Особенности морфо–функциональных изменений мышц при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей
реклама
На правах рукописи ТЕПЛЯКОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Особенности морфо–функциональных изменений мышц при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей 14.01.26 – сердечно–сосудистая хирургия 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2011 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ морфологии человека РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Максим Робертович кандидат медицинских наук Черников Валерий Петрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Вирганский Анатолий Олегович доктор медицинских наук, профессор Яцковский Александр Никодимович Ведущая организация: Научный центр сердечно–сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН Защита состоится «10» октября 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.03 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. Автореферат разослан «7 » июля 2011 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор М.Ш. Цициашвили 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы На сегодняшний день проблема хронической артериальной недостаточности нижних конечностей изучена достаточно хорошо, хотя существует много вопросов, нерешенных до сих пор. В частности, мало изучены морфологические изменения мышц нижних конечностей в соответствии с показателями физикальных и инструментальных методов исследования. Необходимость более точного установления уровня ишемии нижних конечностей связана со степенью агрессивности выполняемого лечебного пособия – от консервативного до хирургического (Покровский A.В. 2004). Нередко для более точной диагностики степени расстройств кровообращения в мышцах нижних конечностей и тяжести ишемии используют дополнительные инструментальные методы исследования, делающие возможным существенно уточнить тактику лечения (Затевахин И.И. и соавт. 2002). Однако, наиболее полно судить о процессах, происходящих в тканях ишемизированных нижних конечностей, позволяют активно развивающиеся в последние годы современные методы клеточной биологии и гистологии, способные выявить молекулярные механизмы реакции клеток на гипоксию. С этих позиций наибольший интерес представляют активирующийся в условиях гипоксии HIF (индуцированный гипоксией фактор), а также транскрипционно–связанные с ним VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и проапоптотический белок BNip3 (Ausserer W.A. et al. 1994, Ferrara N. 1999, Bruick R.K. 2000, Semenza G.L. 2004). Исследований, посвященных взаимосвязи морфологических и молекулярных изменений мышц нижних конечностей с клинической симптоматикой и данными инструментальных методов исследования у 4 больных хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей в современной литературе мало, а некоторые из них несут противоречивую информацию, что и обусловило необходимость проведения данной работы. Цель исследования Определить морфологические и молекулярные изменения мышц нижних конечностей при хронической артериальной недостаточности в соответствии с различными степенями хронической ишемии. Согласно цели исследования в работе были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Оценить гемореологические нарушения при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. 2. Проанализировать морфо–функциональные нарушения мышц у пациентов при различных степенях хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. 3. Выявить динамику экспрессии HIF–1α (индуцированный гипоксией фактор), проапоптотического белка BNip3 и концентрацию VEGF–А (фактор роста эндотелия сосудов) у пациентов с различной степенью ишемии. 4. Оценить интенсивность неоангиогенеза и катаболических процессов в мышцах у различных пациентов с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей. 5. Определить уровень перфузии мышц нижних конечностей при различных степенях хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. 