Электив «Прикладные аспекты современной биотехнологии» для студентов 6-го курса медико-биологического факультета ВолГМУ В плане практических занятий обозначены четыре раздела: 1) Введение в биотехнологию. Биотехнология как наука и сфера производства. Биотехнология и медицина (35ч) 2) Основы генетической инженерии (80 ч) 3) Основы клеточной инженерии. Технология получения и культивирования линий животных и растительных клеток(170 ч) 4) Гибридомная технология получения моноклональных антител. Гибридизация соматических клеток (135 ч) Перечень вопросов для экзаменационных билетов составлен в соответствии с вышеперечисленными разделами. I Вопросы к теоретической части экзамена по разделу «Общая биотехнология» 1. Основные разделы биотехнологии. Предмет, цель и задачи биотехнологии. Разделы биотехнологии. Биотехнология и фундаментальные дисциплины. 2. Основные направления развития современной.биотехнологии. Практическое использование биотехнологических методов и подходов в деятельности человека. 3. Микробиологическая биотехнология. Сельскохозяйственная и экологическая биотехнология. Примеры международного сотрудничества в биотехнологии. 4. Методы традиционной биотехнологии, их классификация. Проблемы стабилизации промышленных штаммов, способы поддержания активности. Международные и национальные коллекции культур микроорганизмов и их значение для развития биотехнологии. 5. Биотехнология и медицина. Биотехнология в понимании основ патологии инфекционных, онкологических и наследственных заболеваний. Применение методов биотехнологии в экспериментальной и клинической медицине. 6. Биотехнологические объекты. Классификация. Критерии выбора биотехнологических объектов для производственных целей. 7. Биотехнологические объекты как средство производства лекарственных, профилактических и диагностических препаратов, гормонов, антибиотиков, витаминов и др. 8. Способы повышения эффективности биотехнологического производства. Селекция и направленное получение организмов-продуцентов целевых продуктов. Внутриклеточная регуляция метаболизма и управление биосинтезом целевых биотехнологических продуктов. 9. Индукция и репрессия синтеза ферментов. Механизмы регуляции действия генов и их использование в биотехнологических процессах. 10.Инженерная энзимология. Использование ферментов и ферментных систем в биотехнологическом производстве. Препаративные и промышленные методы получения ферментных препаратов. 11. Иммобилизованные ферменты и ферментные комплексы. Методы иммобилизации ферментов при производстве лекарственных препаратов, витаминов и других биологически активных веществ. Значение энзимной инженерии для практического здравоохранения. 12. Ферменты и их использование в микроанализе. Перспективы применения аналитической энзимологии в клинической диагностике и научных исследованиях. 13.Биотехнологические системы производства. Принципы и этапы биотехнологического производства веществ-метаболитов. Элементы, составляющие биотехнологический процесс. 14.Структура биотехнологического производства. Схема последовательно реализуемых стадий превращения исходного сырья в биологически активный препарат. 15.Отличия биотехнологических процессов от химического катализа и синтеза. 16.Критерии подбора биореакторов. Устройство, режимы работы биореакторов при реализации конкретных целей. 17.Проблемы при масштабировании биотехнологических процессов. 18.Конечные стадии биотехнологического процесса. Этапы выделения, концентрирования и очистки биотехнологических продуктов. Основные методы. 19.Контроль и управление биотехнологическим процессом. Биотехнология и пробле- мы экологии и охраны окружающей среды. II Вопросы по генетической инженерии 1. Предпосылки возникновения и этапы развития генетической инженерии. 2. Принципиальная схема эксперимента по получению и клонированию рекомбинантных молекул ДНК. 3. Система рестрикции-модификации у бактерий и ее роль в регуляции переноса генетической информации между бактериями. Характеристика рестриктаз и других ферментов, используемых в молекулярном клонировании. 4. Понятие о векторной системе. Требования, предъявляемые к векторным молекулам и штаммам-реципиентам. Векторы автономные и интегративные. Емкость вектора. 5. Понятие о репликоне. Плазмидные векторы. Характеристика основных типов плазмид, используемых в генетической инженерии. 6. Способы введение рекомбинантных ДНК в клетки бактерий: трансформация, мобилизация, трансфекция. 7. Фаг как потенциальный вектор клонирования. Векторы на основе бактериофагафага λ. Стратегия клонирования в фаговых векторах. Упаковка фаговой ДНК in vitro. 8. Космиды. Основные свойства космид. Стратегия клонирования в космидах. 