Серологические реакции:

Серологические реакции основаны на связывании компонентов реакции
антиген - антитело.
1. Реакция нейтрализации (РН) основана на свойстве иммунной сыворотки
при добавлении к соответствующему вирусу блокировать его способность к
репродукции. В серологической диагностике РН применяется для выявления
наростания титра нейтрализирующих антител к определённому (известному)
вирусу в парных сыворотках крови. Титр иммунной сыворотки – конечное её
разведение, которое ещё обеспечивает оптимальное взаимодействие с антигеном.
Титр зависит от концентрации в иммунной сыворотке антител определённой
специфичности.
Как правило, при постановке РН с целью серологической диагностики берут
постоянную дозу вируса и последовательные (обычно 2-кратные) разведения
исследуемых сывороток крови.
2. Реакция гемагглютинации (РГА).
Гемагглютинация – это феномен
склеивания эритроцитов вследствии
воздействия на них различных микроорганизмов.
Механизм гемагглютинации заключается в склеивании эритроцитов(животных
или человека), на поверхности которых адсорбировались микроорганизмы;
последние являются мостиками, соединяющими соседние эритроциты. Возможно
также, что микроорганизмы, адсорбированные на поверхности эритроцитов,
меняют их заряд, вследствие чего эритроциты приобретают способность
склеиваться, оседая на дно пробирки или лунки планшета тонкой плёнкой в виде
перевёрнутого зонтика (картина полной гемагглютинации).
Отношение разных видов микроорганизмов к агглютинации эритроцитов
животных того или иного вида (или человека) устанавливают эмпирическим
путём. Как правило, микроорганизмы, составляющие одну таксономическую
группу, агглютинируют эритроциты одних и тех же видов животных. Видовая
принадлежность агглютинируемых эритроцитов нередко используется для
индикации микроорганизмов.
3. Реакция торможения гемагглютинации(РТГА).
Гемагглютинация – обратимый процесс. О специфичности микробной
гемагглютинации
судят по эффекту торможения или подавления её
соответствующими антимикробными антителами. Это явление лежит в основе
РТГА. Механизм РТГА заключаеться в том, что противомикробные
антигемагглютинины
препятствуют
микроорганизмам
агглютинировать
эритроциты чувствительных видов животных.
В зависимости от цели постановки РТГА её результатом являеться либо
идентификация изолированного штамма, гемагглютинацию которого подавила
известная сыворотка, либо обнаружение специфических противомикробных
антител в исследуемой сыворотке крови.
4. Реакция связывания комплемента (РСК) - это сложная реакция, которая
протекает в две фазы. Для её постановки необходимы следующие ингредиенты:
1
антиген, антитело, комплемент, эритроциты барана, гемолитическая иммунная
сыворотка.
В РСК принимают участие две системы антиген - антитело: специфическая и
гемолитическая. Специфическая система представляет собой:
а) известный антиген (диагностикум) и сыворотку крови больного или
переболевшего данной инфекцией (содержащую соответствующие этому
антигену антитела);
б) или неизвестный антиген и известную диагностическую иммунную
сыворотку крови реконвалисцента. Если антиген и антитело гомологичны, они
образуют специфический невидимый комплекс, который сорбирует на себе
комплемент.
Адсорбция комплемента на специфическом комплексе может быть выявлена
лишь с помощью гемолитической системы, которая состоит из антигена
(эритроциты барана) и иммунной сыворотки (антисыворотки к нему). Гемолиз
эритроцитов в гемолитической системе наступает лишь в присутствии
свободного комплемента.
В случае образования специфического комплекса он адсорбирует коплемент.
При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов не происходит
(положительный результат). Если антиген и антитело гетерологичны, комплемент
находится в свободном виде, так как отдельно ни антигеном, ни антителом он не
сорбируется. При добавлени гемолитической системы происходит гемолиз
эритроцитов (отрицательный результат).
РСК, как и все серологические реакции, универсальна. Она может быть
использована для выявления вирусных антигенов в заразном материале, а также
для обнаружения антител в сыворотке крови больных и переболевших.