5 Научная новизна Впервые на большом клиническом материале проанализированы гемореологические нарушения и их роль в развитии шунтирующего кровотока у больных с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей. Оценены морфо–функциональные нарушения мышц при различных степенях хронической ишемии. Определены степени ишемии нижних конечностей, при которых преобладает неоангиогенез, а при которых клеточная гибель. Оценен уровень нарушения перфузии мышц нижних конечностей в покое и при нагрузке в соответствии с различными степенями хронической артериальной недостаточности. Практическая значимость работы Разработаны тактические принципы лечения больных с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей в зависимости от степени ишемии. Доказана необходимость более раннего лечения I степени ишемии и активного лечения IIА степени ишемии до развития выраженных морфо–функциональных изменений мышц нижних конечностей. Показана необходимость интенсивного (эндоваскулярного и хирургического) лечения пациентов с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей до усиления процессов клеточной гибели и депрессии неоангиогенеза, что наблюдается у всех больных с критической ишемией и половины пациентов с IIБ степенью ишемии. Доказана роль перфузионной сцинтиграфии иммуноферментный и иммунологических анализ) методов (иммуногистохимия, исследования мышц нижних конечностей в определении перспективности выполняемых хирургических сосудистых вмешательств. 6 Внедрение Результаты работы внедрены в практику клиники факультетской хирургии Московского медицинского факультета университета, Российского хирургических государственного отделений центральной клинической больницы святителя Алексия митрополита Московского и ГКБ №1 им. Н.И.Пирогова. Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 11 – 12 ноября 2010 г.), на XVI Всероссийском съезде сердечно–сосудистых хирургов (Москва, 28 ноября – 1 декабря 2010г.), на научно–практической конференции «Современные технологии функциональной диагностики и лечения сосудистых заболеваний» (Москва 30 – 31 марта 2011 г.), а также на совместной научно– клинической конференции кафедры факультетской хирургии Московского факультета Российского государственного медицинского университета, Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ морфологии человека РАМН и сотрудников центральной клинической больницы Святителя Алексия митрополита Московского. Публикации По материалам диссертации опубликованы 11 научных работ, из них 4 в центральной медицинской печати, получен 1 патент на изобретение. 7 Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего в себя 26 отечественных и 97 иностранных источников, иллюстрирована 15 таблицами, 7 диаграммами, 18 рисунками и фотографиями. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа основана на данных обследования 175 пациентов, находившихся на лечении в центральной клинической больнице Святителя Алексия митрополита Московского на базе кафедры факультетской хирургии Московского факультета и кардиологическом отделение 1 ГКБ в 2008 – 2009 годах. Основную группу составили 111 больных (94 мужчины и 17 женщин), в возрасте от 49 до 81 лет, страдающих различной степенью хронической артериальной недостаточности нижних конечностей (рис. 1). Рис. 1. Распределение больных основной группы по степени ишемии конечности. 8 В I контрольную группу вошли 32 пациента в возрасте от 46 до 62 лет без клинических и инструментальных (ультразвуковые допплерография и ангиосканирование) признаков хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. Пациенты контрольной I группы были госпитализированы в стационар для планового оперативного лечения по поводу варикозной болезни нижних конечностей, ХВН I – II ст. (2 – 3 ст. по CEAP). Во II контрольную группу вошли 32 пациента в возрасте от 46 до 70 лет, находившихся на лечении в кардиологическом отделении 1 ГКБ без клинических и инструментальных (ультразвуковые допплерография и ангиосканирование) признаков хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. Следует отметить, что II контрольную группу составили только те пациенты, у которых при сцинтиграфии миокарда не было выявлено достоверных признаков нарушений его перфузии. Уровень хронической ишемии нижних конечностей пациентов основной группы находился в пределах I – IVА степеней по классификации Фонтейна – Покровского в модификации В.