антителами производили в соответствии с инструкциями производителя.
Степень активации тучных клеток оценивали по выбросу гистамина методом
Шора (Shore P.A., 1959) после инкубации ТК с тем или иным препартом в течение 30
мин при 37 С. Концентрацию гистамина в надосадочной жидкости определяли по
флюоресценции продукта конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом при
350/460 нм с помощью Fluoroscan Accent FL (ThermoFisher Scientific).
Оценка адгезии клеток друг к другу. Для оценки интенсивности адгезии суспензионных клеток (НМС-1, ТНР-1 и U-937) их предварительно метили флуоресцентным витальным красителем сукциниловым эфиром карбоксифлюоресцеина и добавляли к конфлюэнтному монослою адгезионной культуры (Фб или EA.hy926). После отмывки монослоя число прикрепившихся клеток оценивали по яркости флюоресценции
при помощи спектрофлюориметра Fluoroscan Accent (480/535 нм). Флюоресценция
линейно зависела от числа прикрепившихся клеток. При изучении влияния индукторов на адгезию, стимуляцию клеток индукторами производили в течение суток.
Связывание меченого биотином CRP c ТК линии НМС-1 оценивали проточной цитометрией по флюоресценции, с помощью стрептавидина, меченого аллофикоцианином (APC). В экспериментах по конкуренции одновременно с меченым биотином CRP к клеткам добавляли немеченный CRP или агрегированный IgG человека
(aIgG, полученный нагреванием раствора IgG при 63 °С в течение 10 мин.), или антитела к Fcγ-рецепторам в различных концентрациях.
Трансфекцию клеток НМС-1 и COLO320HSR проводили двумя плазмидами:
1) плазмидой pNF-κBluc, содержащей ген люциферазы (luc) с промотором, содержащим пять цис-сайтов для белков NF-κB; 2) плазмидой pCMVL с геном галактозидазы под промотором цитомегаловируса (CMV) человека. Клетки активи-
8
ровали исследуемыми веществами через сутки после трансфекции, ответ оценивали
по активности люциферазы или -галактозидазы.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Результаты цитометрического учета анализировали при помощи пакетов
программ Kaluza («Beckman Coulter Inc.», США). Различия между независимыми
группами нормально распределённых данных оценивали с помощью парного tкритерия Стьюдента и считали статистически достоверными при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование экспрессии Fcγ-рецепторов клетками исследуемых линий. Результаты показали, что ТК линии НМС-1 экспрессируют Fcγ-рецепторы II типа —
CD32. В меньшей степени на поверхности ТК представлены высокоаффинные Fcγрецепторы I типа — CD64. Низкоаффинные Fcγ-рецепторы III типа (CD16) на ТК линии НМС-1 отсутствуют (рис. 1).
Под действием IFNγ на ТК клетках линии НМС-1 усиливалась экспрессия CD64
с максимумом через 24 ч. На экспрессию низкоаффинных рецепторов клетками НМС1 стимуляция IFNγ не влияла (рис. 2).
а.
б.
в.
СD32 HMC-1
Рис. 1. Экспрессия клетками линии НМС-1 Fcγ-рецепторов II типа (CD32).
а. экспрессия CD16 клетками HMC-1; б. экспрессия CD32 клетками U-937; в.
экспрессия CD64 клетками EA.hy926. Серым цветом обозначен уровень связывания
клеток с антителами изотипического контроля, черным — связывания антител против
Fcγ-рецепторов II типа. По оси абсцисс уровень флюоресценции, в RFU (относительных единицах флуоресценции), по оси ординат — процент от общего числа проанализированных клеток.
В результате наших экспериментов по изучению экспрессии Fcγ-рецепторов
клетками исследуемых линий мы получили следующие данные (табл. 1).
