ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной
реклама
ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» На правах рукописи МОСЯГИН ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ Влияние возраста и физиологического состояния на активность ферментных систем клеток, тканей и органов животных 03.03.01 – физиология 03.01.04 биохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Максимов В.И., доктор биологических наук, профессор Фурман Ю.В. Москва-2011 Содержание Общая характеристика работы………………………………………. Обзор данных литературы…………………………………………….. 1. Физиолого-биохимическое значение ферментных систем клеток тканей и органов ………………………….……………………………… 1.1. Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных 1.2. Механизмы транспорта питательных веществ в кишечнике……….. 1.3. Транспортные АТФазы и их активность…………………………….. 1.3.1. Характеристика Na+, К +-АТФазы……………………………... 1.2.2. Биологическая роль Са2+-АТФазы……………………………... 1.2.3. Значение и биологическая роль HCO3--АТФазы……………... 1.3.4. Особенности функционирования АТФаз птиц……………… 1.3.5. Влияние различных факторов на транспортные процессы и активность АТФаз …………………………………………………… 2. Собственные исследования…………………………………………… 2.1. Материалы и методы………………………………………………... 2.2. Результаты собственных исследований…………………………... 2.2.1. Транспорт веществ и АТФазная активность эритроцитов, тканей и органов птиц…............................................................................ 2.2.2. Активность АТФаз эритроцитов свиней…………….................. 2.2.3. Активность АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота...... Заключение………………………………………………………............... Выводы……………………………………………………………………... Практические предложения…………………………………………….. Список литературы……………………………………………………… Приложение................................................................................................... ….. ….. 4 13 ...... 13 …... …... ….. ….. ….. ….. …... 14 17 20 20 29 32 36 ….. ….. ….. ….. 37 44 44 54 ….. ….. ....... ….. ….. ….. ….. ....... 54 181 188 202 216 218 220 257 2 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АТФ аденозинтрифосфорная кислота АТФаза аденозинтрифосфатаза Д дальтон кДа килодальтон мг миллиграмм мкг микрограмм мкмоль микромоль ммоль миллимоль нм нанометр Фн (Pi) фосфор неорганический ЦТК цикл трикарбоновых кислот F1 фактор Рэкера * - P<0,05 ** - P<0,01 ***- P<0,001 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время все более очевидной становиться важная и многообразная роль ферментных систем среди различных факторов, участвующих в регуляции и интеграции процессов развития и жизненных отправлений организма. На механизмах, основу которых составляют ферментные системы, базируется раскрытие в онтогенезе путей реализации наследственной информации, регуляции роста и развития, гомеостаза (Свечин К.Б, Аршавский И.А., Квасницкий А.В. и соавт., 1967; Никитин В.Н., 1975; Лысов В.Ф., 1977, 1996, 2004; Кузнецов А.И., 1986; Максимов В.И., 1999-2002, 2004, 2005; Максимов В.И. и др., 1999-2010; Рыжкова Г.Ф., 2005; Гудин В.А., 2006; Torronteras S.R.et al., 1993). В частности, характерные периоды более быстрого и замедленного роста и развития органов и организма в целом в определенной степени связаны с активностью ферментных систем. Известно, что активность этих систем зависит от степени воздействия различных факторов внешней и внутренней среды клетки, таких как изменение рН, концентрации субстрата, химическая модификация молекул, наличие специфических активаторов и ингибиторов, изменения проницаемости мембран, скорости деградации молекул фермента, индукции и репрессии биосинтеза белка молекул ферментов и др. (Чернов Н.Н., 1996; Болдырев А.А., 1997). Степень влияния этих факторов во многом определяется экзогенными и эндогенными условиями существования, оказывающими воздействие на организм, к ним относят: возраст, физиологическое состояние (половое и физиологическое созревание, продуктивность и скорость роста), тип кормления, состояние гормонального фона, стресс, нарушения метаболизма и др. Таким образом, активность ферментов, играет ведущую роль в реализации механизмов биохимической адаптации, обеспечивающих существование организма в постоянно изменяющейся внешней (Лысов В.Ф., 1977; Мороз А.М., 1984; Маслова М.Н. и др., 1991; Решетов В.Б., 1998; Хаитов Р.И., 2000; Кар4 молиев Р.Х., 2002, 2005; Мавров И.И. и др., 2002; Силиванова Е.А., 2006; Кыров Д.Н., 2006 и др.; Харитонов Е.Л., 2003, 2007; Максимов В.И., 2002, 2006, 2008; Михайлов В.В., 2008; Swann A.C., 1985 и др.). Одним из основных свойств живой клетки является избирательный транспорт веществ и энергии в клетку из внешней среды, ведущую роль в которых играет активный транспорт, осуществляемый ферментными системами мембран (ионными насосами), интегральными компонентами которых являются АТФазы. АТФ-зависимые ионные насосы, представляющие комплекс ферментов, обеспечивают как первичный транспорт катионов (H+, Na+, K+, Ca2+) и анионов (Cl-, HCO3-) против их электрохимических градиентов, так и вторично-активный перенос через мембрану в клетку сахаров, аминокислот, органических кислот, за счет энергии трансмембранного градиента концентрации ионов Na+. С работой АТФаз так же связана генерация биотоков, трансмембранного потенциала и передача нервного импульса, процессы сопряжения окислительного фосфорилирования. Накоплено большое количество сведений по изучению транспорта ионов и функционированию Mg2+-, Ca2+-, Na+,K+-, H+-АТФаз (Кагава Я., 1985; Болдырев А.А. и др., 1985, 1998; Вишняков С.И., 1989; Skou J.C. et al., 1992; Скулачев В.П., 1989, 2001; Опритов В.А., 1996; Цвилиховский М.И., 1997; Владимиров Ю.А., 1998; Чизмаджеев Ю.А., 2000, Лопина О.Д., 1997, 1999, 2001; Schiener-Bobis G., 2002; Jorgensen P.L. et al.,2003; Рубцов А.М., 2005 и др., Рыжкова Г.Ф., 2005). Показатель активности АТФазных ионных насосов является очень чутким критерием оценки метаболического состояния организма. Для обеспечения процессов активного транспорта питательных веществ необходимы существенные затраты энергии, которые составляют до 40 % от суммарной энергии, поступившего корма. Существенное влияние на активность транспортных АТФаз оказывает обеспеченность животных белком различного качественного состава (Максимюк Н.Н., 1998; Фурман Ю.В., 2001). Среди питательных веществ корма, влияющих на организм животных, ведущая роль принадлежит белку, он обеспечивает жизнедеятельность орга5 низма и способствует его росту. Роль белка особенно значима для организма птицы. В отличие от других животных птица нуждается в постоянном поступлении в организм большого количества полноценного белка. Более интенсивный обмен веществ в расчете на единицу массы тела птицы определяет и ее более высокую продуктивность. Известно, что 80 % протеина в рационах птицы приходится на долю растительных кормов, однако они имеют дефицит по ряду аминокислот и нуждаются в обогащении ими. Недостаток или избыток (имбаланс) аминокислот в рационе сопровождается нарушением обмена веществ, значительными потерями продуктивности, перерасходом кормов, снижением жизнеспособности организма, рентабельности производства в целом (Архипов А.В., 1984, 2007; Лемешева М., 2006). Дальнейший прогресс птицеводства во многом зависит от использования новых ресурсосберегающих технологий, создания новых высокопродуктивных линий и кроссов птицы. Это в свою очередь связано с решением проблемы дефицита кормового протеина и аминокислот за счет расширения их производства и повышения эффективности их использования (Фисинин В., 2006, 2007, Гальперн И.Л., 2009, Ройтер Я., 2010.). Эту проблему в значительной степени можно решить за счет рационального использования отходов кожевенной промышленности. На предприятиях легкой промышленности их накапливается большое количество, они не только не используются, но и являются источником загрязнения окружающей среды. Производство белковых кормовых добавок из этих отходов является перспективным направлением рационального использования вторичных ресурсов (Фурман Ю.В., 2001; Бикташев Р.У., 1985). Анализируя все вышесказанное, следует отметить, вместе с тем, что еще нет сведений об особенностях влияния возраста и физиологического состояния в конкретные фазы постнатального онтогенеза на активность ферментных систем клеток органов и тканей различных видов животных (Плященко С.И. и др., 1983, 1988; Онегов А.П. и др., 1984; Юрков В.М., 1988; Ярилин 6 А.А., 1989; Жаров А.В., 1998; Идрисов Г.З., 1998; Хаитов Р.М., 2000; Кармолиев Р.Х., 2002, 2005; Галактионов В.Г., 2005; Mafayer J.R. et al., 1987). В связи с этим вполне очевидна актуальность исследования активности транспортных АТФазных систем клеток тканей и органов в постнатальном онтогенезе у птиц, свиней и крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (кроссом), возрастом, кормлением и половым и физиологическим созреванием. Цель работы - выявление особенностей становления физиологобиохимических процессов и функций в организме разных видов животных (птиц, свиней и крупного рогатого скота) в постнатальном онтогенезе, связанных с активностью транспортных АТФазных ферментных систем их клеток тканей и органов в зависимости от их физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), половым и физиологическим созреванием, возрастом и кормлением. Для достижения цели, были поставлены следующие задачи: 1. Установление видовых особенностей функционирования АТФазных ферментных систем клеток, тканей и органов птиц, свиней и крупного рогатого скота. 2. Выявление активности ферментных систем (АТФаз) в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров, специфичности влияние ионов электролитов (Mg2+, Na+, K+) и ингибиторов (строфантинК). 3. Исследование особенности функционирования ферментных систем (АТФаз) в ядерной и цитоплазматической мембранах эритроцитов цыплят бройлеров в зависимости от их физиологического состояния обусловленного генетическим потенциалом (кроссом), возрастом и скармливанием пептидной кормовой добавки из отходов кожевенного производства (ПКД) и сукцината натрия. 7 4. Выявление активности транспортных АТФаз в клетках тканей и органов цыплят-бройлеров в зависимости от их физиологического состояния обусловленного их генетическим потенциалом (кроссом), возрастом и скармливанием ПКД. 5. Изучение активности транспортных АТФаз в эритроцитах свиней в зависимости от их физиологического состояния обусловленного половым и физиологическим созреванием, возрастом. 6. Исследование специфичности влияния ионов электролитов (Na+, K+) и ингибиторов (строфантин-G) на активность транспортных АТФаз в эритроцитах свиней. 7. Изучение активности транспортных АТФаз в эритроцитах крупного рогатого скота в зависимости от их физиологического состояния обусловленного половым и физиологическим созреванием, возрастом. 8. Исследование специфичности влияние ионов электролитов (Na+, K+) и ингибиторов (строфантин-G) на активность транспортных АТФаз в эритроцитах крупного рогатого скота. Научная новизна работы. Впервые установлена физиолого- биохимическая видовая особенность активности транспортных АТФазных ферментных систем клеток тканей, органов и субклеточных структур, которая имеет свое своеобразие у птиц, свиней и крупного рогатого скота в зависимости от возраста (фаз постнатального онтогенеза) и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), кормлением, половым и физиологическим созреванием, продуктивностью и скоростью роста. В ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов (т.е. субклеточных структурах) цыплят-бройлеров выявлены АТФазы, активируемые ионами Mg2+-, Na+, K+-, Ca2+- и HCO3-. АТФазы цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров имеющие существенные различия, проявляющиеся во влиянии на них ионов Na+ и K+. Так, ионы Na+,K+ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, 8 ионы Ca2+ - на 87% и HCO3- анион - на 96% с высокой степенью достоверности. Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na+,K+ и Ca2+ (P>0,05) и была детерминирована ионами HCO3- на 96% (P<0,01). У цыплят-бройлеров выявлена АТФазная активность и особенности функционирования в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов Mg2+-, Na+, K+-; Ca2+- и HCO3-- АТФаз в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (кроссом), кормлением. Так, с возрастом активность Mg2+-, Na+, K+-, Ca2+- и HCO3–АТФаз эритроцитов, клеток тканей и органов цыплят-бройлеров достоверно повышается. При этом детерминация активности ферментов возрастом более выражена у кросса «Бройлер-6», а кормовыми добавками у кросса «ISA». У свиней и крупного рогатого выявлена функциональная активность АТФаз эритроцитов в зависимости от возраста и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой у крупного рогатого скота), половым и физиологическим созреванием. Активность АТФаз эритроцитов свиней и крупного рогатого скота с возрастом достоверно понижается. Выявлены породные отличия активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской и черно-пестрой пород. На активность общей АТФазы порода оказывала влияние на 8,6%; активность Mg2+АТФазы (уабаин нечувствительная компонента) не была детерминирована породой; активность Na+,K+-АТФазы (уабаин чувствительной компоненты) была определена породой на 15,7%. Выявлено, что Na+-чувствительную АТФазную компоненту эритроцитов крупного рогатого породные особенности животных детерминируют на 13,2%; на K+-чувствительную компоненту порода оказывает влияние на 4,2%. Установлены, породные отличия активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота определяемые в средах различного ионного состава: у Mg2+-АТФазы - на 9,6%; Na+,K+-АТФазы - на 2,6%, и HCO3--АТФазы - на 3,2%; активность Ca2+-АТФазы не имела достоверных породных отличий. 9 Теоретическая и практическая значимость работы. Выполненные исследования носят фундаментальный характер и содержат новые решения актуальной научной проблемы выяснения становления физиолого- биохимических механизмов функционирования АТФазных ферментных систем субклеточных органоидов, клеток, тканей и органов. Установленные особенности физиолого-биохимических механизмов активного транспорта с участием АТФазных ионных насосов с возрастом, кормлением, физиологическим состоянием (половое и физиологическое созревание, продуктивность и скорость роста), породой (кроссом) необходимы для решения практических задач по созданию оптимальных условий эксплуатации животных, обеспечивающих полное проявление их генетических потенциальных возможностей. Полученные данные открывают перспективу для дальнейших исследований по раскрытию молекулярных механизмов функционирования АТФазных транспортных систем в субклеточных структурах клеток органов и тканей, животных при изменении внешних и внутренних условий существования. Результаты работы предполагают целенаправленный поиск специфических препаратов, способных эффективно регулировать транспортные процессы. Проведенные биохимические исследования вносят несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы регуляции активного транспорта веществ с участием АТФазных ионных насосов. Положения, выносимые на защиту: 1. Физиолого-биохимические механизмы активного транспорта ионов с участием Mg2+-; Na+,K+-; Ca2+- и HCO3-- АТФаз в организме птиц, свиней и крупного рогатого скота имеют возрастные особенности. 2. Существуют особенности функционирование АТФаз ядерных и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров. 3. Кормовые добавки (пептидная и сукцинат натрия) оказывают стимулирующее влияние на активность АТФаз, физиолого-биохимические показатели крови, тканей и органов и продуктивность цыплят-бройлеров. 10 4. Активность АТФазных ферментных систем клеток тканей и органов цыплят-бройлеров имеют кроссовые особенности. 5. Активность АТФазных ферментных систем эритроцитов крупного рогатого скота имеет породные особенности. Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены и одобрены на: Международной научно-производственной конференции по акушерству, гинекологии и биотехнологии репродукции животных (С.-Петербург, 2001); VI международной научнопроизводственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2002); Международной научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Аграрная наука в начале XXI века» (Воронеж, 2002); VII международной научнопроизводственной конференции БГСХА «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2003); XV международной научно-практической конференции, посвященной 300летию С.-Петербурга «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (С.-Петербург, 2003); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества» (Курск, 2007); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Научные исследования, автоматика и динамика машин, инновационные и средозащитные технологии в техносфере» (Курск, 2007); конференциях профессорско-преподавательского состава Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова (Курск, 1995-2005); VIII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2008); Всеукраинской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Украина, Днепропетровск, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008); 74-й научной конференции Курского государственно11 го медицинского университета, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2009); Всеукраинской научнопрактической конференции «Досягнения перспективи експерементальноi i клiнiчноi бiохiмii» (Украина. Тернополь, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Теоретические основы физической культуры» (Казань, ТГГПУ, 2009); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 90-летию ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2009); Международной научно-практической конференции «Адаптация и становление физиологических функций у животных», посвященной 90-летию кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2010); межкафедральном совещании по предварительной экспертизе диссертации в ФГОУ ВПО МГАВМиБ. По материалам диссертации опубликованы 40 работ, в том числе: 3 патента на полезную модель, 15 - в рецензируемых печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ. В публикациях содержится полный объём информации, касающийся темы диссертации. Основные материалы, изложенные в диссертации, получены автором самостоятельно. Выражаю научным консультантам и своим коллегам глубокую благодарность и признательность за оказанную помощь. Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 259 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 186 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования (1 глава), изложения собственных результатов (3 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 342 источника, в том числе 183 отечественных и 159 иностранных и приложений. 12 ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Физиолого-биохимическое значение ферментных систем клеток тканей и органов Изучение ферментов и ферментных систем живой клетки представляет существенный интерес для биологических и физических наук. С одной стороны, ферменты имеют исключительное значение в биологии. Жизнь зависит от сложной совокупности химических реакций, осуществляемых специфическими ферментами, и любое изменение действия ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для живого организма (Диксон М., Уэбб Э., 1982). Существует большое количество факторов, оказывающих влияние на скорость реакции, идущей с участием фермента. Изменение скорости ферментативной реакции может быть обусловлено тремя механизмами внутриклеточной регуляции активности фермента: 1) изменением активности имеющихся в клетке молекул фермента; 2) Изменением количества молекул фермента в клетке и 3) изменением проницаемости мембран, компартментацией, образованием надмолекулярных комплексов (Мосс Д., 1970, Чернов В.В., 1996). В последе время особое внимание уделяется изучению ферментных систем клеток тканей и органов. Отличительными особенностями ферментных систем являются прочность ассоциации ферментов и определенная последовательность прохождения промежуточных реакций. Ряд таких ферментных комплексов структурно связан биомембранами различных клеточных органоидов и выполняет жизненно важные функции: ионный транспорт, транспорт электронов, последовательные окислительные реакции и др. Ферментные комплексы широко используются в химическом анализе (Болдырев А.А., 1997, Чизмаджев Ю.А., 2000, Шеховцова Т.Н., 2000, Зайцев С.Ю., Максимов В.И., Бардюкова Т.В., 2008). 13 1.1. Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных Жизнедеятельность клетки невозможна без поддержания в ней опреде- ленного соотношения воды, солей и органических веществ. Это обеспечивается за счет межклеточного обмена, то есть обмена веществ между клеткой и ее окружением. Регулирование потока веществ в клетку и удаление из нее метаболитов обеспечивают биомембраны, через которые одновременно в противоположных направлениях проходят все жизненно важные химические вещества. «Мембранная обособленность» живых систем от окружающего пространства является одним из самых важных факторов, отличающих живое от неживого (Болдырев А.А., 1977). Мембраны играют ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток – прокариотических и эукариотических, растительных и животных. Мембраны формируют внутриклеточные компартменты, с их помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды. Они участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые осуществляются между наружной и внутренней сторонами этих компартментов. Это проявляется в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану или в форме передачи информации при помощи конфармационных изменений, индуцируемых в мембранных компонентах. Кроме этого, с мембранами связаны многие клеточные ферменты, осуществляющие большинство жизненно важных функций, например, репликацию прокариотической ДНК, биосинтез белков и их секрецию, биоэнергетические процессы и функционирование гормонального ответа (Kusano T. еt al., 1984; Laffan J. et al., 1987;). Идею о том, что биомембраны представляют собой липидный бислой выдвинули в 1925 году Гортер и Грендел. Дальнейшее развитие этой концепции привело к появлению в 1935 году «сендвичной» модели Давсона- 14 Даниели (J. Danielli, H. Davson, 1934), в которой предполагалось, что белки покрывают поверхность липидного бислоя. В основе современных представлений о строение биомембран лежит жидкостно-мозаичная модель Сингера и Николсона, предложенная в семидесятых годах двадцатого века, согласно которой мембраны представляют собой текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки. В основе строения биомембраны эритроцитов лежит цитоскелет, выполняющий не только механическую функцию, но и участвует в ряде регуляторных процессов, в том числе в передаче сигналов (Yu J. et al., 1973; Fairbanks G. et ah, 1971; Goodman S. R. et al., 1995; Bennett et al., 2001). В последние годы жидкостно-мозаичная модель подверглась модификации. Было установлено, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липидном бислое, а некоторые участки мембран отличаются по своей структуре от классического липидного бислоя. Особенности строения и функции биологических мембран различных органов и тканей достаточно подробно изучены и описаны в литературе (Болдырев А.А., 1982; 1985; Кагава Я., 1985; Геннис Р. и др., 1997). Главная функция биологических мембран - избирательный транспорт различных веществ и ионов между клетками и её органеллами с окружающей средой. Это служит основой всех биоэнергетических механизмов и является строго скоординированным процессом в пространстве и времени (Ovchinnikov Y.A. et al., 1987). Избирательный транспорт веществ и ионов через биологические мембраны создает градиент концентраций веществ по обе стороны мембраны. Кагава Я. (1985) выделяет следующие типы транспорта в биомембранах: 1) пассивный транспорт веществ и ионов в направлении уменьшения электрохимического потенциала. Различают несколько типов пассивного транспорта - свободная и облегченная диффузия; 2) активный транспорт - перенос веществ против градиента их электрохимического потенциала, сопряженный с 15 потреблением энергии и при участии транспортных АТФаз; 3) цитоз - механизм переноса, который сопровождается обратимыми изменениями архитектоники мембран. Главным путем поступления в клетку неорганических ионов аминокислот, пептидов, органических кислот и других метаболитов является активный транспорт, осуществляемый ионными насосами, интегральными компонентами которых являются транспортные АТФазы (Бурков И.А., 1970). Наличие на мембране заряда, а также высокий градиент концентраций ионов натрия по обе стороны мембраны, по мнению Мартиросова С.М. (1981), является основополагающим фактором в процессе поступления сахаров и аминокислот в клетки, что подтверждается экспериментальными исследованиями. Samarzija I., Hinton B.T., Fromter E. (1982) отмечают, что при транспорте в клетку проксимальных канальцев почек одной молекулы аспарагиновой или глутаминовой кислот переносится 2 иона натрия в цитозоль. Перенос сахаров через мембрану щеточной каемки кишечного эпителия осуществляет ферментная система, расщепляющая сахарозу в процессе транспорта на составляющие моносахариды и др. (Кагава Я., 1985; DavisKaplan S.R. et al., 2004). Suleiman M.S., Chapman R.A.(1991) установили, что блокада Na-насоса сердца морской свинки строфантином приводит к выходу аминокислот из клеток желудочка. Это объясняется тем, что в большинстве случаев транспорт этих соединений в клетки является вторично - активным, то есть натрий зависимым. При этом одновременно с сахаром или аминокислотой через мембрану перемещаются ионы натрия, происходит симпорт, а чтобы не произошло накопление натрия в клетках, он активно «откачивается» во внеклеточную среду при помощи натриевого насоса (Вишняков С.И., 1988). Однако эритроциты, поглощающие малые количества аминокислот, обладают в связи с этим и низкой активностью натрий - калиевой помпы. Вишняков С.И. (1988) сделал предположение о том, что в эритроциты ами16 нокислоты транспортируются преимущественно натрий - независимыми способами. Это подтверждается открытием новой транспортной системы для аминокислот, например в эритроцитах лошади Пржевальского. Fincham Daron A., Ellory John Clive, Young James D. (1992) установили сходство новой системы транспорта как с классической Na+- зависимой, так и с Na+- независимой системами. Транспорт аминокислот зависит от их химической структуры, величины молекулы и ее электрического заряда. Так, наибольшей скоростью транспортирования обладают отрицательно заряженные аминокислоты с короткой углеводородной цепью, в то время как для транспорта положительно заряженных аминокислот в среде не требуется присутствия ионов натрия (Christensen N.N., 1972). Интенсивность работы ионных насосов влияет на течение разнообразных физиологических и физико-химических процессов, протекающих в организме. На работу ионных насосов расходуется энергия макроэргических связей АТФ, которая ресинтезируется в процессе окислительного (митохондриального) фосфорилирования, сопряженного с тканевым дыханием. По данным Murphy I., Koss P.G. (1968), активный перенос катионов через плазматическую мембрану на 87% обеспечивается за счет гидролиза АТФ. Болдырев А.А. (1985) выделяет следующие ионные насосы: натрий калиевый, кальциевый, протонный и анионный. Однако существуют и другие АТФазные ферментные системы, транспортирующие ионы, например К+, Н+ - АТФаза. 1.2. Механизмы транспорта питательных веществ в кишечнике Механизм всасывания веществ через клеточные мембраны стенки ки- шечника еще недостаточно изучен. Но не вызывает сомнений тот факт, что он носит как пассивный (диффузия), так и активный характер (Daniel V.G., 1972). При этом показано, что скорость исчезновения аминокислот и пептидов из кишечника анестезированных цыплят обратно пропорциональна молекулярной массе поступающих соединений. Пассивный транспорт – проте17 кает медленно и по своей интенсивности не соответствует высоким скоростям всасывания в кишечнике. Ведущую роль в процессе переноса аминокислот и пептидов играет активный транспорт, его характерной особенностью является перенос через мембрану против градиента концентрации, сопровождающийся затратой энергии. Экспериментальные исследования, проведенные Adibi S.A. (1979), Войновой Р. (1997) дали возможность утверждать, что пептиды транспортируются эпителием тонкого кишечника с помощью механизма отличающегося от механизма транспорта свободных аминокислот. В опытах in vitro и in vivo установлено, что способность аминокислот к всасыванию в виде дипептидов и трипептидов выше, чем свободных аминокислот. Такие же результаты получены Кушак Р.М. (1981), аминокислоты входящие в состав пептидов всасываются в кровь животных и птицей быстрее, чем эквивалентные смеси соответствующих аминокислот. По данным Зильбермана М.И. (1983), Stefan M. (1999), в транспортных процессах участвуют протеиназы энтероцитов, которые гидролизуют пептиды до свободных аминокислот, затем они связываются и переносятся специфическими белками-переносчиками. В опытах по изучению скорости переноса ПКД (Фурман Ю.В., 2001) установлено, что скорость пассивного переноса молекул протеиновой кормовой добавки через стенку кишечника птицы было выше, чем рыбной и мясокостной муки в 1,8 и составила 313 мг/час. Это объясняется тем, что молекулярная масса пептидов белковой добавки составляет от 600 до 1200 дальтон. Молекулярная масса белков мясокостной и рыбной муки значительно выше и составляет от 4000 до 10000 дальтон. Это обуславливало лучшую усвояемость протеиновой кормовой добавки по сравнению с известными кормами. Белки, прежде чем попасть в тонкий отдел кишечника подвергается гидролизу пищеварительными ферментами в желудке и двенадцатиперстной 18 кишке. Как полагает Супрунов О.В. и др. (1997) 30-50% протеина корма под действием желудочного сока расщепляется в желудках птицы до низкомолекулярных соединений главным образом полипептидов. В желудке птицы корм находится, по данным Архипова А.В. и Топоровой Л.В. (1984), 1-3 часа, это время во многом зависит от таких факторов, таких как объем, качество, плотность кормовой массы, осмотическое давление и других. Наивысшая секреторная функция желудка кур наблюдается при наличии 15-22% переваримого протеина в рационе. При уменьшении количества протеина в рационе до 10% и особенно при значительном повышении его до 26-30% эта функция желудка снижается (Георгиевский В.И., 1979). Эвакуация переваренных кормов из желудка имеет большое значение, поскольку этот механизм регулирует в большой степени продвижение питательных веществ в тонкий кишечник, где происходит их всасывание (Meggison P.A., 1980). В тонком отделе кишечника, особенно в тощей и подвздошной завершается расщепление белков до пептидов и аминокислот, лишенных видовой специфичности и способных к всасыванию. Количество аминокислот в корме вызывает сложные изменения в белковом обмене организма птицы. Эти изменения не ограничиваются чисто количественными сдвигами в использовании азота и всего протеина, а носят более сложный характер, обусловленный, с одной стороны специфическими метаболическим действием каждой аминокислоты в отдельности и определенным взаимодействием их в различных комбинациях в полной смеси. На белковый обмен, в свою очередь, влияет весь комплекс питательных и биологически активных веществ (Aparecido S.M. et al., (1997), Akemi Y. (1997), Стивен Л. (1998). Содержание экзогенного азота значительно зависит от времени переваривания корма и аминокислотной сбалансированности (Эггум Б.О., 1980). 19 1.3. Транспортные АТФазы и их активность 1.3.1. Характеристика Na+, К+-АТФазы Внутриклеточный раствор в клетках высших организмов по своему химическому составу отличается от наружной среды: внутри клетки содержится около 150 ммоль·л-1 калия и 26 ммоль·л-1 натрия. Напротив, внеклеточный раствор содержит около 5 ммоль·л-1 калия и 140 ммоль·л-1 натрия. Потенциальная энергия, запасенная в градиентах ионов натрия и калия по обеим сторонам мембраны, используется для проведения возбуждения по нервному волокну, а также при всасывании сахаров и аминокислот в тонком отделе кишечника, который сопряжен с транспортом натрия. Пассивный транспорт натрия и калия через цитоплазматическую мембрану (по электрохимическому градиенту) приводит к выравниванию концентраций этих ионов внутри и снаружи клетки (Кагава Я., 1985). Калий является одним из основных внутриклеточных катионов, необходимых для деления, дифференцировки и роста клеток (Lubin M., 1964; Adler S. et al., 1977; Smith P.L., Me Cabe R.D., 1984). В раннем онтогенезе содержание К+ в различных тканях (скелетных мышцах, подкожной клетчатке, печени, селезенке) достоверно выше, чем в аналогичных тканях взрослых животных (Айзман Р.И., Великанова Л.К., 1978; Соколова М.М., 1981; Великанова Л.К. и др., 1997). Поддержание ионного состава внутри клетки осуществляется натрийкалиевым насосом и сопряжено с гидролизом АТФ до АДФ и неорганического фосфата. В физиологических условиях энергия гидролиза одной молекулы АТФ используется для переноса трех ионов натрия из цитоплазмы во внешнюю среду и двух ионов калия в противоположном направлении. По данным Капелько В.И. (2000) примерно 10-15% всей энергии в кардиомиоцитах расходуется на работу мембранных транспортных белков. Na+,K+-АТФаза является частью Na+,K+-насоса и поэтому названа Na+,K+-АТФазным насосом (Forgae M. et al., 1981; Teller J.K., 1981). 20 Открытие Na+, K+ - АТФазы в 1957 году, связывают с работой лауреата Нобелевской премии Скоу Й., в которой показано, что гомогенат периферических нервов краба содержит фермент, гидролизующий АТФ в присутствии ионов натрия и калия. Однако представление о Na+, K+ - АТФазе как о ферменте, осуществляющем сопряженный транспорт ионов натрия и калия за счет энергии гидролиза АТФ, было сформулировано Скоу Й. позднее (Skou J.C., 1957;1960; 1961; 1964; 1965; 1969;1973; 1974; 1992). Na+, K+-АТФаза контролирует прямо или косвенно такие важные процессы в клетках, как производство тепла, подержание объема клетки, рН, уровня Са2+, мембранного потенциала и т. д. Модулируя уровень Са2+ и мембранный потенциал в возбудимых клетках (нервных и мышечных), Na+-насос регулирует выброс и поглощение нейромедиаторов, проведение нервного импульса, эффективность сокращения (Пойнов Ю.В., 1985; Пойнов Ю.В., Орлова С.Н., 1987; Rossier B.C., et al 1987; Болдырев А.А., 1992; Claussen, T., 1996). Na+, K+-АТФаза обнаружена во многих органах, особенно велико ее содержание в органах, осуществляющих выделительную функцию (почки, солевые железы) или выполняющих электрическую работу (мозг, электрический орган). Во всех случаях она локализована в наружных плазматических мембранах клеток. Этот фермент является маркером плазматической мембраны (Болдырев А.А., 2001, Геннис Р., 1997). Механизм работы Na+, K+-АТФазы описывается в рамках общей схемы E1_E2 –АТФаз (АТФаза Р-типа): E + АТФ Е1Р E2P E1P + АДФ; E2P; E2+ H3PO4; E2 E1 21 Согласно схеме ион Na+ (по всей вероятности, натрий внутренний) необходимы для фосфорилирования фермента. Фосфофермент претерпевает конформационное изменение (E1-Е2) и распадается на E2 и фосфат в присутствии ионов калия (наружного). Затем E2 релаксирует в E1. Состояние E2P фиксируется уабаином (Скулачев В.П., 1989). Истинным субстратом для Na+, K+-АТФазы является комплекс Mg2+АТФ. В клетке основные количества АТФ находятся в виде таких комплексов. При изучении кинетики фосфорилирования очищенного препарата Na+,K+-АТФазы Campos M. et. аl., (1992) установили, что связывание АТФазы с АТФ и с Mg-АТФ характеризуется одинаковыми константами скоростей, тогда как скорости диссоциации комплексов Е-АТФ и Е-Mg-АТФ существенно различаются. Авторами сделан вывод, что истинным субстратом для этого фермента может служить как АТФ, так и Mg-АТФ, а ионы магния служат в качестве активаторов суммарного АТФазного цикла. В процессе изучения субстратной специфичности Na+,K+-АТФазы сарколемы сердца Monosikova R. et аl. (1991) установили, что при наличии ОНгруппы у второго углеродного атома рибозного кольца делает этот субстрат менее предпочтительным, по сравнению с АТФ. Протомер Na+,K+-АТФазы представляет собой мембранно – связанный олигомер, состоящий из эквимолярных количеств двух субъединиц: каталитической и гликозилированной (Лопина О.Д., 1999; Павлов К.В. и др., 1999; Jorgensen P.L., 1982). Хотя в большинстве условий Na+, K+-АТФаза выделяется в форме димера ()2 или ещё более высокомолекулярных комплексов, для нормальной функциональной активности достаточен комплекс (Лопина О.Д., 1999; Павлов К.В. и др., 1999). Молекулярная масса мономеров (субъединиц) для различных тканей и животных не одинакова. Так, по данным Jorgensen P.L. (1974), субъединица имеет молекулярную массу 112000 Д, а 45000 Д. По Ноку Т. (1973) 22 100000 Д - 50000 Д. Kyte J., (1981) приводит следующие данные: - 95000 -55000 Д. Молекулярная масса субъединиц Na+, K+-АТФазы солевых желез утки (Болдырев А.А. и др., 1981) составляет - 91000 Д, - 63 000 Д. Некоторые исследователи считают, что в состав Na+,K+-АТФазы входит еще один белок с молекулярной массой около 10 кДа, который был назван - субъединицей (Вишняков С.И. 1988; Jorgensen P.L. et al., 1982). Другие авторы утверждают, что он является продуктом протеолиза - или субъединицы (Harris W.E. et al., 1988). Определение примерно половины аминокислотной последовательности этого белка позволило Collins J.H., Leszyk K.J. (1987) утверждать, что - субъединица представляет собой индивидуальный белок, а не фрагмент больших субъединиц. В последние годы первичная структура - и - субъединиц Na+,K+АТФазы из различных источников определена путём выяснения последовательности нуклеотидов в соответствующих генах (Болдырев А.А. и др., 1989; Kawakami K. et al., 1986; Shull G.E. et al., 1986). Обнаружено три вида ДНК, кодирующие три изоформы - субъединицы Na+, K+ - АТФазы: так называемые -, (+) (III)-формы. Они состоят из 1018, 1015 и 1013 аминокислот и, соответственно, имеют молекулярную массу около 112 кДа (Shull G.E. et al., 1986). В последнее время появилась информация о четвертом гене, который, по-видимому, также кодирует субъединицу Na+,K+-АТФазы, кроме того, выявлено два гена, кодирующих субъединицу, близкую по структуре - субъединице Na+,K+-АТФазы (Лопина О.Д. 1999). По данным Jaisser C.P. (1993), у различных видов животных обнаружено пять изоформ - субъединицы, входящих в состав Na+,K+-АТФазы (1, 2, 3, НК1, b1). Их физиологическое значение для функционирования Na+насоса, как и смысл существования нескольких её изоформ, в настоящее время непонятны. Известно, однако, что гликозилированная -субъединица необходима для правильной встройки в плазматическую мембрану (Владимирова Н.М. и др., 1998). Интерес к этой субъединице резко возрос после от23 крытия, подтверждающего, что 2 - изоформа гомологична белку, названному ранее адгезионной молекулой на глие, осуществляющей взаимодействие клеток астроцит - нейрон в нервной системе, а строение её полисахаридных цепей родственно строению сложных гликанов адгезивных молекул (Gloor S. et al., 1990). Аналогичное значение для межклеточного взаимодействия нейрональных и глиальных клеток было предложено для 3 - изоформы (Владимирова Н.М. и др., 1998). Роль -субъединицы, предположительно, заключается в облегчении встраивания α-субъединицы в мембрану, в обеспечении пространственной ориентации α –субъединицы в мембране (Ivanov et al., 2002) или для облегчения ее взаимодействия со специфическим ингибитором Nа+,К+-АТФазы уабаином (Умарова и соавт, 1998; Jaunin et al., 1993; Hasler et al., 2001). Изоформы -субъединицы являются сплайс-вариантами и различаются по локализации в организме (Schmalzing et al., 1992). Самой распространенной является 1-субъединица, 2-субъединица обнаружена в нервной ткани и мышцах и 3- в семенниках. Выделяют m-субъединицу, встречающуюся в скелетной и сердечной мускулатуре (Pierre et al., 2002; Scheiner-Bobis, 2002). Основной формой Na+, K+-АТФазы, встречающейся у млекопитающих, является изофермент 11-типа. Этот фермент получен в очищенном виде из почек млекопитающих, где он преобладает (Sweander K.J. et аl., 1985; Долапчиева С.