СИНТЕЗ И ФАРМАКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН
2014, том 57, №5
БИОХИМИЯ
УДК 548:735:183.3.
Ш.А.Кодиров*, академик АН Республики Таджикистан К.Х.Хайдаров,
академик АН Республики Таджикистан М.М.Якубова*, А.Х.Кадыров, Ё.К.Холов
СИНТЕЗ И ФАРМАКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕПАРАТА
УРСОСЛИТ
Институт химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан,
*
Таджикский национальный университет
В работе приведены результаты синтеза и фармако-биохимическое изучение «Урсослит»-а,
а также показано его отличие от «Урсофальк»-а.
Ключевые слова: синтез 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты – экспериментальные лабораторные животные – пропан-1,2-диоловый эфир 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты («Урсослит») –
газовая хроматография.
Существует несколько подходов целенаправленного синтеза новых лекарственных препаратов, в том числе стероидов, которые позволяют получить ряд ценных противомикробных, гепатопротективных и литолитических препаратов.
В гепатологии широко используется препарат «Урсофальк» ( 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой
кислоты), применяемый в качестве холелитолитического, жёлчегонного, гипохолестеринемического
и гепатопротективного средства [1]. Урсофальк образуется под действием бактериальных ферментов
толстой кишки, является гидрофильным изомером 3α,7α-дигидрокси-5β-холановой кислоты.
Одна из особенностей препарата состоит в том, что он не принимается при острых воспалительных заболеваниях жёлчного пузыря, жёлчных протоков и при циррозе печени в стадии декомпенсации, а также при применении не поступает полностью до места назначения, так как более половины его превращается в соли и различные конюгаты.
Печень является органом, в котором обезвреживаются токсические вещества, она защищает
организм от вредных токсинов, поступающих как извне, так и образующихся в организме в результате собственного обмена веществ. Но и клетки печени нуждаются в защите, в том числе от токсических жирных и жёлчных кислот. Такую защиту могут дать клеткам печени «Урсоcлит» и «Урсофальк».
Целью исследований явилась попытка установления связей между химическим строением и
биологической активностью исследуемого соединения. Это позволило бы осуществлять направленный синтез лекарственных средств, обладающих повышенной избирательностью, эффективностью и
продолжительностью действия.
В этом плане следует отметить, что задачей проводимых исследований является нахождение
путей использования природных желчных кислот с целью получения биологически активных соеди-
Адрес для корреспонденции: Кадыров Абдурахмон Хафизович. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе,
ул. Айни, 299/2, Институт химии АН РТ. E-mail: а-kadirov21@mail.ru
401
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2014, том 57, №5
нений, пригодных для лечения и профилактики жёлчнокаменной болезни, а также для других патологий печени.
В задачу наших исследований также входило получение натриевой соли 3α,7β-дигидрокси-5βхолановой кислоты с целью синтеза веществ, обладающих холелитолитическими, гипохолестеринимическими, гиполипидемическими и гепатопротективными свойствами.
Нейтрализация 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты осуществлена путём взаимодействия
её с метилатом натрия с последующим осаждением соли в насыщенном растворе хлористого натрия
(II). Часть представленного исследования была направлена на поиск и нахождение путей использования природных холановых кислот для выявления взаимосвязи между строением этих соединений и
их биологической активностью.
В связи с этим нами осуществлен синтез пропан-1,2-диолового эфира 3α,7β-дигидрокси-5βхолановой кислоты-(II) путём взаимодействия натриевой соли соответствующей холановой кислоты(II), с α-монохлоргидрином глицерина по схеме:
H 3C
H 3C
COONa
COOH
NaOH
Диоксан
OH
OH
HO
HO
II
I
H 3C
OH OH
COOCH2
CH-OH
ClCH2-CH-CH2
CH3OH
CH2-OH
OH
H3C
HO
III
COOCH2-CH-CH2
O
Na2CO3
OH
H 2O
HO
IV
Эксперимент по выявлению наиболее приемлемых условий проведения данной реакции показал, что её следует проводить в среде абсолютного метанола при 65-700С. Продолжительность реакции 6-8 ч.
Такие условия обеспечивают хороший выход (90-92%) пропан-1,2-диолового эфира 3α,7βдигидрокси-5β-холановой кислоты-(III), и дают продукт с высокой степенью чистоты.
В дальнейшем нами была предпринята попытка провести встречный синтез с целью установления пропан-1,2-диолового эфира 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты-(III). Для решения этой
задачи нами была изучена реакция гидролиза моноглицидного эфира 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой
кислоты-(IV), строение которого было доказано достаточно убедительно [2].
402
Биохимия
Ш.А.Кодиров, К.Х.Хайдаров и др.