9. Фазмиды. Структурные и функциональные свойства фазмид. Стратегия клонирования в фазмидах. 10.Стратегия создания библиотек генов: выбор вектора клонирования, выбор рестриктазы для фрагментирования геномной ДНК, условия гидролиза геномной ДНК, фракционирование фрагментов ДНК по размерам. 11.Полимеразная цепная реакция – области применения в здравоохранении. Состав реакционной смеси для ПЦР. Этапы постановки ПЦР. 12.Методы отбора и анализа рекомбинантных клонов (анализ фенотипа, инсерционная инактивация, рестрикционный и ибридизационный анализ). 13. Применения трансгенной технологии для получения медицинских препаратов. 14.Генетическая инженерия эукариотов и области применения. Векторы на основе вирусов животных. Понятие о генотерапии. 15.Этические проблемы при работе с рекомбинантными ДНК и при создании трансгенных организмов. 16.Требования к используемой при работе с препаратами ДНК лабораторной посуде, пластмассовым расходным материалам, оборудовании и приборам. 16. Условия хранения и техника манипуляции с препаратами ДНК и ферментов. 17.Характеристика основных типов плазмид, используемых в генетической инженерии и методы выделения плазмидной ДНК. 18.Правила работы с реактивами. Расчет, приготовление и стерилизация растворов, буферных систем. 19.Штаммы микроорганизмов, используемые для клонирования: номенклатура генотипа, хранение, правила работы. 20.Стратегия клонирования в плазмидных, фаговых, космидных и фазмидных векторах. 21.Техника приготовления гелей, нанесения образцов и проведения подводного горизонтального электрофореза. 22.Теоретические основы и техника постановки ПЦР: набор реакционной смеси, амплификация, учет результатов. III IV Вопросы для раздела “Гибридомная технология” 1. История разработки гибридомной технологии получения моноклональных антител заданной специфичности. 2. Классический опыт Келера и Мильштейна по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител (1975 г.). 3. Основные достижения иммунологии и клеточной биологии, предопределившие успешную реализацию идеи Келера и Мильштейна о получении гибридом, продуцирующих моноклональные антитела узкой специфичности. 4. Основные требования к проведению подготовительных этапов при воспроизведении гибридомной технологии. 5. Принципы подбора злокачественного партнера для гибридизации клеточных линий. 6. Методы стимуляции В-лимфоцитов мыши при подготовке к гибридизации клеточных линий. 7. Методы скрининга позитивных гибридом-продуцентов моноклональных иммуноглобулинов. Принципиальная схема НМФА и непрямого варианта ТИФМ. 8. Техника гибридизации клеточных линий при получении гибридом-продуцентов МКА. Методы слияния клеточных партнеров. 9. Методы контроля динамики образования гибридных клонов. 10.Общая схема гибридизации клеток мышиной миеломы и иммунных спленоцитов мыши. 11.Методы направленного отбора гибридных клонов: методы метаболической и биохимической селекции. 12.Условия культивирования гибридных клонов. 13.Методы клонирования. 14.Криоконсервирование гибридом: режимы замораживания, защитные среды. 15.Критерии оценки жизнеспособности и функционального состояния гибридомпродуцентов МКА. 16.Генетический контроль синтеза иммуноглобулинов. 17.Тиражирование культур гибридных клеток, накопление МКА in vitro и in vivo. 18.Свойства МКА, их особенности, преимущества работы с моноклональными иммуноглобулинами. Области применения МКА. 19.Методы очистки МКА, их концентрирования, стерилизации, иммунохимического анализа. 20.Классы, субклассы мышиных иммуноглобулинов. Методы определения изотипов МКА. 21.Производственные клоны-продуценты МКА. Принципиальная схема накопления МКА в препаративных количествах. Методы контроля конечного продукта. 22.Изготовление медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) на основе МКА и преимущества их использования в практической работе. 23.Метод аффинной хроматографии с использованием иммуносорбентов, приготовленных на основе МКА. Принцип каскадной очистки антигенов. 24.Гибридомы человеческого происхождения. Перспективы их применения в медицине. 25.Гетерогибридомы, трудности их получения и перспективы использования. 26.Применение МКА в клинике для диагностики и лечения. 27.МКА к антигенам возбудителей инфекционных заболеваний, их применение для индикации и идентификации микроорганизмов, очистки антигенов, определения их топографического положения в микробной клетке. 28.Непрямой метод флуоресцирующих антител и его применение для скрининга гибридных клонов, продуцирующих МКА. 29.Применение твердофазного иммуноферментного метода для выявления МКА. 30.Методы контроля видовой принадлежности МКА и гомогенности экспериментальных образцов моноклональных иммуноглобулинов.