9
Как известно из литературы, интактные ТК человека, полученные культивированием CD34+-клеток, выделенных из крови, несут на себе главным образом CD32, а в
цитоплазме содержат следовые количества мРНК CD64 (FcγRI) и CD16 (FcγRIII). При
стимуляции IFNγ они начинали экспрессировать высокоаффинный Fcγ-рецептор I типа (FcγRI, CD64), хотя экспрессия низкоаффинных рецепторов при этом не усиливалась (Okayama et al., 2000).
а.
б.
в.
Рис. 2. Влияние IFNγ на экспрессию Fcγ-рецепторов клетками НМС-1.
а. Экспрессия FcγRIII (CD16); б. Экспрессия FcγRII (CD32); в. Экспрессия FcγRI
(CD64). Серым цветом обозначено связывание антител против соответствующих Fcγрецепторов с интактными клетками, черным — с клетками, активированными IFNγ.
По оси абсцисс – уровень флюоресценции (RFU), по оси ординат — процент от общего числа проанализированных клеток.
Таблица 1
Экспрессия исследуемыми клеточными линиями Fcγ-рецепторов
Линия клеток FcγRIII(CD16) FcγRII (CD32) FcγRI (CD64)
НМС-1
–
+++
+
ТНР-1
–
++
±
U-937
–
++
±
EA.hy926
–
+
–
Фибробласты
–
–
–
COLO320HSR
–
–*
–*
Примечание. * — Орлов и др., 2002; Issakov et al., 2002.
Нами показано, что интактные ТК линии НМС-1 несут на себе не только CD32,
но и небольшое количество CD64, причем при стимуляции IFNγ экспрессия CD64
также усиливается (табл. 1).
10
Из литературы известно, что ТК кожи и легких человека экспрессируют только
CD32a (активационный) (Zhao et al., 2006), тогда как ингибирующий рецептор CD32b,
возможно, отсутствует на ТК человека, в отличие от базофилов крови. На ТК мышей,
напротив, CD32b экспрессируется, причем воздействие на него лиганда генерирует
ингибиторный сигнал, в результате чего ингибируется ответ ТК и на агрегацию FcεRI
(высокоаффинного рецептора для IgE) (Daeron et al., 1995). В некоторых работах показано, что FcγR II типа (CD32) – единственный Fcγ-рецептор, который экспрессируют
ТК линии НМС-1 (Wedi et al., 1996).
Связывание С-реактивного белка с тучными клетками линии НМС-1.
Наши данные показали, что CRP взаимодействует с ТК. Разрешающая способность
проточной цитометрии при использовании аллофикоцианина в качестве флюоресцирующего агента позволяла регистрировать связывания CRP с клетками, начиная с
концентрации 10 мкг/мл (рис. 3). Результаты опытов по конкуренции за связывание с
ТК HMC-1 биотинилированного и немеченого CRP свидетельствуют о специфичности
связывания CRP (рис. 3а). Одновременная инкубация ТК линии НМС-1 с биотинилированным CRP и aIgG также приводила к зависимому от концентрации aIgG снижению флюоресценции клеток (рис. 3б). Антитела к FcγR также снижали связывание
CRP с клетками НМС-1 (рис. 3в).
а.
б.
в.
Рис. 3. Оценка специфичности связывания CRP с тучными клетками НМС-1.
Ингибиция связывания меченого биотином CRP возрастающими концентрациями немеченного CRP (а) и агрегированного IgG человека (б), а также моноклональными антителами к Fc-рецепторам I (CD64) и II типа (CD32).
По оси абсцисс — концентрация немеченого CRP (а) или аIgG (б), мкг/мл;
наименование антител (в): К – изотипический контроль, CD64 и CD32 – антитела к соответствующим рецепторам. По оси ординат — уровень флюоресценции клеток, RFU
(условные единицы интенсивности флуоресценции).
11
Как показали наши данные, CRP в концентрациях от 0,03 до 30 мкг/мл не влиял
на выход гистамина из клеток НМС-1.