ИК-спектры соединения (IV) характеризуются появлением интенсивных полос поглощения в
области, отнесённых к валентным колебания эпоксигрупп (2900-3000см-1).
Полученный различными путями пропан-1,2-диоловый эфир 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой
кислоты-(III) оказался совершенно идентичным по свойствам, ИК-спектральным характеристикам,
при этом смешанная проба плавления депрессии не даёт.
Таким образом, строение соединений (I-IV) было подтверждено методом ПМР и ИКспектроскопии, элементным анализом и встречным химическим синтезом.
ИК-спектры соединения (I-IV) характеризуются появлением интенсивных полос поглощения
в областях, отнесенных к валентным колебаниям гидроксильных групп (3150-3450см-1).
«Урсослит» в соответствии с настоящей работой представляет собой новое, не описанное в
литературе производное «Урсофальк»-а (эфира 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты), относящееся к группе стероидов типа жёлчных кислот, проявляющее лучшее холелитолитическое, жёлчегонное, гепатопротективное, гипохолестеринемическое и гиполипидимическое действие. Эти качества проявляется за счёт сложноэфирной группы.
С целью изучения холелитических и гипохолестеринемических свойств «Урсослит»-а нами
были проведены эксперименты на 20 хомяках обоего пола, с массой тела 55-70 г. Животные были
разделены на следующие группы: 1 – животные интактные, находящиеся на обычном рационе питания в виварии; 2 – нелеченные хомяки, получившие в течение 6-месяцев ХГЛД; 3 – опытные, которым наряду с ХГЛД в течение 6 месяцев ежедневно внутрижелудочно вводили «Урсослит» в дозе 50
мг/кг массы, 4 – животные, которые по той же схеме получили ХГЛД и «Урсофальк» в дозе 50 мг/кг
массы.
Об эффективности изучаемых препаратов судили:
1 - по количеству и проценту оставшихся в живых в течение 6 месяцев хомяков;
2 - по числу и проценту животных с наличием конкрементов;
3 - по изменению содержания основных жёлчных кислот;
4 - по состоянию химизма собранной пузырной жёлчи у опытных и контрольных животных;
5 - по результатам содержания жёлчных кислот, которые установлены методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).
С этой целью после забоя животных методом декапитации, вскрывали брюшную полость, затем после сбора жёлчи производили подсчёт и измерение конкрементов.
Подсчёт песка в составе желчи производился под лупой, а измерение размеров конкрементов
– с помощью миллиметровой бумаги.
В результате проведенных экспериментов было установлено: в жёлчном пузыре у 4 (80%) из 5
хомяков получавших в течение 6 месяцев сухую ХГЛД, а также были обнаружены конкременты разного размера. Их среднее число на 1 животное составляло 5.2±0.12 (Р 0.001) против 0.25±0.04 штук
у интактных животных (табл.1, рис.1,2).
403
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2014, том 57, №5
Таблица 1
Темп развития холетиаза и характер конкрементов жёлчного пузыря у интактных и опытных хомяков,
получивших в течение 6 мес (ХГЛД). (n = 5 хомяков в каждой группе)
1.Интактные (обычная диета)
Число и % животных с
конкрементами в желчном
пузыре
1 (20%)
2. Контроль + ХГЛД
4 (80%)
3.ХГЛД+«Урсослит»50 мг/кг
1 раз в день в течение 6 мес.
1 (20%)
Серия опытов и дозы в мг/кг
массы (число животных)
4. ХГЛД + УДХК 50 мг/кг 1
раз в день в течение 6 мес.
Среднее число конкрементов на 1 животное в т.ч.
камни
всего
песок
2-6 мм
0.25±0.04
0.125±0.2
5.2±0.12
3.5±0.08
2.2 ±0.2
0.0005
0.003
0.025
0.025
1.2  0.3
0.003
1.45  0.01
0.005
3 (60%)
Холелитогенная диета 6 мес.
Контроль
80
70
Урсофальк50мг/кг
60
50
40
30
20
Урсослит-
Интактные
50мг/кг
10
0
Рис.1. Лечебное действие «Урсослит»-а при экспериментальном холелитиазе.
Холелитогенная диета 6 мес.
Среднее число
конкрементов в серии
% Хомяков с конкрементами
90
Контроль
20
15
Урсофальк-50
мг/кг
Урсослит-50
10
5
мг/кг
Интактные
0
1
2
3
4
Рис.2. Эффективность «Урсослит»-а при экспериментальном холелитиазе.
404
-
1.2  0.3
0.01
Биохимия
Ш.А.Кодиров, К.Х.Хайдаров и др.
