УДК 543.424 ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ

УДК 543.424
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ
С ПОМОЩЬЮ ИК-СПЕКТРОСКОПИИ
О.С. Бурматова, К.Е. Сальникова, Н.В. Лакина
Введение
Иммобилизация ферментов на сегодняшний день является одним из перспективных
направлений биотехнологии. Иммобилизация заключается в нанесении ферментов на
твердую подложку, в результате чего получаются гетерогенные ферментные системы.
Иммобилизированные ферменты приобретают стабильность, в том числе при
многократном использовании, устойчивость к внешним факторам (например,
температуре), растворимость в большинстве растворителей; свойства, нехарактерные для
их свободного состояния, приводят к увеличению ферментативной активности и, как
следствию, повышению выхода целевого продукта; легкому разделению продукта
реакции и фермента [1, 2].
В данной работе получены биокатализаторы, имеющие потенциальное применение в
производстве биодизеля. Для подтверждения наличия ковалентных связей в процессе
взаимодействия компонентов использовали метод ИК-Фурье спектроскопии диффузного
отражения, позволяющий анализировать неоднородные образцы.
Методика эксперимента
В качестве носителя фермента в данной работе использовали магнитные
наночастицы (МНЧ). МНЧ готовили следующим образом. В 25 мл азотированной воды
растворяли 5,2 г FeCl3·6H2O и 8,8 г FeSO4·7H2O. Данную смесь по каплям вливали в
250 мл 1,5 М раствора NaOH. Полученные частицы промывали дистиллированной водой
до рН = 7, после чего добавляли 98%-й 0.0128 М этанол, доводя объем раствора до 50 мл.
Далее раствор с образовавшимися МНЧ обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин [3].
После проведения вышеописанных операций из этанольного раствора МНЧ
отобрали небольшое количество частиц на высушивание, оставшийся раствор разделили
на две равные части, на основе которых параллельно готовили две серии катализаторов.
Первая серия катализаторов готовилась с использованием цитрата натрия. Сливали
жидкую фазу, а к МНЧ добавили предварительно растворенный в 200 мл воды цитрат натрия
Na3C6H5O7 (0,2 г), перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 2-х часов.
Натриевая соль лимонной кислоты создает вокруг МНЧ двойной электрический слой, тем
самым стабилизируя частицы. Далее раствор обработали ультразвуком, МНЧ осадили на
магните, отделили их от жидкого слоя. Отобрали небольшое количество образца МНЧ-цитрат
натрия для высушивания в сушильном шкафу. Остальную часть влажных МНЧ обработали
раствором глутарового диальдегида (1 мл диальдегида в 24 мл дистиллированной воды).
Глутаровый диальдегид является сшивающим агентом – активирует носитель
непосредственно перед конденсацией на него липазы. Раствор перемешивали в течение 2х часов, провели операции, как и в предыдущем образце. Растворяли 0,05 г липазы в 50 мл
фосфатного буфера, добавили к влажным частицам МНЧ-цитрат натрия-глутаровый
диальдегид и также поставили на перемешивание с магнитной мешалкой в течение 3-х часов.
Далее повторили операции разделения и сушки.
Таким образом, получили 4 образца для анализа: МНЧ (1), МНЧ-цитрат натрия
(1.2), МНЧ-цитрат натрия-глутаровый диальдегид (1.3), МНЧ-цитрат натрия-глутаровый
диальдегид-липаза (1.4).
Схематически механизм иммобилизации липазы по первому пути изображен на рис. 1.
Рис. 1. Механизм иммобилизации липазы на МНЧ, модифицированные
цитратом натрия и глутаровым диальдегидом
Для получения второй серии образцов к оставшемуся после разделения
этанольному раствору МНЧ добавили 35 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана (АПТС) и
перемешивали в течение двух часов на магнитной мешалке. Аминогруппы АПТС
становятся реакционными центрами на поверхности связанных с ними МНЧ. Затем
частицы промывали дистиллированной водой, осаждали МНЧ с помощью магнита,
сливали водный слой, отбирали пробу МНЧ-АПТС на высушивание. Далее добавляли
глутаровый диальдегид (1 мл в 24 мл воды) и проводили операции аналогично описанным
для предыдущей серии образцов. В результате получили следующие пробы: МНЧ-АПТС
(2.2), МНЧ-АПТС-глутаровый диальдегид (2.3), МНЧ-АПТС-глутаровый диальдегидлипаза (2.4).