Иная картина наблюдалась при изучении влияния CRP на выброс гистамина из
ТК НМС-1, стимулированных IFNγ. В исследованных концентрациях CRP наблюдалось увеличение выхода гистамина по сравнению с контролем (рис. 4).
Из литературы известно, что стимуляция ТК человека через FcγRII IgG не приводит к дегрануляции и не влияет на ответ ТК на анти-IgE (Wedi et al., 1996; Guo et al.,
1992; Okayama et al., 2001). В то же время, есть данные и о стимулирующем действии
агрегированного IgG и CRP на ТК человека линии HMC-1. Так, в исследовании А.П.
Прониной оба лиганда индуцировали дегрануляцию клеток HMC-1 и выход гистамина, при этом эффект CRP был, хотя и умеренным по интенсивности, но достоверным,
тогда как эффект aIgG – достаточно выраженным (Пронина, 2011). На ТК клетках
мышей также показана дегрануляция при стимуляции FcγRII IgG.
Рис. 4. Влияниие CRP на выход гистамина из тучных клеток НМС-1. Зависимость от IFNγ
Клетки НМС-1 инкубировали 24 ч с 15 нг/мл IFNγ (столбцы серого цвета) или
без IFNγ (белые столбцы), после чего стимулировали CRP в указанных концентрациях.
По оси абсцисс: К – ЗФР (негативный контроль), 48/80 – соединение 48/80 (20 мкг/мл;
позитивный контроль), цифры — концентрация CRP (мкг/мл). По оси ординат — индекс стимуляции (отношение выхода гистамина к негативному контролю). Уровень
спонтанного выхода гистамина, без обработки IFN составлял 0,2200,01, после обработки IFN – 0,1950,02 (p<0,05). Достоверность различий с контролем (К): * —
p<0,05, ** — p<0,01, *** — p<0,001.
12
Т.о., в норме FcγRII является единственным рецептором к иммуноглобулину IgG
на ТК человека, причем стимуляция ТК IgG либо совсем не вызывает дегрануляции,
либо вызывает её в малой степени. В то же время показано, что после стимуляции
IFNγ ТК начинают экспрессировать на своей поверхности FcγRI и приобретают способность отвечать на IgG (Woolhiser et al., 2001).
Наши данные не противоречат этому. Так, интактные клетки НМС-1 не отвечали на добавление в среду CRP достоверным выходом гистамина. Но если ТК были
предварительно активированы IFNγ, это приводило не только к повышению экспрессии высокоаффинных рецепторов FcγRI на их поверхности), но и к выходу гистамина
в ответ на стимуляцию CRP. По данным литературы, концентрация aIgG, при которой
степень дегрануляции ТК максимальна, — 1 мкг/мл (Woolhiser et al., 2004). В наших
экспериментах, наибольший выход гистамина наблюдался при стимуляции CRP в
концентрации 3 мкг/мл, то есть при концентрации CRP того же порядка.
Влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток линии HMC-1 к
фибробластам. Результаты наших исследований показали, что при увеличении продолжительности совместной инкубации тучных клеток и фибробластов (в пределах от
20 до 50 мин) адгезия ТК к Фб возрастала. При совместной инкубации ТК и Фб добавление в среду 50 мкг/мл CRP приводило к дополнительному увеличению интенсивности адгезии. При 30-минутной совместной инкубации клеток в присутствии CRP различие с адгезией контрольных клеток было максимальным (рис. 5).
1,2
К
1
Рис. 5. Адгезия тучных клеток
CRP
линии НМС-1 к фибробластам
0,8
при культивировании смеси
0,4
клеток
RFU
0,6
0,2
*
***
***
*
в
реактивного
присутствии
белка.
С-
Зависи-
мость от времени
0
20 минут
30 минут
40 минут
50 минут
Белые столбики — спонтанная адгезия тучных клеток к Фб. Серые — адгезия в присутствии CRP, 50 мкг/мл. Достоверность различий с контролем: * — p<0,05, *** —
p<0,001.