При исследовании жёлчного пузыря интактных хомяков только в трёх случаях обнаружено
наличие камней размером 2-6 мм, среднее количество которых составляло лишь 0.25 ±0.04 штук.
При дифференцировании конкрементов жёлчного пузыря, собранных у опытных и контрольных животных, в зависимости от цвета их окраски были обнаружены следующие закономерности: все
(100%) конкременты жёлчного пузыря интактных животных имели чёрную окраску (рис.1), в то же
время конкременты жёлчного пузыря хомяков, получавших в течение 6 мес. сухую ХГЛД, в 85%
случаев имели бледно-жёлтую окраску. Конкрементов с коричневой окраской было 9.6%, а с чёрной
окраской – 5.4%.
В группе животных, ежедневно получавших в течение 6 мес наряду с сухой ХГЛД ещё и исследуемый «Урсослит» в дозе 50мг/кг массы, только в жёлчном пузыре одного животного из пяти
был обнаружен один камень размером 2.0 мм. Песок и мелкие камни во всех случаях отсутствовали.
У животных, получавших по той же схеме «Урсофальк» в дозе 50 мг/кг массы, конкременты в
желчном пузыре были обнаружены в трёх из пяти случаев, что составляло 60%.
Таким образом, «Урсослит» в дозе 50мг/кг массы тела в среднем в 3-4 раза активнее предупреждал возникновение холелитиаза у подопытных хомяков, чем «Урсофальк» в той же дозе.
Нахождение достаточно большого количества конкрементов разного размера свидетельствует
о малой степени эффективности «Урсофальк»-а при холелитиазе по сравнению с «Урсослит»-ом.
Наличие песка в жёлчном пузыре леченных этим препаратом хомяков, на наш взгляд, может
служить объективным доказательством гипокинетического действия препарата.
Биохимическими исследованиями было установлено, что у хомяков, находившихся в течение
6 мес на холелитогенной диете, резко нарушается химизм желчи в сторону повышения её литогенности. Статистически достоверно также повышалась в желчи концентрация холестерина и особенно
билирубина (Р 0.001) (табл. 2).
Таблица 2
Химизми желчи у хомяков после 6-месячной холитогенно-гиперлипидемической диеты (ХГДЛ), леченных «Урсослит»-ом и «Урсофальк»-ом (n=5 в каждой группе)
Серия опытов и дозы мг/фкг массы
1.Интактный
2.Контроль ХГЛД
общий холестерин,
ммоль/л
6.9±0.001
9.2±0.02
0.01*
Показатели химизма желчи М±м
р<
общий билисумма
общие фосфорубин,
желчных
липиды, г/л
ммоль/л
кислот, г/л
7.1±0.02
3.5±0.023
3.6±0.03
9.9±0.001
1.0±0.05
1.2±0.01
0.001
0.001
0.001
Холато-холестериновый коэффицент (ХХК)
0.50±0.0005
0.10±0.015
0.001
3.ХГЛД + «УРСОСЛИТ»
4.5±0.073
1.7±0.03
6.5±0.22
3.08±0.039
1.4±0.003
50 мг/кг 1-раз день в тече0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
ние 6 мес.
4.ХГДЛ+УДХК 50 мг/кг
5.4±0.05
4.0±0.018
2.7±0.04
1.4±0.01
0.5±0.02
1раз в день в течение 6-мес.
0.01
0.2
0.2
0.2
0.2
Примечение: * – значения Р для контрольной серии даны по сравнению с интактными, а для леченной серии с
помощью «Урсослит»-а и УДХК и по сравнению с контрольной группой.
405
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2014, том 57, №5
В то же время содержание СЖК уменьшалось в 3 раза (Р0.001), а концентрация фосфолипидов – почти в 3.5 раза (Р0.001). Также у контрольных животных уменьшился в 2.5 раза ХХК (Р
0.01).
«Урсослит» в дозе 50 мг/кг массы тела, вводимый 1 раз в день в течение 6 мес., по всем изучаемым параметрам биохимических показателей предупреждал возникающие в результате приёма
ХГЛД нарушения химизма жёлчи.
Под действием препарата концентрация холестерина в составе желчи в среднем снижалась до
4.4 ±0.07 ммоль/л по сравнению 9.2 ±0.02 ммоль/л у нелеченных животных. Содержание СЖК под
действием «Урсослит»-а в среднем повышалось до 6.5 ±0.028 г/л (у нелеченных животных
3.5 ±0.023).
Концентрация общих фосфолипидов в составе жёлчи у леченных «Урсослит»-ом хомяков
возрастала в 3 раза, а содержание билирубина уменьшалось на 65.6%. ХХК под действием «Урсослит»-а увеличивался.
