Протеолитическая и эскулиназная активность

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2011,№2:4752
ИНФЕКТОЛОГИЯ
Протеолитическая и эскулиназная активность иммуноглобулинов при
хирургической инфекции
В.К. Окулич, С.А. Сенькович, А.К. Погоцкий, А.Н. Чередняк
Витебский государственный медицинский университет, г. Витебск, Беларусь
Proteolytic and esculinase activity immunoglobulins in a surgical infection
V. K. Okulich, S.A. Senkovich, A.K. Pogotskij, Cherednyak A.N.
Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Belarus
Аннотация
Summary
Работа посвящена оценке протеолитической и эскулиназ
ной активности иммуноглобулинов класса G у пациентов
с острыми и хроническими гнойновоспалительными за
болеваниями. Обнаружено, что у пациентов с хроничес
ким остеомиелитом, острыми гнойновоспалительными
заболеваниями уровень БАПНАамидазной (трипсинопо
добной) и эскулиназной активности иммуноглобулинов
достоверно выше, чем у пациентов без гнойных процес
сов и здоровых доноров. Обнаружена связь БАПНАами
дазной активности иммуноглобулинов с видом возбуди
теля гнойного процесса, выраженностью воспалительной
реакции, длительностью нахождения пациента в стацио
наре. Показано влияние распространенности гнойного
процесса при остеомиелите на уровень эскулиназной ак
тивности иммуноглобулинов.
The work is devoted to an estimation of proteolytic and
esculinase activity of class G immunoglobulins in patients with
acute and chronic pyoinflammatory diseases. It is revealed,
that in patients who suffer from chronic osteomyelitis, acute
pyoinflammatory diseases the level of BAPNAamidase (similar
on trypsinum) and the esculinase activity of immunoglobulins
is authentically higher, than in patients without purulent
processes and in healthy donors. The association of BAPNA
amidasa activity of immunoglobulins with a kind of the agent
of purulent process, the expression of inflammatory reaction,
and the duration of stay of the patient in a hospital is revealed.
Influence of purulent process prevalence in an osteomyelitis
on the level of esculinase activity of immunoglobulins is
shown.
Ключевые слова
Key words
Каталитическая активность, иммуноглобулин, протеоли
тическая активность, бензоиларгининрнитроанилид,
хирургическая инфекция, эскулиназная активность.
Catalytic activity, immunoglobulin, proteolytic activity,
benzoilargininpnitroanilide, surgical infection, esculinase
activity.
Введение
Несмотря на создание новых методов лече
ния, в том числе антимикробных препаратов,
проблема хирургической инфекции остает
ся актуальной, поскольку при гнойновос
палительных процессах нередко не удается
достичь быстрого эффекта от терапевти
ческих мероприятий. Создание новых мето
дов лечения невозможно без знания меха
низмов взаимодействия микроорганизмов с
иммунной системой макроорганизма. Тем не
менее, некоторые из особенностей патогенеза
инфекционного процесса остаются изучен
ными недостаточно [1].
При воздействии ферментов микроорганиз
мов на иммунную систему возможно образова
ние иммуноглобулинов, обладающих каталити
ческой активностью – абзимов [2, 3]. Ведущим
механизмом в образовании каталитических ан
тител при инфекционном процессе, вероятно,
является идиотипантиидиотипическое взаи
модействие. Иммуноглобулины с собственной
каталитической активностью могут оказывать
собственное, обусловленное ферментными
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°2
47
В.К. Окулич, С.А. Сенькович, А.К. Погоцкий и др.
свойствами, влияние на развитие инфекционно
го процесса. Это воздействие может отличать
ся от действия истинных ферментов изза боль
шей мягкости и длительности воздействия. По
казано, что, несмотря на невысокую удельную
активность абзимов, их суммарная каталити
ческая активность может быть весьма значи
тельной, что позволяет отводить каталитичес
ким иммуноглобулинам значимую роль в пато
генезе различных заболеваний [4, 5].