5.Реакция
пассивной
гемагглютинации
(РПГА)
или
непрямой
гемагглютинации (РНГА), широко используется в вирусологической практике
при диагностике кори, респираторно-синцитиальной вирусной инфекции,
заболеваний, вызываемых вирусами группы Коксаки В, клещевого энцефалита,
бешенства, гепатита В, аденовирусами и др.
Суть реакции заключается в том, что эритроциты (чаще всего человека или
барана),
сенсибилизированные антигеном (или антителом) в присутствии
гомологичного антитела (или антигена) склеиваются, т.е. дают феномен
пассивной гемагглютинации.
Так как все антигены (антитела) хорошо сорбируются на эритроцитах,
последние предварительно обрабатывают танином, после чего их способность
сорбировать белки резко увеличивается.
Эритроциты,
сенсибилизированные
антигенами,
называют
эритроцитарными диагностикумами,
эритроциты, сенсибилизированные
антителами, называют антительными диагностикумами.
РПГА обладает более высокой чувствительностью, чем реакции связывания
комплемента и встречного иммуноэлектрофореза.
2
Имунохроматографический анализ (ИХА) – это метод определения наличия
определённых концентраций веществ в биологическом материале (моча, цельная
кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.) и основывается на реакции
между антигеном и соответствующим ему антителом. Данный метод анализа
осуществляется с помощью индикаторных полосок, палочек, панелей или тесткасет, которые обеспечивают скорость проведения тестирования. ИХА –
сравнительно молодой метод анализа, он часто описывается в литературе также
как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick,
экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны со скоростью
проведения этого метода анализа.
Принцип действия иммунохроматографического теста заключаеться в том,
что при опускании теста в физиологическую жидкость, она начинает мигрировать
вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Движущей фазой в
данном случае являеться физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью
двигаются и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует
исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер),
осуществляется его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что
уже является иммунологическим методом анализа. При этом осуществляется
накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизированных в
тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой тёмной полосы.
Несвязанные антитела с красителем мигрируют дальше вдоль полоски и
взаимодействуют с второстепенными антителами в контрольной зоне, где и
проявляется вторая тёмная полоса. Взаимодействие (и тёмная полоса) в
контрольной зоне
выявлятся всегда (если анализ проведен правильно),
независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости.
Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой
отсканированного изображения.
Принцип РИФ основан на определении флюоресцирующих антител.
Адсорбированный антиген соеденяют с иммунной сывороткой, после чего,
образуемый
комплекс
антиген-антитело
обрабатывают
γ-глобулином,
соединённым с флюорисцин - изотиоцианатом. Так как меченые флюорохромом
антитела не теряют способности соединяться с антигеном и тем самым
обуславливают свечение препаратов в сине - фиолетовых лучах, источником
которых является ртутно-кварцевая лампа. Этот метод даёт возможность
поставить диагноз уже через 2-48 часов от начала заболевания. Материалами для
проведения исследования могут быть смывы с носоглотки, кровь, спинномозговая
жидкость и другие биологические жидкости, где может находиться возбудитель.
Реакция латекс агглютинации является одним из видов реакции
агглютинации, в которой в качестве носителя антигена или антитела используют
синтетические полимерные частички-латексы. Эта реакция используется с целью
выявления наличия антител в сыроватке крови обследуемых людей,
идентификации возбудителя заболевания. Растворимые мелкодисперсные
антигены бактериальной клетки белковой или полисахаридной природы
адсорбируют на поверхности монодисперсного латекса. Такие латексные
3
частички с бактериальными антигенами под действием имvунной сыворотки
склеиватся, что приводит к образованию характерного осадка - тонкой плёночки с
неровными краями. Реакцию оценивают визуально («+» по осадку плёнки на дне
лунки).
Иммуноблотинг – качественный метод, который позволяет с высокой
достоверностью определять Аg или Аt в любой биологической среде организма.
Специфичность и чувствительность метода - 99-100 %. Метод иммуноблотинга
похожий на ИФА, однако финальный этап исследования заключается в переносе
и иммобилизации биополимера (Аg или Аt) на пористую мембрану, где
биополимер анализируют с помощью иммуносорбентов. Иммуноблотинг
благодаря
своей
специфичности
относится
к
референс-тестам
(подтверждающим).