Д. 1988; Капля А.А. и др., 1996, Blanco et al., 1998). Как отмечают Munakata Н. et аl. (1982), в состав и субъединиц, кроме протеидов и липидов, входят маноза, галактоза, глюкозамины и сиаловая кислота, причем Na+,K+-АТФазы различных животных существенно различаются друг от друга по углеводному составу. По данным Jewell E.A. et аl. (1992), соотношение изоформ субъединиц фермента зависит от типа клеток, вида и возраста животных. Так, в клетках с преобладанием 3 изоформы Na+,K+-АТФаза характеризуется более высоким сходством к Na+. 24 Активность Na+,K+-АТФазы изменяется под действием различных факторов. Это рН, температура, концентрация АТФ, которые, по-видимому, воздействуют на фермент, как на уровне самого каталитического акта, так и влияют на олигомерную организацию насоса. Кратковременная активация Na+,K+-АТФазы может достигаться за счет повышения внутриклеточной концентрации Na+, происходящей при открывании натриевых каналов. Долговременная регуляция, обусловленная увеличением синтеза - и -субъединиц Na+,K+-АТФазы, наблюдается в некоторых видах ткани (почечные канальцы) под действием таких гормонов как альдостерон, тироксин (Лопина О.Д., 1999), воздействуя на транскрипционном, посттранскрипционном и трансляционном уровнях. Опыты по изучению активности Na+,K+-АТФазы во фракции изолированных плазматических мембран клеток печени показали, что инсулин (1,6 ЕД/кг и тестостерон (1мг·кг-1) достоверно повышают активность фермента через 40 и 60 мин после внутримышечного введения соответственно. Активация фермента на 32% была обнаружена через 20 мин после внутримышечного введения тироксина (33 мкг/кг). В то же время установлено, что изучаемые гормоны не изменяют активность Na+,K+-АТФазы in vitro – при их инкубации с фракцией плазматических мембран гепатоцитов интактных животных, следовательно, действие гормонов на фермент является не прямым. Активация Na+,K+-АТФазы предупреждается предварительным, за 30 мин до инсулина, тестостерона или за 50 мин до тироксина, внутримышечным введением блокатора биосинтеза белка на уровне транскрипции – актиномицина D (50 мкг/кг). Следовательно, повышение активности Na+,K+-АТФазы проявляется за счет гормонозависимой стимуляции процессов биосинтеза белка в гепатоцитах (Фролькис В.В. и др., 1996). Имеется ряд данных, свидетельствующих об участии Na+,K+-насоса в регуляции электрогенеза скелетных мышечных волокон под влиянием ацетилхолина в низкой концентрации (Кривой И.И. и др. 2001). Влияние на активность Na+,K+-АТФазы различных нейромедиаторов, в том числе ацетил25 холина, вызывающего повышение активности данного фермента, объясняют взаимодействием агониста с соответствующим рецептором и далее изменением уровня фосфорилирования -субъединицы энзима при участии протеинкиназ А и С (Платонова Р.Д. и др., 1986; Gloor S.M., 1990; Кубасов И.В. и др., 1997; Кривой И.И. и др., 2001, 2003, 2004, 2006). Влияние ацетилхолина на Na+,K+-АТФазу осуществляется через М1 холинорецепторы. Известны примеры экспериментального изменения активности Na+,K+АТФазы в результате изменения условий содержания и кормления животных, а также под воздействием стресса (Казеннов A.M. и др., 1999, Медведева И.А. и др, 1993, Kamiya M.et аl.,1968). Na+,K+-АТФазная активность зависит от возраста и физиологического состояния животных (Капля А.А., 1998). По данным Вишнякова С.И. (1984), активность этого энзима выше у молодых животных, чем у взрослых. При этом наблюдали снижение активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов и в мозге животных. При старении снижается число Na+,K+-АТФазных насосов в скелетной мышце крыс и одновременно с этим увеличивается микровязкость их мембран. Снижается содержания в них АТФ на 20%, что отрицательно сказывается на активность фермента. При изменении физиологического состояния животных происходит модификация АТФазной активности сарколеммы сердца, что связано с изменением числа молекул переносчиков. Например, при переходе сусликов из гибернации в активное состояние происходит увеличение количества молекул транспортных АТФаз. Активность Na+,K+-АТФазы из сердца гибернирующих сусликов примерно в 1,5 раз ниже, чем у активных (Жегунов Г.Ф., Рязанцев В.В., 1991). На активность Na+,K+-АТФазы оказывают регуляторное влияние ионы Ca и Mg (Кравцов А.В. и др., 2001, Панюшкина Е.А. и др., 1994, Петруняка В.В. и др, 1990, Bonting S.L. et al, 1983) и ванадат (Bruck R., 1998) . Goldman S.S. et аl. (1973), установили, что для нормального функционирования Na+,K+-АТФазы необходимо липидное окружение, обусловли26 вающее конформационную структуру этого насоса, а, следовательно, и его функциональную способность. Кроме этого, на активность фермента существенно влияет и состав фосфолипидной матрицы (Аскари А., 1990). Так, для нормальной роботы фермента необходимо наличие в липидном окружении фосфатидилсерина или фосфатидилэтаноламина. Активность Na+,K+-АТФазы резко снижается по сравнению с контролем на 60%-80% под действием фосфолипазы А на мембрану. Считают, что под действием фосфолипазы А происходит расщепление фосфолипидов в окружении Na+,K+-АТФазы, приводящее к изменениям её нативной конформации, вследствие чего нарушается взаимодействие энзима с субстратом. Продукты гидролиза фосфолипидов, например длинноцепочечные и ненасыщенные жирные кислоты, угнетают АТФазную активность (Вишняков С.И. 1988). Болдырев А.А. (1992) считает, что на активность АТФаз очень сильное влияние оказывает их липидное окружение и некоторые недоокисленные продукты, и также фазовые переходы липидов биологических мембран (Болдырев А.А. и др., 1995). Вещества, снижающие вязкость липидной матрицы в мембране (перекиси липидов, дезоксихолеат, диэтиловый эфир, желчные кислоты и др), активируют Na+,K+-АТФазу. Напротив, вещества, увеличивающие вязкость липидного компонента мембраны (цитохалазин), снижают активность фермента (Капля А.А., 1997, Barnett R. еt al., 1973). Активность Na+, K+-АТФазы зависит от рН среды. Оптимум рН среды для мембран эритроцитов крупного рогатого скота составляет 7,8-8,0. Снижение или повышение рН среды заметно понижает активность фермента. При этом оптимальный рН среды зависит от концентрации АТФ, соотношения ионов Na+ и K+ и температуры инкубационной среды (Skou J., 1973). Специфическими ингибиторами Na+,K+-АТФазы служат уабаин, олигомицин, уксусный ангидрит, диметилсульфоксид, дигитонин и другие дигиталис подобные вещества, тимерзол, этилмеркуриат, ионы Са2+. (Болдырев А.А., 1985, 1998; Вишняков С.И., 1988; Claussen T. еt al., 1986; Ralph A.K., 27 1986; Peris, S., 2000; Schiener-Bobis G. et al., 2002; Hauck C. Et al., 2004; Федорова О.В. и др, 2005). Уабаин блокирует фосфокиназную и фосфатазную стадии ферментативного процесса. Кинетические исследования указывают на присутствие в молекуле фермента центра связывания уабаина и неконкурентный характер взаимодействия ингибитора (Skou, 1957, Favre et al., 1987). Сердечные гликозиды обладают практически абсолютной специфичностью в отношении Na,K-ATФазы (Акеrа, 1991). Для связывания сердечных гликозидов с рецептором Na,K-ATФазы необходимо присутствие ионов магния (Умарова и соавт., 1995, 1998). У животных многих видов существуют эндогенные сердечные гликозиды, играющие важную физиологическую роль в регуляции Nа,К-АТФазы. Эти соединения были выделены из крови (Balzan et al., 2000), мочи (Goto et al., 1998), гипоталамуса (Tymiak et al., 1993; Lichtstein et al., 2001), почек (Krivoi et al., 2003). Doris (1994) предположил, что они синтезируются в надпочечниках. Изучение их структуры показало, что она гомологично уабаину (Kolbel et al., 1996; Grambert et al., 1998). Некоторые из эндогенных сердечных гликозидов являются производными буфодиенолида (Bagrov et al., 1991, Fedorova et al., 2001) и стереоизомерами уабаина (Zhao et al., 1995). Hamlyn et al. выделен эндогенный уабаин (1998). Вероятно, основная физиологическая роль эндогенных сердечных гликозидов заключается в регуляции кровяного давления (Blaustein, 1996, Buckalew et al,, 1998). АТФазная активность зависит также от соотношении АТФ и АДФ в инкубационной среде. Например, увеличение содержания АДФ в инкубационной среде заметно ингибирует активность АТФазы митохондрий печени крыс. Na+,K+-АТФаза более активно гидролизует АТФ, чем ЦТФ и другие нуклеотидные макроэрги (Robinson J.D. 1979). Bader H. et al. (1968), изучая Nа+, К+- стимулируемую АТФазу, выделенную из различных органов и тканей (эритроцитов, почек, мозга человека, 28 кроликов, собак, ягнят, морских свинок и др.), пришли к выводу, что механизм активности этого фермента общий для большинства видов и тканей животных. 1.3.2. Биологическая роль Са2+-АТФазы Ионы кальция играют важнейшую роль в жизнедеятельности всех организмов. Они служат универсальными внутриклеточными посредниками в передачи информации. Для этого внутри клетки поддерживается очень низкая их концентрация (порядка 10-8 моль) по сравнению с внеклеточной средой, где она равна примерно 3ммоль (Сторожок и соавт., 1997). Выведение ионов кальция из клетки осуществляется системами плазмалеммального активного транспорта или ионного обмена, главную роль, в которой играет кальциевый насос – фермент кальциевая АТФаза (Рубцов А.М., 2005). Кальциевый насос (Ca2+-АТФаза), открыт в 1962 году Гоффманом (Hoffman J.F.).Этот насос в основном функционирует в плазматических мембранах и мембране саркоплазматической сети или саркоплазматического ретикулума. Он обеспечивает низкое содержание ионов Ca2+ в клетке за счет откачивания кальция во внеклеточную среду. При расщеплении одной молекулы АТФ на АДФ и Pi происходит перенос двух ионов Ca2+ из эритроцитов во внеклеточную среду. Са2+-АТФазы, входящие в состав цитоплазматических мембран и внутриклеточных мембран, различаются по ряду свойств. Все Са2+-АТФазы представляют собой мономерные белки, то есть состоят из единственной полипептидной цепи, но несколько различаются по молекулярной массе (Владимиров Ю.А., 1998). Кальциевый насос состоит из двух компонентов: фермента Ca2+АТФазы и ионного кальциевого канала. Ионный канал образован протолипидной фракцией с молекулярной массой 12000Д, а ферментная система образована белковым макрокомпонентом с молекулярным весом 100000Д (Болдырев А.А., 1977). 29 Cooper P. H. et al, (1976), установили, что фракция плазматических мембран клеток молочной железы проявляет наибольшую Ca2+-АТФазную активность в присутствии 4 мМ Ca2+. Добавление ионов Mg2+ на фоне Ca2+ не оказывает влияния на ферментативную активность. На основании сравнения АТФазной активности в суспензии не разрушенных клеток и в гомогенате ими сделан вывод, что активный центр Ca2+АТфазы локализован на внешней поверхности плазматических мембран. Работа Са2+ насоса осуществляется по следующей схеме: 1) связывание двух ионов кальция на поверхности АТФазы, обращенной в цитоплазму; 2) связывание на той же поверхности молекулы АТФ; 3) фосфорилирование белка (образование фосфофермента) и высвобождение АДФ; 4) высвобождение ионов кальция с поверхности АТФазы, обращенной внутрь пузырьков саркоплазматического ретикулума, связывание магния; 5) гидролиз фосфатной связи и отщепление ионов магния; 6) переход молекулы фермента в исходное состояние (центры связывания кальция оказываются опять на поверхности пузырьков саркоплазматического ретикулума). Enyedi A. et al. (1982), предполагают, что истинным физиологическим субстратом для Ca2+-насоса эритроцитов является комплекс Mg-АТФ, а свободный Mg2+ в концентрации 1,0 -2,0 мМ ингибирует активность этого фермента. Однако Pedemonto C.H. et al. (1981), отмечают, что свободный магний является существенно важным активатором Ca2+-АТФазы мембран эритроцитов и участвует в переходе E1 –E2 и E2 – E1 конформационных состояний фермента. Quist E. E. et al.(1975), отмечают, что для функционирования Ca2+ АТФазы, выделенной из мембран эритроцитов человека, необходимо присутствие фосфолипидов. 30 Шевченко А.С., Орлов С.Н. (1977) при изучении действия ионов Ca2+ на активность Mg2+- зависимой АТФазы теней эритроцитов человека и крысы установили, что в работе этих ферментов имеется большое сходство. Максимум активности находился в области 500,0 мкМ кальция. Увеличение концентрации Ca2+ до 2,0 мМ приводило к полному ингибированию активности АТФазы. Кроме Ca2+, на активность Ca2+-АТФазы теней эритроцитов стимулирующее влияние, по данным Pfleger H. et al. (1975), оказывают ионы Sr2+, Ba2+, Mn2+, Ni2+, Co2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+ и Pb2+. Увеличение активности АТФазы в присутствии Hg2+ не наблюдалось. Кроме вышеперечисленных ионов, на активность Ca2+-АТФазы оказывают влияние и другие вещества. Watson E. L. et al. (1971) установили, что рутений красный ингибирует Ca2+ - активируемую АТФазу изолированных мембран эритроцитов (I50 = 10-5 М) и не влияет на Na+ K+ и Mg2+ - АТФазы. Ташмухамедовым Б.А. и др. (1969) было обнаружено, что аминазин и дихлорфенолиндофенол, являющиеся ингибиторами цепи переноса электронов в митохондриях и микросомах, в концентрациях 10-4 – 10-3 M, эффективно подавляют транспорт Ca2+ в эритроцитах. Наряду с этим обнаружено, что разобщающие агенты - динитрофенол и тетрахлоррифторметилбензимидазол, угнетающие накопление Ca2+ в митохондриях и саркоплазматическом ретикулуме, не оказывают значительного влияния на действие транспортной Ca2+ - АТФазы в тенях эритроцитов. Omer B. et al. (1990) отмечают, что введение крысам ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг снижает активность Ca2+ - АТФазы мембран печени по сравнению с контролем на 55,9%, в то время как активность Mg2+АТФазы не изменялась. Safeer R.S. et al. (1990) отмечают, что глюкоза способна ингибировать Ca2+-АТФазу мембран эритроцитов, не оказывая существенного влияния на активность Na+ K+-АТФазы. 31 Кроме D-глюкозы, по данным Deriel M .et al. (1992), ингибирующее действие на Ca2+-АТФазу мембран эритроцитов оказывают D-галактоза, маноза и D-фруктоза. Броун И.И. (1994) выдвинул гипотезу о том, что Ca2+ является третьим сопрягающим ионом, то есть в условиях, препятствующих генерации Н+ и Na+, сопряжение энергетических процессов может происходить за счет Ca2+. Хотя эта гипотеза выдвинута для микроорганизмов, не исключено и аналогичное поведение Ca2+-АТФазы в других животных организмах. Орлов С.Н. и др. (1987) отмечают, что ионы внутриклеточного кальция способны оказывать влияние на активность не только Ca2+-АТФазы, но и других ионных насосов. В частности, ими установлено, что в присутствии 50 мкM Ca2+ происходит 50% ингибирование Na+,K+-АТФазы эритроцитов. Ca2+ в концентрации 10 - 20 мкM также оказывает ингибирующее действие и на анионную аденозинтрифосфатазу. Однако, по данным Mazzanti А. et. al (1992), Ca2+ в концентрации 0,2 2,0 мM дозазависима активирует Na+, К+- АТФазу, выделенную из плаценты человека. Ca2+- зависимая АТФаза является не только обязательным компонентом цитоплазматических мембран клеток, но также обнаружена в ядерных и митохондриальных оболочках. Так, по данным Куликовой О.Г. и др. (1982), Сa2+, Mg2+-активируемая часть составляет в среднем 50% от общей АТФазной активности ядер клеток скелетных мышц. В ииследованиях Рыжковой Г.Ф. и Ревиной А.Б. (2010) показано, что активность Mg2+,Сa2+-АТФазы митохондриальной фракции головного мозга куриных эмбрионов постепенно повышается, начиная с 12 суточного возраста. 1.3.3. Значение и биологическая роль HCO3--АТФазы Анионной АТФазой считают такую ферментную систему, которая осуществляет гидролиз АТФ, зависимый от анионов, и особенно от бикарбоната (Иващенко А.Т., 1982). В литературе наиболее часто встречаются сле32 дующие названия анионных АТФаз: HCO3--АТФаза; SCN- - ингибируемая АТФаза; для митохондриальной H+-АТФазы, чувствительной к действию анионов, существует свое исторически сложившееся название F1-АТФаза или сопрягающий фактор F1 Рэкера. Как отмечает Болдырев А.А. (1985), существует несколько АТФазных систем, чувствительных к анионам. Так, например, анионные АТФазы, наиболее хорошо развиты в эритроцитах. Высокая эффективность системы транспорта ионов Cl- и HCO3- в мембране эритроцитов обусловлена ее большой функциональной нагрузкой. Сопряжение активности этой системы с карбоангидразой, катализирующей обратимую реакцию гидратации CO2, обеспечивает газообмен в тканях и легких. В частности, на связь Mg2+, HCO3--АТФазы с карбоангидразой указывает, в своей работе Suruki S. (1981). Кроме того, ряд АТФаз, по-видимому не участвующих в переносе анионов, реагирует на присутствие последних. Сопрягающий фактор F1 (растворимая митохондриальная АТФаза) является основой АТФазного комплекса митохондрий, осуществляющего протекание АТФазной и АТФ синтетазной реакций в системе окислительного фосфорилирования (Рэкер Э., 1979). Анион - чувствительная АТФаза широко распространена в живых организмах. Она обнаружена в бактериях (Marunouchi T. еt al., 1967), в растительных (Nelson N. еt al., 1962) и животных клетках (Racker E. 1962). В бактериальных клетках анионная АТФаза связана с мембранными структурами и практически отсутствует в растворимой части гомогенатов. Так, после разрушения ультразвуком грамотрицательных бактерий Thiobacillus thiooxidans наибольшая активность SO-3 - стимулируемой АТФазы наблюдалась в осадочной фракции, содержащей мембраны (Marunouchi T. еt al., 1967; 1969). В фотосинтезирующих бактериях Rhdospirillum rubrum АТФаза, стимулируемая сульфатом, локализована в мембранах хроматофоров (Webster G.D. et al., 1977; 1978). АТФаза, активируемая бикарбонатом и ингибируемая тиоционатом, обнаружена в плазматической мембране Esherichia coli (Gunther T. еt al., 1974) и клеточной мембране Paracocus dinitrificans (Fergusson S.J. et al., 1977). 33 Наличие анион-чувствительной АТФазы установлено в мембране грамположительных и других бактерий (Ishida M. еt al. 1969), существенно отличающихся по обмену веществ и по способу энергообеспечения. Локализация аниончувствительной АТФазы в дрожжевых клетках, преимущественно в митохондриях и плазматической мембране (Ryrie I.J. 1975). В клетках высших растений установлено присутствие анионной АТФазы в митохондриях и мембранах тилакоидов хлоропластов. Имеются сведения о наличии НСО3- АТФазы в плазматических мембранах растительных клеток (Nelson N. еt al., 1972; Rungie J.M. et al., 1973; Sullivan C.W. et al., 1975). Наиболее полно исследованы анион-чувствительные АТФазы, обнаруженные в разных органах и тканях животных. НСО3- стимулируемая АТФаза изучалась в слизистой оболочке желудка лягушки (Берсимбаев Р.И., Шайхин С.М., 1979; Kasbekar D.K. et al., 1965; Koenig C. еt al., 1970; Limlomwongse L. et al., 1970; Blum A.L. et al., 1971; Forte J.G. et al.,1973), крысы (Иващенко А.Т. и др., 1975, 1981; Narumi S. еt al., 1973; Soumarmon A. еt al., 1974), кролика (Amelsvoort J.M. et al., 1977), свиньи (Schreijen J.J. et al., 1980), собаки (Spenny J.G. et al., 1973; Tague L.L. et al., 1977), ящерицы (Pont J.J. et al., 1972) и угря (Morisawa М. еt al., 1976). В большинстве животных клеток анионная АТФаза в основном присутствует в митохондриях, причем, как отмечает Иващенко А.Т. (1982), она может составлять 60-90% от общей активности АТФаз клетки. Однако анионные АТФазы присутствуют и в других мембранных структурах клетки (цитоплазматическая мембрана, ядра и лизосомы). Анионная АТФаза, осуществляющая транспорт ионов Cl- в нейрон против электрохимического градиента и активируемая ионами Cl- и/или HCO3описана в работе Мензикова С.А. (2007). Он отмечает, что Cl-,HCO3--АТФаза из мозга животных имеет молекулярную массу 360 кДа и состоит у рыб из одной субъединицы (56 кДа), а у крыс из трех субъединиц (57, 53 и 48 кДа). 34 Данная АТФаза значительно отличается по молекулярным свойствам от транспортных АТФаз Р-типа (Na/K-АТФаза), но по субстратным свойствам сходна с ними. Данный фермент активируется анионами HCO3-, SO42-, SO32-, а анионы SCN- и NO3- ингибируют его. Ионы Cl- активировали АТФазу начиная с концентрации 0,7мМ Практически аналогичные результаты получены ранее Утеулиным К.Р. и Иващенко А.Т. (1978, 1982). По степени влияния анионов на АТФазную активность они делят их на три большие группы: ингибирующие, стимулирующие и малоэффективные. Ими установлено, что анионы HCO3-, CO32-, SO42- стимулировали АТФазную активность, анионы HSO4- на нее не влияли, а анионы NO2-, ClO4-, F-, SCN- ингибировали её. Аналогично влияли эти анионы и на растворимую митохондриальную АТФазу F1. Они выдвинули предположение, что HCO3- - АТФаза эритроцитов имеет большое сходство с F1-АТФазой митохондрий. Это подтверждается и исследованиями других авторов. Так, Каландаришвили Ф.А. и др. (1977) показали способность ядер к окислительному фосфорилированию. Это предположение сделано на основании данных о том, что ядерная АТФаза подавляется олигомицином и грамицидином С и активируется динитрофенолом (Збарский И.Б. и др, 1973). На основании этого ими высказано предположение, что в ядерных оболочках содержится АТФаза типа сопрягающего фактора Рэкера F1, при этом данная АТФаза не активируется натрием и не подавляется уабаином. Однако ядерная АТФаза имеет и свои особенности, отличающие ее от митохондриальной. В частности, имеется существенная разница в концентрациях сульфита и бикарбоната, обеспечивающих полумаксимальную скорость АТФазной реакции для митохондриальной и ядерной АТФаз. Кроме того, существенное отличие АТФазы ядер от АТФазы митохондрий было установлено Иващенко А.Т. (1981) при исследовании способности двухвалентных катионов стимулировать действие бикарбоната на гидролиз АТФ. Так, например, катионы Mg2+ наиболее сильно стимулировали АТФазную активность, а катионы цинка, бария и никеля ее ингибировали. Ионы Mn2+ и Co2+ 35 незначительно активировали АТФазу. С влиянием Ca2+ связано повышение исходной активности АТФазы ядер, однако бикарбонат не стимулировал гидролиза АТФ в присутствии кальция. В отличие от ядерной АТФазы, катионы Co2+ и Mn2+ существенно стимулировали АТФазную активность митохондрий. Кроме того, установлено, что ядерная и митохондриальная АТФазы функционируют в разных диапазонах pH. Так, максимум активности митохондриальной АТФазы наблюдался при pH 8,5 - 9,0, в то время как Mg2+ АТФаза ядер практически не зависела от pH, а активность HCO3- - стимулируемой АТФазы в щелочной среде уменьшалась. Исходя из этих данных Иващенко А.Т. (1978) сделан вывод, что в ядрах имеется своя H+ - АТФаза, отличная от митохондриальной сопрягающей системы. 1.3.4. Особенности функционирования АТФаз птиц Наиболее удобными объектами для изучения функционирования АТФаз являются препараты, получаемые из эритроцитов, почек и мозга. Так, Болдырев А.А. (1977) объясняет это легкостью получения достаточно активных мембранных препаратов из этих объектов. Однако, по мнению Болотникова И.А. и Соловьева Ю.В. (1980), возрастные изменения морфологии и функции эритроцитов птиц изучены недостаточно. Это связано с их более сложным строением, заключающимся в наличии ядра, а в молодых эритроцитах – и митохондрий. С этим фактором связаны также и особенности работы Na+,K+-насоса у птиц. По данным Степаняна Р.А.и Симоняна А.А. (1983), применение специфического ингибитора этой аденозинтрифосфатазы – уабаина в концентрации 2,0-100,0 мМ не вызывает существенного подавления активности АТФазы, выделенной из тканей цыплят. Аналогичные данные получены при исследовании АТФазной активности гомогенатов органов и тканей цыплятбройлеров Фурманом Ю.В. (1991). Показано, что активность этого фермента без добавления ионов в среду инкубации сравнительно низкая, однако с возрастом она увеличивается, достигая максимума у половозрелых кур. В присутствии ионов Na+,K+,Mg2+,Ca2+ активность соответствующих энзимов зна36 чительно возрастала. В опытах Фурмана Ю.В.установлено, что максимальная активность аденозинтрифосфатозной реакции гомогенатов тканей наблюдается при концентрации ионов натрия в среде инкубации – 130 мМ и калия – 20 мМ, причем натрий увеличивал активность фермента значительно сильнее калия. 1.3.5. Влияние различных факторов на транспортные процессы и активность АТФаз Транспортные аденозинтрифосфатазы чутко реагируют на изменение внутренней и внешней среды, регулируя в соответствии с этим интенсивность своей работы. В связи с этим в последнее время пристальное внимание уделяется проблемам регуляции активности Na+,K+-АТФазы (Кравцов А.В. и соавт., 2001; Батоцыренова Е.Г., 2005; Cheng et al., 1999; Therien et al., 1999, 2000; Pu X. et al., 2001, 2002; Zouzoulas et al., 2003; Flemming et al., 2003), выделению и изучению свойств белков, взаимодействующих с этим ферментом (Лопина О.Д., 2001; Акимова О.А. и соавт., 2003). Согласно современным представлениям Na+,K+-ATФаза является не только ионным насосом, но и рецептором, связывающим дигиталис-подобные факторы и передающим сигнал внутрь клетки (Haas et al., 2000; Schoner, 2002; Xie et al., 2002, 2003). По данным Сухомлиной К.Г. (1986), при скармливании белкового препарата – гаприна в рационах цыплят-бройлеров в количестве до 30% отмечалось увеличение активности АТФаз мышц и печени в 1,4–1,5 раза у всех возрастных групп. Она также отмечает, что общая АТФазная активность мышц увеличивается с возрастом почти в 10 раз. Лупашко Н.И., Карташов Г.А. (1978) отмечают, что скармливание курам-несушкам 0,25% добавки сульфида натрия привело к увеличению АТФазной активности сердца эмбрионов. По данным, полученным Симония Г.В.и др. (1992), карнозин – гистидинсодержащий дипептид, являющийся специфическим компонентом скелетных мышц, отчетливо повышал активность Na+,K+-АТФазы мембран 37 эритроцитов, что объясняется его выраженным антиокислительным действием на липидное окружение этого насоса. На активность фермента влияют также изменение осмотического давления в организме, сильное воздействие лазерного излучения на эритроциты, - и рентгеновское излучение и микроволновое облучение клеток. Активность Na+,K+-АТФазы понижается при воздействии анестетиков, яда кобры и этанола, (Beron J. et al, 1995, Вишняков С.И. 1988). Активность Na+,K+АТФазы изменяется при фосорилироавнии одной из субъединиц (Bertorello A.M. et al, 1991, 1993). Глутамат при действии на синаптосомы коры мозга крыс вызывает достоверное снижение активности Na,K-ATФазы и накопление продуктов перекисного окисления липидов. Предполагают, что действие глутамата связано с активацией свободнорадикальных реакций в цитозоле (Аврова Н.Ф. и соавт., 2004; Nathanson et al., 1995; Bulygina, 2002). Применение 3% пептидной кормовой добавки из дехромированных отходов кожевенного производства, по данным Фурмана Ю.В. (1991), повышает АТФазные активности гомогенатов органов и тканей цыплят-бройлеров. Однако такие вещества, как дигитонин (Щеглова М.В., 1981) и ФОС (Г.А.Хмельницкий, 1990), способны полностью ингибировать активность Na+,K+-АТФазы. В организме существуют эндогенные аналоги дигиталиса (ЭДФ), являющиеся физиологическими регуляторами мембранной Na/K-АТФазы (Тапильская Н.И. и др. 2006, Blaustein M.P., 1996). На активность Na+,K+-АТФазы существенное влияние оказывает цАМФ-активируемая протеинкиназа (Palmer et al., 1991, 1993; Nestor et al., 1997; Stewart et al., 1981, 1998). Механизмы, модулирующего влияния этого фермента на активность Na,K-АТФазы, разнообразны и комплексны (Borin, 1997, Муртазина и соавт., 2001; Lingham et al., 1982). В работе Cheng и соавторов (1999) показано, что ионы кальция являются важным посредником в действии протеинкиназы на Na,K-АТФазу. 38 Активность Na+,K+-АТФазы модулируется протеинфосфатазой 2А (РР2А), которая увеличивает количество молекул фермента в плазматической мембране (Blot-Chabaud et al., 1996,), и также протеинкиназой С (РКС) (Chibalin et al., 1998). На активность Cl--АТФазы нейрональных мембран мозга млекопитающих и рыб эффективно влияют специфический блокатор Na+,K+-АТФазы и H+-АТФазы олигомицин. Специфические блокаторы Na+,K+-АТФазы – уабаин и Ca2+-АТФазы – рутениевый красный не влияли на активность фермента (Мензиков С.А., 2007). Он так же установил, что ГАМК, глицин, ацетилхолин и глутамат в концентрации 0,1-100 мкМ активируют «базальную» Mg2+АТФазу. К специфическим ингибиторам АТФаз Р-типа относится ортованадат (VO43-), который действует с цитоплазматической стороны и ингибирует работу Na,K-ATФазу в нано- и микромолярных концентрациях. Ванадат связывается с тем же остатком Asp, по которому происходит фосфорилирование фермента с помощью АТФ. Предполагается, что ванадат стабилизирует Na,K-AТФазу в конформации E1, таким образом ингибируя фермент (Павлов и соавт., 1999). Активность АТФаз изменяется также и при различных патологических процессах. Так Каган В.Е. и др. (1981); Бурлакова Е.Б. и др., (1982) отмечают, что в патогенезе самых различных заболеваний и патологических состояний важную, а зачастую и определяющую роль играют универсальные процессы, развертывающиеся при повреждении клеточных мембран. Это связано с представлением о биологических мембранах, как основном структурном и функциональном элементе клеток и тканей в организме (Verkley A.G., 1984), а также признанием важной роли мембранных нарушений в развитии различных патологических состояний (Cox M. 1981; Roelofsen B. еt al., 1981; Sills R.H. et al., 1982; Маслова М.Н. и др., 1991; Мавров И.И. и др. 2002). 39 На активность АТФаз сущетсвенное влияние оказывают медиаторы воспаления, так, производные лизофосфолипидов (арахидоновая кислота и ее метаболиты), ингибируют Na,K-ATФазу (Satoh Е. et al, 1993). По современным данным, повреждение клеточных мембран связано с воздействием фосфолипаз; лизосомальных эндопепдитаз, процессов клеточного перекисного окисления липидов и состоянием защитно– компенсаторных механизмов, в частности, метаболической активности клеток, антиоксидантной обеспеченности организма (Ramasarma T., 1982; Shier W.T., 1982; Скулачев В.П., 2001; Болдырев А.А., Юнева М.О., 2004). Гаджиев А.Б. и др., (1994), отмечают, что изменения транспорта отдельных катионов, как через плазматическую мембрану клеток, так и на внутриклеточном уровне имеют важное патогенетическое значение при различных патологических состояниях. Нарушение ионного состава в клетке влияет на агрегатное состояние протоплазмы, комформацию и взаимодействие макромолекул, специфичность и активность отдельных ферментов, регуляцию мышечного сокращения, процессы рецепции и т.д. (Бергельсон Л.Д., 1982). Это связано с тем, что одновалентные катионы Na+ и K+, кроме участия в процессах возбуждения и проведения нервного импульса, регулируют внутриклеточное рН и являются кофактором, влияющим на скорость дыхания и гликолиза. Отмечено также, что скорость синтеза внутриклеточных белков может регулироваться концентрацией K+. Одной из общих и быстрых приспособительных реакции клеток на изменение ионного состава является активация синтеза фосфолипидов. Отмечено, что Na+ стимулирует синтез фосфолипидов и влияет на их жирнокислотный состав (Антонов В.Ф. 1982). Нарушение снабжения кислородом тканей мозга, сопровождающееся повышенным образованием высокореакционных свободных радикалов, приводит к целому ряду нежелательных последствий, включая ингибирование белков – ферментов, модификацию ионных каналов, транспортеров, мембранных рецепторов (Ерин А.Н. и др., 1994; Болдырев А.А. и др., 1996). Од40 ним из белков, подвергающихся атаке свободных радикалов, является Na+,К+-АТФаза, в результате чего происходит ее разобщение с активным транспортом ионов, а затем и ингибирование гидролитической активности. Уже через 30 мин после острой церебральной ишемии у крыс Na+,К+-АТФаза мозга оказывается подавленной на 35-40%. Ким Э.А. (1989) обнаружено зависимое от времени снижение Na+,К+-АТФазной активности препаратов сарколеммы миокарда морских свинок и крыс при кратковременной тотальной ишемии (до 45 мин). Максимальное падение данной ферментативной активности миокарда животных достигало 50-55%. Фактором, обусловливающим снижение Na+,К+-АТФазной активности при ишемии, скорее всего является накопления неэстерифицированных жирных кислот вне мембранном поле миокарда. Торможение активности Na+,К+-АТФазы во фракции неочищенных синаптосом коры головного мозга крыс наблюдается в клонической фазе генерализованных судорог, вызванных электрическим раздражением мозга (Мхеян Э.Э., 1998) С точки зрения ряда исследователей, одним из важных звеньев патогенеза возникновения и развития гипертонической болезни является нарушения ионного транспорта, связанные с патологией клеточных мембран. У экспериментальных животных, страдающих гипертонией, снижена активность кальциевых АТФаз в гладких мышцах стенок кровеносных сосудов. Это снижение активности приводит к повышению содержания внутриклеточного кальция. А поскольку ионы Са2+ запускают механизм мышечного сокращения, тонус сосудистой стенки будет усилен, что приведет к повышению кровяного давления в целом организме (Владимиров Ю.А., 1998). Большинство исследователей отмечало более низкую активность Na+транспортирующих систем, в том числе и активность Na+, К+- АТФазы в организме женщин по сравнению с мужчинами, как здоровых, так и больных гипертонической болезнью (Бритов А. Н. и др., 1991; Persky V. еt al., 1990; Turner S.T. et al. 1991; Hansen H.S. et al., 1993). 41 По данным Левитина Е.В. (1989), в патогенезе эпилепсии у детей существенная роль принадлежит изменению функционального состояния ферментов трансмембранного транспорта, о чем убедительно свидетельствует уменьшение активности Na+,К+- и Са2+-АТФаз, в меньшей степени Mg2+АТФазы до проявления клинических признаков в раннем периоде заболевания. Эти изменения детерминированы тяжестью, длительностью, периодом болезни, видом припадков (судорожные и бессудорожные), выраженностью электроэнцефалографического проявления, исходным вегетативным тонусом. В исследованиях Голода Е.А. и др. (1997) выявлено, что снижение активности Са2+-АТФазы в микросомной фракции, выделенной из коркового вещества почек крыс при тепловой ишемии, связано с нарушением мембранной проницаемости. Например, при гемморрагической лихорадке с почечным синдромом наблюдается угнетение АТФазной активности, Na+,K+-, Ca2+активируемой, Mg2+-зависимой АТФазы, наиболее выраженное в олигоанурическом периоде при тяжелой форме болезни. Так, в начальном периоде заболевания уменьшение активности этих энзимов составило в легкой степени - 13%, средней- 8%, тяжелой степени 14%, полиурической - 12,5,7% (Низамова Э.И., 1997). На ферментативную активность влияет облучение. Установлено, что воздействие радиации, а также гипофункции щитовидной железы, равно как и сочетаемое действие обоих факторов приводит к существенному увеличению константы Михаелиса. Наиболее резко выраженные изменения показателей выявлены к исходу третьих суток после сочетаемого действия радиации и гипофункции. Через десять суток картина остается сходной с предыдущей (Багель И.М., Шафрановская Е.В., 1997). В работе Мцехветадзе А.В. и др. (1990) было показано, что в опухолевых клетках карциномы Эрлиха и саркомы Рингера с увеличенной концентрацией кальция до 9,5 мМ (вместо 0,9 мМ) отмечается усиление активного транспорта ионов кальция, коррелирующее с повышением активности фермента Са2+-АТФазы. В нормальных клетках этого явления не наблюдается. 42 Результаты их исследований свидетельствуют о том, что Са2+-АТФазная активность возрастает при всех формах острого лейкоза, но более выражена при острых нелимфобластных лейкозах. Активность Са2+-АТФазы может быть показателем большей злокачественности опухолевого процесса, так как острые нелимфобластные лейкозы хуже поддаются лечению и имеют более неблагоприятный прогноз. Следует отметить, что в развернутой стадии острого нелимфобластного лейкоза лейкоцитоз был выражен в значительно меньшей степени. Следовательно, Са2+-АТФазная активность в меньшей степени зависит от количества бластных клеток, чем от изменения состояния их биомембран. При клинико-гематологическом улучшении и полной ремиссии Са2+-АТФазная активность снижается, что связанно, по-видимому, со значительным ослаблением злокачественного процесса. С учетом вышеизложенного целью настоящей работы явилось изучение особенностей функционирования транспортных АТФазных ферментных систем тканей и органов животных в зависимости от возраста, физиологического состояния и кормления. Это определило общую направленность работы, выбор методических подходов и экспериментальных моделей. 43 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены в 1992…2011 г.г. на животных птицефабрик «Курская», «Красная поляна», «Юбилейная», а также в животноводческих хозяйствах Курской области. Лабораторные анализы выполнялись на кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», в биохимической лаборатории кафедры безопасности жизнедеятельности в техносфере ФГОУ ВПО «Курского института социального образования (филиал) РГСУ», на кафедры органической и биологической химии ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия». Объем исследований представлен в табл. 1. На рис. 1 представлена общая схема исследований. 44 Таблица 1. Количество и возрастные группы исследованных животных Возраст 1 Количество, экз Средняя масса тела 2 3 Цыплята-бройлеры кросса «Бройлер-6» 1 сут 50 37-40 г 15 сут 40 170-210 г 60 сут 40 1500-1800 г Цыплята-бройлеры кросса «ISA» 1 сут 50 45-48 г 10 сут 40 260-290 г 20 сут 40 700-840 г 30 сут 40 1000-1260 г 40 сут 40 2000-2300 г Свиньи 2 мес. 10 18-19 кг 6 мес. 10 75-85 кг 12 мес. 10 110-120 кг 2 года 10 170-180 кг Крупный рогатый скот симментальской породы 140-180 кг 6 мес. 10 220-250 кг 12 мес. 10 480-520 кг 2 года 10 Крупный рогатый скот черно-пестрой породы 140-180 кг 6 мес. 10 220-250 кг 12 мес. 10 480-520 кг 2 года 10 45 Активность ферментных систем (АТФаз) у сельскохозяйственных животных у цыплят-бройлеров в зависимости от: у свиней в зависимости от: у крупного рогатого скота в зависимости от: возраста концентрации ионов электролитов и ингибиторов кросса, породы вида субклеточных структур, тканей и органов включения в рацион ПКД и сукцината Методы исследований Физиологические Биохимические Статистические Внедрение результатов научных исследований Учебный процесс: Московская ГАВМиБ Курский ИСО (филиал) РГСУ Сельскохозяйственные предприятия разных форм собственности Курской области Рис.1. Схема исследований 46 Для решения поставленных задач: 1. Кровь для исследований брали у цыплят-бройлеров кросса «ISA» в 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте, у цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» в 1, 15 и 60 суточном возрасте из вен шеи после умерщвления декапитацией, и из подкрыльцовой вены. Кровь стабилизировали средой Алсвера. У свиней кровь отбирали из вены хвоста путем надрезания его вентральной части, у крупного рогатого скота – из яремной вены. Кровь стабилизировали гепарином из расчета 4-6 единиц на 1мл крови. Стабилизированную кровь в термосе со льдом (+40С) доставляли через 20-30 мин в лабораторию, для последующего анализа. Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования в рефрижераторной центрифуге (+4…100C) в течение 30 мин при 3000 оборотах. Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическим раствором. 2. Печень, почки, фрагменты скелетной мускулатуры и сердце брали у цыплят кросса «ISA» в 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте, у цыплят кросса «Бройлер-6» в 1, 15 и 60 суточном возрасте, в количестве 2-5 г и сразу же помещали в термос со льдом для транспортировки в лабораторию. 