По нашему мнению, для оценки абзимной
активности иммуноглобулинов при инфекци
онном процессе наиболее подходящей моде
лью является хирургическая инфекция. Это
связано с тем, что возбудители хирургичес
кой инфекции синтезируют значительное ко
личество факторов агрессии и инвазии, что
обеспечивает массивное воздействие экзоген
ных ферментов на иммунную систему макро
организма [1]. Особенно важным при инфек
ционном процессе представляется исследова
ние протеолитической абзимной активности,
поскольку протеолитические ферменты син
тезируются многими микроорганизмами–
возбудителями [6]. Также большой интерес
представляет исследование эскулиназной ак
тивности иммуноглобулинов, которая пред
ставляет собой гидролиз кумаринового гли
козида. Ранее был описан гидролиз кумарино
вых эфиров, индуцированный препаратами
моноклональных иммуноглобулинов [7], но
не производилась оценка такой активности у
препаратов поликлональных иммуноглобули
нов. Между тем, эскулиназная активность
встречается у многих микроорганизмов –
возбудителей гнойновоспалительных про
цессов (K. oxytoca, E. coli, P. vulgaris,
Enterobacter spp.), что позволяет предполагать
возможность образование соответствующих
абзимов при инфекционном процессе.
Для оценки протеолитической активности
иммуноглобулинов в качестве субстрата
нами был выбран бензоиларгининрнитро
анилид (БАПНА), как наиболее доступный и
простой количественный метод оценки трип
синоподобной активности [8]. Кроме того,
ранее мы уже производили оценку БАПНА
амидазной активности у микроорганизмов –
возбудителей хирургической инфекции [9],
что позволяет оценить связь между наличи
ем БАПНАамидазной активности у микро
организмов и иммуноглобулинов.
Таким образом, целью нашего исследова
ния было изучить протеолитическую и эску
48
линазную активности иммуноглобулинов у
лиц с хирургической инфекцией и установить
их возможную связь с клиниколабораторны
ми проявлениями заболевания и этиологи
ческим агентом.
Материалы и методы исследований
Нами были исследованы БАПНАамидазная
и эскулиназная активности поликлональных
препаратов иммуноглобулинов класса G, выде
ленных от пациентов, находившихся на стаци
онарном лечении в хирургических отделениях
Витебской областной клинической больницы
или Витебской городской центральной клини
ческой больницы. Всем больным было проведе
но комплексное клиническое, инструменталь
ное и лабораторное обследование.
Обследованные пациенты были разделены
нами на пять групп. Первую группу состави
ли больные хроническим остеомиелитом
трубчатых костей. Больные с различными ос
трыми хирургическими гнойновоспали
тельными процессами (панариции, абсцес
сы, флегмоны различной локализации и т.
п.) составили вторую группу. В третью
группу были включены пациенты с гнойно
воспалительными заболеваниями челюст
нолицевой области, такими как флегмоны и
остеомиелит челюстей. Контрольные группы
составили пациенты, прооперированные по
поводу хирургической патологии не инфек
ционного генеза без гнойновоспалительных
осложнений и здоровые доноры.
Выделение Ig (иммуноглобулинов) прово
дилось в несколько этапов. Первый этап осаждение сыворотки крови 0,75% раство
ром риванола с последующей обработкой
надосадка активированным углем [10]. Сле
дующий этап аффинная хроматография
полученного материала на агарозе, конъюги
рованной с протеином А золотистого стафи
лококка, селективно сорбирующим на себе
иммуноглобулины G подклассов 1, 2, 4. Далее
полученные препараты иммуноглобулинов
четырехкратно диализировали против физи
ологического раствора.
Проверку чистоты IgG проводили с помо
щью электрофореза в 10% и градиентном от 4
до 20% полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия в восстанавливающих
и невосстанавливающих условиях, а гель окра
шивали нитратом серебра [11]. Контроль сте
рильности материала осуществлялась посевом
проб иммуноглобулинов на кровяной агар.