Схема механизма иммобилизации липазы по второму пути показана на
рис. 2 [3].
Полученные в ходе работы образцы – МНЧ, МНЧ-цитрат натрия, МНЧ-цитрат
натрия-глутаровый диальдегид, МНЧ-цитрат натрия-глутаровый диальдегид-липаза и
МНЧ-АПТС, МНЧ-АПТС-глутаровый диальдегид, МНЧ-АПТС-глутаровый диальдегидлипаза – анализировали методом ИК-спектроскопии.
Исследования инфракрасного (ИК) поглощения проведены с помощью фурьеспектрометра IRPrestige-21 с длиной волны 632,8 нм.
Результаты и их обсуждение
По результатам обработки ИК-спектров было доказано существование
ковалентных связей в образцах в процессе сшивания.
Рис. 2. Схема иммобилизации липазы на МНЧ, модифицированные АПТС
и глутаровым диальдегидом
На рис. 3 представлены ИК-спектры образцов первой серии катализаторов.
ИК-спектр образца МНЧ указывает на наличие свободных ОН-групп на
поверхности Fe3O4 (полосы поглощения в областях 3 400–3 200 см-1, 3 600–3 500 см-1 и
1 200–1 040 см-1). Пик в области 870–680 см-1 обусловлен валентными колебаниями связи
Fe–O наночастиц Fe3O4.
После обработки МНЧ 0,1 М цитратом натрия с целью стабилизации наночастиц
образец содержит полосы поглощения, связанные с валентными колебаниями
связи Fe–O в области 910–680 см-1, что свидетельствует о наличии большого количества
координационных связей Fe3+ с карбоксилат-ионами цитрата натрия. Наблюдаемое
раздвоение главного пика (около 750 см-1) объясняется раздвоением энергетических
уровней наночастиц Fe3O4 [4].
Кроме того, о присутствии на поверхности МНЧ цитрата натрия свидетельствуют
валентные колебания связи С-Н при 2 900–2 700 см-1, перекрывающиеся с широкой
полосой
валентных
колебаний
ОН-группы
(3 600–2 900 см-1); валентные колебания карбоксильной группы –С=О, наблюдаемые при
1 650–1 600 см-1;
полоса
поглощения
карбоксилат-иона
при
1 450–1 380 см-1
[3, 5, 6].
По ИК-спектру образца МНЧ-цитрат натрия-глутаровый диальдегид определили
наличие колебаний связи Fe-O-C(OH)- в области 1 100–1 045 см-1, групп
–СН2– в области 1 500–1 400 см-1 и альдегидной группы в областях 1 740–1 720 см-1 и
3 000–2 800 см-1, что доказывает связывание глутарового диальдегида со свободными ОНгруппами на поверхности МНЧ и наличие одной, не вступившей в реакцию, свободной
карбонильной группы диальдегида [3, 5–6].
В образце с иммобилизированной липазой наблюдались полосы поглощения в
областях 3 500–3 300 см-1, 1 150–1 050 см-1, вызванные соответственно валентными и
деформационными колебаниями –NH– группы фермента. Полосы поглощения в области
1 670–1 650 см-1 и 3 300–3 080 см-1 свидетельствуют о пептидной связи –NH-COфермента липазы, находящегося на поверхности модифицированных МНЧ [3, 5, 6].
Появление полосы поглощения в области 1 650–1 550 см-1 доказывает образование
азометиновой связи CH=N между ферментом и сшивающим агентом – глутаровым
диальдегидом. Также наблюдается исчезновение дублетного пика в области 3 000–
2 870 см-1, характеризующего присутствие альдегидной группы, что свидетельствует о
ковалентной связи глутарового диальдегида с аминогруппами фермента [7, 9–11].
Рис. 3. ИК-спектры образцов биокатализаторов, поверхность которых модифицировалась
цитратом натрия
Далее провели сравнительный анализ ИК-спектров образцов с АПТС (рис. 4).
Пик, наблюдаемый в ИК-спектре МНЧ при 800–550 см-1, как и в случае с цитратом
натрия, в анализируемом образце МНЧ–АПТС расщепляется на два пика – при 600 и
740 см-1. Раздвоение полос объясняется раздвоением энергетических уровней наночастиц
Fe3O4 и формированием связи Fe-O-Si, где Fe-O-H группа на поверхности МНЧ заменена
Fe-O-Si(O-)2-R, как показано на рис. 2.