3. Исследования влияния кормовых добавок проводили на четырех группах цыплят кроссов «Бройлер-6» и «ISA». Из суточных цыплят каждого кросса живой были сформированы по четыре группы 100 голов в каждой: три группы опытные и одна – контрольная. Птицу содержали в групповых клетках, плотность посадки, фронт кормления и поения, а также санитарногигиенические условия содержания птицы соответствовали современным рекомендациям. Кормление экспериментальных цыплят проводили комбикормами с пониженным уровнем протеина, в 100 г которых содержалось 18–20 % сырого протеина и 295–310 ккал обменной энергии. Для доведения уровня протеина в комбикорме до рекомендуемых норм использовали протеиновую кормовую добавку из отходов кожевенного производства (опытные группы 1 47 и 2), мясокостную муку и сухое обезжиренное молоко (опытные группы 3 и 4). Схема проведения опытов и дозы даваемых препаратов представлены в таблице 2. Питательность рационов цыплят групп опыта представлена в таблице 3. Во время опытов осуществляли контроль состояния здоровья животных, вели наблюдение за приемом и поедаемостью корма, учитывали их реакцию на различные внешние раздражители. Отмечено, что скармливание препаратов в указанных дозах (табл. 2) не вызывает видимых изменений в поведении и клиническом состоянии цыплят. Таблица 2. Дозы препаратов Ингредиенты рациона 1 (опыт) Основной 95 комбикорм, % жир, % 2 Мясокостная мука, % Протеиновая 3 кормовая добавка, % Сукцинат натрия, мг/кг живой массы Группы опыта 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контр.) 95 93 93 2 - 2 5 2 5 3 - - 25 25 - Таблица 3. Питательность рационов В 100 г кормоГруппы опыта смеси содержит1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) ся, г: сырого 20,050,61 20,050,61 20,160,93 протеина золы 6,600,26 6,600,26 6,610,84 кальция 1,590,54 1,590,54 1,830,91 фосфора 1,870,04 1,870,04 1,830,03 * - по сравнению с контрольной группой 4(контр.) 20,160,93 6,610,84 1,830,91 1,830,03 Содержание в кормосмесях опытных и контрольной групп (табл. 3) сырого протеина, кальция и фосфора существенно не отличалось (P>0,05). 48 Кормление производилось в соответствии с нормами, рекомендованными ВИЖем. Оценка питательности кормов и балансирование производилось по таблицам Томмэ М.Ф. (1963), Калашникова А.П. и др. (2003). 5. В сыворотке крови исследовали содержание общего белка на рефрактометре RFL-1, концентрацию общего кальция, неорганического фосфора устанавливали с использованием наборов «Био-Ла-Тест» фирмы «Лахема» с последующим спектрофотометрированием, фракции белка методом нефелометрии и электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (Кондрахин И.П., 1985, 2004; Симонян Г.А. идр., 1995). Биохимические исследования: 1. Субклеточные фракции (ядра, митохондрии, лизосомы) выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующим двухкратным промыванием каждой фракции в 50 - мМ трисHCl буфере (рН 7,4) по методике Chauveau J. et al.(1956). 2. Выделение ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров. Для изучения АТФаз, локализованных в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов птиц нами был разработан метод выделения этих мембран. Известные методы выделения биомембран имеют определенные недостатки. Так методы, разработанные Seligy V., Miyagi M. (1969) и Шкорбатова Ю.Г. и Шахбазова В.Г. (1982, 1992) предполагают для разрушения цитоплазматических мембран эритроцитов использование детергентов (сапонин, тритон Х-100), что приводило по нашим данным к разрушению не только цитоплазматических, но и ядерных мембран. Метод выделения ядер из тканей Шово и др. (Chauveau J., Moule Y., Rauiller C., 1956), основан на гомогенизации ткани ножевым гомогенизатором с последующим градиентным центрифугированием в растворе сахарозы, оказался неприемлем вследствие полного разрушения, как цитоплазматической мембраны, так и ядер эритроцитов, и невозможности их дифференцировать центрифугированием. Использование 49 метода получения теней эритроцитов млекопитающих Keeton K.S., Kaneko I.I. (1972) путем гемолиза эритроцитов дистиллированной водой приводило в наших опытах к агглютинации мембранных структур. Учитывая вышеизложенное, нами для выделения мембран эритроцитов и ядер был выбран метод замораживания-оттаивания в растворе сахарозы, содержащем 50 ммольл-1 трис-H2S04 буфер (pH 7,4) с последующим центрифугированием 30 мин при 1000 обмин-1. В результате серии опытов было установлено, что оптимальным является 1, 375 мольл-1 (=1,176) раствор сахарозы, а наиболее полное разрушение клеток и выход ядер происходит при 3-х кратном замораживании оттаивании. 3. АТФазную активность определяли методами: а) Keeton, K.S., 1972, при этом активность Na+,К+ - АТФазы рассчитывали по разности между общей АТФазой и уабаиннечувствительной АТФазой. При определении общей АТФазной активности смешивали 0,05 мл суспензии эритроцитов или гомогената тканей с 1,4 мл стандартной среды (150 мМ NaCl; 5,0 мМ KCl; 25 мМ трис-HCl; рН – 8,0). Затем к полученной суспензии добавляли 0,2 мл субстратной среды (3 мМ Na2АТФ, 3 мМ MgCl2) и пробы инкубировали в течение 45 мин при температуре 370С. Реакцию прекращали путем добавления 1,8 мл 6%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали при 00С и в надосадочной жидкости определяли содержание неорганического фосфора. При определении Mg2+-АТФазы, т.е. уабаиннечувствительной АТФазы в субстратную среду вводили 10-4 М уабаина (строфантина G), который подавлял активность Na+,K+-АТФазы. б) Иващенко А.Т. и др.,1981. при этом активность АТФаз оценивали по приросту неорганического фосфата после инкубации при 370С и выражали в наномолях неорганического фосфата (Фн) отщепленного 1 мг белка в 1 мин. При этом активность Mg2+ - АТФазы определяли в 50 мМ трис-H2S04 буфере (pH 7,4) содержащем 60 мМ NaCl, 2 мМ АТФ и 2 мМ MgCl2. Активность Na+, K+ - АТФазы измеряли в той же среде, заменяя 15 мМ NaCl на 15 мМ 50 KCl. Ca2+-АТФазную активность определяли, внося в среду 510-4 M CaCl2. Уровень HCO3--АТФазной активности оценивали по приросту неорганического фосфата при замене 30 мМ NaCl на 30 мМ NaHCO3. 4. Неорганический фосфат определяли спектрофотометрическим методом (Кондрашова М.Н. и др., 1965) при длине волны 390нм. Данный метод основан на изменении поглощения молибдата в не восстановленном комплексе фосфорномолибденовой кислоты. Он позволяет с большой точностью определять неорганический фосфор в присутствии легкогдролизируемых фосфорных эфиров, а также по методу Чена (1957) в модификации Казеннова А.М. и соавт. (1984). 5. Концентрацию белка в гомогенате и субклеточных фракциях определяли методом Lowry et al (1951), а также методом Варбурга и Кристиана (Досон Р., 1991), экстинкцию измеряли при длине волны 260 и 280 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Для вычисления концентрации белка использовали формулу: C(белка) = 1,55А2800,76А260 (мг/мл) 6. Белковые фракции сыворотки крови оценивали электрофоретически на мембранах из ацетата целлюлозы «Владипор» МФАС–ОС–1. 7. Изучения скорости всасывания ПКД. Мы осуществляли ее предварительный гидролиз (t=380C) пепсином в растворе HCl (рН 2,0) 1 час, после чего нейтрализовали раствор 5М NaOH до рН 8,0. Далее проводили гидролиз трипсином (рН 9,0) 1 час. Этот раствор смешивали с физиологическим раствором (контроль) в соотношении 1:5. Для оценки уровня энергозависимого транспорта веществ в раствор добавляли глюкозу – 0,27%, пируват – 6,4 мМ и фумарат – 7 мМ, являющиеся основными энергетическими метаболитами (Доссон Р., 1991). Для моделирования перистальтики кишечника была разработана и смонтирована лабораторная установка, включающая две емкости, имеющие относительную подвижность и разделенные полупроницаемой мембраной, выполненной из стенки тонкого отдела кишечника, снабженная поршнем с 51 приводом (рис. 2). На данное устройство нами получен патент на полезную модель № 51337. На стеклянную трубку с поршнем закрепляли фрагмент стенки тонкого отдела кишечника слизистой оболочкой внутрь. В трубку заливали 5 мл физиологического раствора (контроль) или раствора, содержащий энергетические метаболиты (опыт), оставляя воздушный промежуток 2 см. до поршня. Через каждые 30 мин из раствора отбирали пробы для определения оптической плотности при длине волны 280 нм. Трубку с фрагментов стенки кишечника помешали в сосуд, содержащий исследуемый образец. Ритмические движения, подсоединенного к шкиву с электромотором поршня, моделировали перистальтические сокращение кишечника. 1 2 3 4 5 6 Рис. 2. Схема устройства для определения скорости всасывания (1 – шкив на валу электромотора, 2 – поршень, 3 – стеклянная трубка, 4 – физиологический раствор, 5 – сосуд с исследуемым раствором, 6 – фрагмент стенки кишечника) В опытных и контрольных пробах количество протеина было равным, и концентрация его составляла 10 г в 1 л физиологического раствора. Изучение проводили одновременно в одинаковых условиях при температуре 3738˚С. 52 Количественное определение протеина и аминокислот, перенесенных через мембрану, оценивали спектрофотометрически (λ = 280 нм.). В работе использовали реактивы фирм Sigma, Merk, наборы реактивов «Био-Ла-Тест» фирмы «Лахема» и реактивы отечественного производства (ч.д.а.). Полученные в ходе исследований данные подвергались биометрической обработке (Корниш-Боуден Э., 1983; Варфоломеев С.Д., 1999; Дерффель К.,1994; Геккелер К.,1994; Крутов В.И., 1989, Макарова Н.Я., Трофимец В.Я., 2002, Кутейников А.Н., 2008) на ПЭВМ с использованием MS Excel и STATISTICA 6,0. 53 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Транспорт веществ и АТФазная активность органов и тканей цыплят-бройлеров Моделирование энергозависимого транспорта белков и аминокислот в кишечнике цыплят-бройлеров Скорость активного и пассивного переноса веществ через стеку кишечника представлена на рис. 3. Анализ рисунка показывает, что в физиологическом растворе скорость переноса была постоянна и практически линейно возрастала во времени. Это по нашему мнению связано с пассивным переносов веществ через мембранные структуры. Добавление энергетических субстратов в раствор сопровождалось ускорением транспорта. При этом время достижения максимальной концентрации веществ сокращалось с 48 часов до 8. 0,6 Экстинкция 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 4 8 16 24 36 48 Время, час активный транспорт пассивный перенос Рис. 3. Скорость переноса веществ, (n=5), P0,05 С целью выявления степени влияния времени и энергетических субстратов был проведен двухфакторный дисперсионный анализ скорости переноса 54 веществ. В качестве независимых переменных были определены: А – время, В – добавление в среду энергетических метаболитов. В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации скорости переноса пептидов от независимых факторов. Скорость переноса веществ на 71% (P0,05) детерминирована временем опыта и на 27% (P0,05) добавлением в раствор энергетических метаболитов. Активность общей АТФазы эритроцитов цыплят-бройлеров и влияние на неё ионов электролитов и ингибиторов Нами была проведена серия опытов по выявлению оптимальной концентрации и соотношению ионов электролитов в инкубационной среде для определения общей АТФазной активности эритроцитов птицы, влияния ингибиторов на активность АТФазы (рис.4-6, табл. 4). В результате проведенных исследований было установлено, ионы натрия, калия и магния оказывали активирующее действие на активность АТФазы в разных диапазонах концентраций, так максимальная АТФазная активность проявляется при концентрациях ионов: натрия – 115-145 (рис. 4), ионов калия – 19-28 (рис. 5), ионов магния – 2,0-4,0 ммоль·мл-1 (рис. 6). 55 АТФазная активность, нмоль Фн/мг белка в мин 10 9 8 7 6 5 4 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 Концентрация натрия, ммоль/л Рис. 4. Влияние ионов натрия на активность АТФазы, (n=10), P0,05 АТФазная активность, нмоль Фн/мг белка в мин 5,5 5 4,5 4 3,5 3 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 Концентрация калия, ммоль/л Рис.5. Влияние ионов калия на активность АТФазы, (n=10), P0,05 56 АТфазная активность, нмоль Фн/мг белка в мин 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Концентрация магния, ммоль/л Рис.6. Влияние ионов магния на активность АТФазы, (n=10), P0,05 С целью установления степени влияния ионов Na+, К+ и Mg2+ на активность АТФазы был проведен однофакторный дисперсионный анализ. В качестве назависимой переменной была определена активность АТФазы при наличии в среде инкубации соответствующего иона. За нулевую точку отсчета принимали активность фермента в среде без добавления ионов. В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности фермента от независимого фактора. Активность АТФазы была на 76,5% детерминирована ионами магния, на 96,5% ионами натрия и на 47,6% ионами калия. Изучение комбинаций оптимальных концентраций этих ионов показало, что максимальная АТФазная активность отмечалась в инкубационной среде, содержащей: Na+ - 120 ммоль·мл, К+ - 20 ммоль·мл; Mg2+ - 3,0 ммоль·мл (табл. 1) и составляла 9,240,23 нмоль Фн ·мг белка-1·мин-1. 57 Таблица 4. Влияние комбинаций ионного состава на активность АТФазы, (n=10) № Ионы инкубационной среды Активность АТФазы, нмоль Фн среды ·мг белка-1·мин-1 1 Na+, К+, Mg2+ 9,330,07*** + 2+ 2 Na , Mg 8,420,07*** + 2+ 3 К , Mg 7,180,09*** 2+ 4 Mg 5,400,06*** 5 3,970,08 *** - P0,001 по сравнению с активностью АТФазы в среде №5 Для оценки силы влияния комбинаций ионов на АТФазную активность был проведен однофакторный дисперсионный анализ. В качестве независимой переменной был определен ионный состав среды инкубации. За нулевую точку отсчета принимали активность фермента в среде без добавления ионов. В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности фермента от независимого фактора. Активность АТФазы на 92% детерминирована (P0,05) добавлением в среду инкубации ионов Mg2+, на 98% добавлением ионов К+, Mg2+ и на 99% - ионов Na+ , Mg2+ и Na+, К+, Mg2+. Полученные результаты указывают на то, что ионы натрия играют основную регуляторную роль в активности фермента. В связи с тем, что истинным субстратом АТФаз является комплекс Mg2+-АТФ ионы магния так же оказывали существенное воздействие на активность АТФазы. В то же время ионы калия проявляют наименьшее влияние на активность фермента. Анализ этих данных позволяет предположить, что величина транспорта веществ, а, следовательно, и активность АТФазы существенно зависит от количества натрия и магния в плазме крови. Таким образом, избыток или недостаток этих ионов в кормах цыплят-бройлеров может отражаться на уровне межклеточного обмене веществ, вызывая его существенные нарушения. В связи с тем, что в ряде литературных источников (Р.А.Степанян, А.А.Симоняна, 1983; Ю.В.Фурман, 1991, 2001) показано, что применение уа58 баина (строфантина G) не вызывает существенного подавления активности АТФазы эритроцитов птиц, мы провели изучение влияния строфантина-K на данную АТФазу. Строфантин G и К – алкалоиды, выделенные из семян тропических лиан Strophanthus gratus и Strophanthus kombe соответственно. Строфантин K отличается по химической структуре от строфантина G по углеводной части соответственно b-D-глюкоза (или b-D-цимароза) и -L-рамноза. Строфантин-К в наших исследованиях не оказывал достоверного (P0,05) влияния на активность АТФазы эритроцитов как в среде содержащей ионы натрия и калия, так и в среде без них (рис. 7). АТФазная акивность, нм Фн/мг белка в мин 10 9 8 7 6 5 4 0 2 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Концентрация строфантина К, ммоль/л Mg2+ Mg2+, Na+, K+ Рис. 7. Влияние строфантина К на активность АТФазы в среде без ионов Na+ и К+ и в среде содержащей эти ионы в оптимальной концентрации, (n=10), P0,05 Это подтверждается однофакторным дисперсионным анализом данных, коэффициент детерминации влияния строфантина-К в среде без ионов на ак59 тивность АТФазы составляли 3,9% (Р>0,05), в среде с ионами Na+, К+, Mg2+ 2,5% (P0,05). Регрессионный анализ показал, что уравнения АТФазной активности линейны и практически параллельны оси абсцисс, что подтверждает отсутствии зависимости активности фермента от концентрации ингибитора как в среде содержащей ионы Na+ и К+, так и без них (рис. 8 и 9). Активность АТФаз АТФазная активность = 5,9652+0,0012*x 6,12 6,10 6,08 6,06 6,04 6,02 6,00 5,98 5,96 5,94 5,92 5,90 -20 0 20 40 60 80 100 120 95% confidence Mg2+ Рис. 8. Регрессионный анализ влияния строфантина К на АТФазную активность в среде без ионов Na+ и К+. Активность АТФаз АТФазная активность = 9,2562+0,0007*x 9,40 9,38 9,36 9,34 9,32 9,30 9,28 9,26 9,24 9,22 9,20 9,18 9,16 9,14 9,12 9,10 9,08 -20 0 20 40 Mg2+, Na+, K+ 60 80 100 120 95% confidence Рис. 9. Регрессионный анализ влияния строфантина К на АТФазную активность в среде содержащей ионы Na+ и К+. 60 Выделение ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров Для выделения ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят был применен способ трех кратного замораживания оттаивания в растворе сахарозы с последующим центрифугированием (рис.10-13). После третьего цикла замораживания-оттаивания получали чистую от не разрушенных клеток фракцию ядер (рис 12) и теней эритроцитов (рис.13). Рис. 9. Частичный гемолиз эритроцитов после первого замораживанияоттаивания. Видны не разрушенные ядерные клетки. Рис. 10. Микроскопическая картина суспензии эритроцитов после второго замораживания-оттаивания. Видны тени эритроцитов и ядра. 61 Рис. 11. В осадке ядра эритроцитов (после третьего замораживанияоттаивания и центрифугирования). Рис. 12. В супернатанте «тени» эритроцитов (после третьего замораживания-оттаивания и центрифугирования). 62 Влияние ионов электролитов на АТФазную активность ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров Изучение влияния ионов Na+, K+, Ca2+ и HCO3- на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров суточного возраста (табл. 5.) показали, что АТФазная активность цитоплазматических мембран эритроцитов достоверно выше, чем ядер, за исключением HCO3--АТФазы ядер, которая была достоверно выше активности этого фермента цитоплазматических мембран. Таблица 5. Показатели АТфазной активности цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят суточного возраста (нмоль Фн мг белка-1·мин-1) и результаты дисперсионного анализа, (n=10) АТФаза Мембраны Цитоплазматическая Коэфф. детерминации F P Ядерная Коэфф. детерминации F P Mg2+- Na+,K+- Ca2+- HCO3-- 8,320,12 - 12,370,13 0,97** 10,360,14 0,87** 12,150,13 0,96** 4,890,18 - 531,53 (P0,01) 5,080,14 0,03 125,99 (P0,01) 5,050,15 0,02 484,24 (P0,01) 14,610,43 0,96** - 0,63 (P0,05) 0,41 (P0,05) 429,37 (P0,01) С целью выявления степени влияния ионов на АТФазы ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен однофакторный дисперсионный анализ. Независимым фактором при этом служило наличие в среде инкубации соответствующего иона. За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+-АТФазы. Дисперсионный анализ показал, что ионы Na+ и K+ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, ионы Ca2+ - на 87% и HCO3- анион - на 96% (P0,01). 63 Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na+,K+ и Ca2+ (P>0,05) и была детерминирована ионами HCO3- на 96% (P0,01). С целью выяснения степени влияния ионного состава среды инкубации и возраста на активность АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ (табл. 6). В качестве независимых переменных были определены: А – возраст цыплят - 10, 20, 30 и 40 суток, Б – ионный состав среды. За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+-АТФазы в контрольной группе. Таблица 6. Коэффициенты детерминации возраста и ионного состава среды инкубации на активность АТФаз, (n=40) Коэффициенты детерминации Na+, K+ Ca2+ HCO3Цитоплазматическая мембрана фактор А (возраст) 0,5480* 0,7250* 0,3610* фактора Б (ионный состав) 0,3450* 0,1290* 0,5230* Ядра фактор А (возраст) 0,9190* 0,9230* 0,0283* фактора Б (ионный состав) 0,0004 0,010* 0,8490* * - P0,05 В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности ферментов от независимых факторов. Наибольшее влияние на активность Na+, K+- и Ca2+-АТФаз цитоплазматических мембран и ядер оказывал возраст цыплят. Изменение ионного состава среды оказывало различное влияние на АТФазы, локализованные в цитоплазматической и ядерной мембране. АТФазная активность цитоплазматической мембраны эритроцитов была на 34,5% детерминировали ионами Na+, K+, на 12,9% - ионами Ca2+ и на 52,3% - ионами HCO3-. В то же время ионы Na+, K+ и Ca2+ практически не влияли на АТФазную активность ядер, а анион HCO3- детерминировал ее на 84,9%. Это, по-видимому, связано с отсутствием в ядерных мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров Na+,K+- чувствительной АТФазы. 64 Высокий уровень HCO3--АТФазы ядерных оболочек и цитоплазматических мембран можно объяснить усиленными энергетическими процессами, происходящими в эритроцитах цыплят суточного возраста. В связи с вышеизложенным, нами в дальнейших исследованиях для определения активности АТФаз был выбран метод Иващенко А.Т. и др. (1981). Активность Mg2+-АТФазы определяли в 50 ммольл-1 трис-H2S04 буфере (pH 7,4) содержащем 60 ммольл-1 NaCl, 2 ммольл-1 АТФ и 2 ммольл-1 MgCl2. Активность Na+, K+-АТФазы измеряли в той же среде, заменяя 15 ммольл-1 NaCl на 15 ммольл-1 KCl. Ca2+-АТФазную активность определяли, внося в среду 510-4 мольл-1 CaCl2. Уровень HCO3--АТФазной активности оценивали по приросту неорганического фосфата при замене 30 ммольл-1 NaCl на 30 ммольл-1 NaHCO3. 65 Влияние ПКД и сукцината на активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» Активность АТФаз цыплят 10 суточного возраста была существенно ниже, чем у цыплят 20, 30 и 40-суточного возраста, что, по-видимому, связано с возрастными особенностями строения эритроцитов (табл.7). На величину активности Mg2+-АТФазы оказывали достоверное (P0,05) влияние изучаемые препараты, что подтверждается результатами регрессионного анализа (рис.14-17). Таблица 7 Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» (n=640) АТФаза 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 10 сут 2+ Mg 10,390,08*** 10,020,14** 8,710,11*** 9,460,13 + + Na ,K - 12,080,06*** 11,750,07*** 11,050,09 11,090,11 2+ Ca 11,110,16*** 11,000,09*** 10,560,09** 10,230,05 HCO3 - 13,480,08** 13,240,05* 12,970,43 12,730,20 20 сут 2+ Mg 12,610,20*** 12,530,38*** 10,540,11 10,510,16 + + Na ,K - 15,160,11*** 14,530,12*** 12,690,09*** 12,220,09 Ca2+14,250,13*** 13,930,21*** 12,590,13*** 11,570,15 HCO3 - 17,270,12*** 17,480,14*** 15,630,12*** 14,910,09 30 сут 2+ Mg 13,390,11*** 12,940,10*** 11,330,15* 10,930,15 + + Na ,K - 15,870,10*** 15,040,14*** 13,160,12* 13,630,16 2+ Ca 15,400,12*** 15,220,11*** 13,190,12*** 12,320,11 HCO3 - 21,700,13*** 21,310,13*** 17,940,11*** 16,890,15 40 сут 2+ Mg 15,390,13*** 14,890,14*** 11,780,15** 12,740,26 + + Na ,K - 17,400,17*** 16,880,20*** 13,970,17* 14,510,20 2+ Ca 16,400,15*** 16,130,14*** 14,710,18*** 13,530,25 HCO3 - 27,470,08*** 27,240,19*** 23,370,19* 22,790,23 *- по сравнению с контрольной группой 66 Активность Mg 2+-АТФазы = 8,998+0,1579*x 16 15 14 13 12 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 17 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 14. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы = 8,838+0,1503*x 16 15 14 13 12 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 17 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 15. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 67 Активность Mg2+-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 8,0872+0,1001*x 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 13 12 11 10 9 8 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 16. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 8,3473+0,1025*x 14 13 12 11 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 15 10 9 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 17. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 68 Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности Mg2+-АТФазы в зависимости от скармливаемых препаратов показали, что у цыплят опытной группы 1, получавшей ПКД, рост активности Mg2+-АТФазы происходил более интенсивно по сравнению с другими группами, а наименьшие значения он имел в опытной группе 3, получавшей сукцинат. Уравнения регрессии динамики активности Mg2+-АТФазы: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=8,998+0,1579x y=8,838+0,1503x y=8,0872+0,1001x y=8,3473+0,1025x Двухфакторный дисперсионный анализ влияния возраста и кормовых добавок на активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят показал, что она была детерминирована возрастом на 59% (P0,001) и кормовыми добавками на 29% (P0,001). Активность Na+,K+-АТФазы (рис. 18-21) была достоверно (P0,05) выше во всех опытных группах, по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы. Применение препаратов оказывало существенное влияние на уровень активности Na+,K+-АТФазы. Следует отметить, что разность активности данной АТФазы во всех опытных труппах по сравнению с контролем была достоверной (P0,05). 69 Активность Na+,K +-АТФазы = 10,9619+0,1666*x 18 17 16 15 14 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 19 13 12 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 18. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 10,5729+0,159*x 18 17 16 15 14 13 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 19 12 11 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут + + Рис. 19. Активность Na ,K -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 70 Активность Na+,K +-АТФазы = 10,4096+0,0924*x 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 15,5 11,5 11,0 10,5 10,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 20. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 9,9405+0,1169*x 15 14 13 12 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 16 11 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 21. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 71 С возрастом отмечался интенсивный прирост активности этой АТФазы, что подтверждается уравнениями регрессии: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=10,9619+0,1666x y=10,5729+0,159x y=10,4096+0,0924x y=9,9405+0,1169x Наибольший прирост ферментативной активности был отмечен в группах опыта 1 и 2, описываемых следующими уравнениями регрессии: y=10,9619+0,1666x и y=10,5729+0,159x, соответственно, а наименьший - в 3 опытной группе: y=10,4096+0,0924x, что, по-видимому, связано с увеличением активного транспорта под влиянием ПКД и сукцината. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 62,2% (P0,001) и кормовыми добавками на 29,2% (P0,001). Активность Ca2+-АТФазы с возрастом существенно увеличивалась (рис.22-25) что, вероятно, связано с достоверным увеличением концентрации кальция в сыворотке крови цыплят. 72 Активность Ca2+-АТФазы = 10,0344+0,1702*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 22. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 9,9011+0,1669*x 17 16 15 14 13 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 18 12 11 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 23. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 73 Активность Ca2+-АТФазы = 9,5015+0,1304*x 15 14 13 12 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 16 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 24. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 9,2499+0,1064*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 15 14 13 12 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 25. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 74 Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности Ca2+-АТФазы в зависимости от скармливаемых препаратов (табл. 6) показали, что наибольший прирост активности Ca2+-АТФазы с возрастом отмечен в группах опыта 1 и 2, а наименьший в контрольной группе 4: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=10,0344+0,1702x y=9,9011+0,1669x y=9,5015+0,1304x y=9,2499+0,1064x Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 67,8% (P<0,001) и кормовыми добавками на 23,8% (P<0,001). Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров достоверно (Р0,05) выше в группах опыта 1, 2 и 3 по сравнению с контрольной группой (рис. 26-29). Это, вероятно, связано, с активирующим действием анионов ПКД и сукцината на данную АТФазу. Активность HCO3--АТФазы = 8,384+0,4638*x - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 26. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 75 Активность HCO3--АТФазы = 8,3622+0,4583*x - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 27. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 9,0996+0,3351*x 24 22 20 18 16 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 26 14 12 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 28. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 76 Активность HCO3--АТФазы = 8,7903+0,3215*x 24 22 20 18 16 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 26 14 12 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 29. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности HCO3--АТФазы в зависимости от скармливаемых препаратов показали, что в 1 и 2 опытных группах прирост активности был более интенсивным. Наименьший прирост активности этой АТФазы с возрастом отмечен в контрольной группе 4: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=8,384+0,4638x y=8,3622+0,4583x y=9,0996+0,3351x y=8,7903+0,3215x Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 87,6% (P<0,001) и кормовыми добавками на 8,5% (P<0,001). 77 Результаты кластерного анализа АТФазной активности цитоплазматических мембран эритроцитов 10, 20, 30 и 40 суточного возраста представлены на рис. 30-33. Активность АТФаз цитоплазматических мембран цыплят 10 суточного возраста Степень близости параметров 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 3 (опыт) 4 (контр.) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 30. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 10 суточного возраста Активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 20 суточного возраста 13 12 Степень близости параметров 11 10 9 8 7 6 5 4 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 31. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 20 суточного возраста 78 Активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 30 суточного возраста 16 Степень близости параметров 14 12 10 8 6 4 2 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 32. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 30 суточного возраста Активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 40 суточного возраста 16 Степень близости параметров 14 12 10 8 6 4 2 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 33. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 40 суточного возраста Анализ дендрограмм показывает, что у цыплят 10 суточного возраста в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 2 с наиболее близкими показателями, затем с меньшей степенью однородности с этим кластером объеди79 няется контрольная группа 4 и наибольшие отличия наблюдаются с опытной группой 3. У цыплят 20, 30 и 40 суточного возраста объединение групп в кластеры сходно и происходит по другому принципу. Так в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 2, во второй кластер объединяются группа опыта 3 и контрольная группа 4, и затем с наименьшей однородностью происходит объединение этих двух кластеров в кластер 3. Это говорит о том, что активности АТФаз групп опыта, объединенных в 1-й и 2-й кластер, имеют близкие значения. Содержание белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» Содержание белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров достоверно повышалось с возрастом (рис.34-37). На возрастную динамику концентрации белка существенное влияние оказывали, так же, кормовые добавки. Белок, мг = 0,9618+0,0125*x 1,6 1,5 1,4 Белок, мг 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 34. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров опытной группы 1 80 Белок, мг = 0,9482+0,0083*x 1,35 1,30 1,25 Белок, мг 1,20 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 35. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров опытной группы 2 Белок, мг = 0,8331+0,01*x 1,35 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 36. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров опытной группы 3 81 Белок, мг = 0,911+0,0059*x 1,35 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 37. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров контрольной группы 4 Регрессионный анализ зависимости содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят по группам опыта позволил установить следующие закономерности: 1 (опыт) – y=0,9618+0,125x; 2 (опыт) y=0,9482+0,0083x; 3 (опыт) - y=0,8331+0,01x и 4 (контроль) - y=0,911+0,0059x. Таким образом, наибольшая динамика отмечалась в опытной группе 1, получавшей ПКД. С целью установления силы влияния возраста и кормовых добавок на концентрацию белка в цитоплазматических мембранах был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, который показал, что возраст детерминировал этот показатель на 59%, а применение кормовых добавок на 21% с высокой степенью достоверности (P0,001), что говорит не только об определенных изменениях в мембране эритроцитов с возрастом животных, но и вероятно, об увеличении биосинтеза мембранных белков, в частности АТФаз. 82 Влияние кормовых добавок на активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» Активность АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров при скармливании им ПКД и сукцината (табл.8) была достоверно ниже (Р0,05), чем цитоплазматических мембран. С возрастом отмечается достоверное изменение ферментов этих структур, что подтверждается регрессионным анализом (рис. 38-41) Таблица 8 Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» (n=640) АТФаза 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 10 сут 2+ Mg 4,490,10 4,510,07 4,450,08 4,430,07 + + Na ,K - 4,550,10 4,540,06 4,650,12 4,470,11 2+ Ca 4,600,12 4,520,09 4,590,08 4,490,12 HCO3 - 10,150,11 14,310,08*** 12,070,13*** 10,050,07 20 сут 2+ Mg 5,080,05*** 5,160,06*** 5,120,07*** 4,600,06 + + Na ,K - 5,100,07*** 5,130,15** 5,120,20* 4,610,10 2+ Ca 5,280,09*** 5,430,08*** 5,300,11*** 4,810,08 HCO3 - 9,560,11 12,900,16*** 10,440,13*** 9,530,08 30 сут 2+ Mg 6,320,10*** 6,620,07*** 6,280,08*** 5,840,06 + + Na ,K - 6,380,11** 6,390,11** 5,970,07 5,950,07 2+ Ca 6,680,12*** 6,930,13*** 6,470,12** 6,160,08 HCO3 - 9,250,11 12,080,10*** 9,820,09* 9,500,11 40 сут 2+ Mg 7,010,08 7,530,07* 6,950,17 7,050,17 + + Na ,K - 6,910,10 7,460,09* 7,020,19 7,090,14 2+ Ca 7,320,10 7,770,06** 7,390,12 7,400,09 HCO3 - 8,640,10* 10,220,15*** 9,350,18* 8,970,13 *- по сравнению с контрольной группой 83 Активность Mg 2+-АТФазы = 3,522+0,0881*x 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 7,5 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 38. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы = 3,3234+0,1052*x 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 5,0 4,5 4,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 39. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 84 Активность Mg2+-АТФазы = 3,5368+0,0866*x 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 5,0 4,5 4,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 40. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы = 3,2099+0,0909*x 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 41. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 85 Активность Mg2+-АТФазы у цыплят 10, 30 и 40 суточного возраста всех групп опыта была достоверно (Р0,05) выше, чем в контроле. У цыплят 20 суточного возраста достоверные (Р0,05) отличия от контроля отмечены только в 1 и 2 опытной группах. Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности Mg2+-АТФазы ядер в зависимости от скармливаемых препаратов показали, что с возрастом отмечался существенный прирост активности Mg2+-АТФазы. Следует отметить, что наибольший прирост ферментативной активности отмечался в опытной группе 2, при совместном скармливании препаратов: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=3,522+0,0881x y=3,3234+0,1052x y=3,5368+0,0866x y=3,2099+0,0909x Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 90,0% (P<0,001) и кормовыми добавками на 2,3% (P0,001). Активности Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов у цыплят всех опытных групп 10, 20 и 40-суточного возраста не имела достоверных (P0,05) отличий по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы (рис. 42-45). Это подтверждает полученные ранее данные об отсутствии в ядерных мембранах Na+,K+-чувствительной компоненты. 86 Активность Na+,K +-АТФазы = 3,6452+0,0837*x 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 7,5 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 42. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 3,3719+0,1004*x 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,5 5,0 4,5 4,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 43. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 87 Активность Na+,K +-АТФазы = 3,6981+0,0798*x 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 5,0 4,5 4,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 44. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 3,2284+0,092*x 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 45. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 88 Общая динамика изменения Na+,K+-АТфазной активности аналогична динамике Mg2+-АТФазы и описывается практически сходными уравнениями регрессий: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=3,6452+0,0837x y=3,3719+0,1004x y=3,6981+0,0798x y=3,2284+0,092x Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров была детерминирована возрастом на 86,1% (P0,001) и кормовыми добавками на 1,3% (P0,001). Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров (рис. 46-49) была достоверно выше (P0,05) по сравнению с активностью Mg2+АТФазы в опытных группах 1 и 2, получавших ПКД. Это, вероятно, связано с большим содержанием кальция в препарате. Активность Ca2+-АТФазы = 3,5848+0,0954*x 8,5 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 46. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 89 Активность Ca2+-АТФазы = 3,3529+0,1123*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут 2+ Рис. 47. Активность Ca -АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 3,5434+0,0958*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 48. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 90 Активность Ca2+-АТФазы = 3,1963+0,1008*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 49. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов в зависимости от скармливаемых препаратов показали, что наибольший прирост ферментативной активности отмечался в опытной группе 2, при совместном скармливании препаратов: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=3,5848+0,0954x y=3,3529+0,1123x y=3,5463+0,0958x y=3,1963+0,1008x Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров была детерминирована возрастом на 90,8% (P0,001) и кормовыми добавками на 1,7% (P0,001). Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов была достоверно выше по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы, в среднем в 2,5 раза, что говорит о наличии в мембранах ядер HCO3--чувствительной АТФазы, сходной, по- 91 видимому, с сопрягающим фактором Рэкера и участвующей в энергообеспечении клеток (рис. 50-53). Возрастные изменения активности HCO3--АТФазы ядер имеют существенно отличающуюся динамику от других, изученных АТФаз. Так, наибольшая активность этого фермента отмечена у цыплят 10 суточного возраста и по мере роста цыплят происходит снижение АТФазной активности, что, повидимому, связано со снижением энергетической роли ядер с возрастом. Активность HCO3--АТФазы = 10,6072-0,0482*x 10,8 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 10,6 10,4 10,2 10,0 9,8 9,6 9,4 9,2 9,0 8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут - Рис. 50. Активность HCO3 -АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 92 Активность HCO3--АТФазы = 15,6501-0,131*x 15 14 13 12 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 16 11 10 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут - Рис. 51. Активность HCO3 -АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 12,6189-0,088*x - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 13,0 12,5 12,0 11,5 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут - Рис. 52. Активность HCO3 -АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 93 Активность HCO3--АТФазы = 10,334-0,0328*x - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 10,6 10,4 10,2 10,0 9,8 9,6 9,4 9,2 9,0 8,8 8,6 8,4 8,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 53. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Примененные препараты значительным образом отражались на динамике прироста АТФазной активности, что видно по уравнениям регрессии: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=10,6072-0,0482x y=15,6501-0,131x y=12,6189-0,088x y=10,334-0,0328x Так, наибольшее влияние на активность HCO3--АТФазы ядер оказывало совместное применение препаратов (опытная группа 2) и сукцинат (опытная группа 3), что возможно связано с активацией энергетического обмена. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров была детерминирована возрастом на 29,1% (P0,001) и кормовыми добавками на 5,8% (P0,001). Кластерный анализ активности АТФаз ядер эритроцитов цыплятбройлеров 10, 20, 30 и 40 суточного возраста представлен на рис. 54-57. 94 Активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 10 суточного возраста Степень близости параметров 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контр.) 1 (опыт) Рис. 54. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 10 суточного возраста Активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 20 суточного возраста 9,5 Степень близости параметров 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 2 (опыт) 4 (контр.) 3 (опыт) 1 (опыт) Рис. 55. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 20 суточного возраста 95 Активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят 30 суточного возраста 8 Степень близости параметров 7 6 5 4 3 2 2 (опыт) 4 (контр.) 3 (опыт) 1 (опыт) Рис. 56. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 30 суточного возраста Активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят 40 суточного возраста 5,2 Степень близости параметров 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контр.) 1 (опыт) Рис. 57. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 40 суточного возраста Анализ дендрограмм активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 10, 20, 30 и 40 суточного возраста позволил установить, что с возрастом существенно меняется картина объединения групп опыта в кластеры. 96 Так у цыплят 10 суточного возраста в 1 кластер с наибольшей однородностью объединяются группа опыта 1 и контрольная группа 4. Затем с ними объединяется опытная группа 3, образуя 2-й кластер. И, наконец, со 2-м кластером объединяется с наименьшей степенью однородности опытная группа 2. У цыплят 20 и 30 суточного возраста в 1-й кластер объединяются группа опыта 3 и контрольная группа 4, с наиболее близкими показателями активности АТФаз, затем с ними объединяется с чуть меньшей степенью однородности опытная группа 1. Наибольшие отличия наблюдаются с опытной группой 2. У цыплят 40 суточного возраста в 1-й кластер, с наиболее близкими показателями активности АТФаз объединяются группа опыта 1 и контрольная группа 4, затем с меньшей степенью однородности к ним присоединяется опытная группа 3, образуя 2-й кластер и с еще меньшей степенью однородности опытная группа 2. Содержание белка в ядерных мембранах эритроцитов цыплятбройлеров кросса «ISA» Содержание белка в ядерных мембранах эритроцитов цыплятбройлеров достоверно повышалось с возрастом (рис.58-61). На возрастную динамику этого показателя значительное влияние оказывали, так же, кормовые добавки. Регрессионный анализ зависимости содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят по группам опыта позволил установить следующие закономерности: 1 (опыт) – y=0,7078+0,0087x; 2 (опыт) - y=0,7078+0,0057x; 3 (опыт) - y=0,7078+0,0051x и 4 (контроль) y=0,8229+0,0017x. Таким образом, наибольшая динамика отмечалась в опытной группе 1, получавшей ПКД. Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что возраст детерминировал этот показатель на 74%, а применение кормовых добавок только на 3,1% с высокой степенью достоверности (P0,001), что говорит о значительной перестройке ядерных мембран эритроцитов с возрастом животных. 97 Белок, мг = 0,7078+0,0087*x 1,2 1,1 Белок, мг 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 58. Динамика содержание белка в ядерных мембранах цыплятбройлеров опытной группы 1 Белок, мг = 0,7078+0,0057*x 1,05 1,00 0,95 Белок, мг 0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 59. Динамика содержание белка в ядерных мембранах цыплятбройлеров опытной группы 2 98 Белок, мг = 0,7078+0,0051*x 1,05 1,00 0,95 0,90 Белок, мг 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 60. Динамика содержание белка в ядерных мембранах цыплятбройлеров опытной группы 3 Белок, мг = 0,8229+0,0017*x 0,96 0,94 0,92 0,90 0,88 Белок, мг 0,86 0,84 0,82 0,80 0,78 0,76 0,74 0,72 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Возраст, сут Рис. 61. Динамика содержание белка в ядерных мембранах цыплятбройлеров контрольной группы 4 99 Дисперсионный анализ влияния скармливаемых препаратов на активности АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров кросса «ISA» С целью выяснения степени влияния исследуемых препаратов и возраста на активности АТФаз цитоплазматических (табл. 9) и ядерных (табл. 10) мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ. В качестве независимых переменных были определены: А – возраст цыплят, Б – влияние кормовых добавок. За нулевую точку отсчета принимали активность ферментов в контрольной группе. Таблица 9. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа, (n=160) Коэффициенты детерминации 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 2+ Mg -АТФаза фактор А (возраст) 0,613** 0,639** 0,797** фактора Б (добавки) 0,289** 0,216** 0,015** совместное влияние факторов 0,031* 0,032* 0,047* + + Na ,K -АТфаза фактор А (возраст) 0,618** 0,704** 0,869** фактора Б (добавки) 0,307** 0,206** 0,003 совместное влияние факторов 0,037* 0,036* 0,025* 2+ Ca -АТФаза фактор А (возраст) 0,579** 0,610* 0,816* фактора Б (добавки) 0,328** 0,294* 0,082* совместное влияние факторов 0,045** 0,043* 0,012* HCO3 -АТФаза фактор А (возраст) 0,854** 0,863** 0,964** фактора Б (добавки) 0,107* 0,099* 0,007* совместное влияние факторов 0,031* 0,029* 0,001 В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности ферментов от независимых факторов. Активность Mg2+-АТФазы на 61,3 %, 63,9% и 79,7% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах детерминирована возрастом цыплят и на 28,9 % скармливанием ПКД, 21,6% - при совместном скармливании ПКД и сукцината. Использование сукцината (опытная группа 3) оказывало влияние на ак100 тивность этой АТФазы на всего 1,5%. Совместное влияние факторов было так же незначительным: 3,1%, 3,1% и 4,7% соответственно по группам опыта. Активность Na+,K+-АТфазы на 61,8 %, 70,4% и 86,9% детерминирована возрастом цыплят (соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах) и на 30,7 % скармливанием ПКД, 20,6% - при совместном скармливании препаратов. Использование сукцината (опытная группа 3) не оказывало достоверного влияния. Совместное влияние факторов было незначительным: 3,7%, 3,6% и 2,57% соответственно по группам опыта. Практически аналогичное влияние факторов было установлено для активности Ca2+-АТФазы. Возраст влиял на активность этого фермента 57,9 %, 61,0% и 81,6% (соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах). Активность Ca2+-АТФазы была детерминирована на 32,8 % скармливанием ПКД, 29,4 % - при совместном скармливании препаратов и на 8,2% сукцинатом. Совместное влияние факторов было так же незначительным: 4,5%, 4,3% и 1,2% соответственно по группам опыта. Активность HCO3--АТФазы была в большей степени детерминирована возрастом цыплят, соответственно по группам опыта на 85,4 %, 86,3 % и 96, 4 %. В то же время влияние добавок было существенно меньшим - 10,7%, и 9,9 % в группах 1 и 2, получавших ПКД и ПКД совместно с сукцинатом. Влияние сукцината (группа 3) было не существенным 0,7%. Незначительным было так же и совместное влияние факторов – 3,1% и 2,9% соответственно в группах опыта 1 и 2. В таблице 10 приведены коэффициенты детерминации влияния факторов на активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят-бройлеров. Активность Mg2+-АТФазы, Na+,K+-АТфазы и Ca2+-АТФазы ядер почти на 90 %, была детерминирована возрастом цыплят. Влияние добавок и совместное влияние факторов было незначительно 0,9 – 3,9%. 101 Таблица 10. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа, (n=160) Коэффициенты детерминации 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 2+ Mg -АТФаза фактор А (возраст) 0,906** 0,899** 0,888** фактора Б (добавки) 0,013* 0,039* 0,011* совместное влияние факторов 0,013* 0,012* 0,015* + + Na ,K -АТфаза фактор А (возраст) 0,891** 0,893** 0,842** фактора Б (добавки) 0,009* 0,023* 0,006 совместное влияние факторов 0,016* 0,005 0,011 2+ Ca -АТФаза фактор А (возраст) 0,911** 0,908** 0,916** фактора Б (добавки) 0,012* 0,031* 0,009* совместное влияние факторов 0,012* 0,012* 0,007 HCO3 -АТФаза фактор А (возраст) 0,659** 0,259** 0,520** фактора Б (добавки) 0,009 0,614* 0,219* совместное влияние факторов 0,025 0,092* 0,124* Активность HCO3--АТФазы была также детерминирована возрастом цыплят, соответственно по группам опыта на 65,9 %, 25,9% и 52,0 %. Достоверное влияние кормовых добавок было установлено только в группах опыта 2 и 3, получавших сукцинат, соответственно на 61,4% и 21,9%. В этих группах опыта так же выявлено совместное влияние факторов, детерминирующих активность фермента на 9,2% и 12,4% соответственно. 102 Влияние кормовых добавок на активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров 15 суточного возраста в 1-й и 2-й опытных группах, получавших ПКД (табл. 11), была достоверно выше (P<0,05 и P<0,001), чем в контроле, что подтверждается данными регрессионного анализа (рис. 62, 63, 64, 65). Применение янтарной кислоты (опытная группа 3) не приводило к достоверному изменению активности фермента по сравнению с контролем (P>0,05). Таблица 11. Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» (n=320) АТФаза 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 15 сут 2+ Mg 10,670,23* 11,270,24*** 9,920,25 9,930,27 + + Na ,K - 13,920,11 13,910,10 12,050,23*** 13,690,14 2+ Ca 11,720,19** 11,260,13 10,340,19*** 11,270,10 HCO3 - 12,380,19 14,250,16*** 15,230,27*** 12,730,37 60 сут 2+ Mg 13,330,32*** 16,260,20*** 13,280,32*** 14,690,20 + + Na ,K - 28,120,46*** 29,050,32*** 26,690,47** 24,930,24 2+ Ca 14,700,12 16,850,22*** 13,650,22*** 14,710,17 HCO3 - 27,210,24*** 26,900,22*** 25,630,36* 24,850,30 *- по сравнению с контрольной группой 103 Активность Mg2+-АТФазы = 9,7827+0,0591*x 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 15 14 13 12 11 10 9 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 62. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Mg 2+-АТФазы = 9,608+0,1108*x 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 63. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 104 Активность Mg2+-АТФазы = 8,8033+0,0746*x 15 14 13 12 11 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 16 10 9 8 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 64. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы = 8,3397+0,1058*x 15 14 13 12 11 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 16 10 9 8 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 65. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y активность АТФазы, x - возраст цыплят) 105 Уровень активности Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 60 суточного возраста был достоверно выше в опытных группах 1, 2 и 3 по сравнению с контролем (Р<0,001, Р<0,05, Р<0,002). С возрастом активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов достоверно увеличивалась (P<0,001): 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=9,7827+0,0591x y=9,608+0,1108x y=8,8033+0,0746x y=8,3397+0,1058x Наибольшая возрастная динамика этого показателя отмечена в опытной группе 2, при совместном скармливании ПКД и сукцината. Двухфакторным дисперсионным анализом было установлено, что активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплятбройлеров кросса «Бройлер-6» была детерминирована возрастом на 73,0% и кормовыми добавками на 12,5% с высокой степенью достоверности (P0,001). Активность Na+,K+-АТФазы (рис. 66-69) достоверно (P0,001) выше, чем активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят опытных и контрольной групп как в 15 так и в 60 суточном возрасте. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят опытных групп 1 и 2, получавших ПКД в 15 суточном возрасте не имела достоверных отличий от контроля. При этом было установлено достоверное снижение АТФазной активности в опытной группе 3, получавшей сукцинат по сравнению с контролем. В 60 суточном возрасте активность фермента цыплят опытных групп 1, 2 и 3 была выше, чем в контрольной группе. Было установлено достоверное увеличение активности Na+,K+АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят с возратом, что подтверждается регрессионным анализом. 106 Активность Na+,K +-АТФазы = 9,1933+0,3154*x 32 28 26 24 22 20 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 30 18 16 14 12 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 66. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 8,858+0,3365*x 34 30 28 26 24 22 20 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 32 18 16 14 12 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 67. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 107 Активность Na+,K +-АТФазы = 7,164+0,3255*x 30 26 24 22 20 18 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 28 16 14 12 10 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 68. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 9,9447+0,2497*x 26 24 22 20 18 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 28 16 14 12 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут + + Рис. 69. Активность Na ,K -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y активность АТФазы, x - возраст цыплят) 108 Регрессионным анализом было установлено, что наибольшая возрастная динамика активности Na+,K+-АТФазы в опытной группе 2, при совместном применении препаратов, а наименьшая - в контрольной группе 4: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=9,1933+0,3154x y=8,858+0,3365x y=7,164+0,3255x y=9,9447+0,2497x Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» была детерминирована возрастом на 95,6% и кормовыми добавками на 1,9% с высокой степенью достоверности (P0,001). Активность Ca2+-АТФазы (рис. 70-73) у цыплят 15 суточного возраста была достоверно выше уровня активности Mg2+-АТФазы в опытных группа 1, 2 и 4 (P0,02, P0,05 и P0,002 соответственно). В опытной группе 3, получавшей сукцинат, прироста активности, по сравнению с Mg2+-АТФазой, не выявлено (P0,05). Скармливание ПКД (опытная группа 1) достоверно (P0,02) повышало активность Ca2+-АТФазы, по сравнению с контролем, в то время как, сукцинат (группа 3) наоборот ее понижал (P0,001). Совместное применение препаратов (группа 2) не приводило к изменению активности этой АТФазы по сравнению с контролем (P0,05). В 60 суточном возрасте отмечалось достоверное увеличение активности в опытной группе 2 и ее снижение в опытной группе 3 по сравнению с контролем. С возрастом отмечено увеличение активности фермента, что подтверждается регрессионным анализом возрастной динамики активности этой АТФазы. 109 Активность Ca2+-АТФазы = 10,377+0,072*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 16 15 14 13 12 11 10 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 70. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 8,6757+0,1363*x 19 17 16 15 14 13 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 18 12 11 10 9 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут 2+ Рис. 71. Активность Ca -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 110 Активность Ca2+-АТФазы = 8,847+0,08*x 14 13 12 11 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 15 10 9 8 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 72. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 9,6527+0,0843*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 16 15 14 13 12 11 10 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут 2+ Рис. 73. Активность Ca -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 111 Наибольшая возрастная динамика активности Ca2+-АТФазы была отмечена в опытной группе 2, при совместном применении препаратов, а наименьшая – в опытной группе 1, получавшей ПКД, что, вероятно, связано с большим содержанием кальция в пептидной кормовой добавке, оказывающим ингибирующее влияние на активность этого фермента: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=10,377+0,072x y=8,6757+0,1363x y=8,847+0,08x y=9,6527+0,0843x Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» была детерминирована возрастом на 80,8% и кормовыми добавками на 8,9% с высокой степенью достоверности (P0,001). Активность HCO3--АТФазы у цыплят 15 суточного возраста (рис. 7477) была выше в группах 2 и 3, получавших янтарную кислоту (P0,001), в группе 2, получавшей, так же ПКД активность была несколько ниже, чем в группе 3 (P0,01), а в группе 1, получавшей только ПКД, прироста активности анионной АТФазы по сравнению с контролем не было выявлено (P0,05). Уровень активности анионной АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 15 суточного возраста составил в 1-й опытной группе 12,38±0,18 во 2-й - 14,25±0,15, в 3-й - 15,23±0,26 и в 4-й контрольной группе - 12,73±0,35 нмоль Фн/мг белка в мин. Эти показатели достоверно выше активности Mg2+-АТФазы во всех группах опыта (P0,001). С возрастом отмечался достоверный прирост активности этой АТФазы, что подтверждается регрессионным анализом. 112 Активность HCO3--АТФазы = 7,4393+0,3294*x 30 26 24 22 20 18 - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 28 16 14 12 10 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 74. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 10,0397+0,281*x 28 26 24 22 20 - Активность HCO 3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 30 18 16 14 12 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут - Рис. 75. Активность HCO3 -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 113 Активность HCO3--АТФазы = 11,766+0,2311*x 28 26 24 22 20 - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 30 18 16 14 12 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 76. Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 8,685+0,2695*x 26 24 22 20 18 - Активность HCO 3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 28 16 14 12 10 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут - Рис. 77. Активность HCO3 -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y активность АТФазы, x - возраст цыплят) 114 Наибольшая возрастная динамика активности HCO3--АТФазы была отмечена в опытной группе 1, получавшей ПКД, а наименьшая – в опытной группе 3, получавшей сукцинат. Это вероятно связано активацией анионного транспорта низкомолекулярных отрицательно заряженных фрагментов ПКД и сукцината: 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа y=7,4393+0,3294x y=10,0397+0,281x y=11,766+0,2311x y=8,685+0,2695x Активность HCO3--АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» была детерминирована возрастом на 95,6% и кормовыми добавками на 1,2% (P0,001). Кластерный анализ активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» С целью выяснения степени близости параметров активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров 15 и 60 суточного возраста по группам опыта был проведен кластерный анализ (рис. 78, 79). Активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 15 суточного возраста 10,0 Степень близости параметров 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 3 (опыт) 2 (опыт) 4 (контр.) 1 (опыт) Рис. 78. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 15 суточного возраста 115 Результаты кластерного анализа показали, что у цыплят 15 суточного возраста в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 4 с наиболее близкими показателями, затем с меньшей степенью однородности с этим кластером объединяется контрольная группа 2 и наибольшие отличия наблюдаются с опытной группой 3. Активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 60 суточного возраста 14,0 Степень близости параметров 13,5 13,0 12,5 12,0 11,5 11,0 10,5 10,0 2 (опыт) 4 (контр.) 3 (опыт) 1 (опыт) Рис. 79. Дендрограмма активности АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 60 суточного возраста У цыплят 60 суточного возраста объединение групп в кластеры происходит по другому принципу. Так в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 3, во второй кластер объединяются 1 кластер и контрольная группа 4, и затем с наименьшей однородностью происходит объединение с опытной группой 2. Это говорит о том, что наименьшее влияние на активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов оказывает ПКД (высокая степень близости параметров с контрольной группой), а наибольшее сукцинат. Содержание белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» Содержание белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров достоверно увеличивалось с возрастом (рис. 80-83). 116 Регрессионный анализ зависимости содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят по группам опыта позволил установить следующие уравнения регрессии: 1 (опыт) – y=0,9967+0,0024x; 2 (опыт) - y=0,9992+0,0019x; 3 (опыт) - y=0,9779+0,0028x и 4 (контроль) y=0,9885+0,0024. Таким образом, наибольшая динамика показателя была отмеченаь в опытной группе 3, получавшей сукцинат. С целью установления силы влияния возраста и кормовых добавок на концентрацию белка в цитоплазматических мембранах был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, который показал, что возраст детерминировал этот показатель на 33% с высокой степенью достоверности (P0,001), что говорит об возрастных изменениях цитоплазматической мембраны эритроцитов цыплят-бройлеров. Применение кормовых добавок не оказывало достоверного влияния на динамику содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса (P0,05). Белок, мг = 0,9967+0,0024*x 1,35 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 15 Возраст, сут 60 95% confidence Рис. 80. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1 117 Белок, мг = 0,9992+0,0019*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 15 60 Возраст, сут 95% confidence Рис. 81. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2 Белок, мг = 0,9779+0,0028*x 1,35 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 15 60 Возраст, сут 95% confidence Рис. 82. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3 118 Белок, мг = 0,9885+0,0024*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 15 60 95% confidence Возраст, сут Рис. 83. Динамика содержание белка в цитоплазматических мембранах цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4 Кластерный анализ содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров (рис. 84) позволил установить, что этот показатель имел наиболее близкие значения в опытных группах 1 и 2, получавших ПКД (кластер 1). Содержание белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров 0,91 Степень близости параметров 0,90 0,89 0,88 0,87 0,86 0,85 0,84 0,83 0,82 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис.84 Дендрограмма содержания мембранного белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» 119 Влияние кормовых добавок на активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов (табл.12) цыплят- бройлеров 15 суточного возраста была достоверно выше в опытных 1, 2 и 3 группах чем в контроле, что подтверждается регрессионным анализом (рис. 85-88). Таблица 12. Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» (n=320) АТФаза 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 15 сут 2+ Mg 5,000,06*** 5,070,09*** 5,120,11*** 4,490,11 + + Na ,K - 5,000,06*** 5,070,09*** 5,120,11*** 4,490,11 2+ Ca 4,920,25 5,160,12 5,240,11 5,050,06 HCO3 - 10,990,22 15,500,13*** 12,850,17*** 10,570,25 60 сут 2+ Mg 6,170,14 6,340,12* 5,980,19 5,970,16 + + Na ,K - 6,290,12 6,530,19 6,180,16 6,180,20 2+ Ca 6,430,17 6,730,12 6,220,13 6,160,19 HCO3 - 9,810,14 10,180,11** 9,790,18 9,460,22 *- по сравнению с контрольной группой С возрастом происходит достоверное увеличение активности Mg2+АТФазы во всех опытных группах (P0,05). Уровень Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят 60 суточного возраста был достоверно выше по сравнению с контролем только в опытной группе 2, получавшей ПКД совместно с сукцинатом. 120 Активность Mg2+-АТФазы = 4,611+0,026*x 6,8 2+ Активность Mg -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 85. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg 2+-АТФазы = 4,649+0,0281*x 7,2 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 2+ Активность Mg -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 7,0 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 86. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 121 Активность Mg2+-АТФазы = 4,838+0,019*x 7,0 2+ Активность Mg -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 87. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg2+-АТФазы = 3,9983+0,0328*x 6,8 2+ Активность Mg -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 88. Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 122 Регрессионным анализом были установлены уравнения зависимости активности Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров от возраста: 1 (опыт) – y=4,611+0,026x; 2 (опыт) – 4,649+0,0281x; 3 (опыт) – 4,838+0,019x; 4 (контроль) – 3,9983+0,0328x. Наибольшая динамика прироста активности этой АТФазы была выявлена в контрольной группе 4. Двухфакторным дисперсионным анализом было установлено, что активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» была детерминирована возрастом на 67,1% и кормовыми добавками на 5,9% с высокой степенью достоверности (P0,005). Достоверного прироста АТФазной активности при внесении в среду инкубации ионов K+ (рис. 89-92) по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы в группах опыта 1, 2, 3 и 4 выявлено не было (P0,05). Активность Na+,K +-АТФазы = 4,5723+0,0286*x 6,8 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,6 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 89. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 123 Активность Na+,K +-АТФазы = 4,5843+0,0324*x 7,4 7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 7,2 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут + + Рис. 90. Активность Na ,K -АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na+,K +-АТФазы = 4,7707+0,0235*x 7,0 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,8 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут + + Рис. 91. Активность Na ,K -АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 124 Активность Na+,K +-АТФазы = 3,9253+0,0376*x 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 + + Активность Na ,K -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 7,5 4,5 4,0 3,5 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут + + Рис. 92. Активность Na ,K -АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Возрастная динамика активности Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов описывается следующими уравнениями: 1 (опыт) – y=4,5723+0,0286x; 2 (опыт) – 4,5843+0,0324x; 3 (опыт) – 4,7707+0,0235x; 4 (контроль) – 3,9253+0,0376x. Высокая возрастная динамика активности этого фермента была выявлена в контроле и опытной группе 2, получавшей ПКД и сукцинат. Активность Na+,K+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят была детерминирована возрастом на 70,9% (P0,001) и в меньшей степени кормовыми добавками – 4,3% (P0,02). Достоверного прироста АТФазной активности при внесении в среду инкубации ионов Ca2+ (рис. 93-96) по сравнению с активностью Mg2+125 АТФазы в группах опыта не было установлено (P0,05), в контрольной группе отмечено достоверное (P0,001) увеличение активности Ca2+-АТФазы по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы. Активность Ca2+-АТФазы = 4,418+0,0336*x 7,0 6,5 6,0 5,5 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 7,5 5,0 4,5 4,0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 93. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 4,631+0,035*x 7,4 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 94. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) 126 Активность Ca2+-АТФазы = 4,9127+0,0218*x 7,0 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 95. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca2+-АТФазы = 4,6843+0,0245*x 7,0 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 96. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Уровень активности Ca2+-АТФазы цыплят-бройлеров 60 суточного возраста был достоверно выше, чем в 15 суток и составлял: в 1-й опытной груп127 пе – 6,43±0,16, во 2-й – 6,73±0,12, в 3-й – 6,22±0,12 и в контроле – 6,16±0,18 нмоль Фн/мг белка в мин. Возрастная динамика активности Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов описывается следующими уравнениями: 1 (опыт) – y=4,418+0,0336x; 2 (опыт) – y=4,631+0,035x; 3 (опыт) – y=4,9127+0,0218x; 4 (контроль) – y=4,6843+0,0245x. Высокая возрастная динамика активности этого фермента была выявлена в контроле и опытных группах 1 и 2, получавшей ПКД. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов цыплят была детерминирована возрастом на 65% (P0,001), достоверного влияние кормовых добавок не установлено. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят (рис. 97-100) была достоверно выше по сравнению с контролем в группах опыта 2 и 3, получавших янтарную кислоту (P0,001), особенно в сочетании ее с пептидным препаратом (P0,001). В опытной группе 1, получавшей только ПКД, достоверного прироста активности HCO3--АТФазы по сравнению с контролем не обнаружено (P0,05). Уровень активности этого фермента был достоверно (P0,001) выше почти в 2 раза активности Mg2+-АТФазы во всех опытных группах составлял: в 1-й опытной группе – 10,99±0,20, во 2-й – 15,50±0,12, в 3-й – 12,84±0,16 и в контроле – 10,570,24 нмоль Фн/мг белка в мин. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят 60 суточного возраста достоверно (P0,001) в 1,5 раза выше уровня активности других АТФаз ядер эритроцитов, вероятно в связи с тем, что энергообеспечение их метаболических процессов связано с деятельностью ферментных систем, локализованных в клеточном ядре. С возрастом было отмечено уменьшение активности этого фермента, что объясняется снижением метаболической активности ядер эритроцитов. 128 Активность HCO3--АТФазы = 11,384-0,0263*x 11,5 11,0 10,5 10,0 - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 12,0 9,5 9,0 8,5 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 97. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 17,2663-0,1181*x - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 17 16 15 14 13 12 11 10 9 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 98. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 129 Активность HCO3--АТФазы = 13,8717-0,068*x 13 12 11 - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 14 10 9 8 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 99. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность HCO3--АТФазы = 10,937-0,0247*x 12,5 11,5 11,0 10,5 10,0 9,5 - Активность HCO3 -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 12,0 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис. 100. Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) 130 Активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят 60 суточного возраста составляла: в 1-й опытной группе – 9,81±0,13, во 2-й – 10,18±0,11, в 3-й – 9,79±0,18 и в контрольной группе 4 – 9,46±0,21 нмоль Фн/мг белка в мин. Достоверный (P0,01) снижение активности этой аденозинтрифосфатазы по сравнению с контролем был отмечен только при совместном применении ПКД и сукцината (опытная группа 2). Возрастная динамика активности HCO3--АТФазы ядер эритроцитов описывается следующими уравнениями: 1 (опыт) – y=11,384-0,0263x; 2 (опыт) – y=17,2663-0,1181x; 3 (опыт) – y=13,8717-0,068x; 4 (контроль) – y=10,937-0,0247x. Высокая возрастная динамика активности этого фермента была выявлена в контроле и опытной группе 1, получавшей ПКД, снижение активности фермента в группах 2 и 3, получавших сукцинат было менее выраженным. Двухфакторный дисперсионный анализ влияния возраста и кормовых добавок на активность HCO3--АТФазы ядер эритроцитов цыплят показал, что она была детерминирована возрастом на 45% (P<0,001), достоверного влияние кормовых добавок не установлено (P>0,05). С целью выяснения степени близости параметров активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят-бройлеров 15 и 60 суточного возраста по группам опыта был проведен кластерный анализ (рис. 101, 102). У цыплят 15 суточного возраста в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 4 с наиболее близкими показателями, затем с меньшей степенью однородности с этим кластером объединяется контрольная группа 3 и наибольшие отличия наблюдаются с опытной группой 2. Такое объединение в клсатеры можно объяснить тем, что на активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят бройлеров наибольшее влияние оказывало применение сукцината (2 опыт), особенно в сочетании с ПКД (3 опыт). 131 Активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят 15 суточного возраста 9,0 8,5 Степень близости параметров 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 3 (опыт) 2 (опыт) 4 (контр.) 1 (опыт) Рис. 101. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 15 суточного возраста Активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят 60 суточного возраста 4,20 Степень близости параметров 4,15 4,10 4,05 4,00 3,95 3,90 3,85 3,80 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 102. Дендрограмма активности АТФаз ядер эритроцитов цыплят 60 суточного возраста У цыплят 60 суточного возраста объединение групп в кластеры происходит по другому принципу. Так в 1-й кластер объединяются группы опыта 1 и 2, во второй кластер объединяются 1 кластер и опытная группа 3, и затем с наименьшей однородностью происходит объединение с контрольной группой 4. 132 Это говорит о том, что наибольшее влияние на активность АТФаз ядер эритроцитов цыплят этого возраста оказывало скармливание ПКД (высокая степень близости параметров с контрольной группой), а наименьшее сукцинат. Содержание белка в ядерных мембранах эритроцитов цыплятбройлеров кросса «Бройлер-6» Содержание белка в ядерных мембранах эритроцитов цыплятбройлеров достоверно увеличивалось с возрастом (рис. 103-106). Регрессионным анализом были установлены уравнения зависимости содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят по группам опыта от возраста: 1 (опыт) – y=0,9927+0,0014; 2 (опыт) y=0,9697+0,0021; 3 (опыт) - y=0,9968+0,0019x и 4 (контроль) - y=0,9541+0,0025x. Таким образом, наибольшая динамика показателя была отмечена в контрольной группе 4. Белок, мг = 0,9927+0,0014*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 103. Динамика содержание белка в ядрных мембранах цыплятбройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 1 133 Белок, мг = 0,9697+0,0021*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 10 20 30 40 50 Возраст, сут 60 70 95% confidence Рис. 104. Динамика содержание белка в ядрных мембранах цыплятбройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 2 Белок, мг = 0,9968+0,0019*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 105. Динамика содержание белка в ядрных мембранах цыплятбройлеров кросса «Бройлер-6» опытной группы 3 134 Белок, мг = 0,9541+0,0025*x 1,30 1,25 1,20 Белок, мг 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,90 0,85 10 20 30 40 50 Возраст, сут 60 70 95% confidence Рис.106. Динамика содержание белка в ядрных мембранах цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» контрольной группы 4 С целью установления силы влияния возраста и кормовых добавок на концентрацию белка в цитоплазматических мембранах был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, который показал, что возраст детерминировал этот показатель на 26% с высокой степенью достоверности (P<0,001), что говорит об возрастных изменениях белкового спектра ядерной мембраны эритроцитов цыплят-бройлеров. Применение кормовых добавок не оказывало достоверного влияния на динамику содержания белка в цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса. С целью выявления влияния кормовых добавок на динамику содержания мембранного белка ядер эритроцитов был проведен кластерный анализ (рис.107). 135 Содержание мембранного белка в ядрах эритроцитов цыплят-бройлеров 0,94 Степень близости параметров 0,92 0,90 0,88 0,86 0,84 0,82 0,80 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис.107. Дендрограмма содержания белка в мембраннах ядер эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» Наиболее близкие показатели содержания белка в ядерных мембранах эритроцитов цыплят-брйлеров были в группах опыта 1, 2 и 3 (соответственно 1 и 2 кластеры, что характеризует значительное влияние кормовых добавок на содержание мембранного белка. 136 Дисперсионный анализ влияния скармливаемых препаратов на активности АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров кросса «Бройлер-6» С целью выяснения степени влияния исследуемых препаратов и возраста на динамику возрастной активности АТФаз цитоплазматических (табл. 13) и ядерных (табл. 14) мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ. В качестве независимых переменных были определены: А – возраст цыплят, Б – влияние кормовых добавок. За нулевую точку отсчета принимали активность ферментов в контрольной группе. Таблица 13. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа, (n=160) Коэффициенты детерминации 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (контроль) 2+ Mg -АТФаза фактор А (возраст) 0,807** 0,860** 0,835** фактора Б (добавки) 0,006 0,077** 0,0255** совместное влияние факторов 0,065** 0,001 0,0255** + + Na ,K -АТфаза фактор А (возраст) 0,027 0,030 0,028 фактора Б (добавки) 0,014 0,011 0,025 совместное влияние факторов 0,039 0,043 0,040 2+ Ca -АТФаза фактор А (возраст) 0,933** 0,887** 0,876** фактора Б (добавки) 0,005 0,034** 0,060** совместное влияние факторов 0,006 0,049** 0,001 HCO3 -АТФаза фактор А (возраст) 0,971** 0,023 0,948** фактора Б (добавки) 0,005** 0,0412 0,020** совместное влияние факторов 0,009** 0,023 0,006** ** - P<0,01 по сравнению с контрольной группой 4 В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности ферментов от независимых факторов. Активность Mg2+-АТФазы была детерминирована возрастом цыплят на 80,7 %, 86,0% и 83,5% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах и на 0,6 % скармливанием ПКД, 7,7% - при совместном скармливании ПКД и сукцина137 та. Использование сукцината (опытная группа 3) оказывало влияние на активность этой АТФазы на 2,6%. Активность Na+,K+-АТфазы эритроцитов не зависела от независимых факторов (P0,05). Активности Ca2+-АТФазы была детерминирована возрастом на 93,3%, 88,7% и 87,6 соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах и скармливаемыми препаратами на 0,5%, 3,4% и 6,0% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Активность HCO3--АТФазы была также детерминирована возрастом цыплят, соответственно по группам опыта на 97,1%, 2,3% и 94,8%. В то же время влияние добавок было существенно меньшим – 0,5%, и 4,12 % в группах 1 и 2, получавших ПКД и ПКД совместно с сукцинатом. Влияние сукцината (группа 3) составляло 2,0%. Совместное влияние факторов для всех изучаемых показателей было незначительным. Таблица 14. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа, (n=160) Коэффициенты детерминации 1 (опыт) 2 (опыт) 2+ Mg -АТФаза фактор А (возраст) 0,731** 0,720** фактора Б (добавки) 0,054** 0,087** совместное влияние факторов 0,010 0,004 + + Na ,K -АТфаза фактор А (возраст) 0,765** 0,710** фактора Б (добавки) 0,032** 0,061** совместное влияние факторов 0,014 0,004 2+ Ca -АТФаза фактор А (возраст) 0,606** 0,711** фактора Б (добавки) 0,002 0,046** совместное влияние факторов 0,015 0,022 HCO3 -АТФаза фактор А (возраст) 0,454** 0,433** фактора Б (добавки) 0,052 0,335** совместное влияние факторов 0,001 0,185** ** - P<0,01 по сравнению с контрольной группой 4 3 (контроль) 0,607** 0,047* 0,043* 0,677** 0,04* 0,04* 0,648** 0,009 0,002 0,516** 0,204** 0,113** 138 Активность Mg2+-АТФазы ядер эритроцитов была детерминирована возрастом цыплят на 73,1%, 72,0% и 60,7% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Кормовые добавки также оказывали достоверное влияние на активность этого фермента на 5,4%, 8,7% и 4,7% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Совместное влияние факторов отмечено только в 3 опытной группе, получавшей сукцинат и составляло 4,3%. Активность Na+,K+-АТфазы ядер эритроцитов была детерминирована возрастом цыплят на 76,5%, 71,0% и 67,7% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Кормовые добавки также оказывали достоверное влияние на активность этого фермента - 3,2%, 6,1% и 4,0% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Совместное влияние факторов было не достоверно. Активность Ca2+-АТФазы ядер эритроцитов была достоверно детерминирована возрастом цыплят на 60,65%, 71,1% и 64,8% соответственно в 1, 2 и 3 опытных группах. Кормовые добавки оказывали достоверное влияние на активность этого фермента только при их совместном скармливании (опытная группа 2) – 4,6%. Совместное влияние факторов было не достоверно. Активность HCO3--АТФазы была также детерминирована возрастом цыплят, соответственно по группам опыта на 45,4 %, 43,3% и 51,6%. Достоверное влияние кормовых добавок было установлено только в группах опыта 2 и 3, соответственно на 33,5% и 2,4%. В этих группах опыта так же выявлено совместное влияние факторов, детерминирующих активность фермента на 18,5% и 11,3% соответственно. Это говорит, вероятно, об активации энергетических процессов в ядрах эритроцитов цыплят с участием данной АТФазы. 139 АТФазная активность тканей и органов цыплят бройлеров Кросс «ISA» Определение АТФазной активности показало, что она неодинакова в различных тканях (табл.15). Изученные нами объекты по убыванию активности можно расположить в следующий ряд: сердечная мышца, почки, скелетная мускулатура и печень. С возрастом активность АТФазы возрастает. Наибольшие наибольший прирост активности был отмечен в сердце, далее следует скелетная мускулатура, печень и почки. Таблица 15. Активность АТФазы тканей и органов цыплят-бройлеров Возраст, сут 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) Почки 10 7,70±0,07* 7,56±0,08 7,48±0,12 7,50±0,09 20 7,96±0,11* 7,92±0,21 7,90±0,10 7,62±0,12 30 8,32±0,09* 8,02±0,13 8,06±0,11 8,00±0,09 40 8,69±0,14* 8,50±0,10 8,39±0,11 8,31±0,14 Печень 10 6,99±0,11* 6,89±0,10 6,76±0,17 6,66±0,14 20 7,77±0,10 7,66±0,19 7,57±0,19 7,56±0,10 30 9,25±0,14 9,11±0,14 9,09±0,10 9,14±0,15 40 9,86±0,17* 9,64±0,14* 9,20±0,13 9,07±0,18 Скелетные мышцы 10 7,60±0,15 7,47±0,23 7,37±0,17 7,47±0,19 20 8,32±0,06* 8,21±0,08 8,19±0,14 8,14±0,07 30 8,84±0,14* 8,63±0,16 8,39±0,17 8,43±0,15 40 9,91±0,12* 9,65±0,10 9,47±0,18 9,36±0,24 Сердечная мышца 10 8,59±0,09* 8,57±0,17 7,65±0,12 7,55±0,17 20 9,42±0,13* 9,27±0,16 9,05±0,13 8,93±0,17 30 10,41±0,14 10,24±0,15 10,11±0,09 10,02±0,24 40 11,21±0,16 11,11±0,18 11,03±0,17 11,11±0,20 *- по сравнению с контрольной группой Скармливание ПКД (опытная группа 1) привело к достоверному повышению АТФазной активности по сравнению с контролем в почках и скелетной мускулатуре цыплят бройлеров 10, 20, 30 и 40 суточного возраста, в пече цыплят 10 и 40 суточного возраста и в сердце цыплят 10 и 20 суточного возраста. 140 Совместное скармливание ПКД и сукцината (опытная группа 2) привело к достоверному повышению активности АТФазы печени цыплят 40 суточного возраста. Скармливание сукцината (опытная группа 3) не отражалось на ативности АТФазы изучаемых органов и тканей. Регрессионный анализ позволил установить зависимость активности АТФаз тканей и органов цыплят-бройлеров групп опыта от возраста. Прирост активности АТФазы в гепатоцитах (рис. 108-111) цыплят опытных групп 1 и 2 происходил более интенсивно, чем в контрольной группе и группе опыта 3. Более высокую активность АТФазы в гепатоцитах цыплят опытных групп 1 и 2 можно объяснить тем, что протеин кормовой добавки гидролизован, продукты гидролиза интенсивно всасываются в кишечнике, достигают печени и активизируют в ней метаболические процессы. Печень 1 (опыт), активность АТФазы = 5,9425+0,1009*x 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 1 (опыт), активность АТФазы 7,0 6,5 6,0 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 108. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) 141 Печень 2 (опыт), активность АТФазы = 5,9015+0,097*x 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 2 (опыт), активность АТФазы 7,0 6,5 6,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 109. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) Печень 3 (опыт), активность АТФазы = 5,9509+0,0881*x 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 3 (опыт), активность АТФазы 6,5 6,0 5,5 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 110. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) 142 Печень 4 (контр.), активность АТФазы = 5,8994+0,0883*x 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 4 (контр.), активность АТФазы 6,5 6,0 5,5 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 111. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) В почках (рис. 112-115) и мышцах (рис. 116-119) рост активности АТФазы можно расположить в следующей убывающей последовательности: 1, 2, 3 опытные группы и 4 контрольная группа. В сердечной мышце (рис. 120-123) наиболее интенсивный рост активности АТФазы происходил в контрольной группе и опытной группе 3, получавшей сукцинат. 143 Почки 1 (опыт), активность АТФазы = 7,3388+0,0331*x 9,8 9,6 1 (опыт), активность АТФазы 9,4 9,2 9,0 8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 5 10 15 20 25 30 35 Возраст 40 45 95% confidence Рис. 112. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Почки 2 (опыт), активность АТФазы = 7,2698+0,0292*x 9,2 9,0 2 (опыт), активность АТФазы 8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 113. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почеки цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 144 Почки 3 (опыт), активность АТФазы = 7,2322+0,0289*x 9,0 8,8 3 (опыт), активность АТФазы 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 6,8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 114. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Почки 4 (контр.), активность АТФазы = 7,1614+0,0279*x 9,0 8,8 4 (контр.), активность АТФазы 8,6 8,4 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 115. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почеки цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 145 Мышечная ткань 1 (опыт), активность АТФазы = 6,8111+0,0743*x 11,0 10,5 1 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 116. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Мышечная ткань 2 (опыт), активность АТФазы = 6,7526+0,0696*x 10,5 2 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 117. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 146 Мышечная ткань 3 (опыт), активность АТФазы = 6,7287+0,065*x 10,5 3 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 118. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Мышечная ткань 4 (контр.), активность АТФазы = 6,8606+0,0596*x 11,0 10,5 4 (контр.), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 119. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров оконтрольной группы 4, (n=10) 147 Сердечная мышца 1 (опыт), активность АТФазы = 7,6975+0,0884*x 12,5 12,0 1 (опыт), активность АТФазы 11,5 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 120. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Сердечная мышца 2 (опыт), активность АТФазы = 7,6554+0,0857*x 12,0 11,5 2 (опыт), активность АТФазы 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 121. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 148 Сердечная мышца 3 (опыт), активность АТФазы = 6,6595+0,1121*x 13 3 (опыт), активность АТФазы 12 11 10 9 8 7 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис. 122. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Сердечная мышца 4 (контр.), активность АТФазы = 6,4635+0,1177*x 13 4 (контр.), активность АТФазы 12 11 10 9 8 7 6 5 10 15 20 25 Возраст 30 35 40 45 95% confidence Рис. 123. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 149 Кластерный анализ АТФазной активности тканей и органов цыплятбройлеров в зависимости от применяемых препаратов представлен на рис. 124-127. Печень 4,40 4,35 Степень близости параметров 4,30 4,25 4,20 4,15 4,10 4,05 4,00 3,95 3,90 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 124. Дендрограмма АТФазной активности печени цыплят опытных и контрольной групп Сердечная мышца Степень близости параметров 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 125. Дендрограмма АТФазной активности сердца цыплят опытных и контрольной групп 150 Мышечная ткань Степень близости параметров 4,2 4,1 4,0 3,9 3,8 3,7 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 126. Дендрограмма АТФазной активности мышц цыплят опытных и контрольной групп Почки 3,25 Степень близости параметров 3,20 3,15 3,10 3,05 3,00 2,95 2,90 2,85 2,80 2 (опыт) 4 (контр.) 3 (опыт) 1 (опыт) Рис. 127. Дендрограмма АТФазной активности почек цыплят опытных и контрольной групп Анализ рисунков показывает, что для разных тканей отмечаются существенные различия при объединении в кластеры показателя АТФазной активности опытных и контрольной групп. Так, для АТФаз печени и сердца (рис.124, 125) в 1-й кластер объединяются наиболее близкие по показателю активности фермента 151 опытные группы 1 и 2. Во 2-й кластер объединяются опытная группа 3 и контрольная 4. И, наконец, в 3-й кластер с наименьшей однородностью объединяются 1-й и 2-й кластеры. Это, вероятно связано с тем, что цыплята 1 и 2 опытных групп получали ПКД, а цыплята 3 опытной группы и 4 контрольной – ПКД не получали. Для АТФаз мышечной ткани (рис. 126) цыплят опытных и контрольной групп наблюдается отличная картина. Так, в 1-кластер объединяются группы опыта 1 и 2, затем к ним присоединяется группа опыта 3, образуя 2-й кластер, и с наименьшей степенью однородности, к нему присоединяется контрольная группа 4. Для почек (рис. 127) установлено, что в 1-й кластер объединяются 3 опытная и 4 контрольная группы, затем с меньшей степенью однородности к нему присоединяется 1 опытная группа, и с еще меньшей однородностью 2 опытная группа. Таким образом, можно сделать следующий вывод, что у цыплят опытных групп 1 и 2, получавших ПКД, показатели АТФазной активности имеют близкие значения в печени, сердечной мышце и скелетной мускулатуре. В почках, наоборот, наблюдаются наибольшие различия активности этого фермента в группах 1 и 2 опыта. Это, вероятно связано с особенностями выведения продуктов метаболизма ПКД с мочой. Двухфакторный дисперсионный анализ влияния возраста и кормовых добавок позволил выявить степень и достоверность их влияния на активность АТФазы (табл. 16). АТФазная активность печени, почек, сердца и мышечной ткани в значительной степени детерминирована возрастом (P<0,05), соответственно на 83,8%, 44,6%, 80,9% и 71,0%. 152 Таблица 16. Двухфакторный дисперсионный анализ АТФазной активности тканей и органов цыплят-бройлеров, (n=160) Коэффициенты Печень Почки Сердечная мышца Скелетная детерминации мускулатура фактор А (возраст) 0,838** 0,446* 0,809** 0,710** фактора Б (добавки) 0,015* 0,049* 0,029* 0,021* совместное влияние факторов 0,009 0,012 0,019* 0,005 Влияние кормовых добавок так же достоверно, но незначительно составляет: печень - 1,5%; почки - 4,9%; сердце – 2,9%; скелетная мускулатура – 2,1%. Наибольшее влияние добавок отмечено для АТФазы почек. Совместного влияния факторов не было установлено (P>0,05). Кросс «Бройлер-6» Определение АТФазной активности показало, что она неодинакова в различных тканях (табл. 17). Изученные нами объекты по убыванию активности можно расположить в следующий ряд: почки, печень, скелетные и сердечные мышцы. В процессе выращивания цыплят (с возрастом) активность АТФазы возрастает. Наибольшие изменения в этом отношении отмечены в почках, далее следует скелетная мускулатура, печень, и в меньшей степени такие сдвиги наблюдались в сердечной мышце. Проведенные исследования также показали, что АТФазная активность во всех изученных объектах находилась в зависимости от состава рациона. Достоверные (P<0,05) различия активности АТФазы по сравнению с контрольной группой были установлены у цыплят 15 суточного возраста в скелетных мышцах (группы опыта 1 и 2) и в сердечной мышце (опытная группа 2), у цыплят 60 суточного возраста – в почках (опытная группа 1), печени (опытные группы 1 и 2), скелетных мышцах (опытные группы 1 и 2) и в сердце (опытная группа 2). У цыплят 3 опытной группы, получавшей сукци- 153 нат, достоверных отличий изучаемых показателей от контроля установлено не было. Таблица 17. Активность АТФазы тканей и органов цыплят-бройлеров Возраст, сут 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) Почки 15 8,40±0,13 8,22±0,07 8,16±0,07 8,14±0,12 60 10,88±0,13* 10,70±0,12 10,69±0,18 10,58±0,11 Печень 15 8,01±0,09 8,10±0,06 8,06±0,09 8,02±0,12 60 10,64±0,11* 10,50±0,08* 10,02±0,15 10,09±0,08 Скелетные мышцы 15 7,86±0,06* 7,89±0,04* 7,50±0,08 7,60±0,07 60 10,56±0,13* 10,60±0,08* 10,34±0,11 10,27±0,11 Сердечная мышца 15 7,51±0,09 7,79±0,09* 7,51±0,11 7,34±0,09 60 9,78±0,07 10,00±0,09* 9,83±0,12 9,76±0,09 *- P<0,05 по сравнению с контрольной группой Скармливаемые препараты оказавали влияние так же и на возрастную динамику активности АТФазы, что подтверждается уравнениями регрессии. Так, рост активности АТФазы в почках (рис. 128-131) цыплят опытных групп 1 (y=7,3388+0,0331x) и 2 (y=7,2698+0,0292x), получавших ПКД происходил более интенсивно, чем в контрольной группе 4 (y=7,1614+0,0279x) и группе опыта 3 (y=7,2322+0,0289x). В печени (рис. 132-135) и мышцах (рис. 136-139) рост активности АТФазы можно расположить в следующей убывающей последовательности: 1 опыт (y=5,9425+0,1009x и y=6,8111+0,0743x), 2 опыт (y=5,9015+0,097x и y=6,7526+0,0696x), 3 опыт (y=5,9509+0,881x и y=6,7287+0,065x) и 4 контрольная группа (y=5,8994+0,1009x и y=6,8606+0,0596x). В сердечной мышце (рис. 140-143) наиболее интенсивный рост активности АТФазы происходил в контрольной группе 4 (y=6,4635+0,1177x) и опытной группе 3 (y=6,6595+0,1122x), получавшей сукцинат. 154 Почки 1 (опыт), активность АТФазы = 7,5706+0,0551*x 12,0 11,5 1 (опыт), активность АТФазы 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 128. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Почки 2 (опыт), активность АТФазы = 7,3963+0,055*x 11,5 11,0 2 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 129. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 155 Почки 3 (опыт), активность АТФазы = 7,315+0,0563*x 11,5 11,0 3 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 130. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Почки 4 (контр.), активность АТФазы = 7,3282+0,0542*x 12,0 11,5 4 (контр.), активность АТФазы 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 131. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) почек цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 156 Печень 1 (опыт), активность АТФазы = 7,1353+0,0585*x 11,5 11,0 1 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 132. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Печень 2 (опыт), активность АТФазы = 7,3+0,0533*x 11,0 2 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 133. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 157 Печень 3 (опыт), активность АТФазы = 7,402+0,0436*x 11,0 10,5 3 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 134. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Печень 4 (контр.), активность АТФазы = 7,3294+0,0461*x 11,0 10,5 4 (контр.), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 135. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) печени цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 158 Мышечная ткань 1 (опыт), активность АТФазы = 6,9556+0,0601*x 11,5 11,0 1 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 136. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Мышечная ткань 2 (опыт), активность АТФазы = 6,9813+0,0603*x 11,5 11,0 2 (опыт), активность АТФазы 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 137. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 159 Мышыечная ткань 3 (опыт), активность АТФазы = 6,5489+0,0633*x 11,0 10,5 3 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 138. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Мышечная ткань 4 (контр.), активность АТФазы = 6,7097+0,0593*x 11,0 10,5 4 (контр.), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 139. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) мышц цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 160 Сердечная мышца 1 (опыт), активность АТФазы = 6,7556+0,0504*x 10,5 1 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 140. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) Сердечная мышца 2 (опыт), активность АТФазы = 7,0466+0,0493*x 11,0 10,5 2 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 141. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 161 Сердечная мышца 3 (опыт), активность АТФазы = 6,7315+0,0516*x 11,0 10,5 3 (опыт), активность АТФазы 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис. 142. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) Сердечная мышца 4 (контр.), активность АТФазы = 6,5291+0,0538*x 10,5 10,0 4 (контр.), активность АТФазы 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 10 20 30 40 Возраст, сут 50 60 70 95% confidence Рис. 143. Динамика активности АТФазы (нм Фн/мг белка в мин) сердечной мышцы цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 162 Кластерный анализ АТФазной активности тканей и органов цыплятбройлеров в зависимости от применяемых препаратов представлен на рис. 144-147. Печень 2,6 Степень близости параметров 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 3 (опыт) 4 (контр.) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 144. Дендрограмма АТФазной активности печени цыплят опытных и контрольной групп Сердечная мышца 2,1 Степень близости параметров 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 145. Дендрограмма АТФазной активности сердца цыплят опытных и контрольной групп 163 Мышцы 2,1 Степень близости параметров 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 146. Дендрограмма АТФазной активности мышц цыплят опытных и контрольной групп Почки 2,3 Степень близости параметров 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 4 (контр.) 3 (опыт) 2 (опыт) 1 (опыт) Рис. 147. Дендрограмма АТФазной активности почек цыплят опытных и контрольной групп Анализ рисунков показывает, что для печени, почек, сердечной и скелетной мускулатуры отмечаются существенные различия при объединении в кластеры показателя АТФазной активности опытных и контрольной групп. 164 Так, для АТФаз печени и сердца (рис.144, 145) в 1-й кластер объединялись наиболее близкие по показателю активности фермента опытные группы 1 и 2. Во 2-й кластер объединялись опытная группа 3 и контрольная 4. И, наконец, в 3-й кластер с наименьшей однородностью объединялись 1-й и 2-й кластеры. Это, вероятно связано с тем, что цыплята 1 и 2 опытных групп получали ПКД, а цыплята 3 опытной группы и 4 контрольной – ПКД не получали. Для АТФаз мышечной ткани (рис. 146) цыплят опытных и контрольной групп наблюдалась отличная картина. Так, в 1-кластер объединялись группа опыта 3 и контрольная группа 4, во 2-й кластер группы – группы опыта 1 и 2, и с наименьшей степенью однородности, эти кластеры объединялись в 3 кластер. Для почек (рис. 147) установлено, что в 1-й кластер объединяются 3 и 2 опытные группы, затем с меньшей степенью однородности к нему присоединяется 4 контрольная группа, и с еще меньшей однородностью 1 опытная группа. Таким образом, можно сделать следующий вывод, что у цыплят опытных групп 1 и 2, получавших ПКД, показатели АТФазной активности имеют близкие значения в печени, сердечной мышце и скелетной мускулатуре. В почках наблюдаются наибольшие различия активности этого фермента в группах 1 и 2 опыта. Это, вероятно связано с особенностями выведения продуктов метаболизма сукцината и ПКД с мочой. Двухфакторный дисперсионный анализ влияния возраста и кормовых добавок позволил выявить степень и достоверность их влияния на активность АТФазы (табл.18). АТФазная активность печени, почек, сердца и мышечной ткани в значительной степени детерминирована возрастом (P0,05), соответственно на 90,8%, 91,4%, 93,3% и 95,0%. 165 Влияние кормовых добавок так же достоверно, но существенно меньше и составляет: печень - 1,3%; почки – 0,62%; сердце – 1,1%; скелетная мускулатура – 1,1%. Наибольшее влияние добавок отмечено для АТФазы печени. Совместного влияния факторов было не достоверно (P>0,05). Таблица 18. Двухфакторный дисперсионный тканей и органов цыплят-бройлеров, (n=80) Коэффициенты Печень Почки детерминации фактор А (возраст) 0,907904** 0,913723** фактора Б 0,012692** 0,006261 (добавки) совместное влияние факторов 0,012418 0,000176 анализ АТФазной активности Сердечная мышца Скелетная мускулатура 0,933019** 0,950323** 0,011398** 0,011454** 0,000999 0,000582 166 Влияние ПКД и сукцината натрия на продуктивность цыплятбройлеров Кросс «ISA» Прирост живой массы птицы является интегральным показателем ее физиологического состояния и уровня метаболических процессов. Абсолютная масса цыплят групп опыта весь период выращивания увеличивалась (рис. 148). На прирост живой массы оказывало существенное влияние скармливание препаратов, что показывают данные регрессионного анализа (рис.149152). Живая масса цыплят-бройлеров 2500 2000 1500 1000 500 0 1 сут 10 сут 20 сут 30 сут 40 сут Возраст 1 (опыт) 3 (опыт) 2 (опыт) 4 (контроль) Рис. 148. Динамика живой массы цыплят-бройлеров опытных и контрольной групп (P0,05), (n=160) Так, у цыплят 10-суточного возраста живая масса опытной группы 3, получавшей янтарную кислоту (P<0,05) была достоверно ниже контрольного показателя, в то время как в группах 1 и 2, получавших ПКД, достоверных отличий от контроля не наблюдалось. К 30 суточному возрасту достоверные 167 увеличение живой массы по сравнению с контролем наблюдались у цыплят опытной группы 1, получавшей ПКД. В опытной группе 3, получавшей сукцинат натрия, отмечено достоверное снижение прироста живой массы цыплят по сравнению с контролем (P<0,05). Совместное скармливание препаратов цыплятам опытной группы 2 не вызвало достоверного изменения этого показателя по сравнению с контрольной группой. К 40 суточному возрасту достоверные различия живой массы по группам опыта по сравнению с контролем еще более возрастают (P<0,05). 1 (опыт), масса (г) = -182,8024+54,7552*x 2600 2400 2200 2000 1 (опыт), масса (г) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -5 0 5 10 15 20 Возраст 25 30 35 40 45 95% confidence Рис.149. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) 168 2 (опыт), масса (г) = -176,3445+53,203*x 2400 2200 2000 1800 2 (опыт), масса (г) 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 95% confidence Возраст Рис.150. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 3 (опыт), масса (г) = -155,7578+48,8587*x 2400 2200 2000 1800 3 (опыт), масса (г) 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -5 0 5 10 15 20 Возраст 25 30 35 40 45 95% confidence Рис. 151. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) 169 4 (контр.), масса (г) = -159,3182+49,7454*x 2400 2200 2000 4 (контр.), масса (г) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -5 0 5 10 15 20 Возраст 25 30 35 40 45 95% confidence Рис. 152. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) Регрессионный анализ данных показывает, что наибольший прирост живой массы отмечен у цыплят опытных группы 1 и 2, получавших ПКД, который описывается следующими уравнениями регрессии: у=-182,8+54,8Х и у=-176,3+53,2Х соответственно, где у – живая масса в граммах, Х – возраст цыплят в сутках. Наименьший прирост живой массы отмечен в опытной группе 3, получавшей сукцинат: у=-155,8+48,9Х. Это вероятно связано с активацией процессов катаболизма. С целью выяснения силы влияния возраста и кормовых добавок на интенсивность роста цыплят-бройлеров кросса «ISA» был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, результаты которого показали, что основным детерминирующим фактором был возраст цыплят (коэффициент детерминации 99%). Применение добавок оказывало значительно меньшее влияние на прирост живой массы цыплят, так для ПКД коэффициент детерминации составил 170 Кросс «Бройлер-6» Живая масса цыплят опытных и контрольной групп за время проведения эксперимента увеличивалась (рис. 153). Наибольшее увеличение живой массы цыплят выявлено в опытных группах 1 и 2, получавших ПКД. 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1 сут 10 сут 30 сут 60 сут Возраст 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) Рис. 153. Динамика живой массы цыплят-бройлеров опытных и контрольной групп (P0,05), (n=160) Для выведения математической модели возрастной динамики увеличения живой массы цыплят-бройлеров этого кросса опытных и контрольной групп был применен регрессионный анализ (рис. 154-157). Наибольший прирост живой массы отмечен у цыплят опытных группы 1 и 2, получавших ПКД: у=-171,6782+30,8081Х и у=-174,0205+30,2111Х соответственно, где у – живая масса в граммах, Х – возраст цыплят в сутках. Наименьший прирост живой массы отмечен в опытной группе 3, получавшей сукцинат: у=-158,5565+27,1233Х. Это вероятно связано с активацией процессов катаболизма. 171 1 (опыт), масса (г) = -171,6782+30,8081*x 2000 1800 1600 1400 1 (опыт), масса (г) 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 95% confidence Возраст, сут Рис.154. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 1, (n=10) 2 (опыт), масса (г) = -174,0205+30,2111*x 2000 1800 1600 1400 2 (опыт), масса (г) 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис.155. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 2, (n=10) 172 4 (контроль), масса (г) = -158,5565+27,1233*x 1800 1600 1400 4 (контроль), масса (г) 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис.156. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров опытной группы 3, (n=10) 4 (контроль), масса (г) = -157,406+28,3765*x 1800 1600 1400 4 (контроль), масса (г) 1200 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст, сут Рис.157. Регрессионный анализ динамики живой массы цыплят-бройлеров контрольной группы 4, (n=10) 173 С целью выяснения силы влияния возраста и кормовых добавок на интенсивность роста цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, результаты которого показали, что основным детерминирующим фактором был возраст цыплят (коэффициент детерминации 99,5%). Применение добавок оказывало значительно меньшее влияние на прирост живой массы цыплят, коэффициент детерминации 0,20% (P<0,001). Влияние ПКД и сукцината натрия на биохимические показатели тканей и органов цыплят бройлеров Биохимические показатели крови цыплят-бройлеров кросса «ISA» Биохимические показатели крови цыплят опытных и контрольной групп находились в пределах физиологических норм (табл. 19). У 20 и 40 суточных цыплят содержание общего кальция, фосфора и белка сыворотки крови не имело достоверных различий по группам опыта (P>0,05). Однако с возрастом происходило достоверное (P<0,01) увеличение содержания этих компонентов в сыворотке крови. Достоверных различий в содержании белковых фракций сыворотки крови цыплят 20 суточного возраста по группам опыта не обнаруживается (P>0,05), за исключением -глобулинов, уровень которых достоверно выше в опытной группе, получавшей сукцинат (P<0,01). К 40 суточному возрасту происходит заметное снижение количества альбуминовой и увеличение -глобулиновой и -глобулиновой фракций (P<0,01) сыворотки крови. Достоверного различия в содержании белковых фракций по группам опыта не обнаруживается, за исключением глобулинов, содержание которых достоверно ниже (P<0,05) в опытной группе 1, получавшей ПКД, по сравнению с контролем. Таким образом, применение препаратов не оказывало негативного влияния на биохимические показатели крови цыплят-бройлеров. 174 Таблица 19. Биохимические показатели (x±Sx) крови цыплят опытных и контрольной групп 20 и 40 суточного возраста (n=80) Показатель 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 20 40 20 40 20 40 20 40 сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут. Неорганический 1,66± 1,79± 1,68± 1,71± 1,53± 1,63± 1,47± 1,73± фосфор, 0,01** 0,02** 0,01** 0,02 0,03** 0,01** 0,04 0,02 -1 ммольл Общий 2,97± 3,44± 2,82± 3,24± 2,68± 3,17± 2,67± 3,04± кальций, 0,05** 0,03 0,04** 0,03 0,02 0,04 0,02 0,03 ммольл-1 Общий бе- 38,91± 42,74± 37,86± 42,04± 36,15± 40,46± 38,15± 39,32± лок, г·л-1 0,34 0,43** 0,27 0,36** 0,22** 0,44 0,48 0,52 Альбумин, 7,30± 10,25± 7,06± 9,71± 6,57± 8,91± 6,66± 8,62± г·л-1 0,10** 0,17** 0,08** 0,23** 0,06 0,19 0,10 0,15 5,93± 8,02± 5,52± 7,69± 5,05± 7,19± 5,71± 6,13± глобулин, 0,15 0,10** 0,08 0,12** 0,05** 0,13** 0,11 0,10 г·л-1 4,05± 5,60± 3,77± 4,98± 3,22± 4,67± 3,34± 4,00± глобулин, 0,04** 0,07** 0,04** 0,06** 0,02* 0,08** 0,06 0,09 г·л-1 21,63± 18,87± 21,51± 19,66± 21,31± 19,69± 22,43± 20,57± глобулин, 0,16** 0,25** 0,20** 0,21** 0,25** 0,21** 0,29 0,34 г·л-1 * - P<0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе 4. 175 Биохимические показатели крови цыплят бройлеров кросса «Бройлер-6» У цыплят опытных и контрольной групп 15 и 60 суточного возратса биохимические показатели крови находились в пределах физиологических норм (табл. 20). У 15 и 60 суточных цыплят содержание общего кальция, фосфора и белка сыворотки крови не имело достоверных различий по группам опыта (P>0,05). Однако с возрастом происходило достоверное (P<0,01) увеличение содержания этих компонентов в сыворотке крови. Достоверных различий в содержании белковых фракций сыворотки крови цыплят 15 суточного возраста по группам опыта не обнаруживается (P>0,05), за исключением -глобулинов, уровень которых достоверно выше в опытной группе, получавшей сукцинат (P<0,01). К 60 суточному возрасту происходит заметное снижение количества альбуминовой и увеличение -глобулиновой и -глобулиновой фракций (P<0,01) сыворотки крови. Достоверного различия в содержании белковых фракций по группам опыта не обнаруживается, за исключением глобулинов, содержание которых достоверно ниже (P<0,05) в опытной группе 1, получавшей ПКД, по сравнению с контролем. С целью выяснения силы влияния независимых факторов (возраст и добавки) на биохимичесике показатели крови цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ (табл. 17). Наибольшее влияние на содержание кальция и фосфора в сыворотке крови цыплят оказывал возрас, коэффициенты детерминации соответственно 76,5% и 60,7%. Применение добавок оказывало существенно меньшее влияние на содержание фосфора в сыворотке крови (коэффициент детерминации 2,7%, P<0,001). Влияние кормовых добавок на содержание кальция сыворотки крови не выявлено (P>0,05). Возраст цыплят оказывал достоверное (P<0,001) влияние на содержание альбумина, β- и -глобулиновой фракций сыворотки крови (коэффициенты детерминации: 85,5%, 84,5% и 71,2% соответственно). Применение доба176 вок оказывало достоверное влияние только на содержание альбумина и глобулиновой фракций сыворотки крови, что вероятно связано со стимулирующим влиянием ПКД и сукцината на процессы биосинтеза этих белковых фракций сыворотки крови. Таблица 20. Биохимические показатели крови цыплят опытных и контрольной групп 15 и 60 суточного возраста (n=80) Показатель 1 (опыт) 2 (опыт) 3 (опыт) 4 (контроль) 15 60 15 60 15 60 15 60 сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут. Неорганический 1,04 1,17 0,93 1,08 0,88 1,05 0,97 1,11 фосфор, 0,02 0,02* 0,02 0,02* 0,02 0,015* 0,03 0,02* -1 ммольл Общий 1,62 2,41 1,68 2,45 1,53 2,21 1,54 2,19 кальций, 0,06 0,11* 0,06 0,12* 0,15 0,06* 0,02 0,06* ммольл-1 Общий бе- 40,60 41,20 38,70 38,60 39,20 38,20 39,80 38,80 лок, г·л-1 0,30 0,20 0,10 0,10 0,10 0,20° 0,10 0,10° Альбумин, 24,73 14,00 20,63 12,87 18,70 13,22 23,68 13,22 г·л-1 0,74 0,08° 0,35 0,17° 0,84 0,14° 0,24 0,20° 6,86 8,13 7,74 6,69 7,13 6,59 5,65 7,19 глобулин, 0,28 0,06° 0,22 0,04° 0,26 0,05° 0,09 0,06° г·л-1 0,93 5,61 1,28 5,02 1,69 4,78 2,11 4,78 глобулин, 0,01 0,01° 0,02 0,03° 0,03 0,05° 0,04 0,03° г·л-1 9,09 13,17 9,68 13,89 11,68 13,84 8,34 13,33 глобулин, 0,18 0,06° 0,14 0,11° 0,06 0,14° 0,13 0,08° г·л-1 * - P<0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе 4 ° - P<0,05 по сравнению с показателем у цыплят-бройлеров 15 суточного возраста Содержание витаминов и макро- и микроэлементов в печени цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6» Изучение влияния ПКД на обмен витаминов в печени проводили путем определения количества витаминов А, Е и В2 у цыплят в возрасте 1, 10, 30 и 60 суток опытной группы 1 и контрольной группы (табл.21,22,23). 177 Содержание витамина А в печени опытных цыплят, получавших протеиновую кормовую добавку и контрольной, корм которых содержал эквивалентное количество мясокостной муки, в значительной степени зависело от возраста цыплят, коэффициент корреляции в опытной группе составил 0,990,01, в контрольной 0,970,02. Высокие значения коэффициентов корреляции свидетельствуют о линейности связи возраста цыплят и количеством витамина А в печени (табл. 21). Таблица 21. Содержание витамина А в печени цыплят- бройлеров, мкмоль·г-1 Возраст цыплят, Группы Р суток Опытная Контрольная 1 0,900,03 0,830,02 0,05 10 1,400,03 1,300,03 0,05 30 2,290,08 2,340,06 0,05 60 3,930,10 3,850,17 0,05 Уравнение регрессии содержания витамина А в печени цыплят опытной группы y=0,778+0,047x; контрольной y=0,722+0,047x, где y – содержание витамина А в печени цыплят-бройлеров; x – возраст цыплят. Равенство коэффициентов регрессии свидетельствует о равенстве динамики содержания витамина А в печени цыплят опытной и контрольной групп, различия средних не достоверны (P0,05). Содержание витамина Е в печени цыплят опытной и контрольной групп цыплят-бройлеров (табл. 22) в значительной мере зависит от возраста цыплят-бройлеров, коэффициент корреляции содержания витамина Е в печени цыплят от возраста составляет 0,960,03, контрольной 0,980,02. Таблица 22. Содержание витамина Е в печени цыплят-бройлеров, мкмоль·г-1 Возраст цыпГруппы Р лят, суток Опытная Контрольная 1 0,300,02 0,320,02 0,05 10 0,300,01 0,300,01 0,05 30 0,360,01 0,360,01 0,05 60 0,400,01 0,410,01 0,05 178 Уравнение зависимости витамина Е в печени цыплят от возраста у цыплят опытной группы y=0,2728+0,0016x; контрольной y=0,2799+0,0015x. Как следует из полученных результатов исследований, рост содержания витамина Е в печени цыплят опытной и контрольной групп происходит аналогично, различие средних недостоверны (P0,05). Содержание рибофлавина в печени цыплят несколько в меньшей степени зависит от их возраста, коэффициент корреляции у цыплят опытной группы составляет 0,790,19, контрольной 0,830,11 (табл. 23). Таблица 23. Содержание витамина В2 в печени цыплят бройлеров, мкг·г-1 Возраст цыпГруппы Р лят, суток Опытная Контрольная 1 0,350,01 0,380,01 0,05 10 0,460,01 0,460,02 0,05 30 0,450,01 0,420,01 0,05 60 0,500,02 0,500,02 0,05 Уравнение, отражающее динамику роста содержания витамина В2 в печени цыплят опытной группы y=0,3614+0,0018x; контрольной группы y=0,3677+0014x, где x – возраст цыплят, а y – содержание витамина В2 в печени. Различие содержания витамина В2 в печени цыплят опытной и контрольной группы не существенны, что подтверждается и равенством уравнений регрессии (P0,05). Таким образом, проведенные исследования по изучению динамики содержания витаминов А, Е и В2 в печени цыплят в зависимости от источника протеина корма показали, что замена мясокостной муки протеиновой кормовой добавкой из отходов кожевенного производства существенного влияния на обмен витаминов А, Е и В2 в печени цыплят-бройлеров, различия средних опытной и контрольной групп не достоверны. Химический состав мышц и печени (приложение 3) цыплят- бройлеров получавших 3 % протеиновой кормовой добавки, по данным Ю.В. Фурмана 179 (2001), существенно не отличался от химического состава цыплят-бройлеров контрольной группы, получавших эквивалентное количество мясокостной муки. Как следует из анализа приведенных таблиц накопление токсичных тяжелых металлов в органах цыплят-бройлеров: кобальта, никеля, мышьяка, кадмия, лития и других не наблюдали, концентрация их в продуктах убоя обнаруживалась в виде следов. Таким образом, использование протеиновой кормовой добавки из отходов кожевенного производства в количестве 3% от массы потребляемого корма, не приводило к накоплению тяжелых токсических металлов в органах цыплят-бройлеров, содержание других элементов различалось незначительно от показателей контрольной группы. 180 2.2.2. Активность АТФаз эритроцитов свиней Динамика содержания мембранного белка в эритроцитах свиней Содержания мембранного белка в тенях эритроцитов свиней с возрастом не имело достоверных отличий (P>0,05), что подтверждается данными регрессионного аннализа (рис. 158) и составляло в 24 мес – 1,27±0,03; в 12 мес 1,26±0,03; в 6 мес - 1,26±0,03 и в 2 мес - 1,27±0,03. Белок, мг = 1,2631-1E-8*x 1,45 1,40 1,35 Белок, мг 1,30 1,25 1,20 1,15 1,10 1,05 2 года 1 год 0,5 года 60 сут Возраст Рис.158. Возрастная динамика содержания белка в мембранах эритроцитов свиней (n=40) Влияние строфантина-G на АТФазную активность эритроцитов свиней С возрастом отмечается достоверное снижение активности Mg2+,Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+,K+-АТФазы эритроцитов (рис. 159), что подтверждается данными корреляционного и регрессионного анализов (табл. 24). 