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°2
Инфектология: Протеолитическая и эскулиназная активность иммуноглобулинов при хирургической инфекции
Определение БАПНА–амидазной (трипси
ноподобной) активности иммуноглобулинов
проводили с использованием микрометода,
разработанного нами [8] на основе класси
ческого метода Эрлангера [12]. В основе
метода лежит изменение оптической плот
ности раствора в связи с образованием нит
роанилина при гидролизе субстрата (БАП
НА) по амидной (аналог пептидной) связи.
Учет результатов реакции производится на
спектрофотометре.
Для определении эскулиназной активнос
ти иммуноглобулинов мы модифицировали
методику определения эскулиназной актив
ности микроорганизмов [13]. В реакционную
смесь брали 0,1 мл иммуноглобулинов в кон
центрации 0,5 мг/мл и 0,1 мл 0,04% раствора
эскулина в 0,066 М фосфатном буфере (рН
7,4) с добавлением цитрата железа до концен
трации 0,066%. После 22 часов инкубации
при температуре 37 0С в плоскодонных план
шетах для ИФА производили учет реакции
при длине волны 450 нм.
Статистическая обработка результатов
проводилась на персональном компьютере,
используя пакеты прикладных программ:
Microsoft Excel 2003, BIOSTAT, Statgraphics
Plus, Version 5.1. В связи с тем, что распределе
ние данных внутри групп не во всех случаях
было нормальным, при оценке достоверности
отличий между группами был использован
критерий МаннаУитни. Для определения
корреляционных связей использовали метод
Пирсона. Также использовали однофактор
ный дисперсионный анализ, множественный
регрессионный анализ [14, 15].
Результаты и их обсуждение
При исследовании БАПНАамидазной ак
тивности IgG оказалось, что максимальный
уровень её был обнаружен в группе пациентов
с острыми гнойновоспалительными заболе
ваниями (медиана – 0,281 пкат; 25 75 про
центили соответственно 0,148 0,453 пкат) и
у пациентов с хроническим остеомиелитом
(0,27 пкат; 0 0,524 пкат). Также высокий, но
более низкий, чем предыдущий, уровень ак
тивности наблюдался в группе пациентов с
гнойновоспалительными заболеваниями че
люстнолицевой области (0,226; 0,149 – 0,361
пкат). При сравнении уровня БАПНАами
дазной активности иммуноглобулинов у па
циентов с хроническим остеомиелитом труб
чатых костей и остеомиелитом нижней и вер
хней челюсти у пациентов с остеомиелитом
челюстей последний оказался ниже 0,149
пкат, чем у пациентов с хроническим остео
миелитом трубчатых костей 0,27 пкат, но ста
тистически недостоверно (p>0,05). Уровень
БАПНАамидазной активности иммуноглобу
линов во всех группах пациентов с хирургичес
кой инфекцией был достоверно выше, чем в
группе хирургических пациентов без инфекци
онного процесса (0,168; 0,62 – 0,237 пкат) и в
группе здоровых доноров 0,056; 0,006 – 0,105
пкат (см. таблицу 1).
Таблица 1. БАПНАамидазная активность IgG
Группа
n
Медиана
пкат
Процентиль
2575 пкат
Достоверность
отличий
1. Хронический
остеомиелит
2. Острые гнойно
воспалительные
заболевания
3. Гнойно
воспалительные
заболевания
челюстнолицевой
области
4. Пациенты без
гнойных процессов
5. Здоровые доноры
40
0,27
0 0,524
35
0,281
0,148 – 0,453
33
0,226
0,149 – 0,361
P14<0,05
P15<0,01
P24<0,01
P25<0,001
P34<0,05
P35<0,001
20
0,168
0,062 – 0,237
16
0,056
0,006 – 0,105
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°2
49
В.К. Окулич, С.А. Сенькович, А.К. Погоцкий и др.
Нам не удалось выявить значимых связей
между уровнем БАПНАамидазной активности
иммуноглобулинов и видом микроорганизма,
вызвавшего гнойновоспалительный процесс.