С. Савельева. У 4 пациентов была выявлена I ст. ХАНК, у 7 больных IIА ст., у 62 пациентов IIБ ст., у 21 пациента IIIА ст., у 10 больных IIIБ ст., и у 7 пациентов IVА ст. При этом пораженным сегментом артериального русла в 35 случаях были аорта и подвздошно–бедренные сосуды, в 21 случае поверхностная бедренная и подколенные артерии. У 55 человек имелось сочетанное поражение как сегментов (рис. 2). аорто–подвздошного, так и бедренно–подколенного 9 Рис. 2. Распределение больных основной группы по локализации атеросклеротического поражения. Пациенты основной и I контрольной группы были обследованы по единой схеме, включавшей: клинические, биохимические, лабораторные, инструментальные и гистологические методы исследований. Пациентам I контрольной группы не выполнялась перфузионная сцинтиграфия скелетных мышц, в то время как пациенты II контрольной группы, обследованные по сокращенной схеме (клинические и инструментальные (ультразвуковые допплерография и ангиосканирование) методы исследования с целью исключения у этой группы больных признаков ХАНК) дополнительно проходили перфузионную сцинтиграфию. Выбор этих больных в качестве II контрольной группы обусловлен тем, что все они нуждались в изотопном исследовании миокарда для уточнения кардиологического диагноза, после чего этим пациентам выполнялась перфузионная сцинтиграфия скелетных мышц, что позволило значительно снизить лучевую нагрузку. Лабораторная диагностика заключалась в определении показателей биохимического и клинического анализов крови, свертывающей и 10 противосвертывающей систем, вязкости, PO2, PCO2, Ph крови, показателей ишемического и свободнорадикального повреждения тканей, определения АЧТВ, коалинового времени, тромбинового времени, уровней ПТИ, МНО, малонового диальдегида, VEGF–А методом ИФА. Забор крови проводился в первый день госпитализации пациентов, осуществлялся из подкожной вены пораженной конечности на уровне нижней трети голени или стопы, что, более достоверно отражало местную концентрацию вышеуказанных показателей. Также осуществлялся забор крови из кубитальной вены верхней конечности по некоторым показателям для оценки их значений в общем кровотоке. Комплекс определение инструментальных лодыжечно–плечевого ультразвуковой допплерографии, методов индекса, диагностики выполнение ультразвуковой включал стандартной функциональной дебитометрии, перфузионной сцинтиграфии. Гистологические исследование проводилось пункционной биопсией икроножной мышцы на уровне нижней трети голени пораженной нижней конечности в 1 день госпитализации пациентов в стационар. Препараты для световой микроскопии готовились по общепринятой методике, окрашивались гематоксилином и эозином. Полученные препараты исследовались на микроскопе Leica DM 2500. Иммуногистохимическое исследование выполняли на депарафинированных срезах толщиной 4–5 мкм, расположенных на предметных стеклах, покрытых поли–L–лизином. Использовали первичные поликлональные антитела к VEGF–A, HIF–1α, BNip3 фирмы «Santa Kruz Biotechnology» и набор реактивов для реализации пероксидазной реакции Universal LSAB2 «DAKO». Полученные препараты исследовались на микроскопе Leica DM 2500. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров оценивался полуколичественным способом: 0 – отсутствие реакции, 1 – небольшое, 2 – умеренное, 3 – большое количество маркер– 11 позитивных клеток. Количество оцениваемых клеток в каждом наблюдении варьировало в связи с разными размерами кусочков. Специфическое выявление эндотелиальных клеток осуществлялось первичными поликлональными антителами к CD31 фирмы «Santa Kruz Biotechnology» и набором реактивов для реализации пероксидазной реакции Universal LSAB2 «DAKO». 87 пациентам основной группы были выполнены операции с использованием синтетических протезов Gor–Tex (USA). 24 пациента получали консервативную терапию. Среди больных основной группы 16 пациентов перенесли аорто– бифеморальное шунтирование или протезирование, 21 больному было выполнено линейное одностороннее аорто–бедренное шунтирование, 18 пациентов перенесли сочетанное аорто–бедренное и бедренно–подколенное шунтирование, 29 пациентам было выполнено бедренно–подколенное шунтирование. 3 пациентам было произведено одностороннее аорто– глубокобедренное шунтирование. Все пациенты в послеоперационном периоде получали стандартную терапию, направленную на улучшение реологических свойств крови, противовоспалительное и антибактериальное лечение. Неоперированные получали больные общепринятую в качестве терапию, консервативного направленную на лечения улучшение реологических свойств крови. Статистический анализ. При статистической обработке результатов исследования вычислялись среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибка оценивались с среднего помощью t арифметического. Полученные данные – критерия Стьюдента подвергались корреляционному анализу с вычислением коэффициента корреляции (r) Пирсона. Различия считались достоверными при p < 0,05. Анализ данных был проведен с использованием специализированного пакета Statistica 7.0. 