181 Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 12,5 10,5 8,5 6,5 4,5 2,5 0,5 1 6 11 16 21 Возраст, мес Mg,Na,K-АТФаза Mg-АТФаза Na,K-АТФ аза Рис. 159. Влияние строфантина-G на динамику АТФазной активности эритроцитов свиней (M±m) Таблица 24. Показатели корреляции и регрессии Показатель Mg2+,Na+,K+Mg2+-АТФаза АТФаза Коэффициент воз-0,7753* -0,82301* растной корреляции Уравнение регрессии y=9,64-0,047x y=5,27-0,054x Na+,K+-АТФаза -0,5556143* y=4,37-0,033x С целью выявления степени влияния строфантина-G на активность АТФазы эритроцитов свиней был проведен двухфакторный дисперсионный анализ. Независимым фактором при этом служили возраст (фактор А) и наличие в среде инкубации строфантина- G (фактор Б). За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+,Na+,K+-АТФазы. Дисперсионный анализ показал, что активность АТФазы была детерминирована на 9,15% возрастом и на 87,34% строфантином-G (Р<0,05). Совместное влияние факторов было незначительным (0,58%). Влияние ионов натрия и калия на АТФазную активность эритроцитов свиней Максимальная активность фермента отмечается при концентрации калия - 15-20 ммоль·л-1 и концентрации натрия - 130-150 ммоль·л-1 (рис. 160 и 161). 182 Для определения степени влияния ионов на активность АТФазы был проведен однофакторный дисперсионный анализ, который показал, что ионы натрия детерминировали активность фермента на 52,0%, а ионы калия на 45,8% с высокой степенью достоверности (Р<0,05). Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 3,9 3,7 3,5 3,3 3,1 2,9 2,7 0 2 5 10 15 20 30 Концентрация калия, ммоль/л Рис.160. Влияние ионов калия на активность АТФазы эритроцитов свиней (M±m) Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 4,6 4,4 4,2 4 3,8 3,6 3,4 0 10 30 60 100 130 150 Концентрация натрия, ммоль/л Рис.161. Влияние ионов натрия на активность АТФазы эритроцитов свиней (M±m) 183 Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов свиней С целью сравнения особенностей функционирования АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов свиней с аналогичными показателями у птиц было проведено определение активности АТФаз эритроцитов свиней в средах различного ионного состава (Иващенко А.Т. и др., 1981). В результате было установлено, что активность АТФазы достоверно зависит от наличия в среде инкубации ионов Mg2+, Na+, K+, Ca2+- и HCO3- (табл. 25). Таблица 25. Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) эритроцитов свиней (n=120) Возраст, Mg2+-АТФаза Na+,K+-АТФаза Ca2+-АТФаза HCO3--АТФаза мес 2 5,13±0,08 7,15±0,15** 5,19±0,16 7,90±0,06** 6 4,67±0,11 6,60±0,06** 4,90±0,07 7,38±0,07** 12 4,15±0,12 5,83±0,18** 4,18±0,15 6,52±0,20** 24 3,76±0,12 5,38±0,12** 3,75±0,10 6,18±0,16** 2+ **- P<0,01 по сравнению с активностью Mg -АТФазы По активности изучаемые ферменты можно расположить в следующей возрастающей последовательности: HCO3--АТФаза, Na+,K+-АТФаза, Ca2+АТФаза и Mg2+-АТФаза, что подтверждается данными кластерного анализа (рис. 162) 12 Степень близости параметров 10 8 6 4 2 0 HCO3--АТФаза Ca2+-АТФаза Na+,K +-АТФаза Mg2+-АТФаза Рис.162. Дендрограмма активности АТФаз эритроцитов свиней 184 С целью выявления влияния возраста свиней на активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов были проведены регрессионный (рис. 163-166) и дисперсионный анализы. При этом было установлено, что возрастная динамика активность Mg2+-АТФазы эритроцитов свиней описывается следующим уравнением регрессии: y=5,0833-0,0597x. Активность Mg2+-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 5,0833-0,0597*x 5,8 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 2+ Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 5,6 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 163. Возрастная динамика активности Mg2+-АТФазы эритроцитов свиней (n=40) Активность N+,K +-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 7,1009-0,0783*x 7,5 7,0 6,5 6,0 + + Активность N ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,0 5,5 5,0 4,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 164. Возрастная динамика активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов свиней (n=40) 185 Возрастная динамика активность Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов свиней описывается уравнениями регрессий: y=7,009-0,0783x, y=5,2368-0,0664x и y=7,8382-0,0768x. Активность Ca2+-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 5,2368-0,0664*x 2+ Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 165. Возрастная динамика активности Ca2+-АТФазы эритроцитов свиней (n=40) Активность HCO3--АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 7,8382-0,0768*x 8,0 7,5 7,0 6,5 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 8,5 6,0 5,5 5,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 166. Возрастная динамика активности HCO3--АТФаз эритроцитов свиней (n=40) 186 Таким образом, установлено, что наибольшее снижение активности с возрастом наблюдалось для Na+,K+-, и HCO3--АТФаз эритроцитов, что вероятно связано со снижением метаболических процессов в этих клетках, происходящее с возрастом. Это подтверждается дисперсионным анализом. Однофакторный дисперсионный анализ показал, что активность Mg2+АТФазы была детерминирована возрастом на 71,2%, Na+,K+-АТФазы на – 73,5%, Ca2+-АТФазы на – 69,7% и HCO3--АТФазы на – 73,6% с высокой степенью достоверности (P<0,001). С целью изучения влияния ионного состава среды инкубации на АТФазную активность был проведен однофакотрный дисперсионный анализ. За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+-АТФазы. Результаты анализа показали, что активность Na+,K+-АТФазы была детерминирована составом среды на 61,9%, HCO3--АТФазы на – 76,5% с высокой степенью достоверности (P<0,001) в то время как внесение в среду инкубации ионов Ca2+ не отражалось на активности АТФазы (P>0,05). 187 2.3.2. Активность АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота Симментальская порода Динамика содержания мембранного белка в эритроцитах Содержания мембранного белка в тенях эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы с возрастом не имело достоверных отличий (P>0,05), что подтверждается данными регрессионного аннализа (рис.167) и составляло в 24 мес – 2,21±0,04; в 12 мес 2,26±0,04; в 6 мес – 2,32±0,03. Белок, мг = -2,9327+0,0508*x 2,50 2,45 2,40 Белок, мг 2,35 2,30 2,25 2,20 2,15 2,10 2,05 2 года 1 год 0,5 года Возраст Рис.167. Возрастная динамика содержания белка в мембранах эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=40) Влияние строфантина-G на АТФазную активность эритроцитов С возрастом было отмечено достоверное снижение активности Mg2+,Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+,K+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (рис. 168), что подтверждается данными корреляционного и регрессионного анализов (табл. 26). 188 Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Возраст, мес Mg,Na,K,-АТФаза Mg-АТФаза Na,K-АТФаза Рис. 168. Возрастная динамика активности АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (M±m) Таблица 26. Показатели корреляции и регрессии Показатель Mg2+,Na+,K+Mg2+-АТФаза АТФаза Коэффициент возрастной корреляции -0,69473* -0,57335* Уравнение регрессии y=3,07-0,03*x y=1,99-0,02*x Na+,K+-АТФаза -0,31382* y=1,07-0,01*x С целью выявления степени влияния строфантина-G на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы был проведен двухфакторный дисперсионный анализ. Независимым фактором при этом служили возраст (фактор А) и наличие в среде инкубации строфантина-G (фактор Б). За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+,Na+,K+-АТФазы. Дисперсионный анализ показал, что активность АТФазы была детерминирована на 3,5% возрастом и на 90,5% строфантином-G (Р<0,05). Совместное влияние факторов было незначительным (0,6%). 189 Влияние ионов натрия и калия на АТФазную активность эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы Максимальная активность фермента отмечается при концентрации калия - 15-30 ммоль·л-1 и концентрации натрия - 100-150 ммоль·л-1 (рис. 169, 170). Для определения степени влияния ионов на активность АТФазы был проведен однофакторный дисперсионный анализ, который показал, что ионы натрия детерминировали активность фермента на 82,2%, а ионы калия на Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 67,8% с высокой степенью достоверности (Р<0,05). 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0 2 5 10 15 20 30 Концентрация калия, ммоль/л Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис.169. Влияние ионов калия на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (M±m) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 10 30 60 100 130 150 Концентрация натрия, ммоль/л Рис.170. Влияние ионов натрия на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (M±m) 190 Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы С целью сравнения особенностей функционирования АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов крупного рогатого скота с аналогичными показателями у птиц и свиней было проведено определение активности АТФаз эритроцитов свиней в средах различного ионного состава (Иващенко А.Т. и др., 1981). В результате было установлено, что активность АТФазы достоверно зависит от наличия в среде инкубации ионов Mg2+, Na+, K+, Ca2+и HCO3- (табл.27). Таблица 27. Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=120) Возраст, Mg2+-АТФаза Na+,K+-АТФаза Ca2+-АТФаза HCO3--АТФаза мес 6 2,24±0,06 3,11±0,04** 2,37±0,05 3,26±0,05** 12 1,92±0,03 2,42±0,05** 1,98±0,04 2,98±0,06** 24 1,63±0,03 2,27±0,04** 2,10±0,04* 2,36±0,04** 2+ **- P<0,01 по сравнению с активностью Mg -АТФазы По активности изучаемые ферменты можно расположить в следующей возрастающей последовательности: HCO3--АТФаза, Na+,K+-АТФаза, Ca2+АТФаза и Mg2+-АТФаза, что подтверждается данными кластерного анализа (рис. 171). Так в 1-й кластер объединяются показатели активности Mg2+- и Ca2+-АТФаз, во 2-й кластер с меньшим родством - HCO3--АТФаза и Na+,K+АТФаза и в 3-й кластер объединяются 1-й и 2-й кластеры. 191 2,8 Степень близости параметров 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 HCO3--АТФаза Ca2+-АТФаза Na+,K +-АТФаза Mg2+-АТФаза Рис.171. Дендрограмма активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы С целью выявления влияния возраста на активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы был проведен регрессионный анализ (рис. 172-175). При этом было установлено, что возрастная динамика активность Mg2+-АТФазы эритроцитов описывается уравнением регрессии: y=3,3813-0,0322x. Активность Mg2+-АТФазы, нм Фн/мг белка в мин = 2,3813-0,0322*x 2,6 2,4 2,2 2,0 2+ Активность Mg -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 2,8 1,8 1,6 1,4 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 172. Возрастная динамика активности Mg2+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=40) 192 Активность Na+,K +-АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 3,1824-0,0418*x 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 + + Активность Na ,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 3,4 2,2 2,0 1,8 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 173. Возрастная динамика активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=40) Возрастная динамика активность Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы описывается уравнениями регрессий: y=3,1824-0,0418x, y=2,3123-0,0114x и y=3,5776-0,0506x. Активность Ca2+-АТФазы, нм Фн/мг белка в мин = 2,3123-0,0114*x 2,6 2+ Активность Ca -АТФазы, нм Фн/мг белка в мин 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 174. Возрастная динамика активности Ca2+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=40) 193 Активность HCO3--АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин = 3,5776-0,0506*x 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 - Активность HCO3 -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 3,6 2,4 2,2 2,0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 175. Возрастная динамика активности HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы (n=40) Таким образом, установлено, что наибольшее снижение активности с возрастом наблюдалось для Na+,K+-, и HCO3--АТФаз эритроцитов, что вероятно связано со снижением метаболических процессов в этих клетках, происходящее с возрастом. Это подтверждается дисперсионным анализом, который показал, что активность Mg2+-АТФазы была детерминирована возрастом на 78,9%, Na+,K+-АТФазы на – 88,8%, Ca2+-АТФазы на – 63,3% и HCO3-АТФазы на – 86,6% с высокой степенью достоверности (P<0,001). 194 Активность АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы Динамика содержания мембранного белка в эритроцитах Содержания мембранного белка в тенях эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы с возрастом не имело достоверных отличий (P>0,05), что подтверждается данными регрессионного аннализа (рис. 176) и составляло в 24 мес – 2,11±0,03; в 12 мес 2,13±0,01; в 6 мес – 2,16±0,03. Белок, мг = 2,1673-0,0024*x 2,35 2,30 2,25 Белок, мг 2,20 2,15 2,10 2,05 2,00 1,95 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис.176. Возрастная динамика содержания белка в мембранах эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (n=40) Влияние строфантина-G на АТФазную активность эритроцитов С возрастом было отмечено достоверное снижение активности Mg2+,Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+,K+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (рис. 177), что подтверждается данными корреляционного и регрессионного анализов (табл. 28). 195 Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Возраст, мес Mg,Na,K-АТФ аза Mg-АТФаза Na,K-АТФаза Рис. 177. Возрастная динамика активности АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (M±m) Таблица 28. Показатели корреляции и регрессии Показатель Mg2+,Na+,K+Mg2+-АТФаза АТФаза Коэффициент возрастной корреляции -0,75499* -0,60366* Уравнение регрессии y=3,24-0,03*x y=1,92-0,01*x Na+,K+-АТФаза -0,55524* y=1,32-0,01*x С целью выявления степени влияния строфантина-G на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы был проведен двухфакторный дисперсионный анализ. Независимым фактором при этом служили возраст (фактор А) и наличие в среде инкубации строфантина-G (фактор Б). За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+,Na+,K+-АТФазы. Дисперсионный анализ показал, что активность АТФазы была детерминирована на 3,2% возрастом и на 92,8% строфантином-G (Р<0,05). Совместное влияние факторов было незначительным (0,4%). 196 Влияние ионов натрия и калия на АТФазную активность эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы Максимальная активность фермента отмечается при концентрации калия - 15-30 ммоль·л-1 и концентрации натрия - 100-150 ммоль·л-1 (рис. 178, 179). Для определения степени влияния ионов на активность АТФазы был проведен однофакторный дисперсионный анализ, который показал, что ионы натрия детерминировали активность фермента на 85,9%, а ионы калия на Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин 87,0% с высокой степенью достоверности (Р<0,05). 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0 2 5 10 15 20 30 Концентрация калия, ммоль/л Активность АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис.178. Влияние ионов калия на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (M±m) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 10 30 60 100 130 150 Концентрация натрия, ммоль/л Рис.179. Влияние ионов натрия на активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (M±m) 197 Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы В результате исследований было установлено, что активность АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы достоверно зависит от наличия в среде инкубации ионов Mg2+, Na+, K+, Ca2+- и HCO3- (табл. 29). Таблица 29. Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±σ) эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы (n=120) Возраст, Mg2+-АТФаза Na+,K+-АТФаза Ca2+-АТФаза HCO3--АТФаза мес 6 2,37±0,07 3,29±0,06** 2,42±0,07 3,41±0,06** 12 2,07±0,03 2,53±0,04** 2,11±0,03 3,18±0,04** 24 1,86±0,04 2,37±0,03** 1,91±0,04 2,47±0,03** 2+ **- P<0,01 по сравнению с активностью Mg -АТФазы По активности изучаемые ферменты можно расположить в следующей возрастающей последовательности: HCO3--АТФаза, Na+,K+-АТФаза, Ca2+АТФаза и Mg2+-АТФаза, что подтверждается данными кластерного анализа (рис. 180). Так в 1-й кластер объединяются показатели активности Mg2+- и Ca2+-АТФаз, во 2-й кластер с меньшим родством - HCO3--АТФаза и Na+,K+АТФаза и в 3-й кластер объединяются 1-й и 2-й кластеры. 3,5 Степень близости параметров 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 HCO3--АТФаза Ca2+-АТФаза Na+,K +-АТФаза Mg2+-АТФаза Рис.180. Дендрограмма активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы 198 С целью выявления влияния возраста на активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы был проведены регрессионный анализ (рис. 181-184). При этом было установлено, что возрастная динамика активность Mg2+-АТФазы эритроцитов описывается уравнением регрессии: y=2,4799-0,0268x. Mg2+-АТФаза = 2,4799-0,0268*x 2,8 2,6 2+ Mg -АТФаза 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 181. Возрастная динамика активности Mg2+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы Na+,K +-АТФаза = 3,3718-0,0457*x 3,6 3,4 3,0 + + Na ,K -АТФаза 3,2 2,8 2,6 2,4 2,2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 182. Возрастная динамика активности Na+,K+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы 199 Возрастная динамика активность Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов - y=3,3718-0,0457x, y=2,5181-0,0268x и y=3,7663-0,0534x. Ca2+-АТФаза = 2,5181-0,0268*x 3,0 2,8 2+ Ca -АТФаза 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 183. Возрастная динамика активности Ca2+-АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы HCO3--АТФаза = 3,7663-0,0534*x 3,8 3,6 3,4 3,0 - HCO3 -АТФаза 3,2 2,8 2,6 2,4 2,2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 184. Возрастная динамика активности HCO3--АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы 200 Таким образом, установлено, что наибольшее снижение активности с возрастом наблюдалось для Na+,K+-, и HCO3--АТФаз эритроцитов, что вероятно связано со снижением метаболических процессов в этих клетках, происходящее с возрастом. Это подтверждается дисперсионным анализом, который показал, что активность Mg2+-АТФазы была детерминирована возрастом на 67,5%, Na+,K+-АТФазы на – 89,9%, Ca2+-АТФазы на – 65,2% и HCO3-АТФазы на – 89,6% с высокой степенью достоверности (P<0,001). 201 Заключение На современном этапе развития биологической науки, разработка и использование новых препаратов и способов лечения животных невозможна без детального изучения биохимических процессов, протекающих в организме разных видов животных в отдельные стадии постнатального онтогенеза, при различных физиологических состояниях в норме и патологии. За последние десятилетия накоплен большой практический материал по энзимологии, проблемам клеточной проницаемости, ионного транспорта и его связи с метаболическими процессами в организме животных, ключевое место в которых отводится активному транспорту ионов при участии АТФазных насосов и затрате химической энергии АТФ. Транспортные аденозинтрифосфатазы являются связующим звеном в осуществлении строго скоординированных биохимических процессов протекающих в клетках и межклеточной среде организма животных. Поэтому их функциональная активность представляет собой важнейший критерий оценки метаболического состояния, как всего организма, так и отдельных его органов, тканей и клеток. Для изучения особенностей функционирования АТФазных ионных насосов, встроенных в биомембраны различных клеточных органоидов, необходимо их выделение в достаточно чистом виде, что достигается различными методами, в частности дифференциальным центрифугированием. Наиболее удобными и информативными клетками, в этом отношении, являются эритроциты. Являясь основными форменными элементами крови – ткани, связывающей организм в единое целое, они наиболее полно отражают состояние его метаболических процессов. Однако эритроциты птиц содержат ядра, что отличает их от красных кровяных клеток других видов животных и затрудняет изучение АТФазных насосов, интегрированных в их мембраны. По своему строению и функционироанию цитоплазматические и ядерные мембраны мембраны имеют существенные различия, заключающиеся не только составе их билипидного слоя, но и в особенностях функционирования 202 интегрированных в них белковых ансамблей, и в частности транспортных АТФаз. АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов птиц, имеют особенности функционирования, отличающие их от аналогичных структур других видов животных. Так, ионы натрия в количестве 130 ммоль·мл-1 в значительной степени активизируют работу мембранных АТФаз, ионы калия оказывают меньшее влияние на активность фермента, вероятно, это связано с блокировкой или отсутствием влиянием калий - зависимого центра его регуляции. Эти результаты подтверждались и в опытах по применению ингибитора АТФазы – уабаина, действующего преимущественно на калий-зависимый центр фермента. Применение ингибитора в концентрации от 2 до 100 ммоль не оказывало влияния на величину активности АТФазы эритроцитов птицы. Аналогичные результаты получены в исследованиях Р.А. Степаняна и А.А. Симоняна (1981). Для решения задачи по изучению особенностей функционирования АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров нами была разработана методика выделения этих мембран эритроцитов, основанная на 3х кратном замораживании-оттаивании в растворе сахарозы с последующим градиентным центрифугированием. Установлено, что АТФазы цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят имеют существенные различия, которые проявляются в активирующем действии ионов Na+ и K+ на эти мембраны. Так, замена в среде инкубации ионов натрия на ионы калия практически не отражалась на активности АТФазы ядерной мембраны эритроцитов, коэффициент корреляции (rxy) составил 0,3280,357 с достоверностью (P) > 0,05. В то время как аналогичная замена ионов в среде инкубации цитоплазматических мембран приводила к достоверному изменению их АТФазой активности P<0,05. Коэффициент корреляции между АТФазной активностью цитоплазматических мембран эритроцитов и качественным составом среды инкубации составил (rxy) 0,657 203 0,285. Причем Na+,K+- чувствительная компонента АТФаз этой мембраны, по данным дисперсионного анализа, составляет 24,24,49 % (P<0,01) от общей АТФазной активности. Это свидетельствуют о том, что в цитоплазматической мембране эритроцитов цыплят-бройлеров имеется АТФазная система, чувствительная к ионам Na+ и K+, которая отличается от классической Na+,K+- АТФазы, тем, что она не ингибируется уабаином (Р.А. Степанян, 1983). Поэтому логично предположить, что эта ферментная система, по всей видимости, осуществляет Na+,K+,2Cl-–котранспорт. Наличие таких систем в цитоплазматических мембранах эритроцитов подтверждается работами Palfrey H et al (1980); Колосовой И.А. и др. (1993). В результате проведенных исследований установлено, что с возрастом происходит достоверное увеличение АТФазных активностей ядерных и цитоплазматических мембранных структур эритроцитов цыплят-бройлеров. Причем активности Na+,K+- и HCO3-- АТФаз цитоплазматических мембран повышаются к 40 суточному возрасту почти в 2 раза. Такая динамика функционирования АТФаз, по-видимому, связана с перестройкой клеточной мембраны эритроцитов в процессе их роста и созревания. Это подтверждается данными К.Г. Сухомлиной (1986) и Ю.В. Фурмана (1991), которые, в частности, установили повышение АТФазной активности гомогенатов эритроцитов с возрастом. Однако активность аниончувствительной АТФазы ядерных мембран эритроцитов к 40 суточному возрасту наоборот несколько снижается, что, очевидно, связано с угасанием метаболических процессов при созревании эритроцитов. Это подтверждается работами J. Brody, K. Engel (1964); И.А. Болотникова и Ю.В. Соловьева (1980), установившими, что по мере созревания эритроцитов уменьшается активность дегидрогеназ. Проведенный комплекс биохимических, зоотехнических и ветеринарных исследований позволил установить, что скармливание в рационах цыплят-бройлеров янтарной кислоты и протеиновой кормовой добавки оказывает 204 существенное влияние на течение энергетического и пластического обменов в их организме. Показано, что включение в рационы цыплят-бройлеров протеиновой кормовой добавки из отходов кожевенного производства в количестве 3% от массы комбикорма стимулирует белково-минеральный обмен, активность АТФаз и, как следствие, повышает прирост живой массы на 7–8 %. В настоящих исследованиях установлено, что показатели активности Mg2+-, Na+,K+-, Mg2+,Ca2+- и HCO3-- АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят повышаются при скармливании им протеиновой кормовой добавки. Причем по мере роста и созревания эритроцитов наблюдается перераспределение влияний ПКД на эти ионные насосы. Так, если в 10 суточном возрасте цыплят отмечено активирующее действие препарата (в нмоль Фн ·мг белка-1·мин-1) на Mg2+-, Na+,K+- и Mg2+,Ca2+- АТФазы соответственно на 0,79; 0,23 и 0,54 по сравнению с контролем, то к 40 дню наибольшее влияние протеиновая добавка начила оказывать на Mg2+-, Na+,K+- и HCO3-- АТФазы. Причем активности Na+,K+- и HCO3-- АТФаз повышаются по сравнению с контролем на 3,17 и 2,49 нмоль Фн ·мг белка-1·мин-1 соответственнно, а активность Mg2+- АТФазы по сравнению с ним снижается на 1,36 нмоль Фн ·мг белка-1·мин-1. Это подтверждается исследованиями других авторов, изучавших влияние уровня протеина корма на АТФазные активности (C. Spach, A.A. Aschkenasy, 1971; A.A. Shomaev, Sh.S.Tazhibaev, 1979), так, в частности, К.Г. Сухомлин и др. (1986) установлено повышение АТФазной активности органов и тканей цыплят-бройлеров при увеличении уровня переваримого протеина в рационе. Как было показано выше, активирующее действие протеиновой кормовой добавки на различные транспортные АТФазы не одинаково и зависит от возраста и химического состава препарата. Так, влияние ПКД на Na+,K+- АТФазу цитоплазматических мембран эритроцитов главным образом зависит от содержания в ней хрома (P. Hartmut 205 et al., 1980; С.И. Вишняков, 1986; Г.Ф. Рыжкова, 1988), который в малых количествах оказывает стимулирующее действие на этот ионный насос. Большое содержание кальция (до 9 %) обуславливает увеличение активности Mg2+,Ca2+- АТФазы как цитоплазматических, так и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров. Кроме того, по данным С.Н. Орлова и др. (1987), L. Mazzanti et al.(1992), ионы Ca2+ способны оказывать влияние на другие АТФазы, в частности на Na+,K+- и анионную. В зависимости от дозы его действие может проявляться активированием этой АТФазы или ее ингибированием, что очевидно и имеет место в отношении Mg2+- АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 40 суточного возраста. Включение в основной рацион цыплят-бройлеров сукцината в дозе 25 мгкг-1 живого веса по схеме: 4 дня скакрмливание препарата, 3 дня перерыв и тд. приводит к увеличению активности HCO3-- стимулируемой АТФазы ядерных и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 10 и 40 суточного возраста. Однако если в 10 суточном возрасте это стимулирование составляет в среднем 16–18 %, то к 40 суткам оно заметно снижается до 3–4 %, что связано с переходом энергообеспечения эритроцитов птиц при их созревании к анаэробному гликолизу (J. Brody, K. engel, 1964). А так как HCO3-АТФаза, по данным А.Т. Иващенко и С.Т. Рыскуловой (1975); А.Т. Иващенко (1978); А.Т. Иващенко и И.А. Бушневой (1981); К.Р. Утеулина и А.Т. Иващенко (1982); А.А. Болдырева (1985), по всей видимости, является сходной по функции и строению с F1-АТФазой митохондрий (F1-фактор Рэкера), осуществляющей транспорт протонов и сопряжение процессов окисления и фосфорилирования (согласно гипотезе П. Митчела). В связи с этим увеличение активности HCO3--АТФазы при скармливание сукцината является следствием стимуляции энергетического обмена, в частности, цикла лимонной кислоты, что подтверждается рядом авторов. Так В.В. Дынник, Р. Хайнрих и Е.Е. Сельков (1980) предложили математическую модель углеводного энергетического обмена, описывающую взаимодействие гликолиза, цикла Кребса (ди- и трикарбоновых кислот) и H+- транспортных АТФаз. В исследованиях 206 Ю.Г. Каминского и др. (1986) показано увеличение у подопытных животных количества ресинтезированного АТФ на 30% при введении им сукцината аммония. На основании этого можно сделать заключение, что применение янтарной кислоты приводит к увеличению уровня энергетического обмена в организме цыплят-бройлеров, отражающегося на приросте активности HCO3-АТФазы. Кроме того, нами отмечено, что скармливание сукцината цыплятам приводит к снижению активностей Mg2+- и Mg2+,Ca2+- АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят как в 10-, так и в 40 суточном возрасте в среднем на 6–10 % по сравнению с контролем. Это объясняется, по всей видимости, тем, что янтарная кислота подобно щавелевой и лимонной способна образовывать устойчивые комплексы с ионами Ca2+ и Mg2+, делая их физиологически не активными. Так, в частности В.К. Бауман (1968) отмечает, что внутривенное введение курам 1 мл 10% раствора лимонной кислоты приводит к немедленной смерти вследствие связывания находящегося в кровяном русле ионизированного кальция, причем общее количество кальция в сыворотке крови при этом остается постоянным. Это подтверждается результатами настоящих исследований. Так, нами не выявлено достоверной разницы в содержании общего кальция сыворотки крови цыплят опытных групп, получавших сукцинат и контроля, где этот показатель составил от 1,540,02 до 2,190,06. При совместном применении пептидного препарата и сукцината отмечено увеличение активностей всех АТФаз как цитоплазматических, так и ядерных мембран эритроцитов у цыплят 10 и 40 суточного возраста в среднем на 6–10% по сравнению с контролем. Это объясняется стимулированием белково-минерального и энергетического обменов в их организме, что приводит к увеличению приростов живой массы цыплят-бройлеров в среднем на 6%. 207 С этим связано и неодинаковое действие протеинового препарата и сукцината на активность АТФазных систем ядерных и цитоплазматических мембранных структур эритроцитов цыплят. Так, основное стимулирующее действие протеиновая кормовая добавка оказывает на Mg2+-, Na+,K+- и Mg2+,Ca2+- АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят, с чем связано активированием транспорта аминокислот и кальция через плазматические мембраны. Активность Mg2+-АТФазы этих мембран, по данным L. Mircevova, M. Kodicek (1981); S.L. Schrier et al. (1981); G.S. Gordon et al. (1981), прямо связана с эластичностью и сократимостью эритроцитов, обеспечивая эти процессы энергией. Действие сукцината сопровождается увеличением активности HCO3-АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов. Применение препаратов не вызывает существенного изменения биохимических показателей крови, характеризующих белково-минеральный обмен. Так,нами не отмечено достоверной (P>0,05) разницы в содержание общего кальция, фосфора и белка в сыворотке крови цыплят опытных групп по сравнению с контролем, количество которых в среднем составляло 1,540,02 ммольл-1, 0,970,03 ммольл-1 и 3,980,06% соответственно. Однако с возрастом наблюдается незначительное увеличение этих показателей. Сходные данные получены Лукичевой В.А. (1994) на рационах с различными добавками. Скармливание сукцината цыплятам-бройлерам, на ряду со стимулированием энергетического обмена, оказывает влияние на белковый и минеральный обмены, что, по-видимому, связано со снижением активности Na+,K+АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят 10 суточного возраста, вследствие уменьшения транспорта аминокислот и биосинтеза белка. Это подтверждается тем, что в сыворотке крови цыплят опытных групп, получавших сукцинат достоверно ниже уровень альбуминовой фракции, соответственно на 12,2% Совместное применение протеиновой кормовой добавки (опытная группа N 2) частично компенсирует это снижение. К 40 суточному возрасту достоверных различий по этому показателю по группам 208 опыта не наблюдается, а активность Na+,K+- АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят опытных групп, получавших сукцинат, была выше контроля. Это объясняется участием этого насоса во вторично активном транспорте аниона янтарной кислоты через эритроцитарную мембрану. В частности, J. Samarzija, B.T. Hinton (1982) считают, что транспорт анионных аминокиcлот является Na+- зависимым и требует большого числа этих катионов для нейтрализации второй анионной (карбоксильной) группы у молекул аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Применение протеиновой кормовой добавки в рационах цыплят-бройлеров не вызывает существенного изменения в количественном и качественном составе белков крови. Однако, содержание общего белка в сыворотке крови цыплят опытных групп, получавших ПКД, было несколько выше этого показателя в контроле. Применение сукцината оказывает существенное влияние на иммунную систему организма цыплят-бройлеров, что выражается в достоверном увеличении содержания -глобулинов в сыворотке крови. Анализ полученных данных показал, что применение сукцината усиливает энергетический обмен в организме цыплят-бройлеров, вследствие чего происходит снижение пластических процессов и прироста живой массы в среднем на 5-6 % по сравнению с контролем. В то время как скармливание протеиновой кормовой добавки, наоборот усиливает процессы анаболизма белка, отражающийся в увеличении привесов. В проведенных нами исследованиях показано, что АТФазная активность в органах и тканях цыплят-бройлеров в процессе выращивания с суточного до 40-дневного возраста постепенно увеличивалась. Наибольший рост удельной активности отмечен в почках цыплят, несколько меньший наблюдали в печени, а минимальный в сердечной мышце. Замена мясокостной муки протеиновой кормовой добавкой приводила к увеличению удельной АТФазной активности в эритроцитах, печени и почках цыплят. Аналогичные результаты получены в опытах на цыплятахбройлерах, при скармливании им белкового препарата гаприна (К.Г. Сухо209 млина и др. 1986). По данным C. Spaph; A. Aschkenasy (1971); A.A. Shomaev et al. (1979); И.А. Бушневой, А.Т. Ивашенко (1981); R.J. Movre, M. Trojanova (1981) и других, при протеиновой недостаточности, вследствие распада мембранных белков, значительно снижается активность АТФазы в органах и тканях животных, особенно в печени. Использование полученной нами протеиновой кормовой добавки из отходов кожевенного производства оказывало стимулирующее влияние на активность АТФазы эритроцитов, печени, почек, скелетной мышцы и миокарда, что согласуется с данными, полученными в опытах на свиньях и птице (С.И. Вишняков, 1988; Н.А. Миненков, 1991; Рыжкова Г.Ф., 2005). Свиньи, как известно, относятся по типу обменв к уротелическим животным. В связи с этим, биохимические процессы, происходящие в их организме имеют существенные отличия от птиц, в том числе касающиеся и механизмов активного транспорта, связанного с функционированием АТФазных ионных насосов. В наших исследованиях установлено, что содержания мембранного белка в тенях эритроцитов свиней с возрастом не имело достоверных отличий (P>0,05) и составляло в 24 мес – 1,27±0,03; в 12 мес 1,26±0,03; в 6 мес 1,26±0,03 и в 2 мес - 1,27±0,03. На активность АТФазы эритроцитов свиней существенное влияние оказывал специфический ингибитор Na+,K+-АТФазы – уабаин (строфантинG). Так, было установлено, что активность АТФазы детерминирована на 9,15% возрастом и на 87,34% строфантином-G. При этом активность Mg2+,Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+,K+-АТФазы эритроцитов свиней с возрастом достоверно снижалась. Максимальная активность фермента отмечается при концентрации калия - 15-20 ммоль·л-1 и концентрации натрия - 130-150 ммоль·л-1. Причем, активность АТФазы была детерминирована ионами натрия на 52,0% и ионами калия на 45,8% с высокой степенью достоверности (Р<0,05), что согласуется 210 с данными литературы (С.И. Вишняков, 1988; Н.А. Миненков, 1991; Рыжкова Г.Ф., 2005). С целью сравнения особенностей функционирования АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов свиней с аналогичными показателями у птиц было проведено определение активности АТФаз эритроцитов свиней в средах различного ионного состава (Иващенко А.Т. и др., 1981). В результате было установлено, что активность АТФазы достоверно зависит от наличия в среде инкубации ионов Mg2+, Na+, K+, Ca2+- и HCO3-. Так, что активность Na+,K+-АТФазы была детерминирована составом среды на 61,9%, HCO3-АТФазы на – 76,5% с высокой степенью достоверности (P<0,001) в то время как внесение в среду инкубации ионов Ca2+ не отражалось на активности АТФазы (P>0,05). По активности изучаемые ферменты можно расположить в следующей возрастающей последовательности: HCO3--АТФаза, Na+,K+-АТФаза, Ca2+АТФаза и Mg2+-АТФаза. Следует отметить, что аналогичное распределение было установлено и у птиц. При этом, с возрастом было установлено снижение активности данных ферментов, особенное значительное для Na+,K+-, и HCO3--АТФаз эритроцитов, что вероятно связано со снижением метаболических процессов в этих клетках, происходящее с возрастом. Так, активность Mg2+-АТФазы была детерминирована возрастом на 71,2%, Na+,K+-АТФазы на – 73,5%, Ca2+-АТФазы на – 69,7% и HCO3--АТФазы на – 73,6% с высокой степенью достоверности (P<0,001). Крупный рогататый скот по анатомо-физиологическим особенностям пищеварительной системы отличается от птиц и свиней, что оказывает существенное влияние на процессы метаболизма и активность ферментных систем. С целью изучения влияния возраста и породных особенностей крупного рогатого скота на содержание мембранного белка в эритроцитах был проведен двухфакторный дисперсионный анализ, который показал, что возраст детерминирует этот показатель на 8,8%, и порода - на 2,6% с высокой степенью достоверности (P<0,001), совместное влияние факторов выявлено не было. 211 Это храктеризует незначительные породные отличия в содержании мембранного белка эритроцитов. Для выявления влияния возраста и породных особенностей на активность Mg2+,Na+,K+- (общей), Mg2+- (уабаин нечувствительной компоненты) и Na+,K+-АТФазы (уабаин чувствительной компоненты) эритроцитов крупного рогатого скота был проведен двухфакторный дисперсионный анализ (табл.30), показавший, что на активность общей АТФазы возраст оказывал влияние на 56,1%, порода на 8,6%. Активность Mg2+-АТФазы (уабаин нечувствительная компонента) была детерминирована возрастом на 37,4%, при этом влияние породы выявлено не было. Активность Na+,K+-АТФазы (уабаин чувствительной компоненты) была определена возрастом на 19,3% и породой на 15,7%. Таблица 30. Коэффициенты детерминации влияния возраста и породы крупного рогатого скота на активность АТФаз эритроцитов АТФаза Mg2+,Na+,K+Mg2+Na+,K+Возраст (А) 0,561** 0,374** 0,193** Порода (Б) 0,086** 0,000 0,157** А+Б 0,004 0,034 0,014 * - достоверность дисперсии Таким образом, наибольшие породные отличия выявлены для Na+,K+АТФазы (уабаин чувствительной компоненты), что, вероятно, связано с разным уровнем электролитного обмена (Na+ и K+) у животных симментальской и черно-пестрой пород. Определенные породные отличия АТФазы эритроцитов выявлены также и при влиянии на нее ионов электролитов (Na+ и K+), установленные двухфакторным дисперсионным анализом (табл.31). 