Урсодезоксихолевая кислота по всем изучаемым показателям действовала намного слабее
«Урсослит»-а. В среднем эти показатели составляли: гипохолестеринемический эффект – на 76.3%;
повышение СЖК – на 67.0%; концентрация фосфолипидов – на 200%; ХХК – на 290%.
Концентрация билирубина в составе желчи у животных, получавших «Урсофальк», оставалась без изменений или же была несколько ниже, чем у нелеченных хомяков.
С целью проведения биохимического исследования по изучению литолитических свойств
«Урсослит»-а, конкрементов, необходимо было уточнить содержание жёлчных кислот в жёлчи методом ГЖХ, так как определение содержания жёлчных кислот в жёлчи даёт точную информацию о характере болезни у животных с различными патологиями печени и желчевыводящих путей [3].
Из проведенных исследований можно сделать следующее заключение:
«Урсослит» проявляет выраженное холелитическое, гипохолестеринемическое, гиполипидемическое и гепатопротективное действие, повышает содержание суммарных жёлчных кислот и фосфолипидов, уменьшает высокую литогенность жёлчи;
«Урсослит» проявляет активное лечебное действие при экспериментальном холелитиазе и по
степени эффективности превосходит активность урсодезоксихолевой кислоты. Это проявляется:
а) в более активном (на 30%) предупреждении образования конкрементов в жёлчном пузыре и
резком уменьшении (в 3-4 раза) среднего количества жёлчных камней и полном отсутствии песка в
жёлчевыводящих путях животных;
б) в восстановлении химизма желчи, проявляющемся в уменьшении содержания холестерина
(на 30%), увеличении суммы жёлчных кислот (на 40-50%), повышении содержания фосфолипидов
(на 105%), снижении уровня билирубина и увеличении холато-холестериного коэффициента в 2.5
раза;
«Урсолит» является истинным холеретическим, литолитическим, гипопротективным средством, а проведенные исследования дают возможность рекомендовать его для лечения и профилактики
жёлчно-каменной и других болезней печени.
Поступило 12.03.2014 г.
406
Биохимия
Ш.А.Кодиров, К.Х.Хайдаров и др.
Л И Т Е РАТ У РА
1. Petron M.L., Jazrazi R.P. et al. Ursodeoxycholic acid alone or with chenodeoxycholic acid for dissolution of cholesterol gallstones: a randomized multicentre trial. – Aliment. Pharmacol. Ther., 2001, v. 15,
pp. 123-128.
2. Самандаров Н.Ю., Кадыров А.Х., Раджабов С.И. Некотороые реакции глицидного эфира 3α, 7α,
12α-тригидроксихолановой кислоты. – Вестник ТНУ, 2012, №1/3 (85), с.208-210.
3. Холов Ё.К., Кадыров А.Х., Хайдаров К.Х. Исследование холелитического действия настойки «Рамит». Мат-лы VI Нумановских чтений, 2009, с. 68-71.
Ш.А.Кодиров*, К.Х.Хайдаров, М.М.Якубова*, А.Х.Кадыров, Ё.К.Холов
СИНТЕЗ ВА ТАДЌИЌОТЊОИ ФАРМОКОЛОГЇ ВА БИОХИМИЯВИИ
«УРСОСЛИТ»
Институти химияи ба номи В.И.Никитина Академияи илмхои Чумхурии Точикистон,
Донишгоњи миллии Тољикистон
Дар маќолаи мазкур усули синтези маводи доругии «Урсослит» ба рох монда шуда,
хосиятњои
холелитолитикї,
гипохолестериникї
ва
гиполипидемикии
он
бо
усулњои
фармокологї ва биохимиявї омўхта шудааст.
Калимањои калидї: синтез туршобаи 3α,7β-дигидрокси-5β-холонат – њайвончањои озмоишї (миримушон) – эфири пропан-1,2-диоли туршобаи 3α,7β-дигидрокси-5β-холонат – хроматографияи
газї.
SH.A.Kodirov*, K.H.Haydarov, M.M.Yakubova*, A.H.Kadirov, U.K.Kholov
SYNTHESIS AND PHARMACO-BIOCHEMICAL STUDIES “URSOSLIT”
V.I.Nikitin Institute of Chemistry, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan,
Tajik National University
In this paper the method of synthesis and a drugs material “Ursoslit”s was presented and investigated
the holylipotic, hypoholeterinic and hypolipiddemic characters of them. The results of the synthesis and
pharmacological biochemistry “Ursoslit” shows its distinctive character form “Ursofalk”s.
Key words: Syntesis of 3α,7β-hidroxy-5β-cholaic acid, the experimental laboratory animals – propane-1,2diol ester 3α,7β-hidroxy-5β-cholaic acid (Ursoslit) – gas chromatography.
407