12 Результаты и их обсуждение Наше исследование показало, что практически у всех исследуемых больных была выявлена высокая вязкость крови. Максимальное увеличение составило 67%, а среднее – 24%. Причиной вязкостных отклонений в большинстве случаев было сочетание полицитемии и высокой вязкости плазмы, причём у мужчин был более выражен первый фактор, а у женщин второй. По–видимому, полицитемия у мужчин была результатом хронического обструктивного бронхита, пневмосклероза и эмфиземы лёгких, а также курения. Нарушение снижением эластических фильтруемости, в свойств той или эритроцитов, иной проявляющееся степени наблюдалось практически у всех обследованных больных. Отмечалось также и повышение концентрации МДА (малоновый диальдегид) в плазме крови. Во всех случаях высоких концентраций МДА отмечалась низкая способность эритроцитов к деформации. При анализе многочисленных показателей, определяемых нами у больных с хронической артериальной недостаточностью конечностей, мы обнаружили, что у одних пациентов РО2 в подкожной вене ишемизированной нижней конечности (т.е. крови, оттекающей от больной нижней конечности) было выше соответствующего показателя, определяемого нами в подкожной вене верхней конечности (отражающей парциальное напряжение кислорода в системном кровотоке). Эти пациенты составили I клиническую группу с кислородным индексом больше 1,0. У других больных, вошедших во II клиническую группу, парциальное напряжение кислорода в подкожной вене нижней конечности было ниже или равнялось РО2 венозной крови кубитальной вены (кислородный индекс меньше или равен 1,0). 13 При анализе степеней ишемии пациентов обеих групп было установлено, что у больных I клинической группы (47 больных с кислородным индексом больше 1,0) в 8,5 % случаев была выявлена I степень ишемии, 14,9% случаев регистрировалась IIА степень ишемии и в 76,6% случаев была отмечена IIБ степень ишемии. Пациентов с III и IV степенью ишемии среди больных I клинической группы нами обнаружено не было. Напротив, среди пациентов II клинической группы (64 больного с кислородным индексом меньше или равным 1,0) мы не встретили ни одного пациента с I и IIА степенями ишемии. В 40,7% случаев мы выявили IIБ степень ишемии, в 32,8% случаев – IIIА степень, в 15,6% случаев – IIIБ степень и в 10,9% случаев – IVА степень ишемии. Иными словами, среди пациентов II клинической группы в 59,3% случаев наблюдалась критическая ишемия нижней конечности. Причиной выявленной нами разницы в концентрации РО2 в местном и системном кровотоке может быть переход мышцы преимущественно на анаэробный метаболизм, вследствие трансформации части медленных окислительных и быстрых смешанных в гликолитические мышечные волокна на фоне длительно существующей хронической ишемии. Длительно существующая хроническая ишемия приводит и к структурной перестройке капиллярного русла. Существенно снижается количество капилляров, окружающих мышечные волокна и прежде всего за счет уменьшения числа капилляров, приходящихся на одно мышечное волокно (рис. 3, 4). Поэтому, несмотря на гипотрофию мышечного волокна, дистанция от капилляра до наиболее удаленных (центральных) митохондрий становится больше, что также ухудшает утилизацию кислорода. 14 Рис. 3. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента страдающего облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, ХАНК IIA ст. Окраска CD31. Специфическое выявление эндотелиальных клеток. Рис. 4. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента, страдающего облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, ХАНК IIIA ст. Окраска CD31. Специфическое выявление эндотелиальных клеток. Значительное снижение плотности и диаметра капилляров. 