212 Таблица 31 Коэффициенты детерминации влияния градиента ионов электролитов и породы крупного рогатого скота на АТФазную активность эритроцитов АТФаза Na+ K+ Градиент концентрации иона (А) 0,722*** 0,797*** Порода (Б) 0,132*** 0,093*** А+Б 0,005 0,002 Выявлено, что ионы Na+ детерминируют АТФазную активность эритроцитов крупного рогатого скота на 72,2%, при этом породные особенности животных оказывают влияние на Na+ -чувствительную компоненту на 13,2%. Ионы K+ определяют активность АТФазы на 79,7%, при этом порода оказывает влияние всего на 9,3% с высокой степенью достоверности. В исследованиях установлены достоверные породные отличия активности Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов (табл.32, рис. 185, 186) Таблица 32. Коэффициенты детерминации влияния возраста и породы крупного рогатого скота на активность АТФаз эритроцитов АТФаза Mg2+Na+,K+Ca2+HCO3-Возраст (А) 0,661** 0,868** 0,559** 0,852** Порода (Б) 0,096** 0,026** 0,000* 0,032** А+Б 0,005 0,002 0,085** 0,002 * - достоверность дисперсии При этом были установлены, породные отличия активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота: Mg2+-АТФазы на 9,6%; Na+,K+АТФазы на 2,6%, и HCO3--АТФазы на 3,2%. Активность Ca2+-АТФазы не имела достоверных породных отличий. Анализ математической модели зависимости активности Mg2+-АТФазы от возраста животных (рис. 185, 186) показал, что у молодых животных потенциал симментальской породы был существенно выше, чем у черно- 213 пестрой породы. При этом эти две породы имели примерно одинаковые темпы возрастного снижения аткивности этого фермента. АТФазная активность, нмоль Фн/мг белка в мин Mg2+-АТФаза = 2,42*exp(-0,0169*x) Na +,K+-АТФаза = 3,2065*exp(-0,0158*x) Ca 2+-АТФаза = 2,2986*exp(-0,005*x) HCO3- -АТФаза = 3,6683*exp(-0,0183*x) 3,6 Mg2+-АТФаза Na +,K+-АТФаза Ca 2+-АТФаза HCO3--АТФаза 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 185. Регрессионный анализ возрастной динамики активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота симментальской породы Scatterplot (Spreadsheet1 5v*30c) Mg2+-АТФаза = 2,4983*exp(-0,0128*x) Na +,K+-АТФаза = 3,3938*exp(-0,0163*x) Ca 2+-АТФаза = 2,5341*exp(-0,0125*x) HCO3- -АТФаза = 3,8655*exp(-0,0184*x) АТФазная активность, нмоль Фн/мг белка в мин 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Возраст, мес Рис. 186. Регрессионный анализ возрастной динамики активности АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы 214 Так, активность Na+,K+- и Ca2+-АТФаз у молодых животных чернопестрой породы была достоверно выше этого показателя у симменталов, что говорит о более высоком уровне обмена веществ, однако у животных чернопестрой породы возрастные темпы снижения активности этих ферментов были выше, чем у симменталов. Активность HCO3--АТФазы эритроцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы 6 мес возраста была достоверно выше аналогичного показателя животных симментальской породы, у которых, кроме этого, был выше темп возрастного снижения активности этого фермента. Полученные данные позволяют сделать предположение, что животные черно-пестрой породы при рождении получают более высокий генетический потенциал, проявляющийся в уровне активности АТФаз, однако с возрастом происходит его снижение, до уровней симментальской породы. 215 ВЫВОДЫ 1. Вид животных (птицы, свиньи и крупный рогатый скот), в зависимости от возраста (фаз постнатального онтогенеза) и физиологического состояния, обусловленного генетическим потенциалом (породой, кроссом), кормлением, физиологическим созреванием, продуктивностью и скоростью роста, определяет своеобразие активности транспортных АТФазных ферментных систем клеток тканей, органов и субклеточных структур. 1.1. У цыплят-бройлеров кроссов «ISA» и «Бройлер-6» активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов детерминирована возрастом: Mg2+-АТФазы на 59,2-73,0%, Na+,K+-АТФаза на 62,1-95,6%, Ca2+АТФаза на 67,8-80,8% и HCO3--АТФаза на 87,6-95,6%. Активность ядерных АТФаз детерминирована возрастом на 90,0-67,1% - Mg2+-АТФазы, 86,170,9% - Na+,K+-АТФазы, 90,8-65,0% - Ca2+-АТФазы и HCO3--АТФазы – на 29,1-44,8%. 1.2. У свиней активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз мембран эритроцитов зависит от возраста: наибольшее снижение для Na+,K+-, и HCO3-АТФаз эритроцитов. Активность Mg2+-АТФазы детерминирована возрастом на 71,2%, Na+,K+-АТФазы на – 73,5%, Ca2+-АТФазы на – 69,7% и HCO3-АТФазы на – 73,6% (***). 1.3. С возрастом крупного рогатого скота активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз эритроцитов достоверно снижается. Активность Mg2+АТФазы детерминирована возрастом на 66,1%, Na+,K+-АТФазы на – 86,8%, Ca2+-АТФазы на – 55,9% и HCO3--АТФазы на – 85,2% (***). Динамика активности АТФаз у симментальской и черно-пестрой пород имеет определенные отличия. Активность Mg2+-АТФазы детерминирована породой на 9,6%, Na+,K+-АТФазы на – 2,6% и HCO3--АТФазы на – 3,2% (***) влияние породы на активность Ca2+-АТФазы не установлено. 2. Активность АТФазных ферментных систем эритроцитов цыплятбройлеров специфична по отношению концентраций ионов натрия, калия и магния. Так, наибольшее активирующее влияние на АТФазную активность проявляется при концентрациях ионов: натрия – 115-145, ионов калия – 1928, ионов магния – 2,0-4,0 ммоль·мл-1. При этом активность АТФазы на 76,5% детерминирована ионами магния, на 96,5% ионами натрия и на 47,6% ионами калия. Максимальная АТФазная активность отмечалась в инкубационной среде, содержащей ионы: Na+ - 120 ммоль·мл, К+ - 20 ммоль·мл; Mg2+ - 3,0 216 ммоль·мл и составляла 9,240,23 нмоль Фн ·мг белка-1·мин-1. На активность АТФазы не оказывает влияния специфический ингибитор – строфантин-К в диапазоне концентраций 0-100 ммоль·л-1 в среде содержащей ионы Na+ и К+, так и в среде без них. 3. АТФазы, локализованные в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров имеют определенные различия. Так, ионы Na+ и K+ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, ионы Ca2+ - на 87% и HCO3- анион - на 96% с высокой степенью достоверности. Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na+, K+ и Ca2+ (P>0,05) и была детерминирована ионами HCO3- на 96% (P<0,01). 4. Кормовые добавки (пептидная кормовая добавка и сукцинат) оказывают существенное влияние на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA»и «Бройлер-6», и таким образом на физиологические процессы, обеспечивающие скорость роста. 5. Различные ткани и органы цыплят-бройлеров своеобразны по уровню АТФазной активности. По уровню возрастания АТФазной активности они располагаются в следующий ряд: почкискелетные и сердечные мышцыпечень. У цыплят кроссов «ISA» и «Бройлер-6» установлена сходная возрастная динамика активности фермента тканей и органов. С возрастом цыплят активность АТФазы увеличивается: наибольшие изменения отмечены в печени, сердце и мышечной ткани и в меньшей степени - в почках. 6. Динамика АТФазной активности тканей и органов цыплят-бройлеров кроссов «ISA» и «Бройлер-6» зависит от применяемых добавок (ПКД и сукцинат) - наибольший рост активности АТФазы в печени, почках и мышцах цыплят, получавших ПКД и в сердечной мышце, получавших сукцинат; имеет кроссовые и возрастные отличия - детерминация возрастом более выражена у кросса «Бройлер-6», а кормовыми добавками у кросса «ISA». 7. Кормовые добавки (ПКД и сукцинат) оказывают стимулирующее влияние на физиологические процессы, обеспечивающие скорость роста. Наибольший прирост живой массы цыплят-бройлеров кроссов «ISA» и «Бройлер-6» отмечен в группах, получавших ПКД, а наименьший - в группе, получавшей сукцинат; скорость роста цыплят-бройлеров кросса «ISA» существенно выше у цыплят-бройлеров кросса «Бройлер-6». 217 8. Скорость роста цыплят-бройлеров кроссов «ISA» и «Бройлер-6» имеет достоверную сильную корреляционную связь с активностью АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов. 9. На активность АТФазы эритроцитов свиней существенное влияние оказывает специфический ингибитор (строфантин-G), который детерминирует активность фермента на 87,34%. Активность АТФазы зависела от физиологического состояния, возраста - на 9,15%. При этом активность Mg2+,Na+,K+-АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+,K+-АТФазы эритроцитов свиней с возрастом снижалась. 10. Максимальная активность АТФазы эритроцитов свиней отмечается при концентрации ионов калия - 15-20 ммоль·л-1 и концентрации ионов натрия - 130-150 ммоль·л-1. Ионы натрия детерминируют активность фермента на 52,0%, а ионы калия - на 45,8% (*). 11. Возраст крупного рогатого скота оказывает влияние на активность общей АТФазы эритроцитов на 56,1%, физиологическое состояние, обусловленное породой - на 8,6%. Активность Mg2+-АТФазы (уабаин нечувствительная компонента) детерминирована возрастом на 37,4%, при этом влияние породы выявлено не было. Активность Na+,K+-АТФазы (уабаин чувствительной компоненты) определена возрастом на 19,3% и породой - на 15,7%. 12. У крупного рогатого скота активность АТФазы детерминирована на 90,5-92,5% строфантином-G (*). Ионы Na+ детерминировали АТФазную активность эритроцитов крупного рогатого скота на 72,2%, ионы K+ - на 79,7%. При этом породные особенности животных оказывали влияние на Na+чувствительную компоненту АТФазы на 13,2% и на K+-чувствительную компоненту - на 9,3% с высокой степенью достоверности. 13. Изучением скорости активного и пассивного переноса веществ, продуктов гидролиза ПКД через стеку кишечника установлено, что скорость переноса веществ на 71% (*) детерминирована временем опыта и на 27% (*) добавлением в раствор энергетических метаболитов. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Рекомендуется широкое использование в бройлерном птицеводстве протеиновой кормовой добавки из отходов кожевенного производства для восполнения в растительных рационах дефицита кормового белка. 2. Установленные биохимические тесты (показатели активности транспортных АТФазных насосов) рекомендуется применять для оценки метабо218 лического состояния, физиологических процессов и функций в организме цыплят-бройлеров, свиней и крупного рогатого скота симментальской и черно-пестрой пород в практической и научно-исследовательской работе. 3. Научные разработки и выводы работы рекомендуются к использованию при написании учебных пособий и методических указаний по физиологии, биохимии и кормлению сельскохозяйственных животных, по скотоводству, свиноводству и птицеводству для студентов вузов по агробиологическим специальностям. 4. Материалы диссертации внедрены в сельскохозяйственные предприятия разных типов и форм собственности Курской области, используются в учебном процессе в изучении курсов «Физиология» и «Биохимия», в ФГОУ ВПО «Курский институт социального образования (филиал) РГСУ», ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии». 219 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. А.с. RU 51337 U1, МПК, А 61 D 7/00 (2006.01). Устройство для определения скорости всасывания питательных веществ [Text] / В.В. Мосягин [и др.]. – патент на полезную модель; заявка 3 2005129472; зарегистр. 10.02.2006. 2. Аврова, Н.Ф. Влияние глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на активность Na+,K+-АТФазы и накопление продуктов перекисного окиления липидов в синаптосомах коры мозга крыс [Text] / Н.Ф. Аврова, СМ. Молчанова, Л.А. Юрлова и др. // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 2004. - Т.40, № 1. - С. 39-46. 3. Айзман, Р.И. Формирование в онтогенезе ионодепонирующей функции тканей патологии [Текст] / Р.И Айзман, Л.К. Великанова //Журнал эволюции, биохимии и физиологии. – 1978. – Вып.14. – С. 547-552. 4. Акимова, О.А. Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой [Text] / О.А. Акимова, Н.В. Долгова, Н.В. Мает, A.M. Рубцов, О.Д. Лопина // Биохимия. - 2003. - Т. 68, вып. 9. - С. 1271-1279. 5. Активность лизосомальных и некоторых других ферментов в тканях мидий при разном уровне солености [Текст] / Р.У. Высоцкая [и др.] // Проблемы изучения рационального использования и охраны ресурсов Белого моря: материалы IX Междунар. конф. – Петразаводск, 2005. – С. 72-75. 6. Активность некоторых ферментов энергетического обмена у птицы при разных белковых добавках к рациону [Текст] / К.Г. Сухомлина [и др.] // Сборник научных трудов ТСХА. – М.: ТСХА, 1986. – С. 111–114. 7. Антонов, В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран [Текст] / В.Ф. Антонов. – М.: Наука, 1982. – 151 с. 8. Архипов, А.В. Протеиновое и аминокислотное питание птицы [Текст] / А.В. Архипов, Л.В. Топорова. – М.: Колос, 1984. – 247 с. 220 9. Архипов, А.В. Липидное питание, продуктивность птицы и качество продуктов птицеводства [Text] / А.В. Архипов. – М.: Агробизнесцентр. – 2007. – 440 с. 10. Аскари, А. Регуляция Na-насоса липопротеидами: механизм и физиологическое значение [Text] / А. Аскари // Биологические науки. - 1990. №6. -С.7-15. 11. Багель, И.М. Модификация активности Са2+-АТФазы мембран саркоплазматического ретикулума скелетной мышцы после облучения у животных с гипофункцией щитовидной железы [Текст] / И.М. Багель, Е.В. Шафрановская // Третий съезд по радиационным исследованиям: тезисы докладов. – М.: Пущино, 1997. – Т.1. – С. 227-228. 12. Барьерно-транспортные и структурные свойства мембран эритроцитов при псориазе [Текст] / И.И. Мавров [и др.] // Дерматологiя та венерологiя. – 2002. – № 2 (16). – С. 15-19. 13. Батоцыренова, Е.Г. Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность Nа+,К+-АТФазы [Электронный ресурс]: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04. - СПб., 2005 (Из фондов Российской государственной библиотеки). - Полный текст: http//diss.rsl.ru. 14. Берсимбаев, Р.И. Регуляция активности НСО-3-стимулируемой аденозинтрифосфатазы в слизистой желудка крыс и лягушек [Текст] / Р.И. Берсимбаев, С.М. Шайхин // IV Всесоюзный биохимический съезд : тезисы. – М., 1979. – Т.2. – С.23-24. 15. Биофизика мембран [Текст]. – М., 1969. – 263 с. 16. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы [Текст] / А.А. Болдырев [и др.]. – М.: МГУ, 1985. – 203 с. 17. Болдырев, А.А. Na/K-АТРаза как олигомерный ансамбль / А.А. Болдырев//Биохимия.-2001.-Т. 66, вып. 8.-С. 1013-1025. 221 18. Болдырев, А.А. Na/K-АТФаза – свойства и биологическая роль [Текст] / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – №4. – С.2-9. 19. Болдырев, А.А. Na,K-АТФаза солевых желез утки [Текст] / А.А. Болдырев, О.Д. Лопина, И.А. Свинухова // Биохимия. – 1981. – Т. 46, вып. 8. –С. 24-29. 20. Болдырев, А.А. Na+,К+-АТФаза как олигомерная система [Текст] / А.А. Болдырев // Итоги науки и техники. - ВИНИТИ. – Биол. химия. - 1982. С. 75-146. 21. Болдырев, А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов [Текст] / А.А. Болдырев. – М. : Изд-во МГУ, 1985. – 167 с. 22. Болдырев, А.А. Как регулируется активность мембранных ферментов [Текст] / А.А. Болдырев, В.Д. Прокопьева // Биологические науки. – 1985. – № 9. – С. 5-13. 23. Болдырев, А.А. Новые подходы к исследованию жизни и смерти нейрональной клетки [Текст] / А.А. Болдырев, О.М. Юнева // Соросовский образовательный журнал. – 2004. – Т.8, № 2. – С. 7-14. 24. Болдырев, А.А. Регуляция активности мембранных ферментов [Текст] / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. – 1997. – № 6. – С. 21-27. 25. Болдырев, А.А. Роль структуры субстрата в функционировании Na+,К+ -АТФазы [Текст] /А.А. Болдырев, О.Д. Лопина, И.А. Свинухова // Биохимия. – 1989. – Т.54, вып. 9. – С. 895-908. 26. Болдырев, А.А. Современное состояние проблемы транспортных АТФаз и транспортные аденозинтрифосфатазы [Текст] / А.А. Болдырев. – М.: Изд-во МГУ, 1977. – 115 с. 27. Болдырев, А.А. Функциональная активность Na+,К+ -АТФазы тканей в норме и при патологиях [Текст] / А.А. Болдырев // Украинский биохимический журнал. – 1992. – Т.64, № 5. – С.3-10. 222 28. Болдырев, А.А. Является ли Na+,К+ -АТФаза мишенью окислительного стресса? [Текст] / А.А. Болдырев, Е.Р. Булыгина, Г.Г. Крамаренко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1996. – № 3. – С. 275-278. 29. Болотников, И.А. Гематология птиц [Текст] / И.А. Болотников, Ю.В. Соловьев. – Л. : Наука, 1980. – 116с. 30. Броун, И.И. Са2+: третий сопрягающий ион? [Текст] /И.И. Броун // Биохимия. –1994. – Т.59, вып.12. – С. 1779-1783. 31. Булычев, А.Г. Лизосомные ферменты и активность естественных киллеров [Текст] / А.Г. Булычев, Т.В. Блинова // Цитология. – 199l. – T.33, № 2. – C. 76-79. 32. Бурков, И.А.Структурные основы функционирования транспортных систем [Текст] / И.А. Бурков, А.Ф. Кисилев //Новые методы и модификация в биохимических исследованиях в животноводстве. – М.: Колос, 1970. – С. 174-182. 33. Варфоломеев, С.Д. Биокенетика [Текст] / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. – М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. – 720 с. 34. Великанова, Л.К. Резервные возможности функции почек и водно – солевого гомеостаза [Текст] / Л.К. Великанова, Р.И., Айзман Н.П. Абаскалова. – Новосибирск: НГПУ, 1997. – 128с. 35. Вишняков, С.И. Активность Na+,К+ -АТФазы и распределения электролитов в тканях овец с эритроцитами LK- генотипа [Текст] / С.И. Вишняков. – М., 1984. – 39с. – Деп. в ВНИИ, № 200-84. 36. Вишняков, С.И. Межклеточный обмен в организме животных [Текст] / С.И. Вишняков. – М.: Агропромиздат, 1988. – 158 с. 37. Владимиров, Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки [Текст] / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – №3. – С. 20-27. 223 38. Влияние карнозина на активность Na,K–АТФазы: перспективы применения в клинической кардиологии [Текст] / Г.В. Симония [и др.] // Биохимия. – 1992. – Т. 57, вып. 9. – С. 45-48. 39. Влияние пероксида водорода и гипохлорита на активность Na,KАТФазы мозга [Текст] / А.А. Болдырев [и др.] // Биохимия. – 1995. – Т. 60, вып.10. – С. 1688-1695. 40. Войнова, Р. Транспорт свободных и соединенных пептидной связью аминокислот в тонкой кишке цыплят [Текст] / Р. Войнова, Я. Профиров // Животноводческие науки. – 1997. – № 5-6. – С. 72-75. 41. Галактионов, В.Г. Эволюционная иммунология / В.Г. Галактионов. – М.: ИКЦ,2005. – 407 с. 42. Гальперн, И.Л. Методы ускоренного повышения генетического потенциала продуктивных признаков промышленных кроссов кур [Текст] / И.Л. Гальперн // Достижения науки и техники АПК – 2009. - №7. – С. 50-54. 43. Геннис, Р.Б. Биомембраны: Молекулярная структура и функции [Текст] / Р.Б. Геннис. – М.: Мир, 1997. – 624 с. 44. Георгиевский, В.И. Минеральное питание животных [Текст] / В.И. Георгиевский, Б.Н. Анненков, В.Т.Самохин. – М.: Колос, 1979. – 471 с. 45. Голод, Е.А. Са-зависимая АТФазная активность и перекисное окисление липидов микросомной фракции коркового вещества почек крыс после тепловой ишемии без и с протекцией α-токоферолом [Текст] / Е.А. Голод, М.И. Савина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1997. – Т. 124, № 9. – С. 289-291. 46. Дерффель, К. Статистика в аналитической химии [Текст] / К. Дерффель. – М.: Мир, 1994. – 268 с. 47. Диксон, М. / Ферменты // М. Диксон, Э. Уэбб. – М.: Мир, 1982.- Т.1 – 392 с. 224 48. Долапчиева, С.Д. Экспрессия изоформ и субъединиц Na+ K+АТФазы в моторных нейронах спинного мозга крысы [Текст] / С.Д. Долапчиева // Биологические мембраны. – 1988. – Т15, № 3.– С.286-289. 49. Досон, Р. Справочник биохимика [Текст] / Р. Досон, Д. Элиот, У. Эллиот. – М.: Мир, 1991. – 565 с. 50. Ерин, А.Н. Свободнорадикальные механизмы при церебральных патологиях [Текст] / А.Н Ерин., Н.В. Гуляева, Е.В. Никушкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1994. – № 10. – С. 343-348. 51. Ерюхин, И.А. Воспаление как общепатологическая реакция [Текст] / И.А. Ерюхин, В.Я Белый, В.К. Вагнер. – Л. : Наука, 1989. – 262 с. 52. Жаров, А.В. Современное состояние и перспективы развития патологической анатомии / А.В. Жаров, В.П. Шишков // Проблемы инфекционной и и незаразной патологии сельскохозяйственных животных. Материалы Всероссийской научно-методической конференции патологической анатомии с/х животных. – Казань, 1998. С. 3-12. 53. Жегунов, Г.Ф. Возможный механизм регуляции АТФазной активности плазматических мембран миоцитов сердца [Текст] / Г.Ф. Жегунов, В.В. Рязанцев // Физиологический журнал СССР. – 1991. – Т.77, № 3. – С.130-133. 54. Зайцев, С.Ю. Супрамолекулярные ферментные системы крови собак в клинической диагностике / С.Ю. Зайцев, В.И. Максимов, Т.В. Бардюкова // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. – 2008. – Т.49. №2. – С. 122-126. 55. Иванова, В.Т. Путь к синтезу белка [Текст] / В.Т.Иванова, А.Н. Шамина. – Л.: Химия, 1982 – 176 с. 56. Иващенко, А.Т. Аниончувствительная аденозинтрифосфатаза мембран эритроцитов крысы [Текст] /А.Т. Иващенко // Биохимия. – 1978. – Т. 43, № 6. – С. 1086-1089. 225 57. Иващенко, А.Т. Выделение и свойства аниончувствительной аденозинтрифосфатазы из мембран эритроцитов [Текст] / А.Т. Иващенко, И.А. Бушнева // Биохимия. – 1981. – Т.45, № 3. – С. 486-488. 58. Иващенко, А.Т. Исследование аденозинтрифосфатазной активности ядер клеток печени и тимуса крысы [Текст] / А.Т. Иващенко // Биохимия. – 1978. – Т.43, № 11. – С. 2064-2068. 59. Иващенко, А.Т. Исследование аниончувствитеольной аденозинтрифосфатазы митохондрий печени и почек крысы [Текст] / А.Т. Иващенко //Известия АН. КазССР. Сер. Биология. – 1978. – №1. – С. 31-35. 60. Иващенко, А.Т. Механизм влияния анионов на активность аденозинтрифосфатаз [Текст] / А.Т. Иващенко // Научые доклады высшей школы биологических наук. – 1981. – №7. – С. 5-15. 61. Иващенко, А.Т. НСО-3- стимулируемая АТФаза гомогенатов тканей крысы [Текст] / А.Т. Иващенко, А.А. Жубанова, Б.С. Балмуханов // Биохимия. – 1975. – Т.40, №5. – С. 1091-1093. 62. Иващенко, А.Т. Стимулируемая бикарбонатом АТФаза мембран эритроцитов крысы [Текст] / А.Т Иващенко, С.Т. Рыскулова // Вопросы медицинской химии. – 1975. – Вып. 5. – С. 492–494. 63. Идрисов, Г.З. Проблемы повышения качества подготовки зооветспециалистов / Г.З. Идрисов // Материалы Международной научной конференции посвященной 125-летию академии. – Казань, 1998. – Т1. – С. 3-8. 64. Изоферменты Na+ K+-АТФазы серого вещества и ствола мозга теленка [Текст] / Н.М. Владимирова [и др.] // Биологические мембраны. – 1998. – Т.15, №3. – С. 349-352. 65. Исследование АТФазной и АТФ-зависимой активности Са2+ ядрами скелетных мышц. Эффекты денервации и электрической стимуляции [Текст] / О.Г. Куликова [и др.] // Биохимия. – 1982. – Т.47, вып.7. – С.1216-1221. 226 66. Кагава, Я. Биомембраны [Текст] / Я. Кагава. – М. : Высш. школа, 1985. – 303 с. 67. Казеннов, A.M. Влияние стресса и ингибирования ацетилхолинэстеразы in vivo на свойства Na+K+-Атфазы эритроцитов у крыс / A.M. Казеннов, М.Н. Маслова, В.Н. Дубровский, Е.А. Скверчинская, Ф.А.,Рустамов, Т.В. Тавровская // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1999. -Т. 35, №1,-С. 29-32. 68. Казеннов, A.M. Исследование активности Na,K-АТФазы в эритроцитах млекопитающих / А.М.Казеннов, М.Н.Маслова, А.Д. Шалабодов //Биохимия. -1984. - Т.49, ВЫП.7. - С. 1089-1095. 69. Каландаришвили, Ф.А. Окисление и фосфорилирование в ядрах и ядерных оболочках клеток печени крысы в процессе постнатального развития и регенерации после частичной гепактомии [Текст] / Ф.А. Каландаришвили, С.Н. Кузьмина, И.Б. Збарский // Биохимия. – 1977. – №7. – С.1167-1172. 70. Кальницкий Б.Д. Итоги и перспективы исследований в области биологии сельскохозяйственных животных / Б.Д. Кальницкий, В.В. Калашников // Проблемы биологии продуктивных животных. -2007. – №1. – С.612. 71. Капелько, В.И. Нарушение энергообразования в клетках сердечной мышцы: причины и следствия [Текст] / В.И. Капелько // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т.6, №5. – С.14-20. 72. Капля, А.А.Влияние фосфолипазы А2 из яда Naja Naja Oxiana на активность изоферментов Na+K+-Атфазы мозга крысы [Текст] / А.А. Капля, В.В. Кравцова, А.В. Кравцов // Биохимия. – 1996. – Вып. 6. – С. 9981005. 73. Капля, А.А. Инактивация Na+K+-ATP-азы мозга крыс додецилсульфатом натрия: влияние рН, ионов магния, температуры / А.А. Капля, А.В. 227 Кравцов // Украинский биохимический журнал. - 1997. - Т. 69, №4.-С. 38. 74. Капля, А.А. Физиологическая и адаптационная значимость изоферментов Na+K+-ATPазы/ А.А. Канля // Украинский биохимический журнал. 1998. - Т. 70, № 3. - С. 3-11. 75. Кармолиев, Р.Х. Биохимические процессы при свободнорадикальном окислении и антиоксидантной активности. Профилактика окислительного стресса у животных // Р.Х. Кармолиев // Сельскохозяйственная биология.- 2002.- №2.- С.19-28. 76. Кармолиев, Р.Х. Свободнорадикальная патология в этиопатогенезе болезней животных / Р.Х. Кармолиев //Ветеринария.- 2005.- №4.- С.42-47. 77. Клинико-диасгностическое значение определения осмотической и кислотной резистентности эритроцитов у больных геммарогической лихорадкой с почечным синдромом [Текст] / Э.И. Низамова [и др.] // Здравоохранение Башкортостана. – 1997. – №1-2. – С. 30-34. 78. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии [Текст] / И.П. Кондрахин [и др.]. – М.: Агропромиздат, 1985. – 287 с. 79. Колб, В.Г. Интерпретация некоторых энзимологических показателей при заболеваниях внутренних органов [Текст] / В.Г. Колб, Е.Т. Зубовская // Здравоохранение Белоруссии. – 1976. – № 9. – С. 62-66. 80. Колосова, И.А. Роль GTP–связывающих белков в регуляции Na+/H+ – обмена и Na+,K+,2Cl-–котранспорта: действие фторид иона [Текст] / И.А. Колосова, Й. Бернхард, С.Н. Орлов, Ф.Р. Бюллер // Биохимия,1993. т. 58, с. 456. 81. Комаров, Ф.И. Биохимические исследования в клинике [Текст] / Ф.И. Комаров, Б.Ф. Коровкин, В.В. Меньшиков. – Л., 1981. – 408 с. 82. Кондрашова, М.Н. Метод определения неорганического фосфата по спектрам поглощения молибдатных комплексов в ультрафиолете 228 [Текст] / М.Н. Кондрашова, М.Н Лесогорова, С.Э. Шноль // Биохимия. – 1965. – Т.30, вып.3. – С. 567-562. 83. Корниш-Боуден, Э. Основы математики для биохимиков [Текст] /Э. Корниш-Боуден. – М.: Мир, 1983. – 144 с. 84. Кривой, И.И. Роль К+ каналов и Na+ K+-АТФазы в гиперполяризации мембраны скелетных мышечных волокон, вызываемой ацетилхолином [Текст] / И.И. Кривой, Е.В. Лопатина, В.В. Кравцова // Биологические мембраны – 2001. – Т.18, №1. – С.10-15. 85. Кривой, И.И. Экстракт почек свиньи содержит специфический ингибитор оуабаин-чувствительной аг изоформы Na+ K+-ATPазы мышечных волокон диафрагмы крысы / И.И. Кривой, А.Н. Васильев, В.В. Громова, А.Е. Прытков, И.И. Марахова, В.В. Кравцова, М.Г. Добрецов, Ф. Мендел // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2003. Т. 89, № 11.-С. 1340-1351. 86. Кривой, И.И. Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и Ка,К-АТФазы в скелетной мышце / И.И. Кривой, Т.М. Драбкина, М.Г. Добрецов, А.Н. Васильев, В.В. Кравцова, М.Дж. Итон, С.Н. Скачков, Ф. Мендел // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. -Т. 90, Яо1.-С. 59-72. 87. Кривой, И.И. Анализ взаимодействия никотинового холинорецептора и Na+ K+-АТФазы в скелетной мышце крысы и мембранном препарате электрического органа Тофе(1о / Кривой И.И., Т.М. Драбкина, А.Н. Васильев, В.В. Кравцова, Ф. Мендел // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2006. - Т.92, № 2. - С. 191-203. 88. Кравцов, А.В. Регуляция Na+ K+-ATP-азы: эффекты ионов Mg и Са / А.В. Кравцов, В.В. Кравцова // Украинский биохимический журнал. 2001. - Т. 73,М2.-С. 5-27. 89. Кубасов, И.В. Роль Na+/K+-АТФазы в пресинаптическом последействии экзогенного ацетилхолина в диафрагме крысы [Текст] / И.В. Кубасов, 229 И.И. Кривой, Е.В. Лопатина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицин6ы. – 1997. – Т.123, №5. – С. 531-534.ромышленной технологии. – Казань, 1986.- С.66. 90. Кузнецов, А.И. Сравнительная характеристика морфологического состава и биохимических особенностей крови у физиологически зрелыхи незрелых поросят в подсосный период /А.И. Кузнецов, Л.И. Москвина // Физиологические особености свиней и проблемы их выращивания в условиях п 91. Кушак, Р.И. Всасывание аминокислот [Текст] / Р.И.Кушак // Физиоло гия всасывания. – Л. : Наука, 1977. – С. 123-126. 92. Кыров, Д.Н. Исследование модулирующих эффектов гемолизата эритроцитов на активность Na,K-АТФазы [Текст] : автореф. дис. … канд. биолог. наук / Д.Н. Кыров. – Тюмень, 2006. – 234 с. 93. Левитин, Е.В. Структурно – функциональное нарушение клеточных мембран при эпилепсии у детей и методы их коррекции [Текст] / Е.В. Левитин. – Тюмень, 1989. – 127 с. 94. Лемешева, М. Аминокислотное питание птицы [Текст] / М. Лемешева // Животноводство России. – 2006. – № 11. – С. 25-27. 95. Лисон, С. Кормление племенных петухов [Текст] / С. Лисон // Птицеводство. – 1997. – № 2. – С. 38-40. 96. Лопина, О.Д. Физиология протонной помпы [Текст] / О.Д. Лопина // Российский журнал гастроэнтологии, гепатологии, колопроктологии. – 1997. – №5. – С. 91-96. 97. Лопина, О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na+, K+ATФазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами [Текст] / О.Д. Лопина // Биохимия. – 2001. – Т. 66, № 10. – С. 1389– 1400. 230 98. Лопина, О.Д. Na+,К+ -АТФаза: структура, механизм и регуляция активности [Текст] /О.Д. Лопина // Биологические мембраны. – 1999. – Т.16, № 6. – С. 584-603. 99. Лукичева, В.А. Обмен белков сыворотки крови цыплят-бройлеров на рационе с различными добавками [Текст] / В.А. Лукичева // Вопросы ветеринарной биологии: Сб.науч.тр. МВА.- М.: МВА, 1994.- с. 36–39. 100. Лупашко, Н.И. Окислительные процессы у эмбрионов и цыплят при скармливании курам сульфата натрия [Текст] / Н.И. Лупашко, Г.А. Карташов // Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных. – Харьков, 1978. – С. 43–45. 101. Лысов, В.Ф. Физиология молодняка сельскохозяйственных животных / В.Ф. Лысов. – Казань, 1977. – 62 с. 102. Лысов, В.Ф. Физиологические аспекты профилактики и лечения нарушений структурно-физиологической упорядоченности тканей, органов организма животных / В.Ф.Лысов // Труды первого съезда ветеринарных врачей Республики Татарстан. – Казань, 1996 .- С 204-209. 103. Лысов, В.Ф. Основы физиологии и этологии животных / В.Ф. Лысов, Т.В. Иполитова, В.И. Максимов, Н.С. Шевелев. – М.: Колос, 2004. 586с. 104. Лысов, В.Ф. Физиологии и этологии животных / В.Ф. Лысов, В.И. Максимов. – М.: Колос, 2004. 255с. 105. Макарова, Н. В. Статистика в Excel / Макарова Н. В., Трофимец В. Я. // Учеб. пособие. — М.: Финансы и статистика, 2002. - 368 с. 106. Максимов, В.И. Становление гормонального статуса тканей органов свиней в постнатальном онтогенезе [Текст] / В.И. Максимов // Доклады РАСХН, 2002.- № 4. – C.42-45. 107. Максимов, В.И. Становление гормонального статуса тканей и органов у свиней в постнатальном онтогенезе / В.И. Максимов // Свиноводство.1999.- №4.- С.17-21. 231 108. Максимов, В.И. Ферментный профиль крови собак в норме и при хронической сердечной недостаточности [Текст] / В.И. Максимов, Т.В. Бардюкова, Е.В. Тульская, С.Ю. Зайцев // Ученые записки Казанской гос.академии ветеринарной медицины. – Т. 185. – Казань, 2006. – С. 3-9. 109. Максимов, В.И. Влияние условий микроклимата на активность ферментов в организме свиней в постнатальном онтогенезе [Текст] / В.И. Максимов, А.В. Парахневич, В.С. Григорьев // Инновационные технологии в свиноводстве: материалы международн. науч.-практ. конф. Кубанский гос. агр. ун-т. - Краснодар, 2008. – С. 168-171. 110. Максимюк, Н.Н. Белковые гидролизаты для цыплят-бройлеров [Текст] / Н.Н. Максимюк // Зоотехния. – 1998. – №8. – С. 23. 111. Маслова, М.Н. Активность и свойства Na+, K+-АТФазы в эритроцитах и ингибитор Na+-насоса в плазме у лиц с пограничной артериальной гипертензией [Текст] / М.Н.Маслова, Л.Е. Огородникова, Ю.С. Титков // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 1991.– Т. 77, № 9. – С. 232–237. 112. Медведева, И.А. Активность Ка,К-АТфазы эритроцитов при иммобилизационном стрессе у крыс с различной двигательной активностью / И.А. Медведева, М.Н. Маслова // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 1993. - Т.79, №10. - С 17-22. 113. Мембранные липиды как переносчики информации [Текст] / Е.Б. Бурлакова [и др.] // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. – М. : Наука, 1982. – С. 74-78. 114. Мензиков, С.А. АТР-зависимый сопряженный с ГАМКА-рецепторами Cl–насос нейрональных мембран [Текст] : автореф. дис. … док. биол. наук / С.А. Мензиков. – М., 2007. – 48 с. 115. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники [Текст] / Г.А. Меркулов. – М. : Медгиз, 1961. – 340 с. 232 116. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Под ред. проф. И.П. Кондрахина. - М.: КолосС, 2004. 520 с. 117. Мороз, А.М. Активность Na+, К+ - АТФазы в эритроцитах после воздействия лазерного излучения [Текст] / А.М. Мороз. // Украинский биохимический журнал. – 1984. – Т.55, № 6. – С. 674-676. 118. Мосс, Д. Ферменты [Текст] / Д. Мосс. – М.: Мир, 1970. – 127с. 119. Муртазина, Д.А. Фосфорилирование α-субъединицы Na,K-ATPазы из солевых желез уток под действием сАМР-зависимой протеинкиназы ингибирует активность фермента / Д.А. Муртазина, СП. Петухов, A.M. Рубцов, К.Б. Стори, О.Д. Лопина // Биохимия. - 2001. - Т.66, вып. 8. -С. 1066-1077. 120. Мхеян, Э.Э. Активность микросомальных транспортных АТФаз и содержание фосфолипидов в ткани при паратиреопривной тетании [Текст]: автореф дис. канд. биол. наук / Э.Э. Мхеян. – Ереван, 1990. – 23 с. 121. Мцехветадзе, А.В. Изменения активности фермента Са2+ АТФазы бластных клеток больных острыми лейкозами [Текст] / А.В. Мцехветадзе, И.И. Гопуридзе, И.Г. Шургая // Гематология и трансфузиология. – 1990. – Т.35, №9. – С. 20-21. 122. Na+,K+-АТФазная активность в сарколемме миокарда при ишемии [Текст] / Ким Э.А. [и др.] // Украинский биохимический журнал. – 1989. – Т.61, №4. – С. 60-65. 123. Na+/Н+-противотранспорт и кальциевый обмен в клетках периферической крови здоровых лиц и больных с хронической сердечной недостаточностью [Текст] /А.Б.Гаджиев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1994. – №12. – С. 572-575. 124. Никитин, В.И. эндокринная ситуация врзраста / В.И. Никитин // XII съезд Всесоюзного физиологического общества им И.О. Павлова. Тбилиси – 1975. – Л.:Наука, 1975. – Т.1. – С. 249-250. 233 125. Новые данные об элементарных грибовидных частицах ядерных мембран [Текст] / И.Б. Збарский [и др.] // Цитология. – 1973. – Т.15, №12. – С. 1453-1457. 126. Нок, Т. Транспотные системы и усвояемость питательных веществ [Текст] / Т. Нок // Химико- фармацевтический журнал. – 1973. – Т.8, №10. – С. 15-18. 127. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных [Текст] / под ред. А.П. Калашникова, Н.И. Клейменова. – М. : Агропромиздат, 1985. – 352 с. 128. О влиянии дигитонина на активность Na,K- АТФазы из мозга быка [Текст] / Щеглова М.В. [и др.] // Биохимия. – 1981. – Т. 46, вып. 1. – С. 62-69. 129. Онегов, А.П. Справочник по гигиене сельскохозяйственных животных / А.П.Онегов, Ю.И.Дударев, М.А.Хабибулов. – М.: Россельхозиздат, 1984. 436 с. 130. Опритов, В.А. Электричество в жизни животных и растений [Текст] / В.А. Опритов // Соросовский образовательный журнал. –1996. – №96. – С. 40-46. 131. Орлов, С.Н. Транспорт калия, анионов и активность Na+-насоса мембраны эритроцитов: три различных механизма регуляции внутриклеточным кальцием [Текст] / С.Н.Орлов, Н.И Покудин., Ю.В. Котелевцев // Биохимия. – 1987. – Т.52, вып.8. – С. 1373-1386. 132. Павлов, К.В. Электрогенный транспорт ионов Na+,К+-АТФазой [Текст] / К.В. Павлов, В.С.Соколов // Биологические мембраны. – 1999. – Т.16, №6. – С. 604-637. 133. Панюшкина, Е.А. Эндогенный Са2+--зависимый ингибитор Na+,К+АТРазы эритроцитов изменяет чувствительность фермента к уабаину, калию и фурасемиду / Е.А. Панюшкина, В.В. Петруняка // Биологические мембраны. - 1994. - Т . 11, №1. - С.7-11. 234 134. Петров, А.М. Методические рекомендации по изучению резистентности телят-трансплантантов и ее коррекция / А.М. Петров, Е.С. Воронин, М.М. Серых. – Россельхозакадемия,1995.- 53 с. 135. Петров, А.М. Динамика основных иммунологическихпараметров теляттрансплантантов / А.М. Петров, .С. Воронин. – М.: МВА им.К.И. Скрябина, 1999. 186 с. 136. Петруняка, В.В. Активация и ингибирование Na+,К+-АТР-азы мембранэритроцитов эндогенными Са2+-зависимыми регуляторами. Са2+зависимое действие уабаина на Са2+-АТР-азу / В.В. Петруняка, Е.А. Панюшкина, Е.П. Северина // Биологические мембраны. - 1990. - Т. 7, № 4. - С. 352-357. 137. Платонова, Р.Д. Активация ацетилхолином натриевого насоса в мышце лягушки [Текст] / Р.Д. Платонова, М.А Посконова, И.М. Родионов //Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. – 1986. – №7. – С. 921-925. 138. Плященко, С.И. Естественная резистентность организма животных при различных типах кормления и условиях содержания / С.И. Плященко,В.Т. Сидоров // Ветеринармя. – 1983.№8. – С. 21-23. 139. Плященко, С.И. Влияние экологическихфакторов на бактериальную обсемененность воздуха и заболеваемость оросят-отъемышей /С.И. Плященко, И.А. Хохлова, Л.С. Кутузов // Ветеринария. – 1988.- №5. – С. 1820. 140. Повреждение мембран саркоплазматического ретикулума при перекисном окислении и его роль в развитии мышечных патологий [Текст] / Каган В.Е. [ и др.] // Биофизика мембран. – М. : Наука, 1981. – С.88-95. 141. Пойнов, Ю.В. О мемебранной концепии первичной артериальной гипертензии: К развитию представлений и природе гипертонической болезни [Текст] / Ю.В. Пойнов // Кардиология. – 1985. – №10. – С. 63-71. 235 142. Пойнов, Ю.В. Первичная артериальная гипертензия как патология клеточных мембран [Текст] / Ю.В. Пойнов, С.Н. Орлова. – М.: Медицина, 1987. –192 с. 143. Покровский, А.А. Биохимические методы исследования в клинике [Текст] / А.А. Покровский. – М. : Медицина, 1969. – 652с. 144. Роль аминопептидазы щеточной каймы тонкого кишечника свиньи в транспорте дипептидов / М.И. Зильберман [и др.] // Макромолекулы в функционирующей клетке : четвертый симпозиум СССР -Италия. – Киев, 1983. – С. 227-232. 145. Ройтер, Я. Роль генофонда в создании новых пород и кроссов [Текст] / Я. Ройтер // Животноводство России.- 2010. - №1.- С. 19-20. 146. Рубцов, А.М. Ca-ATPаза саркоплазматического ретикулума: молекулярная организация, механизм функционирования и особенности регуляции активности [Текст] / А.М. Рубцов // Успехи биологической химии. – 2005. – Т.45. – С. 235-268. 147. Рыжкова Г. Ф. Активность транспортных АТФаз и межклеточный обмен электролитов у сельскохозяйственных животных в норме и при включении в рацион биологически активных веществ : Дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.04 Курск, 2005, 333 с. РГБ ОД, 71:06-3/123 148. Рыжкова, Г.Ф. Активность транспортных ферментных систем в тканях куриных эмбрионов в динамике / Г.Ф. Рыжкова, А.Б. Ревина // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. – 2010. №3. – С. 47-51. 149. Рэкер, Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды [Текст] / Э. Рэкер. – М.: Мир, 1979. – 216 с. 150. Свечин, К.Б. Возрастная физиология животных / К.Б. Свечин, И.А. Аршавский, А.В. Квасницкий и др. – М.: Колос, 1967. 431 с. 151. Симонян, Г.А. Ветеринарная гематология / Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов. – М.: Колос, 1995. – 256 с. 236 152. Скорость Na+/Li+-противотранспорта эритроцитов и артериальная гипертония: данные одномоментного популяционного исследования [Текст] / А.Н. Бритов [и др.] // Кардиология. – 1991. – №8. – С. 54-58. 153. Скулачев, В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии [Текст] / В.П. Скулачев . – М. : Высш. шк, 1989. – 283 с. 154. Скулачев, В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода [Текст] / В.П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, №6. – С.410. 155. Соколова, М.М. Роль тканевых депо и калийуретического действия альдостерона в гомеостазе калия [Текст] / М.М. Соколова // Физиологический журнал СССР. – 1981 – 67(3). – С. 448-453. 156. Степанян, Р.А. АТФазная активность плазматических мембран печеночной ткани кур в онтогенезе [Текст] / Р.А.Степанян, А.А. Симонян // Биологический журнал Армении. – 1983. – Т.36, N 10. – С. 830-834. 157. Сторожок С.А. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства / С.А. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров.Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 1997. - 140с. 158. Супрунов, О.В. Физиологическое обоснование нормирования протеина и аминокислот для птиц [Текст] / О.В. Супрунов, О.В. Федорченков // Биосфера и человек: региональная науч.-практ. конф. – Майкоп, 1997. – С. 99-101. 159. Тапильская, Н.