По сравнению со свободными наночастицами, образец с адсорбированным на них
АПТС содержит полосы поглощения в области 2 800–3 000 см-1 за счет валентных
колебаний C-H-связи; пик при 1 092 см-1 обусловлен вибрацией растяжения C-N- связи;
колебание вблизи 1 045 см-1 отвечает валентным колебаниям Si-O-связи; колебания при
850–780 см-1, 1 600–1 540 см-1, 3 200–3 000 см-1 обусловлены наличием -NH2-группы. Все
эти пики доказывают присутствие АПТС [4].
Пришивание липазы на поверхность частиц МНЧ с АПТС и глутаровым
диальдегидом, по данным соответствующего ИК-спектра, приводит к появлению пиков в
тех же областях, что и в образце липазы, иммобилизированной на поверхности
модифицированных цитратом натрия и глутаровым диальдегидом МНЧ.
Рис. 4. ИК-спектры образцов биокатализаторов, поверхность которых модифицировалась
АПТС
Заключение
Получены образцы биокатализаторов на основе МНЧ. Для их анализа применили
метод ИК-спектроскопии. По ИК-спектрам доказано присутствие свободных ОН-групп на
поверхности
МНЧ;
определено
наличие
азометиновых
связей
между АПТС и глутаровым диальдегидом, глутаровым диальдегидом и липазой; наличие
полос поглощения, характеризующих пептидные связи, указывает на присутствие в
соответствующем образце фермента.
Библиографический список
1. Ghaly A.E. Production of Biodiesel by Enzymatic Transestrification: Review / A.E. Ghaly [et
al.] // American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Vol. 6. 2010. Issue 2.
P. 5476.
2. Gunnlaugsdottir H. Alcoholysis and glyceride synthesis with immobilized lipase on
controlled-pore glass of varying hydrophobicity in supercritical carbon dioxide /
H. Gunnlaugsdottir [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. Vol. 22. 1998.
P. 360367.
3. Tudorache M. Recyclable biocatalytic composites of lipase-linked magnetic
macro-/nano-particles for glycerol carbonate synthesis / M. Tudorache [et al.] // Applied
Catalysis A: General. Vol. 437–438. 2012. P. 90–95.
4. Ming Ma. Preparation and characterization of magnetite nanoparticlescoated by amino silane /
Ming Ma [et al.] // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. Vol. 212. 2003. Р.
219–226.
5. Тарасевич, Б.Н. ИК-спектры основных классов органических соединений: справ.
материалы / Б.Н. Тарасевич. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2012. 55 с.
6. Наканиси, К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений: практ.
руководство / К. Наканиси; пер. Н.Б. Куплетской, Л.М. Эпштейн; под ред. А.А. Мальцева.
М.: Мир, 1965. 220 с.
7. Силверстейн, Р. Спектрометрическая идентификация органических соединений /
Р. Силверстейн, Ф. Вебстер, Д. Кимл; пер. Н.М. Сергеева, Б.Н. Тарасевича. М.: Бином.
Лаборатория знаний, 2011. 359 с.
8. Беленова, А.С. Исследование четвертичной структуры липазы из rhizopus niveus /
А.С. Беленова [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8. № 2. С.
246–251.
9. Андронати, С.А. Синтез, кристаллическая и молекулярная структура анти-изомера βхлорпропионилоксиимина
5-метил-2-(β-хлорпропионил)аминобензофенона
/
С.А. Андронати [и др.] // Журнал структурной химии (сентябрь – октябрь 2001). Т. 42. №
5.
10. Черниенко, А.В. Новые термотропные жидкокристаллические алкилен-ароматические
полиэфиры с нелинейными гетарилсодержащими мезогенами / А.В. Черниенко [и др.] //
Известия СПбГТИ (ТУ). 2012. № 13(39).
11.
Паньков, В.В.
Структура
и
свойства
нанокомпозитов
SiO2–Fe2O3 /
В.В. Паньков, М.И. Ивановская, Д.А. Котиков // Химические проблемы создания новых
материалов и технологий: сб. ст. Под ред. О.А. Ивашкевича. Мн.: БГУ, 2008. Вып. 3. С.
24–38.