15 У больных с кислородным индексом более 1,0, в целом, наблюдался более высокий уровень VEGF–А (сосудистый эндотелиальный фактор роста), составивший, в среднем, 1130,35+112,33 пг/мл. При этом, при I степени хронической артериальной недостаточности он составил 968,45+58,61 пг/мл, при IIА степени – 1774,11+125,10 пг/мл, при IIБ степени – 648,50+35,24 пг/мл (рис. 5). Рис. 5. Показатели VEGF–А у больных с КИ больше 1,0 и пациентов I контрольной группы (норма). Метод иммуноферментного анализа. Обнаруженные нами данные свидетельствуют о том, что у пациентов I группы с кислородным индексом более 1,0 с одной стороны преобладают более низкие степени ишемии (I, IIА, IIБ), а с другой – имеются более высокие цифры VEGF–А. Это можно объяснить следующим. При длительно существующей хронической артериальной недостаточности конечностей уже на начальных стадиях заболевания происходят морфо–функциональные перестройки мышечных волокон с тенденцией уменьшения аэробного и увеличения доли анаэробного энергетического обмена. Это начинает происходить даже при I степени ишемии. При этом при I степени значительно повышается концентрация 16 VEGF–А, стимулирующего неоангиогенез. Максимальный уровень VEGF–А наблюдается при IIА степени ишемии, у пациентов же со IIБ степенью он снижается в 2,7 раза. Подобная динамика сосудистого эндотелиального фактора роста может свидетельствовать о снижении компенсаторных возможностей и потребностей неоангиогенеза при прогрессировании хронической ишемии от IIА к IIБ степени. Иными словами можно сказать, что при I степени ишемии имеются только начальные признаки метаболической перестройки мышц нижних конечностей, приводящие к снижению аэробного обмена и преобладанию анаэробного метаболизма со значительным увеличением интенсивности стимулирования неоангиогенеза. К появлению IIБ степени ишемии подобные компенсаторные механизмы значительно снижаются, увеличивается доля анаэробного обмена и падает концентрация VEGF–А, стимулирующего неоангиогенез. В связи с этим можно заключить, что у подавляющего числа больных со IIБ степенью ишемии, морфо–функциональная перестройка мышечных волокон нижних конечностей становится стойкой (а в ряде случаев, возможно и необратимой) либо требующей для этого значительный временной интервал после восстановления магистрального артериального кровотока. Пациенты со IIА степенью ишемии составляют, по–видимому, переходную группу больных, у которых хоть уже и преобладает анаэробный обмен мышечных волокон, еще сохраняются резервы для быстрого регресса ишемических морфофункциональных изменений на фоне максимальной стимуляции неооангиогенеза. Подобные пациенты, по–видимому, нуждаются в своевременном восстановлении магистрального артериального кровотока до развития стойких ишемических расстройств. Доказательством этого могут служить данные, полученные нами при анализе больных II группы (с кислородным индексом менее или равным 1,0). 17 Как показали результаты нашего исследования, в этой группе на фоне преобладания более тяжелых степеней ишемии – IIБ, IIIA, IIIБ и IVА наблюдались меньшие значения VEGF–А. Так, концентрация ишемизированной нижней VEGF–А в конечности сыворотке составила, венозной в среднем, крови всего 446,09+41,33 пг/мл, что в 2,5 раза меньше, чем соответствующий средний показатель у больных I группы. При этом при IIБ степени ишемии концентрация VEGF–А составила 357,45+27,12 пг/мл, при IIIА степени – 478,67+41,75 пг/мл, при IIIБ степени – 620,17+54,77 пг/мл и при IVА степени – 328,06+20,15 пг/мл (рис. 6). Рис. 6. Показатели VEGF–А у больных с КИ меньше или равным 1,0 и пациентов I контрольной группы (норма). Метод иммуноферментного анализа. Как видно из представленных данных, при IIБ степени ишемии у пациентов I и II групп имеются достоверно разные значения VEGF–А. Если у больных I группы при IIБ степени ишемии уровень VEGF–А составил 648,50+35,24 пг/мл, то соответствующий показатель у пациентов со IIБ степенью ишемии во II группе был в 1,8 раза меньше. Это свидетельствует, по–видимому, о значительном угнетении компенсаторных возможностей 18 стимуляции неоангиогенеза у больных II группы. Лишним доказательством этого могут служить низкие значения VEGF–А у пациентов II группы, имеющих критическую ишемию конечности. Максимальный уровень VEGF– А у этих больных был выявлен при IIIБ степени (при наличии постоянных интенсивных болей покоя) и составил всего 620,17+54,77 пг/мл. Похожие данные были получены нами при анализе динамики экспрессии VEGF–A, выявляемого внутриклеточно методом иммуногистохимии. Важно отметить тот факт, что уровень VEGF–A, определяемый в сыворотке крови ишемизированной нижней конечности, в целом, соответствовал экспрессии VEGF–А, определяемом в мышечной