Вероятно, это связано с воздействием есте
ственных биоценозов макроорганизма и услов
нопатогенной флоры. Иммунная система мак
роорганизма постоянно контактирует с фер
ментами, синтезируемыми различными микро
организмами. В этой связи у пациентов, пови
димому, отмечается некий базовый уровень аб
зимной активности, выступающий в качестве
своеобразной маскировки абзимной активнос
ти, возникшей под воздействием патогенного
микроорганизма. Возможно, определенное зна
чение играет также тот факт, что в процессе
развития инфекционного процесса, особенно
при хронизации заболевания, различные мик
роорганизмы в гнойном очаге с течением вре
мени сменяются, вследствие чего связь уровня
БАПНАамидазной активности иммуноглобу
линов с видом обнаруженного микроорганиз
мом может отсутствовать, хотя в случае выде
ления первичного возбудителя ее, возможно,
удалось бы установить.
Важно определить, какие же клиниколабо
раторные проявления заболевания и с какой
силой влияют на уровень протеолитической
(БАПНАамидазной) активности иммуногло
булинов. При использовании однофакторного
дисперсионного анализа нами было выявлено
(для всей совокупности пациентов с гнойно
воспалительными процессами) статистически
значимое влияние на уровень БАПНАамидаз
ной активности иммуноглобулинов класса G
следующих факторов: длительности нахожде
ния пациента на стационарном лечении – 18,87
% (n=22, p<0,05), уровня температуры тела
больного – 5,1 % (n=30, p<0,05), абсолютного
количества лимфоцитов – 1,88 % (n=56,
p<0,05).
При исследовании методом однофакторно
го дисперсионного анализа группы пациентов с
острыми гнойновоспалительными процессами
(включая больных с гнойновоспалительными
заболеваниями челюстнолицевой области) на
уровень БАПНАамидазной активности имму
ноглобулинов класса G выявлено влияние следу
ющих факторов: абсолютного уровня лейкоци
тов – 3 % (n=38, p<0,05), абсолютного уровня
лимфоцитов 2,9 % (n=38, p<0,05), абсолютно
го уровня моноцитов – 3,3 % (n=38, p<0,01),
абсолютного уровня эозинофилов – 8,3 %
(n=38, p<0,01).
50
Степень влияния отдельных клиниколабо
раторных проявлений на уровень БАПНАами
дазной активности иммуноглобулинов G оказа
лось довольно низким, что свидетельствует о
формировании трипсиноподобной активности
иммуноглобулинов при совокупном влиянии
многих разнонаправленных факторов.
Для пациентов с хирургической инфекцией
методом [15] пошаговой множественной регрес
сии (способ последовательного уменьшения груп
пы переменных) нами была построена статисти
чески значимая модель (p<0,05) зависимости
БАПНАамидазной активности иммуноглобу
линов от клиниколабораторных факторов:
БАПНА = 20,01 + 0,55*Т + 0,13*Микр –
0,102*Л + 0,007*M – 0,002*Н
Где БАПНА – уровень БАПНАамидазной
активности иммуноглобулина;
Т – температура тела пациента;
Микр – уровень БАПНАамидазной актив
ности микроорганизма, вызвавшего патологи
ческий процесс в балльной шкале: 0 баллов –
активность отсутствует, 1 – низкая (от 0 до 0,5
пкат), 2 – средняя (0,5 – 1 пкат), 3 – высокая (>1
пкат);
Л – абсолютное количество лейкоцитов х 109/л;
M – абсолютное количество моноцитов х 106/л;
Н – абсолютное количество незрелых (палоч
коядерных и юных) форм нейтрофилов х 106/л;
Предложенная модель описывает 60,7 %
дисперсии БАПНАамидазной активности им
муноглобулинов.