Иммуноферментный
анализ
(ИФА)
или,
точнее,
ферментный
иммуносорбентный анализ (англ. enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) —
иммунологический метод для обнаружения определенных антигенов, основанный
на идентификации комплексов антиген-антитело. Широко используется в
лабораторной диагностике.
Существует целый ряд подходов, которые позволяют определить, состоялось
ли связывание антитела с антигеном-мишенью. Один из них — это ферментный
иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используется для диагностики
разнообразных антигенов. Процедура анализа включает такие этапы:
Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с
мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный
препарат обычно используют для получения антител, с помощью которых потом
и выявляют данную мишень. Раньше использовались первые антитела, которые
были по своей природе поликлональными. Разработка и применение
моноклональных
антител
дало
возможность
значительно
улучшить
специфичность иммуноферментного анализа.
Ферментный иммуносорбентный анализ широко применяется для диагностики
разнообразных инфекционных заболеваний, онкопроцессов (в основном
благодаря специфическим белкам и пептидам), определения разнообразных
4
низкомолекулярных соединений, таких как токсины, лекарственные средства и
т.п.
Методы идентификации нуклеиновых кислот.
Существуют два способа молекулярно-генетического анализа – метод
гибридизации и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Методы выявляют ДНК или РНК в любой биологической жидкости. В основе
этих двух методов лежит свойство нуклеиновых кислот к саморепродукции in
vitro. Наиболее широко используется ПЦР (специфичность 99-100 %,
чувствительность 98~99 %).
Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании
определенного участка ДНК с помощью ферментов in vitro (в искусственных
условиях). При этом происходит копирование только того участка, который
удовлетворяет заданные условия, и только в том случае, если он присутствует в
исследуемом образце.
Для проведения самой простой ПЦР нужны такие компоненты:
 ДНК-матрица, то есть фрагмент ДНК, что содержит тот участок, который
нужно амплифицировать.
 Два праймера, комплементарного концам необходимого фрагменту.
 Термостабильная ДНК-полимераза.
 Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
 Буферный раствор.
Вирусологический метод - культивирование вирусов, их индикация и
идентификация. Материалами для вирусологического исследования могут быть
кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека.
Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных
заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства,
эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для
выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторносинцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают
аденовирусы. Из фекалий выделяют энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы.
Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда
лабораторных животных.
Источник получения клеток — ткани, извлечённые у человека при операции,
органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или
злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластного типа и
смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека
или почечных клеток обезьян.
5
Для большинства патогенных вирусов характерно наличие тканевой и типовой
специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках
приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры.
Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное
заражение 3-4 культур клеток, так как только одна из них может оказаться
чувствительной.
Бактериологический посев (культуральное или микробиологическое
исследование) — лабораторное исследование, при котором биоматериал, в
котором предположительно могут находиться патогенные микроорганизмы,
помещают в благоприятную для их размножения среду при определенных
температурных параметрах с последующей оценкой результатов и определения
чувствительности к антибактериальным препаратам. Метод ценен для
определения условно-патогенной микрофлоры, определения чувствительности к
антибиотикам.
Из всех методов диагностики инфекционных заболеваний это самый дорогой и
трудоемкий метод. Однако эти его недостатки с лихвой компенсируются: если
анализ на инфекцию методом посева дает положительный результат, можно не
сомневаться в присутствии этих бактерий в организме.
Материал для исследования можно брать из полости рта, прямой кишки,
половых органов. Правила забора аналогичны забору при ПЦР-диагностике.
Сроки выполнения различны — от нескольких дней до нескольких недель
(зависят от определяемого возбудителя).
Прямая бактериоскопия мазка
Бактериоскопия (от лат. — «скопео» — смотреть) — лабораторный метод
исследования бактерий под микроскопом. Используют светооптическую и
электронную микроскопию. Материал( кровь, костный мозг, ликвор, пунктаты
лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое, желчь, моча, мокрота
и т.д.) после забора центрифугируют, окрашивают и изучают под микроскопом.
Диагностика инфекционных болезней бактериальной, протозойной этиологии и,
реже, вирусных болезней (малярия, лептоспироз, менингококковая инфекция,
лямблиоз, возвратный тиф, амебиаз и др.)
6