ткани. Дополнительным доказательством прогрессирующих дистрофических морфо–функциональных изменений в мышечных волокнах у больных II группы является экспрессия BNip3, свидетельствующего об инициации у них процессов клеточной гибели. В I группе больных мы наблюдали относительно низкую окраску клеток при выявлении BNip3 (рис. 7). В целом экспрессия этого маркера апоптоза нарастала в соответствии со степенью ишемии: при I степени практически не отличалась от нормы, при IIБ – была максимальной. Данная динамика экспрессии BNip3 свидетельствует о том, что даже при начальных степенях ишемии наблюдается усиление программируемой клеточной гибели. Во II группе больных мы наблюдали выраженную экспрессию BNip3 (рис. 8). Максимальная экспрессия в этой группе пациентов была выявлена у больных с критической ишемией, особенно при IIIБ ст., что указывает на практически полную депрессию других компенсаторных механизмов у данных больных. 19 Рис. 7. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента I группы с ХАНК IIA ст. Специфическое выявление BNip3. Рис. 8. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента II группы с ХАНК IIIБ ст. Специфическое выявление BNip3. 20 У пациентов со IIБ степенью ишемии экспрессия маркера апоптоза во II клинической группе была значительно выше, чем в I клинической группе. Это свидетельствует о том, что больные со IIБ степенью ишемии неоднородны не только по показателям неоангиогенеза (VEGF–A), но и по BNip3, что является дополнительным доказательством необходимости более раннего и интенсивного лечения пациентов II группы с кислородным индексом менее или равным 1,0. При анализе динамики экспрессии HIF–1α у пациентов I группы с кислородным индексом более 1,0 мы обнаружили, что интенсивность окраски маркер–позитивных клеток нарастала в зависимости от степени ишемии. Максимальная экспрессия у больных этой группы была выявлена при IIБ степени хронической артериальной недостаточности (рис. 9), минимальная при I степени. В условиях нарастающей ишемии усиление экспрессии HIF–1α у пациентов I группы, на наш взгляд, в большей степени вызвано необходимостью усиления неоангиогенеза, как основного компенсаторного механизма, что было подтверждено при исследовании уровня VEGF–А. Во II группе больных наибольшая экспрессия HIF–1α наблюдалась при IIIА степени ХАНК (рис. 10) (максимальная экспрессия среди всех пациентов I и II клинических групп), при IIIБ и IVА прогрессивно снижалась. Минимальная экспрессия HIF–1α была выявлена нами при IVА степени хронической артериальной недостаточности, интенсивность которой была даже ниже, чем у пациентов I контрольной группы (норма). Высокая экспрессия HIF–1α у пациентов II группы с кислородным индексом меньшим или равным 1,0 при IIБ и IIIА степенях ХАНК отражает максимальную потребность тканей в кислороде. Однако, низкий уровень VEGF–А в этой группе пациентов свидетельствует о значительном угнетении неоангиогенеза, а высокая экспрессия BNip3 об активизации у них процессов клеточной гибели. Таким образом, в данном случае HIF–1α в большей 21 степени стимулирует не ангиогенез, а апоптоз и, возможно, исходя из последних литературных данных – аутофагию, что говорит об исчерпании других компенсаторных возможностей у этих пациентов. Рис. 9. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента I группы с ХАНК IIA ст. Специфическое выявление HIF–1α. 22 Рис. 10. Иммуногистохимия икроножной мышцы пациента II группы с ХАНК IIIA ст. Специфическое выявление HIF–1α. Таким образом, следует отметить, что уровень HIF–1α отражает не столько степень ишемии конечности, сколько интенсивность стимуляции неоангиогенеза или апоптоза с аутофагией и характеризует потребность тканей к улучшению кровоснабжения, либо необходимости программированной гибели клеток. При I степени ишемии мы не выявили достоверной разницы ни в гемодинамических (Т прихода и Т плато), ни в метаболических (удельная активность) показателях, регистрируемых в мышцах голеней при перфузионной сцинтиграфии. Причем это касалось исследования как в покое, так и при стандартной физической нагрузке. Это может быть связано с достаточными компенсаторными нагрузке на фоне I стадии ишемии. резервами мышц при выполняемой 23 При IIA степени ишемии исследуемые параметры в покое также не отличались от контрольной группы, однако при нагрузке было отмечено достоверное увеличение времени