13
Влияние лигандов Fcγ-рецепторов (С-реактивного белка, агрегированного
IgG) на адгезивность тучных клеток НМС-1. Наши опыты показали (рис. 6), что 24часовая стимуляция тучных клеток CRP приводит к достоверному и дозозависимому
увеличению адгезии тучных клеток к монослою интактных фибробластов. Стимуляция aIgG также приводила к более интенсивной адгезии тучных клеток линии HMC-1
к фибробластам.
Рис. 6. Адгезия активированных
тучных клеток НМС-1 к интактным фибробластам.
По оси абсцисс — активаторы тучных клеток и их концентрация, по оси
ординат — индекс стимуляции. Различия
с контролем достоверны: ** — p<0,01;
*** — p<0,001.
Из литературных данных известно, что для С-реактивного белка характерно
проявление провоспалительной активности [Назаров, 2001], в частности известно, что
он усиливает моноцитарно-эндотелиальную адгезию, увеличивает уровень экспрессии
молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелиальных клетках
[Devaraj et al., 2008]. Кроме того, показано, что агрегация Fcγ-рецепторов на поверхности мышиных тучных клеток приводит к усилению их адгезии к фибронектину
[Dastych et al., 1997].
Влияние С-реактивного белка на адгезивность фибробластов для тучных
клеток линии НМС-1. Несмотря на отсутствие на фибробластах Fc-рецепторов (табл.
1, раздел «Экспрессия Fcγ-рецепторов на фибробластах»), прединкубация монослоя
Фб с различными концентрациями CRP приводила к дозозависимому увеличению степени адгезии к ним интактных ТК линии НМС-1 (рис. 7а).
В отличие от эффекта CRP, после инкубации монослоя Фб с aIgG в концентрациях 10 и 50 мкг/мл достоверного увеличения степени адгезии к ним ТК не происходило (p>0,05) (рис. 7б). Другой пентраксин, сывороточный Р-компонент амилоида
(SAP), который, как известно из литературы, также связывается с FcγR, в концентра-
14
ции 30 мкг/мл, также оказывал стимулирующее действие на Фб и вызывал увеличение
адгезии на 40 % по сравнению с контролем (рис. 7б).
Как показали наши опыты, при стимуляции фибробластов С-реактивным белком
все же происходит некоторое усиление адгезии к ним тучных клеток (рис. 7а) несмотря на отсутствие на фибробластах рецепторов к CRP (то есть Fcγ-рецепторов). Как известно, растущие в культуре фибробласты продуцируют белки матрикса, в том числе
фибронектин и ламинин, с которыми на молекуле CRP имеются сайты связывания
(Salonen et al., 1984). На обратной же стороне молекулы CRP находятся сайты связывания с Fcγ-рецепторами (Marnell et al., 2005).
а.
б.
1,55
1,45
1,35
1,25
1,15
1,05
0,95
0,85
0,75
1,35
1,25
1,15
1,05
0,95
*
***
CRP, 10
мкг/мл
CRP, 50
мкг/мл
0,85
0,75
K
CRP, 5
мкг/мл
***
K
aIgG, 10
мкг/мл
aIgG, 50
мкг/мл
SAP, 30
мкг/мл
Рис. 7. Адгезия тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам, обработанным
CRP, aIgG или сывороточным Р-компонентом амилоида.
По оси ординат — индекс стимуляции. Различия с контролем достоверны:
* — p<0,05, *** —p<0,001.
В связи с этим мы предположили, что в случае прединкубации фибробластов с
CRP этот пентраксин может способствовать их адгезии с ТК не прямо, т.е. не путем
непосредственного связывания с Фб и их активации, а косвенно — связываясь с компонентами межклеточного матрикса (фибронектином и другими белками). Когда же
происходит добавление ТК, то они в свою очередь связываются своими FcγR с CRP,
ассоциированным с матриксом, и таким образом происходит усиление адгезии.
Для проверки данного предположения был произведен следующий эксперимент.