При построении модели мы анализировали
следующие клиниколабораторные факторы:
длительность заболевания, длительность стацио
нарного лечения, острота процесса, температура,
уровень лейкоцитов, моноцитов, эозинофилов,
незрелых форм нейтрофилов (все в абсолютных
числах), наличие синдрома системного воспали
тельного ответа, вид и характеристики микроор
ганизма – возбудителя гнойного процесса.
Обращает на себя внимание тот факт, что со
гласно полученной нами модели на уровень БАП
НАамидазной активности иммуноглобулинов
оказывает влияние уровень БАПНАамидазной
активности у микроорганизма – возбудителя
хирургической инфекции, что является свиде
тельством значимой роли микроорганизмов в
формировании абзимной активности.
При исследовании эскулиназной активности
IgG наиболее высокий уровень был выявлен в
группе пациентов с острыми гнойновоспали
тельными процессами – 88; 11 203 ЕОП. Уро
вень активности в этой группе был достоверно
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°2
Инфектология: Протеолитическая и эскулиназная активность иммуноглобулинов при хирургической инфекции
выше, чем в других исследованных группах, за
исключением пациентов с хроническим остео
миелитом (см. таблицу 2). Уровень эскулиназ
ной активности у пациентов с инфекцией челю
стнолицевой области был достоверно выше,
чем у здоровых доноров, причем уровень ак
тивности у пациентов с остеомиелитом челюс
тей (0; 0 – 55 ЕОП, n=6) был достоверно
(р<0,005) ниже, чем у пациентов с флегмонами
челюсти (36,5; 8,5 – 59 ЕОП, n=10). При сравне
нии уровня эскулиназной активности у пациен
тов с остеомиелитом челюсти, последний оказал
ся достоверно ниже (0; 0 – 55 ЕОП), чем у паци
ентов с хроническим остеомиелитом трубча
тых костей (41; 12,562), p<0,05. В связи с тем,
что при остеомиелите трубчатых костей гной
ный процесс выражен значительно больше, чем
при остеомиелите челюстей, полученные данные
указывают на влияние распространенности гной
ного процесса на уровень эскулиназной актив
ности иммуноглобулинов. Между остальными
группами достоверных отличий не выявлено.
Заключение
1. В результате нашего исследования показано
наличие достоверно повышенного уровня
БАПНАамидазной активности иммуногло
булинов у хирургических больных с гнойно
воспалительными процессами в сравнении с
больными без гнойных осложнений. Наи
высший уровень выявлен в группе больных с
острыми гнойновоспалительными заболева
ниями (0,281 пкат; 0,148 и 0,453 пкат, n=35)
и у пациентов с хроническим остеомиели
том (0,27 пкат; 0 и 0,524 пкат, n=40). Также
высокий уровень активности наблюдался
при гнойновоспалительных заболеваниях
челюстнолицевой области (0,226; 0,149 –
0,361 пкат, n=33). Наименьшим уровень ока
зался в группе здоровых доноров (0,056;
0,006 – 0,105 пкат, n=16). Результаты работы
свидетельствуют о повышении протеолити
ческой активности иммуноглобулинов клас
са G у пациентов с острой и хронической хи
рургической инфекцией.
2. Полученные нами данные показывают, что
формирование протеолитической активнос
ти иммуноглобулинов у пациентов с гнойно
воспалительными процессами происходит
под влиянием ряда факторов: длительности
нахождения пациента в стационаре (косвен
ная оценка тяжести и длительности заболе
вания); микроорганизма–возбудителя пато
логического процесса; уровня воспалитель
ной реакции, лабораторными проявления
ми которой стали уровень лейкоцитов и
сдвиг лейкоцитарной формулы влево, темпе
ратурная реакция.
3. У поликлональных препаратов иммуноглобу
линов класса G, полученных от больных с
хирургической инфекцией, показано нали
чие эскулиназной активности, причем у лиц
с острыми гнойновоспалительными процес
сами она была значительно выше, чем у лиц
без инфекционного процесса и у лиц с хро
ническими гнойными процессами. Получе
ны данные, указывающие на влияние рас
пространенности гнойного процесса при ос
теомиелите на уровень эскулиназной актив
ности иммуноглобулинов.