выхода кривой на плато на 28% (рис. 11). Рис. 11. Перфузионная сцинтиграфия пациента с ХАНК IIА ст. При IIБ степени ХАНК в большинстве случаев мы также не выявили достоверной разницы ни в гемодинамических (Т прихода и Т плато), ни в метаболическом (удельная активность) показателях, регистрируемых в икроножных мышцах, по сравнению с контрольной группой. При стандартной физической нагрузке было отмечено увеличение Т прихода и Т плато, по сравнению с первым этапом исследования, соответственно, на 29% и 84%, (p<0,05) при снижении удельной активности, в среднем, в 1,5 раза (p<0,05) (рис. 12). Это свидетельствует о наличии у большинства исследуемых нами пациентов со IIA и IIБ степенями ишемии напряжения, клинически проявляющейся феноменом перемежающейся хромоты. Следует, однако, отметить, что у 12 больных со IIБ степенью ХАНК было выявлено достоверное, по сравнению с контрольной группой, ухудшение динамических и статических показателей в состоянии физиологического покоя, не смотря на наличие дистанции «безболевой ходьбы» около 100 метров. 24 Рис. 12. Перфузионная сцинтиграфия пациента с ХАНК IIБ ст. Подобных случаев (наличия достоверных признаков ишемии в покое) среди пациентов со IIА степенью ишемии выявлено не было. При исследовании сцинтиграфических показателей в случаях критической ишемии конечностей были выявлены нарушения перфузии мышц голеней в покое, прогрессирующие соответственно увеличения степени хронической ишемии. Максимальные нарушения были обнаружены при IVА степени (рис. 13). Рис. 13. Перфузионная сцинтиграфия пациента с ХАНК IIIA ст. 25 Таким образом, наше исследование показало, что при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей происходит постепенная морфо–функциональная перестройка мышц голеней со снижением доли аэробного и увеличении доли анаэробного обмена. При этом начальные изменения начинают выявляться на самых ранних стадиях заболевания – при I степени ишемии и становятся пограничными при IIА степени. У 42% больных со IIБ степенью ишемии и у всех пациентов с критической ишемией нижних конечностей процессы апоптоза начинают преобладать над процессами неоангиогенеза. Выводы 1. Пациенты с хронической артериальной недостаточностью IIБ и III степени имеют достоверные нарушения реологических свойств крови, преимущественно в ишемизированной конечности. Это проявляется повышенной вязкостью плазмы и крови, низкой деформируемостью эритроцитов, способствующих развитию шунтирующего кровотока. 2. По мере прогрессирования заболевания у больных хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей происходит гипотрофия мышечных волокон с редукцией окружающих их капилляров. 3. При хронической артериальной недостаточности нижних конечностей происходит изменение мышечного метаболизма с уменьшением доли аэробного и увеличением доли анаэробного обмена, которые начинаются уже на самых ранних стадиях заболевания (с I степени хронической ишемии), что требует более активной лечебной тактики. 4. Максимальная концентрация VEGF–А (фактор роста эндотелия сосудов) в сыворотке венозной крови нижней конечности наблюдается при легких степенях ишемии (I и IIА), что отражает активность неоангиогенеза и 26 позволяет прогнозировать более благоприятное течение заболевания как в раннем, так и позднем периоде после начатого лечения. 5. Низкий уровень VEGF–А (фактор роста эндотелия сосудов) наблюдается у больных с критической ишемией и у 42 % пациентов с IIБ степенью ишемии, на фоне активации BNip3 (проапоптотический белок), что характеризует усиление у этих пациентов катаболических процессов на фоне депрессии неоангиогенеза. Подобные морфологические изменения у этой группы больных носят стойкий, часто необратимый характер, что может неблагоприятно сказаться как в ближайшем, так и отдаленном послеоперационном периоде. 6. При I и II степенях ишемии нарушения перфузии мышц нижних конечностей возникают лишь при большой физической нагрузке, при IIБ степени – при умеренной, при критической ишемии – в покое. В целом, нарушения перфузии мышц нижних конечностей при их хронической артериальной недостаточности коррелируются с морфо–функциональными изменениями мышц при различных степенях ишемии. Практические рекомендации 1. формой I степень ишемии нижних конечностей, являясь субклинической заболевания, требует активного (медикаментозного, физиотерапевтического и др.) лечения, поскольку у этих пациентов уже имеются признаки смещения метаболизма в сторону анаэробного обмена на фоне активного неоангиогенеза. 