Мы произвели обработку монослоя Фб CRP в концентрации 50 мкг/мл. На следующий
день произвели отмывку Фб для удаления несвязавшегося белка. ТК перед добавлением к фибробластам обработали Fc-фрагментами IgG человека, чтобы «блокировать» на
15
них FcγR. Контролем служили необработанные ТК. После отмывки от несвязавшегося
Fc-фрагментов ТК добавили к Фб.
Адгезия ТК с заблокированными FcγR не отличалась от контроля, то есть от адгезии ТК с интактным Фб, не обработанным CRP, и была достоверно ниже адгезии
ТК, не обработанных Fc-фрагментами (рис. 9). Т.о., было подтверждено предположение, что С-реактивный белок не активизирует фибробласты, а является якорем для
тучных клеток в матриксе соединительной ткани.
20
18
K
Fc
16
14
Рис. 9. Адгезия тучных клеток линии НМС-
12
10
1 к фибробластам, активированным CRP.
8
**
6
##
**
*
4
Роль Fcγ-рецепторов клеток НМС-1
2
0
К
CRP
T NF
Из наших данных видно, что CRP и aIgG, действуя через одни и те же рецепторы — FcγR I и II типов (Crowell et al., 1991; Bharadwaj et al., 1999), вызывают у клеток
однонаправленный ответ (табл. 2). Также стоит отметить, что для CD32 (FcγR II) в
большей степени характерно взаимодействие с IgG в виде иммунных комплексов
(Gessner et al., 1998), нежели с отдельными молекулами IgG. Результаты наших экспериментов также показали стимулирующее влияние aIgG на адгезию клеток. Т.о., можно сделать заключение, что активация FcγRII приводит к запуску сигнального каскада,
результатом которого является активация генов, отвечающих за адгезию клеток друг к
другу или к белкам матрикса соединительной ткани. Подобное действие CRP, в частности, было показано на эндотелиальных клетках, выделенных из аорты (D. Bharadwaj
et al, 1999). Кроме того, авторы показали, что при выключении гена CD32 при помощи
siRNA происходит снижение адгезивных свойств клеток эндотелия относительно интактных клеток, обработанных CRP. Такого же эффекта авторы достигали при добавлении в среду к эндотелиальным клеткам блокирующих антител против CD32.
Для проверки активации NF-B-сигнального пути при действии на ТК CRP, мы
трасфецировали ТК плазмидой, содержащей ген люциферазы под промотором, содержащим сайты связывания с белками NF-κB. Т.о., при активации белков NF-κB в клет
ках начинала накапливаться люцифераза, активность которой можно измерить при
помощи люминометра. Наши данные показали, что ТК НМС-1, трансфецированные
16
Таблица 2
Влияние С-реактивного белка и агрегированного IgG на адгезию клеток исследуемых
линий (степень усиления по сравнению с контролем, %)
Взаимодействующие
Препарат
клетки
Обработаны
Не обрабо-
лигандом
таны
CRP
аIgG
%
n
%
n
 ±m
t
p
FcγR
НМС-1
Фб
54±7
18
58±4
14
4±8
0,5
>0,05
EA.hy926
НМС-1
83±11
87
43±12
66
40±16
2,5
<0,05
EA.hy926
ТНР-1
78±14
66
200±32
50
122±35
3,5
<0,01
U-937
Фб
26±4
30
56±7
30
30±8
3,75
<0,01
Примечание. CRP и aIgG использованы в концентрации 50 мкг/мл. Контроль –
уровень адгезии при использовании соответствующей пары необработанных клеток.
плазмидой pNF-κBluc, реагировали на стимуляцию CRP синтезом люциферазы: люминесценция в клетках, стимулированных CRP, увеличивалась на 40 % по сравнению
с контрольными.
В контрольных опытах клетки COLO320HSR, не экспрессирующие на своей поверхности Fcγ-рецепторы, не реагировали на добавление в среду CRP или aIgG ни при
одной из исследованных концентраций.