Таблица 2. Эскулиназная активность IgG
Группы
n
Медиана
ЕОП
Процентиль
2575 ЕОП
Достоверность
отличий
1. Хронический
остеомиелит
2. Острые гнойно
воспалительные
заболевания
3. Гнойновоспалительные
заболевания челюстно
лицевой области
4. Пациенты без гнойных
процессов
5. Здоровые доноры
7
41
12,562
20
88
11203
P23<0,05
P24<0,05
P25<0,01
16
13
051
13
37
653
15
0
036
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°2
51
В.К. Окулич, С.А. Сенькович, А.К. Погоцкий и др.
Литература
1. Косинец А.Н., Стручков Ю.В. Инфекция в хирургии:
руководство. Витебск: издво ВГМУ, 2004, 510 с.
класса G. Инструкция на метод МЗ РБ, регистрационный
№60101, 2002.
2. Monroe J.G., Green M.I. Antiidiotypic antibodies and
disease. Immunol. Invest. 1986, Vol. 2: 1517
9. Окулич В.К., Сенькович С.А., Косинец А.Н. Роль фак
тор агрессии и инвазии микроорганизмов в формирова
нии ферментативной активности IgG, выделенных от
больных с хирургической инфекцией. Иммунопатология,
аллергология, инфектология. 2001, № 2: 97103.
3. Азаренок К.С. и др. Иммуноглобулины класса G c
гиалуронидазной активностью и возможные меха
низмы их образования. Иммунология. 1989, N 2: 15–
17
4. Генералов И.И. Абзимная активность иммуноглобули
нов. Витебск: издво ВГМУ, 2000, 152 с.
5. Kalaga R. et all. Unexpected presence of polyreactive catalytic
antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased
levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1995, Vol. 5 (155):
26952702.
6. Хоулт Дж. и др. Определитель бактерий Бердж. Моск
ва: Мир, 1997, 12 т.
7. Pollack S.J., Nakayama G.R., Schultz P. Introduction of
nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining
sites. Science. 1988, Vol. 242: р. 10381040.
8. Окулич В.К., Косинец А.Н., Сенькович С.А., Конопель
ко Е.А. Определение БАПНАамидазной активности мик
роорганизмов, сывороток крови и иммуноглобулинов
10. Фримель Г. и др. Иммунологические методы. Москва:
Мир, 1987, 472 с.
11. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нукле
иновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирова
ние. Москва, 1981: 286 с.
12. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and
properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch.
Biochem. Biophys. 1961, Vol. 95: 271276
13. Ballow A. et. al. Manual of clinical microbiology. Washington,
1991: 1364 p.
14. Григорьев С.Г. и др. Пакет прикладных программ
Statgraphics на персональном компьютере (практическое
пособие). СанктПетербург, 1992: 178 с.
15. Дюк В. Обработка данных на ПК в примерах. Санкт
Петербург: издво «Питер Паблишинг», 1997: 240 с.
Сведения об авторах:
Окулич Виталий Константинович
доцент кафедры клинической микробиологии УО ВГМУ
г. Витебск, ул Короткевича д20 кв 122
Тел. д. 8 (0212) 436068
Тел. МТС +375297103489
vokul@mail.ru
Сенькович Сергей Алексеевич – ассистент кафедры клинической микробиологии УО ВГМУ
Адрес: 210033, г. Витебск, ул. Берестеня 40?8
Тел. д. 8 (0212) 247184
s_senkovich@mail.ru
Погоцкий Алексей Константинович ? старший преподаватель кафедры стоматологии детского возраста и ЧЛХ УО ВГМУ
Адрес: 210032, г. Витебск, пр?т Победы 17?76
тел. д. 8 (0212) 257578
тел. р. 8 (0212) 227195
pogot@mail.ru
Чередняк Алина Николаевна 1988 г. студентка 5 курса лечебного факультета ВГМУ
Поступила 1.04.2011 г.
52
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°2