И. Эндогенные дигиталисоподобные ингибиторы Na/KАТФазы – новый класс гормонов с широким спектром функций [Текст] / Н.И. Тапильская, И.А Егорова, А.Я. Багров // Цитокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, №3. – С. 3-9. 160. Тодоров, И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии [Текст] / И. Тодоров. – София, 1968. – 106 с. 237 161. Томмэ, М.Ф. Переваримость кормов [Текст] / М.Ф. Томмэ, Р.В. Мартыненко, А.В. Неринг. – М.: Колос, 1970. – 463 с. 162. Умарова, Ф.Т. Влияние сердечных гликозидов на внутримолекулярную динамику Na+,K+-ATфaзы / Ф.Т. Умарова, О.В. Белоногова, Г.И. Лихтенштейн // Биологические мембраны. - 1995. - Т. 12, № 1. - С. 39-49. 163. Умарова, Ф.Т. Изучение структурно-функциональной зависимости ингибирующего влияния флавоноидов на Na+,K+-ATPa3y и их положительно-ионотропного действия / Ф.Т. Умарова, З.А. Хумбактова, Э.Х. Батиров, В.М. Меклер// Биологические мембраны.-1998.-Т.15,№1.-С. 24-35. 164. Утеулин, К.Р. Особенности действия анионов на АТФазу митохондрий [Текст] / К.Р. Утеулин, А.Т.Иващенко // Биохимия. – 1982. – Т.47, вып.10. – С. 1641-1644. 165. Фисинин, В. Промышленное птицеводство: стратегия развития [Текст] / В. Фисинин // АгроРынок. – 2006. – №4. – С.6-10. 166. Фисинин, В. И. Птицеводство дало мяса больше чем две отрасли вместе взятые [Текст] / В.И. Фисинин // Животноводство России. – 2007. – №2. – С. 2-4. 167. Фисинин, В.И. Вступительное слово академика РАСХН В.И. Фисинина [Текст] / В.И. Фисинин // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2007. – №1. – С. 3-5. 168. Фролькис, В.В. Инвенторный механизм гормональной регуляции Na+ K+-АТФазы [Текст] / В.В. Фролькис, А.Л. Кобзарь, О.В. Соколова //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1996. – Т.122, №7. – С. 9-11. 169. Федорова, О.В. Эндогенные дигиталиснодобные ингибиторы Na+ K+АТФазы в патогенезе солечувствительной артериальной гипертензии / О.В. Федорова, А.Я. Багров // Артериальная гипертензия. - 2005. - Т. 11, № 2. - С.27-32. 238 170. Фурман, Ю.В. Технологические основы производства кормовых добавок и биопрепаратов, физиологические аспекты их применения в животноводстве [Текст] : дисс. на соискание ученой степени док. биол. наук / Ю.В. Фурман. – М., 2001. – 321 с. 171. Фурман, Ю.В. АТФазная активность, показатели белково-минерального обмена и продуктивности цыплят-бройлеров при скармливании им пептидного препарата из отходов кожевенного производства [Текст] : дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук / Ю.В. Фурман. – Курск, 1991. – 234 с. 172. Хаитов, Р.М. Физиология иммунной системы / Р.М. Хаитов// Российский физиологический журнал.- 2000. – Т.86. - №3. – С. 252-268. 173. Цвилиховский, М.И. Активность Na, K+-АТФазы, Ca2+, Mg2+ АТФазы и Mg2+-АТФазы в плазматической мембране эпителия тонкого кишечника животных различного возраста [Текст] / М.И. Цвилиховский // Доклад Нациальной АН Украины. – 1997. – №9. – С. 169-170. 174. Чернов, Н.Н. Ферменты в клетке и пробирке [Текст] / Н.Н. Чернов // Соросовский образовательный журнал. – 1996. – №5. – С. 28-34. 175. Чизмаджев, Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – №8. – С. 12-17. 176. Чурин, Б.В. Колебания активности Щелочной фосфатз и содержания фосфора в крови здоровых и больных язвенной болезнью [Текст] / Б.В. Чурин, Т.Г. Цирельникова, В.А. Жуков // Клиническая лабораторная диагостика. – 1995. – № 1. – С. 12-13. 177. Шевченко, А.С. Об особенностях влияния ионов кальция на активность Mg2+ зависимой АТФазы в тенях и реконструированных эритроцитах [Текст] / А.С. Шевченко, С.Н. Орлов // Биохимия. – 1977. – Т.42, вып.5. – С. 906-909. 239 178. Шеховцова, Т.Н. Ферменты: их использование в химическом анализе / Т.Н. Шеховцова // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т.6, №1. – С.44-48. 179. Шкорбатов, Ю.Г. Биоэлектрические свойства клеточных ядер [Текст] / Ю.Г. Шкорбатов, В.Г. Шахбазов // Успехи современной биологии. – 1992. – Т. 112, вып. 4. – С. 499-501. 180. Шкорбатов, Ю.Г. О роли нуклеиновых кислот и других биополимеров в образовании электрического заряда клеточного ядра [Текст] / Ю.Г. Шкорбатов, В.Г. Шахбазов // Молекулярная генетика и биофизика. – 1982. – N 7. – С. 35–38. 181. Эггум, Б. Косвенное определение адекватности протеина [Текст] / Б. Эггум // Белковый обмен и питание. – М.: Колос, 1980. – С. 172-180. 182. Юрков, В.М. Резистентность организма и продуктивность молдняка свиней при различных режимах освещения [Текст] / Юрков В.М. // Ветеринария.- 1988.- №2.- С.28-30. 183. Ярилин, А.А. Гуморальный контроль процессов пролиферации, дифференцировки и гибели клеток тимуса. Двойственный эффект сигналов: Онтогенез, эволюция, биосфера / А.А. Ярилин. –М.: 1989. – 123 с. 184. A putative H+ K+ -ATPase is selectively expressed in surface epithelial cells of distal colon. [Text] / F. Jaisser [et al.] //Amer. j. physiol. Cel. Physiol. – 1993. – V.256, № 34. – P. 1080-1089. 185. Adibi, S.A. Na,K-pump in the liposoms [Text] / S.A. Adibi // Biochim. et Biophys. Acta. – 1979. – V. 467, № 3. – P. 340-345. 186. Amelsvoort, J. Is there a plasma membrane –located anion-sensitive ATPase? [Text] / J. Amelsvoort, J. Port, S. L. Bonting // Biochem. biophys. Acta. – 1977. – V.466, №2. – P. 283-301. 187. Bagrov A. Endogenous plasma Na,K-ATPase inhibitory activity and digoxin like immunoreactivity after acute myocardial infarction / A. Bagrov, 240 O.V.Fedorova, M.N. Maslova, N.T. Roukoyatkin, M.V. Ukhanova, E.P. Zhabro // Cardiovasc.Res.-1991.-V.25, №5.-P.371-377. 188. Bader, H. Comparison of sources of a phosphorylated intermediate in transport ATPase / H.Bader, R.Post, G.Bond // Biochim.et biophys. acta .-1968.15.-N 1.-p.41-46. 189. Balzan S. Selective inhibition of human erythrocyte Na+/K+-ATPase by cardiac glycosides and by a mammalian digitalis like factor / S. Balzan, G. D'Urso, S. Ghione, A. Martinelli, U. Montali // Life Sciences. - 2000. - № 67. - P. 1921-1928. 190. Barnett, R. Mechanism of the effects of lipid phase stransition on the Na+К+ATPase and the role of protein conformational changes [Text] / R. Barnett// Рrop. and funct. of Na+К+- ATPase: int. congr. – N.Y., 1973. – P.561-568. 191. Bennett V. Spectrin and Ankyrin-Based Pathways: Metazoan Inventions for Integrating Cells Into Tissues /V. Bennett, A.J. Baines//Physiol. Rev. - 2001. - V.81, Nb3.-P. 1353-1392. 192. Beron J. Aldosterone modulates sodium kinetics of Na, K-ATPase containing an subunit in A6 kidney cell epithelia/ J. Beron, L. Mastroberardino, A. Spillmann, and F.Verrey // Mol. Biol. Cell - 1995. - V.6. - P.261-271. 193. Bertorello A.M. Phosphorylation of the catalytic a subunit of Na+, K+ATPase inhibits the activity of the enzyme/ A.M. Bertorello, A. Aperia, S.I. Walaas, A.C. Nairn, P. Greengard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. V.88. - P. 11359-11362. 194. Bertorello A. M. Short-term regulation of renal Na-K-ATPase activity: physiological relevance and cellular mechanisms/A. M. Bertorello, A. I. Katz //Am. J. Physiol. - 1993. — V.265, № 6 (Pt2). - P.743-755. 195. Blanco G. Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function / G. Blanco and R.W. Mercer // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 1998. - V.275. - F633-F650. 241 196. Blaustein M.P. Endogenous ouabain: role in the pathogenesis of hypertension / M.P. Blaustein // Kidney Int. - 1996. - V.49. - P. 1748-1753. 197. Blot-Chabaud M. Role of protein phosphatase in the regulation of Na+-K+ATPase by vasopressin in the cortical collecting duct/ M. Blot-Chabaud, N. Coutry, M. Laplace, J. Bonvalet, and N.Farman// J. Membr. Biol. - 1996. V.I53. - P.233-239. 198. Bonting S.L. Magnesium-induced conformational changes in Na,K-ATPase / S.L. Bonting, H.G.P. Swarts, W.H.M. Peters // In Current Topics in Membranes Transport. Structure, Mechanism and Function of the Na,K-pump. New York. Lond.: Acad. Press. -1983. - V.I9. - P.403-424. 199. Borin M.L. Roles of PKA and PKC in regulation of Na+ pump activity in vascular smooth muscle cells / M.L. Borin // Ann. NY Acad. Sci. - 1997. V.834. – P.576-578. 200. Bruck R. Vanadyl ions stimulate K+ uptake into isolated perfused rat liver via the Na+/K+-pump by a tyrosine kinase-dependent mechanism/ R. Bruck, Z. Halpem, H. Aeed, Y. Shechter, S.J.D. Karlish //. Pflagers. Arch. -1998. V.435. - P.610-616. 201. Buckalew V.M. Summary of a symposium on natriuretic and digitalis-like factors / V.M. Buckalew, H.C. Gonick // Clin. and Exper. Hypertension. 1998. - V.20, № 5-6.-P. 481-488. 202. Bulygina E. Activation of glutamate receptors inhibits Na+,K+-ATPase of cerebellum granule cells / E. Bulygina // Biochemistry. - 2002. - Vol. 67. P.1209-1214. 203. Cheng S.X.J. [Ca2+]i determines the effects of protein kinases A and С on activity of rat renal Na+,K+-ATPase / S.X.J. Cheng, 0. Aizman, A.C. Nairn, P. Greengard, A. Aperia // The Journal of Physiology. - 1999. - V.518, №1. - P. 37-46. 242 204. Campos, M. Effect of magnesium and ATP on pre-steady-state phosphorylation kinetics of the Na+К+- ATPase [Text] / M.Campos, L. Beuge // Biochim. biophis. acta. biomembranes. – 1992. – V.1105, №1. – P.51-60. 205. Chauveau, J. [Text] / J. Chauveau, Y. Mouley, C. J. Rouiller //Gell Biol. – 1962. № 12. P. 17. 206. Chen P.S. Microdetermination of phosphorus / P.S. Chen, T.Y. Toribara, H. Warner // Analyt. Chem. -1957. - V.28. - P.1756-1758. 207. Chibalin A.V. Phosphorylation of the catalytic a-subunit constitutes a triggering signal for Na+, K+-ATPase endocytosis / A.V. Chibalin, C.H. Pedemonte, A.I. Katz, E. Feraille, P.O. Berggren, and A.M. Bertorello //J. Biol.Chem.1998.-V. 273.-P. 8814-8819. 208. Christensen , N.N. Role of membranes in secretory proceses [Text] / N.N. Christensen // - London, 1972. – P. 433–447. 209. Claussen, T. Regulation of active Na+K+- transport in skeletal muscle [Text] / T. Claussen // Phisiol. rev. – 1986. – V.66. – P. 542-580. 210. Clausen T. The Na+, K+ pump in skeletal muscle: quantification, regulation and functional significance/ T. Clausen// Acta Physiol. Scand. - 1996. V.I56. -P. 227-235. 211. Comparison of the ATP binding in the active sites of (Na+К+)- ATPase, Mg2+- ATPase and Ca2+- ATPase with low affinity to calcium from cardiac sarcolemma [Text] / R. Monosikova [et al.] //Bratisl. lek. listy. – 1991. – V.92, №3-4. – P. 142-145. 212. Comparison of the ATP binding in the active sites of (Na+К+)- ATPase, Mg2+- ATPase and Ca2+- ATPase with low affinity to calcium from cardiac sarcolemma [Text] / R. Monosikova [et al.] //Bratisl. lek. listy. – 1991. – V.92, №3-4. – P. 142-145. 213. Cooper, P.H. Characterization of calciumion activated adenosinetriphosphotase in the plasma membrane of rat mast cells [Text] / P.H. Cooper, D.R. Stanworth //Biochem. j. – 1976. – V.156, № 3. – P. 691-700. 243 214. Cox, M. Potassium homeostasis [Text] / M. Cox // The medical clinics of North America. – 1981. – V.65, № 2. – P. 363-384. 215. Daniel, V.G. Intestinal amino acid tdansfer in the pig (sus scafa) [Text] / V.G. Daniel // Comp. Biochem. Physiol. –1972. – № 42a. – P. 689-695. 216. Danielli, J.F. Contribution to the theory of permeability of thin films [Text] / J.F. Danielli, H.A. Davson //J. cell. comp. physiol. – 1934. – V.5. – P.495508. 217. Davis-Karlan, S.R. «Genome-wide analysis of iron-dependent growth releals a novel yeast gene required for vacuolar acidification» / S.R. Davis-Karlan, D.M. Ward, S.L. Shiflett, J.Karlan.- J.Biol.Chem.,Vol.279, N 6, 2004.pp.4322-4329. 218. Detailed structural Analysis of exposed Domains of membrane –bound Na+К+- ATPase [Text] / Y.A Ovchinnikov. [et al.] //FEBS LETT. – 1987. – V.217, № 2. – P. 269-274. 219. Doris P.A. Ouabain in plasma from spontaneously hypertensive rats / P.A. Doris // Am. J. Physiology. - 1994. - V.266, № 1, part 2. - P. H360-H364. 220. Effect of acetylsalicylic acid on liver plasma membraine Ca2+- ATPase activity [Text] / B.Omer [et al.] // Pharmacol. and pharm. – 1990. – V.42, №5. – P. 441-446. 221. Effect of calcium on Na+,K+-ATPase isolated from human placenta [Text] / L. Mazzanti [et al.] //Biochem. int. – 1992. – V.27, № 5. – P. 847-852. 222. Endogenous dititalis – like factors in hypertension and chronic renal insufficiency [Text] / A.K. Ralph [et al.] //Kidney int. – 1986. – V.30. – P. 723729. 223. Enyedi, A. On the substrate specificity of the red cell calcium pump [Text] / A. Enyedi, B.Sarkadi, G. Gardos //Biochim. et biophis. acta. – 1982. – V.687, №1. – P.109-112. 244 224. Erythrocyte membraines catalyze a novel glucosedenendent enzymatic glycosylation that inhibits plasma membraine Ca2+-ATPase activity [Text] / R.S. Safeer [et al.] // FASEB Jounal. – 1990. – N 7. – P. 2209. 225. Fedorova O.V. Marinobufogenin an endogenous a-1-sodium pump ligand in hypertensive Dahl salf-sensitive rats /O.V. Fedorova, N.I. Kolodkin, N.I.Agalakova // Hypertension. - 2001. - V.37. - P. 462-466. 226. Fairbanks G. Electrophoretic analisis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T. L. Steck, D. K.H. Wallach// Biochemistry,- 1971. —V.I 0,№ 13. —P.2606-2617. 227. Favre H. Receptor-assay for endogenous inhibitors of a Na-K ATPase/ H. Favre, G. Siegenthaler, B. Martin, D. Roth, G. Granger, F. Louis // Klin. Wochenschr. - 1987. - V. 65 (Suppl VIII). - P.49-52. 228. Fergusson, S.J. The inhibitor-sensitivity of the plasma membrane adenosine triphosphatase of Paracoccus dentrificansi comparision with mitochondrial adenosine triphosphatase [Text] / S.J. Fergusson, P. John //Biochem. soc. trans. – 1977. – V.5. – P.1525-1527. 229. Fincham, D. A. Characterization of a novel variant of amino acid transport system asc in erythrocytes from Przewalski horse [Text] / D. A. Fincham, J. C. Ellory, J. D. Young // Can.J.Physiol.and Pharmacol. – 1992. – N 8. – P. 1117–1127. 230. Flemming С Functional Modulation of the Sodium Pump: The Regulatory Proteins «Fixit» / Flemming С and Yasser A. Mahmmoud // News in Physiological Sciences.-2003.-Vol. 18, № 3. - P. 119-124. 231. Forgae, M. K+ – independent active transport of Na+ by the (Na+and К+) – stimulated adenosine triphosphatase [Text] / M. Forgae, G. Chin //Biol. chem. – 1981. – V.256, № 8. – P. 3645-3646. 232. Forte, J.G. Isolation of plasma membranes from Erlich Ascites tumor cells. Influence of amino acid on (Na++K+)-ATPase and K+-stimulated phosphatase 245 [Text] / J.G.Forte, T.M Forte, E. Heinz //Biochem. biophys. acta. – 1973. – V.298, №4. – P. 827-841. 233. Gastric HCO-3- stimulated ATPase. Evidence against its microsomal localization in rat founds mucosa [Text] / A. Soumarmon [et al.] //Biochem. biophys. acta. – 1974. – V.339, № 3. – P. 403-414. 234. Goldman, S.Cold resistance of the brain during hiberation Na+,K+ -activated ATPase [Text] / S. Goldman, J. Wills //Crybiology. – 1973. – V.10. – P.218224. 235. Goodman S. R. Brain spectrin: of mice and men / S. R. Goodman, W. E. Zimmer, M. B. Clark, I. S. Zagon, J. E. Barker, M. L. Bloom // Brain. Res. Bull. - 1995. - V.36, N2 6. - P.593-606. 236. Goto A. Purification of endogenous digitalis-like factors from normal human urin / A. Goto, K. Yamada // Clin. and Exper. Hypertension. - 1998. - V. 20, № 5-6.-P. 551-556. 237. Grambert G. Inhibition of rat Na+/K+-ATPase isoforms by endogenous digitalis extracts from neonatal human plasma / G. Grambert, S. Balzan, A. Paci, S. Decollogne, U. Montali, S. Ghione, L.G. Lelievre // Clin. and Exper. Hypertension. - 1998. - V.20, № 5-6. - P. 669-674. 238. Gunther, T. Effect of salts on the activity and inhibition of E. Coli membrane ATPase by etherynic acid and inhibitors [Text] / T. Gunther, W.Dellnitz, G. Marriss // Z Naturfor. – 1974. – V.292, № 1-2. – P. 54-59. 239. Haas M. Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal-transducing function of Na+/K+-ATPase [Text] / M. Haas, A. Askari, Z. Xie // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 27832-27837. 240. Harris, W.E. Origin of the γ polypeptide of the Na+K+ATPase [Text] / W.E. Harris, W.H. Sthal // Biochem. biophys. acta. – 1988. – V.942, № 2. – P.236244. 241. Hasler U. Structural and functional features of the transmembrane domain of the Na,K-ATPase p subunit revealed by tryptophan scanning / 246 U.Hasler,G.Crambert, J.D.Horisberger, K.Geering// J. Biol. Chem. - 2001. V.276. - P.16356-16364. 242. Helose – specific inhibition in vitro of human red cell Ca2+- ATPase activity[Text] / M.R. Deriel [et al.] //Biochim. et biofhys. Acta biomembranes. – 1992. – V.110, № 1. – P.119-122. 243. Hypertension and sodium transport in 390 healthy adults in Chicago [Text] / V. Persky [et al.] //J. of hypertension. – 1990. – V.8. – P.121-128. 244. Ishida, M. Membrane ATPase of Bacillus megaterium. I Proporties of membrane ATPase and its solubilised form [Text] / M. Ishida, S.Mizushima //J. biochem. – 1969. – V.66, №1. – P. 33-43. 245. Ivanov A.V. Role of the self-association of P subunits in the oligomeric structure of Na+/K+-ATPase /A.V. Ivanov, N.N. Modyanov, A. Askari // Biochem.J. - 2002. - V. 364, № 1. - P. 293-299. 246. Jaunin P. Role of transmembrane and extracytoplasmic domain of P-subunits in subunit assembly, intracellular transport & functional expression Na,KATPase / P. Jaunin, F. Jaisser, A. T. Beggah, K. Takeyasu, P. Mangeat, B. С Rossier, J.-D.Horisberger, K. Gering //J. Cell. Biol. -1993. - V.I23, №6. - P. 1751-1799. 247. Jewell, E.A. Isoforms of the subunit of Na,K-ATPase and their significance: Ion Pumps, Stract. and Mech.: meet. (Gathenburg, aug. 12–14, 1991) [Text] / E.A Jewell, O.I. Shamraj, J.B. Lingred // Acta Physiol. Scand. Suppl. – 1992. – N 607. – P. 161–169. 248. Jewell, E.A. Isoforms of the subunit of Na,K-ATPase and their significance: Ion Pumps, Stract. and Mech.: meet. (Gathenburg, aug. 12–14, 1991) [Text] / E.A Jewell, O.I. Shamraj, J.B. Lingred // Acta Physiol. Scand. Suppl. – 1992. – N 607. – P. 161–169. 249. Jorgensen, P.L. Purification and characterization of (Na++К+)-ATPase. IV. Enzymation of the purity and of the molecular weight and polypeptide con- 247 tent per enzyme unit in preparations from the outer medulla of rabbit Kidney [Text] / P.L. Jorgensen //Biochim. et biophis. acta. – 1974. – V.356. – P. 53. 250. Jorgensen, P.L. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: Functional sites and their interactions [Text] / P.L.Jorgensen, K.O. Hakansson, S.J. Karlish // Annu. Rev. Physiol. – 2003. – V. 65. – P. 17-49. 251. Kamiya, M. Changes in activity of sodium – potassium adenosinetriphosphotase in cells during adaptation of the Japanese eel to sea water [Text] / M. Kamiya, S.Utida //Comp. biochem. phisiol. – 1968. – V.26. – P. 675-685. 252. Kasbekar, D.K. An adenosine triphosphatase from frog gastric mucosa [Text] / D.K. Kasbekar, R.P Durbin //Biochem. biophys. acta. –1975. – V.105, № 3. – P. 472-482. 253. Keeton, K.S. Characterization of adenosinetriphosphatase in erythrocyte membrane of the cow [Text] / K.S. Keeton, I.I. Kaneko // Proc. soc. ekp. biol. and med. – 1972. – N 1. – P. 140. 254. Koenig, C. A histochemical study of adenosine triphosphatase in the toad (Bufo spinuloses) gastric mucosa [Text] / C. Koenig, J.D. Vial //J. histochem. cytochem. – 1970. – V.18, №5. – P. 340-353. 255. Kolbel F. The endogenous digitalis-like factor / F. Kolbel, V.Schreiber // Mol. Cell Biochem. -1996. - V. 111. .№ 5. - P.160-161. 256. Kyte, J. Molleculer consideration relevant to the mechanism of active transport [Text] / J. Kyte // Nature. – 1981. – V.292, № 6. – P. 201-204. 257. Krivoi I. Porcine kidney extract contains factor(s) that inhibit the ouabainsensitive isoform of Na,K-ATPase (аг) in rat skeletal muscle / I. Krivoi, A. Vasiliev, V. Kravtsova, M. Dobretsov, F. Mandel // Annals New York academy of sciences. - 2003. - V. 986. - P. 639-641. 258. Laffan, J. DNA Replication by a DNA –Membrane Complex Extracted from Bacillus subtilisi Site of Subcomplexes [Text] / J. Laffan, W. Fischein //J. bacteriology. – 1985. – V.169. – P. 2819-2827. 248 259. Lichtstein D. Endogenous digitalis-like Na+,K+-ATPase inhibitors, and brain function / D. Lichststein, H. Rosen // Neurochem. Res. - 2001. - V.26, №. 8/9. - P.971-978. 260. Limlomwongse, L. Developmental changes in ATPase and K+-stimulated phosphatase of to dploe gastrica microsomes [Text] / L. Limlomwongse, J.G. Forte //Amer. j. phisiol. – 1970. – V.219, № 6. – P. 1717-1722. 261. Lingham R.B. Regulation of rat brain (Na+, K+)-ATPase activity by cyclic AMP/ R.B. Lingham, and A.K. Sen// Biochim. Biophys. Acta. - 1982. V.688. -P. 475-485. 262. Lubin, M. Cell potassium and the regulation of protein synthesis [Text] / M. Lubin //Jn: the cellular function of membrane transport. // Prentice – Hall. Englewood. – Clifs. – N.J., 1964. – P.193-244. 263. Mack, S. Metionina, colina e betaina Come funzinano e dove interagisco nel metabolismo animale [Text] / S. Mack, V. Ciro // Tecn. Molit. – 1999. – № 3. – P. 291-296. 264. Mafayer J.R. Juffence of manure gases on pulerty in gilts / J.R.Mafayer, D.T.Kell, M.A.Dulcman // J.anim. Sc.- 1987. – P. 1476-1483/ 265. Marunouchi, T. Separation of sulfite – dependent ATPase from other ATP hydrolyzing enzymes [Text] / T. Marunouchi //J. biochem. – 1969. – V.66, №1. – P. 113-115. 266. Marunouchi, T. Studies on the sulfite-dependent ATPase of a sulfur oxidizing bacterium, thiobacillus thiooxidans [Text] / T. Marunouchi, T. Mori //J. biochem. – 1967. – V.62, №4. – P. 401-407. 267. Meggison, P.A. Effeciency of utilization of non protein-nitrogen in cattle. [Text] / P.A. Meggison, Mc. N. Meniman // Proc. Nutr. Soc. –1980. –V. 38, № 3. – P. 147-152. 268. Molecular cloning and sequence analysis of human. Na+K+-ATPase subunit [Text] / Kawakami K. [et al.] // Nucl. aced. res. – 1986. – V.14. – P.28332844. 249 269. Molecular cloning and sequence analysis of human. Na+K+-ATPase subunit [Text] / Kawakami K. [et al.] // Nucl. aced. res. – 1986. – V.14. – P.28332844. 270. Munakata, H. The α and β subunits of lamb Kidney Na+К+-ATPase are Both glycoproteins [Text] / H. Munakata, K. Schmid // Biochim. biophis. res. commun. – 1982. – V.107, №1. – P. 229-231. 271. Murphy, R.A. Hidrogen ion buffers and enzymatic activity myosin B adenosine triphosphatase [Text] / R.A. Murphy, P.G. Koss // Arch. Biochem. and Biophis. – 1968. – V.128. – P. 236. 272. Narumi, S. Effect of gastric acid stimulants and inhibitors of the activities of HCO-3- stimulated and Mg2+-dependent ATPase and carbonic anhidrase in rat gastric mucosa [Text] / S. Narumi, M. Kanno // Biochem. biophys. acta. – 1973. – V.311, №1. – P. 80-89. 273. Nathanson J.A. The cellular Na+ pump as a site of action for carbon monoxide and glutamate: a mechanism for long-term modulation of cellular activity [Text] / J.A. Nathanson, C. Scavone, C. Scanlon, and M. McKee // Neuron. 1994.-Vol.l4.-P. 781-794. 274. Nelson, N. Partial resolution of the enzimes catalizing phosphorylation [Text] / N. Nelson, H.Nelson, E. Racker //J. biol. chem. – 1972. – V.247, №20. – P. 6506-6510. 275. Nestor N.B. Effects of protein kinase modulators on the sodium pump activities of HeLa cells transfected with distinct isoforms of Na, K-ATPase [Text] / N.B.Nestor, L.K. Lane, R.Blostein// Ann. NY Acad. Sci. - 1997. - V.834. P.579-581. 276. Palfrey H.Clive Protein phosphorylation and the regulation of cation cotransport [Text] / Palfrey H.Clive, Alper Seth L., Greengard Paul. // J.Exp.Biol.1980.- 89.- p. 103–115. 277. Palmer C.J. Purification and complete sequence determination of the major plasma membrane substrate for cAMP-dependent protein kinase and protein 250 kinase С in myocardium [Text] / C.J. Palmer, B.T. Scott, L.R. Jones // J. Biol. Chem. - 1991. -V.266.-P.I 1126-11130. 278. Palmer L.G. Regulation of the Na-K pump of the rat cortical collecting tubule by aldosterone [Text] / L.G. Palmer, L. Antonian, G. Frindt // J. Gen. Physiol. -1993.-V. 102.-P.43-57. 279. Peris, S. Ion-mediated resistance to osmotic changes of ram spermatozoa: the role of amiloride and ouabain [Text] / Peris, S., Solanes, D., Pena, A., EnricRodriguez-Gil, J., and Riga, T. // Theriogenology.- Vol. 54.- No 9, 2000, P. 1453-1467. 280. Pedemonto, C.H. Ca2+-stimulated ATPase from rat red cell membranes: Studies on the kinetic mechanism [Text] / C.H. Pedemonto, H.F. Balengo //Comp. biochem. and phisiol. – 1981. – №3. – P. 559-564. 281. Pfleger, H. Activation of membrane bound high affinity calcium ionsensitive adenosine triphosphatase of human erythrocytes by bivalent metal ions [Text] / H. Pfleger, H.U. Wolf // Biochem. j. – 1975. – V.147, №2. –P. 359-361. 282. Pierre S.V. Structure/function analysis of Na+-K+-ATPase central isoformspecific region: involvement in PKC regulation [Text] / S.V. Pierre, M.-J. Duran, D.L.Carr, and Th.A. Pressley // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2002. - V.283. - F1006-F1074. 283. Pont, J. An anion- sensitive ATPase in lizard gastric mucosa [Text] / J.Pont, T. Hansen, S.L. Bonting //Biochem. biophys. acta. – 1972. – V.247, №1. – P. 189-200. 284. Properties of ATPase of gastric mucosa. V. Preparation of membranes and mitochondria by sonal centrifugation [Text] / J.G. Spenny [et al.] //Biochem. biophys. acta. – 1973. – V.311, №4. – P. 545-564. 285. Proporties of soluble ATPase from of gastric mucosa [Text] / A.L. Blum [et al.] // Biochem. biophys. acta. – 1971. – V.249, №1. – P. 101-113. 251 286. Pu H.X. Functional role and immunocytochemical localization of the Уа and Yb forms of the Na,K-ATPase у subunit / H.X. Pu, F. Cluzeaud, R.Goldshleger, S. J.D. Karlish, N. Farman, Rh. Blostein // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, №23. - P. 20370-20378. 287. Pu H.X. Distinct regulatory effects of the Na,K-ATPase у subunit / H.X. Pu, R. Scanzano, Rh. Blostein // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, № 23. - P. 20270-20276. 288. Quist, E.E. Cflcium transport in human erythrocytes. Separation and reconstitution of high and low Ca affinity (Mg+Ca)-ATPase activites in membranes prepared at low ionic streghth [Text] / E.E. Quist, B.D. Roufogalis //Arch. biochem and biophys. – 1975. – V.168, №1. – P. 240-251. 289. Racker, E. Adenosine triphosphatase and oxidative phosphorylation [Text] / E. Racker //Federat. procc. – 1962. – V.21. – P. 54. 290. Ramasarma, T. Generation of H2O2 in Biomembranes [Text] / T. Ramasarma //Biochem. biophys. Acta. – 1982. – V.694, №1. – P. 63-69. 291. Robinson, J.D. Cation and nucleotide interactions with Na+K+ATPase, structure and function [Text] / J.D.Robinson, M.S.Flasher. – N.Y.: Acad. Press, 1979. – P. 275-285. 292. Rossier, B.C. Regulation of the sodium pump:how and why [Text] / B.C. Rossier, K.Gerring // Trends dichem. sci. – 1987. – V.12. - №12. – P.483487. 293. Rungie, J.M. Salt-stimulated adenosine triphosphatase from smooth microsomes of turnip [Text] / J.M. Rungie, J.T. Wiskich //Plant. Phisiol. – 1973. – V.51. – №6. – P. 1064-1068. 294. Ryrie, I.J. Purfication and partial characterisation of the oligomycin-sensitive ANPase from Yeast mitochondria [Text] / I.J. Ryrie //Archiv. biochem. biophys. – 1975. – V.168, №2. – P. 712-719. 252 295. Samarzija, J. Electrophysiological analisis of rat renal sugar and amino acid transport [Text] / J. Samarzija, B.T.Hinton, E. Fromter // Pflugers Arch.1982. – N 2. – P. 190–197. 296. Satoh T. Intracellular signaling in the regulation of renal Na-K-ATPase. II. Role of eicosanoids/ T. Satoh, H.T. Cohen, A.I. Katz// J. Clin. Invest. - 1993. -V.91.-P.409-415. 297. Schiener-Bobis, G. Action of palytoxin on apical H+/K -ATPase in rat colon. Eur. / G. Schiener-Bobis // J. Biochem. – 2002. – V. 269. – P.3905-3911. 298. Schiener-Bobis, G. The sodium pump. Its molecular properties and mechanics of ion transport [Text] / G. Schiener-Bobis // Eur. J. Biochem. – 2002. – V. 269. – P. 2424–2433. 299. Schmalzing G. The adhesion molecule on glia (AM0G/p2) and al subunits assemble to functional sodium pumps in Xenopus oocytes / G. Schmalzing, S.Kroner, M. Schachner, S. Gloor// J. Biol. Chem. - 1992. - V.267. - P. 20212-20216. 300. Schoner W. Sodium pump and steroid hormone receptor Na+,K+-ATPase / W. Schoner // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269, № 10. - P. 2423. 301. Schoner W. Endogenous glycosides, a new class of steroid hormones / W. Schoner // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269, № 10. - P. 2440-2448. 302. Schwinger RHG Isoform specific affinities of digoxin, digitoxin, methyldigoxin and ß-acetyl-digoxin for human Na,K-ATPase. Naunyn Schmiedebergs [Text] / C. Hauck [et al.] // Arch Pharmacol. – 2004. – V. 369. – P. 95. 303. Seligy, V. Studies of template activity of chromatin isolate from metabolically active and inactivated cells [Text] / V. Seligy, M. Miyagi // Exp.Cell Res. – 1969. – V.58, № 1. – P. 27–34. 304. Shier, W.T. Cytolitic Mechanisme Self –destruction of Mammalion celle by Activation of endogenous Hyrolytic enzymes [Text] / W.T. Shier //Clin. Toxicol. – 1982. – V.1, №1. – P. 1-32. 253 305. Shull, G.E. Molecular cloning of three distinct from of the Na+, К+-ATPase α-subunit from rat drain [Text] / G.E. Shier, J. Greeb J.B. Lingerel //Biochemistry. – 1986. – V.25, №25. – P. 8125-8132. 306. Sills, R.H. Decreased erythrocyte deformability in the anemia of bacterial meningitis [Text] / R.H. Sills, M.T. Caserta, S.A Ladaw // J. pediatr. – 1982. – V.101, №3. – P. 345-348. 307. Skou, J.C. Effect of ATP on the intermediary steps of the reaction of the Na, K dependent enzyme system [Text] / J.C. Skou //Biochim. et biophis. acta. – 1974. – V.339. – P.234. 308. Skou, J.C. Enzymatic aspects of active linked transport of Na+ and К+-trough the cell membranes [Text] / J.C. Skou //Progr. bophys. molec. biol. – 1964. – V.14. – P.131. 309. Skou, J.C. Enzymatic basis for active transport of Na+ and К+-across cell membrane [Text] / J.C. Skou // Physiol. Rev. – 1965. – V.45. – P. 596. 310. Skou, J.C. Further investigation on a (Mg2++Na2+)-activated adenosine triphosphatase possibly related to the active, linked transport «of Na+ and К+across the nerve membrane» [Text] / J.C. Skou // Biochim. et biophis. acta. – 1960. – V.42. – P.6. 311. Skou, J.C. The effect of cations, g-strophanthin and oligomycin on the labeling from (32P)-ATP on the (Na++К+)- activated enzyme system and the effect of cations g-strophanthin on the labeling from (32P)-ATP and 32P [Text] / J.C. Skou, C. Hilberg // Biochim. et biophis. acta. – 1969. – V.185. – P.198. 312. Skou, J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from crab peripheral nerves [Text] / J.C. Skou // Biochim. biophis. acta. – 1957. – V.23. – P. 394-401. 313. Skou, J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from crab peripheral nerves [Text] / J.C. Skou // Biochim. biophis. acta. – 1957. – V.23. – P. 394-401. 254 314. Skou, J.C. The Na, K-ATPase [Text] / J.C. Skou, M. Esnmann // J. Bioenerg. and Biomembr. – 1992. – V. 24. – P. 249–261. 315. Skou, J.C. The relationship of the (Na++К+)- activated enzyme system to transport of sodium and potassium across the cell membrane [Text] / J.C. Skou // J. bioenerg. – 1973. – V.4. – P.11. 316. Smith, P.l. Mechanism and regulation of transcellular potassium transport by the colon. [Text] / P.l. Smith, R.D. Me Cabe //Amer. j. physiol. – 1984. – V.247. – P.445-456. 317. Sodium – potassium pump activity in white Blood ceels from children with an increased risk of developing hypertension-the odense schollchild Study [Text] / H.S. Hansen [et al.] // Scand. j. of clin. & labor. inves. – 1993. – V.53. – P.57-65. 318. Stewart D.J. Role of cyclic GMP in cholinergic activation of Na-K pump in duck salt gland/ D.J. Stewart, A.K. Sen// Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1981. -V.240.-P.207-214. 319. Stewart W.C. Acute and chronic regulation of Na+/K+-ATPase transport activity in the RN22 Schwann cell line in response to stimulation of cyclic AMP production/ W.C. Stewart, P.H. Pekala, E.M. Lieberman// Glia. - 1998. - V.23. -P.349-360. 320. Studies on (K++H+)-ATPase. I Essential arginine residue in its substrate binding center [Text] / J.J. Schrijen [et al.] //Biochem.biophys. acta. – 1980. – V.597, №2. – P. 331-344. 321. Suleiman, M.S. The effect of inhibition of the Na-pumping normal Tyrode and during Ca-depletion on the amino acid content of isolated perfused guinea-pig hearts [Text] / M.S. Suleiman, R.A. Chapman // J. Physiol. – 1991. – 438. – P. 318. 322. Sullivan, C.W. Multiple ion-stimulated adenosine triphosphatase activities with membranes of diatom Nitzschiab alba [Text] / C.W. Sullivan, B.E. Volcani //Archiv. biochem. bophys. – 1975. – V.167, №2. – P.437-443. 255 323. Sullivan, C.W. Multiple ion-stimulated adenosine triphosphatase activities with membranes of diatom Nitzschiab alba [Text] / C.W. Sullivan, B.E. Volcani //Archiv. biochem. bophys. – 1975. – V.167, №2. – P.437-443. 324. Sweander, K.J. Two Isozymes of the Na+, K+-ATPase have distinct antigenic. [Text] / K.J Sweander, R.C. Gilkeson // J. biol chem. – 1985. – V.260, №15. – P. 9016-9022. 325. Tague, L.L. Effect of ethanol on bicarbonate - stimulated ATPase, ATP and cyclic AMP in canine gastric mucose [Text] / L.L. Tague, L.L. Shanbour //Proc. soc. exptl. miol. med. – 1977. – V.154, №1. – P.37-40. 326. Teller, J.K. Enzymatyczne podstawy dzialania Pompy sodowey [Text] / J.K. Teller // Post. biol. komork. –1981. – №4. – P. 367-382. 327. The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of beta subunit of the Na+K+ATPase. [Text] / S.M. Gloor [et al.] // J. cell. biol. – 1990. – V.110. – P. 165-175. 328. The Lipids of red Cell membranes comperitional and structural and functional aspects [Text] / B. Roelofsen [et al.] // Scand. j. clin. lab. invest. – 1981. –V.41, №156. – P. 111-115. 329. Therien A.G. Expression and functional role of the у subunit of the Na,KATPase in mammalian cells / A.G. Therien, S.J. Karlish, Rh. Blostein // J.Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P.12252-12256. 330. Therien A.G. Mechanisms of sodium pump regulation / Alex G.Therien and Rhoda Blostein // Am J Physiol Cell Physiol. - 2000. - Vol. 279. - P.541-566. 331. Tymiak A.A. Physicochemical characterization of a ouabain isomer isolated from bovine hypothalamus/ A.A. Tymiak, J.A. Norman, M. Bolgar, G.C. DiDonato, H. Lee, W.L. Parker, L-C Lo, N. Berova, K. Nakanishi, E. Haber, G.T.Jr. Haupert// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. - V.90. -P.8189-8193. 332. Torronteras S.R. HormonalStorage patterns and morphological htterogeneity of porcine gonadotrope ctlls during postnatal development / Torronteras S.R., 256 Castano J.P., Almaden Y., Ruiz Navaro A., racia Navaro F. // In.: Mol.Cell.Endocrinol.- 1993/ - Vol. 97. - №1-2.- P.51-59/ 333. Turner, S.T. Sodium – lithium countertransport and hypertension in Rochester, Minnsota [Text] / S.T. Turner, V.V. Michels // Hypertension. – 1991. – V.18. – P. 183-190. Verkley, A.G. Lipidis in tramembranous particles [Text] / A.G. Verkley // Biochem. biophys. acta. – 1984. – V.779, №3. – P.43-63. 334. Watson, E. L. Ca2+-activated membraine ATPase : selective inhidition by ruthenium red [Text] / E. L Watson., F. Vincenzi, P. W. Davis // Biochem.et Biophys. Acta. – 1971. – N 2. – P. 606–610. 335. Webster, G.D. Affinity chromatography of H+-translocating adenosine triphosphatase isolated by chloroform extraction of Rhodospirillum rubrum chromatophpres Modification of binding affinity by divalent cations and activatyng anions [Text] / G.D. Webster, J.B. Jackson // Biochim. et biophis. acta. – 1978. –V.503. – P.135-154. 336. Webster, G.D. Interconversion two kinetically distinct states of the membrane- bound and solubilised H+-translocating ATPase from Rhodospirillum rubrum. [Text] / G.D.Webster, P.A. Edwards, J.B Jackson // FEBS letters. – 1977. – V.76, №1. – P.29-35. 337. Xie Z. Na+/K+-ATPase as a signal transducer / Z. Xie, A. Askari // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269, № 10. - P. 2434-2439. 338. Xie Z. Na+-K+-ATPase-Mediated Signal Transduction: From Protein Interaction to Cellular Function / Z. Xie and Ting Cai // Molecular Interventions, 2003.-№3.-P. 157-168. 339. Yamamato, A. Usefulness of plasma lysine concentration as a parameter to estimate lysin requirement a shorterPenod in laying hens [Text] / A. Yamamato // Nihon chikusan gakkaiho - Anum Sci. and Techol. – 1997. – № 4. –P. 360-366. 257 340. Yu J. Selective soiubilization of protein and phospholipids from red blood cell membranes by nonionic detergents / J.Yu , D. A.Eishman , T. E. Sleek // J. Supramal. Struct. — 1973. - V.I, - №2. -P.233-248. 341. Zhao N. Na,K-ATPase inhibitors from bovine hypothalamus and human serum are different from ouabain: nanogram scale CD structural analysis/ N. Zhao, L.C. Lo, N. Berova, K. Nakanishi, A.A. Tymiak, J.H. Ludens, G.T. Haupert // Biochemistry. - 1995. - V.34. - P.9893-9896. 342. Zouzoulas A. Modulation of Na,K-ATPase by the y-Subunit Studies with transfected cells and transmembrane mimetic peptides / A. Zouzoulas, A. G.Therien, R. Scanzano , Ch. M. Deber and Rh. Blostein // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, Issue 42. - P . 40437-40441. 258 Приложение 1 Аминокислотный состав протеинового препарата, мясокостной и рыбной муки, г в 100 г (по данным Ю.В. Фурмана) Аминокислоты ПКД Мясокостная Рыбная мука мука Лизин 5,970,44 5,831,02 5,070,23 Гистидин 8,121,64 2,990,53 5,790,67 Аргинин 6,201,48 8,670,64 4,340,34 Аспарагиновая кислота 6,210,61 9,101,55 6,021,01 Серин 1,330,30 1,040,43 2,500,33 Треонин 1,060,19 1,58,38 2,720,33 Глутаминовая кислота 7,951,44 5,751,83 8,841,35 Пролин 10,810,76 4,670,48 5,630,43 Глицин 12,680,93 13,751,02 6,730,13 Аланин 7,871,81 5,840,53 7,570,61 Изолейцин 2,830,17 2,070,14 3,080,07 Валин 2,470,42 2,450,60 3,470,55 Лейцин 2,830,16 2,780,63 4,840,49 Фенилаланин 4,380,49 2,090,46 2,710,20 Тирозин 3,780,08 2,630,21 2,140,10 Метионин 1,690,12 0,630,10 2,660,06 Сумма 84,184,81 93,010,58 74,127,56 в т.ч. заменимые, % 60,1 57,8 53,3 незаменимые, % 39,9 42,2 46,7 Минеральный состав протеинового препарата, мясокостной и рыбной муки, г·кг-1 (по данным Ю.В. Фурмана) Показатели ПКД Мясокостная мука Рыбная мука Кальций 34,440 1,311 70,380 0,576 81,158 1,632 Фосфор 1,620 0,570 4,324 0,217 64,383 1,600 Магний 0,070 0,0002 0,036 0,0004 0,143 0,0003 Натрий 5,578 0,042 4,220 0,006 6,100 0,015 Калий 0,914 0,012 1,1200,034 2,25 0,045 Хром 0,00415 0,00281 0,00386 0,00082 0,00234 0,00128 259 Приложение 2 Структура и питательность применявшихся рационов, % Компоненты рациона Группы 1-я Кукуруза 30,0 Пшеница 10,0 Ячмень 20,5 Шрот соевый 11,0 Дрожжи кормовые 5,0 Шрот подсолнечниковый 12,0 Рыбная мука 3,0 Мел 1,0 Сухое обезжиренное моло- 4,5 ко Премикс 1,0 Мясокостная мука 2,0 Протеиновая кормовая до- 3,0 бавка Жир кормовой 2,0 Итого, % 100,0 2-я 30,0 4,3 18,2 11,0 5,0 12,0 3,0 1,0 4,5 3-я 30,0 5,3 18,2 11,0 5,0 12,0 3,0 1,0 4,5 4-я 30,0 7,3 18,2 11,0 5,0 12,0 3,0 1,0 4,5 1,0 2,0 3,0 1,0 86,0 - 1,0 8,0 - 2,0 100,0 2,0 100,0 2,0 100,0 260 Приложение 3 Химический состав мышц цыплят-бройлеров, ммоль·кг-1 сырой ткани (по данным Ю.В. Фурмана) Элемент Группы опыта опытная контрольная Кальций 190,6 146,6 Кобальт 0 0 Хром 0 0 Медь 2,23 2,62 Железо 10,64 14,18 Калий 16037 14154 Магний 1326 1138 Молибден 0,9871 2,038 Марганец 0,62 0,95 Натрий 1858 1950 Никель 0 0 Фосфор 10348 9119 Мышьяк 0 0 Кадмий 0 0,27 Литий 0 0 Химический состав печени цыплят-бройлеров, ммоль·г-1 сырой ткани (по данным Ю.В. Фурмана) Элемент опытная контрольная Кальций 551,1 365,0 Кобальт 0 0 Хром 0 0 Медь 15,66 17,49 Железо 631,6 627,5 Калий 12088 14641 Магний 809,0 938,3 Молибден 2,6 4,4 Марганец 7,94 12,28 Натрий 6465 7526 Никель 0 0 Фосфор 13448 14799 Мышьяк 0 0 Кадмий 0 0 Литий 0,01 0 261