ВЫВОДЫ
1. На тучных клетках НМС-1, моноцитоподобных клетках ТНР-1 и U-937, на эндотелиальных клетках EA.hy926 экспрессируются Fc-рецепторы второго типа к IgG
(FcγRII, CD32). Экспрессия высокоаффинных Fc-рецепторов первого типа (FcγRI,
CD64) на тучных клетках усиливается под влиянием IFNγ. На фибробластах и клетках
карциномы толстой кишки COLO320HSR Fcγ-рецепторы не экспрессируются.
2. Низкоаффинные Fc-рецепторы к иммуноглобулину класса IgG (FcγRII) служат рецепторами для C-реактивного белка на эндотелиальных клетках EA.hy926 и на тучных
клетках НМС-1.
3. Интактные тучные клетки линии НМС-1 не отвечают на стимуляцию C-реактивным
белком выходом гистамина. Способность к дегрануляции и выбросу гистамина в ответ
17
на C-реактивный белок требует экспрессии высокоаффинных рецепторов FcγRI и
наблюдается после активации IFNγ.
4. С-реактивный белок и другие лиганды Fcγ-рецепторов – агрегированный IgG и сывороточный Р-компонент амилоида усиливают адгезию клеток дуг к другу: стимулируют адгезию тучных клеток и моноцитов к фибробластам, усиливают адгезивные
свойства эндотелиальных клеток для тучных клеток и моноцитов, повышают адгезивность фибробластов.
5. При действии С-реактивного белка на клетки, несущие FcγRII, происходит активация NF-κB-сигнального пути.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи (в т.ч. опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ):
1. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fc-gamma receptormediated effects on human peripheral blood basophils in vitro / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // C-Reactive Protein: New Research / Ed. S. Nagasawa. – New York: Nova Science Publishers, 2009. – Р.
147–169.
2. Трулёв, А.С. Факторы острой фазы воспаления как модуляторы взаимодействия
тучных клеток и фибробластов / А.С. Трулёв, И.В. Кудрявцев, П.Г. Назаров //
Бюлл. Восточно-Сибирск. Научн. Центра СО РАМН. – 2012. – № 3 (85). – Ч. 2. – С.
319–322.
3. Трулев, А.С. Влияние факторов острой фазы воспаления на взаимодействие тучных
клеток с соединительной тканью. Взаимодействие тучных клеток человека линии
HMC-1 с фибробластами / А.С. Трулев, Н.А. Иванова, П.Г. Назаров // Росс. аллергол. журн. – 2012. – № 1. – Вып. 1. – С. 313–315.
4. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fc receptor-mediated effects on human peripheral blood
basophils / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Basophil Granulocytes / Ed. P.K.
Vellis. – New York: Nova Science Publishers, 2009. – Р. 95–121.
5. Трулев А.С. Базофилы человека: регрануляция и повторная активация в культуре in
vitro / А. С. Трулев, П.Г. Назаров // Астраханск. мед. журн. – 2008. – № 3. – С. 135137.
Тезисы:
6. Трулев, А.С. Индукция программируемой клеточной гибели мономерной формой Среактивного белка / А.А. Бутюгов, А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Rus. J. Immunol. –
2004. – Vol. 9. – N 1. – Р. 290.
7. Трулев, А.С. Пентраксины, пептиды, противовоспалительные средства / П.Г. Назаров, А.А. Бутюгов, А.П. Пронина, А.С. Трулев // Russ. J. Immunol. – 2006. – Vol. 9. –
Suppl. 3. – С. 129.
8. Трулев, А.С. Пентраксины и нейромедиаторы / П.Г. Назаров, Г.И. Нежинская, А.А.
Бутюгов, А.С. Трулев // Мед. иммунол. – 2006. – Т. 8. – № 2-3. – С. 161.
9. Trulioff, A.S. Cholinergic regulation of anaphylaxis. The parasympathetic and autonomous mechanisms / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Abstr. Int. Symp. «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». – 2007. – P. 54-55.