2. IIA степень ишемии целесообразно рассматривать в качестве переходной формы заболевания, при которой следует применять более интенсивную тактику лечения, вплоть до эндоваскулярного и хирургического восстановления магистрального кровотока для профилактики развития грубых морфо–функциональных изменений мышц нижних конечностей. 27 3. Пациенты с IIБ степенью ишемии представляют классическую форму заболевания, у 42% из которых уже активизируются процессы клеточной гибели миоцитов, что диктует необходимость более раннего оперативного (эндоваскулярного) лечения. 4. Восстановление артериального кровотока у больных с критической ишемией и у 42 % пациентов с IIБ степенью ишемии не может рассматриваться в качестве окончательного варианта лечения, в связи с наличием тяжелых морфо–функциональных изменений мышц нижних конечностей. Эти больные требуют активного лечения в послеоперационном периоде на протяжении длительного (часто пожизненного) периода времени. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Петухов Е.Б., Кузнецов М.Р., Федин А.И., Комов К.В., Тепляков С.А., Холопова Е.А., Лисенков О.П., Ибрагимов Т.М. Гемореологические проблемы при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2009. – №2. – С.13 – 18. 2. Kuznetsov M.R., Boldin B.V., Turkin P.Y., Vorontsov K.V., Chekhovich Y.V., Kolomiceva T.N., Komov K.V., Teplyakov S.A. Expert system of forecasting of the remote results of surgical treatment of the obliterating atherosclerosis. (материалы доклада). // The eighth international conference high medical technologies in XXI century, October 25 – November 1, 2009, Spain Benidorm p. 47. 3. Кузнецов М.Р., Тепляков С.А. Антитромбоцитарная терапия у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2010. – №1 – С.43 – 47. 4. Кузнецов М.Р., Черников В.П., Тепляков С.А., Габиева М.Г. Клинико–морфологические параллели различных степеней хронической 28 артериальной недостаточности нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2010. – Том.16. – №3. – С.152 – 157. 5. Кузнецов М.Р., Болдин Б.В., Родионов С.В., Тепляков С.А., Косых И.В. Антитромбоцитарная терапия в качестве профилактики поздних тромботических осложнений после реконструктивных сосудистых операций на артериях нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2010. – Том.16. – №4 (приложение). – С.223 – 224. 6. Кузнецов М.Р., Черников В.П., Болдин Б.В., Родионов С.В., Тепляков С.А. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов VEGF в скелетных мышцах при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2010. – Том.16. – №4 (приложение). – С.224 – 225. 7. Каралкин А.В., Кузнецов М.Р., Тепляков С.А. Возможности радионуклидного исследования перфузии мышц нижних конечностей в диагностике хронической артериальной недостаточности. // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2010. – Том.16. – №4. – С.47 – 51. 8. Каралкин Кузнецов М.Р., Болдин Б.В., Черников В.П., Тепляков С.А., А.В. Способ прогнозирования течения раннего послеоперационного периода после операций на артерии или артериях, выполненных по поводу облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. // Патент РФ №2426988 от 27.05.2010г. 9. Тепляков С.А., Яглова Н.В., Черников В.П. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов VEGF в скелетных мышцах при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. // Сборник научных трудов. Материалы VII Всероссийской конференции по патологии клетки. Москва 11 – 12 ноября 2010. – С.251 – 252. 10. Кузнецов М.Р., Черников В.П., Болдин Б.В., Родионов С.В., Тепляков С.А. Фактор роста эндотелия сосудов в икроножных мышцах при хронической артериальной недостаточности. // Бюллетень НЦССХ им. 29 А.Н.Бакулева РАМН. Сердечно–сосудистые заболевания (приложение). Материалы XVI Всероссийского съезда сердечно–сосудистых хирургов. Москва, 28 ноября – 1 декабря 2010. – С.106. 11. Болдин Б.В., Кузнецов М.Р., Родионов С.В., Тепляков С.А., Лисенков О.П., Косых И.В., Остапчук Н.А. Прогнозирование стеноза артериальных анастомозов вмешательств. // «Современные после Материалы технологии реконструктивных научно–практической функциональной диагностики сосудистых конференции и сосудистых заболеваний». Москва, 30 – 31 марта 2011. – С.105 – 106. лечения