18
10. Трулев, А.С. Активация пентраксинами фактора NF-kB в клетках COLO320HSR,
лишенных Fcγ-рецепторов / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г.
Назаров // Мед. иммунол. – 2007. – Т. 9, № 2-3. – С. 166–167.
11. Трулев, А.С. Fc gammaR-независимая активация фактора NF-kB пентраксином /
А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс. аллергол. журн.
– 2007. – № 3, прилож. 1. – С. 36.
12. Trulioff, A.S. Fc gammaR-independent NF-kB activation by a pentraxin / A.S. Trulioff,
S.V. Orlov, A.P. Perevozchikov, P.G. Nazarov // Abstr. 8th John Humphrey advanced
summer programme in immunology. Immunology and viral infection. Moscow, Sept. 1014, 2007. – P. 58.
13. Трулев, А.С. Активация базофилов крови лигандами Fcγ-рецепторов и ее холинергическая модуляция / А.П. Пронина, П.Г. Назаров, А.С. Трулев // Сибирск. мед.
журн. –2008. – Т. 23. – № 3. – Вып. 1. – С. 108.
14. Trulioff, A.S. Activation of human blood basophils by Fc gamma receptor-specific ligands and its cholinergic modulation / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Asian
J. Pharmacodyn. Pharmacokin. – 2008. – Vol. 8. – № 3. – Р. 184.
15. Трулев, А.С. Роль Fc gamma-рецепторов в реализации биологического действия
пентраксинов на клетки нелимфоидного происхождения / А.С. Трулев, С.В. Орлов,
А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс. аллергол. журн. – 2008. – №1, прил.1. –
С.295-296.
16. Трулев, А.С. Способность базофилов крови человека к повторной дегрануляции и
выбросу гистамина / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Цитокины и воспаление. – 2008. –
Т. 7. – № 3. – С. 67-68.
17. Трулев, А.С. Новые данные о роли Fc-рецепторов в физиологии базофилов человека / П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С.Трулев // Аллергол. иммунол. – 2008. – Т. 9.
– № 4. – С. 486-487.
18. Trulioff, A.S. A role of cholinergic system of blood basophilic leukocytes in regulation
of spontaneous and Fc-gamma-receptor-induced histamine release / P.G. Nazarov, A.P.
Pronina, A.S. Trulioff [et al.] // Abstr. 2nd Int. symp. ”Interaction of the nervous and immune systems in health and disease”, June 16 - 19 2009. St. Petersburg, 2009. – Р. 42-43.
19. Трулев, А.С. Пентраксины в защитных реакциях и процессах иммунорегуляции /
П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С. Трулев, [и др.] // Мед. иммунол. – 2009. – Т. 11,
№ 4. – С. 326-327.
20. Трулев, А.С. Сравнительный анализ влияния С-реактивного белка и агрегированного IgG на адгезивность клеток эндотелия для моноцитов / А.С. Трулев, П.Г.
Назаров // Вестн. Уральск. акад. мед. науки. – 2010. – 2/1 (29). – С. 212.
21. Трулев, А.С. Связывание C-реактивного белка с эндотелиальными клетками EA.hy
926 / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Мед. иммунол. – 2011. – Т. 13. – № 4-5. – С. 337338.
22. Трулёв, А.С. Автономная холинергическая система: пермиссивная роль в регуляции рецепторных функций тучных клеток / П.Г. Назаров, Н.А. Иванова, А.С. Трулёв [и др.] // Росс. аллергол. жур. – 2013. – № 2. – ч. 2. – С. 207-208.
23. Trulioff, A.S. Autonomous cholinergic system of mast cells: a role in the modulation of
cell-cell contacts / P.G. Nazarov, N.A. Ivanova, A.S. Trulioff // «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии»: Тезисы IV Международного симпозиума. Санкт-Петербург, 18 июня – 21 июня 2013 г. – С. 125-126.
19